CN107937482B - 一种检测多核苷酸激酶的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种检测多核苷酸激酶的试剂盒及其检测方法。本发明试剂盒包括：探针A，探针S，混合液A，模板DNA，λ核酸外切酶，多核苷酸激酶标准品，1×NEBuffer和10mM三磷酸腺苷。本发明试剂盒检测方法操作简单、降低了检测成本，且灵敏性高、特异性强，可以应用于复杂样品的检测。并且本发明试剂盒还可应用于PNK活性抑制性检测中。

Description

一种检测多核苷酸激酶的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种检测多核苷酸激酶的试剂盒及其检测方法。
背景技术
多核苷酸激酶(PNK)是一种能够催化磷酸基团从ATP的γ位转移到DNA的5’-羟基末端进而生成5’-磷酸末端的DNA末端加工酶。这种PNK催化的磷酸化反应在DNA重组、DNA复制和DNA损伤修复等很多细胞过程中都发挥着重要的作用；PNK表达和活性异常与多种人类疾病密切相关；目前，PNK被认为是一种潜在的可用于癌症治疗的靶物质。
现有技术中，荧光检测方法因其便利性和灵敏性成为PNK活性检测最常用的方法。目前已有多种荧光检测方法用于PNK活性的分析测定，如：基于金纳米颗粒的荧光恢复检测法，基于免淬灭发夹型探针的荧光检测法，纸基荧光检测法，基于氧化石墨烯的分子信标荧光检测法以及基于催化活性分子信标组装的荧光检测法等。这些荧光检测方法在PNK活性的定量测定中都表现出良好的性能，但这些方法大多需要昂贵的荧光标记；同时由于不彻底的荧光淬灭效应还可能产生假阳性干扰。此外，因为缺乏有效的信号放大策略，这些方法的灵敏度普遍较低，多数方法的灵敏度还不足以支持实际应用。
与传统的聚合酶链式反应(PCR)及其他核酸扩增方法相比，指数扩增反应(EXPAR)具有恒定的反应温度、较高的扩增效率和较快的扩增动力学等显著优点。通过将DNA聚合酶介导的链延长反应和切刻酶介导的单链切刻反应结合起来，指数扩增反应(EXPAR)能够快速在恒定温度下实现106倍的信号扩增。指数扩增反应(EXPAR)最初被用于检测DNA，后来扩展到用于检测microRNA、端粒酶、转录因子和致病菌等其他靶物质。
发明内容
为了解决上述方法存在的问题，本发明提供了一种检测多核苷酸激酶的试剂盒及其检测方法。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明第一个方面，提供一种检测多核苷酸激酶的试剂盒，包括以下成分：探针A，探针S，混合液A，模板DNA，λ核酸外切酶，多核苷酸激酶标准品，1×NEBuffer和10mM三磷酸腺苷。
本发明第二个方面，提供一种检测多核苷酸激酶的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)将探针A、探针S和1×的NEBuffer 2混合后在95℃下孵育5分钟，而后缓慢冷却30分钟以上至室温，得反应体系I；
(2)向上述反应体系I中加入三磷酸腺苷、λ核酸外切酶以及待测PNK于37℃孵育15～30分钟后，在70～80℃水浴中加热5～15分钟，缓慢冷却至室温，得反应体系II；
(3)将上述反应体系II置于冰上，加入模板DNA、10×NEBuffer 2混合均匀后加入混合液A，混合均匀后立即将混合液置于实时荧光定量系统中进行荧光监测。
本发明第三个方面，提供一种检测多核苷酸激酶的试剂盒在PNK活性抑制性检测中的应用。
本技术方案是基于磷酸化作用触发两级恒温指数扩增超灵敏检测PNK的免标记荧光定量方法。当体系中没有靶物质PNK存在时，无法引发任何扩增反应；反之，当靶物质PNK存在时，经过PNK催化的磷酸化作用和λ核酸外切酶的消化作用，探针在DNA聚合酶和切刻酶的作用下可以引发第一级链置换反应，产生大量的触发序列，进而启动第二级链置换反应，最终实现指数扩增，PNK的活性信号通过信号转换实现有效放大；最后利用SYBR green I染料作为荧光指示剂，可以轻松实现对荧光信号的免标记实时监测。
与现有技术相比，本发明具有以下技术优点：
(1)本发明试剂盒操作简单，成本低廉：本发明利用两级恒温指数扩增反应和SYBRGreen I染料实现PNK活性的实时定量检测；相比荧光标记等方法，本发明无需昂贵的荧光标记，大大降低了实验成本；相比聚合酶链式反应(PCR)，本发明无需使用昂贵的热循环仪，恒温下即可完成扩增反应，降低了实验成本；
(2)本发明试剂盒效率高，效果好：本发明两级恒温指数扩增反应在60分钟内即可达到较高的扩增效率，实现PNK活性的快速高效检测；相比其他方法因不彻底的荧光淬灭效应可能会产生假阳性的干扰，本发明试剂盒直接使用SYBR Green I作为荧光指示剂，免受假阳性干扰；
(3)本发明试剂盒灵敏度高，应用潜力巨大：本发明由PNK和λ核酸外切酶共同实现的磷酸化-外切酶消化反应过程能够将PNK的催化活性信号高效率、高特异性地转化为可扩增的核酸信号；同时，基于链置换反应触发指数扩增反应的两级恒温指数扩增反应的扩增效率也很高；此外，结合荧光指示剂SYBR GreenI，可以产生用于实时定量测定的荧光信号，因此本发明试剂盒的检测灵敏度很高，检测限低至0.0002单位每毫升，优于大多数现有的PNK活性检测方法；在实际样品内进行PNK活性测定时，本试剂盒的灵敏度甚至可以达到单细胞水平，有很大的实际应用价值，展现出巨大的临床诊断和生物研究潜力；
(4)特异性好：由于本发明试剂盒中对探针的设计是基于沃森-克里克碱基互补配对原则，很大程度上避免了探针之间的非特异性结合；同时，本发明试剂盒通过PNK和λ核酸外切酶共同实现的磷酸化-外切酶消化反应，探针S对探针A3’末端的“封锁”作用可以避免非特异性扩增反应的发生，大幅降低了后续非特异性扩增可能产生的干扰信号；
(5)应用范围广
本技术发明试剂盒既能实现对PNK催化活性的实时定量检测，也能很好地开展关于PNK抑制实验的实时检测；此外，本发明试剂盒还可用于成分复杂的实际样品(癌细胞)内PNK催化活性的实时定量检测，灵敏度可达单细胞水平。
附图说明
图1：基于两级恒温扩增反应在单细胞水平检测多核苷酸激酶(PNK)的方法原理说明。
图2：(A)对PNK催化磷酸化反应所触发的λ外切酶消化产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；(B)对磷酸化反应触发的两级恒温指数扩增反应的实时定量分析。PNK和λ核酸外切酶的浓度分别为5单位每毫升、0.25单位每微升，探针和模板DNA的浓度分别为100纳摩尔每升和50纳摩尔每升。
图3：(A)不同PNK浓度下的实时荧光定量检测结果；(B)POI值与PNK浓度的线性关系图；插图：POI值与PNK浓度对数的线性关系图；误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差；探针和模板DNA的浓度分别为100纳摩尔每升和50纳摩尔每升。
图4：利用不同的生物酶作为靶物质进行扩增反应所得的ΔPOI值比较；所用生物酶的浓度均为0.5单位每毫升，探针和模板DNA的浓度分别为100纳摩尔每升和50纳摩尔每升；误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。
图5：不同的PNK抑制剂的抑制效果，(A)二磷酸腺苷；(B)硫酸铵；(C)磷酸氢二钠；PNK的浓度为0.5单位每毫升，探针和模板DNA的浓度分别为100纳摩尔每升和50纳摩尔每升；误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。
为了提高PNK检测的灵敏度和准确性，降低检测成本，本发明第一个方面，提供一种检测多核苷酸激酶的试剂盒，包括以下成分：探针A，探针S，混合液A，模板DNA，λ核酸外切酶，多核苷酸激酶标准品，1×NEBuffer和10mM三磷酸腺苷。
在本发明优选的技术方案中，所述混合液A包括：0.05～0.15毫克每毫升的牛血清白蛋白、0.1～0.3单位每微升的Nt.BbvCI切刻酶，0.05～0.15单位每微升的KF聚合酶、200～300微摩尔每升的三磷酸脱氧核苷酸以及10×的SYBR green I染料。
在本发明进一步优选的技术方案中，所述混合液A包括：0.1毫克每毫升的牛血清白蛋白、0.2单位每微升的Nt.BbvCI切刻酶，0.1单位每微升的KF聚合酶、250微摩尔每升的三磷酸脱氧核苷酸以及10×的SYBR green I染料。
在本发明优选的技术方案中，所述探针A的核苷酸序列为5’-GCA CAA AGG ACTGAG GCT GAG GGT TGC GCA TCT GCT ATG AAA CAA GCC AGA TGC TCA AC-3’，如SEQ IDNO.1所示，其5’末端作磷酸化修饰；探针S的核苷酸序列为5’-GTT GAG CAT CTG GCT TGTTTC ATA GCA GAT GTT TTT T-3’，如SEQ ID NO.2所示，其5’末端作磷酸化修饰。
在本发明优选的技术方案中，所述模板DNA核苷酸序列为5’-GCA CAA AGG ACTGAG GCT GAG GGC ACA AAG GAC TGA G-3’，如SEQ ID NO.3所示，其3’末端为磷酸基末端。
在本发明优选的技术方案中，所述1×NEBuffer包括以下成分及其浓度：10毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸Tris-HCl、50毫摩尔每升的氯化钠、50毫摩尔每升的氯化镁以及1毫摩尔每升的二硫苏糖醇；pH值为7.9。
本发明第二个方面，提供一种检测多核苷酸激酶的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)将探针A、探针S和1×的NEBuffer 2混合后在95℃下孵育5分钟，而后缓慢冷却30分钟以上至室温，得反应体系I；
(2)向上述反应体系I中加入三磷酸腺苷、λ核酸外切酶以及待测PNK样品于37℃孵育15～30分钟后，在70～80℃水浴中加热5～15分钟，缓慢冷却至室温，得反应体系II；
(3)将上述反应体系II置于冰上，加入模板DNA、10×NEBuffer 2混合均匀后加入混合液A，混合均匀后立即将混合液置于实时荧光定量系统中进行荧光监测。
在本发明优选的技术方案中，反应体系I中探针A、探针S浓度均为100纳摩尔每升；
在本发明优选的技术方案中，所述反应体系II中所用λ核酸外切酶浓度为5000单位每毫升，三磷酸腺苷浓度为10毫摩尔每升。
本发明试剂盒检测原理为：当体系中没有靶分子PNK存在时，探针S与探针A通过沃森-克里克碱基互补配对原则杂交形成部分互补的双链结构，这个结构可以“封锁”住探针A的3’末端，使其无法引发任何扩增反应，进而避免非特异性扩增反应的发生。反之，当靶分子PNK存在时，PNK催化探针S的5’羟基末端转变为5’磷酸末端；λ核酸外切酶是一种可以从双链DNA的5’磷酸末端高效地将单核苷酸切除的核酸外切酶，将其加入体系后，5’磷酸末端的探针S被消化，留下的单链探针A可自发形成带有5’突出末端的发夹型结构，在Klenow大片段DNA聚合酶和Nt.BbvCI切刻酶的辅助下，其3’末端序列可作为引物启动第一级链置换反应(SDA1)。随着链置换反应的进行，会产生大量的触发序列；指数扩增反应的模板DNA包含两段完全相同的、与触发序列互补的序列，以及夹在这两段序列中间的Nt.BbvCI切刻酶识别序列；第一级链置换反应产生的触发序列可与此模板DNA杂交形成双链结构并在DNA聚合酶和切刻酶的作用下启动第二级链置换反应(SDA2)，产生大量新的触发序列，进而再与新的DNA模板结合以启动新一轮的SDA2，最终实现指数扩增。通过这种两级恒温扩增反应快速生成了大量的双链DNA，通过使用双链DNA荧光染料SYBR Green I可以实现对扩增信号的实时监测。
本发明第三个方面，提供一种检测多核苷酸激酶的试剂盒在PNK活性抑制性检测中的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1一种检测多核苷酸激酶的试剂盒
所述检测多核苷酸激酶的试剂盒，包括以下成分：探针A，探针S，混合液A，模板DNA，λ核酸外切酶，多核苷酸激酶标准品，1×NEBuffer和10mM三磷酸腺苷。
所述混合液A包括：0.05毫克每毫升的牛血清白蛋白、0.1单位每微升的Nt.BbvCI切刻酶、0.05单位每微升的KF聚合酶、200微摩尔每升的三磷酸脱氧核苷酸以及10×的SYBRgreen I染料。
所述探针A的核苷酸序列为5’-GCA CAA AGG ACT GAG GCT GAG GGT TGC GCA TCTGCT ATG AAA CAA GCC AGA TGC TCA AC-3’，如SEQ ID NO.1所示，其5’末端作磷酸化修饰；探针S的核苷酸序列为5’-GTT GAG CAT CTG GCT TGT TTC ATA GCA GAT GTT TTT T-3’，如SEQ ID NO.2所示，其5’末端作磷酸化修饰。
所述模板DNA核苷酸序列为5’-GCA CAA AGG ACT GAG GCT GAG GGC ACA AAG GACTGA G-3’，如SEQ ID NO.3所示，其3’末端为磷酸基末端。
所述1×NEBuffer包括以下成分及其浓度：10毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸Tris-HCl、50毫摩尔每升的氯化钠、50毫摩尔每升的氯化镁以及1毫摩尔每升的二硫苏糖醇；pH值为7.9。
实施例2一种检测多核苷酸激酶的试剂盒
所述检测多核苷酸激酶的试剂盒，包括以下成分：探针A，探针S，混合液A，模板DNA，λ核酸外切酶，多核苷酸激酶标准品，1×NEBuffer和10mM三磷酸腺苷。
所述混合液A包括：0.15毫克每毫升的牛血清白蛋白、0.3单位每微升的Nt.BbvCI切刻酶、0.15单位每微升的KF聚合酶、300微摩尔每升的三磷酸脱氧核苷酸以及10×的SYBRgreen I染料。
所述混合液A包括：0.1毫克每毫升的牛血清白蛋白、0.2单位每微升的Nt.BbvCI切刻酶、0.1单位每微升的KF聚合酶、250微摩尔每升的三磷酸脱氧核苷酸以及10×的SYBRgreen I染料。
所述探针A、探针S及模板DNA的核苷酸序列同实施例1类似。
所述1×NEBuffer所含成分及浓度与实施例1类似。
实施例3一种检测多核苷酸激酶的试剂盒
所述检测多核苷酸激酶的试剂盒，包括以下成分：探针A，探针S，混合液A，模板DNA，λ核酸外切酶，多核苷酸激酶标准品，1×NEBuffer和10mM三磷酸腺苷。
所述混合液A包括：0.1毫克每毫升的牛血清白蛋白、0.2单位每微升的Nt.BbvCI切刻酶、0.1单位每微升的KF聚合酶、250微摩尔每升的三磷酸脱氧核苷酸以及10×的SYBRgreen I染料。
所述探针A、探针S及模板DNA的核苷酸序列同实施例1类似。
所述1×NEBuffer所含成分及浓度与实施例1类似。
实施例4一种检测多核苷酸激酶的试剂盒的检测方法
所述试剂盒的检测方法分为以下步骤：
(1)将18.6微升含有浓度均为100纳摩尔每升的探针A、探针S和1×的NEBuffer 2的反应体系在95℃下孵育5分钟，而后缓慢冷却30分钟以上至室温，得反应体系I；
(2)向上述反应体系I中加入0.2微升浓度为10毫摩尔每升的三磷酸腺苷、1微升浓度为5000单位每毫升的λ核酸外切酶以及待测PNK样品，于37℃孵育20分钟后，在75℃水浴中加热10分钟，再缓慢冷却至室温得；
(3)将反应体系II置于冰上，加入50纳摩尔每升的指数扩增反应模板DNA、2微升的10×NEBuffer 2，混合均匀后然后加入混合液A，混匀后立即将混合液置于37℃的实时荧光定量系统中进行荧光监测，每隔30秒读取一次荧光强度。
试验例1本发明试剂盒检测可行性验证
首先利用12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了PNK催化磷酸化反应所触发的λ外切酶消化的产物。如图2A所示，当探针S和探针A共存时，它们通过高温退火形成部分双链结构，因此它们各自单独存在的条带(探针S-泳道1，探针A-泳道2)消失而出现一条新的杂交双链条带(泳道3)；当分别加入λ核酸外切酶(泳道4)或PNK(泳道5)时，不会发生消化反应，因此这条杂交双链的条带未发生任何变化；当同时加入λ核酸外切酶和PNK时，杂交双链的条带消失、探针A的条带重新出现(泳道6)，这说明PNK催化的磷酸化反应触发了λ外切酶消化反应，消化了探针S。我们进一步通过实时荧光定量装置监测了磷酸化反应触发的两级恒温指数扩增反应，结果如图2B所示，当λ核酸外切酶和PNK同时存在时，实时荧光强度呈现出S型的快速增长，这说明了PNK触发的两级恒温指数扩增反应的发生；当没有PNK和λ核酸外切酶或二者只存在其一时，没有显著的荧光信号产生，说明PNK和λ核酸外切酶对于启动两级恒温指数扩增反应都是必须的。由此可见，本发明试剂盒切实可行，可用于PNK的相关测定。
试验例2本发明试剂盒检测灵敏度检验
为了评估本发明试剂盒检测PNK活性的灵敏度，以POI值作为定量的依据(POI值是指实时定量荧光曲线最大斜率处所对应的时间值)，利用实施例3试剂盒案实施例4检测方法对不同浓度的PNK进行了实时定量分析。从图3A和3B都可以看出，不同浓度的PNK所对应的POI值也不相同，随着浓度的升高，POI值顺次减小；同时，以POI值对PNK浓度的对数作图(图3B插图)，在0.001单位每毫升到1单位每毫升的浓度范围内显示出了良好的线性关系，经过计算可以得出检出限为0.0002单位每毫升，高出以往基于生物发光检测、比色检测和荧光检测等技术的方法20-300倍，这足以说明本发明试剂盒的检测灵敏度之高。
试验例3本发明试剂盒检测特异性实验检验
本发明试剂盒检测的特异性主要取决于探针S的5’末端被磷酸化进而可被λ核酸外切酶消化的过程。为了评估本发明试剂盒检测PNK的特异性，使用DNA限制性内切酶HhaI，DNA甲基转移酶Dam，DNA糖基化酶UDG(尿嘧啶DNA糖基化酶)、TDG(胸腺嘧啶DNA)和hOGG1(8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶)等5种不同的生物酶作为PNK检测中潜在的干扰酶进行了特异性实验。理论上，这些酶都无法引发磷酸化反应，因此没有扩增反应发生。从而以ΔPOI值(在相同条件下，有生物酶的实验组和无生物酶的对照组POI值的差值为ΔPOI值)作为评估的依据。实验结果如图4所示，PNK的ΔPOI值比HhaI酶、Dam酶、UDG酶、TDG酶以及hOGG1酶的ΔPOI值分别高出33.2倍、67.8倍、20.6倍、10.2倍、62.4倍。因此本发明试剂盒具有很高的特异性，可以应用于复杂样品的检测。
试验例4本发明试剂盒在PNK活性抑制性检测中的应用
为了评估本发明试剂盒在检测PNK活性抑制检测中的应用，使用二磷酸腺苷(ADP)、硫酸铵[(NH4)2SO4)]和磷酸氢二钠(Na2HPO4)三种PNK抑制剂作为研究模型进行了相关实验，这三种物质都不会抑制λ核酸外切酶的活性。由如图5A可知，随着二磷酸腺苷的浓度从0逐渐增加到25纳摩尔每升，PNK的相对活性逐渐降低，经计算，IC50(使PNK的活性降低50％时的抑制剂浓度)为0.9毫摩尔每升，与其他方法所得二磷酸腺苷的IC50结果一致；硫酸铵和磷酸氢二钠的抑制效果与此类似，结果参见图5B和图5C，其IC50分别为10.2毫摩尔每升和20.4毫摩尔每升，与其他方法所得的IC50相符。因此本发明试剂盒可用于PNK活性抑制实验的检测，有望用于PNK活性抑制药物作用效果的监测。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 一种检测多核苷酸激酶的试剂盒及其检测方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcacaaagga ctgaggctga gggttgcgca tctgctatga aacaagccag atgctcaac 59
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gttgagcatc tggcttgttt catagcagat gtttttt 37
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcacaaagga ctgaggctga gggcacaaag gactgag 37

Claims (2)

1.一种检测多核苷酸激酶的试剂盒，其特征在于，包括以下成分：探针A，探针S，混合液A ，模板DNA，λ核酸外切酶，多核苷酸激酶标准品， 1×NEBuffer和10mM三磷酸腺苷；混合液A包括：0.1毫克每毫升的牛血清白蛋白、0.2单位每微升的Nt.BbvCI切刻酶、0.1单位每微升的KF聚合酶、250微摩尔每升的三磷酸脱氧核苷酸以及10×的SYBR green I染料；
所述探针A的核苷酸序列为5’-GCA CAA AGG ACT GAG GCT GAG GGT TGC GCA TCT GCTATG AAA CAA GCC AGA TGC TCA AC-3’，如SEQ ID NO.1所示，其5’末端作磷酸化修饰；探针S的核苷酸序列为5’-GTT GAG CAT CTG GCT TGT TTC ATA GCA GAT GTT TTT T-3’，如SEQID NO.2所示，其5’末端为羟基末端；
所述模板DNA核苷酸序列为5’-GCA CAA AGG ACT GAG GCT GAG GGC ACA AAG GAC TGAG-3’，如SEQ ID NO.3所示，其3’末端为磷酸基末端。
2.根据权利要求1所述检测多核苷酸激酶的试剂盒，其特征在于，所述1×NEBuffer包括以下成分及其浓度：10毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸Tris-HCl、50毫摩尔每升的氯化钠、50毫摩尔每升的氯化镁以及1毫摩尔每升的二硫苏糖醇；pH值为7.9。
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