CN117025612A - 偏肺病毒检测的核酸适配体、试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种偏肺病毒检测的核酸适配体、试剂盒及应用，该核酸适配体包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；本发明还提供了含有该核酸适配体的试剂盒。此试剂盒用于检测感染样本中偏肺病毒含量时，具有操作简单、反应迅速、准确性高和灵敏度高的特点，还可结合酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜等检测装置，实现对于病毒的精确检测。试剂盒特异性好，测量范围宽有着良好的市场前景。

Description

偏肺病毒检测的核酸适配体、试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种偏肺病毒检测的核酸适配体、试剂盒及应用。
背景技术
人偏肺病毒(human metapenu-movirus，hMPV)属于副黏病毒科，偏肺病毒属，是一种有包膜的单负链RNA病毒。目前的研究认为，偏肺病毒引起的感染主要发生在冬季，特别是12月份至1月份，是病毒流行及检出的高峰期。其主要易感人群为儿童、老年人与免疫力低下患者。主要通过咳嗽和打喷嚏的分泌物，密切接触等方式传播。偏肺病毒感染后的常见临床表现为发烧、咳嗽、缺氧、气喘、呼吸道感染等症状，往往被诊断为细支气管炎、支气管炎和肺炎。目前偏肺病毒的实验室诊断方法有病毒分离、血清学诊断、RT-PCR、酶联免疫扩增杂交分析等。
对于偏肺病毒的样品检测在临床检测以及实验研究中十分重要。目前市面上针对偏肺病毒的检测试剂盒都是抗原检测，以单通道检测为主。而且市售抗原检测试剂盒用的是抗体检测，抗体作为一种蛋白成分，具有不易表达合成、易降解、存在非特异性免疫原性等缺点。因此有必要开发一种特异性高、灵敏度高的偏肺病毒检测方法。
发明内容
本发明提供一种偏肺病毒检测的核酸适配体、试剂盒及应用该适配体灵敏度较高、特异性好、测量范围宽、操作简单、可用于快速检测靶蛋白、适合大规模推广，有着良好的市场前景。
本发明的技术方案是，一种偏肺病毒检测的核酸适配体，该核酸适配体包含如SEQID NO.1所示的核苷酸序列。
进一步地，所述核酸适配体在核苷酸序列上结合有荧光物质、纳米发光材料、生物素、地高辛或酶标记。
更进一步地，所述荧光物质为FAM荧光基团或Cy5荧光基团；或，所述纳米发光材料为量子点或上转换纳米颗粒；或，所述酶标记为辣根过氧化物酶或蔗糖酶。
进一步地，所述核苷酸序列上的任意位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化修饰。
本发明还涉及一种用于偏肺病毒检测的试剂盒，其包括至少一种上述的核酸适配体。
进一步地，该试剂盒还包括以下内容：
(A)用于固定样本溶液的蛋白包被板；
(B)蛋白包被液；
(C)封闭液；
(D)漂洗液；
(E)样本前处理液。
进一步地，所述蛋白包被液的配方为：35mM NaHCO3和13mM Na2CO3，蛋白包被液的pH为9.5～9.8。
进一步地，所述封闭液的配方为136mM NaCl，2.6mM KCl，2mM KH2PO4，8mMNa2HPO4，0.05％ Tween-20和1％ BSA；封闭液的pH为7.1～7.5；所述漂洗液的配方为136mMNaCl，2.6mM KCl，2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4和0.05％ Tween-20，其pH为7.1～7.5。
进一步地，所述样本前处理液的配方为：150mM NaCl,1％ Triton X-100和50mMTris,其pH为7.8～8.2。
本发明还涉及所述的核酸适配体和/或所述的检测试剂盒在检测感染样本中偏肺病毒含量中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明通过SELEX技术筛选得到的针对偏肺病毒靶蛋白抗原表位的核酸适配体具有较高的特异性和亲和力，并且具有无免疫原性、分子小、可进行修饰、合成容易、不易降解、无毒等优点。
2、本发明提供的含有偏肺病毒检测核酸适配体的试剂盒，对偏肺病毒的检测具有较高的灵敏度与特异性，在偏肺病毒感染病人样本和健康人样本的检测中，偏肺病毒感染病人的阳性检出率，即灵敏度为96％；健康人群检测的阳性检出率为0％；其具有灵敏度较高、特异性好、测量范围宽、操作简单的优点，可以快速检测靶蛋白、适合大规模推广，有着良好的市场前景。
3、本发明试剂盒采用核酸适配体作为检测物，能有效克服不易表达合成、易降解、存在非特异性免疫原性等问题，还具有分子小、可进行修饰、合成容易、不易降解、无毒、无免疫原性等优点。
附图说明
图1为本发明核酸适配体--偏肺病毒-aptamer核苷酸序列的二级结构图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
本发明以偏肺病毒靶蛋白抗原表位具有如SEQ ID NO.2所示序列氨基酸，通过SELEX技术筛选所得本申请的偏肺病毒的核酸适配体，再联接上荧光基团，以便观察和识别；最后将所述核酸适配体用于制备检测试剂盒，具体包括：
1、确定待测靶蛋白抗原表位
通过文献查阅与生物信息学分析，本发明人确定了偏肺病毒靶蛋白抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2：
2、筛选特异性结合的核酸适配体序列
体外合成一个含有40个随机序列的单链DNA文库；以偏肺病毒靶蛋白抗原表位为筛选条件，采用SELEX技术筛选出具有高特异性、高亲和力的DNA适配体序列，偏肺病毒的核酸适配体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3、合成带有荧光基团标记的核酸适配体
将筛选得到的核酸适配体序列以共价键的形式在核酸适配体5’端连上荧光基团。检测偏肺病毒的核酸适配体具有如下序列，所带荧光基团为FAM。
5’-TTCAGCACTCCACGCATAGC-(N40)-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’
4、制备试剂盒
试剂盒包括以下组分：A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液，C)封闭液，D)漂洗液，E)带有荧光基团标记的核酸适配体，和F)样本前处理液。
下面将结合实施例及实验数据对偏肺病毒检测的核酸适配体和试剂盒进行详细说明。
实施例1用于检测偏肺病毒的核酸适配体
1、确定偏肺病毒靶蛋白抗原表位
根据文献查阅与生物信息学分析，确定适合作为核酸适配体检测靶点的靶蛋白上的具体抗原表位区域。
(1)选择偏肺病毒上多个具有较强免疫原性的抗原表位，构建融合表达蛋白作为适配体筛选靶蛋白，具有如下所示序列：
(2)根据已确定的氨基酸序列，直接在申请人公司进行核苷酸序列的合成以及原核密码子优化，将合成的基因片段插入原核表达载体pET32a的BamH I/Hind III的酶切位点上。诱导表达出相应用于适配体筛选的靶蛋白。
2、构建适配体文库与引物设计
(1)通过常规生物技术服务公司的基因合成服务，体外合成含有40个随机序列的单链DNA文库，其核苷酸序列如下：
(2)针对核酸适配体5’端固定序列，设计合成的上游引物P1，具有如下序列：5’-TTCAGCACTCCACGCATAGC-3’。
(3)针对核酸适配体3’端固定序列，设计合成的下游引物P2，具有如下序列，5’-biotin-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’。同时在引物5’端连接有生物素基团。
3、利用SELEX筛选技术，从文库中筛选得到能有效结合靶蛋白的核酸适配体序列
(1)将10nmol的初始单链DNA随机文库溶解在500μl的PBS溶液中，用92℃的恒温水浴锅水浴5min，之后迅速的插入冰中冰浴10min，之后将经过处理的初始单链DNA随机文库与相应靶蛋白在冰上孵育1h，再加入Ni-NTA Magnetic Agarose Beads，继续孵育1h。孵育完成后，使用磁性分离器吸附，去除上清，用2ml的PBS洗涤Beads。最后用10ml预冷的PBS重悬Beads，使之充分吹打混匀，之后92℃恒温水浴10min，13000g离心，收集上清，即为第一轮筛选后特异性识别靶蛋白的单链DNA文库。
(2)对筛选后的单链DNA文库进行PCR扩增，以制备次级文库。PCR反应的体系如下：Premix Tap Mix 25μl，筛选后的单链DNA文库8μl，上游引物2.5μl，下游引物2.5μl，ddH2O12μl，总体积为50μl。按照如下的程序进行PCR循环扩增：95℃变性3min，经过35个循环扩增程序为95℃30s，55℃30s，72℃30s，最终的延伸为72℃10min，最后维持在16℃终止反应。对经过PCR扩增后的文库进行琼脂糖凝胶回收以得到纯净的文库片段。
(3)对扩增得到的次级文库进行进一步的制备。将扩增后的双链DNA文库与100μl链酶亲和素标记的磁珠常温孵育20min，利用双链DNA文库上的生物素与链酶亲和素的亲和作用将双链DNA文库结合到磁珠的表面，之后使用磁性分离器吸附，去除上清，用2ml的PBS洗涤磁珠。加入终浓度为200mM的NaOH溶液常温反应10min使得双链DNA文库变性变成单链，其中带有生物素标记的一条链会结合在磁珠上，不带生物素标记的那一条链会脱离到上清液中。收集上清液，用脱盐柱除去NaOH，最后加入500μl的PBS，收集到的溶液即为下一轮筛选所需要用到的单链DNA文库。
(4)重复上述(1)～(3)的制备过程15次，最后筛选得到的单链DNA文库对于靶蛋白的识别能力最强。将所得到的单链DNA文库进行克隆测序后，最终得到了本发明中所筛选出来的可用于检测偏肺病毒的核酸适配体，其DNA序列为：偏肺病毒-aptamer如SEQ ID NO.1所示：
SEQ ID NO.1:
(5)为了能在反应体系内对反应产物进行灵敏检测，给适配体5’端标记上荧光基团(共价键结合的形式，直接在常规生物技术服务公司合成)，最终的试剂盒里的适配体信息如下：偏肺病毒-aptamer，具有如下序列：
5’-FAM-TTCAGCACTCCACGCATAGCTAGATTTTAGTAGCACAAAAAGCTTATATAACTAGAGCCCCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’。
实施例2
针对实施例1筛选出来的具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的核酸适配体。在5’端标记上Cy5荧光基团，其标记方法可参考《荧光标记寡核苷酸探针及其应用》，杜金伟等，中国生物工程杂志，第22卷第4期。最终所得适配体具有如下序列。
5’-Cy5-TTCAGCACTCCACGCATAGCAGATACGCGAGGGGTCATTTGTATATACCCTATGCCTGGTTACCCCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’。
实施例3
针对实施例1筛选出来的具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的核酸适配体。在5’端标记上纳米荧光量子点，具体标记方法可参考《采用量子点标记的寡核苷酸探针检测ApoEε4等位基因》，杨华静等，华中科技大学学报(医学版)，2008(04)。
得到序列如下：
5’-QD-TTCAGCACTCCACGCATAGCAGATACGCGAGGGGTCATTTGTATATACCCTATGCCTGGTTACCCCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’。
实施例4
针对实施例1筛选出来的具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的核酸适配体。在5’端标记上辣根过氧化物酶，标记方法可参考《HRP标记DNA探针的制备及杂交条件探讨》，何燕等，贵阳医学院学报，2001(02)。得到如下序列。
5’-HRP-TTCAGCACTCCACGCATAGCAGATACGCGAGGGGTCATTTGTATATACCCTATGCCTGGTTACCCCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’。
实施例5
针对实施例1筛选出来的具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的核酸适配体。在5’端进行磷酸化，得到如下序列。
5’-P-TTCAGCACTCCACGCATAGCAGATACGCGAGGGGTCATTTGTATATACCCTATGCCTGGTTACCCCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’。
实施例6
针对实施例1筛选出来的具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的核酸适配体。在5’端进行氨基化。得到如下所示序列：
5’-amino-TTCAGCACTCCACGCATAGCAGATACGCGAGGGGTCATTTGTATATACCCTATGCCTGGTTACCCCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’。
实施例7
针对实施例1筛选出来的具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的核酸适配体。在5’端进行巯基化。得到如下所示序列：
5’-SH-TTCAGCACTCCACGCATAGCAGATACGCGAGGGGTCATTTGTATATACCCTATGCCTGGTTACCCCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’。
实施例8核酸适配体的验证
通过结构预测软件RNA Structure Program来分析预测筛选出来的核酸适配体的二级结构，结果显示该核酸适配体(SEQ ID NO.1)可以形成特殊的茎环结构和发卡结构。偏肺病毒-aptamer可形成如图1所示的二级结构。
实施例9
使用ForteBio Octet RED96相互作用分析仪检测核酸适配体与靶蛋白的结合力，并设置PBS作为对照组，检测方法可参考《基于生物膜干涉技术检测PDL1抗体与PDL1抗原的亲和力》，胡妍等，生物技术进展.2021,11(06)；所得结果见下表1。
表1
适配体 与靶蛋白的解离常数Kd(nM)
偏肺病毒-aptamer 7.9
PBS对照 无结合
实施例10
取0.2μg适配体，分别放置于常温血清、水溶液中。4周后进行RT-PCR检测(同时检测的对照样品为新鲜的0.2μg适配体、无菌水)，发现处理组样品能扩增出完整条带，并且条带亮度与对照组条带亮度一致，表明适配体没有发生降解。
实施例11
用偏肺病毒感染敏感宿主细胞，同时设置没有感染的阴性对照组。感染36h后用胰酶消化细胞，离心得到细胞沉淀并去除上清液，再用PBS重悬。对细胞进行固定与透化处理(参考此网页介绍：https://www.novopro.cn/articles/201606271111.html#/)，再将对应偏肺病毒的带有荧光基团标记的核酸适配体分别与感染病毒的细胞悬液以及未感染对照组细胞悬液混合处理1h，通过流式细胞仪分析计算。具体见表3。
表3
检测对象 荧光强度倍数
未感染对照组 1
感染组 6.86
结果显示感染了偏肺病毒的细胞样品所对应的核酸适配体标记荧光数值显著升高，说明筛选得到的适配体可用作病毒感染的检测。
实施例12用于检测偏肺病毒的试剂盒的制备
(A)用于固定样本溶液的96孔蛋白包被板：使用具有蛋白吸附能力的ELISA酶标板；
(B)蛋白包被液：配方为35mM NaHCO3，13mM Na2CO3,pH 9.5-pH 9.8，使用双蒸水配置。
(C)封闭液：配方为136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,1％ BSA,pH 7.1-pH 7.5，使用双蒸水配置。
(D)漂洗液：配方为136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.1-pH 7.5，使用双蒸水配置。
(E)带有荧光基团标记的核酸适配体：实施例1(5)得到的带有荧光基团标记的核酸适配体用TE缓冲液溶解并配置到工作浓度(200nM)。
(F)样本前处理液：配方为150mM NaCl,1％ Triton X-100,50mM Tris,pH7.8-pH8.2。
将上述A、B、C、D、E、F混合，即可制备得到检测EB病毒的试剂盒。
实施例13试剂盒的应用
取50份已确认偏肺病毒阳性的样本与50份已确认无偏肺病毒的对照样本。取市售某品牌病毒抗原检测试剂盒与实施例12所得检测EB病毒的核酸适配体检测试剂盒同时做平行实验。实验结果如下表4：
表4
上述实施例只为说明本发明的技术思路和特点，所述内容仅为本发明的较佳实施例，但本发明的保护范围并不局限于此。在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等效变化或改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1. 一种偏肺病毒检测的核酸适配体，其特征在于：该核酸适配体包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体的核苷酸序列上结合有荧光物质、纳米发光材料、生物素、地高辛或酶标记。
3.根据权利要求2所述的核酸适配体，其特征在于：所述荧光物质为FAM荧光基团或Cy5荧光基团；所述纳米发光材料为量子点或上转换纳米颗粒；所述酶标记为辣根过氧化物酶或蔗糖酶。
4.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于：所述核苷酸序列上的任意位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化修饰。
5.一种用于偏肺病毒检测的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1~4任意一项所述的核酸适配体。
6.根据权利要求5述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括以下内容：
（A）用于固定样本溶液的蛋白包被板；
（B）蛋白包被液；
（C）封闭液；
（D）漂洗液；
（E）样本前处理液。
7. 根据权利要求6述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白包被液的配方为：35mM NaHCO3和13mM Na2CO3，蛋白包被液的pH 为9.5~9.8。
8. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭液的配方为136mM NaCl，2.6mM KCl，2mM KH2PO4，8mM Na2HPO4，0.05% Tween-20和1% BSA；封闭液的pH 为7.1~7.5；所述漂洗液的配方为136mM NaCl，2.6mM KCl，2mM KH2PO4, 8mM Na2HPO4和0.05% Tween-20，其pH为7.1~7.5。
9. 根据权利要求6所述的一种用于检测偏肺病毒的试剂盒，其特征在于，所述样本前处理液的配方为：150mM NaCl, 1% Triton X-100和50mM Tris, 其pH为7.8~8.2。
10.权利要求1-4任意一项所述的核酸适配体和/或权利要求5-9任意一项所述的检测试剂盒在检测感染样本中偏肺病毒含量中的应用。
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