CN109161579B - 基于连接酶的恒温扩增法及其在多核苷酸激酶检测中的应用 - Google Patents

基于连接酶的恒温扩增法及其在多核苷酸激酶检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种基于连接酶的恒温扩增法及其在多核苷酸激酶检测中的应用，靶标多核苷酸激酶(PNK)存在时，供体RNA与受体RNA连接以形成完整的RNA触发链，RNA触发链诱导有效的双链特异性核酸酶介导的Taqman探针切割释放荧光基团产生明显的荧光信号。该方法表现出较高的选择性和灵敏度，检测限低至0.000005U/mL，即使在单细胞水平也能检测到内源性多核苷酸激酶(PNK)活性。此外，本方法可以进一步用于多核苷酸激酶(PNK)抑制剂的筛选以及复杂生物样品的精确测定。

Description

基于连接酶的恒温扩增法及其在多核苷酸激酶检测中的应用
技术领域
本公开属于生物分析技术领域，具体涉及一种基于连接酶的恒温扩增法及其在多核苷酸激酶检测中的应用。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
多核苷酸激酶(PNK)是一种DNA/RNA末端加工酶，催化磷酸基团从腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)转移到DNA/RNA核苷酸的5'羟基末端以产生5'磷酸末端。多核苷酸激酶(PNK)是参与碱基切除修复(BER)和非同源末端修复途径(NHEJ)的主要修复酶。多核苷酸激酶(PNK)活性失调可能干扰细胞修复系统的稳定性并导致一系列疾病，包括神经退行性疾病，脊髓小脑性共济失调和癌症。因此，多核苷酸激酶(PNK)现在被认为是癌症治疗的潜在靶点，开发灵敏检测多核苷酸激酶(PNK)的方法具有重要意义。
传统的多核苷酸激酶(PNK)检测方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳法和同位素标记法，然而，这些方法操作过程繁琐、耗时长而且存在放射性污染，这大大限制了它们的广泛应用。最近，以荧光检测，化学发光和电化学检测为基础的各种多核苷酸激酶(PNK)分析方法已经被开发出来，并且这些方法大多数都基于λ核酸外切酶(λexo)的辅助切割。然而，λ核酸外切酶(λexo)可能非特异性切割没有多核苷酸激酶(PNK)的样品中的非磷酸化探针，导致目标信号不正确地转移至输出信号，从而导致假阳性结果,具有选择性、特异性差的缺点，对于靶标多核苷酸激酶(PNK)不能准确定量检测。
发明内容
针对以上背景技术，本发明人认为基于连接酶的扩增法更适合于灵敏精确的检测多核苷酸激酶(PNK)，因为连接反应只能在由多核苷酸激酶(PNK)催化的5'磷酸化产物存在下发生。这种新型的基于连接酶的多核苷酸激酶(PNK)检测方法具有选择性高，灵敏度高，操作简单,检测限低等优点。同时，通过改变RNA链和Taqman探针的序列，该测定方法将很容易扩展用于检测其他生物分子，可能为生物分析的广泛领域提供有前景的工具。
本公开具体采用以下技术方案：
在本公开的第一个典型的实施方式中，提供一种基于连接酶的恒温扩增法检测多核苷酸激酶的方法，该方法包括：
靶标多核苷酸激酶(PNK)存在时，供体RNA与受体RNA连接以形成完整的RNA触发链，RNA触发链诱导有效的双链特异性核酸酶介导的Taqman探针切割释放荧光基团产生明显的荧光信号。
在本公开的第二个典型的实施方式中，提供一种用于筛选或鉴定多核苷酸激酶抑制剂的方法，该方法包括：
靶标多核苷酸激酶(PNK)存在时，供体RNA与受体RNA连接以形成完整的RNA触发链，RNA触发链诱导有效的双链特异性核酸酶介导的Taqman探针切割释放荧光基团产生明显的荧光信号。
本公开还包括采用上述方法筛选或鉴定的多核苷酸激酶抑制剂。
在本公开的第三个典型的实施方式中，提供一种基于连接酶的恒温扩增法检测多核苷酸激酶的试剂盒，至少包括以下成分：供体RNA、受体RNA、Taqman探针、双链特异性核酸酶(DSN)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)和RNA连接酶；
其中，受体RNA与Taqman探针的3’端互补，供体RNA与Taqman探针的5’端互补，受体RNA与供体RNA连接后完整的RNA与Taqman探针完全互补。
本公开还保护上述试剂盒在检测多核苷酸激酶或者在多核苷酸激酶活性抑制性检测中的应用。
与本发明人知晓的相关技术相比，本公开其中的一个技术方案具有如下有益效果：
(1)本公开是一种新型的基于连接酶的扩增方法，能够灵敏、高效的检测多核苷酸激酶(PNK)的活性并筛选其抑制剂。本方案使用一种猝灭/荧光基团双标记DNA检测探针Taqman探针(Taqman probe)。当靶标多核苷酸激酶(PNK)存在时，催化5'羟化的供体RNA磷酸化，产生5'磷酸化的供体RNA，其可以与3'羟化受体RNA连接完整的RNA触发链，RNA触发链可以诱导双链特异性核酸酶(DSN)介导的Taqman探针(Taqman probe)切割释放荧光基团以产生明显的荧光信号。相反，当不存在多核苷酸激酶(PNK)时，5'羟化供体RNA不能与3'羟化受体RNA连接，不能切割DNA Taqman探针(Taqman probe)释放荧光基团，因此不能检测到荧光信号，通过荧光信号的强弱从而实现对多核苷酸激酶(PNK)活性的定量检测。该方法表现出较高的选择性和灵敏度，检测限低至0.000005U/mL，即使在单细胞水平也能检测到内源性多核苷酸激酶(PNK)活性。此外，本方法可以进一步用于多核苷酸激酶(PNK)抑制剂的筛选以及复杂生物样品的精确测定。
(2)原理简明，操作简单且耗时短：本技术方案整个过程仅需一种荧光/猝灭基团双标记检测探针并且以双链特异性核酸酶(DSN)作为荧光信号放大的工具酶,与传统的方法相比，大大降低了探针设计的复杂度以及设计成本，而且无需昂贵复杂的热循环程序来放大目标信号，分析时间短，提高了检测的简便性。
(3)灵敏度高、特异性好：本技术方案是基于连接酶的新型扩增法，连接反应只能在由多核苷酸激酶(PNK)催化的5'磷酸化产物存在下发生，且通过双链特异性核酸酶(DSN)诱导荧光信号放大提高信噪比，与基于λ核酸外切酶(λexo)辅助切割的荧光检测，化学发光和电化学检测方法相比，本技术方案具有更高的灵敏度与特异性。
(4)本公开是以双链特异性核酸酶(DSN)作为信号放大的工具酶，无需昂贵复杂的热循环程序来放大目标信号，同时通过简单地监测由Taqman探针切割产生的荧光信号可以灵敏地检测靶标多核苷酸激酶(PNK)，避免了在其他基于连接酶的扩增方法中产品分离的繁琐步骤。
附图说明
构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1：基于连接酶的等温扩增法检测多核苷酸激酶的原理说明。
图2：(A)不存在任何酶(曲线1，黑线)，单独存在多核苷酸激酶(PNK)(曲线2，棕线)，单独存在RNA连接酶2(Rnl2)(曲线4，绿线)，单独存在双链特异性核酸酶(DSN)(曲线4，蓝线)，存在多核苷酸激酶(PNK)和RNA连接酶2(Rnl2)(曲线5，青线)，存在多核苷酸激酶(PNK)和双链特异性核酸酶(DSN)(曲线6，粉红线)，存在RNA连接酶2(Rnl2)和双链特异性核酸酶(DSN)(曲线7，黄线)，存在多核苷酸激酶(PNK)、RNA连接酶2(Rnl2)和双链特异性核酸酶(DSN)(曲线8，红线)时的荧光发射光谱。(B)反应产物的非降解聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析。泳道M：20bp DNA Ladder；泳道1：不含任何酶；泳道2：单独存在多核苷酸激酶(PNK)时的产物表征；泳道3：单独存在RNA连接酶2(Rnl2)时的产物表征；泳道4：单独存在双链特异性核酸酶(DSN)时的产物表征；泳道5：存在多核苷酸激酶(PNK)和RNA连接酶2(Rnl2)时的产物表征；泳道6：存在多核苷酸激酶(PNK)和双链特异性核酸酶(DSN)时的产物表征；泳道7：存在RNA连接酶2(Rnl2)和双链特异性核酸酶(DSN)时的产物表征；泳道8：存在RNA连接酶2(Rnl2)和双链特异性核酸酶(DSN)时的产物表征。泳道M用SYBR Gold染料染色，其他泳道直接激发。多核苷酸激酶(PNK)，RNA连接酶2(Rnl2)和双链特异性核酸酶(DSN)的浓度分别为30个单位每毫升，30个单位每毫升和3个单位每毫升。
注：曲线1～7在图中并未完全分离开。
图3：(A)从0(对照)到50个单位每毫升不同浓度多核苷酸激酶(PNK)的荧光发射光谱。(B)荧光强度随多核苷酸激酶(PNK)浓度的变化。插图显示荧光强度与多核苷酸激酶(PNK)浓度对数之间的线性关系。误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。
图4：溶血性嗜血杆菌甲基转移酶(HhaIMtase)(黄色柱)、甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(Fpg)、CpG甲基转移酶(M.SssIMTase)(蓝色柱)、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)(青色柱)、牛血清白蛋白(BSA)(粉红色柱)和多核苷酸激酶(PNK)(红柱)存在时的荧光强度，不用任何酶处理的样品作为对照(对照、黑色柱)。酶浓度均为30个单位每毫升，牛血清白蛋白(BSA)浓度为10纳摩尔每升。误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。
图5：不同浓度硫酸铵(A)和磷酸氢二钠(B)对多核苷酸激酶(PNK)相对活性的影响。误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。
注：由于专利提供的图片是黑白颜色，所以彩色并未显示。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
多核苷酸激酶(PNK)表达和活性异常与癌症的发生密切相关,高效和灵敏的检测多核苷酸激酶(PNK)活性对于多核苷酸激酶(PNK)相关生物医学研究和疾病诊断具有重要意义。但是，现存的多核苷酸激酶(PNK)检测方法具有程序繁琐，检测时间长，存在高风险放射性污染以及非特异性切割扩增等显著的缺点。因此，为了克服以上不足，本公开旨在开发一种简单快速、高灵敏度、高特异性的多核苷酸激酶(PNK)检测方法。
本技术方案开发了一种基于连接酶触发的双链特异性核酸酶(DSN)介导的循环切割方法对多核苷酸激酶(PNK)进行灵敏检测，与大多数的基于连接酶的扩增方法不同的是，本技术方案以双链特异性核酸酶(DSN)作为信号放大的工具酶，无需昂贵复杂的热循环程序来放大目标信号。同时我们设计了一种猝灭/荧光基团双标记DNA检测探针Taqman探针，作为连接反应的模板以及信号输出的探针，以实现多核苷酸激酶(PNK)的信号检测,这也大大降低了设计复杂度。该方法涉及靶标多核苷酸激酶(PNK)将供体RNA(11nt)磷酸化，随后磷酸化产物发生连接反应并与Taqman探针互补形成DNA/RNA杂交体，在双链特异性核酸酶(DSN)作用下切割Taqman探针释放荧光信号。由于双链特异性核酸酶(DSN)的独特性质，供体RNA(11nt)或受体RNA(11nt)都不能诱导双链特异性核酸酶(DSN)对Taqman探针(22nt)的切割，因为它只能切割至少15bp的DNA/RNA杂交体中的DNA链，所以当无多核苷酸激酶(PNK)存在时，无法产生荧光信号。本技术方案避免了繁琐的操作过程，具有很高的简便性、特异性和灵敏度，并可进一步应用于复杂生物样品中的靶标抑制剂的筛选和准确检测。
在本公开的一个典型的实施方式中，该方法包括：
靶标多核苷酸激酶(PNK)存在时，供体RNA与受体RNA连接以形成完整的RNA触发链，RNA触发链诱导有效的双链特异性核酸酶介导的Taqman探针切割释放荧光基团产生明显的荧光信号。
具体的，靶标多核苷酸激酶(PNK)存在时，催化5'羟化的供体RNA的磷酸化以产生5'磷酸化的供体RNA，其可以与3'羟化受体RNA连接以形成完整的RNA触发链；RNA触发链与Taqman探针完全互补，形成RNA触发剂/Taqman探针双链体杂交体，Taqman探针被双链特异性核酸酶(DSN)特异性割，Taqman探针两端的荧光基团与淬灭基团分离并产生荧光信号,释放的RNA触发链可结合新的Taqman探针，开始新一轮切割，循环放大信号；当不存在多核苷酸激酶(PNK)时，5'羟化供体RNA不能与3'羟化受体RNA连接，不能切割DNA Taqman探针(Taqman probe)释放荧光基团，因此不能检测到荧光信号。
在本公开的一个或一些具体实施方式中，该方法包括：
(1)将水、双链特异性核酸酶(DSN)缓冲液、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、供体RNA和多核苷酸激酶混合均匀进行磷酸化反应，灭活；
(2)灭活后，加入Taqman探针、受体RNA和RNA连接酶进行连接反应；
(3)连接反应结束后，加入双链特异性核酸酶(DSN)进行特异性切割反应，反应结束后，测定荧光光谱。
其中，双链特异性核酸酶(DSN)缓冲液的组成为：50毫摩尔每升的pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，5毫摩尔每升的氯化镁和1毫摩尔每升的二硫苏糖醇(DTT)。
进一步的，磷酸化反应的条件为：35～40℃反应10～60分钟。
进一步的，连接反应的条件为：35～40℃反应40～90分钟。
进一步的，特异性切割反应条件为：50～60℃反应10～60分钟。
在本公开的一个或一些具体实施方式中，该方法包括：
1)制作标准曲线：
将水、双链特异性核酸酶(DSN)缓冲液、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)和供体RNA混合，再分别加入不同质量的多核苷酸激酶，混合均匀进行磷酸化反应，灭活；
灭活后，加入Taqman探针、受体RNA和RNA连接酶进行连接反应；
连接反应结束后，加入双链特异性核酸酶(DSN)进行特异性切割反应，反应结束后，测定荧光光谱，得到不同浓度的多核苷酸激酶样品对应的荧光光谱图；
根据不同浓度的多核苷酸激酶样品荧光光谱图在520nm发射波长处的荧光强度绘制标准曲线；
2)取待检测样品，按照步骤1)中的方法进行荧光检测，根据标准曲线得到待检测样品中多核苷酸激酶的浓度。
在本公开的一个具体实施方式中，所述受体RNA为5’-UAACACUGUCU-3’，所述供体RNA为5’-GGUAAAGAUGG-3’，Taqman探针为5’-荧光基团-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-淬灭基团-3’。但并不仅仅限于以上序列，只要满足以下条件即可：受体RNA与Taqman探针的3’端互补，供体RNA与Taqman探针的5’端互补，受体RNA与供体RNA连接后完整的RNA与Taqman探针完全互补。
Taqman探针(Taqman probe)是一种猝灭/荧光基团双标记DNA检测探针。
进一步的，Taqman探针的5'末端用羧基荧光素(FAM，F)修饰，3'末端用[[2-氯-4-硝基-苯基]-偶氮基]-苯胺(Eclipse,Q)猝灭基团修饰，FAM和Eclipse之间的荧光共振能量转移(FRET)的FAM发射光被Eclipse猝灭。
在本公开的一个典型的实施方式中，提供一种用于筛选或鉴定多核苷酸激酶抑制剂的方法，该方法包括：
靶标多核苷酸激酶(PNK)存在时，供体RNA与受体RNA连接以形成完整的RNA触发链，RNA触发链诱导有效的双链特异性核酸酶介导的Taqman探针切割释放荧光基团产生明显的荧光信号。
本技术方案中，使用基于连接酶的扩增法对多核苷酸激酶(PNK)进行检测，由于连接反应只能在由多核苷酸激酶(PNK)催化的5'磷酸化产物存在下发生，因此可避免假阳性结果，此方法具有较高的特异性。双链特异性核酸酶(DSN)作为工具酶诱导荧光信号放大，这大大提高了方法的灵敏度简化了操作过程。
在本公开的又一个典型的实施方式中，还提供采用上述方法筛选或鉴定的多核苷酸激酶抑制剂。
在本公开的再一个典型的实施方式中，提供一种基于连接酶的恒温扩增法检测多核苷酸激酶的试剂盒，至少包括供体RNA、受体RNA、Taqman探针和双链特异性核酸酶；
其中，受体RNA与Taqman探针的3’端互补，供体RNA与Taqman探针的5’端互补，受体RNA与供体RNA连接后完整的RNA与Taqman探针完全互补。
进一步的，还包括1×双链特异性核酸酶(DSN)缓冲液、焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水。
在本公开的另一个典型的实施方式中，还提供上述试剂盒在检测多核苷酸激酶或者在多核苷酸激酶活性抑制性检测中的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
以下实施例中，受体RNA为5’-UAACACUGUCU-3’，供体RNA为5’-GGUAAAGAUGG-3’，Taqman探针为5’-FAM-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-Eclipse-3’。
实施例1
实验原理(如图1)：
本公开技术方案设计了两条短RNA链(11nt)，供体RNA和受体RNA以及一条DNATaqman探针链(22nt)。Taqman探针在5'末端用FAM(F)荧光基团修饰，在3'末端用Eclipse(Q)的猝灭基团修饰，其中FAM的荧光由于荧光共振能量转移(FRET)效应而被Eclipse猝灭。供体RNA的5'末端用羟基修饰可用于感测多核苷酸激酶(PNK)的存在。在缺乏多核苷酸激酶(PNK)的情况下，由于供体RNA中缺乏5'-磷酸基团，因此供体和受体RNA不能连接，但它们仍然可以结合Taqman探针以形成供体RNA/受体RNA/Taqman探针三明治型的杂交体，由于双链特异性核酸酶(DSN)只能切割15bp以上的DNA/RNA杂交体中的DNA链，而三明治杂交体中RNA链的长度短于15nt，因此Taman探针不能被切割，也不能检测到荧光信号。在靶标多核苷酸激酶(PNK)存在的情况下，它通过将磷酸酯部分从腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的γ位置转移至其5'-羟基末端(5'OH)以不断地催化5'羟基化供体RNA的磷酸化以产生5'-磷酰基末端(5'P)。随后，5'磷酸化供体RNA和3'羟化受体RNA通过RNA连接酶2(Rnl2)连接以形成完整的RNA触发链。RNA触发链与Taqman探针完全互补，通过碱基配对形成RNA触发链/Taqman探针双链杂交体，RNA触发剂/Taqman探针双螺旋杂交体中的Taqman探针被双链特异性核酸酶(DSN)切割，FAM与Eclipse分离产生荧光信号，伴随着游离RNA触发剂的释放，其可以进一步结合新的Taqman探针以引发下一轮切割反应。因此，通过简单地监测由Taqman探针循环切割产生的荧光信号，可以均匀且灵敏地检测靶标多核苷酸激酶(PNK)。
1、原理的实验验证
为了证明所提出的检测方法的可行性，本公开分别在存在和不存在靶标多核苷酸激酶(PNK)、RNA连接酶2(Rnl2)和双链特异性核酸酶(DSN)时进行荧光检测。如图2A所示，当多核苷酸激酶(PNK)，RNA连接酶2(Rnl2)和双链特异性核酸酶(DSN)共存时，产生显著增强的荧光信号(图2A，曲线8)，其比不存在多核苷酸激酶(PNK)时的荧光高3.92倍(图2A，曲线7)，由此说明多核苷酸激酶(PNK)在RNA连接酶2(Rnl2)和双链特异性核酸酶(DSN)的辅助下可以有效引起信号放大。此外，在缺乏三种酶中的一种或两种(图2A，曲线2-6)时与没有任何酶的对照组相比(图2A，曲线1)，没有观察到明显的荧光信号，由此证明多核苷酸激酶(PNK)催化的磷酸化，RNA连接酶2(Rnl2)催化的连接反应和双链特异性核酸酶(DSN)催化的切割反应都是信号产生所必需的，缺一不可。
通过12(w/w)％非降解性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析对结果进一步证实。在不同条件下处理样品，通过直接激发FAM分析反应产物。如图2B所示，当靶标多核苷酸激酶(PNK)，RNA连接酶2(Rnl2)和双链特异性核酸酶(DSN)共同存在时(图2B，泳道8)，可以观察到明显的荧光条带，表明靶标多核苷酸激酶(PNK)诱导Taqman探针切割并且FAM荧光恢复。相反，在不存在三种酶中的一种或两种时，没有观察到显著的条带(图2B，泳道1-7)，表明缺少多核苷酸激酶(PNK)，RNA连接酶2(Rnl2)和双链特异性核酸酶(DSN)中的任何一种切割反应都不能发生，Taqman探针保持完整并且FAM的荧光猝灭。综上所述，本技术方案完全可行。
2、灵敏度检测
为了测定本技术方案检测多核苷酸激酶(PNK)的灵敏度，在最佳实验条件下检测了一系列不同浓度的多核苷酸激酶(PNK)稀释液。如图3A所示，随着多核苷酸激酶(PNK)浓度从0(对照)升至50U/mL，荧光信号逐渐升高。图3B显示了520nm处的FAM荧光强度与多核苷酸激酶(PNK)浓度之间的校准曲线。在对数刻度上，荧光强度与0.00001U/mL至1U/mL的多核苷酸激酶(PNK)浓度范围内呈线性相关，相关系数(R2)为0.994。校准方程为F＝1656.89+165.82log10C，其中F是荧光强度，C是多核苷酸激酶(PNK)浓度(U/mL)。根据3σ/K规则，计算出检测限为0.000005U/mL，其中σ代表对照样品的标准偏差，K代表线性回归曲线的斜率。值得注意的是，所提出的检测方法的灵敏度明显优于大多数其他基于连接酶的多核苷酸激酶(PNK)测定。例如，它比生物发光检测法(0.004U/mL)高800倍，比分子信标荧光检测法(0.002U/mL)高400倍，比基于石墨烯氧化物的荧光恢复测定法(0.001U/mL)高出400倍。该检测方法的超高灵敏度可归因于通过特异性RNA连接酶2(Rnl2)催化的连接反应和双链特异性核酸酶(DSN)切割活性的信号扩增对多核苷酸激酶(PNK)活性的有效信号转导。
3、特异性检测
为了研究所提出的检测方法在复杂生物基质中潜在应用的可行性，本公开进一步使用溶血性嗜血杆菌甲基转移酶(HhaIMTase)，甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(Fpg)，CpG甲基转移酶(M.SssIMTase)，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和牛血清白蛋白(BSA)作为负对照进行特异性实验。溶血性嗜血杆菌甲基转移酶(HhaIMTase)特异性切割含有5'-GCGC-3'序列的DNA链。甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(Fpg)从双链DNA中切除受损的嘌呤残基以产生嘌呤/无嘧啶位点。CpG甲基转移酶(M.SssIMTase)甲基化5'-CG-3'序列内的胞嘧啶残基。尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)从单链和双链DNA中释放尿嘧啶残基。牛血清白蛋白(BSA)是一种常用的无关蛋白。理论上，这些干扰样品都不能诱导供体RNA的磷酸化。由于RNA连接酶2(Rnl2)是高保真酶，其只能催化5'磷酸化供体RNA存在下的连接反应，因此不发生连接反应和随后的切割反应，因此不能检测到FAM信号。如图4所示，与未加入任何酶处理的对照组(Control)中的低背景信号相比，加入了30U/mL靶标多核苷酸激酶(PNK)的荧光信号明显增高。当溶血性嗜血杆菌甲基转移酶(HhaIMTase)，甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(Fpg)，CpG甲基转移酶(M.SssIMTase)，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)，牛血清白蛋白(BSA)存在时没有观察到明显的荧光信号变化，证明了所提出的用于多核苷酸激酶(PNK)检测方法的高特异性和准确性。
4、多核苷酸激酶(PNK)的抑制剂分析
多核苷酸激酶(PNK)是疾病治疗的潜在靶标，多核苷酸激酶(PNK)活性的药物抑制已被认为是化疗和放射治疗癌症的一种有前途的方法。为了研究所提议的多核苷酸激酶(PNK)抑制实验的可行性，对两种典型的多核苷酸激酶(PNK)抑制剂硫酸铵和磷酸氢二钠进行了试验，两种方法均能通过盐诱导多核苷酸激酶(PNK)蛋白构象的改变而有效抑制多核苷酸激酶(PNK)活性。多核苷酸激酶(PNK)的相对活性(RA)按下式计算：
Figure BDA0001801982000000091
其中F0是不存在多核苷酸激酶(PNK)时的荧光强度，Ft是存在多核苷酸激酶(PNK)时的荧光强度，Fi是存在多核苷酸激酶(PNK)抑制剂时的荧光强度。如图5A所示，多核苷酸激酶(PNK)的相对活性随着硫酸铵浓度从0增加到25毫摩尔每升而降低。硫酸铵的半抑制浓度(IC50)计算为7.43毫摩尔每升，与通过生物发光多核苷酸激酶(PNK)测定(9.88毫摩尔每升)获得的结果一致。同样，随着磷酸氢二钠浓度的增加，多核苷酸激酶(PNK)的相对活性也从0降低到50毫摩尔每升，其IC50值为13.42毫摩尔每升，与电化学多核苷酸激酶(PNK)分析法(16毫摩尔每升)的结果一致。这些结果表明，该方法可用于多核苷酸激酶(PNK)抑制试验，具有很大的开发潜力。
实施例2
多核苷酸激酶(PNK)的检测包括三个连续的步骤：
第一步，将含有焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水，1×双链特异性核酸酶(DSN)缓冲液(组成为：50毫摩尔每升的pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl),5毫摩尔每升的氯化镁和1毫摩尔每升的二硫苏糖醇(DTT))，0.2毫摩尔的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，100纳摩尔的供体RNA和多核苷酸激酶(PNK)的30μL反应混合物，在37℃反应30分钟以进行多核苷酸激酶(PNK)催化的磷酸化反应，随后在65℃下灭活20分钟。
第二步，加入250纳摩尔的Taqman探针，100纳摩尔的受体RNA和30个单位每毫升的RNA连接酶2(Rnl2)，并在37℃下反应60分钟以进行连接反应。
第三步，在上述反应混合物加入3个单位每毫升的双链特异性核酸酶(DSN)并在55℃下反应30分钟以进行特异性切割反应。用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水将反应产物(30微升)稀释至60微升以测量荧光光谱。
凝胶电泳分析：在靶标多核苷酸激酶(PNK)，RNA连接酶2(Rnl2)和双链特异性核酸酶(DSN)分别存在和不存在的条件下反应产物用12(w/w)％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
特异性和抑制剂分析：30个单位每毫升的溶血性嗜血杆菌甲基转移酶(HhaIMTase)，甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(Fpg)，CpG甲基转移酶(M.SssIMTase)，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和10纳摩尔每升牛血清白蛋白(BSA)用于探究该方法的特异性。对于多核苷酸激酶(PNK)抑制剂的测定，使用硫酸铵和磷酸氢二钠作为抑制剂模型。将不同浓度的抑制剂与多核苷酸激酶(PNK)混合并在磷酸化反应前孵育10分钟。以下操作程序与上述多核苷酸激酶(PNK)活性测定相同。
实际样品的分析：用核蛋白提取试剂盒对人宫颈癌细胞(HeLa)和肺癌细胞(A549)中的核蛋白进行提取，并且根据上述多核苷酸激酶(PNK)活性测定的方法来检测细胞提取液中多核苷酸激酶(PNK)活性。
上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种非疾病的诊断治疗目的的基于连接酶的恒温扩增法检测多核苷酸激酶的方法，其特征是，该方法包括：
靶标多核苷酸激酶(PNK)存在时，供体RNA与受体RNA连接以形成完整的RNA触发链，RNA触发链诱导有效的双链特异性核酸酶介导的Taqman探针切割释放荧光基团产生明显的荧光信号；所述受体RNA与Taqman探针的3’端互补，供体RNA与Taqman探针的5’端互补，受体RNA与供体RNA连接后完整的RNA与Taqman探针完全互补，所述供体RNA是5’端羟基化的，所述Taqman探针是一种猝灭/荧光基团双标记DNA检测探针；由于双链特异性核酸酶DSN只能切割至少15bp的DNA/RNA杂交体中的DNA链，所述供体RNA或受体RNA都不能诱导双链特异性核酸酶DNA对Taqman探针的切割。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是：具体的，靶标多核苷酸激酶(PNK)存在时，催化5'羟化的供体RNA的磷酸化以产生5'磷酸化的供体RNA，其可以与3'羟化受体RNA连接以形成完整的RNA触发链；RNA触发链与Taqman探针完全互补，形成RNA触发剂/Taqman探针双链体杂交体，Taqman探针被双链特异性核酸酶(DSN)特异性割，Taqman探针两端的荧光基团与淬灭基团分离并产生荧光信号,释放的RNA触发链可结合新的Taqman探针，开始新一轮切割，循环放大信号；当不存在多核苷酸激酶(PNK)时，5'羟化供体RNA不能与3'羟化受体RNA连接，不能切割DNA Taqman探针释放荧光基团，因此不能检测到荧光信号。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是，具体的包括以下步骤：
1)制作标准曲线：
将水、双链特异性核酸酶(DSN)缓冲液、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)和供体RNA混合，再分别加入不同质量的多核苷酸激酶，混合均匀进行磷酸化反应，灭活；
灭活后，加入Taqman探针、受体RNA和RNA连接酶进行连接反应；
连接反应结束后，加入双链特异性核酸酶(DSN)进行特异性切割反应，反应结束后，测定荧光光谱，得到不同浓度的多核苷酸激酶样品对应的荧光光谱图；
根据不同浓度的多核苷酸激酶样品荧光光谱图在520nm发射波长处的荧光强度绘制标准曲线；
2)取待检测样品，按照步骤1)中的方法进行荧光检测，根据标准曲线得到待检测样品中多核苷酸激酶的浓度。
4.如权利要求3所述的方法，其特征是，磷酸化反应的条件为：35～40℃反应10～60分钟。
5.如权利要求3所述的方法，其特征是，连接反应的条件为：35～40℃反应40～90分钟；
6.如权利要求3所述的方法，其特征是，特异性切割反应条件为：50～60℃反应10～60分钟。
7.一种基于连接酶的恒温扩增法检测多核苷酸激酶的试剂盒，其特征是，至少包括以下成分：供体RNA、受体RNA、Taqman探针和双链特异性核酸酶、RNA连接酶；靶标多核苷酸激酶(PNK)存在时，供体RNA与受体RNA连接以形成完整的RNA触发链，RNA触发链诱导有效的双链特异性核酸酶介导的Taqman探针切割释放荧光基团产生明显的荧光信号；所述受体RNA与Taqman探针的3’端互补，供体RNA与Taqman探针的5’端互补，受体RNA与供体RNA连接后完整的RNA与Taqman探针完全互补，所述供体RNA是5’端羟基化的，所述Taqman探针是一种猝灭/荧光基团双标记DNA检测探针；由于双链特异性核酸酶DSN只能切割至少15bp的DNA/RNA杂交体中的DNA链，所述供体RNA或受体RNA都不能诱导双链特异性核酸酶DNA对Taqman探针的切割。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征是：还包括1×双链特异性核酸酶(DSN)缓冲液和焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水。
9.权利要求7或8所述的试剂盒在检测多核苷酸激酶中的应用，所述应用非疾病诊断治疗目的。
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