CN102154528A - 轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用引物、探针及试剂盒 - Google Patents
轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用引物、探针及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用引物、探针及试剂盒，所述引物包括特异性扩增A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒序列的三对引物，所述探针包括A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒的三条特异性检测探针，试剂盒包括所述三对引物以及用所述三条特异性检测探针与荧光编码微球进行偶联制成的特异性检测微球混合物。经实验证明，利用本发明引物和探针通过多重PCR结合液相芯片检测的方法，能够同时对A型轮状病毒和诺如病毒GI型、GII型进行准确地检测，而且特异性强、灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术，特别是轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用引物、探针及试剂盒。
背景技术
急性腹泻是一个全球性的严重的公共卫生问题，在儿童的发病率仅次于呼吸道感染，列为第二位。在发展中国家5岁以下儿童尤为突出，其年发病率为2.2次。全世界每年发生30-50亿例病例，其中500-1000万例死亡，其病原有细菌、病毒及原虫等，以病毒最为严重。A组轮状病毒是儿童重症胃肠炎（腹泻）主要病原，占腹泻住院儿童中的20-60%。
轮状病毒(rotavirus, RV)为呼肠病毒科轮状病毒属病毒。病毒体呈圆球形，有双层衣壳，每层衣壳呈二十面体对称。病毒体的核心为双股RNA，由11个不连续的节段组成。每一个片段各编码1种蛋白，VP1～4，VP6和VP7 6种结构蛋白，其中VP4经胰蛋白酶裂解可产生具有增强病毒感染性的VP5和VP8；5种非结构蛋白为NSP1～NSP5。根据内层壳衣中VP6蛋白上抗原的差异，RV被分为A，B，C，D，E，F，G七组，其中A群为主要引起婴幼儿腹泻。
诺如病毒(Noruvirus，简称NoV)的感染是引起成人腹泻的重要病因，广泛地分布于全世界。该类病毒常常可以引起成人和年长儿童肠炎的暴发流行，也是食物集体中毒最主要的病毒，占腹泻住院儿童中的5-15%。根据NoV RNA多聚酶和衣壳蛋白区核苷酸序列的相似性，将 NoV 分为 5 个组：GI、GII、GIII、GIV、GV。感染人的NoV包括GⅠ、GⅡ和GIV。近年来，变异株GII4在芬兰、挪威、荷兰、澳大利亚、日本、台湾和香港出现，且逐渐成为流行的优势株；一些国家和地区还发现NoV的重组株。
腹泻病毒的检测方法主要包括：电镜、病毒分离鉴定、血清分型、中和抗体、RT-PCR和核苷酸序列分析。但目前，除RT-PCR、real time PCR技术外，尚缺乏快速敏感的诊断方法。轮状病毒较难培养，且实验周期长，操作比较复杂，不利于推广。NoV原型株不能用细胞株培养，也不能建立动物模型，传统的检测方法不能检测出食品或水标本中较低浓度的病毒；由于不同株间壳衣蛋白抗原具有相当大的变异性，因此酶联免疫吸附法（ELISA）的应用也受到了限制。
目前，轮状病毒和诺如病毒的检测手段主要采用分子生物学诊断技术。聚合酶链式反应(PCR)技术广泛应用于病毒特异性基因的检测，尽管它也具有灵敏、特异的优点，但结果判定需要电泳，费时费力，且反应产物容易产生污染而导致假阳性。荧光定量PCR技术融合了PCR的高灵敏性，DNA杂交的高特异性，光谱技术的精确定量等多种优点，通过直接检测PCR反应过程中荧光信号的变化实现对目的分子的定量，不需要电泳检测，并且整个过程完全闭管式操作，污染机会大大降低，避免了常规PCR容易造成的假阳性问题。相对常规PCR，荧光定量PCR在敏感性、特异性与速度等方面具有优势，但实时荧光PCR技术受到荧光种类及仪器自身的限制，最多只能对5个靶标进行检测，且实验成功的难度极大。
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出一个或多个核酸片段的PCR反应。多重PCR主要用于多种病原体（病原菌、致病病毒）的同时检测或鉴定、某些遗传病及基因的分型检测鉴定。多重PCR的特点有：1）高效性，能在同一PCR反应管内同时检出多个靶基因，为临床提供更多更准确的诊断信息；2）经济性，在同一反应管内同时检出多个靶基因，节省试剂，节约经费开支；3）简便性，在同一反应管内同时检测多个靶基因，一次操作即可完成多个靶基因检测，将大大的节省时间和劳动。
液相芯片技术是一种新型检测平台，将流式检测技术与芯片技术有机地结合在一起，利用其多达100种荧光编码微球，可以标记上100种不同的探针分子，可同时对一个标本中的100种不同的目的分子进行检测。液相芯片检测时先后加入样品和报告分子与标记的荧光编码微球反应，样品中的目的分子（PCR扩增产物）能够与探针和报告分子特异性结合，从而使标记的荧光编码微球携带上报告分子链霉素-藻红蛋白，随后利用仪器对荧光编码微球进行检测和结果分析。液相芯片技术采用微流技术使荧光编码微球快速单列通过检测通道，并使用红色和绿色两种激光分别对单个微球上的分类荧光和报告分子上的报告荧光进行检测。红色激光可将微球分类，从而鉴定各个不同的反应类型（即定性）；绿色激光可确定微球上结合的报告分子的数量，从而确定微球上集合的目的分子的数量（即定量）。通过红绿双色激光的同时检测，可完成对反应的实时、定性和定量分析。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用的引物、探针及试剂盒，使得能够通过采用多重PCR结合液相芯片检测的方法，在一次检测中，准确地完成A型轮状病毒（简写为HRV-A）、GI型诺如病毒（简写为NoV GI）和GII型诺如病毒（简写为NoV GII）的检测。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用引物，其特征在于：包括特异性扩增A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒序列的三对引物，其碱基序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、及SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，其中碱基序列为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的引物的5’端带Biotin标记。
一种轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用探针，与上述轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用引物配套使用，包括A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒的特异性检测探针，其碱基序列分别如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示，探针的5’端带NH2标记。
本发明还提供了一种轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用试剂盒，包括上述特异性扩增A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒序列的三对引物。
本发明轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用试剂盒的一种优选方案中，还包括用上述轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用探针与荧光编码微球进行偶联制成的特异性检测微球混合物。
上述轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用试剂盒还可以包括A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒阳性标准品，它们分别是用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示序列的引物对得到的扩增产物为插入子构建的重组质粒。
用上述液相芯片试剂盒检测A型轮状病毒、诺如病毒GI型和GII型的过程为：用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、及SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的三对引物制成混合引物工作液，构建多重PCR反应体系，对待检样品进行PCR扩增，并将设计的每种特异性检测探针与相应荧光编码的微球进行偶联制成特异性检测微球并混合制成微球混合物，然后先后将多重PCR扩增后的产物和报告分子加入制得的微球混合物进行反应，最后将反应液通过液相芯片检测仪（如Luminex 100）进行检测：在鞘液的作用下，反应液中的微球快速单列通过检测通道，红色和绿色两种激光分别对单个微球上的分类荧光和报告分子上的报告荧光进行检测，读出检测结果。
本发明根据A型轮状病毒和诺如病毒GI型、GII型基因序列设计了特异性引物及探针，经实验证明，利用该引物和探针通过多重PCR结合液相芯片检测的方法，能够同时对A型轮状病毒和诺如病毒GI型、GII型进行准确地检测，而且特异性强、灵敏度高。
与传统检测方法相比，本发明采用多重PCR结合液相芯片检测的方法，实现了对同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测分析，样本用量少，操作简单、快速，可大大降低检测成本。
附图说明
图1为质粒pUCm-T-HRV-A的图谱。
图2为质粒pUCm-T-NoV GI的图谱。
图3为质粒pUCm-T-NoV GII的图谱。
具体实施方式
实施例1：A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒阳性标准品的构建：分别用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示序列的引物对得到的扩增产物为插入子构建的重组质粒作为阳性标准品，具体如下。
1）引物序列：
KHRV-A F 5’-CATGTTGATTAAGTGAGGACCAGAC-3’ ；即SEQ ID NO:1
KHRV-A R 5’- CAGTTACTCTACGTAGCGAACATG-3’ ；即SEQ ID NO:2
KNoV GI F 5’-AGGGTGGCAGGCCATGTT-3’；即SEQ ID NO:7
KNoV GI R 5’-TCACCGGGGGTATTATTTGG-3’ ； 即SEQ ID NO:8
KNoV GII F 5’-CCTGCACCTCCCAATGGAA -3’； 即SEQ ID NO:9
KNoV GII R 5’-AATCCAGGGGTCAATTACATTTTG-3’； 即SEQ ID NO:10 。
2）分别提取轮状病毒、诺如病毒GI型、诺如病毒GII RNA，反转录成cDNA，分别以对应的引物进行PCR扩增，扩增体系和程序如下：
表1 PCR扩增反应体系
| 成分 | 体积 |
| 10×Taq DNA Buffer（含Mg2+） | 5μL |
| dNTPs(10mM) | 1μL |
| Taq酶（5U/μL） | 1μL |
| 引物（上/下游）(10μM) | 1μL |
| ddH2O | 39.5μL |
| 模板 | 2.5μL |
| 总体积 | 50μL |
反应程序：
3）所获得的扩增产物分别进行琼脂糖凝胶检测并切胶纯化。
4）将连接产物转化至DH5α感受态细胞。挑选单克隆，进行菌落PCR鉴定、测序鉴定。
所构建的质粒pUCm-T-HRV-A、pUCm-T-NoV GI、pUCm-T-NoV GII的图谱如图1-3所示。
实施例2：轮状病毒和诺如病毒多重PCR扩增及液相芯片检测方法的建立。
1）特异性扩增A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒序列的引物的碱基序列为：
HRV-A F 5’-CATGTTGATTAAGTGAGGACCAGAC-3’ ；即SEQ ID NO:1
HRV-A R 5’- CAGTTACTCTACGTAGCGAACATG-3’ ；即SEQ ID NO:2
NoV GI F 5’-GCTGGATGCGCTTCCATGACC-3’ ；即SEQ ID NO:3
NoV GI R 5’- TCCGGTACCARCTGRCCRGC-3’ ；即SEQ ID NO:4
NoV GII F 5’-GCCAATGTTCAGATGGATGAGAT-3’ ；即SEQ ID NO:5
NoV GII R 5’- TCTTCATTCACAAAAYTGGGAG-3 ；即SEQ ID NO:6
其中三种下游引物的5’端带Biotin标记。
2）多重PCR扩增。
混合引物工作液的制备：引物比例为上游引物：下游引物=1μM：10μM=1：10进行扩增；将轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒引物混合，混合引物工作液中上游引物浓度为1μM/种；下游引物浓度为10μM/种。
反应体系如表2所示：
表2 多重PCR反应体系
| 成分 | 体积 |
| 10×Taq DNA Buffer(含Mg2+) | 2.5μL |
| dNTPs(10 mM) | 0.5μL |
| Taq酶（5U/μl） | 0.5μL |
| 混合引物工作液 | 0.5μL |
| 模板 | 5μL |
| H2O | 16μL |
| 总体积 | 25μL |
反应程序：
3）核酸探针偶联：每种探针先分别与对应编号微球偶联，然后计数，根据浓度进行稀释后制备成微球混合液(10μL 约含250个/种微球)。
三条特异性检测探针的序列为：
HRV-A Probe 5’- TTTTTTTTTTTTTTTCATCTGGTATCCAATCTTAGTT-3’；即SEQ ID NO:11
NoV GI Probe 5’ - TTTTTTTTTTTTTTT TAAATGATGATGGCGTCTAA-3’ ；即SEQ ID NO:12
NoV GII Probe 5’- TTTTTTTTTTTTTTTGATCGCAATCTGGCTCC-3’ ；即SEQ ID NO:13
三条探针的5’端均带NH2标记。
表3 探针与微球的对应关系。
| 微球 | 6# | 34# | 61# |
| 探针 | HRV-A | NoV GI | NoV GII |
将核酸探针偶联到荧光编码微球上的方法，包括以下步骤：取20μL荧光编码微球，12，000×g 离心5min，弃上清，加入50μL核酸偶联缓冲液，充分混匀，加入100pmol/μL的氨基化修饰的核酸探针2 μL，加入10mg/mL核酸偶联活化剂3 μL，充分混匀，室温避光孵育45min，加入200μL核酸偶联洗涤液1，充分混匀，12，000×g 离心微球10min，弃上清，200μL核酸偶联洗涤液2，充分混匀，12，000×g 离心微球10min，弃上清，加入100μL 核酸偶联微球贮存液，全速震荡悬浮微球。
4）PCR产物与偶联核酸探针的微球混合物(10μL 约含250个/种微球)杂交，包括以下步骤：
充分重悬偶联核酸探针的微球混合液；
每个样品孔和背景孔，加入微球工作液 10μL；
加入33μL 核酸检测缓冲液 1；
每个背景孔，加入7μL ddH2O（或PCR blank产物）；
每个样品孔，加入7μL PCR产物；
充分混匀，于金属加热器中进行如下反应：a）95℃变性5min；b）52℃杂交15min。
在样品进行杂交反应时，用核酸检测缓冲液 2将SA-PE（1mg/mL）稀释至4μg/mL，制备新鲜的报告液（备注：每个反应需要25μL的报告液）；
每个反应孔中加入25μL的报告液，充分混匀；
于金属加热器中52℃孵育5min；
加入50μL终止液（52℃预热），混匀。
5）依照液相芯片检测仪Luminex 200的说明对步骤4）杂交后的80μL上述反应液进行检测。
轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测实验结果判断标准（注：该判断标准仅供参考，亦可对结果判断标准进行调整）如下：
A、数据有效性分析：a）空白对照与寡核苷酸探针杂交荧光中值不高于100；b）阳性对照与自身对应寡核苷酸探针特异性杂交荧光中值高于空白对照七倍以上；
B、待测样本分析判断：a）待测样本的荧光中值不高于100时，判断为阴性样本；b）Cut off值为250，待测样本的荧光中值≥250时，判断为阳性样本；c）当150≤荧光中值＜250时，设置为灰度区间，判断为可疑样品，需要进行重复实验或采取其他检测方法进一步验证。注：将实验所获得数据对应的阴性读数计算平均值为33.23321，阴性对照荧光中值的7倍为233，因此将本实验的cutoff值定为250。
实验：从2010年腹泻病人样本库中获取人粪便样品，用TIANGEN的TIANamp病毒RNA提取试剂盒分别提取RNA，然后根据Takara反转录试剂盒反转录获得cDNA。分别用阳性对照样品和从上述人粪便样品获得的cDNA作为模板，采用上述轮状病毒和诺如病毒多重PCR扩增及液相芯片检测方法进行检测，结果如表4所示。
表4 轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测实验结果。
| Sample | NoV GI | NoV GII | HRV-A |
| PCR blank | 40 | 87 | 68 |
| NoV GI阳性标准品 | 444 ※ | 62.5 | 75 |
| NoV GII阳性标准品 | 35.5 | 806 ※ | 80 |
| HRV-A阳性标准品 | 32 | 90 | 1300 ※ |
| HRV-A+NoV GI阳性标准品 | 418 ※ | 96 | 1391 ※ |
| HRV-A+NoV GII阳性标准品 | 38 | 727.5 ※ | 1214.5 ※ |
| NoV GI+NoV GII阳性标准品 | 384 ※ | 769 ※ | 77.5 |
| HRV-A+NoV GI+NoV GII阳性标准品 | 324 ※ | 761 ※ | 1013.5 ※ |
| 001 | 335 ※ | 53.5 | 64 |
| 321 | 33 | 647 ※ | 80 |
| 325 | 23 | 623 ※ | 74 |
| 380 | 27.5 | 77 | 642.5 ※ |
| 477 | 30.5 | 622 ※ | 74 |
| 428 | 36.5 | 97 | 961 ※ |
| 482 | 46 | 56 | 76 |
| 483 | 21 | 48 | 72 |
| Cut off 值 | 250 | 250 | 250 |
注：经实时荧光检测实验结果表明，样本482、483为阴性样本；001、321、325、477为诺如病毒样本；380、428为轮状病毒样本。通过测序分析，001为诺如病毒GI型样本。
由表4可见，以阳性标准品为模板进行多重PCR扩增及液相芯片检测，能明显判断A型轮状病毒、GI型诺如病毒、GII型诺如病毒单一病毒以及两种、三种病毒混感，而且对人粪便样品的检测结果与实时荧光及测序检测结果一致，表明轮状病毒和诺如病毒多重PCR扩增及液相芯片检测方法建立成功。在临床样本检测中，会出现病毒混合感染的现象，采用阳性标准品检测的实验结果表明，本方法能对混合感染样本进行准确的检测。
实施例3：轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测灵敏性实验。
将实施例1制备的阳性标准品进行定量，采用10倍稀释法进行稀释，稀释至10-5，即100ng/5μL 。以实施例2的检测方法进行多重PCR扩增及液相芯片检测，每PCR反应加入模板量为5μL，PCR产物与偶联特异探针的微球混合物进行杂交反应，然后用液相芯片检测仪进行检测。轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒液相芯片检测灵敏性实验结果分别如表5-7所示。
表 5 轮状病毒液相芯片检测灵敏度实验结果。
| Sample | NoV GI | NoV GII | HRV-A |
| PCR blank | 31.5 | 76.5 | 83 |
| HRV-A 1pg | 20 | 21.5 | 20 |
| HRV-A 10pg | 19 | 39 | 22 |
| HRV-A 100pg | 26 | 43.5 | 766 ※ |
| HRV-A 1ng | 33 | 55 | 1075 ※ |
| HRV-A 10ng | 33.5 | 47 | 701 ※ |
| HRV-A 100ng | 31.5 | 70.5 | 1179.5 ※ |
| Cut off 值 | 250 | 250 | 250 |
表6 GI型诺如病毒液相芯片检测灵敏性实验结果。
| Sample | NoV GI | NoV GII | HRV-A |
| PCR blank | 31.5 | 76.5 | 83 |
| NoV GI1pg | 24 | 32 | 16 |
| NoV GI 10pg | 25.5 | 36 | 24 |
| NoV GI 100pg | 23 | 26.5 | 11 |
| NoV GI 1ng | 540 ※ | 51 | 60 |
| NoV GI 10ng | 316.5 ※ | 34 | 34 |
| NoV GI 100ng | 325 ※ | 36.5 | 30 |
| Cut off 值 | 250 | 250 | 250 |
表 7 GII型诺如病毒液相芯片检测灵敏度实验结果。
| Sample | NoV GI | NoV GII | HRV-A |
| PCR blank | 31.5 | 76.5 | 83 |
| NoV GII 1pg | 25 | 27 | 16.5 |
| NoV GII 10pg | 35.5 | 675.5 ※ | 37 |
| NoV GII 100pg | 35 | 718 ※ | 40 |
| NoV GII 1ng | 42 | 1080 ※ | 42 |
| NoV GII 10ng | 28 | 716.5 ※ | 31 |
| NoV GII 100ng | 34.5 | 887 ※ | 24.5 |
| Cut off 值 | 250 | 250 | 250 |
实验结果表明，GII型诺如病毒的灵敏度较高，检出限为10pg/PCR；轮状病毒的检出限为100pg/PCR；GI型诺如病毒的灵敏度较低，检出限为1ng/PCR。
实施例4：轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测干扰性实验。
将实施例1制备的阳性标准品进行定量，将质粒pUCm-T-HRV-A、pUCm-T-NoV GI、pUCm-T-NoV GII分别稀释成100ng/5μL，50ng/5μL，20ng/5μL，10ng/5μL，1ng/5μL，将阳性标准品分成三组，为HRV-A：NoV GI、HRV-A：NoV GII、NoV GI：NoV GII，阳性标准品的浓度比例设置为1：1、1：2、2：1、1：5、5：1、1：10、10：1、1：100、100：1，以实施例2的检测方法进行多重PCR扩增及液相芯片检测，每PCR反应加入模板量为5μL/种，PCR产物与偶联特异核酸探针的微球混合物进行杂交反应，然后用液相芯片检测仪进行检测。三组的实验结果分别如表8-10所示。
表8 轮状病毒与GI型诺如病毒干扰性实验结果。
| Sample | NoV GI | NoV GII | HRV-A |
| PCR blank | 16 | 14 | 13 |
| HRV-A: NoV GI（1:1） | 486 ※ | 27 | 505 ※ |
| HRV-A: NoV GI（1:2） | 512 ※ | 25.5 | 450 ※ |
| HRV-A: NoV GI（2:1） | 519.5 ※ | 35 | 656 ※ |
| HRV-A: NoV GI（1:5） | 619 ※ | 24.5 | 991 ※ |
| HRV-A: NoV GI（5:1） | 549 ※ | 26 | 1053 ※ |
| HRV-A: NoV GI（1:10） | 599 ※ | 23 | 1167 ※ |
| HRV-A: NoV GI（10:1） | 534.5 ※ | 41 | 1899 ※ |
| HRV-A: NoV GI（1:100） | 616 ※ | 25.5 | 941 ※ |
| HRV-A: NoV GI（100:1） | 729 ※ | 31 | 2036.5 ※ |
| Cut off 值 | 250 | 250 | 250 |
表 9 轮状病毒与GII型诺如病毒干扰性实验结果。
| Sample | NoV GI | NoV GII | HRV-A |
| PCR blank | 16 | 14 | 13 |
| HRV-A: NoV GII（1:1） | 19 | 1095.5 ※ | 719.5 ※ |
| HRV-A: NoV GII（1:2） | 17 | 1137.5 ※ | 803 ※ |
| HRV-A: NoV GII（2:1） | 17 | 1186.5 ※ | 746 ※ |
| HRV-A: NoV GII（1:5） | 18 | 1104.5 ※ | 427 ※ |
| HRV-A: NoV GII（5:1） | 16 | 1231 ※ | 717 ※ |
| HRV-A: NoV GII（1:10） | 9 | 903 ※ | 957 ※ |
| HRV-A: NoV GII（10:1） | 25.5 | 1259 ※ | 950 ※ |
| HRV-A: NoV GII（1:100） | 21 | 1222 ※ | 1694.5 ※ |
| HRV-A: NoV GII（100:1） | 26 | 1181 ※ | 1653 ※ |
| Cut off 值 | 250 | 250 | 250 |
表 10 GI型诺如病毒与GII型诺如病毒干扰性实验结果。
| Sample | NoV GI | NoV GII | HRV-A |
| PCR blank | 16 | 14 | 13 |
| NoV GI: NoV GII（1:1） | 372 ※ | 1033 ※ | 12 |
| NoV GI: NoV GII（1:2） | 266 ※ | 1206 ※ | 16 |
| NoV GI: NoV GII（2:1） | 394 ※ | 1043.5 ※ | 17 |
| NoV GI: NoV GII（1:5） | 350.5 ※ | 999 ※ | 12 |
| NoV GI: NoV GII（5:1） | 394 ※ | 1170 ※ | 15 |
| NoV GI: NoV GII（1:10） | 282 ※ | 1041 ※ | 14 |
| NoV GI: NoV GII（10:1） | 456 ※ | 1067 ※ | 14 |
| NoV GI: NoV GII（1:100） | 436.5 ※ | 997.5 ※ | 13.5 |
| NoV GI: NoV GII（100:1） | 448.5 ※ | 1282 ※ | 12 |
| Cut off 值 | 250 | 250 | 250 |
实验结果表明，轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒液相芯片检测当病毒之间的模板量不同（1：1、1：2、2：1、1：5、5：1、1：10、10：1、1：100、100：1）时，仍能够准确判断检测。在临床样本检测中，轮状病毒和诺如病毒常常出现混合感染，且感染量的多少也往往是不同的。采用阳性标准品进行检测的实验结果表明，本实验所建立的轮状病毒和诺如病毒的液相芯片检测方法对不同感染量的混合样品也可以准确检测。
上述实施例2中，从粪便样品中提取RNA后，首先通过反转录试剂盒反转录获得cDNA，再通过构建的多重PCR反应体系进行扩增，获得液相芯片检测用的扩增产物。本发明还可以将从粪便样品中提取的RNA直接通过多重RT-PCR扩增体系及程序进行扩增，获得液相芯片检测用的扩增。下面通过实施例5说明。
实施例5：轮状病毒和诺如病毒粪便样品液相芯片检测实验。
1）、轮状病毒和诺如病毒多重RT-PCR扩增体系及程序：
表11 多重RT-PCR反应体系
| 成分 | 体积 |
| 10×One step RNA PCR buffer | 2.5μL |
| MgCl2(25mM) | 5μL |
| dNTPs(各10mM) | 2.5μL |
| RNAase Inhibitor（40U/μL） | 0.5μL |
| AMV RTase XL（5U/μl） | 0.5μL |
| AMV-optimized Taq（5U/μl） | 0.5μL |
| RNase-free dd H2O | 3μL |
| 混合引物工作液 | 0.5μL |
| 模板 | 10μL |
| 总体积 | 25μL |
反应程序：
多重RT-PCR反应体系中的混合引物工作液与表2中的混合引物工作液相同。
实施例5在多重RT-PCR扩增后，核酸探针偶联、扩增产物与偶联核酸探针的微球混合物(10μL 约含250个/种微球)杂交、用液相芯片检测仪对杂交后的反应液进行检测、以及实验结果判断标准均与实施例2相同。
2）、轮状病毒和诺如病毒粪便样品液相芯片检测实验结果。从2010年腹泻病人样本库中获取人粪便样品，用TIANGEN的TIANamp病毒RNA提取试剂盒分别提取RNA，然后以提取的RNA为模板，采用实施例5的方法进行检测，结果如表12所示。
表 12 轮状病毒和诺如病毒粪便样品液相芯片检测实验结果。
| Sample | NoV GI | NoV GII | HRV-A |
| PCR blank | 43 | 35 | 32 |
| 001 | 567 ※ | 59 | 28 |
| 002 | 41 | 40 | 745 ※ |
| 005 | 51.5 | 78 | 1040※ |
| 006 | 74.5 | 60 | 260 ※ |
| 007 | 12 | 27 | 14 |
| 009 | 32 | 36 | 55 |
| 010 | 61 | 31.5 | 49 |
| 018 | 76.5 | 399 ※ | 75 |
| 023 | 59 | 1484※ | 34 |
| 026 | 22.5 | 37.5 | 33.5 |
| 031 | 7 | 21 | 1106.5※ |
| 033 | 39 | 462 ※ | 519 ※ |
| 032 | 31 | 45.5 | 50 |
| 044 | 56 | 42 | 553※ |
| 051 | 45.5 | 277 ※ | 42 |
| 053 | 27 | 75 | 2485※ |
| 054 | 53 | 440 ※ | 27 |
| 066 | 27 | 83 | 282 ※ |
| 092 | 39.5 | 51 | 636 ※ |
| Cut off 值 | 250 | 250 | 250 |
注：经实时荧光检测实验结果表明，样本007、009、010、026、032为阴性样本；001、018、023、051、054为诺如病毒样本；002、005、006、031、044、053、066、092为轮状病毒样本；033为轮状病毒和诺如病毒混感样品。通过测序分析，001为诺如病毒GI型样本。
实验结果表明，实施例5所建立的液相芯片检测实验方法能对A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒进行准确检测，对人粪便样品的检测结果与实时荧光及测序检测结果一致，表明轮状病毒和诺如病毒多重RT-PCR扩增及液相芯片检测方法建立成功。同时，粪便样品第033号标本的检测结果也表明，本方法能对混感样品进行准确检测。
<110> 何雅青
胡春凌
汪朝晖
<120> 轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用引物、探针及试剂盒
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
catgttgatt aagtgaggac cagac 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
cagttactct acgtagcgaa catg 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 3
gctggatgcg cttccatgac c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 4
tccggtacca rctgrccrgc 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 5
gccaatgttc agatggatga gat 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 6
tcttcattca caaaaytggg ag 22
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 7
agggtggcag gccatgtt 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 8
tcaccggggg tattatttgg 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 9
cctgcacctc ccaatggaa 19
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 10
aatccagggg tcaattacat tttg 24
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工探针
<400> 11
tttttttttt tttttcatct ggtatccaat cttagtt 37
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<213> 人工探针
<400> 12
tttttttttt ttttttaaat gatgatggcg tctaa 35
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工探针
<400> 13
tttttttttt tttttgatcg caatctggct cc 32
Claims (5)
1.一种轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用引物，其特征在于：包括特异性扩增A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒序列的三对引物，其碱基序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、及SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，其中碱基序列为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的引物的5’端带Biotin标记。
2.一种与权利要求1所述引物配套使用的探针，其特征在于：包括A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒的特异性检测探针，其碱基序列分别如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示，探针的5’端带NH2标记。
3.一种轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测用试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的三对引物。
4.根据权利要求3所述的相芯片检测用试剂盒，其特征在于：还包括用权利要求2所述的探针与荧光编码微球进行偶联制成的特异性检测微球混合物。
5.根据权利要求3或4所述的相芯片检测用试剂盒，其特征在于：还包括A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒阳性标准品，它们分别是用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示序列的引物对得到的扩增产物为插入子构建的重组质粒。
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