DE112018007595T5 - Verfahren zum Nachweis des Target-Tumorserums-Nukleinsäureligand-Komplexes und ein Kit - Google Patents

Verfahren zum Nachweis des Target-Tumorserums-Nukleinsäureligand-Komplexes und ein Kit Download PDF

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Abstract

Die Erfindung offenbart ein Verfahren zum Nachweis des Target-Tumorserums-Nukleinsäureligand-Komplexes und ein Kit. Das Verfahren dient zum Nachweis von Marker-Target der zusammengesetzten Proben, durch die Bindung von spezifischen Nukleinsäureligandensätzen und spezifischen Targets wird der Target-Marker-Signal in ein Nukleinsäuresignal umgewandelt, und eine Echtzeit-PCR kann für dynamischen quantitativen Nachweis verwendet werden.Das Kit umfasst Fängermagnetperlenreagenz, eine Blockierungslösung, ein Nachweisreagenz, eine Waschflüssigkeit und eine quantitative Echtzeit-PCR-Reaktionslösung, wobei die Fängermagnetperle mit einer Partikelgröße von 5 bis 5000 nm in dem Fängermagnetperlenreagenz gelöst wird; wobei die Blockierungslösung sich um eine Proteinblockierungslösung handelt; wobei Tumor- und Nicht-Tumor-Serum-spezifische Nukleinsäureligandensätze im Nachweisreagenz gelöst werden; wobei die quantitative Echtzeit-PCR-Reaktionslösung einen Primer und fluoreszierende Sonden für Nukleinsäureligand enthält. Dieses Verfahren weist die Eigenschaften von Schnell, hoher Empfindlichkeit, starker Spezifität, gleichzeitigem Nachweis von mehreren Aptamere und dergleichen auf.

Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die Erfindung betrifft das Gebiet des biomedizinischen Nachweises, insbesondere ein Verfahren zum Nachweis des Target-Tumorserums-Nukleinsäureligand-Komplexes und ein Kit.
  • STAND DER TECHNIK
  • Mit der Entwicklung der SELEX-Technologie werden Nukleinsäureligand als neuartige Art von Ligandenmolekülen mit starker Spezifität, breitem Anwendungsbereich und einfacher Modifikation bei der Erkennung und Behandlung von Krankheiten, beim Screening und der Anwendung von Arzneimitteln sowie bei der Überwachung der Lebensmittel- und Umweltsicherheit, biologischem Nachweis usw. eingesetzt.
  • Der Nukleinsäure-Beacon-Ligand ist ein neues Nachweismolekül, das vom Nukleinsäureligand abgeleitet ist. Dadurch wird es hergestellt, dass bei dem 5'-Ende seines Liganden wird eine doppelsträngige Nukleotidsequenz mit einer fluoreszenzmarkierten Sonde mit Nukleinsäureligand eines bekannten spezifischen Targetmoleküls verbunden, es weist nicht nur die Erkennungsfähigkeit des Nukleinsäureligand, sondern auch die Funktionen von Signalspeicherung, -Übertragung und -verstärkung auf. Es ist eine neue Art von Nachweismolekül, welches einfache Konstruktion, starke Spezifität, hohe Empfindlichkeit und breiten Anwendungsbereich hat. Da allerdings der Nukleinsäure-Beacon-Ligand die Beacon-Sequenz erhöht, wird die Sequenz des Nukleinsäuremoleküls des Liganden geändert und die Molekülraumstruktur und die Bindungskraft des Liganden von Aptamer werden beeinflusst. Daher ist der Nachweis bequemer und praktischer, wenn die Struktur des Nukleinsäure-Aptamer nicht geändert wird und auch noch eine quantitative Echtzeit-PCR verwendet werden kann.
  • Als neuartiges multifunktionales Material sind die Magnetische Perlen aufgrund ihrer guten Biokompatibilität und funktionellen Oberflächengruppen einen ideale Träger für Nukleinsäureligand-Nachweis geworden. Dabei ist es in dem Bereich von Lebensmittel-, Medizin-, Umwelt- und biologischen Trennung für den Nukleinsäureligand-Nachweis Immer weiter angewendet.
  • Serum ist die zugänglichste Probe in der klinischen Arbeit und kann eine große Menge an Informationen zur Körperfunktion liefern. Fast alle Zellen im Körper kommunizieren direkt oder indirekt mit dem Blut. Daher kann jede Krankheit Spuren in Serumproteinen hinterlassen und bestimmte Eigenschaften verändern.
  • Für Den traditionellen Nachweis von Proteinen verwendet meistens einen enzymgebundenen Immunoassay (ELISA), wobei der Fängerantikörper mit Antigenen im Serum gebunden, und dann der an dem Kopplungsenzyme gebundene Nachweisantikörper hinzufügt wird, wobei einen „Sandwich“ - Komplex aus Fängerantikörper-Antigen-Nachweisantikörper gebildet wird, und schließlich die Aktivität des Kopplungsenzymes nachgewiesen das Nachweisergebnis angegeben wird. Der Nachweisbereich ist allerdings durch den Kd-Wert des Fängerantikörpers und der Antigenreaktion begrenzt, und die Empfindlichkeit ist nicht gut.
  • Derzeit gibt es zwei spezifische Methoden für die Nachweistechnologie mit Nukleinsäure-Beacon-Ligand. Einer ist der durch Nukleinsäure-Beacon-Ligand vermittelte Immun-PCR-Nachweis, dabei der Prozess ähnelt dem ELISA-Verfahren und der Unterschied besteht darin, dass das Antigen mit einem aus dem spezifische Nukleinsäure-Beacon-Ligand und Fängerantikörper gebildeten Komplex anstelle von RaMIgG-HRP, welche dem Fängerantikörper entspricht, nachgewiesen wird, dabei wird der quantitativen Echtzeit-PCR-Nachweis durchgeführt; der andere ist ein durch Nukleinsäure-Beacon-Ligand vermittelter PCR-Nachweis, bei dem der dem Targetmolekül entsprechende Nukleinsäure-Beacon-Ligand direkt als Nachweismolekül verwendet wird, nach Bindung an das Targetmolekül, Elution und Trennung wird eine quantitative Echtzeit-PCR zum Nachweis verwendet. Beide Methoden verwenden zuerst Nukleinsäure-Beacon-Ligandenmoleküle, um das Targetmolekül spezifisch zu identifizieren, dann die Signaltransduktion durchzuführen und schließlich die Signalverstärkungsfunktion durch quantitative Echtzeit-PCR zu vervollständigen, um den Nachweis des Targetmoleküls zu erreichen. Das Nukleinsäure-Beacon-Liganden-Verfahren zum Nachweis von Targetmolekülen hat die Vorteile von Schnelle, hoher Empfindlichkeit und starker Spezifität.
  • Die quantitative Echtzeit-PCR-Nachweistechnologie für Nukleinsäureligand ist eine verbesserte Art der Nachweistechnologie mit Nukleinsäure-Beacon-Ligand. Bei dem Nukleinsäure-Beacon-Ligand ist eine doppelsträngige Beacon-Sequenz an beiden Enden der Ligandensequenz gefügt und dient dazu, das Signal dann durch der Bindung des Liganden mit Targetmolekül über den Liganden an die Beacon-Sequenz überträgt und den Nachweis des Targetmoleküls durch einem Nachweis von Beacon, der anhand von quantitative Echtzeit-PCR durchgeführt wird, indirekt ermöglicht. Während des Implementierungsprozesses wird jedoch festgestellt, dass die Wechselwirkung zwischen Aptamer und Targetmolekül nicht unbedingt nur durch eine einzelne Kette muss, sondern durch mehrere Ketten vervollständigt werden kann. Gleichzeitig beeinflusst das doppelsträngige Beacon auch die räumliche Struktur des Liganden, sodass die Beacon-Sequenz nicht nur den Ligandenstruktur, sondern auch die Synergie inzwischen den Liganden beeinflusst, wodurch die Bindung des Liganden mit Targetmolekül und die Nachweisergebnisse beeinflusst werden. Daher ist es notwendig, den Mangel zu verbessern und die Nachweistechnologie zu verbessern.
  • INHALT DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
  • Um die oben erwähnten Mängel im Stand der Technik zu überwinden, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis des Target-Tumorserums-Nukleinsäureligand-Komplexes und ein Kit bereit. Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden technischen Lösungen realisiert: ein Nukleinsäureliganden-Nachweiskit des zusammengesetzten Target-Tumorserums, umfassend Fängermagnetperlenreagenz, eine Blockierungslösung, ein Nachweisreagenz, eine Waschflüssigkeit und eine quantitative Echtzeit-PCR-Reaktionslösung,
    wobei die Fängermagnetperle mit einer Partikelgröße von 5 bis 5000 nm in dem Fängermagnetperlenreagenz gelöst wird;
    wobei die Blockierungslösung sich um eine Proteinblockierungslösung handelt;
    wobei Tumor- und Nicht-Tumor-Serum-spezifische Nukleinsäureligandensätze im Nachweisreagenz gelöst werden;
    wobei die quantitative Echtzeit-PCR-Reaktionslösung einen Primer und fluoreszierende Sonden für Nukleinsäureligand enthält.
  • Das oben erwähnte Fängermagnetperlenreagenz kann insbesondere als 5 ml 0,01 M Bindepuffer mit einem pH von 7,4 ausgewählt werden, der 50% der Fängermagnetperlenpartikel mit einer Partikelgröße von 5 bis 5000 nm enthält; in dem oben erwähnten Nachweisreagenz sind Tumorserum-spezifische Nukleinsäureligandensätze für Magenkrebs (G-seq), Leberkrebs (H-seq), Lungenkrebs (L-seq) usw. sowie nicht-Tumor (N-seq) serumspezifische Nukleinsäureliganden aufgelöst. Jeweiliger Ligand im Nachweisreagenz ist 109 Molekulare Kopienzahl, 0,1 × Bindepuffer-Mischlösung; die oben erwähnte Waschflüssigkeit enthält vorzugsweise eine erste Waschflüssigkeit und eine zweite Waschflüssigkeit, und die erste Waschflüssigkeit kann ausgewählt sein als 10 ml 0,01 M Bindepuffer mit einem pH von 7,4 (einschließlich 0,17% Tween), und die zweite Waschflüssigkeit kann ausgewählt sein als 10 ml 3 × SSC , worin Zitronensäure und Natriumchlorid aufgelöst werden, die vorstehende quantitative Echtzeit-PCR-Reaktionslösung kann ausgewählt sein als ein PCR-System, das ein Paar Primer und Fluoreszenzsonden mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen für Nukleinsäureligand umfasst.
  • Vorzugsweise werden die Tumor- und Nicht-Tumorserum-spezifische Nukleinsäureligandensätze mittels der bidirektionalen thermischen umlaufenden subtraktiven -SELEX-Technologie-Screening erhalten. Dabei können die Tumor(Magenkrebs, Leberkrebs und Lungenkrebs)- und Nicht-Tumor-Serum-spezifischen Nukleinsäureligandensätze erhalten, indem Magenkrebs-, Leberkrebs- und Lungenkrebs -Serum (bzw. Serummischung von mehr als 10 Fällen) und Nicht-Tumor-Serum (bzw. Serummischung von mehr als 10 Fällen) als miteinander zu subtrahierendes Target mittels der bidirektionalen (oder mehrfachen) subtraktiven SELEX-Technologie-Screening bearbeitet. Der Gehalt vom spezifische Nukleinsäureligand jedes Serums im Nachweisreagenz beträgt vorzugsweise 106-109 molekulare Kopien.
  • Vorzugsweise entsprechen die Nukleinsäureliganden in den Tumor- und Nicht-Tumorserum-spezifischen Nukleinsäureligandensätze den Fluoreszenzsonden eins zu eins, d.h. jede eine fluoreszierende Sonde ist für einzelne Nukleinsäureligandensequenz ausgelegt. Insbesondere umfasst die fluoreszierende Sonde vorzugsweise mindestens eine von MGB-Sonden, TaqMan-Sonden und Molecular Beacons mit einer Sequenz von 5 bis 25 bp Länge, deren 3'-Ende und 5'-Ende jeweils mit einer fluoreszierenden Gruppe und einer Löschgruppe markiert (fluoreszierende Gruppen: FAM, HEX, TET; Löschgruppen: TAMRA, BHQ und andere Fluoreszenzlöschmaterialien), mit der können der quantitativen Echtzeit-PCR-Nachweis unterstützt werden.
  • Vorzugsweise weist die Oberfläche der Fängermagnetperle eine funktionelle Gruppe oder ein Fängermolekül auf, das mit dem Targetmolekül koppeln kann, und die funktionelle Gruppe umfasst mindestens eine von Epoxygruppe, Carboxylgruppe, Aminogruppe und NHS, und das Targetmolekül ist chemisch gekoppelt. Das Fängermolekül ist eines oder mehrere von der Gruppe aus Antigene, Antikörper, Affinitätsproteine, Nukleinsäure-Aptamere usw., die spezifisch an Targetmoleküle binden, über funktionelle Gruppen an die Oberfläche von Magneterle binden und durch immunologische Bindung, Proteinliganden-Aptamer-Bindung und Nukleinsäureligand-Aptamer-Bindung usw. an das Targetmolekül binden können. Bei dem Targetmolekül handelt sich um mindestens eine oder mehrere der Gruppe aus Nukleinsäuren, Proteine, Lipide, Aminosäuren und anderen biologischen Moleküle.
  • Vorzugsweise ist der Primer ein Ligandenprimer und die Sonde ist eine 5-25-Basensequenz auf der Ligandensequenz, und die 3'- und 5'-Enden der Sequenz weist eine Löschgruppe und eine fluoreszierende Gruppe auf.
  • Vorzugsweise enthält die Blockierungslösung Magermilchpulver und Kasein- oder Rinderblutalbumin.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren mittel des vorstehenden Kits zum Nachweis des Target-Tumorserums-Nukleinsäureligand-Komplexes und ein Kit, und das Verfahren umfasst speziell die folgenden Schritte:
    1. 1) Bereiten der zu testenden Probe vor: Entfernen der Blutzellen und Lipide aus dem Blut und Trennen des Serum ab.
    2. 2) Fängeren und Nachweisen von Targetmolekülen: Mischen des FängerMagnetperlenreagenz mit der zu testenden Probe und Inkubieren für 1 Stunde bei 37 ° C, wobei einer Magnetperle-Targetmolekülkomplex gebildet wird (ber der unspezifischen Bindung erfordert es eine Blockierungslösung bei 37 °C für 1 Stunde lang Blockierung) Waschen mit der ersten Flüssigkeit 3 Mal(3 Minuten /mal), Trennen magnetisch und Entfernen der Magnetperlen.
    3. 3) Binden des Beacon-Liganden: Erhitzen des Nachweisreagenz für 5 Minuten lang bei 95 °C, Abkühlen dann schnell 5 Minuten im Eiswasser, Zugeben der Magnetperle und bei 37 °C für das Binden 1 Stunde lang halten, Trennen magnetisch und verwerfen des Überstands.
    4. 4) Waschen: Zugeben der zweiten Waschflüssigkeit von 0,5 ml, einmal Waschen für 3 Minuten, Trennen magnetisch, Zugeben noch der ersten Waschflüssigkeit von 0,5 ml, Waschen 3 Mal mit 3 Minuten / Mal, Trennen magnetisch und Entfernen der Magnetperle.
    5. 5) Extrahieren der Liganden: Zugeben des 1 × PCR-Puffers von 15 µl, Erhitzen für 5 Minuten bei 95 °C, zu den Magnetperle geben, 5 Minuten auf 95 ° C erhitzen, magnetisch trennen und den Überstand entnehmen.
    6. 6) Ligandennachweis: Pipettieren 2 µl des in Schritt 5 beschriebenen Überstands in eine quantitative Echtzeit-PCR-Reaktionslösung von 18 µl,
  • Erfolgen von PCR, Sammeln und Verarbeiten der Daten (oder qualitative und quantitative Bestimmen der Multi-Target-Liganden mittels der Gensequenzierung).
  • Der oben erwähnte Schritt 1) kann auf folgende Weise durchgeführt werden: Verwenden der Venenpunktion, um Blut in ein Reagenzglas mit Antikoagulans zu entnehmen, sofort vorsichtig Schütteln, um Blut und Antikoagulans zu mischen, Zentrifugieren 10 Minuten lang bei 3000 U / min, und nach 30-minütigem Einfrieren bei -80 °C Sammeln des Überstands, 12.000 g Zentrifugieren für 30 Minuten und Entfernen der Blutfette, Erhalten des zu testenden Serum durch Trennung (oder jeweils durch Mischen mit Verhältnis von Wasser: Acetonitril: Serum = 2: 0,5: 1, Zentrifugieren mit 5000 U / min für 30 Minuten bei niedriger Temperatur und Entnehmen des Überstands, Entfernen des Proteins mit hoher Fülle).
  • Der obige Schritt 6) wird vorzugsweise auf die folgende Weise durchgeführt: Nach Bedarf werden mehrfacher quantitativer Echtzeit-PCR-Nachweis, mehrfaches Bibliotheks-Screening und mehrfacher Primer-Nachweis, Gensequenzierung und andere Verfahren verwendet, um Liganden oder Ligandensätze, die spezifisch an den Fängermagnetperle gebunden werden, nachzuweisen. Durch mehrfachen quantitativen Echtzeit-PCR-Nachweis (Gensequenzierung usw.) von Nukleinsäureligandensätzen kann ein qualitativer und quantitativer Nachweis spezifischer Markersätze erreicht werden.
  • Die quantitative Echtzeit-PCR-Nachweisverfahren für Nukleinsäureliganden muss dem Liganden keine Sequenz hinzufügen, und ändert es nicht die räumliche Struktur des Liganden, dabei die Nachweissondensequenz von quantitativer Echtzeit-PCR beträgt 5 bis 25 Basensequenzen auf der Ligandensequenz. Auf diese Weise besteht keine Notwendigkeit, die Ligandenstruktur, die Bindungskraft des Liganden von Aptamere zu modifizieren, dabei ist die Nachweisempfindlichkeit verbessert.
  • Die Vorteile der vorliegenden Erfindung sind:
    1. 1. Das Nachweiskit der vorliegenden Erfindung dient zum Nachweis von zusammengesetzten Targets. Durch die Bindung von spezifischen Nukleinsäureligandensätzen und spezifischen Targets in Serum wird das zusammengesetzte Target-Serummarker-Proteinsignal in ein Nukleinsäuresignal umgewandelt, und eine Echtzeit-PCR kann für dynamischen quantitativen Nachweis verwendet werden. Dieses Nachweisverfahren kann Signale mehrerer Targetmoleküle durch Nukleinsäureliganden in Nukleinsäuresignale umwandeln und daher weist die Eigenschaften von Schnell, hoher Empfindlichkeit, starker Spezifität, gleichzeitigem Nachweis mehreren Aptamere und dergleichen auf.
    2. 2. Die vorliegende Erfindung verwendet Magnetperle als Träger des Targetmoleküls, dadurch kann magnetisches Trennen von Nachweismolekül durchgeführt werden, dabei ist die Operation einfach.
    3. 3. Der Nukleinsäureligand der vorliegenden Erfindung ist ein Nicht-Tumor (N-seq), Magenkrebs (G-seq), Leberkrebs (H-seq), Lungenkrebs (L-seq) - Serum-spezifische Nukleinsäureligandensequenze, der mittels der bidirektionalen thermischen umlaufenden subtraktiven -SELEX-Schnell Screening erhalten wird. Fluoreszenzsonden werden jeweils gemäß den Liganden vorgesehen und die Targetmolekülsignale werden durch PCR-Amplifikation exponentiell amplifiziert.
    4. 4. Nicht-Tumor (N-seq) Serum-Nukleinsäureliganden können Marker im Nicht-Tumor-Serum spezifisch erkennen und können als Negativkontrolle zum Nachweis von Tumorserum verwendet werden.
    5. 5. In der vorliegende Erfindung ist ein Nachweisreagenz, das aus Nicht-Tumor (N-seq) Serum-Nukleinsäureliganden und Magenkrebs (G-seq), Leberkrebs (H-seq), Lungenkrebs (L-seq) Serum-spezifischen Nukleinsäureliganden besteht, eingesetzt, dessen Vorteil besteht darin, dass durch Nachweis relativ klar zwischen Tumormarkern und Nicht-Tumormarkern im Serum unterscheiden kann.
  • Figurenliste
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend in Verbindung mit den Zeichnungen und spezifischen Ausführungsformen ausführlicher beschrieben.
    • 1 ist ein schematisches Diagramm des Prinzips des Nachweises von Tumor- und Nicht-Tumor-Serum durch mehrfache quantitative Echtzeit-PCR in Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend in Verbindung mit spezifischen Ausführungsformen weiter beschrieben:
    • Beispielsweise umfassen die in den folgenden Ausführungsformen verwendeten Kits die folgenden Reagenzien:
      • Reagenz 1: Fängeren von Magnetperle Reagenz: 5 ml, 0,01 M Bindepuffer mit pH 7,4, worin 50% der FängerMagnetperlepartikel mit einer Partikelgröße von 5 bis 5000 nm aufgelöst wird;
      • Reagenz 2: Nachweisreagenz: Tumorserum-spezifischer Nukleinsäureligand: Magenkrebs- (G-seq), Leberkrebs- (H-seq), Lungenkrebs- (L-seq) und Nichttumorserumspezifischer Nukleinsäureligand: Nicht-Tumor (N- seq) wird jeweils mit 0,1 × Bindepuffer in einer Mischung von 109 molekularen Kopien aufgelöst;
      • Reagenz 3: Blockierungslösung: 10 ml, einschließlich Magermilchpulver und Kasein;
      • Reagenz 4: Waschflüssigkeit 1: 10 ml, 0,01 M Bindepuffer (enthaltend 0,17% Tween) mit pH 7,4;
      • Reagenz 5: Waschflüssigkeit 2: 10 ml 3 × SSC einschließlich Zitronensäure und Natriumchlorid;
      • Reagenz 6: Quantitative Echtzeit-PCR-Reaktionslösung 1 ml, PCR-System, das ein Paar Primer und Fluoreszenzsonden mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen für Nukleinsäureligand umfasst;
  • Beispiel 1: Nachweis von Tumor- und Nicht-Tumor-Serum anhand von quantitativer Echtzeit-PCR
  • Diese Ausführungsform umfasst die folgenden Schritte:
    • (1) Vorbereiten der zu testenden Probe: Verwenden der Venenpunktion, um Blut in ein Reagenzglas mit Antikoagulans zu entnehmen, sofort vorsichtig Schütteln, um Blut und Antikoagulans zu mischen, Zentrifugieren 10 Minuten lang bei 3000 U / min, und nach 30-minütigem Einfrieren bei -80 °C Sammeln des Überstands, 12.000 g Zentrifugieren für 30 Minuten und Entfernen der Blutfette, durch Mischen und Bearbeiten mit Verhältnis von Wasser: Acetonitril: Serum = 2: 0,5: 1, Zentrifugieren mit 5000 U / min für 30 Minuten bei niedriger Temperatur und Entnehmen des Überstands, Entfernen des Proteins mit hoher Fülle, Erhalten des zu testenden Serum.
    • (2) Einfangen von Targetmolekülen anhand von Magnetperle: Nehmen 2 gleiche Mengen jeweils 50 µl von NHS-Basierender Agar-Magnetperle in ein 1,5 ml EP-Röhrchen und kennzeichnen dieser als H1 und H2. Fügen 50 µl zu testendes Serums in H1 und H2 hinzu und Platzieren 1 Stunde bei 37 °C für Inkubieren, nach 1 Stunde Blockieren bei 37 °C mit Proteinblockierungslösung 3 Mal Waschen mit Waschflüssigkeit 1, 3 Minuten / Mal, Trennen Magnetisch.
    • (3) Binden von Liganden: Nehmen jeweils 200 µl Nicht-Tumor- (N-seq), Magenkrebs- (G-seq), Leberkrebs- (H-seq) und Lungenkrebs-(L-seq) Nukleinsäureliganden-Nachweislösungen, Erhitzen 5 Minuten lang bei 95 °C. Nach schnellem Abkühlen in Eiswasser für 5 Minuten wird Nicht-Tumor (N-seq) zu H1-Magnetperle, und die Mischung von Magenkrebs (G-seq), Leberkrebs (H-seq) und Lungenkrebs (L-seq) zu H2-Magnetperle hinzugegeben, nach 1 Stunde lang bei 37 °C, Trennen magnetisch und Verwerfen des Überstands.
    • (4) Waschen: Geben der Waschflüssigkeit 2 von 0,5 ml in den obigen zwei Röhrchen zum 3-maligen Waschen, 3 Minuten / Mal, dann mit 0,5 ml Waschflüssigkeit 1 zum 3-maligen Waschen, 3 Minuten / Mal;
    • (5) Herstellen der Nachweisvorlage: Geben 15 µl 1 × PCR-Puffer zu H1- und H2-Magnetperle, 5 Minuten bei 95 °C erhitzen und den Überstand magnetisch trennen.
    • (6) Nachweis: Nehmen 2 µl H1- und H2-Überstand aus Schritt (5) und geben ihn in 18 µl quantitatives Echtzeit-PCR-Reaktionssystem (SYBRGreen I), führen quantitative Echtzeit-PCR durch, sammeln und verarbeiten die Daten.
  • Testergebnisanalyse: Ergebnis 1, CT-Wert H1 ist kleiner als H2, was anzeigt, dass die Serumprobe kein Tumorserum ist, Ergebnis 2, CT-Wert H1 ist größer als H2, was anzeigt, dass die Serumprobe Tumorserum ist.
  • Beispiel 2: Mehrfach-Echtzeit-PCR-Nachweis von Tumor- und Nicht-Tumor-Serum in
  • Diese Ausführungsform umfasst die folgenden Schritte:
    • (1) Vorbereiten der zu testenden Probe: Verwenden der Venenpunktion, um Blut in ein Reagenzglas mit Antikoagulans zu entnehmen, sofort vorsichtig Schütteln, um Blut und Antikoagulans zu mischen, Zentrifugieren 10 Minuten lang bei 3000 U / min, und nach 30-minütigem Einfrieren bei -80 °C Sammeln des Überstands, 12.000 g Zentrifugieren für 30 Minuten und Entfernen der Blutfette, durch Mischen und Bearbeiten mit Verhältnis von Wasser: Acetonitril: Serum = 2: 0,5: 1, Zentrifugieren mit 5000 U / min für 30 Minuten bei niedriger Temperatur und Entnehmen des Überstands, Entfernen des Proteins mit hoher Fülle, Erhalten des zu testenden Serum.
    • (2) Herstellen des Magnetperle-Targetmolekül-komplexes: Geben 50 µl Fängermagnetperle aus agar in ein 1,5 ml EP-Röhrchen, Geben 50 µl des zu testenden Serums, Inkubieren für 1h bei 37 °C, Waschen 3 mal mit Waschflüssigkeit 1, 3 Minuten / Mal, Trennen magnetisch. (Hinweis: Nukleinsäureliganden-Fängeragar-Magnetperle sind Fängermagnetperle, die durch Kopplung von Streptavidin über chemische Bindungen und anschließende durch Bindung von biotinylierten Liganden über Avidin ausgeformt. Die Liganden zum Fängeren des Targetmolekül kann sowohl Nachweisliganden, als auch ein Targetmolekülspezifischer Ligand sein, der durch Screening verschiedener Nukleinsäurebibliotheken erhalten wird; andere Fängermagnetperle können auch durch chemische Bindung an Antikörper oder Antigene gekoppelt werden, um Fängermagnetperle zu formen, oder das Targetmolekül durch chemische Kopplung einzufangen).
    • (3) Binden von Liganden: Erhitzen der gemischten Nachweislösung 200µl aus Nicht-Tumor- (N-seq), Magenkrebs- (G-seq), Leberkrebs- (H-seq) und Lungenkrebs-(L-seq) Nukleinsäureliganden für 5 Minuten bei 95 °C, nach schnellem Abkühlen in Eiswasser für 5 Minuten zu den Magnetperle von Schritt (2) geben, 1 Stunde bei 37° C halten für Bindung, magnetisch trennen und den Überstand verwerfen.
    • (4) Waschen: Geben der Waschflüssigkeit 2 von 0,5 ml in das Röhrchen und zum 3-maligen Waschen, 3 Minuten / Mal, dann mit 0,5 ml Waschflüssigkeit 1 zum 3-maligen Waschen, 3 Minuten / Mal;
    • (5) Herstellen der Nachweisvorlage: Geben 15 µl 1 × PCR-Puffer zu Magnetperle, 5 Minuten bei 95 °C erhitzen und den Überstand magnetisch trennen.
    • (6) Mehrfach-PCR-Nachweis: Nehmen 2 µl des Überstands aus Schritt (5) und zu 18 µl quantitative Echtzeit-PCR-Reaktionslösung hinzugeben. In Bezugnahme auf das in 1 gezeigte Prinzip,die Reaktionslösung enthält die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Primer P7 und P11 des Liganden sowie mittels TaqMan Sonden mit vier verschiedenen Wellenlängen markierte Nicht-Tumor- (N-seq), Magenkrebs- (G-seq), Leberkrebs- (H-seq) und Lungenkrebs- (L-seq) Nukleinsäureligand. Die Emissionswellenlängen der Sonden liegen in 4 Kanälen, dabei finden quantitative Mehrfach-Echtzeit-PCR statt, Erfassen und Verarbeiten von Daten.
  • Testergebnisanalyse: Ergebnis 1, CT-Wert: Der erste Kanal ist kleiner als der zweite, dritte und vierte Kanal, was darauf hinweist, dass die Serumprobe kein Tumorserum ist. Ergebnis 2, CT-Wert: Der zweite Kanal ist kleiner als der erste, dritte und vierte Kanal, was darauf hinweist, dass das Serum Die Probe kann Magenkrebs-Serum sein, Ergebnis 3, CT-Wert: Der dritte Kanal ist kleiner als der erste, zweite und vierte Kanal, was darauf hinweist, dass die Serumprobe Leberkrebs-Serum sein kann; Ergebnis 4. CT-Wert: Der vierte Kanal ist kleiner als der erste, zweite und dritte Kanal, was darauf hinweist, dass die Serumprobe Lungenkrebs-Serum sein kann.
  • Es sollte notiert werden:
    1. 1. Wenn die Nachweisprobe mehr als die Kapazität von 4 Kanälen des quantitativen Echtzeit-PCR-Nachweises ist, kann jedes Röhrchen des PCR-Systems mit einer zusätzlichen Referenz versehen und zum Nachweis von 3 Proben verwendet. Zum Nachweis von zehn Arten von Tumoren kann es beispielsweise in vier Gruppen von PCR-Nachweissystemen unterteilt werden. In jeder Gruppe werden TaqMan-Sonden mit Nicht-Tumor-Nukleinsäureliganden als Referenz für Fehler zwischen PCR-Röhrchen verwendet.
    2. 2. Wenn jeder Tumor mehr als zwei Liganden hat, kann solche zusammen gruppiert werden. Die TaqMan-Sonde verwendet eine Emissionswellenlänge und wird in einem PCR-Nachweissystem nachweisen.
    3. 3. In dieser Ausführungsform können je nach Bedarf bei verschiedener Probenmarker verschiedene Nukleinsäurebibliotheken verwendet werden, um Liganden zu screenen. Auf diese Weise können während des Probennachweises verschiedene Primer-PCR-Systeme für dieselbe Nachweisvorlage verwendet werden, um Markerinformationen zu erhalten und den Probentyp zu bestimmen.
  • Beispiel 3: Gensequenzierung zum Nachweis von Tumor- und Nicht-Tumor-Serum
  • Diese Ausführungsform umfasst die folgenden Schritte:
    • (1) Vorbereiten der zu testenden Probe: Verwenden der Venenpunktion, um Blut in ein Reagenzglas mit Antikoagulans zu entnehmen, sofort vorsichtig Schütteln, um Blut und Antikoagulans zu mischen, Zentrifugieren 10 Minuten lang bei 3000 U / min, und nach 30-minütigem Einfrieren bei -80 °C Sammeln des Überstands, 12.000 g Zentrifugieren für 30 Minuten und Entfernen der Blutfette, durch Mischen und Bearbeiten mit Verhältnis von Wasser: Acetonitril: Serum = 2: 0,5: 1, Zentrifugieren mit 5000 U / min für 30 Minuten bei niedriger Temperatur und Entnehmen des Überstands, Entfernen des Proteins mit hoher Fülle, Erhalten des zu testenden Serum.
    • (2) Herstellen des Magnetperle-Targetmolekül-komplexes: Geben 50 µl Fängermagnetperle aus agar in ein 1,5 ml EP-Röhrchen, Geben 50 µl des zu testenden Serums, Inkubieren für 1h bei 37 °C, Waschen 3 mal mit Waschflüssigkeit 1, 3 Minuten / Mal, Trennen magnetisch. (Hinweis: Nukleinsäureliganden-Fängeragar-Magnetperle sind Fängermagnetperle, die durch Kopplung von Streptavidin über chemische Bindungen und anschließende durch Bindung von biotinylierten Liganden über Avidin ausgeformt. Die Liganden zum Fängeren des Targetmolekül kann sowohl Nachweisliganden, als auch ein Targetmolekülspezifischer Aptamer sein, der durch Screening verschiedener Nukleinsäurebibliotheken erhalten wird; andere Fängermagnetperle können auch durch chemische Bindung an Antikörper oder Antigene gekoppelt werden, um Fängermagnetperle zu formen, oder das Targetmolekül durch chemische Kopplung einzufangen).
    • (3) Binden von Liganden: Erhitzen der gemischten Nachweislösung 200 µl mit Schlusskonzentration von 109 aus Nicht-Tumor- (N-seq), Magenkrebs-(G-seq), Leberkrebs- (H-seq) und Lungenkrebs-(L-seq) Nukleinsäureliganden für 5 Minuten bei 95 °C, nach schnellem Abkühlen in Eiswasser für 5 Minuten zu den Magnetperle von Schritt (2) geben, 1 Stunde bei 37 °C halten für Bindung, magnetisch trennen und den Überstand verwerfen.
    • (4) Waschen: Geben der Waschflüssigkeit 2 von 0,5 ml in das Röhrchen und zum 3-maligen Waschen, 3 Minuten / Mal, dann mit 0,5 ml Waschflüssigkeit 1 zum 3-maligen Waschen, 3 Minuten / Mal;
    • (5) Herstellen der Nachweisvorlage: Geben 15 µl 1 × PCR-Puffer zu Magnetperle, 5 Minuten bei 95 °C erhitzen und den Überstand magnetisch trennen.
    • (6) Gensequenzierung: Sequenzieren des in Schritt (5) erhaltenen Überstands durch das Sequenzierungsverfahren der zweiten oder dritten Generation, und dann Analysieren jedes Liganden. Zusammenfassend: die Kopienzahl des Liganden repräsentiert die Anzahl spezifischer Targetmoleküle und auch die Art des getesteten Serums.
  • Es versteht sich, dass der Durchschnittsfachmann auf der Grundlage der obigen Beschreibung Verbesserungen oder Änderungen vornehmen kann, und alle diese Verbesserungen und Änderungen sollten in den Schutzbereich der beigefügten Ansprüche der vorliegenden Erfindung fallen.
  • Die vorliegende Erfindung ist oben als Beispiel beschrieben. Offensichtlich ist die Realisierung des Patents für die vorliegende Erfindung nicht durch die obigen Verfahren beschränkt, solange verschiedene Verbesserungen, die durch das Verfahrenskonzept und die technische Lösung des Patents für die vorliegende Erfindung vorgenommen wurden, übernommen werden oder ohne Verbesserung die Patentierte Konzepte und technische Lösungen direkt auf andere Gelegenheiten angewendet werden, liegen alle im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung.

Claims (9)

  1. Kit zum Nachweis des Target-Tumorserums-Nukleinsäureligand-Komplexes, dadurch gekennzeichnet, dass es Fängermagnetperlenreagenz, eine Blockierungslösung, ein Nachweisreagenz, eine Waschflüssigkeit und eine quantitative Echtzeit-PCR-Reaktionslösung umfasst, wobei die Fängermagnetperle mit einer Partikelgröße von 5 bis 5000 nm in dem Fängermagnetperlenreagenz gelöst wird; wobei die Blockierungslösung sich um eine Proteinblockierungslösung handelt; wobei Tumor- und Nicht-Tumor-Serum-spezifische Nukleinsäureligandensätze im Nachweisreagenz gelöst werden; wobei die quantitative Echtzeit-PCR-Reaktionslösung einen Primer und fluoreszierende Sonden für Nukleinsäureligand enthält.
  2. Kit zum Nachweis des Target-Tumorserums-Nukleinsäureligand-Komplexes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumor- und Nicht-Tumor-Serum-spezifischen Nukleinsäureligandensätze mittels der bidirektionalen thermischen umlaufenden subtraktiven -SELEX-Technologie-Screening erhalten werden..
  3. Kit zum Nachweis des Target-Tumorserums-Nukleinsäureligand-Komplexes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäureliganden in den Tumor- und Nicht-Tumor-Serum-spezifischen Nukleinsäureligandensätze mit der fluoreszierenden Sonde eins zu eins entsprechen.
  4. Kit zum Nachweis des Target-Tumorserums-Nukleinsäureligand-Komplexes nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszierende Sonde mindestens eine MGB-Sonden, TaqMan-Sonden und Molecular Beacon umfasst, wobei die fluoreszierende Sonde für die Nukleinsäureligandensequenz ausgelegt ist.
  5. Kit zum Nachweis des Target-Tumorserums-Nukleinsäureligand-Komplexes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche der FängerMagnetperle eine funktionelle Gruppe oder ein Fängermolekül, das mit einem Targetmolekül koppeln kann, aufweist, wobei die funktionelle Gruppe mindestens eine der Epoxygruppen, Carboxylgruppen, Aminogruppen und NHS umfasst, wobei es über eine chemische Gruppe an das Targetmolekül gekoppelt sein kann, wobei das Fängermolekül eines oder mehrere von der Gruppe aus Antigen-, Antikörper-, Affinitätsprotein- und Nukleinsäureliganden ist, wobei das Targetmolekül durch Immunbindung, Proteinliganden-Aptamer-Bindung oder Nukleinsäureliganden-Aptamer-Bindung eingefangen werden kann, wobei das Targetmolekül mindestens eines oder mehrere der Gruppe aus Nukleinsäure, Proteine, Lipide, Aminosäuren und anderen biologischen Molekülen enthält.
  6. Kit zum Nachweis des Target-Tumorserums-Nukleinsäureligand-Komplexes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Nachweisreagenz die gegen Nicht-Tumorserum mittels SELEX subtraktiven Screening gescreente Magenkrebs-, Leberkrebs- und Lungenkrebs-Tumorserum- spezifische Nukleinsäureliganden sowie die gegen Tumorserum mittels SELEX subtraktiven Screening gescreente Nicht-Tumorserum-spezifische Nukleinsäureliganden aufgelöst werden.
  7. Kit zum Nachweis des Target-Tumorserums-Nukleinsäureligand-Komplexes nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Waschflüssigkeit eine erste Waschflüssigkeit und eine zweite Waschflüssigkeit umfasst und wobei die erste Waschflüssigkeit ein Bindepuffer mit einem darin gelösten Tween ist, wobei die zweite Waschflüssigkeit SSC mit darin gelöster Zitronensäure und Natriumchlorid ist.
  8. Kit zum Nachweis des Target-Tumorserums-Nukleinsäureligand-Komplexes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Blockierungslösung Magermilchpulver und Kasein oder Rinderserumalbumin umfasst.
  9. Kit zum Nachweis des Target-Tumorserums-Nukleinsäureligand-Komplexes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Primer ein Ligandenprimer ist, und wobei die Sonde eine 5-25-Basensequenz auf der Ligandensequenz ist, wobei Sequenz 3' und 5' mit Löschgruppe und fluoreszierender Gruppe endet.
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