CN117025838A - 一种靶向纳米磁珠特异性提取新型冠状病毒核酸的方法 - Google Patents
一种靶向纳米磁珠特异性提取新型冠状病毒核酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117025838A CN117025838A CN202310651861.5A CN202310651861A CN117025838A CN 117025838 A CN117025838 A CN 117025838A CN 202310651861 A CN202310651861 A CN 202310651861A CN 117025838 A CN117025838 A CN 117025838A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- probe
- seq
- biotin
- avidin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 87
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 81
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 81
- 239000011324 bead Substances 0.000 title claims abstract description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 title claims abstract description 11
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 60
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 15
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims abstract description 13
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 claims abstract description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 claims abstract 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 8
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 8
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 8
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 7
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101150040063 orf gene Proteins 0.000 claims description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 2
- 108700002099 Coronavirus Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 23
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 15
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 10
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 abstract description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 6
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 abstract description 3
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 10
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 3
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 2
- 238000000184 acid digestion Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000034486 Multi-organ failure Diseases 0.000 description 1
- 208000010718 Multiple Organ Failure Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 208000029744 multiple organ dysfunction syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种基于靶向纳米磁珠特异性提取新型冠状病毒核酸(SARS‑CoV‑2)的方法。本发明利用SARS‑CoV‑2核酸序列，设计针对3个靶区域的生物素/氨基化核酸探针，与亲和素/羧基化纳米磁珠偶联，构建特异性核酸富集的功能化纳米磁珠；对限制性内切酶消化的SARS‑CoV‑2核酸进行富集提取，通过碱基互补配对和生物素亲和素/氨基羧基的结合，形成靶核酸‑生物素化探针‑亲和素化磁珠/靶核酸‑氨基化探针‑羧基化磁珠杂合体，经磁分离、洗涤，去除蛋白质和非特异核酸，得到富集纯化的靶核酸分子。本发明所述方法为构建一种新型磁性纳米探针富集体系，特异性吸附病毒核酸，提高检测灵敏度，增加检测特异性和准确性。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种核酸检测样本的富集方法。
背景技术
新型冠状病毒感染(Corona virus disease 2019,COVID-19)是由一种新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的以肺部感染和损伤为主，进而可能发展为多器官功能衰竭的急性流行性传染病。
目前，SARS-CoV-2的检测方法主要是免疫学检测和分子生物学检测方法。其中免疫学方法是检测病原体抗原或病人体液中的抗体，用于初筛。但在感染初期，病原体抗原含量较低，且病毒感染人体后抗体的产生一般需要几天至几周不等,尤其是部分免疫功能较弱的病人抗体载量更低。目前，免疫学方法受灵敏度限制，无法实现早期准确筛查。分子生物学的检测方法是检测核酸，核酸检测的方法主要有新一代测序(Next generationsequencing,NGS)，荧光实时定量逆转录PCR(Quantitative real-time polymerasechainreaction，qRT-PCR)两种。其中NGS测序法具有很高的准确度和灵敏度，但仪器昂贵、数据分析复杂、耗时较长，不适合在医疗机构中推广使用。目前，在医院、疾病预防控制中心和第三方检测机构广泛采用qRT-PCR法，该方法具有灵敏度高、特异性强的特点。然而，在临床应用中发现，病毒检测阳性率约为30％-60％，主要是由患者病毒核酸载量存在差异所造成。在样品量有限的情况下，如何获取更多的病毒核酸分子，是提高检测灵敏度和检出率的关键。
目前，病毒核酸分离纯化的方法主要是通过纳米磁珠对核酸进行吸附分离，与传统的柱纯化方法相比，磁珠法更为快速、有效，且易于实现自动化。然而，该类磁珠对核酸为非特异性吸附，既能对宿主核酸也能对病毒核酸吸附，导致背景核酸增多，影响了检测灵敏度和特异性。本发明开发一种覆盖特异性病毒核酸探针的纳米磁珠，辅以限制性内切酶进行核酸消化，可对SARS-CoV-2核酸进行特异性吸附，与常规的核酸提取磁珠相比，qRT-PCR检测的Ct值提前，提高了检测灵敏度。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明开发了一种靶向纳米磁珠特异性提取新型冠状病毒核酸的方法，实现对病毒的核酸富集，结果具有较好的特异性、灵敏度和重复性。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种核酸富集探针靶向纯化新型冠状病毒核酸的体系，所述体系包括引物探针组合物以及探针和磁珠的偶联。
所述引物探针组合物包括针对新型冠状病毒核酸N基因、ORF基因、E基因的三个不同区域的生物素/氨基化核酸探针。生物素/氨基化核酸探针是一条寡核苷酸链，长度为20-60nt，5’端标记的基团为生物素/氨基。生物素/氨基化探针能和亲和素/羧基化磁珠进行共价偶联，构成生物素化探针-亲和素化磁珠杂合体/氨基化探针-羧基化磁珠杂合体。探针5’端连接14-30个随机碱基，增加探针臂长，减小生物素和亲和素/氨基和羧基结合时的空间位阻；3’端连接封闭基团阻断修饰，包括但不限于C3-Spacer、C5-Spacer、C7-Spacer、biotin-TEG、phosphate等，对核酸进行封闭，封闭后的探针缺乏延伸能力，避免与扩增引物混淆，不产生非特异扩增。探针与核酸靶序列之间的退火温度大于探针与探针之间的退火温度有利于探针捕获靶核酸序列。
所述ORF基因捕获探针组核酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5五种序列之一；
所述N基因捕获探针组核酸序列为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9、SEQ ID NO.10五种序列之一；
所述E基因捕获探针组核酸序列为SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15五种序列之一。
进一步，所述探针和磁珠的偶联采用如下方案：
1、生物素化捕获探针与亲和素化磁珠偶联
(1)涡旋震荡亲和素磁珠，再超声15秒，使磁珠充分混匀；
(2)取200μL亲和素磁珠到离心管中；
(3)将离心管置于磁力架上磁性分离30秒，弃上清；
(4)加1000μL 1×Binding/Wash Buffer洗涤1次；
(5)重复步骤4；
(6)将微球重新悬浮在990μL 2×Binding/Wash Buffer中；
(7)加10μL生物素化探针，室温震荡1小时，再置于磁力架上磁性分离30-60秒，弃上清；
(8)加1000μL 1×Binding/Wash Buffer洗涤2次；
(9)加200μL DNA/RNA Elution Buffer(pH 8.2)重悬磁珠，避光保存于2-8℃。
注：
(1)Binding&Washing Buffer I(2X)：10mM Tris-HCl(pH 7.5),1mM EDTA,2MNaCl,0.01％-0.1％Tween-20
(2)Binding&Washing Buffer I(1X)：PBS(1X，pH 7.4),0.05％Tween-20,0.1％BSA
(3)DNA/RNA Elution Buffer：95％formamide,10mM EDTA,pH 8.2
2.氨基化捕获探针与羧基化磁珠偶联
(1)将-20℃干燥的EDAC粉末平衡至室温；
(2)超纯水重悬氨基化寡核苷酸至终浓度为1mM；
(3)涡旋震荡磁珠，超声15秒，使磁珠充分混匀；
(4)吸取所需体积磁珠于离心管中；
(5)将离心管置于磁力架上进行磁性分离30-60秒，弃上清；
(6)向离心管中加入50μL 0.1M MES(pH 4.5)，重悬磁珠，瞬时涡旋，再超声30秒，备用；
(7)用超纯水配制浓度为0.1nmol/μL氨基化寡核苷酸；
(8)将2μL(0.2nmol)1:10稀释的捕获寡核苷酸加入到重新悬浮的磁珠中，并涡旋混合；
(9)用超纯水配制10mg/mL EDAC新鲜溶液；
(10)将2.5μL新配制的10mg/mL EDAC加入到重新悬浮的磁珠中，并涡旋混合；
(11)室温避光孵育30分钟；
(12)将1.0mL的0.02％Tween-20添加到偶联磁珠中，并涡旋混合；
(13)将离心管置于磁力架上进行磁性分离30-60秒，弃上清；
(14)加1.0mL 0.1％SDS重悬磁珠；
(15)将离心管置于磁力架上进行磁性分离30-60秒，弃上清；
(16)加100μL TE(pH 8.0)重悬磁珠，涡旋后超声约20秒；
(17)将偶联的磁珠避光储存在2-8℃。
本发明还提供了一种SARS-CoV-2核酸限制性内切酶消化体系见表1，通过内切酶对模板核酸进行消化，使得核酸片段碎片化，促进捕获探针特异性富集SARS-CoV-2核酸。
表1SARS-CoV-2核酸限制性内切酶消化体系
注：10×Buffer:100mM Tris-HCl(pH 7.5)，100mM MgCl2，0.2％Triton X-100，1mg/mL BSA。
进一步，所述捕获探针特异性富集SARS-CoV-2核酸采用如下方案：
(1)试剂准备：
①裂解结合液：9×SSC、0.05％Tween-20(v/v)
②洗涤液：80％乙醇(v/v)
③洗脱液：95％formamide,10mM EDTA,pH 8.2
(2)试剂分液：按照表2所示，在深孔板中加入对应试剂。
表2核酸提取试剂
(3)把深孔板放在核酸提取仪上，按照表3设置提取程序。
表3核酸提取程序
(4)运行核酸提取程序，核酸富集纯化。
综上所述，本技术方案的有益效果在于：
本发明设计了一种新型的SARS-CoV-2核酸捕获探针，使其根据碱基互补原理与靶核酸特异性结合，辅以限制性内切酶进行核酸消化，形成靶核酸-探针杂合体，经磁珠分离、洗涤，去除蛋白质和其他非特异核酸，得到富集纯化的靶核酸分子。采用该方式可特异性地捕获目标基因，实现纯化和富集SARS-CoV-2核酸目的，增加检测特异性和准确性，提高检测灵敏度，降低了检测的假阴性率，对COVID-19的防控具有重要意义。
附图说明
图1是靶核酸-生物素化探针-亲和素化磁珠杂合体/靶核酸-氨基化探针-羧基化磁珠杂合体示意图
图2是生物素化探针和亲和素化磁珠偶联前后的扫描电镜图
图3是生物素化探针和亲和素化磁珠偶联前后的透射电镜图
图4是靶向磁珠和常规磁珠提取核酸后的PCR检测扩增曲线图
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明做进一步说明。此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种用于新型冠状病毒核酸富集及检测的方法。
1.引物和探针的设计与合成
根据NCBI GenBank中已公布的多种新型冠状病毒核酸进行比对，选取ORF基因、N基因、E基因片段范围的保守区域作为捕获探针的设计的靶序列，易于设计保守性良好、稳定性强的探针。应用引物设计软件Primer Premier V6.0设计出若干套探针，经Oligo7.0对序列进行初筛选后，再利用BLAST筛选出几组候选的探针组。捕获探针的5’端采用生物素/氨基进行标记，3’采用磷酸基团进行标记。经过预实验，确定了以下的引物和探针序列。序列分别如下：
SEQ ID NO.1
SEQ ID NO.6
SEQ ID NO.11
2.捕获探针与亲和素磁珠进行偶联
(1)涡旋震荡亲和素磁珠，再超声15秒，使磁珠充分混匀；
(2)取200μL亲和素磁珠到离心管中；
(3)将离心管放在磁力架上磁性分离30秒，弃上清；
(4)加1000μL 1×Binding/Wash Buffer洗涤1次；
(5)重复步骤4；
(6)将微球重新悬浮在990μL 2×Binding/Wash Buffer中；
(7)加10μL生物素探针，室温震荡1小时，再置于磁力架上磁性分离30-60秒，弃上清；
(8)加1000μL 1×Binding/Wash Buffer洗涤2次；
(9)加200μL DNA/RNA Elution Buffer(pH8.2)重悬磁珠，避光保存于2-8℃。
注：
(1)Binding&Washing Buffer I(2X)：10mM Tris-HCl(pH 7.5),1mM EDTA,2MNaCl,0.01％-0.1％Tween-20
(2)Binding&Washing Buffer I(1X)：PBS(1X，pH 7.4),0.05％Tween-20,0.1％BSA
(3)DNA/RNA Elution Buffer：95％formamide,10mM EDTA,pH 8.2
3.核酸释放，限制性内切酶消化见表1；
表1SARS-CoV-2核酸限制性内切酶消化体系
| 组分 | 酶切体系(μL) |
| 10×Buffer | 10.0 |
| EcoI | 1.0 |
| RNaseFreeWater | 4.0 |
| TemplateDNA | 85.0 |
注：10×Buffer：100mM Tris-HCl(pH 7.5)，100mM MgCl2，0.2％Triton X-100，1mg/mLBSA。
4.特异性富集新冠核酸
(1)试剂准备：
①裂解结合液：9×SSC、0.05％Tween-20(v/v)
②洗涤液：80％乙醇(v/v)
③洗脱液：95％formamide,10mM EDTA,pH 8.2
(2)试剂分液：按照表2所示，在深孔板中加入对应试剂，样本选择10000copie/mL核酸进行提取。
表2核酸提取试剂
(3)把深孔板放在核酸提取仪上，按照表3设置提取程序，同时采用商品化核酸提取试剂提取核酸，评价本发明的效果。
表3核酸提取程序
(4)运行核酸提取程序，核酸富集纯化
5.核酸检测
对上述提取得到的核酸使用奕昕生物科技股份有限公司的《新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)》进行PCR扩增，利用宏石SLAN-96荧光定量PCR仪进行扩增检测，扩增体系见表4，扩增程序见表5。
表4PCR扩增体系
| 组份 | 加入量(μL/每反应) |
| 2019-nCoVMix | 4 |
| 酶系 | 5 |
| 扩增反应液 | 7.5 |
| 去RNA酶水(阴性对照) | 3.5 |
| 总体积 | 20 |
表5PCR扩增程序
6.检测结果见表6
表6靶向磁珠和常规磁珠提取核酸后的PCR检测结果
上述实施例的结果表明，本发明开发了一种靶向纳米磁珠特异性提取新型冠状病毒核酸的方法，可对SARS-CoV-2核酸进行富集，辅以内切酶对模板核酸进行消化，提高核酸的提取效率和灵敏度。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种靶向纳米磁珠特异性提取新型冠状病毒核酸的方法，其特征在于：
A、生物素/氨基化核酸捕获富集探针设计；
B、亲和素/羧基化磁珠偶联；
C、核酸释放，限制性内切酶消化；
D、核酸捕获体系富集纯化靶向核酸；
E、PCR核酸检测目的片段。
2.根据权利要求1所述的生物素/氨基化核酸捕获富集探针，其特征在于，所述探针与核酸靶序列互补配对的靶特异性序列。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针的5’端带有生物素/氨基化标记物。
4.根据权利要求2所述的生物素/氨基化探针，其特征在于探针5’端连接14-30个随机碱基，增加探针臂长，减小生物素和亲和素/氨基和羧基结合时的空间位阻。
5.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针的3’端连接封闭基团阻断修饰，包括但不限于C3-Spacer、C5-Spacer、C7-Spacer、biotin-TEG、phosphate等。
6.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针结合序列的长度为20-60nt。
7.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针与核酸靶序列之间的退火温度大于探针与探针之间的退火温度。
8.根据权利要求2所述的生物素/氨基化核酸捕获富集探针组合物，分别为针对新型冠状病毒N基因、ORF基因、E基因的三个不同区域核酸探针组合物：
针对N基因的捕获富集探针，其序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5的其中一种；
针对ORF基因的捕获富集探针，其序列为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9、SEQ ID NO.10的其中一种；
针对E基因的捕获富集探针，其序列为SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15的其中一种。
9.根据权利要求1所述的限制性内切酶消化，其特征在于，内切酶一类具有严格识别位点，并在识别位点内或附近切割双链DNA的脱氧核糖核酸酶。
10.根据权利要求1所述的一种通过探针捕获富集核酸的方法，其特征在于，采用权利要求2所述核酸捕获探针组合，使其根据碱基互补配对和生物素亲和素/氨基和羧基的结合原理，形成靶核酸-生物素化探针-亲和素化磁珠杂合体/靶核酸-氨基化探针-羧基化磁珠杂合体，经磁珠分离、洗涤，去除蛋白质和其他非特异核酸，得到富集的SARS-CoV-2核酸分子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310651861.5A CN117025838A (zh) | 2023-06-02 | 2023-06-02 | 一种靶向纳米磁珠特异性提取新型冠状病毒核酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310651861.5A CN117025838A (zh) | 2023-06-02 | 2023-06-02 | 一种靶向纳米磁珠特异性提取新型冠状病毒核酸的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117025838A true CN117025838A (zh) | 2023-11-10 |
Family
ID=88621469
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310651861.5A Pending CN117025838A (zh) | 2023-06-02 | 2023-06-02 | 一种靶向纳米磁珠特异性提取新型冠状病毒核酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117025838A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118086510A (zh) * | 2024-04-23 | 2024-05-28 | 上海金翌生物科技有限公司 | 用于检测Twist1基因甲基化水平的捕获探针及应用 |
| CN118256638A (zh) * | 2024-04-18 | 2024-06-28 | 甘肃省科学院传感技术研究所 | 特异性核酸探针、核酸富集法及形成的沙门氏菌检测方法 |
-
2023
- 2023-06-02 CN CN202310651861.5A patent/CN117025838A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118256638A (zh) * | 2024-04-18 | 2024-06-28 | 甘肃省科学院传感技术研究所 | 特异性核酸探针、核酸富集法及形成的沙门氏菌检测方法 |
| CN118256638B (zh) * | 2024-04-18 | 2024-10-22 | 甘肃省科学院传感技术研究所 | 特异性核酸探针、核酸富集法及形成的沙门氏菌检测方法 |
| CN118086510A (zh) * | 2024-04-23 | 2024-05-28 | 上海金翌生物科技有限公司 | 用于检测Twist1基因甲基化水平的捕获探针及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112708699B (zh) | 一种病毒样本灭活裂解试剂盒及其应用 | |
| CN117025838A (zh) | 一种靶向纳米磁珠特异性提取新型冠状病毒核酸的方法 | |
| CN113234856B (zh) | 一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法 | |
| CN113718045B (zh) | 用于检测4种鲍特菌和特异性检测百日咳鲍特菌的dna片段、引物、探针和试剂盒及应用 | |
| CN113005226A (zh) | 检测SARS-CoV-2的寡核苷酸和试剂盒 | |
| CN111549100A (zh) | 一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的构建方法及其产品和应用 | |
| CN107354207B (zh) | 基于双链探针的液相杂交捕获试剂盒、洗涤试剂盒及其应用 | |
| CN103146846A (zh) | 一种基于单一标准品的四色荧光定量pcr方法和试剂盒 | |
| CN111471799B (zh) | 一种多重纳米-荧光定量超敏规模化检测试剂盒 | |
| CN108929918B (zh) | 一种用于检测prrsv的现场快速检测方法及试剂盒 | |
| CN117925912A (zh) | 基于RAA-CRISPR-Cas13a试纸检测人腺病毒B亚属DNA的试剂盒 | |
| CN110643740A (zh) | 帕利亚姆血清群病毒的实时荧光定量rt-pcr检测引物、探针及检测试剂盒 | |
| CN111363748B (zh) | 一种核酸适配体及其构建方法和其在检测中华鳖彩虹病毒中的应用 | |
| CN113502341A (zh) | 梅毒螺旋体16s RNA的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 | |
| CN107988429B (zh) | 一种检测狂犬病毒的试剂及其应用 | |
| CN114317546B (zh) | 一种用于检测evd68病毒的核酸适配体、试剂盒及应用 | |
| CN116879549A (zh) | 一种核酸适体识别石斑鱼虹彩病毒的应用与该核酸适体 | |
| CN118389752B (zh) | 一种检测穿山甲a型轮状病毒的荧光定量pcr引物及方法 | |
| CN116515840B (zh) | 一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的试剂盒与检测方法 | |
| US11788129B2 (en) | Nucleic acid detection kit and nucleic acid detection method | |
| CN110643682A (zh) | 一种用于dna检测的信号放大系统、试剂盒和方法 | |
| CN111676226B (zh) | 一种六价铬的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其用途 | |
| CN113969281B (zh) | 经修饰的CrRNA片段及非洲猪瘟病毒试剂盒 | |
| CN116836988A (zh) | 一种核酸适体及其在制备检测鱼类神经坏死病毒的产品中的应用 | |
| CN115287374A (zh) | 实时检测丙型肝炎病毒核酸的荧光定量pcr检测方法及其试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |