CN106093437B - 一种DNA pulldown方法及试剂盒 - Google Patents

一种DNA pulldown方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN106093437B
CN106093437B CN201610633292.1A CN201610633292A CN106093437B CN 106093437 B CN106093437 B CN 106093437B CN 201610633292 A CN201610633292 A CN 201610633292A CN 106093437 B CN106093437 B CN 106093437B
Authority
CN
China
Prior art keywords
magnetic bead
dna
added
probe
buffer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610633292.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106093437A (zh
Inventor
王晓香
董先辉
张娟
曾健
周剑
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GUANGZHOU BIOSENSE BIOSCIENCE Co Ltd
Original Assignee
GUANGZHOU BIOSENSE BIOSCIENCE Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GUANGZHOU BIOSENSE BIOSCIENCE Co Ltd filed Critical GUANGZHOU BIOSENSE BIOSCIENCE Co Ltd
Priority to CN201610633292.1A priority Critical patent/CN106093437B/zh
Publication of CN106093437A publication Critical patent/CN106093437A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106093437B publication Critical patent/CN106093437B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种DNA pulldown方法及试剂盒。所述方法包含以下步骤：S1、磁珠预处理：使用BSA(牛血清白蛋白)和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；S2、制备探针‑磁珠复合物；S3、提取并预处理细胞核蛋白：向提取核蛋白样品中加入脱氧核糖核酸酶孵育，再加入磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；S4、pulldown；S5、蛋白样品的收集。本发明具有如下有益效果：本发明通过预先使用BSA、寡核苷酸随机引物封闭磁珠，降低了磁珠与蛋白、基因组DNA的非特异性结合。本发明通过系统性核酸酶防护，防止核酸酶的污染，增加了实验的稳定性和可靠性，重复性好，简化了实验流程。

Description

一种DNA pulldown方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于研究DNA与蛋白相互作用的DNApulldown方法及试剂盒。
背景技术
随着功能基因组学的兴起，蛋白质-DNA相互作用的研究变得越来越重要。蛋白质-DNA相互作用涉及很多生物学功能，如基因调节、DNA修复和DNA重组(ROHS R,JIN X,WEST SM,et al.2010.Origins of specificity in protein-DNA recognition.Annu RevBiochem[J],79:233-269)。现有研究DNA-蛋白相互作用的技术方案有多种，如酵母单杂交(Y1H)方法、ChIP-seq方法、凝胶迁移实验(EMSA)和DNA pulldown方法。
DNA pulldown方法是一种非常重要的蛋白质-DNA相互作用的研究方法。该方法可以在同一个样品中分离DNA-蛋白复合体。通常，是通过高亲和性的标签(如生物素)标记DNA，标签的目的是固定DNA，通过琼脂糖珠子或磁珠可以分离出生物素化的DNA，从而分离出细胞裂解液中的DNA-蛋白复合体。分离出的蛋白进行洗脱后可以通过Western Blot进行检测，或通过质谱进行筛选(DENG W G,ZHU Y,MONTERO A,et al.2003.Quantitativeanalysis of binding of transcription factor complex to biotinylated DNA probeby a streptavidin-agarose pulldown assay.Anal Biochem[J],323:12-18)。
DNA pulldown方法具有很多优点，如可以富集低丰度的靶标，可以通过多种方法构建尾端标记的DNA，可以分离出完整的DNA-蛋白复合体，可以联合Western Blot或质谱进行分析等。随着DNA pulldown技术的不断完善，其在生命科学研究及医学领域中扮演的角色愈加重要。
Kazuhito Yamashita等报道在血管内皮细胞中，通过DNA pulldown实验发现，在低氧情况下HIF-1结合ET-1基因的启动子区域，启动ET-1的表达。进一步的研究发现ET-1启动子中的HIF-1结合区不足以应答低氧反应，还需要附近额外的50bp的序列帮助，此区域包括AP-1、GATA-2、NF-1的结合区。证实了AP-1、GATA-2、NF-1可以稳定HIF-1与ET-1启动子的结合，进一步招募p300/CBP形成ET-1低氧应答复合体(YAMASHITA K,DISCHER D J,HU J,etal.2001.Molecular regulation of the endothelin-1gene by hypoxia.Contributionsof hypoxia-inducible factor-1,activator protein-1,GATA-2,AND p300/CBP.J BiolChem[J],276:12645-12653)。
Deng WG等使用双生物素化的环氧化酶2(COX-2)的启动子作为探针，开展DNApulldown，检测了经过不同处理的人类成纤维细胞的细胞核提取物，发现佛博尔酯或肿瘤坏死因子alpha处理后DNA探针与p300和PCAF的结合增加，但是不影响与Srb7、Med7或TFII(B)的结合，证实在肿瘤中p300和PCAF通过结合COX-2的启动子启动COX-2的表达。
但是，DNA pulldown实验还存在很多缺点，如DNA探针与蛋白结合的特异性不高，实验过程还会受到核酸酶污染的影响。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种DNA pulldown方法及试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种DNA pulldown方法，包含以下步骤：
S1、磁珠预处理：使用BSA(牛血清白蛋白)和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；
S2、制备探针-磁珠复合物：将步骤S1预处理的磁珠与生物素标记的DNA探针结合；
S3、提取并预处理细胞核蛋白：向提取的核蛋白样品中加入脱氧核糖核酸酶孵育，再加入未预处理的磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；
S4、pulldown：将步骤S3收集的上清加入到步骤S2制备的探针-磁珠复合物中，加入DNA precipitation buffer及脱氧核糖核酸酶抑制剂孵育，收集磁珠，用DNAprecipitation buffer洗涤磁珠，得到蛋白-探针-磁珠复合物；
S5、探针-蛋白复合物的收集：将步骤S4制得的蛋白-探针-磁珠复合物加入UreaCHAPS buffer孵育，去除磁珠，收集上清即得探针-蛋白复合物。
优选地，所述步骤S1磁珠预处理的方法为：用1mL 1×TES洗涤80μL链霉亲和素标记的磁珠，去除TES洗涤液，再向磁珠中加入1mL含BSA和寡核苷酸随机引物的1×TES，室温孵育30min后去除TES溶液。
优选地，所述TES中BSA的浓度为0.05-0.5wt％，寡核苷酸随机引物的浓度为10-20μmol/L。
优选地，所述步骤S1中寡核苷酸随机引物为20bp以内的DNA序列。
优选地，所述步骤S2制备探针-磁珠复合物的方法为：向2-5μg DNA探针中加入DNAstructure buffer至100μL，再将其加入步骤S1预处理后的磁珠中，并加入100μL 2×TES，25℃温和旋转混合30-60min，去上清；用1×TES洗涤磁珠两次，去除TES。
优选地，所述步骤S3中预处理细胞核蛋白的方法为：向1.5×107个细胞提取获得的核蛋白提取物中加入5μL DNase和1.6μL DNase Buffer，25℃温和孵育1h；再加入40μL未预处理的磁珠，4℃温和旋转30min；收集上清液为预处理的核蛋白。
优选地，所述步骤S3提取细胞核蛋白的方法为：用含0.5mM PMSF的PBS洗涤1.5×107个细胞两次，每次4℃、1000rpm离心5min，弃上清；加入390μL预冷Buffer 1、4μL 10mg/ml的PMSF溶液、4μL protease inhibitor cocktail和2μL100mM DTT溶液，重悬细胞后，剧烈涡旋10秒钟充分混匀，冰浴10min；4℃、1400g-2500g离心5min，弃上清；加入390μL冷Buffer 2、4μL 10mg/ml的PMSF溶液、4μL protease inhibitor cocktail和2μL 100mM DTT溶液，涡旋充分重悬沉淀，冰浴20min，每隔2min高速剧烈涡旋15-30秒钟充分混匀；4℃、12,000g-16,000g离心10min，弃沉淀，上清为核蛋白提取物；所述Buffer1的配方为：10mMHEPES-KOH(pH 7.9)、1.5mM MgCl2、10mM KCl、0.1mMEDTA和0.4wt％NP-40；所述Buffer 2的配方为50mM HEPES-KOH(pH 7.9)、5mM MgCl2、420mM NaCl、0.1mM EDTA和2wt％glycerol(丙三醇)。
优选地，所述步骤S4pulldown的具体方法为：将步骤S3制备的核蛋白加入到探针-磁珠复合物中，并加入465μL DNA precipitation buffer、5μL protease inhibitorcocktail、15μg poly(dI·dC)、5μL 10mg/ml的PMSF(苯甲基磺酰氟)溶液、2.5μL 100mMDTT(二硫苏糖醇)、5μL 0.5M EDTA(乙二胺四乙酸)溶液和2.5μL 0.5M EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)溶液；4℃旋转混合孵育30-60min，收集磁珠，4℃，加入975μL DNAprecipitation buffer、10μL 10mg/ml的PMSF溶液、10μL protease inhibitor cocktail和5μL 100mM DTT溶液，洗涤磁珠，再重复洗涤四次。本发明中选用EDTA作为脱氧核糖核酸酶的抑制剂。
优选地，所述步骤S5探针-蛋白复合物的收集方法为：向蛋白-探针-磁珠复合物中加入40μL Urea CHAPS buffer和0.4μL 100mM DTT溶液，4℃孵育5-10h，上清即为探针-蛋白复合物。
一种DNA pulldown试剂盒，包含下述试剂：
磁珠及其处理试剂：2×TES溶液，链霉亲和素标记的磁珠，寡核苷酸随机引物；所述寡核苷酸随机引物的浓度为10-20μmol/L；
DNA处理试剂：DNase，DNase Buffer；
蛋白提取及处理试剂：Buffer 1，Buffer 2，Urea CHAPS buffer，proteaseinhibitor cocktail、DTT溶液、PMSF溶液；所述DTT溶液的浓度为100mM，所述PMSF溶液的浓度为10mg/mL；
探针及结合处理试剂：DNA structure buffer，DNA precipitation buffer，poly(dI·dC)；
所述Buffer1的配方为：10mM HEPES-KOH(pH 7.9)、1.5mM MgCl2、10mM KCl、0.1mMEDTA和0.4wt％NP-40；所述Buffer 2的配方为50mM HEPES-KOH(pH 7.9)、5mM MgCl2、420mM NaCl、0.1mM EDTA和2wt％glycerol。
本发明针对目标区域设计特异性DNA探针，探针经过脱硫生物素标记；链霉亲和素偶联在磁珠上，并和脱硫生物素亲和结合；细胞核提取物与磁珠-探针复合物孵育，作用蛋白分子可以和DNA探针特异性结合；经过洗涤可以将非特异性结合蛋白分子去除；最后，在洗脱液(针对链霉亲和素)进行洗脱，得到目的探针-蛋白复合物，再经过Western Blot或质谱鉴定蛋白质类型。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
①本发明通过预先使用BSA封闭磁珠，降低了磁珠与蛋白的非特异性结合；本发明通过预先使用寡核苷酸随机引物封闭磁珠，降低了磁珠与基因组DNA的非特异性结合。BSA和寡核苷酸随机引物的大小正合适，既能封闭磁珠增强实验的特异性，又不会过大而影响探针与蛋白的结合。
②本发明采用脱氧核糖核酸酶预处理蛋白样品，采用未预处理的磁珠对蛋白样品进行预洗涤，除去蛋白样品内的基因组DNA，防止其缠绕磁珠从而影响耦连在磁珠上的DNA探针与蛋白质的结合，再采用脱氧核糖核酸酶抑制剂灭活脱氧核糖核酸酶。本发明通过系统性核酸酶防护，防止核酸酶的污染，增加了实验的稳定性和可靠性，重复性好，简化了实验流程。
③本发明中磁珠首先与探针孵育，去除多余探针后再与蛋白孵育，较传统探针先与蛋白孵育再与磁珠孵育或探针、蛋白和珠子同时孵育极大的节约了磁珠的使用量，节约实验成本。本发明采用磁珠取代了琼脂糖珠，省掉离心的步骤，节约试验时间。同时，采用磁珠法洗涤取代了琼脂糖珠离心的步骤，可以使上清液去除的更加彻底，提高反应的特异性。
附图说明
图1为不同方法pulldown效果图。
具体实施方式
为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施方式做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。
实施例1
本实施例中针对目标区域P53蛋白设计特异性DNA探针，探针经过脱硫生物素8-oxoG标记。探针的设计和标记方法是本领域技术人员所熟知的，在此不再赘述。链霉亲和素偶联在磁珠(BeaverBeadsTM Streptavidin，海狸生物科技有限公司)上，并和脱硫生物素亲和结合；细胞核提取物与磁珠-DNA探针孵育，作用蛋白分子可以和探针特异性结合；经过洗涤可以将非特异性结合蛋白分子去除；最后，再用洗脱液(针对链霉亲和素)进行洗脱，得到目的探针-蛋白复合物，再经过Western Blot鉴定蛋白质类型。具体步骤如下：
S1、磁珠预处理
①取80μL链霉亲和素标记的磁珠置于EP管中，加入1mL 1×TES洗涤磁珠；
②置于磁力架上去除TES洗涤液，向磁珠加入1mL含0.5wt％BSA和10μmol/L寡核苷酸随机引物的1×TES，室温孵育30min后置于磁力架上去除TES溶液。所述寡核苷酸随机引物为20bp以内的DNA序列。
S2、制备探针-磁珠复合物
①向2-5μg DNA探针中加入DNA structure buffer至100μL，再将其加入步骤S1预处理的磁珠中，并加入100μL 2×TES，25℃旋转温和混合30min-60min，置于磁力架上去上清；
②加入0.35mL 1×TES，25℃温和旋转洗涤磁珠5min，置于磁力架上去除洗涤液；
③重复步骤②一次。
S3、提取并预处理细胞核蛋白
S31、提取核蛋白
①用含0.5mM PMSF的PBS洗涤1.5×107个Hela细胞两次，每次4℃1000rpm离心5min，弃上清；
②加入390μL预冷Buffer 1、4μL 10mg/mL的PMSF(Thermo Fisher)溶液、4μLprotease inhibitor cocktail(Thermo Fisher)和2μL 100mM DTT(Thermo Fisher)溶液，重悬细胞后，剧烈涡旋10秒钟充分混匀，冰浴10min；所述Buffer1的配方为：10mM HEPES-KOH(pH 7.9)、1.5mM MgCl2、10mM KCl、0.1mMEDTA和0.4wt％NP-40；
③4℃，1400g-2500g离心5min，弃上清；
④加入390μL预冷Buffer 2、4μL 10mg/mL的PMSF溶液、4μL protease inhibitorcocktail和2μL 100mM DTT溶液，涡旋充分重悬沉淀，冰浴20min，每隔2min高速剧烈涡旋15-30秒钟充分混匀；所述Buffer 2的配方为50mM HEPES-KOH(pH 7.9)、5mM MgCl2、420mMNaCl、0.1mM EDTA和2wt％glycerol；
⑤4℃，12,000g-16,000g离心10min，弃沉淀，上清为核蛋白提取物；
⑥考马斯亮蓝或BCA试剂盒测定蛋白质浓度；
⑦蛋白样品-80℃保存备用。
S32、预处理核蛋白
①向上述制备的核蛋白提取物中加入5μL DNase(TURBOTM DNase)、1.6μL DNaseBuffer(TURBOTM DNase Buffer)，室温25℃温和孵育1h；
②向蛋白样品中加入40μL未预处理的磁珠，4℃温和旋转30min；
③磁力架上收集磁珠，将上清液预处理的核蛋白转移到新的EP管中。
S4、pulldown
①将制备的核蛋白加入到探针-磁珠复合物中，并加入465μL DNA precipitationbuffer、15μg poly(dI·dC)、5μL 10mg/mL的PMSF溶液、5μL protease inhibitorcocktail、2.5μL 100mM DTT溶液、5μL 0.5M EDTA溶液和2.5μL 0.5M EGTA溶液；
②4℃旋转混合孵育30min；
③磁力架上收集磁珠，去除上清液；
④4℃，加入975μL DNA precipitation buffer、10μL 10mg/mL的PMSF溶液、10μLprotease inhibitor cocktail和5μL 100mM DTT溶液，洗涤磁珠，去除非特异性结合的蛋白，再重复洗涤四次，得到蛋白-探针-磁珠复合物。
S5、蛋白样品收集
①向蛋白-探针-磁珠复合物中加入40μL Urea CHAPS buffer和0.4μL 100mM DTT溶液，4℃孵育5-10h。
②磁力架上收集磁珠，上清即为探针-蛋白复合物，将上清转移到新的管子中。
③产物置于-80℃保存，供进一步Western Blot分析。
为了更好的说明本发明的效果，发明人还进行了两组对比实验。
对比例1使用的方法简述为：取200μg的细胞核提取物在DNA沉淀缓冲液(20mMHepes-KOH(pH7.9)、1mM MgCl2、80mM KCl、0.2mM EDTA、10wt％glycerol、0.5mMdithiothreitol、0.1wt％Triton X-100、1mM phenylmethylsulfonyl fluoride和protease inhibitor mixture)中重悬，在体系中加入15μg poly(dI·dC)，加入生物素化的寡核苷酸探针，4℃混匀30min，然后加入50μL亲和素的磁珠(Dynal)，4℃混匀30min，通过磁铁收集磁珠，再通过DNA沉淀缓冲液洗2次，捕获的蛋白用Western Blot检测(TAKAKI H,ICHIYAMA K,KOGA K,et al.2008.STAT6Inhibits TGF-beta1-mediated Foxp3inductionthrough direct binding to the Foxp3promoter,which is reverted by retinoicacid receptor.J Biol Chem[J],283:14955-14962)。
对比例2使用的方法简述为：通过加入生物素化的引物(Invitrogen)PCR扩增的方法获得生物素化的DNAs。向蛋白中加入免疫纯化的亲和素-琼脂糖珠子(Pierce)孵育1h，然后加入1μg生物素化的DNA通过转动摇床混匀12h。200×g离心60s，再把沉淀用预冷的TBS缓冲液(20mM Tris,150mM NaCl)洗三次，最后进行Western Blot检测(XIE Y,ZHANG Y,ZHAOX,et al.2016.A CAPS-based binding assay provides semi-quantitative validationof protein-DNA interactions.Sci Rep[J],6:21030)。
使用本实施例和对比例的方法分别验证8-oxoG-DNA探针对P53蛋白的pulldown效果。泳道1为10％input组；泳道2为LacZ组，使用LacZ DNA探针，此孔作为阴性对照；泳道3为pulldown组，使用实验组DNA探针。图1A为本发明方法pulldown效果图；图1B为按照对比例1所述方法pulldown效果图；图1C为按照对比例2所述方法pulldown效果图。可见本发明相对于Takaki报道方法和Xie报道方法的Western Blot的条带拖尾现象更少，说明本试剂盒蛋白富集效率更高，特异性更好。相对于Xie报道的方法中的几乎不能检出的结果，本发明具有更高的灵敏度。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一种DNA pulldown方法，其特征在于，包含以下步骤：
S1、磁珠预处理：使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；
所述步骤S1磁珠预处理的方法为：用1mL 1×TES洗涤80μL链霉亲和素标记的磁珠，去除TES洗涤液，再向磁珠中加入1mL含BSA和寡核苷酸随机引物的1×TES，室温孵育30min后去除TES溶液；
所述TES中BSA的浓度为0.05-0.5wt%，寡核苷酸随机引物的浓度为10-20μmol/L；
所述步骤S1中寡核苷酸随机引物为20bp以内的DNA序列；
S2、制备探针-磁珠复合物：将步骤S1预处理的磁珠与生物素标记的DNA探针结合；
S3、提取并预处理细胞核蛋白：向提取核蛋白样品中加入脱氧核糖核酸酶孵育，再加入未预处理的磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；
所述步骤S3提取细胞核蛋白的方法为：用含0.5mM PMSF的PBS洗涤1.5×107个细胞两次，每次4℃、1000rpm离心5min，弃上清；加入390μL预冷Buffer 1、4μL 10mg/mL 的PMSF溶液、4 μL protease inhibitor cocktail和2 μL100mM DTT溶液，重悬细胞后，剧烈涡旋10秒钟充分混匀，冰浴10min；4℃、1400g-2500g离心5min，弃上清；加入390μL冷Buffer 2、4μL10mg/mL 的PMSF溶液、4μL protease inhibitor cocktail和2μL 100mM DTT溶液，涡旋充分重悬沉淀，冰浴20min，每隔2min高速剧烈涡旋15-30秒钟充分混匀；4℃、12,000g-16,000g离心10min，弃沉淀，上清为核蛋白提取物；所述Buffer1的配方为：10 mM HEPES-KOH、1.5 mM MgCl2、10 mMKCl、0.1mMEDTA和0.4wt% NP-40；所述Buffer 2的配方为50 mMHEPES-KOH、5 mM MgCl2、420 mMNaCl、0.1 mM EDTA和2wt% glycerol；
S4、pulldown：将步骤S3制备的蛋白样品加入到步骤S2制备的探针-磁珠复合物中，加入DNA precipitation buffer及脱氧核糖核酸酶抑制剂孵育，收集磁珠，用DNAprecipitation buffer洗涤磁珠，得到蛋白-探针-磁珠复合物；
S5、探针-蛋白复合物的收集：将步骤S4制得的蛋白-探针-磁珠复合物加入Urea CHAPSbuffer孵育，去除磁珠，收集上清即得探针-蛋白复合物。
2.根据权利要求1所述的DNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S2制备探针-磁珠复合物的方法为：向2-5μg DNA探针中加入DNA structure buffer至100μL，再将其加入步骤S1中预处理的磁珠中，并加入100μL 2×TES，25℃温和旋转混合30-60min，去上清；用1×TES洗涤磁珠两次，去除TES。
3.根据权利要求1所述的DNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S3中预处理细胞核蛋白的方法为：向1.5×107个细胞提取获得的核蛋白提取物中加入5μL DNase和1.6μLDNase Buffer，25℃温和孵育1h；再加入40 μL未预处理的磁珠，4℃温和旋转30 min；上清液为预处理的核蛋白。
4.根据权利要求1所述的DNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S4 pulldown的具体方法为：将步骤S3制备的核蛋白加入到探针-磁珠复合物中，并加入465μL DNAprecipitation buffer、5μL protease inhibitor cocktail、15μg poly(dI•dC)、5μL10mg/mL 的PMSF溶液、2.5μL 100mM DTT溶液、5μL 0.5 M EDTA溶液和2.5μL 0.5M EGTA溶液；4℃旋转混合孵育30-60min，收集磁珠，4℃，加入975μL DNA precipitation buffer、10μL 10mg/mL 的PMSF溶液、10μL protease inhibitor cocktail和5μL 100mM DTT溶液，洗涤磁珠，再重复洗涤四次。
5.根据权利要求1所述的DNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S5蛋白样品的收集方法为：向蛋白-探针-磁珠复合物中加入40μL Urea CHAPS buffer 和0.4μL 100mM DTT溶液，4℃孵育5-10h，上清即为探针-蛋白复合物。
CN201610633292.1A 2016-08-03 2016-08-03 一种DNA pulldown方法及试剂盒 Active CN106093437B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610633292.1A CN106093437B (zh) 2016-08-03 2016-08-03 一种DNA pulldown方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610633292.1A CN106093437B (zh) 2016-08-03 2016-08-03 一种DNA pulldown方法及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106093437A CN106093437A (zh) 2016-11-09
CN106093437B true CN106093437B (zh) 2018-03-20

Family

ID=57454960

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610633292.1A Active CN106093437B (zh) 2016-08-03 2016-08-03 一种DNA pulldown方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106093437B (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108949750A (zh) * 2018-08-17 2018-12-07 上海锐翌生物科技有限公司 提取粪便dna的方法及试剂盒
WO2020093308A1 (zh) * 2018-11-08 2020-05-14 廖世奇 一种复合靶标-肿瘤血清核酸配基检测方法及试剂盒
CN110133287B (zh) * 2019-05-22 2021-07-30 上海碧云天生物技术有限公司 蛋白抽提溶液及其应用
CN110964073B (zh) * 2019-11-28 2023-06-02 上海市第一妇婴保健院 用于捕获胎儿特有dna甲基化修饰结合蛋白的探针及方法
CN111733459A (zh) * 2020-07-08 2020-10-02 佰奥思特生物医药科技(上海)有限公司 一种dna编码化合物库及其筛选方法
CN113607520A (zh) * 2021-08-02 2021-11-05 湖州中科湖兴生物科技有限公司 一种提高抗药抗体分析中药物耐受的操作方法
CN113980960A (zh) * 2021-11-29 2022-01-28 大连海洋大学 寻找已知启动子序列结合未知蛋白的特异性引物及方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2541250A1 (en) * 2011-06-30 2013-01-02 Koninklijke Philips Electronics N.V. Molecular architecture on magnetic particles for affinity assays with low non-specific binding
US20160146786A1 (en) * 2013-06-26 2016-05-26 Phylogica Limited Method of monitoring cellular trafficking of peptides
CN103739664B (zh) * 2014-01-29 2017-01-18 中国医学科学院肿瘤医院 利用dna免疫共沉淀分离和鉴定dna结合蛋白的方法
CN104946667A (zh) * 2015-05-28 2015-09-30 吉林大学 一种柔嫩艾美尔球虫tert相关蛋白基因及医用用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN106093437A (zh) 2016-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106093437B (zh) 一种DNA pulldown方法及试剂盒
Zhang et al. A novel electrochemical cytosensor for selective and highly sensitive detection of cancer cells using binding-induced dual catalytic hairpin assembly
CN105018590B (zh) 蛋白配体和基因同时检测试剂盒及应用
CN107043766A (zh) 一种即用型的核酸磁珠提取试剂
Wei et al. Rapid and sensitive detection of microRNA via the capture of fluorescent dyes-loaded albumin nanoparticles around functionalized magnetic beads
CN103739664B (zh) 利用dna免疫共沉淀分离和鉴定dna结合蛋白的方法
CN110191962A (zh) 外来体相关核酸的测序和分析
CN106591297A (zh) 一种磁珠法核酸提取方法
JPS60262055A (ja) 核酸のハイブリツド形成分析法およびそれに用いる試薬系
CN106168625B (zh) 一种RNA pulldown方法及试剂盒
US20180010168A1 (en) One-step procedure for the purification of nucleic acids
Lin et al. Lab in a tube: isolation, extraction, and isothermal amplification detection of exosomal long noncoding RNA of gastric cancer
CN102839181A (zh) 一种胃癌细胞的核酸适配体序列及用途
CN109337901B (zh) 真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀方法及试剂盒
CN108949742B (zh) 一种猪脂肪组织的超声破碎方法及其应用
Selth et al. Studying RNA–protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation
Jia et al. CRISPR-powered biosensing platform for quantitative detection of alpha-fetoprotein by a personal glucose meter
CN103695419B (zh) 一种病毒核酸提取试剂
CN111763713A (zh) 非诊断目的基于靶标等温循环扩增及核酸试纸条技术检测miRNA-21的方法及试剂盒
CN106353499A (zh) 肺癌血清标志物适配体和基因同时检测试剂盒及应用
CN117025838A (zh) 一种靶向纳米磁珠特异性提取新型冠状病毒核酸的方法
Baranello et al. Mapping DNA breaks by next-generation sequencing
CN106520773B (zh) 卵巢粘液性癌细胞3ao的核酸适配体wyz-3及其筛选方法和应用
Huang et al. An integrated microfluidic system for early diagnosis of breast cancer in liquid biopsy by using microrna and FET biosensors
CN114592047A (zh) 一种检测循环肿瘤细胞的方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant