CN104634975A - 诺如病毒检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种诺如病毒检测试剂盒及检测方法，试剂盒包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸和反应支持物；样品垫设置在所述反应支持物的底端，所述样品垫的顶端压住所述胶体金垫的底端并与之粘贴，所述胶体金垫的顶端压住所述硝酸纤维素膜的底端并与之粘贴，所述硝酸纤维素膜的顶端被所述吸水滤纸的底端压住并与之粘贴。能够简化粪便或者呕吐物样本中诺如病毒的检测流程。利用该种检测试剂盒检测诺如病毒，不对任何实验仪器、环境或者操作人员具有依赖性，操作简单、方便、检测周期短、易于判读；另外，不需要特殊的仪器设备，不需要专业培训，适应性强，便于随时随地的监测和检验。

Description

诺如病毒检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种诺如病毒检测试剂盒及检测方法。背景技术
诺瓦克病毒(Norwalk Viruses，NV)是人类杯状病毒科(Human Calicivirus，HuCV)中诺如病毒(Norovirus，NV)属的原型代表株。NV是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺瓦克病毒最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻的患者粪便中分离的病原。此后，世界各地陆续自胃肠炎患者粪便中分离出多种形态与之相似但抗原性略异的病毒样颗粒，均以发现地点命名，如：Hawaii Virus(HV)、Snow Mountain Virus(SMV)、Mexico Virus(MxV)Southampton Virus(SOV)等，先是称为小圆结构病毒(Small Round StructuralVirus，SRSV)，后称为诺瓦克样病毒(Norwalk-like virus，NLV)。直至2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒(Norovirus，NV)。诺如病毒与在日本发现的札幌样病毒(Sapporo-like Virus，SLV)，现在的正式名称为札如病毒(Sapovirus，SV)，合称为人类杯状病毒。
NV有许多共同特征：直径约为26～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称；从急性胃肠炎病人的粪便中分离，不能在细胞或组织中培养，也没有合适的动物模型；基因组为单股正链RNA；在氯化铯密度梯度中的浮力密度为1.36～1.41g／cm3；电镜下缺乏显著的形态学特征，负染色电镜照片显示，NV是具有典型的羽状外缘，表面有凹痕的小圆状结构病毒。
诺如病毒感染性腹泻是由诺如病毒属病毒引起的腹泻，具有发病急、传播速度快、涉及范围广等特点，是引起非细菌性腹泻暴发的主要病因。诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。
诺如病毒遗传高度变异，在同一时期和同一社区内可能存在遗传特性不同的毒株流行。诺如病毒抗体没有显著的保护作用，尤其是没有长期免疫保护作用，极易造成反复感染。
诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。美国每年在所有的非细菌性腹泻暴发中，60-90％是由诺如病毒引起。荷兰、英国、日本、澳大利亚等发达国家也都有类似结果。在发展中国家，诺如病毒感染性腹泻普遍存在，也常引起暴发流行。在我国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒检出率为15％左右，血清抗体水平调查表明我国人群中诺如病毒的感染亦十分普遍。1995年，我国报道了首例诺如病毒感染，之后山西、北京、安徽、福州、武汉、广州等地区先后发生多起诺如病毒感染性腹泻暴发疫情。
目前，该项目检测主要应用的检测方法为：直接电镜法(EM)、免疫电镜法(IEM)、放射免疫法(RIA)、生物素-亲和素免疫法(Biotin-Avidin Immunoassy)和酶联免疫法(ELISA)、杂交技术和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等方法进行检测。但是，这些检测方法均需要依赖相应的仪器设备、并需要使用液体试剂等，不便于实地检测，而且试剂的保存和使用也受到限制，也不便于快速简便的得到实验结果。
因而，目前需要一种能够早期、快速、简便、可靠地诊断诺如病毒的方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种诺如病毒检测试剂盒及检测方法。
本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一种诺如病毒检测试剂盒，包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸和反应支持物；其中，所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜、所述吸水滤纸依次设置在所述反应支持物上；所述样品垫设置在所述反应支持物的底端，所述样品垫的顶端压住所述胶体金垫的底端并与之粘贴，所述胶体金垫的顶端压住所述硝酸纤维素膜的底端并与之粘贴，所述硝酸纤维素膜的顶端被所述吸水滤纸的底端压住并与之粘贴。
优选的，所述吸水滤纸长度为33.0mm，所述吸水滤纸与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1.0mm。
优选的，所述胶体金垫的长度为6.0mm，所述胶体金垫与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1.0mm。
优选的，所述样品垫的长度为25.0mm，所述样品垫与所述胶体金垫重叠粘贴在一起的重叠长度为2.0mm。
优选的，所述胶体金垫为含有胶体金标记的诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体的胶体金垫。
优选的，所述硝酸纤维素膜设置有检测条带和质控条带，所述检测条带设置于靠近所述胶体金垫的一侧并含有诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体，所述质控条带设置于远离所述胶体金垫的一侧并含有羊抗鼠IgG多克隆抗体。
优选的，所述反应支持物为塑料。
本发明提供一种应用诺如病毒检测试剂盒进行诺如病毒检测的方法，包括以下步骤：
(1)将待检样本用稀释液处理；其中，所述待检样本为粪便或者呕吐物；
(2)将稀释好的样本滴加至诺如病毒检测试剂盒的样品垫上；样本将依次沿着反应支持物上的各个附着物向吸水滤纸的方向移动；
(3)若所述样本中含有诺如病毒，则诺如病毒中的诺如病毒衣壳蛋白在经过所述胶体金垫的过程中，与所述胶体金垫标记的诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体特异性结合形成复合物；所述复合物在经过所述硝酸纤维素膜的过程中，依次与相对于所述复合物不足量的诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体以及羊抗鼠IgG多克隆抗体特异性结合；则检测条带处出现红色或粉红色，样本为阳性；
若所述样本中不含有诺如病毒，则检测条带处未出现红色或粉红色，样本为阴性：
(4)如果质控条带处出现红色或粉红色，则表明实验结果有效；如果质控条带处未出现红色或粉红色，则表明胶体金失效或者实验操作有误，实验结果无效。
优选的，步骤(1)中，使用2％的NP40和0.5％的十二烷基苯磺酸钠的0.02M磷酸盐缓冲液作为样品稀释液，稀释待检样本。
本发明的有益效果如下：
本发明提供的诺如病毒检测试剂盒，能够简化粪便或者呕吐物样本中诺如病毒的检测流程。利用该种检测试剂盒检测诺如病毒，不对任何实验仪器、环境或者操作人员具有依赖性，操作简单、方便、检测周期短、易于判读；另外，不需要特殊的仪器设备，不需要专业培训，适应性强，便于随时随地的监测和检验。
本发明提供的检测方法操作简单方便、不依赖较高实验室条件、用于快速检测诺如病毒，进而实现快速简便的辅助诊断腹泻等相关疾病的病因。
附图说明
图1是本发明的一个检测试剂盒的正面示意图；
图2是本发明的一个检测试剂盒的侧面示意图；
图3是本发明的一个检测试剂盒检测结果阳性示意图；
图4是本发明的一个检测试剂盒检测结果阴性示意图；
图5是本发明的一个检测试剂盒结果无效示意图；
图6是本发明的一个检测试剂盒结果无效示意图。
其中：1、吸水滤纸；2、硝酸纤维素膜；3、胶体金垫；4、样品垫；5、反应支持物；T、检测条带；C、质控条带。
具体实施方式
以下结合附图对本发明进行详细说明：
本发明实施方式为针对GII.4诺如病毒的具体检测方式，其他亚型或者基因型的检测方法，在制得合适的单克隆抗体后均可以按照以下思路得到检测方法。
本发明提供的诺如病毒检测试剂盒由吸水滤纸1、硝酸纤维素膜2、胶体金垫3、样品垫4和反应支持物5组成。其中，反应支持物可以为塑料。吸水滤纸可以防止样本在硝酸纤维素膜的一端堆积，从而导致后续的样本无法继续前行，进而能够使反应充分。硝酸纤维素膜2包括含有诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体(免疫原为VLP GII.4，抗体编号为17E11)的检测条带T以及含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控条带C。胶体金垫3含有胶体金标记的诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体(免疫原为VLP GII.4，抗体编号为10C07)。包被检测条带T和质控条带C的硝酸纤维素膜2粘贴在反应支持物5上。
具体的，样品垫设置在反应支持物的底端，样品垫的顶端压住胶体金垫的底端并与之粘贴，样品垫的长度为25.0mm，所述样品垫与所述胶体金垫重叠粘贴在一起的重叠长度为2.0mm。
胶体金垫的顶端压住硝酸纤维素膜的底端并与之粘贴，胶体金垫的长度为6.0mm，所述胶体金垫与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1.0mm。
硝酸纤维素膜的顶端被吸水滤纸的底端压住并与之粘贴，吸水滤纸长度为33.0mm，吸水滤纸与硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1.0mm。
在检测条带T的方向上硝酸纤维素膜的边缘距离反应支持物边缘28.0mm，在质控条带C的方向上硝酸纤维素膜的边缘距离反应支持物的边缘32.0mm。
为了能够达到检测诺如病毒衣壳蛋白的目的，需要选用合适的稀释液配方，从而能够将诺如病毒病毒外壳的衣壳蛋白分离出来，本实例中使用的是含有2％的NP40和0.5％的十二烷基苯磺酸钠的0.02M磷酸盐缓冲液作为样品处理液。
将50～80μl的待检样品处理液直接滴加至检测试剂盒样品垫，此时样品将依次沿着反应支持物5上的各个附着物向吸水滤纸的方向移动，10分钟内读取实验结果。
如果待检样本(粪便或呕吐物)中含有的诺如病毒时，则与检测试剂盒上的胶体金标记的诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体特异性结合形成复合物，而后继续前行，与包被在硝酸纤维素膜2上的另一个诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体发生特异性结合，在检测条带处出现红色或者粉红色，即检测线，表明待检样品中含有诺如病毒，为阳性，参照图3。
如果待检样本中含有的不含有诺如病毒，就不能形成足量复合物，检测条带处也就不能出线红色或粉红色，为阴性，参照图4。
无论样本中是否含有诺如病毒，上述胶体金标记的单克隆抗体都会继续前行至质控条带并与此处包被的羊抗鼠IgG多克隆抗体结合，形成红色或者粉红色条带，即为质控线。如果在检测中此条带不出现，则证明胶体金失效或者操作有失误，结果无效，需要重新检测，参照图5和图6。
本发明提供的诺如病毒检测试剂盒，能够简化粪便或者呕吐物样本中诺如病毒的检测流程。利用该种检测试剂盒检测诺如病毒，不对任何实验仪器、环境或者操作人员具有依赖性，操作简单、方便、检测周期短、易于判读；另外，不需要特殊的仪器设备，不需要专业培训，适应性强，便于随时随地的监测和检验。
本发明提供的检测方法操作简单方便、不依赖较高实验室条件、用于快速检测诺如病毒，进而实现快速简便的辅助诊断腹泻等相关疾病的病因。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种诺如病毒检测试剂盒，其特征在于，包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸和反应支持物；其中，所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜、所述吸水滤纸依次设置在所述反应支持物上；所述样品垫设置在所述反应支持物的底端，所述样品垫的顶端压住所述胶体金垫的底端并与之粘贴，所述胶体金垫的顶端压住所述硝酸纤维素膜的底端并与之粘贴，所述硝酸纤维素膜的顶端被所述吸水滤纸的底端压住并与之粘贴。
2.根据权利要求1所述的诺如病毒检测试剂盒，其特征在于，所述吸水滤纸长度为33.0mm，所述吸水滤纸与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1.0mm。
3.根据权利要求1所述的诺如病毒检测试剂盒，其特征在于，所述胶体金垫的长度为6.0mm，所述胶体金垫与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1.0mm。
4.根据权利要求1所述的诺如病毒检测试剂盒，其特征在于，所述样品垫的长度为25.0mm，所述样品垫与所述胶体金垫重叠粘贴在一起的重叠长度为2.0mm。
5.根据权利要求1所述的诺如病毒检测试剂盒，其特征在于，所述胶体金垫为含有胶体金标记的诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体的胶体金垫。
6.根据权利要求1所述的诺如病毒检测试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜设置有检测条带和质控条带，所述检测条带设置于靠近所述胶体金垫的一侧并含有诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体，所述质控条带设置于远离所述胶体金垫的一侧并含有羊抗鼠IgG多克隆抗体。
7.根据权利要求1所述的诺如病毒检测试剂盒，其特征在于，所述反应支持物为塑料。
8.一种应用诺如病毒检测试剂盒进行诺如病毒检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待检样本用稀释液处理；其中，所述待检样本为粪便或者呕吐物；
(2)将稀释好的样本滴加至诺如病毒检测试剂盒的样品垫上；样本将依次沿着反应支持物上的各个附着物向吸水滤纸的方向移动；
(3)若所述样本中含有诺如病毒，则诺如病毒中的诺如病毒衣壳蛋白在经过所述胶体金垫的过程中，与所述胶体金垫标记的诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体特异性结合形成复合物；所述复合物在经过所述硝酸纤维素膜的过程中，依次与相对于所述复合物不足量的诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体以及羊抗鼠IgG多克隆抗体特异性结合；则检测条带处出现红色或粉红色，样本为阳性；
若所述样本中不含有诺如病毒，则检测条带处未出现红色或粉红色，样本为阴性：
(4)如果质控条带处出现红色或粉红色，则表明实验结果有效；如果质控条带处未出现红色或粉红色，则表明胶体金失效或者实验操作有误，实验结果无效。
9.根据权利要求8所述的诺如病毒检测的方法，其特征在于，步骤(1)中，使用2％的NP40和0.5％的十二烷基苯磺酸钠的0.02M磷酸盐缓冲液作为样品稀释液，稀释待检样本。
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