CN110157777B - 一种基于发卡结构变换的放大型荧光生物传感器及制备方法 - Google Patents

一种基于发卡结构变换的放大型荧光生物传感器及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于发卡结构变换的放大型荧光生物传感器及制备方法，所述传感器包括扩增均相反应液A液、扩增均相反应液B液、发卡DNA序列；所述扩增均相反应液A液，包括：目标miRNA序列、Nt.BstNBI缓冲液、RNA酶抑制剂、dNTP、模板DNA序列；所述扩增均相反应液B液，包括：去离子水、切口核酸内切酶Nt.BstNBI缓冲液、Vent（exo‑）DNA聚合酶、ThermoPol缓冲液。本发明扩增出的大量靶标适体与发卡结合，仅通过发卡的结构反转，即可实现对信号的放大与衰减。操作简单、快捷。

Description

一种基于发卡结构变换的放大型荧光生物传感器及制备方法
技术领域
本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种基于发卡结构变换的放大型荧光生物传感器及制备方法。
背景技术
微小RNA（miRNA）是内源的，进化上保守的，非编码的单链RNA。这些miRNA在调节转录中起着至关重要的作用，并在广泛的生物过程中发挥重要的调节作用，如细胞增殖，分化，凋亡和造血。miRNA的表达可能与许多人类疾病有密切关系。因此，miRNA的检测在疾病诊断及分子生物学的功能分析方面都具有十分重要的意义。
由于其体积小，浓度低，家族成员的序列高度相似，miRNA检测非常具有挑战性。Northern blotting是2000年代miRNA分析的黄金方法。然而，它灵敏度较差且耗时，不适合快速miRNA检测。然后高灵敏的定量逆转录酶聚合酶链反应（qRT-PCR）被用于量化miRNA。然而，由于miRNA的长度短，很难设计引物以区分具有相似序列的miRNA。为了克服这些传统技术的缺陷，新的检测方法不断涌现，比如基于纳米粒子的检测，表面增强拉曼散射（SERS），电化学检测，以及荧光扩增检测等。
但传统的荧光扩增的生物传感器通常仅可检测信号增高(Signal-on)或者检测信号降低(Signal-off)，有可能会出现假阳性或假阴性的检测结果。此外荧光扩增方法的背景信号高，荧光标记复杂，都降低了miRNA检测的可靠性和便利性。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种基于发卡结构变换的放大型荧光生物传感器及制备方法。本发明将扩增与荧光比率相结合，既可以提高检测的灵敏度，又可以提高miRNA检测的可靠性与便利性。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于发卡结构变换的放大型荧光生物传感器，包括扩增均相反应液A液、扩增均相反应液B液、发卡DNA序列。
所述扩增均相反应液A液，包括：目标miRNA序列、Nt.BstNBI缓冲液、RNA酶抑制剂、dNTP、模板DNA序列；
所述扩增均相反应液B液，包括：去离子水、切口核酸内切酶Nt.BstNBI、Vent（exo-）DNA聚合酶、ThermoPol缓冲液。
所述的目标miRNA序列、模板DNA序列和发卡DNA序列，其序列分别是：
目标miRNA序列：5'-UGAGG UAGUA GGUUG UAUAG UU-3'，
模板DNA序列：5'-TAACG GATTA AGTTG TGTCC TTCAA CAGAC TCAAA CTATA CAACCTACTA CCTCA A-P-3'，
发卡DNA序列：5'-CTTGC CAAT/iBHQ2dT/ CGATA ACGGA TTAAG TTGTG TCCTTCGAA/iCy5dT/ TGGCA AGCAG TCGCC AATT-Cy3-3'，
所述的模板DNA序列3'端修饰一个磷酸基团。
所述的发卡DNA序列第十个碱基T修饰一个猝灭基团BHQ2，第四十个碱基T修饰一个荧光基团Cy5，3'端修饰一个荧光基团Cy3。
所述的扩增均相反应液A液与B液混合后，均相反应混合液中RNA酶抑制剂终浓度为0.8 UμL-1、dNTP终浓度为300μM、模板DNA序列终浓度为0.1μM、Nt.BstNBI缓冲液终浓度为0.5×、切口核酸内切酶Nt.BstNBI终浓度为0.4Uμl-1 、Vent（exo -）DNA聚合酶终浓度为0.05Uμl-1、ThermoPol缓冲液终浓度为1×。
所述的扩增均相反应液中1× ThermoPol缓冲液包括：20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2 SO4，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100，Tris = 2-氨基-2-羟甲基丙烷-1,3-二醇，pH8.8。
0.5×Nt.BstNBI缓冲液包括：25mM Tris-HCl，50mM NaCl，5mM MgCl2，0.5mM二硫苏糖醇，pH 7.9。
所述的发卡DNA序列的终浓度为200nM。
上述放大型荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备扩增均相反应液的A、B液。
（2）等温指数扩增反应：将扩增均相反应液的A液与B液混合反应。
（3）发卡DNA序列与扩增反应产物混合反应。
（4）荧光检测。
所述的步骤（1）的A液与B液均在冰上制备。
所述的步骤（2）等温指数扩增反应的条件：总体积为50μl，温度55℃，反应时间为2h。
所述的步骤（3）扩增反应产物需80℃反应20min使酶失活，再与发卡混合反应。
所述的步骤（3）反应条件为：总体积为50μl，温度37℃，反应时间为1h。
本发明的优点在于：
（1）通过等温指数扩增对靶标进行指数型放大信号，极大地提高了检测的灵敏度。
（2）两种荧光检测信号的比率型生物传感器，靶分子的存在会引起一种荧光基团信号增强，而另一种荧光基团信号降低，该策略不仅可进一步提高检测灵敏度，还可增强检测特异性。
（3）扩增出的大量靶标适体与发卡结合，仅通过发卡的结构反转，即可实现对信号的放大与衰减，操作简单、快捷。
附图说明
图1为本发明的构建流程示意图。
图2为实施例1中不同浓度目标物的荧光比率图。
图3为实施例2中不同目标物的荧光比率选择性图。
图4为本方法检测4例肝癌患者和4例正常人血清样本中let-7a的结果。
具体实施方式
实施例1
一种检测不同浓度let-7a的放大型荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备扩增均相反应液的A、B液。
（2）等温指数扩增反应：将扩增均相反应液的A液与B液混合反应。
（3）发卡DNA与扩增反应产物混合反应。
（4）荧光检测。
步骤（1）的具体方法为：制备扩增均相反应液的A液，取不同浓度的目标（0nM、1nM、5nM、7.5nM、10nM）miRNA0.5μl、取10×的Nt.BstNBI缓冲液2.5μl、取10nM的dNTP1.5μl、取1μM的模板DNA5μl、取40U/μl的RNA酶抑制剂1μl；制备扩增均相反应液的B液，取去离子水30μl、取10U/μl的切口核酸内切酶Nt.BstNBI 2μl、取1U/μl的Vent（exo -）DNA聚合酶2.5μl、取10× ThermoPol缓冲液5μl。
目标let-7a序列5'-UGAGG UAGUA GGUUG UAUAG UU-3'，
模板DNA序列5'-TAACG GATTA AGTTG TGTCC TTCAA CAGAC TCAAA CTATA CAACCTACTA CCTCA A-P-3'，
发卡DNA序列 5'-CTTGC CAAT/iBHQ2dT/ CGATA ACGGA TTAAG TTGTG TCCTTCGAA/iCy5dT/ TGGCA AGCAG TCGCC AATT-Cy3-3'，
步骤（2）的具体方法为：等温指数扩增反应的总体积为50μl，A液与B液均在冰上制备，反应温度为55摄氏度，金属浴2h。
步骤（3）的具体方法为：将扩增后的反应液在80℃条件下金属浴20分钟使酶失活，取25μl反应液和25μl的400nM的发卡DNA混合于PCR管中，将混合液置于PCR扩增仪中恒温37℃反应1h。
步骤（4）的具体方法为：将PCR管中的混合液用滴管转移至荧光比色皿中，用荧光仪检测。荧光仪激发波长为512nm，发射波长为560nm，检测范围532nm-700nm。
读取荧光信号变化，测定结果如图2所示。随着目标浓度的增加，Cy3的荧光信号减弱，Cy5的荧光信号增加，实现了荧光共振转移。该方法的检测下限为10pM。
实施例2
一种检测let-7a的放大型荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备扩增均相反应液的A、B液。
（2）等温指数扩增反应：将扩增均相反应液的A液与B液混合反应。
（3）发卡DNA与扩增反应产物混合反应。
（4）荧光检测。
步骤（2）、（3）、（4）同实施例1。
所述的步骤（1）的反应过程的主要步骤如下：制备扩增均相反应液的A液，取不同的miRNA（miRNA-21、miRNA-141、let-7a、miRNA-21+miRNA-141+ let-7a的mixture）10nM0.5μl、取10×的Nt.BstNBI缓冲液2.5μl、取10nM的dNTP1.5μl、取1μM的模板DNA 5μl 、取40U/μl的RNA酶抑制剂1μl；制备扩增均相反应液的B液，取去离子水30μl、取10U/μl的切口核酸内切酶Nt.BstNBI 2μl、取1U/μl的Vent（exo -）DNA聚合酶2.5μl、取10× ThermoPol缓冲液5μl。
目标let-7a序列：5'-UGAGG UAGUA GGUUG UAUAG UU-3'，
miRNA-21 序列：UAGCU UAUCA GACUG AUGUU GA，
miRNA-141 序列：UAACA CUGUC UGGUA AAGAU GG，
模板DNA序列：5'-TAACG GATTA AGTTG TGTCC TTCAA CAGAC TCAAA CTATA CAACCTACTA CCTCA A-P-3'，
发卡DNA序列 5'-CTTGC CAAT/iBHQ2dT/ CGATA ACGGA TTAAG TTGTG TCCTTCGAA/iCy5dT/ TGGCA AGCAG TCGCC AATT-Cy3-3'，
读取荧光信号变化，每组数据平行测定三次，测定结果如图3所示。miRNA-21和miRNA-141的检测结果与空白对照相近。let-7a与mixture（该样本中含有miRNA-21、miRNA-141和let-7a，三者摩尔浓度比例为miRNA-21：miRNA-141：let-7a=100:100:1）相近，且let-7a的荧光比率值最高。则该方法具有良好的选择性。
实施例3
一种检测血清中let-7a的放大型荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备扩增均相反应液的A、B液。
（2）等温指数扩增反应：将扩增均相反应液的A液与B液混合反应。
（3）发卡DNA与扩增反应产物混合反应。
（4）荧光检测。
步骤（2）、（3）、（4）同实施例1。
所述的步骤（1）的反应过程的主要步骤如下：制备扩增均相反应液的A液，将血清样本稀释50倍，取稀释后的血清样本0.5μl，取10×的Nt.BstNBI缓冲液2.5μl、取10nM的dNTP1.5μl、取1μM的模板DNA 5μl 、取40U/μl的RNA酶抑制剂1μl；制备扩增均相反应液的B液，取去离子水30μl、取10U/μl的切口核酸内切酶Nt.BstNBI 2μl、取1U/μl的Vent（exo -）DNA聚合酶2.5μl、取10× ThermoPol缓冲液5μl。
目标let-7a序列：5'-UGAGG UAGUA GGUUG UAUAG UU-3'，
模板DNA序列：5'-TAACG GATTA AGTTG TGTCC TTCAA CAGAC TCAAA CTATA CAACCTACTA CCTCA A-P-3'，
发卡DNA序列： 5'-CTTGC CAAT/iBHQ2dT/ CGATA ACGGA TTAAG TTGTG TCCTTCGAA/iCy5dT/ TGGCA AGCAG TCGCC AATT-Cy3-3'，
本实施例针对四组肝癌患者和健康志愿者的let-7a进行分析，读取荧光信号变化，每组数据平行测定3次，测定结果如图4所示，正常人血清中let-7a的表达明显高于患病者，正常人中let-7a的表达量约是肝癌患者血清中let-7a的4.51 ~ 5.08倍。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种基于发卡结构变换的放大型荧光生物传感器及制备方法
<130> 5
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
ugagguagua gguuguauag uu 22
<210> 2
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
taacggatta agttgtgtcc ttcaacagac tcaaactata caacctacta cctcaa 56
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cttgccaatc gataacggat taagttgtgt ccttcgaatg gcaagcagtc gccaatt 57
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
uaacacuguc ugguaaagau gg 22

Claims (6)

1.一种基于发卡结构变换的放大型荧光生物传感器，其特征在于：所述传感器包括扩增均相反应液A液、扩增均相反应液B液、发卡DNA序列；
所述扩增均相反应液A液，包括：目标miRNA序列、Nt.BstNBI缓冲液、RNA酶抑制剂、dNTP、模板DNA序列；
所述扩增均相反应液B液，包括：去离子水、切口核酸内切酶Nt.BstNBI、Vent（exo -）DNA聚合酶、ThermoPol缓冲液；
所述目标miRNA序列：5'-UGAGG UAGUA GGUUG UAUAG UU-3'；
模板DNA序列：5'-TAACG GATTA AGTTG TGTCC TTCAA CAGAC TCAAA CTATA CAACCTACTA CCTCA A-P-3'，模板DNA序列3'端修饰一个磷酸基团；
发卡DNA序列：5'-CTTGC CAAT/iBHQ2dT/ CGATA ACGGA TTAAG TTGTG TCCTT CGAA/iCy5dT/ TGGCA AGCAG TCGCC AATT-Cy3-3'；发卡DNA序列第十个碱基T修饰一个猝灭基团BHQ2，第四十个碱基T修饰一个荧光基团Cy5，3'端修饰一个荧光基团Cy3。
2.根据权利要求1所述的一种基于发卡结构变换的放大型荧光生物传感器，其特征在于：
所述的扩增均相反应液A液与B液混合后，均相反应混合液中RNA酶抑制剂终浓度为0.8UμL-1、dNTP终浓度为300μM、模板DNA序列终浓度为0.1μM、Nt.BstNBI缓冲液终浓度为0.5×、切口核酸内切酶Nt.BstNBI终浓度为0.4Uμl-1 、Vent（exo -）DNA聚合酶终浓度为0.05Uμl-1、ThermoPol缓冲液终浓度为1×。
3.根据权利要求2所述的一种基于发卡结构变换的放大型荧光生物传感器，其特征在于：
所述1×ThermoPol缓冲液包括：20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2 SO4，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100，Tris = 2-氨基-2-羟甲基丙烷-1,3-二醇，pH8.8；
0.5×Nt.BstNBI缓冲液包括：25mM Tris-HCl，50mM NaCl，5mM MgCl2，0.5mM二硫苏糖醇，pH 7.9。
4.根据权利要求1所述的一种基于发卡结构变换的放大型荧光生物传感器，其特征在于：所述的发卡DNA序列的终浓度为200nM。
5.如权利要求1-4任一所述的生物传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）制备扩增均相反应液的A、B液；
（2）等温指数扩增反应：将扩增均相反应液的A液与B液混合反应；
（3）发卡DNA与扩增反应产物混合反应；
（4）荧光检测。
6.如权利要求5所述生物传感器的制备方法，其特征在于：
所述的步骤（1）的A液与B液均在冰上制备；
所述的步骤（2）等温指数扩增反应的条件：总体积为50μl，温度55℃，反应时间为2h；
所述的步骤（3）扩增反应产物需80℃反应20min使酶失活，再与发卡DNA序列混合反应；
所述的步骤（3）反应条件为：总体积为50μl，温度37℃，反应时间为1h。
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