CN112526130A - 检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒及其应用 - Google Patents

检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112526130A
CN112526130A CN202011479228.5A CN202011479228A CN112526130A CN 112526130 A CN112526130 A CN 112526130A CN 202011479228 A CN202011479228 A CN 202011479228A CN 112526130 A CN112526130 A CN 112526130A
Authority
CN
China
Prior art keywords
norovirus
aptamer
rotavirus
kit
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202011479228.5A
Other languages
English (en)
Inventor
张祺
刘为勇
刘芳
刘映乐
屈三甫
梅益
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan University WHU
Original Assignee
Wuhan University WHU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan University WHU filed Critical Wuhan University WHU
Priority to CN202011479228.5A priority Critical patent/CN112526130A/zh
Publication of CN112526130A publication Critical patent/CN112526130A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1048—SELEX
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/14—Reoviridae, e.g. rotavirus, bluetongue virus, Colorado tick fever virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种针对A组轮状病毒、诺如病毒II型的核酸适配体检测试剂盒，还提供了试剂盒的制备方法和应用。此试剂盒检测时具有操作简单、反应迅速、准确性高和灵敏度高的特点，可结合酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜等检测装置，就可以实现对于两种病毒的精确检测。试剂盒灵敏度较高、特异性好、测量范围宽、操作简单、可以同时检测两种病毒、有着良好的市场前景。

Description

检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒及其应用
技术领域
本申请涉及生物体外检测，具体地说，本发明涉及同时检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒，制备试剂盒的方法，以及试剂盒在同时检测轮状病毒、诺如病毒样本中的应用。
背景技术
轮状病毒(Rotavirus，RV)是一种双链核糖核酸病毒，隶属于呼肠孤病毒科，是引起婴幼儿腹泻的主要病原体之一，主要感染小肠上皮细胞，进而引起细胞损伤，导致腹泻。轮状病毒总共有七种，以英文字母编号为A、B、C、D、E、F和G，其中A组RV是导致全球5岁以下儿童严重脱水性腹泻的主要病原。由于在RV每次感染后人体的免疫力会逐渐的增强，所以成人很少会受到其影响。轮状病毒每年在夏秋冬季流行，借由粪口途径传染，轮状病毒感染会导致严重的腹泻，造成婴儿与幼儿总计超过50％以上因为严重腹泻而住院治疗的案例，有时候甚至会因为脱水而导致死亡。对于轮状病毒A种传染病的专门诊断方式是对病患的粪便利用酶联免疫法识别病毒。逆转录聚合酶链锁反应(RT-PCR)可以检测并识别所有种与所有血清型的人类轮状病毒。
诺如病毒(Norovirus,NV)，又称诺瓦克病毒(Norwalk Viruses,NV)是人类杯状病毒科中诺如病毒属的一种病毒。诺如病毒感染发病的主要表现为腹泻和/或呕吐，国际上通常称之为急性胃肠炎，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。诺如病毒分5个基因组(GⅠ～GⅤ)，其中只有GⅠ、GⅡ和GⅣ可以感染人，我国目前最常见的诺如病毒为GⅡ、GⅠ型。诺如病毒传播途径包括人传人、经食物和经水传播。诺如病毒变异快、环境抵抗力强、感染剂量低，感染后潜伏期短、排毒时间长、免疫保护时间短，且传播途径多样、全人群普遍易感，具有高度传染性和快速传播的能力，血清抗体水平调查显示中国人群中诺如病毒感染的情况十分常见。对于检测诺如病毒GI群和GII群，Real-time RT-PCR的敏感性高于传统RT-PCR。
对于A组轮状病毒、诺如病毒II型的样品检测在临床检测以及实验研究中十分重要。现有的技术中对于病毒感染或者病毒蛋白的检测多采用特异性的抗体进行识别，制备比较复杂，步骤比较繁琐，成本较高，在大规模推广中有一定的缺陷。核酸适配体是一段单链核酸(一般大小在20～60个碱基左右)，能通过折叠形成特定的三维结构并与相对应的靶分子进行高亲和力、高特异性的结合。核酸适配体可以通过模拟自然进化过程的人工筛选技术-指数富集配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment，SELEX)筛选得到，是一种具有识别功能的新型核酸分子。利用SELEX技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性的与靶物质高度亲和的核酸适配体，该技术已经成功的运用于许多靶物质的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、蛋白质、氨基酸以及各种细胞因子等。该技术具有库容量大、适应范围广泛、分辨率高、亲和力高，筛选过程相对简便、快速、经济，实用性高等特点。适配体对应靶标物质的高特异性和高亲和性的特点与抗体的功能类似，但是适配子的靶标范围更加的广泛，可以很好地运用于医学检测、诊断和治疗等多个方面。
核酸适配体具有特异性和高亲和力的原因是单链核酸在遇到靶标分子时可以形成例如口袋、发卡、G-四聚体等独特的三维结构，这些结构在结合靶标分子时的原理与抗体特异性识别相应抗原决定簇的原理类似，例如通过氢键、疏水结构、离子键等与靶标分子特异性的结合。基于适配体具有较高特异性地识别病原微生物或者病变细胞的生物学特性，核酸适配体能被广泛的应用于检测技术以及生物传感器的构建，能够实现对于病原体或者疾病的精准诊断。
目前市面上针对A组轮状病毒、诺如病毒II型的抗原检测试剂盒都是单通道检测，也就是一次反应只能检测一种抗原，无法做到同一个反应中对两种或两种以上病毒抗原的检测。而且市售抗原检测试剂盒用的是抗体检测，抗体作为一种蛋白成分，具有不易表达合成、易降解、存在非特异性免疫原性等缺点。婴幼儿腹泻仅是一种症状和表现形式，其病原体有时是单一的，但也有很大比例是混合感染，快速诊断显得尤为重要。目前市面上还没有此类检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时快速检测轮状病毒、诺如病毒的试剂盒，使用该试剂盒可同时检测样本中是否存在轮状病毒、诺如病毒，灵敏度高，双通道同时快速检测。
本发明的再一个目的是提供制备试剂盒的方法
本发明的第三个目的是提供试剂盒在检测轮状病毒、诺如病毒样本中的应用。
本发明公开了一种快速检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒，包括以下组分：A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液，C)封闭液，D)漂洗液，E)样本前处理液，和F)带有荧光基团标记的核酸适配体，其特征是，核酸适配体含有轮状病毒的核酸适配体和诺如病毒II型的核酸适配体，两种适配体的荧光基团相异。
本发明还公开了核酸适配体的核苷酸序列，本发明中轮状病毒的核酸适配体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，诺如病毒II型的核酸适配体具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明公开的检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒中的组分A)固定样本溶液的蛋白包被板可采用普通的ELISA板包初上阳性或待检测样品，直接使用市面上销售的具有蛋白吸附能力的ELISA酶标板。
本发明继续公开了试剂盒的组成，其中B)蛋白包被液是由35mM NaHCO3，15mMNa2CO3,pH 9.3-pH 9.9组成的，其中C)封闭液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mMNa2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.1-pH 7.7组成的，其中D)漂洗液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.1-pH 7.7组成的，其中E)样本前处理液是由150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH7.8-pH8.2组成的。
在一个优先方案中，本发明还公开了A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液是由35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH 9.6组成的，C)封闭液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.4组成的，D)漂洗液是由136mMNaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.4组成的，E)样本前处理液是由150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH8.0组成的。
本发明公开的核酸适配体序列上接有功能基团，功能基团为各种生物素标记物、发光标记物和酶标标记物，发光标记物选自FAM、VIC荧光基团中的一种，两种适配体的荧光基团相异。
本发明还公开了制备检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒方法，轮状病毒的核酸适配体以A组轮状病毒靶蛋白抗原表位具有如SEQ ID No.3所示序列氨基酸，通过SELEX技术筛选所得；诺如病毒的核酸适配体以诺如病毒II型靶蛋白抗原表位具有如SEQ ID No.4所示序列氨基酸，通过SELEX技术筛选所得；再联接上的荧光基团，但要求两个核酸适配体连接的荧光基团相异，以便观察和识别。
本发明还公开了检测的试剂盒在同时检测轮状病毒/诺如病毒中的应用
为了实现本发明中，申请人通过下列方式制备检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒。
1)确定待测病毒的靶蛋白抗原表位
通过文献查阅与生物信息学分析，本发明人确定了A组轮状病毒靶蛋白抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示以及诺如病毒靶蛋白抗原表位的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。
2)筛选特异性结合的核酸适配体序列
体外合成一个含有41个随机序列的单链DNA文库；以A组轮状病毒、诺如病毒II型靶蛋白特定区域为筛选条件，采用SELEX技术筛选出具有高特异性、高亲和力的DNA适配体序列，轮状病毒的核酸适配体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，诺如病毒II型的核酸适配体具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
3)合成带有荧光基团标记的核酸适配体
直接在常规生物技术服务公司合成筛选得到的核酸适配体序列，合成时以共价键的形式在核酸适配体5’端连上荧光基团。检测A组轮状病毒的核酸适配体具有如SEQ IDNo.1所示序列，所带荧光基团为FAM；检测诺如病毒II型的核酸适配体具有如SEQ ID No.2所示序列，所带荧光基团为VIC。
4)制备试剂盒
试剂盒包括以下组分：A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液，C)封闭液，D)漂洗液，E)样本前处理液，和F)带有荧光基团标记的核酸适配体，核酸适配体含有轮状病毒的核酸适配体和诺如病毒II型的核酸适配体，两种适配体的荧光基团相异。
试剂盒中试剂组分配方如下：B)蛋白包被液是由35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH9.3-pH 9.9组成的，C)封闭液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.1-pH 7.7组成的，D)漂洗液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.1-pH 7.7组成的，E)样本前处理液是由150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH7.8-pH8.2组成的，F)核酸适配体由公司合成粉剂，溶于TE缓冲液中，工作浓度为200nM。
本发明通过SELEX技术筛选到的针对A组轮状病毒、诺如病毒II型的核酸适配体对相应的靶病毒具有较高的特异性和亲和力，并且具有无免疫原性、分子小、可进行修饰、合成容易、不易降解、无毒等优点。利用本发明筛选到的核酸适配体进行的检测方法对相应的病毒进行检测时具有操作简单、反应迅速、准确性高和灵敏度高的特点，利用该核酸适配体构建分子探针或者检测试剂盒，并结合酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜等检测装置，就可以实现对于两种病毒的精确检测。同时该试剂盒有较宽的检测范围，便于临床实用。本发明的意义在于：试剂盒灵敏度较高、特异性好、测量范围宽、操作简单、可以同时检测两种病毒、适合大规模推广，有着良好的市场前景。
本发明的优点是
1.在A组轮状病毒、诺如病毒II型感染病人粪便样本和健康人粪便样本的检测中，A组轮状病毒感染病人的阳性检出率，即灵敏度为96.7％；诺如病毒II型感染病人的阳性检出率，即灵敏度为96.9％；健康人群检测的阳性检出率为0％。
2.双通道同时检测两种核酸适配体标记上两种不同发射波段的荧光基团，能在同一个反应体系中同时完成两种病原体检测，相对于市面上普通的免疫检测试剂盒(如胶体金试剂盒)来说，缩短了反应时间，节省了反应试剂与待测样本用量。
3.独特的核酸适配体序列本发明所用核酸适配体序列为通过SELEX技术筛选所得，具有完全的独创性。
本试剂盒采用核酸适配体作为检测物，能有效克服以上问题，它具有分子小、可进行修饰、合成容易、不易降解、无毒、无免疫原性等优点。通过在不同核酸适配体上标记不同荧光基团，能做到在同意反应中对两种及两种以上并病原的同时检测。
附图说明
图1是本发明核酸适配体中A组轮状病毒-aptamer核苷酸序列的二级结构图；
图2是本发明核酸适配体中诺如病毒II型-aptamer核苷酸序列的二级结构图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
实施例1确定A组轮状病毒、诺如病毒II型的靶蛋白抗原表位
根据文献查阅与生物信息学分析，确定待测适合作为核酸适配体检测靶点的病毒蛋白以及病毒蛋白上的具体抗原表位区域。
A)选择A组轮状病毒VP6蛋白全长作为适配体筛选靶蛋白，具有如SEQ ID No.3所示序列：
MDVLYSLSKTLKDARDKIVEGTLYSNVSDLIQQFNQMIITMNGNEFQTGGIGNLPIRNWNFNFGLLGTTLLNLDANYVETARNTIDYFVDFVDNVCMDEMVRESQRNGIAPQSDSLRKLSAIKFKRINFDNSSEYIENWNLQNRRQRTGFTFHKPNIFPYSASFTLNRSQPAHDNLMGTMWLNAGSEIQVAGFDYSCAINAPANIQQFEHIVPLRRVLTTATITLLPDAERFSFPRVINSADGATTWFFNPVILRPNNVEVEFLLNGQIINTYQARFGTIVARNFDTIRLSFQLMRPPNMTPAVAVLFPNAQPFEHHATVGLTLRIESAVCESVLADASETLLANVTSVRQEYAIPVGPVFPPGMNWTDLITNYSPSREDNLQRVFTVASIRSMLIK(SEQ ID No.3)
B)选择诺如病毒II型VP1蛋白的P2区域作为适配体筛选靶蛋白，具有如SEQ IDNo.4所示序列：
TTQLSPVNICTFRGDVTHITGSRNYTMNLASQNWNNYDPTEEIPAPLGTPDFVGKIQGMLTQTTRTDGSTRGHKATVYTGSADFAPKLGRVQFETDTDHDFEANQNTKFTPVGVIQDGSTTHRNEPQQWVLPSYSGRNTHNVHL(SEQ ID No.4)
C)根据已确定的氨基酸序列，直接在公司进行核苷酸序列的合成以及原核密码子优化，将合成的基因片段插入原核表达载体pET32a上。诱导表达出相应用于适配体筛选的两种病毒的靶蛋白。
实施例2构建适配体文库与引物设计
A)通过常规生物技术服务公司的基因合成服务，体外合成含有41个随机序列的单链DNA文库，其核苷酸序列如下
GATGACATTGCACAAGTCAGG-(N41)-GAGTGAATCCTGCTGTTCGA
B)针对核酸适配体5’端固定序列，设计合成的上游引物P1，具有如SEQ ID No.5所示序列：
5’-GATGACATTGCACAAGTCAGG-3’(SEQ ID No.5)
C)针对核酸适配体3’端固定序列，设计合成的下游引物P2，具有如SEQ ID No.6所示序列，同时在引物5’端连接有生物素基团：5’-biotin-TCGAACAGCAGGATTCACTC-3’(SEQID No.6)
实施例3利用SELEX筛选技术，从文库中筛选得到能有效结合病毒靶蛋白的核酸适配体序列
A)将10nmol的初始单链DNA随机文库溶解在500μl的PBS溶液中，用92℃的恒温水浴锅水浴5min，之后迅速的插入冰中冰浴10min，之后将经过处理的初始单链DNA随机文库与相应病毒靶蛋白在冰上孵育1h，再加入Ni-NTA Magnetic Agarose Beads，继续孵育1h。孵育完成后，使用磁性分离器吸附，去除上清，用2ml的PBS洗涤Beads。最后用10ml预冷的PBS重悬Beads，使之充分吹打混匀，之后92℃恒温水浴10min，13000g离心，收集上清，即为第一轮筛选后特异性识别病毒靶蛋白的单链DNA文库。
B)对筛选后的单链DNA文库进行PCR扩增，以制备次级文库。PCR反应的体系如下：Premix Tap Mix 25μl，筛选后的单链DNA文库8μl，上游引物2.5μl，下游引物2.5μl，ddH2O12μl，总体积为50μl。按照如下的程序进行PCR循环扩增：95℃变性3min，经过35个循环扩增程序为95℃30s，55℃30s，72℃30s，最终的延伸为72℃10min，最后维持在16℃终止反应。对经过PCR扩增后的文库进行琼脂糖凝胶回收以得到纯净的文库片段。
C)对扩增得到的次级文库进行进一步的制备。将扩增后的双链DNA文库与100μl链酶亲和素标记的磁珠常温孵育20min，利用双链DNA文库上的生物素与链酶亲和素的亲和作用将双链DNA文库结合到磁珠的表面，之后使用磁性分离器吸附，去除上清，用2ml的PBS洗涤磁珠。加入终浓度为200mM的NaOH溶液常温反应10min使得双链DNA文库变性变成单链，其中带有生物素标记的一条链会结合在磁珠上，不带生物素标记的那一条链会脱离到上清液中。收集上清液，用脱盐柱除去NaOH，最后加入500μl的PBS，收集到的溶液即为下一轮筛选所需要用到的单链DNA文库。
D)重复上述的阳性筛选过程、PCR扩增以及次级单链DNA文库的制备过程15次，最后筛选得到的单链DNA文库对于病毒靶蛋白的识别能力最强。将所得到的单链DNA文库进行克隆测序后，最终得到了本发明中所筛选出来的可用于检测A组轮状病毒、诺如病毒II型感染的核酸适配体，其DNA序列分别为：
A组轮状病毒-aptamer
GATGACATTGCACAAGTCAGGGGCATATTGCGAAGCTCAATGCTGTGCCATTATCAAGGTTCGAGTGAATCCTGCTGTTCGA
诺如病毒II型-aptamer
GATGACATTGCACAAGTCAGGGCCAGATGACTCACACGCCCCAAAGCGGGTTGAAATATCAAGAGTGAATCCTGCTGTTCGA
E)为了能在一个反应体系内同时进行两种反应产物的检测，给每种适配体5’端标记上不同的荧光基团(共价键结合的形式，直接在常规生物技术服务公司合成)，最终的试剂盒里的适配体信息如下：
A组轮状病毒-aptamer，具有如SEQ ID No.1所示序列：
5’-FAM-
GATGACATTGCACAAGTCAGGGGCATATTGCGAAGCTCAATGCTGTGCCATTATCAAGGTTCGAGTGAATCCTGCTGTTCGA-3’(SEQ ID No.1)
诺如病毒II型-aptamer，具有如SEQ ID No.2所示序列：
5’-VIC-
GATGACATTGCACAAGTCAGGGCCAGATGACTCACACGCCCCAAAGCGGGTTGAAATATCAAGAGTGAATCCTGCTGTTCGA-3’(SEQ ID No.2)
实施例4适配体的验证
A)通过结构预测软件RNA Structure Program来分析预测筛选出来的核酸适配体的二级结构，结果显示所有的核酸适配体都可以形成特殊的茎环结构和发卡结构。A组轮状病毒-aptamer可形成如图1所示的二级结构，诺如病毒II型-aptamer可形成如图2所示的二级结构。
B)使用ForteBio Octet RED96相互作用分析仪检测核酸适配体与靶蛋白的结合力，所得结果如下：
适配体 与靶蛋白的解离常数Kd(nM)
A组轮状病毒-aptamer 8.1
诺如病毒II型-aptamer 8.2
PBS对照 无结合
C)分别采用人血白蛋白、免疫血清球蛋白、粪便乳铁蛋白与2种核酸适配体进行特异性检测，经过结合实验发现，2种适配体都不与这些蛋白结合。用2种病毒的靶蛋白对2种适配体进行交叉反应检测，实验结果显示，2种适配体只与对应的靶蛋白结合。
D)2种适配体各取0.2μg，分别放置于常温血清、水溶液中。4周后用RT-PCR检测，发现放置的核酸适配体结构稳定，没有发生降解。
E)分别用A组轮状病毒、诺如病毒II型感染敏感宿主细胞，同时设置没有感染的阴性对照组。感染36h后用胰酶消化细胞，离心得到细胞沉淀并去除上清液，再用PBS重悬。对细胞进行固定与透化处理，再将对应A组轮状病毒、诺如病毒II型的带有荧光基团标记的核酸适配体分别与感染病毒的细胞悬液以及未感染对照组细胞悬液混合处理1h，通过流式细胞仪分析计算。不同病毒的核酸适配体标记了不同的荧光基团，可以在流式细胞仪中明显区分，结果显示感染了A组轮状病毒、诺如病毒II型的细胞样品所对应的核酸适配体标记荧光数值显著升高，说明筛选得到的适配体可用作病毒感染的检测。
实施例5，试剂盒的配方
本试剂盒包含以下配方：
1)用于固定样本溶液的96孔蛋白包被板
2)蛋白包被液
3)封闭液
4)漂洗液
5)样本前处理液
6)带有荧光基团标记的核酸适配体
实施例6，试剂盒的制备
本试剂盒所有配方的制备信息如下：
1)用于固定样本溶液的96孔蛋白包被板
直接使用市面上销售的具有蛋白吸附能力的ELISA酶标板
2)蛋白包被液
属于常规分子检测试剂，配方为35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH 9.3-pH 9.9，使用双蒸水配置。
3)封闭液
属于常规分子检测试剂，配方为136mM NaCl,2.6mM KCl,2mMKH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.1-pH 7.7，使用双蒸水配置。
4)漂洗液
属于常规分子检测试剂，配方为136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mMNa2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.1-pH 7.7，使用双蒸水配置。
5)样本前处理液
属于常规分子检测试剂，配方为150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH7.8-pH8.2，使用双蒸水配置。
6)带有荧光基团标记的核酸适配体
通过常规生物技术服务公司的基因合成服务，直接合成，用TE缓冲液溶解并配置到工作浓度(200nM)。
实施例7，试剂盒的应用
取20份已确认轮状病毒阳性的样本、20份已确认诺如病毒阳性的样本与20份已确认无轮状病毒、无诺如病毒的对照样本。由于目前市场上没有同时检测轮状病毒与诺如病毒的抗原检测试剂盒，所以取市售某品牌轮状病毒抗原检测试剂盒与市售某品牌诺如病毒抗原检测试剂盒与我们的核酸适配体检测试剂盒同时做平行实验。实验结果如下：
Figure BDA0002836919540000101
序列表
<110> 武汉大学
<120> 检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatgacattg cacaagtcag gggcatattg cgaagctcaa tgctgtgcca ttatcaaggt 60
tcgagtgaat cctgctgttc ga 82
<210> 2
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatgacattg cacaagtcag ggccagatga ctcacacgcc ccaaagcggg ttgaaatatc 60
aagagtgaat cctgctgttc ga 82
<210> 3
<211> 397
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp
1 5 10 15
Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln
20 25 30
Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr
35 40 45
Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Ile Arg Asn Trp Asn Phe Asn Phe Gly
50 55 60
Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr
65 70 75 80
Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys
85 90 95
Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln
100 105 110
Ser Asp Ser Leu Arg Lys Leu Ser Ala Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn
115 120 125
Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg
130 135 140
Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr
145 150 155 160
Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Asp Asn Leu
165 170 175
Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly
180 185 190
Phe Asp Tyr Ser Cys Ala Ile Asn Ala Pro Ala Asn Ile Gln Gln Phe
195 200 205
Glu His Ile Val Pro Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr
210 215 220
Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser
225 230 235 240
Ala Asp Gly Ala Thr Thr Trp Phe Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro
245 250 255
Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr
260 265 270
Tyr Gln Ala Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile
275 280 285
Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Pro Asn Met Thr Pro Ala Val
290 295 300
Ala Val Leu Phe Pro Asn Ala Gln Pro Phe Glu His His Ala Thr Val
305 310 315 320
Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Val Cys Glu Ser Val Leu Ala
325 330 335
Asp Ala Ser Glu Thr Leu Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu
340 345 350
Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr
355 360 365
Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg
370 375 380
Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Ile Lys
385 390 395
<210> 4
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Thr Thr Gln Leu Ser Pro Val Asn Ile Cys Thr Phe Arg Gly Asp Val
1 5 10 15
Thr His Ile Thr Gly Ser Arg Asn Tyr Thr Met Asn Leu Ala Ser Gln
20 25 30
Asn Trp Asn Asn Tyr Asp Pro Thr Glu Glu Ile Pro Ala Pro Leu Gly
35 40 45
Thr Pro Asp Phe Val Gly Lys Ile Gln Gly Met Leu Thr Gln Thr Thr
50 55 60
Arg Thr Asp Gly Ser Thr Arg Gly His Lys Ala Thr Val Tyr Thr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Asp Phe Ala Pro Lys Leu Gly Arg Val Gln Phe Glu Thr Asp
85 90 95
Thr Asp His Asp Phe Glu Ala Asn Gln Asn Thr Lys Phe Thr Pro Val
100 105 110
Gly Val Ile Gln Asp Gly Ser Thr Thr His Arg Asn Glu Pro Gln Gln
115 120 125
Trp Val Leu Pro Ser Tyr Ser Gly Arg Asn Thr His Asn Val His Leu
130 135 140
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatgacattg cacaagtcag g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcgaacagca ggattcactc 20

Claims (7)

1.一种快速检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒，包括以下组分：A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液，C)封闭液，D)漂洗液，E)样本前处理液，和F)带有荧光基团标记的核酸适配体，其特征是，核酸适配体含有轮状病毒的核酸适配体和诺如病毒II型的核酸适配体，两种适配体的荧光基团相异。
2.根据权利要求1所述的检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒，其特征在于轮状病毒的核酸适配体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，诺如病毒II型的核酸适配体具有SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒，其特征在于B)蛋白包被液是由35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH 9.3-pH 9.9组成的，C)封闭液是由136mM NaCl,2.6mMKCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.1-pH 7.7组成的，D)漂洗液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.1-pH 7.7组成的，E)样本前处理液是由150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH7.8-pH8.2组成的。
4.根据权利要求3所述的检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒，其特征在于B)蛋白包被液是由35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH 9.6组成的，C)封闭液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mMKH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.4组成的，D)漂洗液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.4组成的，E)样本前处理液是由150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH8.0组成的。
5.根据权利要求1所述的检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒，其特征在于核酸适配体序列上接有功能基团，功能基团为各种生物素标记物、发光标记物和酶标标记物，发光标记物选自FAM、VIC荧光基团中的一种，两种适配体的荧光基团相异。功能基团通过共价键的方式连接到核酸适配体的5’端。
6.一种制备权利要求1中检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒，其特征是，轮状病毒的核酸适配体以A组轮状病毒靶蛋白抗原表位具有如SEQ ID No.3所示序列氨基酸，通过SELEX技术筛选所得；诺如病毒的核酸适配体以诺如病毒II型靶蛋白抗原表位具有如SEQ IDNo.4所示序列氨基酸，通过SELEX技术筛选所得；再将荧光基团以共价键的形式连接到核酸适配体的5’端。
7.权利要求1中所述检测的试剂盒在同时检测轮状病毒/诺如病毒中的应用。
CN202011479228.5A 2020-12-15 2020-12-15 检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒及其应用 Withdrawn CN112526130A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011479228.5A CN112526130A (zh) 2020-12-15 2020-12-15 检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011479228.5A CN112526130A (zh) 2020-12-15 2020-12-15 检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112526130A true CN112526130A (zh) 2021-03-19

Family

ID=75000215

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011479228.5A Withdrawn CN112526130A (zh) 2020-12-15 2020-12-15 检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112526130A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154528A (zh) * 2011-05-20 2011-08-17 何雅青 轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用引物、探针及试剂盒
CN104894136A (zh) * 2015-05-23 2015-09-09 刘慧� 一种能特异性检测轮状病毒的核酸适体及试剂盒
CN105866408A (zh) * 2016-05-17 2016-08-17 北京美康基因科学股份有限公司 一种四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒及其制备方法
CN108034762A (zh) * 2017-12-21 2018-05-15 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 多重pcr检测六种腹泻病毒用引物探针组
CN109628457A (zh) * 2019-02-03 2019-04-16 淮海工学院 单链dna核酸适配体及其筛选方法与用途
CN110305987A (zh) * 2019-08-06 2019-10-08 张鹏 检测诺如病毒i型、诺如病毒ii型和轮状病毒的试剂盒

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154528A (zh) * 2011-05-20 2011-08-17 何雅青 轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用引物、探针及试剂盒
CN104894136A (zh) * 2015-05-23 2015-09-09 刘慧� 一种能特异性检测轮状病毒的核酸适体及试剂盒
CN105866408A (zh) * 2016-05-17 2016-08-17 北京美康基因科学股份有限公司 一种四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒及其制备方法
CN108034762A (zh) * 2017-12-21 2018-05-15 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 多重pcr检测六种腹泻病毒用引物探针组
CN109628457A (zh) * 2019-02-03 2019-04-16 淮海工学院 单链dna核酸适配体及其筛选方法与用途
CN110305987A (zh) * 2019-08-06 2019-10-08 张鹏 检测诺如病毒i型、诺如病毒ii型和轮状病毒的试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MATTHEW D. MOORE ET AL.: "Generation and characterization of nucleic acid aptamers targeting the capsid P domain of a human norovirus GII.4 strain", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111693712B (zh) 一种采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法
CN111978378B (zh) SARS-CoV-2抗原多肽及其应用
US11293918B2 (en) Method and kit for simultaneous detection of multi target molecules using magnetic bead-aptamer conjugate
CN112415195A (zh) 检测新型冠状病毒双靶点的试剂盒及其应用
CN112415205A (zh) 检测eb病毒/hcmv的试剂盒及其应用
CN112462061A (zh) 检测h1n1、rsv-a和adv3的试剂盒及其应用
CN112941078B (zh) 一种检测新冠病毒SARS-CoV-2 S1蛋白的核酸适体、筛选方法及其用途
CN103898203B (zh) 微小隐孢子虫的检测方法及检测试剂盒
CN114736292B (zh) 靶向诺如病毒蛋白的纳米抗体及其应用
CN114957454B (zh) 一种抗csfv e2蛋白的纳米抗体、融合蛋白及其制备方法和应用
CN115073613A (zh) 一种融合蛋白GLuc-p30及其制备方法和应用
WO2020014883A1 (zh) 一种特异性识别妥布霉素的单链dna适配体及其应用
Kim et al. Dual synergistic response for the electrochemical detection of H1N1 virus and viral proteins using high affinity peptide receptors
CN112526130A (zh) 检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒及其应用
KR101032956B1 (ko) 수청바이러스 유래 뉴클레오캡시드 단백질을 이용하여 신증후출혈열 특이 ＩｇＭ과 ＩｇＧ를 검출하는 신속 진단 키트
CN114720700A (zh) 检测抗细胞骨架相关蛋白4-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤试剂盒的应用
CN114410641B (zh) 一种用于检测风疹病毒的核酸适配体、试剂盒及应用
CN114410640B (zh) 一种用于检测麻疹病毒的核酸适配体、试剂盒及应用
CN114381460B (zh) 一种用于检测腮腺炎病毒的核酸适配体、试剂盒及应用
CN114317546B (zh) 一种用于检测evd68病毒的核酸适配体、试剂盒及应用
CN115060908A (zh) 检测抗丝状肌动蛋白成帽蛋白β-IgG抗体的试剂盒
CN110819632A (zh) 用于结合曲妥珠抗体的核酸适体
KR102373670B1 (ko) 신종 인플루엔자 바이러스에 고특이적 고선택적 결합이 가능한 펩타이드 리셉터 및 그를 이용한 바이러스 검출용 바이오칩의 제작방법
CN117025612A (zh) 偏肺病毒检测的核酸适配体、试剂盒及应用
CN115894674B (zh) 一种用于检测冠状病毒的抗体及制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20210319

WW01 Invention patent application withdrawn after publication