CN102391372B - 一种肝癌药物治疗的靶标及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于医学肿瘤学技术领域的一种肝癌药物治疗的靶标Vasorin蛋白及其应用。本发明通过液相差异SELEX的方法，以伴肝外转移的AFP阴性HCC患者血清为靶标，以正常人血清为消减靶标，获得特异识别肝癌患者血清的富集单链DNA文库，然后，利用凝胶阻滞的方法，鉴定出一个与正常血清成分差异差异蛋白-Vasorin蛋白。RNAi沉默Vasorin蛋白的表达后，细胞凋亡增加，细胞迁移减弱，证实Vasorin蛋白是肝癌治疗的有效靶标。

Description

一种肝癌药物治疗的靶标及其应用

技术领域

本发明属于医学肿瘤学技术领域，具体涉及一种肝癌药物治疗的靶标Vasorin蛋白及其应用。

背景技术

指数富集的配基系统进化技术，简称SELEX(Systematic Evolution ofLigands by EXponential Enrichment)技术，是近十几年兴起并迅速得到发展的高通量生物文库筛选技术。应用大容量的随机寡核苷酸文库(ssDNA文库和RNA文库)，结合PCR体外扩增技术，以指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过反复的体外筛选、扩增，最终获得的寡核苷酸配基(aptamer)。由于aptamer具有精确识别、无免疫原性、易体外合成与修饰等优点，又称为“人工替代抗体”，在基础医学、临床诊断与新药研发等方面具有广阔的应用前景。尤其是近年来兴起的复合靶SELEX技术，使得对未知靶分子进行筛选成为可能，并且通过引入消减筛选步骤，能够获得特异识别两组复合靶子中差异存在分子的aptamer，并能利用该配基反过来对差异靶分子进行研究，这就为开发新型分子探针以及鉴定生物标志物，尤其是肿瘤标志物分子开辟了新的途径。

发明人通过液相差异SELEX的方法，从伴肝外转移的AFP阴性HCC患者血清中鉴定出一个与正常血清成分差异的蛋白，Vasorin(VASN)蛋白。该蛋白与肿瘤的关系还鲜有报道。有研究发现，VASN通过与TGF-β结合阻断TGF-β信号通路，参与新生血管形成。其相似蛋白SLIT蛋白在多种实体瘤中高表达，参与肿瘤诱导的新生血管形成和促进肿瘤细胞的增殖与抗凋亡，与肿瘤的恶性程度相关。最新的一篇文献证实，VASN在人胶质母细胞瘤中高表达，它作为HIF-1的靶子，能够抑制TNFα和低氧诱导的细胞凋亡，有可能作为人胶质母细胞瘤的潜在诊断标志物或药物治疗靶标。应用分泌蛋白组学的方法分析药物治疗前后对人甲状腺癌细胞株TPC-1分泌蛋白的影响，发现VASN蛋白水平在治疗后下降。目前尚未见有关Vasorin蛋白与肝癌相关的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肝癌药物治疗的靶标--Vasorin蛋白。

本发明的目的还在于提供上述肝癌药物治疗的靶标的鉴定方法。

本发明的目的还在于提供上述肝癌药物治疗的靶标在鉴定肝癌中的应用。

本发明的目的还在于提供以Vasorin蛋白为靶标的治疗肝癌的药物。

一种肝癌药物治疗的靶标，所述靶标为Vasorin蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

上述肝癌药物治疗的靶标的鉴定方法，其特征在于，首先通过液相差异SELEX的方法，以伴肝外转移的AFP阴性HCC患者血清为靶标，以正常人血清为消减靶标，获得特异识别肝癌患者血清的富集单链DNA文库；然后，利用凝胶阻滞的方法，从与富集单链DNA文库结合的蛋白中鉴定出一个与正常血清成分差异的蛋白，即Vasorin蛋白。

上述肝癌药物治疗的靶标在鉴定肝癌中的应用。

以Vasorin蛋白为靶标的治疗肝癌的药物，所述药物为Vasorin的抗体或siRNA。

所述siRNA的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示。

本发明的有益效果：本发明利用免疫印迹、ELISA等方法证实，Vasorin蛋白在肝癌患者血清中是高表达的。以肝癌细胞株HepG2细胞为模型，RNAi沉默Vasorin蛋白的表达后，细胞凋亡增加，细胞迁移减弱，证实Vasorin蛋白是治疗的有效靶标。

附图说明

图1为EMSA鉴定第五轮富集文库与肝癌血清的结合。

图2为Western Blot的方法鉴定Vasorin蛋白在肝癌血清与正常血清中的表达水平。

图3为ELISA的方法鉴定Vasorin蛋白在肝癌血清与正常血清中的表达水平；

其中，N1，N2，N3为正常人血清标本；P1-P8为肝癌患者血清标本。

图4为Western Blot的方法鉴定Vasorin蛋白在肿瘤细胞株的表达；

其中，7721、HepG2为人肝癌细胞株，L02为人永生化正常肝细胞。

图5为激光共聚焦检测Vasorin蛋白在HepG2细胞中的定位；

其中，a-FITC通道检测VASN信号，b-Evans兰衬染细胞去除背景荧光，c-DAPI染色细胞核，d-三个通道的叠加图。

图6为siRNA沉默Vasorin蛋白在HepG2细胞中的表达；

其中，a为Q-PCR验证沉默效果，b为Western Blot验证沉默效果。

图7为MTT细胞增殖实验检测Vasorin沉默后HepG2细胞生长变化。

图8为细胞划痕和transwell迁移实验检测Vasorin沉默后HepG2细胞迁移变化；

其中，上排为划痕实验，下排为transwell细胞迁移实验。

图9为流式检测Vasorin沉默后肝癌细胞凋亡变化；

其中，圆圈圈出部分为晚期凋亡细胞。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。

以下实施例并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书。

实施例1

通过利用液相差异SELEX的方法，从伴肝外转移的AFP阴性HCC患者血清中鉴定出Vasorin蛋白。

1、合成随机单链DNA寡核苷酸文库和相应的引物

GP45文库：

5’-GCAATGGTACGGTACTTCC(45N)CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’(SEQ ID No.2)。

引物：

正义引物(Plong-1)：5’-GCAATGGTACGGTACTTCC-3’(SEQ ID No.3)。

反义引物(P11)：5’-ttagCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3’(SEQ ID No.4)。

反义引物(Pstem-loop)：

5’-GCTAAGCGGGTGGGACTTCCTAGTCCCACCCGCTTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3’(SEQ ID No.5)。

Plong-1与P11用于扩增双链产物，Plong-1与Pstem-loop用于扩增单链产物。

上述单链DNA(ssDNA)均由上海生工公司合成。

2、EMSA-SELEX筛选

将一定浓度的ssDNA文库溶解于合适体积的缓冲液中，于100℃变性5min后立即置于冰上充分冷却(第1轮筛选ssDNA文库的用量为1,500pmol，以后每轮筛选的投入量递减)；然后将ssDNA文库与AFP阴性HCC患者血清在37℃共孵育2h(随着筛选轮数的增加可适当减少孵育时间，以增加筛选配基的亲和力和特异性)；ssDNA文库与蛋白的共同孵育体系加入10X上样缓冲液，6％天然PAGE分离；卸胶，核酸染色后置于紫外灯下观察。对照GP45的原库的位置，将这一位置以上的胶切胶(由于ssDNA与蛋白相结合后泳动速度变慢，所以高于GP35的位置)，经凝胶洗脱缓冲液洗脱6h以上后，乙醇沉淀回收其中的核酸。

3、基于EMSA分离的消减SELEX筛选

将文库用筛选缓冲液溶解，于100℃变性5min后立即置于冰上充分冷却；文库与正常人血清在37℃共孵育2h；将孵育体系进行6％的天然PAGE分离；卸胶，核酸染色，置于紫外灯下观察。对照GP45的原库的位置，将该位置的胶切胶，经凝胶洗脱缓冲液洗脱6h以上后，乙醇沉淀回收，获得消减文库。

4、文库的扩增

将乙醇沉淀回收到ssDNA用适量的水溶解后，加入PCR反应体系直接扩增；PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性1min，37℃退火80sec，58℃延伸1min，扩增3个循环；最后58℃终延伸5min。再次PCR确定最终扩增循环数：取10ul上述PCR产物为模板，再次PCR扩增，从12个循环开始，每3个循环取样，8％7M尿素胶分析。选择目标条带PCR产量大、无杂带的循环数为合适循环数，将剩余90ul PCR产物全部扩增。将全部扩增的PCR产物通过8％7M尿素胶回收，凝胶洗脱缓冲液洗脱后再乙醇沉淀回收，核酸定量仪确定ssDNA的量，用于下一轮的筛选。

5、重复n轮筛选

第一轮仅阳性筛选，自第二轮开始消减筛选，消减后的文库进行阳性筛选，回收后的文库扩增后投入下一轮筛选。如此重复5轮筛选。

6、质谱鉴定生物标志物

将第四轮筛选后文库扩增，首先进行消减筛选，切胶回收消减文库；消减文库与筛选靶标共孵育，孵育后的体系加入10X上样缓冲液，6％天然PAGE分离；卸胶，核酸染色后置于紫外灯下观察，可见明显的阻滞条带；将阻滞条带切胶，酶解后进行生物质谱鉴定，同时，将无文库孵育的筛选靶标电泳泳道对应位置切胶，同样酶解后进行质谱鉴定(用于扣除迁移速率与阻滞复合物迁移相同的蛋白)。

7、质谱结果分析、验证

Vasorin蛋白在肝癌患者血清中的表达水平分析：取肝癌患者血清及正常血清；试剂盒的方法去除高丰度蛋白(白蛋白、IgG等)；取等量样品加入6×SDS上样缓冲液，行12％SDS-PAGE分离；卸胶，转膜，Vasorin单抗WB检测蛋白水平。

Vasorin蛋白在肝癌细胞系中的表达水平分析：培养肿瘤细胞与正常细胞；收集细胞，用细胞裂解液裂解获取总蛋白；BCA试剂盒定量细胞总蛋白；取等量细胞总蛋白，加入6×SDS上样缓冲液，行12％SDS-PAGE分离；卸胶，转膜，Vasorin单抗免疫印迹的方法检测蛋白水平，GAPDH作为内部参照。

8、Vasorin蛋白在HepG2细胞内的亚定位研究

培养细胞，细胞爬片；无水甲醇固定，-20℃固定过夜；细胞爬片用PBS洗三次，利用Vasorin单抗和FITC标记二抗进行免疫细胞染色，DAPI染色细胞核5min，伊文氏蓝衬染全细胞，激光共聚焦显微镜观察绿色荧光信号及其定位。

9、RNAi沉默Vasorin蛋白在HepG2细胞的表达

根据Vasorin蛋白的mRNA序列，合成其siRNA：正义链5’-CAGCCUUGUCUUCUAGCUUdTdT-3’(SEQ ID No.6)；反义链3’-dTdTGUCGGAACAGAAGAUCGAA-5’(SEQ ID No.7)；细胞接种6孔板，lipo2000转染siRNA及NC对照；转染6小时后，更好细胞培养液；转染48小时后，试剂盒的方法提取细胞总蛋白，Western Blot检测Vasorin蛋白表达水平，GAPDH作为内部参照。

10、沉默Vasorin蛋白后HepG2细胞增殖检测

根据Vasorin蛋白的mRNA序列，合成其siRNA；细胞接种96孔板，lipo2000转染siRNA及NC对照；转染6小时后，更好细胞培养液；转染前、转染后12、24、36、48、60、72小时，改良MTT法检测A595。

11、沉默Vasorin蛋白后HepG2细胞迁移变化

根据Vasorin蛋白的mRNA序列，合成其siRNA；细胞接种24孔板，lipo2000转染siRNA及NC对照；转染6小时后，更好细胞培养液培养12小时后细胞撤血清饥饿12小时；将细胞重新接种于Transwell小室，8小时后结晶紫染色计穿过细胞数。

12、沉默Vasorin蛋白后HepG2细胞凋亡检测

根据Vasorin蛋白的mRNA序列，合成其siRNA；细胞接种6孔板，lipo2000转染siRNA及NC对照；转染6小时后，更好细胞培养液；转染48小时后，凋亡试剂盒染色，流式检测。

实验结果：

通过建立的基于EMSA分离的消减SELEX筛选，获得了特异识别肝癌患者血清的富集文库。由图1可以得到结论，第五轮文库能够与肝癌血清中的特异成分结合，导致泳动速率变慢，在天然PAGE凝胶中产生阻滞的条带(箭头所示)，而与正常血清成分无结合。

经过质谱鉴定，与第五轮富集文库特异结合的血清蛋白为Vasorin蛋白。

由图2及图3可以得到结论：肝癌患者血清中的Vasorin水平高于正常人血清中的Vasorin蛋白水平。在受测试的8例肝癌患者血清中，有6例患者Vasorin血清水平高于正常对照(Western Blot方法)；而经过ELISA方法验证，有5例患者血清Vasorin为阳性，正常对照均为阴性。

由图4可以得到结论：肝癌肿瘤细胞株7721和HepG2中的VASN蛋白表达水平高于永生化的正常细胞L02中的表达水平。

由图5可以得到结论：Vasorin蛋白表达在HepG2细胞表面及细胞质中，因此，Vasorin具有药物治疗靶标的应用前景。

由图7-图9可以得到结论：HepG2细胞中Vasorin蛋白表达水平被siRNA沉默(图6)后，细胞的增殖变慢(图7，siRNA组)，迁移变弱(图8，siRNA组)，细胞凋亡增加(图9，siRNA组)，证实Vasorin是有效的药物治疗靶标。

Claims (1)

1.Vasorin的siRNA在制备治疗肝癌的药物中的应用，所述siRNA的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示。