DE102016224234A1 - Mittel und verfahren zur detektion von analyten mittels makroskopischer granulat-partikel - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft magnetisch separierbare Makro-Granulate auf Polymer-Basis zur Durchführung von Immunoassays zur Detektion unterschiedlichster Analyten für medizinische, biologische, biotechnologische Bereiche. Die die Größe der makroskopischen Granulat-Partikel beträgt zwischen 0,5 mm und 10 mm im Querschnitt, vorzugsweise zwischen 1 mm und 5 mm. Vorzugsweise sind die Makro-Granulate magnetisch separierbar. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform befinden sich die Makro-Granulate auf Polymer-Basis in einer Pipettenspitze.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines magnetisch separierbaren Makro-Granulats auf Polymer-Basis zur Durchführung von Immunoassays zur Detektion unterschiedlichster Analyten für medizinische, biologische, biotechnologische Bereiche.
- Stand der Technik
- Neben der molekularbiologischen Diagnostik sind die Analyse und der Nachweis von Proteinen, Antikörpern etc. zu einem unverzichtbaren Bestandteil in der modernen medizinischen Labordiagnostik, der forensischen Diagnostik, der veterinärmedizinischen Labordiagnostik und in der Lebensmittel- und Umweltdiagnostik geworden.
- Immunoassays und ihre Derivate kommen immer dann zum Einsatz, wenn der Analyt nicht in Form einer Nukleinsäure vorliegt, die zur Detektion durch molekularbiologische Techniken vervielfältigt werden könnte. Dies betrifft den Nachweis von unterschiedlichen Molekülen, wie z. B. Hormone, Toxine, Alkohole und Proteine im Allgemeinen. Immunoassays finden darüber hinaus als sogenannte Schnelltests Verwendung, wenn ein schneller Nachweis z. B. einer ganzen Zelle oder eines Viruspartikels angestrebt wird. Diese Nachweistechnologien sind u.a. ELISAs (zum Nachweis von Proteinen oder Nukleinsäuren, R. Yalow et al. J. Clin. Invest.. 39, 1157–75 (1960), Blotting-Techniken (zum Nachweis von Proteinen und Nukleinsäuren Southern, E.M. J. Mol. Biol. 98 503–517 (1975); Alwine JC et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 74,5350–5354 (1977): Renart, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (7), 3116–3120 (1979), Biochip-Techniken (zum Nachweis von Proteinen und Nukleinsäuren z.B.
WO 8808875 US 4956302 ) oder der Nachweis mittels Biobarcodes (Proteine und NukleinsäurenUS 20030054358 A1 ). Als Detektionsmoleküle werden in diesen Assays sowohl Antikörper als auch Aptamere, Enzyme (z.B. Alkoholtest) oder einzelne, chemisch aktive Moleküle (wie z.B. Nitrittest) verwendet. Viele der Nachweismethoden für Proteine sind aber an teure geräteabhängige Systeme gekoppelt (ELISA-Reader, Elektrophoresen, Blotter, Washer, etc.) und erfordern zugleich eine zeitaufwendige Methodik (ELISA, Western-Blotting, Chip-basierte Detektion). Lateral Flow Assays stellen dagegen eine einfach und schnell durchzuführende Alternative dar, sind aber oftmals in Bezug auf ihre Sensitivität nur begrenzt einsetzbar. - Die erzielbaren Sensitivitäten stellen ein generelles Problem der vorgestellten Nachweistechnologien dar. Einerseits liegt dies an der nur begrenzt möglichen Signalverstärkung, andererseits an der geringen Menge an Probe, die für das entsprechende Testformat eingesetzt werden kann (bei einem konventionellen ELISA max. 100 µl). Hinzu kommen noch Probleme mit etwaigen Matrixeffekten bei schwierigen Probenmaterialien, wie z. B. Blutplasma, Lebensmitteln etc.. Diese Probleme werden teilweise durch Verwendung von unterschiedlichen LowCross-Puffern gelöst [1]. Mit diesen Puffern wird die ursprüngliche Probe verdünnt und einem Antikörper zugefügt. Dies erhöht zwar die Spezifität der Antikörper-Antigen-Bindung, führt aber durch die Verdünnung des Ausgangsmaterials zu einem Sensitivitätsverlust.
- Bisherige Technologien zur Lösung des Problems bezüglich des limitierten Probenvolumens sehen den Einsatz von Beads vor, an die der Analyt gebunden wird [2]. Die Größe der eingesetzten Beads liegt hierbei im Bereich von Mikro- und Nanometern. Dies erscheint zunächst sehr vorteilhaft, da Beads bei einem kleinen Gesamtvolumen eine sehr große Oberfläche besitzen. Die mit Antikörpern gekoppelten Beads werden der Probe zugefügt und anschließend zusammen mit dem darauf gebundenen Antigen entweder durch eine Zentrifugation oder durch magnetische Separation dem weiteren Nachweisverfahren zugeführt. Beads werden darüber hinaus auch für die Separation diverser Probenbestandteile, wie z.B. Exosomen, Zellen und Molekülen verwendet. Die Separation der Beads aus einer Lösung ist aber stets problematisch, da insbesondere Beads im Mikrometer- bzw. Submikrometermaßstab sehr viel Zeit benötigen, um mittels eines Magnetfeldes separiert zu werden. Dies umso mehr, je visköser die zu untersuchende Probe ist. Man muss deshalb immer mit einem Verlust an Beads während der Magnetseparation oder mit einer sehr langen Separationszeit rechnen. Bei Verwendung größerer Probenvolumina verstärkt sich diese Problematik entsprechend, weshalb das Gesamtreaktionsvolumen bei diesen Methoden auf 1 bis 2 ml begrenzt ist. Ein weiteres Problem entsteht durch die magnetischen Eigenschaften solcher Beads. Dies ist die Ursache für eine Aggregation der Beads, welche zum Verlust der Assayfunktionalität während der Lagerung führen können.
- Einen Vorteil könnten sogenannte Makropartikel-basierte ELISA bieten. Die Verwendung von funktionalisierten ca. 0,6 cm großen Makropartikeln für ELISA ist bereits publiziert [4], allerdings besitzen die bisher bekannten Makropartikel keine magnetischen bzw. paramagnetischen Eigenschaften. Dies erlaubt deshalb auch keine magnetische Separation der Beads zur Durchführung der Nachweisreaktion. Ein weiteres Problem besteht in der fehlenden Automatisierungsmöglichkeit von Makropartikel-basierten Nachweisverfahren. Eine sehr interessante Entwicklung hinsichtlich einer ELISA-Automatisierung ist die Benutzung einer modifizierten Pipettenspitze [3]. Hierbei wurden die Pipettenspitzen selbst mit einem Antikörper beschichtet. Der nachfolgende ELISA wurde auf der Oberfläche der Spitzen als feste Phase durchgeführt. Die in sich geschlossenen Pipettenspitzen bieten zwar einen Schutz gegen Kreuzkontaminationen, das einsetzbare Volumen des Probenmaterials ist hierbei aber sehr begrenzt (von den Autoren werden 30 µl Probe verwendet). Darüber hinaus bedarf diese Methodik einer sehr komplizierten Apparatur und einer äußerst aufwendigen Herstellung der funktionalisierten Spitzen und ist demzufolge für diagnostische Routineanwendungen nicht kostengünstig/kostendeckend einsetzbar.
- Aufgabe der Erfindung
- Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung definiert sich aus den aufgeführten Nachteilen von bekannten Nachweissystemen.
- Lösung der Aufgabe
- Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.
- Das erfindungsgemäße Mittel ermöglicht eine schnelle Signalgenerierung ggf. aus einem großen Probenvolumen ohne komplizierte Gerätetechnik, eine sehr hohe Empfindlichkeit und ist darüber hinaus für einen automatisierten Ablauf jeglicher Art geeignet. Es stellt ein alternatives, neuartiges Mittel zur Durchführung bisheriger ELISA-Anwendungen dar.
- Das erfindungsgemäße Mittel zum Nachweis eines Analyten nutzt spezifische makroskopische Granulat-Partikel-(„MGP“). Dabei können diese Partikel verschiedene Formen und Größen aufweisen, vorzugsweise Größen zwischen 1 mm und 5 mm im Querschnitt. Die Partikel können aus den bekannten Materialien bestehen, welche die Fähigkeit besitzen, auf ihrer Oberfläche die funktionsfähigen Detektionsmoleküle (Antikörper, Aptamere, chemische Gruppen etc.) zu tragen. Darüber hinaus kann das eingesetzte Granulat mittels eines Magneten separiert werden.
- Solch ein Material ist als Granulat unter dem Markennamen TECACOPM® bekannt.
- Das erfindungsgemäße Mittel weißt ebenfalls die für ELISA-Verfahren notwendige beschichtbare Oberfläche auf. Nach erfolgter Beschichtung kann das erfindungsgemäße Granulat für die Durchführung der Nachweisreaktion eingesetzt werden. Dies basiert auf den für ELISA-Anwendungen bekannten Abläufen:
- 1. Ein oberflächenbeschichtetes Granulat wird mit einer Probe in Kontakt gebracht, welche einen nachzuweisenden Analyten enthält. Dies kann dadurch erfolgen, dass das Granulat sich frei in der Probe befindet oder indem die Probe am Granulat vorbeigeleitet wird. Der Analyt bindet dabei spezifisch an das Granulat.
- 2. Nach einer kurzen Inkubation wird das Granulat mittels magnetischer Separation von der Probe getrennt und nachfolgend kurz gewaschen.
- 3. Anschließend wird das Granulat mit Nachweismolekülen (z.B. HRP-markiertes Antikörper) in Kontakt gebracht.
- 4. Danach wird das Granulat erneut unter Anwendung der magnetischen Separation gewaschen, um nichtgebundene Nachweismoleküle effizient abzutrennen.
- 5. Der finale Nachweis erfolgt z.B. nach Zugabe einer Substratlösung und durch kolorimetrische Messung der Substrat-Umsatzreaktion.
- Der am erfindungsgemäßen Mittel gebundene Analyt fungiert als Brücke zwischen dem erfindungsgemäßen Mittel und den übrigen Nachweiskomponenten. Nachweiskomponenten können dabei markierte Moleküle sein, die sich einerseits spezifisch an den Analyten binden und anderseits die Möglichkeit einer Detektion erlauben (z.B. Meerettichperoxidase-markierter Antikörper, mit einem fluoreszierenden Stoff markiertes Aptamer, ein weiteres Nachweismolekül gekoppelt an Partikel, welche selbst die Detektionsmoleküle enthalten etc.).
- Gemäß der Zielstellung der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäße Mittel in idealster Weise geeignet, eine Nachweisreaktion zu ermöglichen. Das Granulat bietet eine ausreichend große Bindungsoberfläche für den Analyten. Es kann wegen seiner Makroeigenschaften und seiner magnetischen Eigenschaften in einem sehr großen Probenvolumen (z.B. 1 ml–100 ml) eingesetzt werden. Hierzu nutzt man vorzugsweise ein Verfahren, bei welchem die Probe am erfindungsgemäßen Mittel vorbeigeleitet wird. Damit wird erreicht, dass die in der Probe enthaltenen Analyten akkumulierend an der Oberfläche des Granulats angereichert werden. Diese Vorgehensweise ermöglicht einerseits die Sensitivität des Verfahrens zu erhöhen, anderseits die Probe mit dem Analyten mit einem für die Bindung günstigeren Puffer zu verdünnen und damit die Matrixeffekte der Probe zu minimieren. Ein weiterer wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Mittels gegenüber einer Bead-basierten ELISA-Anwendung besteht darin, dass auf Grund der Größe der Granulate die Separation der Granulate aus der Probe sehr schnell erfolgt. Im Gegensatz dazu benötigen Nano- und Mikrometer große Beads extrem lange, um separiert werden zu können. Verluste an Beads treten überhaupt nicht mehr auf. Dies ist ein erhebliches Problem bei kleinen Beads.
- Eine spezielle Ausführungsform zur Automatisierung des Nachweisverfahrens besteht in einer Pipettenspitze, welche mit dem erfindungsgemäßen Granulat befüllt ist. Das Auf- und Abpipettieren der Probe ermöglicht die gewünschte Flüssigkeitsfluktuation an der Oberfläche des erfindungsgemäßen Mittels. Durch Pipettierschritte kann das Granulat auch in Kontakt mit den Nachweiskomponenten gebracht werden. Anderseits kann bei Bedarf das Granulat schon vor der Verbringung in die Spitze mit einem großen Volumen an Probe in Kontakt gebracht werden und nach einer magnetischen Separation in die Spitze überführt werden, was bei der Benutzung einer Pipettenspitze als Feste Phase in einem ELISA [3] nicht möglich ist.
- In dem Fall der Verbringung des Granulates in eine Pipettenspitze treten seine magnetischen Eigenschaften in der Bedeutung zurück, seine makroskopischen Eigenschaften können aber genutzt werden: MGP verbleiben in der Pipettenspitze während der Pipettierschritte. Die Verbringung des Granulates in eine Pipettenspitze löst auch das Problem mit der Kreuzkontamination der benachbarten Proben. Es ist auch möglich, alle Automatisierungssysteme, die auf magnetischer Separation basieren, für die durchzuführenden ELISA zu verwenden, was mit nicht-magnetischen Makropartikeln nicht möglich ist. Darüber hinaus kann auch in einer Pipettenspitze die Separation der Granulate mittels eines Magnetfeldes erfolgen.
- Besonders gut einsetzbar ist das erfindungsgemäße Mittel z.B. für ein Online-Monitoring in Durchflusssystemen. Hierbei erfolgt die Bindung des Analyten an das erfindungsgemäße Mittel innerhalb einer Bypassleitung und der Analyt kann anschließend innerhalb kürzester Zeit außerhalb der Leitung detektiert werden.
- Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Beispielen näher beschrieben werden. Dabei stellen die Ausführungsbeispiele keine Limitierung der Erfindung dar.
- Ausführungsbeispiel 1:
- Nachweis des C-reaktiven Proteins (CRP)
- Die Nachweisgrenze von CRP bei kommerziellen Assays liegt bei 1 mg/L.
- Ein Polypropylen-Magnetgranulat (Durchmesser ca. 4 mm) wurde mit anti-CRP-Antikörper (Senova GmbH) 5 Stunden lang inkubiert. Der Antikörper lagerte sich durch die hydrophoben Wechselwirkungen an der Granulatoberfläche an. Anschließend wurde das funktionalisierte Granulat geblockt. Jeweils ein funktionalisiertes Granulatkorn wurde pro Nachweisreaktion verwendet. Der zweite anti-CRP-Antikörper wurde mit HRP (Horseradish peroxidase) für einen späteren kolorimetrischen Nachweis konjugiert.
- Eine Verdünnungsreihe des CRP-Antigens wurde hergestellt:
1: 30 mg/L, 2: 3 mg/L, 3: 1,5 mg/L, 4: 0,75 mg/L, 5: 0,37 mg/L, 0,06 mg/L - Der Immunoassay wurde wie folgt durchgeführt:
- 1. Ein Magnet-Granulat-Korn wurde mit 50 µl CRP Antigen aus der Verdünnungsreihe und 150 µl PBS in Kontakt gebracht.
- 2. Inkubation 30 min unter rotierender Bewegung
- 3. 3× Waschen mit konventionellen ELISA-Washing-Buffer (AJRobescreen GmbH). Begleitet von Magnetseparation des Magnet-Granulats.
- 4. Zugabe des HRP-markierten anti-CRP Detektionsantikörpers zu dem Granulatkorn.
- 5. Inkubation 30 min unter rotierender Bewegung
- 6. 3× Waschen mit konventionellen ELISA-Washing-Buffer (AJRobescreen GmbH). Begleitet von Magnetseparation des Magnet-Granulats.
- 7. Die Magnet-Granulat-Körner wurden in eine ELISA-Reader-kompatible Mikrotiterplatte überführt.
- 8. Eine kolorimetrische HRP-vermittelte TMB-Färbung diente der Vermessung der Proben in einem ELISA-Reader bei 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 630 nm (Thermo Fisher). Messergebnisse (Mittelwert aus 3×Reaktion) s. Tab.1.
- Tab. 1 Messwerte bei 450 nm
Nr Konzentration Messwert OD450nm 1 30 mg/L 2,859 2 3 mg/L 1,488 3 1,5 mg/L 0,725 4 0,75 mg/L 0,374 5 0,37 mg/L 0,185 6 0,06 mg/L 0,097 7 Kein Ag 0,060 8 ELISA BG 0,055 -
1 zeigt die Darstellung der Messwerte abzüglich Leerkontrolle. - Der Versuch belegt eine hintergrundarme Detektion des Antigens CRP bis zur Detektionsgrenzen, die unterhalb der Detektionsgrenze konventioneller CRP-ELISA liegen.
- Ausführungsbeispiel 2:
- Einfluss des Probenvolumens auf die Signalstärke bei der Detektion von CRP
- Die Vorbereitung des Magnetgranulats für den Versuch erfolgte wie im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben.
- Das Antigen CRP wurde in einer Konzentration von 0,03 mg/L hergestellt.
- Die Magnet-Granulat-Körner wurden mit folgenden Volumina der Probe inkubiert:
1. 50 µl, 2. 100 µl, 3. 1 ml, 4. 5 ml, 5. 10 ml - Nach einer Inkubation für eine Stunde wurden die Granulat-Körner wie im Beispiel 1 für eine Detektion mit einem ELISA-Reader vorbereitet. Die Ergebnisse der Messung s. Tabelle 2 (Mittelwert aus 3× Bestimmung) Tab. 2 Messwerte bei 450 nm
Nr Volumen Messwert OD450nm 1 50 µl 0,062 2 100 µl 0,192 3 1 ml 0,82 4 5 ml 1,016 5 10 ml 1,041 6 100 µl nur PBS 0,095 7 ELISA BG 0,055 -
2 zeigt die Darstellung der Messwerte abzüglich Leerwert. - Der Versuch zeigt, dass die Erhöhung des Probenvolumens zu einer höheren Sensitivität führt, was einen Vorteil gegenüber eines herkömmlichen ELISA darstellt, bei dem das Probenvolumen durch die Größe der Mikrotiterplatte limitiert ist.
- Literatur:
-
- [1] http://www.candor-bioscience.de/methoden/elisa.html
- [2] A new method of measuring C-reactive protein, with a low limit of detection, suitable for risk assessment of coronary heart disease. Eda S, Kaufmann J, Molwitz M, Vorberg E. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 1999;230:325.
- [3] An automated ELISA system using a pipette tip as a solid phase and a pH-sensitive field effect transistor as a detector Hitoshi Tsuruta, Hideaki Yamada, Yukiko Motoyashiki, Keiko Oka, Chieko Okada, Michihiro Nakamura Journal of Immunological Methods 183 (1995) 221–229
- [4] Vadim V Shmanai, Tamara A Nikolayeva, Ludmila G Vinokurova, and Anatoli A Litoshka Oriented antibody immobilization to polystyrene macrocarriers for immunoassay modified with hydrazide derivatives of poly(meth)acrylic acid BMC Biotechnol. 2001; 1:4.
- ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
- Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
- Zitierte Patentliteratur
-
- WO 8808875 [0003]
- US 4956302 [0003]
- US 20030054358 A1 [0003]
- Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- ELISAs (zum Nachweis von Proteinen oder Nukleinsäuren, R. Yalow et al. J. Clin. Invest.. 39, 1157–75 (1960) [0003]
- Blotting-Techniken (zum Nachweis von Proteinen und Nukleinsäuren Southern, E.M. J. Mol. Biol. 98 503–517 (1975) [0003]
- Alwine JC et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 74,5350–5354 (1977) [0003]
- Renart, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (7), 3116–3120 (1979) [0003]
Claims (11)
- Mittel zur Detektion eines Analyten, umfassend magnetische makroskopische Granulat-Partikel, dadurch gekennzeichnet, dass diese eine Oberflächenbeschichtung aufweisen, an der der zu bestimmende Analyt spezifisch bindet.
- Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Größe der makroskopischen Granulat-Partikel zwischen 0,5 mm und 10 mm im Querschnitt, vorzugsweise zwischen 1 mm und 5 mm, beträgt.
- Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die makroskopischen Granulat-Partikel aus einem Konglomerat zwischen einem Polymer und einem magnetischen bzw. paramagnetischen Material bestehen und dadurch magnetisch separierbar sind.
- Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Oberflächenbeschichtung Antikörper, Aptamere oder chemische funktionelle Gruppen dienen.
- Testkit zur Detektion eines Analyten, umfassend das Mittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, sowie Waschpuffer, Nachweismoleküle und Mittel zum Sichtbarmachen des Nachweisprozesses.
- Vorrichtung zur Detektion eines Analyten, umfassend mindestens eine Pipettenspitze, in der sich makroskopische Granulat-Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 befinden
- Testkit zur Detektion eines Analyten, umfassend die Vorrichtung gemäß der Ansprüche 6 bis 5 sowie Waschpuffer, Nachweismoleküle und Mittel zum Sichtbarmachen des Nachweisprozesses.
- Testkit nach Anspruch 5 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen ELISA handelt.
- Automatisches Gerät zur Detektion eines Analyten, umfassend mehrere Pipettenspitzen gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 sowie Behälter mit der Probe des Analyten, Waschpuffern, Nachweismolekülen und Mittel zum Sichtbarmachen des Nachweisprozesses, wobei die Pipettenspitzen nach dem walk-away-Prinzip nacheinander in die Behälter des Analyten, der Waschpuffer und der Nachweismoleküle eingetaucht werden und final die Substrat-Umsatzreaktion auf einem geeigneten Mittel sichtbar gemacht wird.
- Verfahren zur Detektion eines Analyten, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) makroskopische magnetische Granulat-Partikel, die eine Oberflächenbeschichtung aufweisen, an der der zu bestimmende Analyt spezifisch bindet, werden mit einer Probe in Kontakt gebracht, die einen nachzuweisenden Analyten enthalten, wobei der Analyt an die Granulat-Partikel gebunden wird, die sich entweder frei in der Probe befinden oder indem die Probe am Granulat vorbeigeleitet wird b) nach einer kurzen Inkubation wird das Granulat mittels magnetischer Separation von der Probe getrennt und nachfolgend kurz gewaschen. c) anschließend wird das Granulat mit Nachweismolekülen in Kontakt gebracht. d) danach wird das Granulat erneut unter Anwendung der magnetischen Separation gewaschen, um nichtgebundene Nachweismoleküle abzutrennen. e) der finale Nachweis des Analyten erfolgt nach Zugabe einer Substratlösung und durch Messung der Substrat-Umsatzreaktion auf einem geeigneten Mittel bzw. einer direkten Messung der markierten Nachweismoleküle.
- Verwendung der Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4 für das Online-Monitoring in Durchflusssystemen.
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2016
- 2016-12-06 DE DE102016224234.2A patent/DE102016224234A1/de active Pending
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