CN104450712B - 一种特异识别Vasorin(VASN)蛋白的寡核苷酸配基V4‑2的序列和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了属于分子生物医学技术领域的一种特异识别Vasorin(VASN)蛋白的寡核苷酸配基V4‑2的序列和应用。本发明设计V4‑2特异性的序列，采用5’端或3’端修饰、标记(如FITC、生物素或者地高辛)的方法检测V4‑2能够特异识别Vasorin(VASN)蛋白。V4‑2作为试剂盒的组成部分或者检测指标，用于肝癌的辅助诊断、靶向治疗或者进行肝癌疾病发生、发展、进程相关的基础研究等。本发明的方法简单，迅速，灵敏，适用于临床肿瘤血清标本的辅助诊断、肿瘤生物导向治疗，具有广泛临床应用和基础应用前景。

Description

一种特异识别Vasorin(VASN)蛋白的寡核苷酸配基V4-2的序 列和应用
发明领域：
本发明涉及特异识别Vasorin(VASN)蛋白的寡核苷酸配基V4-2的序列和修饰，以及修饰后的V4-2在识别Vasorin(VASN)蛋白方面的应用。本发明涉及V4-2在生物医药方面的应用。V4-2作为试剂盒的组成部分或者检测指标，用于肝癌的辅助诊断或者进行肝癌疾病发生、发展、进程相关的基础研究等。V4-2作为载体递送药物靶向肝癌细胞方面的应用。
背景技术：
指数富集的配基系统进化技术，简称SELEX(Systematic Evolution of Ligandsby EXponential Enrichment)技术，是近十几年兴起并迅速得到发展的高通量生物文库筛选技术。应用大容量的随机寡核苷酸文库(ssDNA文库和RNA文库)，结合PCR体外扩增技术，以指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过反复的体外筛选、扩增，最终获得的寡核苷酸配基(aptamer)基于空间结构与靶分子呈高特异性和高亲和力的结合。由于aptamer具有精确识别、无免疫原性、易体外合成与修饰等优点，又称为“人工替代抗体”，在基础医学、临床诊断与新药研发等方面具有广阔的应用前景。尤其是近年来兴起的复合靶SELEX技术，使得对未知靶分子进行筛选成为可能，并且通过引入消减筛选步骤，能够获得特异识别两组复合靶子中差异存在分子的aptamer，并能利用该配基反过来对差异靶分子进行研究，这就为开发新型分子探针以及鉴定生物标志物，尤其是肿瘤标志物分子开辟了新的途径。
我们从伴肝外转移的AFP阴性HCC患者血清中鉴定出一个与正常血清成分差异的蛋白，Vasorin(VASN)蛋白。有研究发现，VASN通过与TGF-β结合阻断TGF-β信号通路，参与新生血管形成。其相似蛋白SLIT蛋白在多种实体瘤中高表达，参与肿瘤诱导的新生血管形成和促进肿瘤细胞的增殖与抗凋亡，与肿瘤的恶性程度相关。最新的一篇文献证实，VASN在人胶质母细胞瘤中高表达，它作为HIF-1的靶子，能够抑制TNFα和低氧诱导的细胞凋亡，有可能作为人胶质母细胞瘤的潜在诊断标志物或药物治疗靶标。应用分泌蛋白组学的方法分析药物治疗前后对人甲状腺癌细胞株TPC-1分泌蛋白的影响，发现VASN蛋白水平在治疗后下降。
本发明是通过SELEX技术获得了一个寡核苷酸配基V4-2。经鉴定，V4-2能够特异识别Vasorin(VASN)蛋白，而不结合其他蛋白，对照核酸序列与上述蛋白均无结合，目前尚未见能特异结合Vasorin(VASN)蛋白的核酸适配体的相关研究报道。
发明内容：
本发明目的在于提出特异识别Vasorin(VASN)蛋白的寡核苷酸配基VA-2的序列及其应用领域，包括V4-2作为试剂盒的组成部分或者检测指标，用于肝癌的辅助诊断或者进行肝癌疾病发生、发展、进程相关的基础研究等。V4-2作为载体递送药物靶向肝癌细胞方面的应用。本发明通过以下技术方案实现：
首先由Invitrogen公司合成V4-2序列，并在5’端或3’端修饰、标记(如FITC、生物素或者同位素)，然后进行应用研究：组织化学或荧光方法检测V4-2识别Vasorin(VASN)蛋白。
本发明优点：
1)与蛋白类的抗体相比，单链的寡核苷酸更加稳定；aptamer可直接体外合成、标记，因此不需要标记的二抗，使得操作更为简单、迅速；aptamer的合成成本较抗体制备成本低，周期短。
2)本发明证实V4-2能够特异识别Vasorin(VASN)蛋白。因此，V4-2序列在临床医学与基础医学的肿瘤研究相关领域中均具有广泛的应用价值和广阔的市场前景。
附图说明：
图1EMSA实验证实V4-2所结合的靶蛋白为Vasorin(VASN)蛋白。
图2ELISA实验证实V4-2所结合的靶蛋白为Vasorin(VASN)蛋白。
具体实施方式：
下面通过V4-2对Vasorin(VASN)蛋白的识别来进一步描述本发明。
本发明通过以下技术方案实现：
1.通过同位素以及生物素标记的V4-2对Vasorin(VASN)蛋白的特异识别来进一步描述本发明。
1.1合成V4-2(序列表中SEQ ID No.1)、GP35(序列表中SEQ ID No.2)和GP45(序列表中SEQ ID No.3)序列，通过置换反应使V4-2、GP35和GP45的5’端标记上γ-32P-ATP。
γ-32P-V4-2：
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGGTGGCTGGTGATGGGGGGCTGTATGCTGGTGTTGTATTGCCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’
γ-32P-GP35：
5’-GCAATGGTACGGTACTTCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’
γ-32P-GP45：
5’-GCAATGGTACGGTACTTCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’
注：N代表A、T、G、C任意一种。
1.2..合成V4-2、GP35和GP45序列，均在5’端标记Bio(Invitrogen公司完成)。
Bio-V4-2：
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGGTGGCTGGTGATGGGGGGCTGTATGCTGGTGTTGTATTGCCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’
Bio-GP35：
5’-GCAATGGTACGGTACTTCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’
Bio-GP45：
5’-GCAATGGTACGGTACTTCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’
注：N代表A、T、G、C任意一种。
1.2EMSA鉴定γ-32P-ATP标记的V4-2对Vasorin(VASN)蛋白的特异识别
2.1将一定浓度的γ-32P-ATP标记的V4-2、GP35和GP45溶解于合适体积的缓冲液中(1×PBS-1mmolMgCl2)，于100℃变性5min后立即置于冰上充分冷却；
2.2将经过变性处理后的γ-32P-ATP标记的V4-2、GP35和GP45与Vasorin(VASN)蛋白在37℃共孵育40min；
2.3aptamer与Vasorin(VASN)蛋白的共同孵育体系加入10×DNA上样缓冲液，6％天然PAGE胶电泳分离；
2.4卸胶，压片，扫描留图。
3.ELISA方法鉴定生物素标记的V4-2特异识别Vasorin(VASN)蛋白
3.1一定量的Vasorin(VASN)蛋白融于pH9.7的碳酸盐缓冲液中，按照100μl/孔加入到酶联条中，4℃包被蛋白过夜；
3.2弃包被液，每孔加入100μl含1％casein蛋白的马来酸封闭液，室温封闭60min；
3.3将不同浓度的Bio-V4-2、Bio-GP35和Bio-GP45溶解于合适体积的缓冲液中(1×PBS-1mmolMgCl2)，于100℃变性5min后立即置于冰上充分冷却；
4.4将经过变性处理后的Bio-V4-2、Bio-GP35和Bio-Gp45文库加入酶联条中，使核酸序列与包被的蛋白共同孵育37℃3h；
4.5弃去孔内液体，每孔用350μl的洗涤液洗涤，重复洗涤3次，最后一次洗涤后要把孔内液体完全甩干；
4.6每孔加入100μl按照1∶100稀释好的HRP酶，室温孵育40min，弃去孔内液体，洗板5次，方法同上；
4.7每孔加入100μl TMB显色底物，37℃避光显色，当有明显颜色变化时，加10μl终止液，酶联仪读数。
实验结果：
EMSA方法和ELISA方法均证明V4-2特异结合Vasorin(VASN)蛋白
由图1可以得到结论：EMSA实验证明V4-2特异识别Vasorin(VASN)蛋白，而阴性对照序列则与该蛋白无结合。
由图2可以得到结论：ELISA实验证明V4-2能够特异结合Vasorin(VASN)蛋白，且结合存在剂量效应关系，而对照序列与Vasorin(VASN)蛋白无结合。
总之，V4-2能够特异识别Vasorin(VASN)蛋白，具有广泛临床应用价值。

Claims (4)

1.一种特异识别Vasorin(VASN)蛋白的寡核苷酸配基V4-2的序列，其特征在于，所述的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1中所述序列，其特征在于，所述寡核苷酸配基V4-2为体外化学合成，或通过PCR分子生物学方法制备而成。
3.根据权利要求1中所述序列，其特征在于，所述寡核苷酸配基V4-2的5’端或3’端为经FITC、生物素或地高辛标记。
4.权利要求1中所述寡核苷酸配基V4-2在制备肿瘤研究试剂、临床肿瘤标本的鉴别试剂及肿瘤生物导向治疗药物中的应用。
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