CN105132577B - 一种对miRNA进行多重定量检测的方法 - Google Patents

一种对miRNA进行多重定量检测的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种对miRNA进行多重定量检测的方法。本发明所述的方法包括逆转录、单链互补延伸、S1核酸酶消化、固相吸附提取和荧光定量检测的步骤。本发明以荧光定量PCR为基础，结合应用了S1核酸酶的单链消化作用与核酸固相吸附提取技术，实现了miRNA定量检测的通量突破。

Description

一种对miRNA进行多重定量检测的方法
技术领域
本发明属于荧光定量PCR技术领域，涉及一种可同时定量检测两种或两种以上miRNA的荧光定量PCR方法。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一组具有基因表达调控功能的长度约20～25个核苷酸的非编码RNA。大量研究表明miRNA参与了各种疾病(如：肿瘤、自身免疫性疾病等)的发生、发展，同时miRNA的表达变化也可被用来筛查、诊断疾病或者对疾病进行预后判断。建立稳定精确的miRNA定量检测方法是其作为生物标记物并用于临床诊断的前提。由于受个体差异性与生物样本多样性的双重影响，单一的miRNA表达变化通常难以精确预测疾病，而必须依赖于多个miRNA组合的表达(表达谱)变化对疾病进行预测。该情况为miRNA的定量检测方法提出了更高要求，即应当建立miRNA的多重定量检测方法。此外，miRNA定量检测的内参标准化也提出了建立双重或多重检测miRNA的方法需求。
茎环引物RT-PCR(Stem-loop RT-PCR)法是目前检测单个miRNA最精准的方法，也是目前其它类miRNA检测方法参照的标准。该方法采用特殊设计的茎环引物对特定miRNA进行逆转录，然后再采用特殊设计的上下游引物及探针对miRNA进行荧光定量检测。该方法能够对10个以下的拷贝进行检测，是检测灵敏度最高的miRNA检测方法。然而该方法最大缺陷是几乎难以实现多重检测，也很难对其实现稳定的标准化控制。该缺陷是限制其进入临床使用的最大障碍。
基因芯片法是检测miRNA的另一种常用方法，该方法是基于固相介质通过固定探针实现对miRNA进行多重检测的方法。通量高是该方法的最大特点，但其敏感性与检测结果的可重复性很低又是其最大缺点，从而该方法也难以进入临床使用。
因此，本领域需要进一步开发既能保证检测灵敏度又能保证一定通量的miRNA检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可同时定量检测两种或两种以上miRNA的荧光定量PCR方法。
在本发明的第一方面，提供一种对miRNA进行多重定量检测的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)以待测miRNA为模板，以逆转录引物进行逆转录，从而获得逆转录产物；所述逆转录引物的5’端序列为通用序列1，3’端序列为与目标miRNA的3’端序列互补的特异结合序列；
(2)以(1)获得的逆转录产物为模板，以互补引物进行单链互补延伸，从而获得单链互补延伸产物；所述互补引物的5’端为通用序列2，3’端为与目标miRNA的5’端序列相应的序列；
(3)以S1核酸酶处理(2)获得的单链互补延伸产物，从而去除单链核酸；
(4)对S1核酸酶处理后的体系进行固相吸附提取，从而获得纯化的双链DNA分子；
(5)以上游通用引物和下游通用引物以及目标miRNA特异性探针对经过(4)处理的体系进行PCR荧光定量检测，从而确定miRNA的量；所述的上游通用引物和下游通用引物的序列具有与通用序列2和通用序列1的序列相应(同义或反义)或互补的序列；所述的目标miRNA特异性探针具有目标miRNA或其片段的同义或反义序列。
在一个优选例中，所述的目标miRNA为1-6种，较佳地为2-4种；相应地，所述的逆转录引物的种类同目标miRNA种类(即每一目标miRNA对应一种如步骤(1)设计的逆转录引物)，所述的互补引物的种类同目标miRNA种类(即每一目标miRNA对应一种如步骤(2)设计的互补引物)；所述的目标miRNA特异性探针的种类同目标miRNA种类(即每一目标miRNA对应一种如步骤(5)设计的特异性探针)。
在另一优选例中，所述的通用序列1和通用序列2序列不变。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述的通用序列1的长度为10～40个碱基；较佳地为15～30个碱基。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述的与目标miRNA的3’端序列互补的特异结合序列的长度为8～14个碱基；较佳地为10～12个碱基。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述的通用序列2的长度为10～40个碱基；较佳地为15～30个碱基。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述的与目标miRNA的5’端序列相应的序列的长度为8～14个碱基；较佳地为10～12个碱基。
在另一优选例中，所述的“与目标miRNA的3’端序列互补的特异结合序列”和“与目标miRNA的5’端序列相应的序列”两者相加的碱基数等于或适当小于该目标miRNA的碱基数。
在另一优选例中，步骤(1)中，逆转录引物的浓度高于10nM；较佳地为10-500nM，如20nM，50nM，100nM，150nM，200nM，300nM或400nM。
在另一优选例中，步骤(2)中，互补引物的浓度高于10nM；较佳地为10-500nM，如20nM，50nM，100nM，150nM，200nM，300nM或400nM。
在另一优选例中，步骤(2)中，只进行1次变性-退火延伸的过程以避免非特异性延伸。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、检测步骤与原理示意图，其中右列步骤是左列步骤的延续。
图2、扩增曲线(miR-16标准品梯度)。
图3、对数曲线(miR-16标准品梯度)。
图4、扩增曲线(1pM miR-16，0.1pM miR-39)。
图5、对数曲线(1pM miR-16，0.1pM miR-39)。
图6、扩增曲线(10fM miR-16，1fM miR-39)。
图7、对数曲线(10fM miR-16，1fM miR-39)。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，揭示了一种既能保证检测灵敏度又能实现一定通量的miRNA检测方法。
如本发明所用，所述的“多重定量检测”是指在一个批次的检测或针对一个RNA样品(含有多于一种miRNA)的检测中，同时检测多于一种的目标miRNA。
如本发明所用，所述的“通用序列”是指即使一个反应系统中需要对2种以上目标miRNA进行检测时，该“通用序列”的序列保持不变。
如本发明所用，所述的“与X序列相应的序列”是指一种序列，其与X序列是同义的或是反义的。并且，当X序列是RNA序列时，其相应的序列可以是DNA序列。
本发明以荧光定量PCR为基础，结合采用了S1核酸酶的单链消化作用与核酸固相吸附提取技术，实现了miRNA定量检测的通量突破。本发明所述的方法可分为逆转录、单链互补延伸、S1核酸酶消化、固相吸附提取和荧光定量检测几步。
逆转录：如图1中，首先设计逆转录引物②，逆转录引物序列中包含一段通用引物序列区和一段能够与目标miRNA(③)的3’端序列结合的特异序列区。其中通用引物序列区的长度约15～30个碱基；特异序列区的长度应接近于目标miRNA长度的一半，约10～40个碱基；较佳地为15～30个碱基(以10～12个为最佳)。逆转录过程中逆转录引物②的特异序列区与对应miRNA的3’端序列结合，在逆转录酶的作用下延伸至miRNA的5’端形成逆转录产物④。
单链互补延伸：如图1中，单链互补延伸是指互补引物①与逆转录产物④之间的互补延伸。互补引物①的序列也包含一段通用引物序列区和目标miRNA的5’端的部分序列区。互补引物①与逆转录产物④经过热变性与退火后互补结合，之后在DNA聚合酶的作用下互为模板延伸成双链⑤。
S1核酸酶消化：如图1中，S1核酸酶具有消化单链核酸的特性。单链互补延伸反应结束后的体系经过S1核酸酶消化处理后可将剩余的逆转录引物、互补引物以及未参与互补反应的单链去除，同时一些非特异结合的双链也会被消化，从而可有效降低反应体系中核酸分子的复杂性，以避免上述组分对后续PCR过程产生干扰。
固相吸附提取：为了避免S1核酸酶以及其它残留物对后续PCR过程产生干扰，对S1核酸酶消化反应结束后的体系进行固相吸附提取，最终获得纯化的双链DNA分子。为了尽量减少提取过程中的吸附损失，提取过程中应采用微量DNA吸附柱。
荧光定量检测：如附图1中对互补形成并经过消化与提纯处理的双链⑤进行荧光定量检测。其中上、下游引物分别设在逆转录引物与互补引物的通用序列区。水解探针设计在miRNA序列区以保证检测特异性。水解探针的序列既可以是目标miRNA的同义序列也可以是其反义序列。
如图1中，当同时检测多个miRNA时，在逆转录反应体系中需加入针对不同miRNA的逆转录引物以形成相应的逆转录产物。进一步不同的逆转录产物分别与其对应的互补引物结合并互补延伸形成双链。因不同的双链产物均含有通用序列，在荧光定量检测中这些产物可被通用引物进行无差别扩增。结合各自特异性的水解探针可实现对每一种产物的定量检测。
在上述步骤中，逆转录与单链互补延伸过程对整个定量检测较为重要。其中逆转录步骤中逆转录引物的浓度应当设在10nM以上以保证足够的检测灵敏度，且在适当范围(如10-300nM)内其引物浓度越高越有利于提高其检测灵敏度。本步反应过程中逆转录引物在与不同量级的目标miRNA作用时会有不同比例的逆转录引物被延伸，进而将miRNA的定量关系转换为逆转录引物产生延伸的比例关系。
在单链互补延伸过程中保持足够的互补引物浓度对于保证足够的检测灵敏度同样重要，其浓度也应当设在10nM以上。通常，可将互补引物的浓度与逆转录引物的浓度设为相等(也可设为不相等，故此处不构成对权利要求的限定)。互补引物可与发生延伸的逆转录引物形成一定效率的结合与互补延伸，进而又将miRNA的定量关系演化为双链DNA数量关系。最后，在荧光定量检测中通过检测所形成的双链DNA的数量即可确定原始样本中miRNA的数量。
为了保证反应的特异性逆转录与互补延伸反应应当(但不是必须)分步进行。分步进行的形式既可以是取一定量的逆转录产物加入到互补延伸体系也可以是在逆转录体系中补充互补延伸反应所需的组分。其中后者有利于最大限度利用逆转录产物，有利于提高检测灵敏度。同样为了保证检测的特异性互补延伸反应过程中应当只进行1次变性-退火延伸的过程以避免非特异性延伸。此外，在确保无非特异延伸的前提下，可适当增加循环过程以提高检测敏感性。
互补延伸产物可取用部分或者全部用于S1核酸酶消化步骤，消化结束后应将全部产物进行DNA提取处理。
荧光定量步骤中上游引物对应于互补引物的通用序列，下游引物对应于逆转录引物中的通用序列。本领域技术人员应理解，上下游引物不一定需要与各自的对应的通用序列在序列上与长度上完全一致，只要满足能够与通用序列结合并启发延伸的引物均是可用的。
荧光定量步骤中探针的主体或全部序列应设在与目标miRNA对应的区域，本领域技术人员可以理解，无论该探针设计在正义链还是反义链上，均包含在本发明中。
本发明的特点在于在常规逆转录与荧光定量检测的中间引入了单互补延伸步骤。本领域技术人员应理解，本步骤既可以是在逆转录结束后的体系中增加本步反应所需组分然后进行反应的形式，也可以是以上步产物为底物建立新的反应体系的形式。
本发明的特点还在于在常规逆转录与荧光定量检测的中间引入了S1核酸酶消化步骤以降低反应体系中核酸组分的复杂性。本步骤既可以是在上步反应结束后的体系中增加本步反应所需组分然后进行反应的形式，也可以是以上步产物为底物建立新的反应体系的形式。
本发明的特点还在于在常规逆转录与荧光定量检测的中间引入了固相吸附提取步骤，该步骤有利于去除对后续PCR过程中有干扰的物质。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、定量检测两种miRNA示例
1、受试miRNA
本实施例以所述的发明方法同时定量检测miR-16与miR-39。miR-16是人体内持续表达的miRNA，其表达水平变化与一些疾病有一定关系。miR-39是线虫体内表达在人体内不表达的miRNA，故常被当作质控品参入样本中。同时检测miR-16与miR-39有助于实现miR-16检测的标准化。
2、序列设计
(1)根据数据库获得miR-16与miR-39的序列分别如下：
miR-16：5’-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3’(SEQ ID NO:1)；
miR-39：5’-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’(SEQ ID NO:2)
(2)分别设计针对miR-16与miR-39的逆转录引物、互补引物及水解探针为：
逆转录引物(其中，单下划线部分为通用序列区1，双下划线部分为与相应miRNA3’端11碱基互补的特异序列区)：
miR-16引物：5’-GTCCGAGGTCTGCCTACACAA3’(SEQ ID NO:3)；
miR-39引物：5’-GTCCGAGGTCTGCCTACACAA-3’(SEQ ID NO:4)。
互补引物(其中，单下划线部分为通用序列区2，双下划线部分为与相应miRNA 5’端11碱基互补)：
miR-16引物：5’-ACTCGACACGACACTTGTGAGTA-3’(SEQ ID NO:5)；
miR-39引物：5’-ACTCGACACGACACTTGTGAGTA-3’(SEQ ID NO:6)。
水解探针：
miR-16探针：5’-(FAM)TAGCAGCACGTAAATATTGGCG(MGB)-3’(SEQ ID NO:7)；
miR-39探针：5’-(VIC)TCACCGGGTGTAAATCAGCTTG(MGB)-3’(SEQ ID NO:8)。
逆转录引物(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4)和互补引物中(SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6)中含通用序列区，根据该序列设计通用引物的序列如下：
上游通用引物：5’-ACTCGACACGACACTTGTG-3’(SEQ ID NO:9)；
下游通用引物：5’-GTCCGAGGTCTGCCTAC-3’(SEQ ID NO:10)。
水解探针与通用引物配制成25μM备用。逆转录引物与互补引物分别配制成500nM备用。
3、检测方法
(1)待测样品
A组：以经过10倍系列稀释(10pM，10fM，10aM)的miR-16标准品作为待测样品。
B组：以miR-16与miR-39的标准品混合样品，其中miR-16为1pM，miR-39为0.1pM作为待测样品。
C组：以miR-16与miR-39的标准品混合样品，其中miR-16为10fM，miR-39为1fM作为待测样品。
(2)逆转录
按照表1配置逆转录反应体系，反应体系为10μl。
表1
逆转录反应条件为：42℃1小时，95℃5分钟。
(3)单链互补延伸
按照表2，在逆转录反应结束后的体系中补充互补引物与热启动DNA聚合酶(HSTaq)。
表2
组分 储液浓度 储液用量 工作浓度
互补引物 500nM 2μl 100nM
HSTaq酶 5U/μl 0.25μl 1.25U
逆转录产物 \ 10μl \
互补延伸反应条件为：95℃6分钟，45℃30秒，65℃1分钟。避免反复变复性，反应结束后保持在2～8℃。
(4)S1核酸酶消化
取2微升上步产物，构建25微升S1核酸酶消化反应体系，如表3。
表3
组分 储液浓度 储液用量 工作浓度
H2O \ 19.5μl \
10×Buffer \ 2.5μl
S1核酸酶 100U/μl 1μl 0.4U/μl
底物 \ 2μl \
反应条件为：23℃30分钟。
(5)固相吸附提取
采用商业化提取试剂盒(QIAmp DNA Mini Kit)，对S1核酸酶消化反应结束后的样本进行提纯。
(6)荧光定量检测
建立荧光定量检测体系(25微升)，对提取产物中的双链分子进行检测，反应体系如表4。
表4
反应条件为：95℃5分钟；95℃15秒，65℃1分钟，50次循环。
4、检测结果
按照上述方法单独检测经过10倍系列稀释的miR-16标准品，检测结果如图2与3。
表明本发明方法能够检测到10aM的目标分子。其敏感性非常理想。
同时检测miR-16与miR-39的标准品混合样品(其中miR-16为1pM，miR-39为0.1pM)的检测结果见图4与5。
同时检测miR-16与miR-39的标准品混合样品(其中miR-16为10fM，miR-39为1fM)的检测结果见图6和7。
上述结果显示，本发明方法能够同时检出两种miRNA，并且检测灵敏度非常理想，能够检出微小含量的miRNA。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (15)

1.一种对miRNA进行多重定量检测的方法，该方法为非诊断性的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)以待测miRNA为模板，以逆转录引物进行逆转录，从而获得逆转录产物；所述逆转录引物的5’端序列为通用序列1，3’端序列为与目标miRNA的3’端序列互补的特异结合序列；
(2)以(1)获得的逆转录产物为模板，以互补引物进行单链互补延伸，从而获得单链互补延伸产物；所述互补引物的5’端为通用序列2，3’端为与目标miRNA的5’端序列相应的序列；
(3)以S1核酸酶处理(2)获得的单链互补延伸产物，从而去除单链核酸；
(4)对S1核酸酶处理后的体系进行固相吸附提取，从而获得纯化的双链DNA分子；
(5)以上游通用引物和下游通用引物以及目标miRNA特异性探针对经过(4)处理的体系进行PCR荧光定量检测，从而确定miRNA的量；所述的上游通用引物和下游通用引物的序列分别与步骤(4)获得的双链DNA分子的序列中存在的通用序列2和通用序列1的序列相应或互补；所述的目标miRNA特异性探针具有目标miRNA或其片段的同义或反义序列。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目标miRNA为1-6种；相应地，所述的逆转录引物的种类同目标miRNA种类，所述的互补引物的种类同目标miRNA种类；所述的目标miRNA特异性探针的种类同目标miRNA种类。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的目标miRNA为2-4种。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的通用序列1和通用序列2序列不变。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的通用序列1的长度为10～40个碱基。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的通用序列1的长度为15～30个碱基。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的与目标miRNA的3’端序列互补的特异结合序列的长度为8～14个碱基。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的与目标miRNA的3’端序列互补的特异结合序列的长度为10～12个碱基。
9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的通用序列2的长度为10～40个碱基。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的通用序列2的长度为15～30个碱基。
11.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的与目标miRNA的5’端序列相应的序列的长度为8～14个碱基。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的与目标miRNA的5’端序列相应的序列的长度为10～12个碱基。
13.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，逆转录引物的浓度为10-500nM。
14.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，互补引物的浓度为10-500nM。
15.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，只进行1次变性-退火延伸的过程以避免非特异性延伸。
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CN103210092A (zh) * 2010-06-14 2013-07-17 新加坡国立大学 修饰的茎-环寡核苷酸介导的反转录和碱基间隔限制的定量pcr
WO2015049308A1 (en) * 2013-10-03 2015-04-09 Biocartis N.V. Quantification of micro rna

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