CN114317546B - 一种用于检测evd68病毒的核酸适配体、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种用于检测EVD68病毒的核酸适配体、试剂盒及应用。本申请用于检测EVD68病毒的核酸适配体为Seq ID No.1所示序列或其互补序列的核酸片段。本申请用于检测EVD68病毒的核酸适配体，具有较高的特异性和亲和力，具有分子小、可进行修饰、合成容易、不易降解、无毒、无免疫原性等优点；克服了EVD68病毒特异性抗体不易表达合成、易降解、存在非特异性免疫原性等问题。采用本申请的核酸适配体进行EVD68病毒检测不仅灵敏度高、特异性好，而且测量范围宽、操作简单，可以快速准确的检测EVD68病毒。

Description

一种用于检测EVD68病毒的核酸适配体、试剂盒及应用

技术领域

本申请涉及EVD68病毒检测技术领域，特别是涉及一种用于检测EVD68病毒的核酸适配体、试剂盒及应用。

背景技术

肠道病毒EV-D68(Enterovirus-68，EVD68病毒)是小RNA病毒家族中肠道病毒D群的一员，该病毒原名为鼻病毒87型，后划归肠道病毒属,是一种无包膜的单链正义RNA病毒。与大多数耐酸并在胃肠道繁殖的肠道病毒不同，EVD68病毒对酸敏感，其物理生化特性与其他肠道病毒差异较大，反而与人类鼻病毒较为相似，感染后主要引起呼吸道疾病，少数病例可表现为神经系统疾病和急性弛缓性脊髓炎，严重情况下甚至可以导致感染者死亡。EVD68病毒常于早秋至冬季流行，根据地区不同可稍有差异。普遍易感，但发病以小儿为多，成人多为隐性感染。EVD68病毒主要在患者的呼吸道分泌物中潜伏存活，病人在咳嗽、打喷嚏或接触物体表面时都会传播病毒。目前EVD68病毒感染的实验室诊断主要包括病毒分离、血清学方法和分子生物学方法。

对于EVD68病毒的样品检测在临床检测以及实验研究中十分重要。现有的技术中对于病毒感染或者病毒蛋白的检测多采用特异性的抗体进行识别，抗体作为一种蛋白成分，存在不易表达合成、易降解、存在非特异性免疫原性等缺点；并且，抗体的制备比较复杂，步骤比较繁琐，成本较高，在大规模推广中有一定的缺陷。

因此，如何研发一种新的特异性强、灵敏度高的EVD68病毒检测技术，是目前亟待解决的问题。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的用于检测EVD68病毒的核酸适配体、试剂盒及应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于检测EVD68病毒的核酸适配体，该核酸适配体为Seq ID No.1所示序列或其互补序列的核酸片段。

Seq ID No.1：

5’-TTCAGCACTCCACGCATAGCTGACGTCATCCATACTGACGCACATGAGTGAGTAGACCCACCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’。

需要说明的是，本申请的核酸适配体是通过人工筛选技术-指数富集配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)筛选到的针对EVD68病毒靶蛋白抗原表位的核酸适配体，具有较高的特异性和亲和力。与现有的EVD68病毒特异性抗体相比，本申请的核酸适配体，克服了抗体不易表达合成、易降解、存在非特异性免疫原性等问题；并且，本申请的核酸适配体具有分子小、可进行修饰、合成容易、不易降解、无毒、无免疫原性等优点。采用本申请的核酸适配体进行EVD68病毒检测，灵敏度高、特异性好、测量范围宽、操作简单，可以快速准确的检测EVD68病毒靶蛋白，适合大规模推广，有良好的市场前景。本申请的一种实现方式中，对EVD68病毒感染病人样本和健康人样本的检测结果显示，本申请核酸适配体对EVD68病毒感染病人的阳性检出率，即灵敏度为94％，而健康人群检测的阳性检出率为0％；说明本申请的核酸适配体能够有效的检出EVD68病毒感染病人，没有假阳性。

还需要说明的是，本申请的关键在于研究发现Seq ID No.1所示序列的核酸片段能够作为特异性检测EVD68病毒的核酸适配体；可以理解，Seq ID No.1所示序列的互补序列的核酸片段同样具有相同的特异性和亲和力。

本申请的一种实现方式中，本申请核酸适配体的核酸序列上结合有荧光物质、纳米发光材料、生物素、地高辛和酶标记中至少一种。

优选的，荧光物质为荧光基团，荧光基团包括FAM荧光基团或Cy5荧光基团。可以理解，FAM荧光基团或Cy5荧光基团只是本申请的一种实现方式中采用的荧光基团，不排除还可以是其他荧光基团。

优选的，纳米发光材料为量子点或上转换发光材料。

优选的，酶标记为辣根过氧化物酶、蔗糖酶或功能性多肽。

本申请的一种实现方式中，本申请核酸适配体的核酸序列上具有磷酸化、甲基化、去甲基化、氨基化、巯基化、同位素化、羧基化、硫代修饰、2-甲氧基修饰、3’端倒置dT/dG修饰中的至少一种修饰。

需要说明的是，本申请的关键在于研发获得了能够特异性、灵敏度检测EVD68病毒的核酸适配体，至于核酸适配体的具体标记或修饰，可以参考现有的核酸适配体标记或修饰方案。

本申请的另一方面公开了一种由本申请的核酸适配体改造而成的肽核酸。

需要说明的是，肽核酸是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同，肽核酸可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。可以理解，本申请的肽核酸由于是采用本申请的核酸适配体改造而成，因此，具有本申请核酸适配体类似的特异性和灵敏度。

还需要说明的是，本申请的关键在于特异性检测EVD68病毒的核酸适配体，至于具体如何将核酸适配体改造成肽核酸，可以参考现有技术，在此不作具体限定。

本申请的再一面公开了一种用于检测EVD68病毒的试剂盒，该试剂盒中包括本申请的核酸适配体，或者本申请的肽核酸。

本申请的一种实现方式中，本申请的试剂盒还包括以下中的至少一种：

(A)固定样本溶液的蛋白包被板；

(B)蛋白包被液；

(C)封闭液；

(D)漂洗液；

(E)样本前处理液。

需要说明的是，本申请的试剂盒，其关键在于包括本申请的核酸适配体，能够特异性的对EVD68病毒进行检测；至于其他需要使用到的耗材或试剂，例如(A)固定样本溶液的蛋白包被板、(B)蛋白包被液、(C)封闭液、(D)漂洗液和(E)样本前处理液等，可以根据需求组装到试剂盒中，也可以自行配制或单独购买获得。

本申请的一种实现方式中，蛋白包被液的配方为：35mM NaHCO₃、13mM Na₂CO₃，pH9.3-pH9.9；封闭液的配方为：136mM NaCl、2.6mM KCl、2mM KH₂PO₄、8mM Na₂HPO₄、0.05％Tween-20、1％BSA，pH7.1-pH7.5；漂洗液的配方为：136mM NaCl、2.6mM KCl、2mM KH₂PO₄、8mMNa₂HPO₄、0.05％Tween-20，pH7.1-pH7.5；样本前处理液的配方为：150mM NaCl、1％TritonX-100、50mM Tris、pH7.8-pH8.2。

本申请的再一面公开了本申请的核酸适配体，或者本申请的肽核酸，或者本申请的试剂盒，在制备诊断或治疗EVD68病毒引起的疾病的药物或工具中的应用。

可以理解，本申请的核酸适配体、肽核酸和试剂盒，能够特异性的检测EVD68病毒；因此，也能够用于对EVD68病毒引起的疾病进行诊断。例如，通过检测受检对象的离体样本中是否含有EVD68病毒，以此判断受检对象是否感染EVD68病毒，从而判断受检对象是否患有相关疾病。因此，本申请的核酸适配体、肽核酸和试剂盒可以用于制备诊断或治疗EVD68病毒引起的疾病的药物或工具。

本申请的再一面公开了一种非诊断治疗目的的EVD68病毒的检测方法，包括采用本申请的核酸适配体，或者本申请的肽核酸，或者本申请的试剂盒，对环境、食品、工具、离体样本或生物源性材料进行EVD68病毒检测。

需要说明的是，本申请的检测方法，虽然可以用于对EVD68病毒及其引起的疾病进行检测；但是，除此之外，还能够对环境、食品、工具、离体样本或生物源性材料中的EVD68病毒进行检测，以避免EVD68病毒扩散或传播。例如，对医院或一些特殊环境进行EVD68病毒检测，可以判断这些环境是否存在EVD68病毒感染风险；又例如，对出入境的食品、工具、离体样本或生物源性材料进行EVD68病毒检测，可以避免EVD68病毒输入。

本申请的有益效果在于：

本申请用于检测EVD68病毒的核酸适配体，具有较高的特异性和亲和力，具有分子小、可进行修饰、合成容易、不易降解、无毒、无免疫原性等优点；克服了EVD68病毒特异性抗体不易表达合成、易降解、存在非特异性免疫原性等问题。采用本申请的核酸适配体进行EVD68病毒检测不仅灵敏度高、特异性好，而且测量范围宽、操作简单，可以快速准确的检测EVD68病毒。

附图说明

图1是本申请实施例中用于检测EVD68病毒的核酸适配体的二级结构图。

具体实施方式

核酸适配体是一段单链核酸，一般大小在20～60个碱基左右，能通过折叠形成特定的三维结构并与相对应的靶分子进行高亲和力、高特异性的结合。核酸适配体可以通过模拟自然进化过程的人工筛选技术-指数富集配体系统进化技术(Systematic Evolutionof Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)筛选得到，是一种具有识别功能的新型核酸分子。利用SELEX技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性的与靶物质高度亲和的核酸适配体，该技术已经成功的运用于许多靶物质的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、蛋白质、氨基酸以及各种细胞因子等。该技术具有库容量大、适应范围广泛、分辨率高、亲和力高，筛选过程相对简便、快速、经济，实用性高等特点。核酸适配体对应靶标物质的高特异性和高亲和性的特点与抗体的功能类似，但是核酸适配体的靶标范围更加的广泛，可以很好地运用于医学检测、诊断和治疗等多个方面。

核酸适配体具有高特异性和高亲和力的原因是单链核酸在遇到靶标分子时可以形成例如口袋、发卡、G-四聚体等独特的三维结构，这些结构在结合靶标分子时的原理与抗体特异性识别相应抗原决定簇的原理类似，例如通过氢键、疏水结构、离子键等与靶标分子特异性的结合。基于核酸适配体具有较高特异性地识别病原微生物或者病变细胞的生物学特性，核酸适配体能被广泛的应用于检测技术以及生物传感器的构建，能够实现对于病原体或者疾病的精准诊断。

然而，目前尚未有特异性检测EVD68病毒的核酸适配体及其相关研究和报道。因此，如果能够研发出用于检测EVD68病毒的核酸适配体，不仅能够提高EVD68病毒检测的特异性和灵敏度；而且，能够规避抗体不易表达合成、易降解、存在非特异性免疫原性的问题。

因此，本申请创造性的采用SELEX技术筛选针对EVD68病毒靶蛋白抗原表位的核酸适配体，以期获得具有较高的特异性和亲和力的EVD68病毒检测核酸适配体。

基于以上研究和认识，本申请研发获得了一种用于检测EVD68病毒的核酸适配体，该核酸适配体为Seq ID No.1所示序列或其互补序列的核酸片段；

Seq ID No.1：

5’-TTCAGCACTCCACGCATAGCTGACGTCATCCATACTGACGCACATGAGTGAGTAGACCCACCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’。

本申请的核酸适配体具有以下优点：

本申请通过SELEX技术筛选到的针对EVD68病毒靶蛋白抗原表位的核酸适配体具有较高的特异性和亲和力；并且，具有无免疫原性、分子小、可进行修饰、合成容易、不易降解、无毒等优点。本申请所用核酸适配体序列为通过SELEX技术筛选所得，具有完全的独创性。

本发明的核酸适配体灵敏度高、特异性好、测量范围宽、操作简单、可以快速检测靶蛋白、适合大规模推广，有着良好的市场前景。本申请的一种实现方式中，在EVD68病毒感染病人样本和健康人样本的检测中，EVD68病毒感染病人的阳性检出率，即灵敏度为94％；健康人群检测的阳性检出率为0％。

采用本申请的核酸适配体作为检测物，能有效克服抗体不易表达合成、易降解、存在非特异性免疫原性等问题。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例1用于检测EVD68病毒的核酸适配体

1、确定EVD68病毒靶蛋白抗原表位

根据文献查阅与生物信息学分析，确定适合作为核酸适配体检测靶点的靶蛋白上的具体抗原表位区域，具体如下：

(1)选择EVD68病毒VP1蛋白上具有较强免疫原性的区域(第12～290位氨基酸)作为适配体筛选靶蛋白，靶蛋白具有如Seq ID No.2所示序列；

Seq ID No.2：

QVESIIKTATDTVKSEINAELGVVPSLNAVETGATSNTEPEEAIQTRTVINQHGVSETLVENFLGRAALVSKKSFEYKNHASSSAGTHKNFFKWTINTKSFVQLRRKLELFTYLRFDAEITILTTVAVNGNNDSTYMGLPDLTLQAMFVPTGALTPKEQDSFHWQSGSNASVFFKISDPPARMTIPFMCINSAYSVFYDGFAGFEKNGLYGINPADTIGNLCVRIVNEHQPVGFTVTVRVYMKPKHIKAWAPRPPRTMPYMSIANANYKGRDTAPNTLN。

(2)根据已确定的氨基酸序列，直接在生物公司进行核苷酸序列的合成以及原核密码子优化，将合成的基因片段插入原核表达载体pET32a的BamH I/Hind III的酶切位点上。核酸序列合成以及将其插入原核表达载体pET32a都是由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

获得克隆载体后，诱导表达出相应用于适配体筛选的靶蛋白，具体包括：①先将预活化的菌液按1:100接入新鲜LB培养基中，置于37℃培养2～2.5h使菌液OD值＝0.6～0.8左右；②将菌液在冰水混合物中进行降温处理；③加入终浓度0.1mM IPTG，16℃，诱导15h。

2、构建适配体文库与引物设计

(1)通过生工生物工程(上海)股份有限公司的基因合成服务，体外合成含有40个随机序列的单链DNA文库，其包括10¹⁴个ssDNA，即初始单链DNA随机文库，单链DNA的核苷酸序列如下：

5’-TTCAGCACTCCACGCATAGC-(N40)-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’

其中，N40即40个随机序列的单链DNA。

(2)针对核酸适配体5’端固定序列，设计并合成上游引物P1，上游引物P1具体为Seq ID No.3所示序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

Seq ID No.3：5’-TTCAGCACTCCACGCATAGC-3’。

(3)针对核酸适配体3’端固定序列，设计并合成的下游引物P2，下游引物P2具体为Seq ID No.4所示序列，同时在引物5’端连接有生物素基团(biotin)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

Seq ID No.4：5’-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’。

3、利用SELEX技术从文库中筛选核酸适配体

(1)阳性筛选：将10nmol的初始单链DNA随机文库溶解在500μL的PBS溶液中，用92℃的恒温水浴锅水浴5min，之后迅速的插入冰中冰浴10min，之后将经过处理的初始单链DNA随机文库与Seq ID No.2所示序列的靶蛋白在冰上孵育1h，再加入Ni-NTA MagneticAgarose Beads，继续孵育1h。孵育完成后，使用磁性分离器吸附，去除上清，用2mL的PBS洗涤Beads。最后用10mL预冷的PBS重悬Beads，使之充分吹打混匀，之后92℃恒温水浴10min，13000g离心，收集上清，即为第一轮筛选后特异性识别靶蛋白的单链DNA文库。

(2)PCR扩增：对第一轮筛选后特异性识别靶蛋白的单链DNA文库进行PCR扩增，以制备次级文库。PCR反应的体系如下：Premix Tap Mix 25μL、筛选后的单链DNA文库8μL、上游引物P1 2.5μL、下游引物P2 2.5μL、ddH₂O 12μL，总体积为50μL。按照如下的程序进行PCR循环扩增：95℃变性3min，然后进入35个循环扩增：95℃30s、55℃30s、72℃30s，循环结束后，72℃延伸10min，最后维持在16℃终止反应。对经过PCR扩增后的文库进行琼脂糖凝胶回收以得到纯净的文库片段，回收试剂盒采用

Gel Extraction Kit。

(3)次级单链DNA文库制备：对扩增得到的次级文库进行进一步的制备：将琼脂糖凝胶回收的文库片段与100μL链酶亲和素标记的磁珠常温孵育20min，利用双链DNA文库上的生物素与链酶亲和素的亲和作用将双链DNA文库结合到磁珠的表面，之后使用磁性分离器吸附，去除上清，用2mL的PBS洗涤磁珠。加入终浓度为200mM的NaOH溶液常温反应10min使得双链DNA文库变性变成单链，其中带有生物素标记的一条链会结合在磁珠上，不带生物素标记的那一条链会脱离到上清液中。收集上清液，用脱盐柱除去NaOH，最后加入500μL的PBS，收集到的溶液即为下一轮筛选所需要用到的单链DNA文库。

(4)重复前述步骤(1)阳性筛选、(2)PCR扩增和(3)次级单链DNA文库制备15次，最后筛选得到的单链DNA文库对于靶蛋白的识别能力最强。

将最后筛选获得的单链DNA送擎科生物科技有限公司测序。

测序结果显示，本例最后筛选得到的单链DNA为Seq ID No.1所示序列，即本例用于检测EVD68病毒的核酸适配体。

Seq ID No.1：

5’-TTCAGCACTCCACGCATAGCTGACGTCATCCATACTGACGCACATGAGTGAGTAGACCCACCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’。

(5)为了能在反应体系内对反应产物进行灵敏检测，本例在Seq ID No.1所示序列的核酸适配体的5’端标记FAM荧光基团。带有FAM荧光基团标记的核酸适配体由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例2核酸适配体的验证

1、二级结构预测

本例采用结构预测软件RNA Structure Program，对实施例1筛选获得的Seq IDNo.1所示序列的核酸适配体进行二级结构预测，结果如图1所示。

图1的结果显示，Seq ID No.1所示序列的核酸适配体可以形成特殊的茎环结构和发卡结构。

2、核酸适配体与靶蛋白的结合力测试

使用ForteBio Octet RED96相互作用分析仪检测核酸适配体与靶蛋白的结合力，并设置PBS作为对照试验，实验原理与操作步骤参考如下网页：

http://hzaml.hzau.edu.cn/info/1107/3266.htm#/

ForteBio Octet RED96相互作用分析仪检测结果如表1所示。

表1核酸适配体与靶蛋白的结合力测试结果

适配体	与靶蛋白的解离常数Kd(nM)
		EVD68病毒-aptamer	8.0
PBS对照	无结合

表1的结果显示，Seq ID No.1所示序列的核酸适配体能与EVD68的VP1蛋白特异性结合。

3、特异性检测

本例分别采用人血白蛋白、免疫血清球蛋白、EVD68病毒VP1蛋白与核酸适配体进行特异性检测，实验原理与操作步骤可参考如下网页：

http://hzaml.hzau.edu.cn/info/1107/3266.htm#/

实验结果显示，实施例1的核酸适配体与人血白蛋白、免疫血清球蛋白都无结合，只与EVD68病毒VP1蛋白结合；说明实施例1的核酸适配体具有较好的特异性。

4、稳定性测试

在常温下，取0.2μg实施例1的核酸适配体放到1mL的血清中，另取0.2μg实施例1的核酸适配体放到水溶液中。常温放置4周后用RT-PCR检测。上游引物P1即Seq ID No.3所示序列，下游引物P2即Seq ID No.4所示序列，PCR反应的体系如下：Premix Tap Mix 25μL、溶于血清或者水溶液的核酸适配体8μL、上游引物P1 2.5μL、下游引物P2 2.5μL、ddH₂O 12μL，总体积为50μL。按照如下的程序进行PCR循环扩增：95℃变性3min，然后进入35个循环扩增：95℃30s、55℃30s、72℃30s，循环结束后，72℃延伸10min，最后维持在16℃终止反应。

检测结果显示，常温放置的核酸适配体结构稳定，没有发生降解。

5、病毒感染实验

用EVD68病毒感染敏感宿主细胞，同时设置没有感染的阴性对照组。细胞铺在6孔板中，感染时的MOI为0.1，37℃细胞培养箱中培养36h。感染36h后用胰酶消化细胞，每孔加入200μL胰酶，2000rpm离心，得到细胞沉淀并去除上清液，再用500μL的PBS重悬。对细胞进行固定与透化处理，具体参考网页https://www.novopro.cn/articles/201606271111.html#/；再将对应EVD68病毒的带有荧光基团标记的核酸适配体分别与感染病毒的细胞悬液以及未感染对照组细胞悬液混合处理1h，使终浓度达到1μg/mL左右的浓度，采用流式细胞仪分析计算FAM通道的荧光数值。

结果显示，感染了EVD68病毒的细胞样品所对应的核酸适配体标记荧光数值显著升高，说明实施例1筛选得到的核酸适配体可用作EVD68病毒感染的检测。

实施例3用于检测EVD68病毒的试剂盒

本例用于检测EVD68病毒的试剂盒包含以下配方：

(A)固定样本溶液的蛋白包被板；本例采用96孔蛋白包被板；

(B)蛋白包被液；

(C)封闭液；

(D)漂洗液；

(E)样本前处理液；

(F)实施例1筛选的带有FAM荧光基团标记的核酸适配体。

其中，(A)用于固定样本溶液的96孔蛋白包被板：直接使用市面上销售的具有蛋白吸附能力的ELISA酶标板。(B)蛋白包被液：属于常规分子检测试剂，配方为35mM NaHCO₃、13mM Na₂CO₃，pH 9.3-pH 9.9，使用双蒸水配置。(C)封闭液：属于常规分子检测试剂，配方为136mM NaCl、2.6mM KCl、2mM KH₂PO₄、8mM Na₂HPO₄、0.05％Tween-20、1％BSA，pH 7.1-pH7.5，使用双蒸水配置。(D)漂洗液：属于常规分子检测试剂，配方为136mM NaCl、2.6mM KCl、2mM KH₂PO₄、8mM Na₂HPO₄、0.05％Tween-20、pH 7.1-pH 7.5，使用双蒸水配置。(E)样本前处理液：属于常规分子检测试剂，配方为150mM NaCl、1％Triton X-100、50mM Tris，pH7.8-pH8.2。(F)带有荧光基团标记的核酸适配体：将实施例1合成的带有FAM荧光基团标记的核酸适配体溶解到TE缓冲液溶中，使用时配制工作浓度为200nM。

实施例4试剂盒的应用

取50份已确认EVD68病毒阳性的临床咽拭子样本与50份已确认无EVD68病毒作为对照的临床咽拭子样本，采用实施例4的试剂盒进行病毒感染实验。

与此同时，采用三个市售的EVD68病毒抗原检测试剂盒作为对照，三个市售的EVD68病毒抗原检测试剂盒分别标记为试剂盒A、试剂盒B和试剂盒C。

具体实验方法为：

1、使用前让所有试剂和样品恢复至室温，将待测样品用包被液进行稀释。

2、向相应的孔中添加100μL的待测样品，室温孵育2小时。包被时间可根据实际情况进行优化调整。

3、弃溶液并用漂洗液洗涤2次，每次在样品孔中加入200μL漂洗液。在完成最后一次洗涤后，通过吸取或倾倒而将残留的漂洗液进行去除。

4、向样品孔中添加200μL封闭液，室温孵育2小时。

5、弃溶液。重复第3步的洗涤步骤。

6、向样品孔中添加100μL带有荧光基团标记的核酸适配体，避光室温孵育2小时。孵育时间可根据实际检测的荧光信号强度进行优化调整。

7、弃溶液。重复第3步的洗涤步骤，共进行4次洗涤。

8、使用全波段激光酶标仪对样品孔进行检测，设置如下：激发波长为494nm，检测波长为522nm。

结果判断方式为：荧光数值大于50即为阳性结果。

统计实施例4试剂盒以及作为对照的试剂盒A、试剂盒B和试剂盒C，对50份EVD68病毒阳性样本和50份无EVD68病毒对照样本的检测结果，结果如表2所示。

表2核酸适配体及抗原检测试剂盒对阳性样本和对照样本的检测结果

	核酸适配体	试剂盒A	试剂盒B	试剂盒C
					EVD68病毒阳性样本	47/50	45/50	46/50	45/50
无EVD68病毒的对照样本	0/50	1/50	1/50	0/50

表2中的数据分别为，阳性结果和样本数，例如“47/50”是指50份EVD68病毒阳性样本中检出为阳性结果的数量是47份，“0/50”是指50份无EVD68病毒的对照样本中检出为阳性结果的数量是0份。

表2的结果显示，实施例4的试剂盒能够有效的检出EVD68病毒阳性样本，其灵敏度为94％，而对于无EVD68病毒的对照样本没有假阳性检出；而试剂盒A、试剂盒B和试剂盒C对EVD68病毒阳性样本的灵敏度都低于实施例1筛选的核酸适配体，并且，试剂盒A和试剂盒B分别有假阳性检出。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 世通兰达（深圳）生物科技发展有限公司

<120> 一种用于检测EVD68病毒的核酸适配体、试剂盒及应用

<130> 21I33069

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 80

<212> DNA

<213> EVD68病毒核酸适配体

<400> 1

ttcagcactc cacgcatagc tgacgtcatc catactgacg cacatgagtg agtagaccca 60

cctatgcgtg ctaccgtgaa 80

<210> 2

<211> 279

<212> PRT

<213> EVD68病毒VP1蛋白免疫原性区域

<400> 2

Gln Val Glu Ser Ile Ile Lys Thr Ala Thr Asp Thr Val Lys Ser Glu

1 5 10 15

Ile Asn Ala Glu Leu Gly Val Val Pro Ser Leu Asn Ala Val Glu Thr

20 25 30

Gly Ala Thr Ser Asn Thr Glu Pro Glu Glu Ala Ile Gln Thr Arg Thr

35 40 45

Val Ile Asn Gln His Gly Val Ser Glu Thr Leu Val Glu Asn Phe Leu

50 55 60

Gly Arg Ala Ala Leu Val Ser Lys Lys Ser Phe Glu Tyr Lys Asn His

65 70 75 80

Ala Ser Ser Ser Ala Gly Thr His Lys Asn Phe Phe Lys Trp Thr Ile

85 90 95

Asn Thr Lys Ser Phe Val Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu Leu Phe Thr

100 105 110

Tyr Leu Arg Phe Asp Ala Glu Ile Thr Ile Leu Thr Thr Val Ala Val

115 120 125

Asn Gly Asn Asn Asp Ser Thr Tyr Met Gly Leu Pro Asp Leu Thr Leu

130 135 140

Gln Ala Met Phe Val Pro Thr Gly Ala Leu Thr Pro Lys Glu Gln Asp

145 150 155 160

Ser Phe His Trp Gln Ser Gly Ser Asn Ala Ser Val Phe Phe Lys Ile

165 170 175

Ser Asp Pro Pro Ala Arg Met Thr Ile Pro Phe Met Cys Ile Asn Ser

180 185 190

Ala Tyr Ser Val Phe Tyr Asp Gly Phe Ala Gly Phe Glu Lys Asn Gly

195 200 205

Leu Tyr Gly Ile Asn Pro Ala Asp Thr Ile Gly Asn Leu Cys Val Arg

210 215 220

Ile Val Asn Glu His Gln Pro Val Gly Phe Thr Val Thr Val Arg Val

225 230 235 240

Tyr Met Lys Pro Lys His Ile Lys Ala Trp Ala Pro Arg Pro Pro Arg

245 250 255

Thr Met Pro Tyr Met Ser Ile Ala Asn Ala Asn Tyr Lys Gly Arg Asp

260 265 270

Thr Ala Pro Asn Thr Leu Asn

275

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttcagcactc cacgcatagc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttcacggtag cacgcatagg 20

Claims (8)

1.一种用于检测EVD68病毒的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体为Seq IDNo.1所示序列的核酸片段；

Seq ID No.1：

5’-TTCAGCACTCCACGCATAGCTGACGTCATCCATACTGACGCACATGAGTGAGTAGACCCACCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’。

2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体的核酸序列上结合有荧光物质、纳米发光材料、生物素、地高辛和酶标记中至少一种。

3.根据权利要求2所述的核酸适配体，其特征在于：所述荧光物质为荧光基团，所述荧光基团为FAM荧光基团或Cy5荧光基团；

所述纳米发光材料为量子点或上转换发光材料；

所述酶标记为辣根过氧化物酶、蔗糖酶或功能性多肽。

4.一种用于检测EVD68病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括权利要求1-3任一项所述的核酸适配体。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包括以下中的至少一种，

（A）固定样本溶液的蛋白包被板；

（B）蛋白包被液；

（C）封闭液；

（D）漂洗液；

（E）样本前处理液。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白包被液的配方为，35mM NaHCO₃、13mM Na₂CO₃，pH9.3-pH9.9；

所述封闭液的配方为，136mM NaCl、2.6mM KCl、2mM KH₂PO₄、8mM Na₂HPO₄、0.05% Tween-20、1% BSA，pH7.1-pH7.5；

所述漂洗液的配方为，136mM NaCl、2.6mM KCl、2mM KH₂PO₄、8mM Na₂HPO₄、0.05% Tween-20，pH7.1-pH7.5；

所述样本前处理液的配方为，150mM NaCl、1% Triton X-100、50mM Tris、pH7.8-pH8.2。

7.如权利要求1-3任一项所述的核酸适配体或者权利要求4-6任一项所述的试剂盒在制备诊断EVD68病毒引起的疾病的工具中的应用。

8.一种非诊断治疗目的的EVD68病毒的检测方法，其特征在于：包括采用权利要求1-3任一项所述的核酸适配体，或者权利要求4-6任一项所述的试剂盒，对环境、食品、工具、离体样本或生物源性材料进行EVD68病毒检测。

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