CN102071260A

CN102071260A - 一种检测甲型h1n1流感病毒rna的靶序列及试剂盒

Info

Publication number: CN102071260A
Application number: CN 200910199297
Authority: CN
Inventors: 吴大治; 夏懿
Original assignee: Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2009-11-24
Filing date: 2009-11-24
Publication date: 2011-05-25

Abstract

本发明提供一种检测甲型H1N1流感病毒(2009)RNA的靶序列与试剂盒，其特征在于采用基于该病毒两个核苷酸靶序列设计的特异性引物探针，在单个反应管中经一步法荧光RT-PCR检测甲型H1N1流感病毒(2009)RNA，以扩增模板的荧光信号强弱和循环阈值来判断样品中甲型H1N1流感RNA的存在。试剂盒组分包括PCR缓冲液、RT/Taq混合酶、阴性对照及阳性对照。试剂盒的使用包括样品处理和扩增检测两个步骤，试剂盒操作简便快速，灵敏度高，可广泛应用于疾控和临床中甲型H1N1流感病毒(2009)的快速鉴定。

Description

一种检测甲型H1N1流感病毒RNA的靶序列及试剂盒

技术领域

本发明属于一种检测甲型H1N1流感病毒RNA的靶序列及试剂盒。

背景技术

甲型流感病毒(Influenza A virus)是正粘病毒科的线状单股负链RNA病毒，根据病毒表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)分成许多亚型，目前已发现的血凝素有16个亚型(H1～16)、神经氨酸酶有9个亚型(N1～9)。甲型H1N1流感病毒作为其中的一个病毒亚型，病毒颗粒呈多形态，一般为球形，直径为80～120nm，有囊膜。囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，即纤突和刺突，分别是柱状的血凝素(HA)、蘑菇状的神经氨酸酶(NA)和膜上的M2基质蛋白。病毒颗粒内为核衣壳，呈螺旋状对称，直径10nm，两端具有环状结构，存在于病毒的囊膜内，由大小不等的8个独立片段组成，基因组大小约为1316kb。

甲型流感病毒基因之间重排、重组现象非常普遍和广泛，重组变异的病毒株常会造成不同程度的季节性流感流行和流感大流行。甲型H1N1流感病毒(2009)作为2009年在全球引起爆发和流行的新型重组流感病毒，经研究发现它是由4种病毒重组变异形成的：1种禽流感病毒、1种普通流感病毒和2种在猪之间广泛传播的猪流感病毒。人感染了甲型H1N1流感病毒(2009)后的症状与普通人流感相似，包括发热、咳嗽、喉咙痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻和呕吐，重者会继发肺炎和呼吸衰竭，甚至死亡。

一般流感病毒诊断常用的方法包括血清学诊断法、病毒分离培养法和特异性抗体检测法等。和这些方法比较，荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术具有准确灵敏、简便快速的优点，因此目前世界卫生组织和国家卫生部均推荐采用荧光RT-PCR技术检测甲型H1N1流感病毒(2009)并公布了引物探针序列，由于病毒的高度变异性、以及该序列在设计之初可供参考的病毒株基因公布序列较少，推荐使用的引物探针存在序列和现有公布的多数病毒株基因序列错配的问题，从而导致检测荧光值低、灵敏度不足甚至漏检。为了准确鉴定甲型H1N1流感病毒(2009)，有必要寻找另外的甲型H1N1流感病毒(2009)特异性核苷酸检测序列。

发明内容

本发明提供一种用于检测甲型H1N1流感病毒(2009)RNA的靶序列与试剂盒，其特征在于，采用基于甲型H1N1流感病毒(2009)HA和NA基因靶序列设计的特异性引物探针，在单个反应管中通过一步法荧光RT-PCR检测甲型H1N1病毒RNA。本发明克服了世界卫生组织推荐使用的引物探针序列和现有公布病毒株基因靶序列错配的不足，所筛选的检测靶序列对2009年爆发的甲型H1N1流感病毒(2009)基因序列具有更高的特异性，从而提高了检测的灵敏度和准确性，试剂盒适用于疾控和临床中甲型H1N1流感病毒(2009)的快速鉴定。

在本发明的第一方面，提供了一种检测甲型H1N1流感病毒(2009)的靶序列，它包括来源于该病毒HA和NA基因特定区域的两条序列，具有SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2中连续的70～300个核苷酸。

在本发明的第二方面，提供了一种检测甲型H1N1流感病毒(2009)RNA的试剂盒，它含有两对特异性扩增甲型H1N1流感病毒(2009)靶序列的引物及相应的两条荧光探针，所述引物长度为15～35个核苷酸，探针长度20～50个核苷酸。一对引物序列中一条序列与SEQ ID No.1所示的序列相同，另一条序列与SEQ ID No.1所示的序列互补；另一对引物序列中一条序列与SEQ IDNo.2所示的序列相同，另一条序列与SEQ ID No.2所示的序列互补；两条荧光探针序列分别与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列相同或互补，其中一条探针5’端标记FAM(6-羧基荧光素)荧光基团，另一条探针5’端标记HEX(六氯-6-羧基荧光素)荧光基团，两条探针3’端均标记淬灭基团如TAMRA(6-羧基-四甲基罗丹明)或BHQ(Black Hole Quencher)。

在另一优选例中，所述两对引物序列可以选自SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7；所述两条探针序列可以选自SEQ ID No.5和SEQ ID No.8的序列。引物探针序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85％以上。

在另一优选例中，含有引物探针的试剂盒还包括PCR缓冲液、逆转录酶和Taq DNA聚合酶混合酶(RT/Taq混合酶)、阴性对照及阳性对照。

在本发明的第三方面，提供了一种快速鉴定样品中甲型H1N1流感病毒(2009)的方法，它包括步骤：

(1)样品处理提取模板RNA

(2)模板RNA扩增检测

用特异性引物和探针进行一步法荧光RT-PCR，通过检测荧光信号的强弱和扩增循环阈值(Ct值)来检测样品中的甲型H1N1流感病毒(2009)RNA。

具体实施方式

本发明人经过深入广泛的研究，从国内国外公开的甲型H1N1流感病毒株基因序列中比对筛选出两条较为保守的核苷酸序列，这两条序列分别属编码病毒颗粒囊膜表面的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因特定区域的一部分，是2009年爆发的H1N1型病毒本身特有的结构性、功能性蛋白的基因序列，且序列在H1N1型病毒株之间较为保守，选择它们作为扩增引物的靶序列，具有很好的特征性，这两条靶序列具体序列示于SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

通过同源性比较，甲型H1N1流感病毒(2009)基质蛋白基因中有多个区域可以作为病毒RNA检测的特异性区域，但SEQ ID No.1和2所示的核苷酸序列是一种特别优选的适合作为甲型H1N1流感病毒(2009)RNA检测的序列。因此，基于序列SEQ ID No.3～8，本发明提供了一种应用一步法荧光RT-PCR同时扩增HA和NA基因检测甲型H1N1流感病毒(2009)RNA的方法；还提供一种快速检测甲型H1N1流感病毒(2009)RNA的试剂盒。

本发明的关键是使用了特异性扩增病毒基因序列的引物对，以及荧光探针，所述引物长度为15～35个核苷酸，探针长度20～50个核苷酸。一对引物序列中一条序列与SEQ ID No.1所示的序列相同，另一条序列与SEQ ID No.1所示的序列互补；另一对引物序列中一条序列与SEQ ID No.2所示的序列相同，另一条序列与SEQ ID No.2所示的序列互补；两条荧光探针序列分别与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列相同或互补，其中一条探针5’端标记FAM荧光基团，另一条探针5’端标记HEX荧光基团，两条探针3’端均标记淬灭基团如TAMRA或BHQ。本发明所用的两对引物对和两条荧光探针属于区分2009年爆发的甲型H1N1流感病毒(2009)型特异性序列，由于它们和已知公开的甲型H1N1流感病毒(2009)基因序列同源性好，互补性高，从而减少了两者之间的错配，因此试剂盒荧光检测信号好、检出极限低、灵敏度高。

在一优先例中：一种快速检测甲型H1N1流感病毒(2009)RNA的试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液、RT/Taq混合酶、阴性对照及阳性对照，其特征是：

(1)PCR缓冲液含有Tris-HCl、KCl、dNTPs、MgCl₂、两对引物(序列例如SEQ ID No.3和4、SEQ ID No.6和7)、两条荧光探针(序列例如SEQ ID No.5和8，一条5’端标记FAM荧光基团，另一条5’端标记HEX荧光基团，两条探针3’端均标记淬灭基团如TAMRA或BHQ)、无菌去离子水。

(2)RT/Taq混合酶含有鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV RT酶)和TaqDNA聚合酶。

(3)阳性对照含有以SEQ ID No.1和2序列为模板、经体外转录获得的人工RNA。

在本发明的一个优选方案中，由PCR缓冲液、RT/Taq混合酶配制好的荧光RT-PCR反应液包含10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，3mM MgCl₂，0.35μM的两对引物，0.2μM的两条探针、3U M-MLV RT酶和1.5U Taq DNA聚合酶，无菌去离子水。其中引物为SEQ ID No.3和4、SEQ ID No.6和7序列，荧光探针为SEQ ID No.5和SEQ ID No.8序列，SEQ ID No.5探针5’端标记FAM荧光基团，SEQ ID No.8探针5’端标记HEX荧光基团，两条探针3’端均标记荧光淬灭基团BHQ-1。

在本发明的一个优选方案中，阳性对照是以SEQ ID No.1和2序列为模板、经体外转录获得的人工RNA。SEQ ID No.1和2序列片段插入到pBluescriptIISK+载体质粒T7 RNA聚合酶启动子的序列下游，含有这两个序列片段的质粒经限制性内切酶线性化处理，经纯化后作为T7 RNA聚合酶的模板，采用商用体外转录试剂盒转录获得RNA，该RNA经纯化后用分光光度计法测定浓度并稀释到1×10⁵copy/ml，作为试剂盒阳性对照-20℃保存。

本发明提供的一步法荧光RT-PCR检测甲型H1N1流感病毒(2009)的试剂盒，经过对反应体系各组分，例如引物浓度、荧光探针浓度、Mg²⁺浓度、退火温度等的优化，将特异性引物探针筛选技术和荧光RT-PCR系统相结合，通过实验优化方案，试剂盒能完全满足快速特异检测甲型H1N1流感病毒(2009)的实际需要。

本发明还提供一种利用本发明试剂盒检测甲型H1N1流感病毒(2009)的方法，该方法包括以下检测步骤：

(1)采用商业病毒RNA提取试剂盒进行样品处理和模板RNA提取；

(2)分别取试剂盒阴性对照、阳性对照及提取的RNA、加入由PCR缓冲液和RT/Taq混合酶一起配制的荧光RT-PCR反应液，在荧光PCR仪上进行扩增检测，通过对样品反应管荧光信号的强弱和扩增循环阈值(Ct值)的检测，比较待测样品和试剂盒对照的循环阈值，判断样品中甲型H1N1流感病毒(2009)RNA阳性或阴性。

本发明与现用的病毒分离培养法、血清学诊断法及特异性抗体检测法比较，具有以下主要优点和效果：

(1)和分离培养法比较具有检测速度快和灵敏的特点，本发明试剂盒加上RNA提取，2～3小时完成检测获得结果。

(2)和血清学、抗体检测方法比较具有灵敏的特点，并能缩短病毒检测的“窗口期”。

(3)试剂盒使用了基于检测甲型H1N1流感病毒(2009)型特异性靶序列的两种荧光探针，探针采用不同荧光标记，两种荧光信号相互干扰，保证了检测特异性和灵敏度。

(4)试剂盒闭管检测，操作简便快速。

(5)试剂盒可以实现高通量样品检测。

此外，和WHO推荐使用的甲型H1N1流感病毒(2009)引物探针序列比较，本发明试剂盒所用引物探针序列和已知公开的2009年爆发甲型H1N1流感病毒(2009)基因序列同源性好，互补性高，从而减少了两者之间的错配，因此试剂盒荧光检测信号好、检出极限低、灵敏度高。本发明的上述特点，均为采用检测靶序列的引物探针和荧光RT-PCR技术组合应用而直接引起。从原理上说，本发明试剂盒通过对实时荧光RT-PCR两个检测通道荧光扩增信号和循环阈值的分析，判断甲型H1N1流感病毒(2009)RNA的存在。作为一种甲型H1N1流感病毒(2009)RNA快速检测的手段，本发明的技术方案设计合理，可以广泛应用于疾控和临床中该病原体的快速鉴定。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人的分子克隆手册中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明中所涉及的主要试剂说明：

鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV RT酶)为Invitrogen公司生产的Superscript III逆转录酶，Taq DNA聚合酶、dNTPs(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)均为上海宏谊公司生产，引物探针以及其它化学试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。病毒RNA提取试剂盒采用QIAGEN公司的QIAampViral RNA Mini Kit等商业病毒RNA提取试剂盒。

实施例1：甲型H1N1流感病毒(2009)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)的制备

采用常规方法制备一种快速检测甲型H1N1流感病毒(2009)RNA的荧光RT-PCR试剂盒，该试剂盒包括：PCR缓冲液、RT/Taq混合酶、阴性对照、阳性对照。其中：

(1)PCR缓冲液含有Tris-HCl、KCl、dNTPs、MgCl₂、两对引物(序列例如SEQ ID No.3和4、SEQ ID No.6和7)、两条荧光探针(序列例如SEQ ID No.5和8，一条5’端标记FAM荧光基团，另一条5’端标记HEX荧光基团，两条探针3’端均标记淬灭基团如TAMRA或BHQ-1)、无菌去离子水。

具体地，由PCR缓冲液、RT/Taq混合酶配制好的荧光RT-PCR反应液包含10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，3mM MgCl₂，0.35μM的两对引物，0.2μM的两条探针、3U M-MLV RT酶和1.5U Taq DNA聚合酶，无菌去离子水。其中引物为SEQ ID No.3和4、SEQ ID No.6和7序列，荧光探针为SEQ ID No.5和SEQ ID No.8序列，SEQ ID No.5探针5’端标记FAM荧光基团，SEQ ID No.8探针5’端标记HEX荧光基团，两条探针3’端均标记荧光淬灭基团BHQ-1。

具体地，阳性对照是以SEQ ID No.1和2序列为模板、经体外转录获得的人工RNA。SEQ ID No.1和2序列片段插入到pBluescriptII SK+载体质粒T7RNA聚合酶启动子的序列下游，含有这两个序列片段的质粒经限制性内切酶线性化处理，经纯化后作为T7 RNA聚合酶的模板，采用商用体外转录试剂盒转录获得RNA，该RNA经纯化后用分光光度计法测定浓度并稀释到1×10⁵copy/ml，作为试剂盒阳性对照。阴性对照采用无RNase的无菌去离子水。阴性对照和阳性对照均保存于-20℃。

试剂盒制备工艺简述如下：

(1)合成的引物探针定量配制、浓度检测、抽样质检。

(2)将PCR缓冲液、RT/Taq混合酶无菌分装，抽样质检。

(3)将阴性、阳性对照品进行浓度测定、分装，抽样质检。

(4)将上述分装后的4种组分置于同一容器中，组装为成品试剂盒，封装后保存于-20℃。

实施例2：甲型H1N1流感病毒(2009)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)的应用

(1)样品处理

样品采用中国药品生物制品检定所分发的甲型H1N1流感病毒(2009)RNA参考品(包括阳性参考品、阴性参考品、最低检测量参考品等，最低检测量参考品有5管包含1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴和1×10⁵copy/ml浓度的甲型H1N1流感病毒(2009)鸡胚培养物)和临床采集的具有病毒性流感症状的患者咽拭子。临床采集的咽拭子样本需要进行预处理，即先在运输(保存)液中漩涡振荡混匀，洗下拭子上粘附的病毒和含病毒细胞获得咽拭子漂洗液。然后取参考品、咽拭子漂洗液、以及试剂盒两个对照品各140μl，每管中加入QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit中的AVL 560μl(预混有Carrier RNA)，按照其说明书进行后续步骤，最后获得洗脱的RNA进行荧光RT-PCR扩增检测。

(2)扩增检测

按照发明内容中的方法，按样品数n取PCR缓冲液14.5×(n+2)、RT/Taq混合酶2×(n+2)组分，混匀后每个扩增管分装15μl，分别加入上述采用QIAGEN公司QIAamp Viral RNA Mini Kit提取的试剂盒阴性对照和阳性对照、n个样品RNA模板各10μl。每个反应扩增管体积为25μl，将上述扩增管放到LC480实时荧光PCR仪器(Roche公司)上按照50℃15min、95℃2min后94℃15sec、55℃40sec循环45次的程序运行。

荧光PCR仪运行结束后，试剂盒结果判断方法为：在FAM和HEX荧光波长检测通道阴性对照均为阴性，阳性对照均为阳性；在这两个荧光波长检测通道中样品扩增曲线呈明显的S形且其循环阈值(Ct值)＜45者为甲型H1N1流感病毒(2009)RNA阳性，无Ct值或该值为45者为阴性。

经过分析试剂盒检测样品的荧光RT-PCR结果，发现中国药品生物制品所甲型H1N1流感病毒(2009)参考品中12个阴性参考品检测全部为阴性，2个阳性参考品P1和P2检测均为阳性，5个最低检测量参考品检测4个为阳性，S5管检测为阴性，表明试剂盒最低能检测1×10²copy/ml RNA的病毒培养物样品。5个临床咽拭子漂洗液样品中2个为阳性。

核苷酸序列表

SEQUENCE LISTING

<110>上海复星医学科技发展有限公司

上海复星医药(集团)股份有限公司

吴大治，夏懿

<120>一种检测甲型H1N1流感病毒RNA的靶序列及试剂盒

<130>H1N1

<140>CN

<141>2009-10-25

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>500

<212>DNA

<213>Influenza A virus(A/2009(H1N1))

<220>

<221>SEQ ID No.1

<222>(1)..(500)

<400>1

taccgagata tgcattcgca atggaaagaa atgctggatc tggtattatc atttcagata 60

caccagtcca cgattgcaat acaacttgtc agacacccaa gggtgctata aacaccagcc 120

tcccatttca gaatatacat ccgatcacaa ttggaaaatg tccaaaatat gtaaaaagca 180

caaaattgag actggccaca ggattgagga atgtcccgtc tattcaatct agaggcctat 240

ttggggccat tgccggtttc attgaagggg ggtggacagg gatggtagat ggatggtacg 300

gttatcacca tcaaaatgag caggggtcag gatatgcagc cgacctgaag agcacacaga 360

atgccattga cgagattact aacaaagtaa attctgttat tgaaaagatg aatacgcaat 420

tcacagcagt aggtaaagag ttcaaccacc tggaaaaaag aatagagaat ttaaataaaa 480

aagttgatga tggtttcctg 500

<210>2

<211>500

<212>DNA

<213>Influenza A virus(A/2009(H1N1))

<220>

<221>SEQ ID NO.2

<222>(1)..(500)

<400>2

tcgaaatgaa tgcccctaat tatcactatg aggaatgctc ctgttatcct gattctagtg 60

aaatcacatg tgtgtgcagg gataactggc atggctcgaa tcgaccgtgg gtgtctttca 120

accagaatct ggaatatcag ataggataca tatgtagtgg gattttcgga gacaatccac 180

gccctaatga taagacaggc agttgtggtc cagtatcgtc taatggagca aatggagtaa 240

aaggattttc attcaaatac ggcaatggtg tttggatagg gagaactaaa agcattagtt 300

caagaaacgg ttttgagatg atttgggatc cgaacggatg gactgggaca gacaataact 360

tctcaataaa gcaagatatc gtaggaataa atgagtggtc aggatatagc gggagttttg 420

ttcagcatcc agaactaaca gggctggatt gtataagacc ttgcttctgg gttgaactaa 480

tcagagggcg acccaaagag 500

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>Influenza A virus(A/2009(H1N1))

<220>

<221>SEQ ID No.3

<222>(1)..(21)

<400>3

ggaaagaaat gctggatctg g 21

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>Influenza A virus(A/2009(H1N1))

<220>

<221>SEQ ID No.4

<222>(1)..(24)

<400>4

atcggatgta tattctgaaa tggg 24

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>Influenza A virus(A/2009(H1N1))

<220>

<221>SEQ ID No.5

<222>(1)..(24)

<400>5

tcagatacac cagtccacga ttgc 24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>Influenza A virus(A/2009(H1N1))

<220>

<221>SEQ ID No.6

<222>(1)..(24)

<400>6

ataaatgagt ggtcaggata tagc 24

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>Influenza A virus(A/2009(H1N1))

<220>

<221>SEQ ID No.7

<222>(1)..(20)

<400>7

cgccctctga ttagttcaac 20

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>Influenza A virus(A/2009(H1N1))

<220>

<221>SEQ ID No.8

<222>(1)..(24)

<400>8

agcaaggtct tatacaatcc agcc 24

Claims

1.本发明提供一种用于检测甲型H1N1流感病毒(2009)RNA的靶序列与试剂盒，其特征在于，采用基于该病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因设计的两对引物探针，在单个反应管中经一步法荧光RT-PCR同时检测甲型H1N1流感病毒(2009)两个靶序列RNA；试剂盒组分包括PCR缓冲液、RT/Taq混合酶、阴性对照及阳性对照。

2.如权利要求1所述，其特征在于，用于检测甲型H1N1流感病毒(2009)两个靶序列来源于该病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因，分别具有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中连续的70～300个核苷酸。

3.如权利要求1所述，其特征在于，所用的试剂盒含有两对特异性扩增甲型H1N1流感病毒(2009)的引物及两条荧光探针，所述引物长度为15～35个核苷酸，探针长度20～50个核苷酸。

4.如权利要求3所述的试剂盒，一对引物序列中一条序列与SEQ ID No.1中所示的序列相同，另一条序列与SEQ ID No.1中所示的序列互补；另一对引物序列中一条序列与SEQ ID No.2中所示的序列相同，另一条序列与SEQ ID No.2中所示的序列互补；两条荧光探针序列分别与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的序列相同或互补。

5.如权利要求3所述的试剂盒，所述一对引物序列可以选自SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；另一对引物序列可以选自SEQ ID No.6和SEQ ID No.7；所述两条探针序列可以选自SEQ ID No.5和SEQ ID No.8的序列，其中一条探针5’端标记FAM荧光基团，另一条探针5’端标记HEX或JOE、VIC荧光基团，两条探针3’端均标记淬灭基团TAMRA或BHQ。引物探针序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85％以上。

6.如权利要求1所述方法和引物探针建立的试剂盒，其特征在于按照以下浓度配制成的反应体系进行扩增反应：Tris-HCl(pH8.3)10mM，KCl 50mM，MgCl₂1.5～5mM，引物各0.2～0.5μM，两条探针各0.1～0.5μM、M-MLVRT酶和Taq DNA聚合酶各1～5U。

7.如权利要求1所述建立的试剂盒，在甲型H1N1流感病毒(2009)快速鉴定中的应用，包括以下步骤：

(1)样品处理提取模板RNA，样本包括鼻咽拭子、组织或培养物。

(2)模板RNA扩增检测，以荧光PCR仪上FAM和HEX通道扩增模板的荧光信号强弱和循环阈值来判断样品中甲型H1N1流感RNA的存在。