CN108588178B - 一种检测碱性磷酸酶的试剂盒及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种去磷酸化引发的转录反应介导的双信号扩增灵敏地检测碱性磷酸酶的方法，设计了一个5'‑磷酸化的T7启动子单链，碱性磷酸酶能够催化5'‑磷酸化的T7启动子去磷酸化，保护T7启动子链不被λ核酸外切酶消化，剩余的T7启动子能够激活T7RNA聚合酶介导的转录反应，从而产生大量的RNA转录物。随后，这些RNA转录物与Taqman探针互补配对形成RNA‑DNA双链体，引入双链特异性核酸酶引发Taqman探针的循环切割，从而产生明显增强的荧光信号。该方法操作简便，具有高灵敏度和很高的特异性，可以应用于复杂生物样品中的靶标抑制剂的筛选以及宫颈癌细胞中靶标的定量检测。

Description

一种检测碱性磷酸酶的试剂盒及其方法
技术领域
本发明属于有机物检测技术领域，具体涉及一种检测碱性磷酸酶的试剂盒及其方法。
背景技术
碱性磷酸酶(ALP)是原核生物和真核生物细胞中普遍存在的一种水解酶，催化磷酸基团从含有磷酸酯的多磷酸底物上移除。在人类的身体中，碱性磷酸酶广泛存在于组织(例如骨，肾，肝等)中，在细胞信号转导、细胞分裂、分化、骨骼钙化等多种正常细胞功能中起着重要的作用。另一方面，碱性磷酸酶活性的下调与多种人类疾病密切相关，包括低磷酸酯酶症，原发性胆汁性肝硬化，糖尿病以及各种癌症等。因此，开发可靠的碱性磷酸酶活性的检测方法对于临床疾病的诊断和碱性磷酸酶在生理和病理过程中作用的研究是相当有价值的。
目前，已经建立了多种基于凝胶电泳，电化学，比色，表面增强拉曼散射和荧光的方法。然而，基于凝胶电泳的检测方法是非均质和半定量的，电化学分析涉及电极洗涤和制备的复杂步骤，表面增强拉曼散射需要复杂和昂贵的拉曼光谱仪，而比色分析的检测灵敏度很低。与上述方法相比，荧光分析法由于其具有操作简单，易于重复等明显优点，更常用于碱性磷酸酶的检测，并且已经报道了一系列基于不同纳米材料和化学探针的荧光碱性磷酸酶检测方法。然而它们也有明显的局限性。基于纳米材料的分析涉及功能纳米材料的繁琐制备步骤，如碳量子点，石墨烯量子点，聚合物纳米颗粒，银纳米簇和铜纳米粒子。而基于合成化学探针的测定需要高成本和复杂的小分子荧光探针的合成，包括双光子荧光探针，聚集诱导的发射(AIE)探针和四聚苝探针等。此外，这些方法往往容易受到其他无关生物分子的干扰，并且对其他类型的磷酸酶有非特异性反应。
在生物分析方法中，大多数碱性磷酸酶分析使用非核酸分子作为酶的底物，如肽，单磷酸鸟苷(GMP)，三磷酸腺苷(ATP)，对硝基苯基磷酸酯(PNPP)，焦磷酸酯(PPi)，5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯，这些底物均不能被基于DNA或RNA聚合酶的扩增反应进行扩增。然而，在一些检测方法中，DNA也被用作碱性磷酸酶检测的有效底物，但是都不涉及核酸扩增过程。值得注意的是，尽管DNA聚合酶被用于分子信标和基于发夹探针的碱性磷酸酶检测，但是它们仅催化简单的延伸反应以打开分子信标或发夹探针，仍不涉及核酸扩增反应，具有较低的检测灵敏度。因此，使用核酸扩增技术来改善碱性磷酸酶的检测性能是非常有必要的。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的第一个目的是提供一种去磷酸化引发的转录反应介导的双信号扩增灵敏地检测碱性磷酸酶的试剂盒。基于T7RNA聚合酶的转录扩增反应，以超高灵敏度来定量检测碱性磷酸酶活性的方法。基于T7RNA聚合酶的核酸扩增方法对T7启动子是特异性的，只有当特定的启动子序列(T7启动子)存在时才能够合成RNA，因此有效地排除了非特异性扩增的干扰并达到很高的特异性。
为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
一种检测碱性磷酸酶的试剂盒，包括与碱性磷酸酶反应的双链DNA底物、Taqman探针、引发Taqman探针的循环切割的双链特异性核酸酶(DSN)；所述双链DNA底物由5'-磷酸化的T7启动子单链和模板双链体结合得到。
所述磷酸化的T7启动子序列为5’-磷酸-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’；
所述模板序列为5’-TAA CAC TGT CTG GTA AAG ATG GCC CTA TAG TGA GTCGTATTA-3’；
所述Taqman探针序列：5’-FAM-TAA CAC TGT CTG GTA AAG ATG G-Eclipse-3’；所述Taqman探针在5'末端用FAM荧光标记，在其3'末端用Eclipse标记。
优选的，所述试剂盒还包括双链特异性核酸酶缓冲液，其组成为：50mmol/L的pH8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，5mmol/L的氯化镁，1mmol/L的二硫苏糖醇；
进一步优选的，Tris-HCl、氯化镁、二硫苏糖醇的体积比为48-52:3-6:0.6-1.4。
优选的，所述试剂盒还包括5'-磷酸化的T7启动子单链和模板双链体结合的三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA)缓冲液和退火缓冲液，所述退火缓冲液为5mmol/L的pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)和50mmol/L的氯化钠；
进一步优选的，退火缓冲液中Tris-HCl和氯化钠的体积比为0.3-0.7:3-7。
本发明的第二个目的是提供一种检测碱性磷酸酶的方法，使用以上所述试剂盒，具体步骤为：
1)5'-磷酸化的T7启动子的去磷酸化
将碱性磷酸酶和100nmol/L的双链DNA底物(T7启动子-模板双链体)，Cut Smart缓冲液混合，孵育后灭活得到混合溶液A；然后，将1单位的λ核酸外切酶(λexo)加入到以上混合溶液A中得到混合溶液B，混合溶液B进行先孵育，再进行后孵育将λexo灭活，得到混合溶液C；
2)转录反应
取一定体积D的步骤1)中得到的混合溶液C，其中含有一定量的λexo消化产物，在RNA生产系统中反应，得到转录产物溶液E；
3)互补配对
取一定体积F的步骤2)得到的转录产物溶液E、双链特异性核酸酶缓冲液、20个单位的RNA酶抑制剂和600nmol/L的Taqman探针在一定体积的溶液G中反应；
4)荧光检测
用荧光分光光度计进行测量，用490纳米的激发波长，在500-650纳米的范围内记录荧光光谱，激发和发射狭缝分别设定为5.0和5.0纳米。
优选的，步骤1)中混合溶液A、步骤2)中的体积含量D、步骤3)中的体积含量F、步骤3)中的溶液G的体积比为3-5：5-7：0.8-1.2：5-7。
优选的，步骤1)中的双链DNA底物与Cut Smart缓冲液的体积比为0.8-1.2：1-3。
优选的，步骤1)中得到混合溶液A前孵育的温度为30-40℃；孵育的时间为20-40分钟。
优选的，步骤1)中得到混合溶液A前灭活的温度为60-70℃；灭活的时间为3-7分钟。
优选的，步骤1)中混合溶液B先孵育的温度为30-40℃；孵育的时间为20-40分钟。
优选的，步骤1)中混合溶液B后孵育的温度为80-100℃；孵育的时间3-7分钟。
优选的，步骤2)中混合溶液C与λexo消化产物的体积比为4-6：0.8-1.2。
优选的，步骤2)中反应温度为30-40℃；反应时间为50-70分钟。
优选的，步骤3)中体积F、双链特异性核酸酶缓冲液和Taqman探针的体积比为0.8-1.2：1-3：1-2。
优选的，步骤3)中反应温度为50-60℃；反应时间为30-50分钟。
优选的，步骤4)中荧光光谱用装备有氙灯作为激发光源的荧光分光光度计进行测量。
Cut Smart缓冲液的组成为：50mmol/L的醋酸钾，20mmol/L的pH 7.9的三羟甲基氨基甲烷-醋酸(Tris-Ac)，10mmol/L的醋酸镁，100ug/L的牛血清白蛋白；
优选的，醋酸钾、Tris-Ac、醋酸镁和牛血清白蛋白的体积比为5:2:1:1。
本申请的技术方案原理为：采用基于T7RNA聚合酶的转录扩增反应灵敏地检测碱性磷酸酶活性的方法，利用5'-磷酸化的T7启动子单链，碱性磷酸酶能够催化5'-磷酸化的T7启动子去磷酸化，保护T7启动子链不被λ核酸外切酶(λexo)消化，剩余的T7启动子能够激活T7RNA聚合酶介导的转录反应，从而产生大量的RNA转录物。随后，这些RNA转录物与Taqman探针互补配对形成RNA-DNA双链体，引入双链特异性核酸酶(DSN)引发Taqman探针的循环切割，从而产生明显增强的荧光信号。
一种检测碱性磷酸酶的试剂盒中双链DNA底物储备溶液的制备方法，具体步骤为：
将寡核苷酸用10×Tris-EDTA缓冲液稀释制备储备溶液，1微摩尔每升的T7启动子链与1微摩尔每升的模板链在退火缓冲液中孵育，随后缓慢冷却至室温。形成的双链DNA底物储存在3-5℃使用。
优选的，在退火缓冲液中孵育的温度为90-100℃；孵育的时间为3-7分钟。
本发明的第三个目的是提供一种检测碱性磷酸酶的试剂盒及其方法应用于复杂生物样品中的靶标抑制剂的筛选以及癌细胞中靶标的定量检测；所述癌细胞为宫颈癌细胞。
本发明的有益效果：
1)在本设计方案的整个过程中，我们将碱性磷酸酶的活性用核酸扩增反应转化为增强的荧光信号，这是第一次使用核酸扩增法来检测碱性磷酸酶的活性。另外，我们使用5'-磷酸化的T7启动子链作为碱性磷酸酶的底物，避免了功能性纳米材料和小分子探针的复杂设计及合成，使操作简便，缩短了时间并降低了成本。
2)本技术方案中，我们由于采用了双信号扩增策略，即T7RNA聚合酶介导的转录扩增反应和双链特异性核酸酶辅助的信号放大反应，达到了超高的灵敏度，且优于大多数报道的检测方法。由于T7RNA聚合酶具有极高的启动子特异性，当碱性磷酸酶不存在时，磷酸化的T7启动子被完全消化，使转录反应无法进行，因此大幅度降低了背景信号，从而达到很高的特异性。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1：基于转录介导的双信号扩增的碱性磷酸酶活性检测的原理说明图；
图2：(A)碱性磷酸酶介导的T7启动子的保护和转录反应产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳表征。泳道M：DNA marker；泳道1：不存在碱性磷酸酶；泳道2：存在碱性磷酸酶(5个单位每升)。所有泳道均被SYBR Gold染色剂染色。(B)碱性磷酸酶诱导的Taqman探针荧光恢复的聚丙烯酰胺凝胶电泳表征。泳道M：DNA marker；泳道1：不存在碱性磷酸酶；泳道2：存在碱性磷酸酶(5个单位每升)。泳道M用SYBR Gold染色剂染色，泳道1和2直接拍FAM的荧光发射通道。(C)不存在碱性磷酸酶(对照，黑线)和存在5个单位每升的碱性磷酸酶(红线)时的荧光发射光谱的测量。插图：不存在碱性磷酸酶(对照)和存在5个单位每升的碱性磷酸酶时的反应溶液的管内荧光检测；
图3：(A)不同浓度的碱性磷酸酶对应的的荧光发射光谱；(B)不同浓度的碱性磷酸酶对应的荧光强度变化；插图：荧光强度(F)和碱性磷酸酶(C)浓度之间的线性关系。误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差；
图4：尿嘧啶DNA糖基化酶(5个单位每升)，CpG甲基转移酶(5个单位每升)，葡萄糖氧化酶(10毫克每升)，过氧化氢酶(10毫克每升)，链酶亲和素(10毫克每升)，牛血清白蛋白(10毫克每升)和碱性磷酸酶(5个单位每升)对应的荧光强度；不加任何靶分子的样品作为对照组；误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差；
图5：碱性磷酸酶的酶活动力学分析。碱性磷酸酶的浓度是5个单位每升；碱性磷酸酶的孵育时间为5分钟；误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差；
图6：不同浓度的钒酸钠对应的碱性磷酸酶相对活性的变化；碱性磷酸酶的浓度是5个单位每升；误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差；
图7：(A)对照组，104个HEK细胞，104个HEK细胞+50微摩尔每升的钒酸钠，104个Hela细胞，104个HeLa细胞+50微摩尔每升的钒酸钠对应的荧光强度；(B)HeLa细胞的个数与荧光强度之间的线性关系；误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面结合实施例对本发明进一步说明
实施例1
第一，去磷酸化反应在20微升的反应体系中进行，包括5个单位每升的碱性磷酸酶，100纳摩尔每升的双链DNA底物(T7启动子-模板双链体)，1×Cut Smart缓冲液，于37℃孵育30分钟，后65℃灭活5分钟。然后，将1单位的λ核酸外切酶(λexo)加入到以上混合物中，在37℃再孵育30分钟，后在90℃孵育5分钟将λ核酸外切酶(λexo)灭活。
第二，转录反应在30微升反应溶液中进行，包括6微升的λ核酸外切酶(λexo)消化产物，在T7RiboMAX Express大规模RNA生产系统中于37℃反应60分钟。
第三，将5微升的转录产物RNA与1×双链特异性核酸酶缓冲液(50毫摩尔每升的pH8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，5毫摩尔每升的氯化镁，1毫摩尔每升的二硫苏糖醇，)，0.1个单位的双链特异性核酸酶(DSN)，20个单位的RNA酶抑制剂和600纳摩尔每升的Taqman探针在30微升的反应溶液中于55℃反应40分钟，
第四，对样品进行荧光测量。荧光光谱用装备有氙灯作为激发光源的F-7000荧光分光光度计在室温下测量。用490纳米的激发波长，在500-650纳米的范围内记录荧光光谱。激发和发射狭缝分别设定为5.0和5.0纳米。使用520纳米处的荧光强度进行实验数据分析，如图2所示。
Cut Smart缓冲液的组成为：50mmol/L的醋酸钾，20mmol/L的pH 7.9的三羟甲基氨基甲烷-醋酸(Tris-Ac)，10mmol/L的醋酸镁，100ug/L的牛血清白蛋白。
醋酸钾、三羟甲基氨基甲烷-醋酸、醋酸镁和牛血清白蛋白的体积分别为5微升，2微升，1微升，1微升。
双链特异性核酸酶缓冲液的组成为：50mmol/L的pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，5mmol/L的氯化镁，1mmol/L的二硫苏糖醇。
Tris-HCl、氯化镁、二硫苏糖醇的体积分别为5微升，0.5微升，0.1微升。
双链DNA底物储备溶液的制备：
将寡核苷酸用10×三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA)缓冲液稀释制备储备溶液。1微摩尔每升的T7启动子链与1微摩尔每升的模板链在退火缓冲液中于95℃孵育5分钟，随后缓慢冷却至室温。形成的双链DNA底物储存在4℃使用。
退火缓冲液为5mmol/L的pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)和50mmol/L的氯化钠；退火缓冲液中Tris-HCl和氯化钠的体积分别为5微升，50微升。
凝胶电泳：
将实施例1步骤3)得到的产物用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)在1×TBE缓冲液(9毫摩尔每升的pH 7.9的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，9毫摩尔每升的硼酸，0.2毫摩尔每升的乙二胺四乙酸)中，于110V恒定电压下进行电泳分析。凝胶通过Bio-RadChemiDoc MP成像系统(Hercules，CA)成像。
抑制剂测试：
为了检测碱性磷酸酶抑制剂的作用，不同浓度的钒酸钠与5个单位每升的碱性磷酸酶，100纳摩尔每升的双链DNA底物，1×Cut Smart缓冲液(50毫摩尔每升的醋酸钾，20毫摩尔每升的pH 7.9的三羟甲基氨基甲烷-醋酸(Tris-Ac)，10毫摩尔每升的醋酸镁，100微克每毫升的牛血清白蛋白)在37℃中反应30分钟，65℃灭活5分钟，实验与上述检测碱性磷酸酶的检测方式相同。碱性磷酸酶的相对活性(RA)按照以下方法测量：
Figure BDA0001617750060000061
其中F0表示碱性磷酸酶不存在时的荧光强度，Ft表示5个单位每升的碱性磷酸酶存在时的荧光强度，Fi表示5个单位每升的碱性磷酸酶和钒酸钠共同存在时的荧光强度。根据相对活性(RA)-钒酸钠浓度的曲线计算半抑制浓度(IC50)值。结果如图6所示。
动力学分析：
为了测量碱性磷酸酶的动力学参数，我们测量在5个单位每升的碱性磷酸酶和不同浓度的双链DNA底物存在时于37℃下反应5分钟时的初始速度。动力学参数符合米氏方程：
Figure BDA0001617750060000071
其中Vmax表示最大初始速度，[S]表示双链DNA底物的浓度，Km表示米氏常数。
在人胚肾293细胞(HEK)和人子宫颈癌(HeLa)细胞中碱性磷酸酶的检测：
将实施例1步骤1)中的一定浓度的碱性磷酸酶替换成人胚肾293细胞(HEK)和人子宫颈癌(HeLa)细胞的提取物，其它步骤相同。
细胞培养和细胞提取物的制备方法：
人子宫颈癌细胞(HeLa)和人胚肾293细胞系(HEK)在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中，于37℃在含有5％二氧化碳的培养箱中进行培养。细胞数量由Count star细胞计数器测量。用胰蛋白酶消化收集细胞，后用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)洗涤两次，于1000rpm离心5分钟。然后将细胞悬浮在100微升的裂解缓冲液(10毫摩尔每升的pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，150毫摩尔每升的氯化钠，1％的乙基苯基聚乙二醇(NP-40)，0.25毫摩尔每升的脱氧胆酸钠，1.0％的甘油和0.1毫摩尔每升的4-(2-胺乙基)苯磺酰氟盐酸盐)中，在冰上孵育30分钟，然后在4℃于12000rpm离心20分钟。将上清液转移到新的离心管中，保存在-80℃。
总结：
如图1所示，本技术方案设计了一种5'-磷酸化的T7启动子链(T7promoter)作为碱性磷酸酶的底物，一条由T7RNA聚合酶转录的模板链(template)，Taqman探针(taqmanprobe)用于荧光信号的输出。5'-磷酸化的T7启动子链可以通过Watson-Crick碱基配对与模板链结合，形成部分互补的DNA双链结构。当不存在碱性磷酸酶时，DNA双链中的5'-磷酸化的T7启动子将被λ核酸外切酶(λexo)完全消化，其中，λ核酸外切酶是一种高度持续的核酸外切酶，能够以每秒12个核苷酸的速度从5'-3'方向催化5'-磷酸化DNA的消化。由于T7RNA聚合酶是极具启动子特异性的，只有在T7启动子存在时才能引发转录反应，因此当碱性磷酸酶不存在时，便不会发生转录反应。相反，当碱性磷酸酶存在时，它可以催化5'-磷酸化的T7启动子进行去磷酸化，有效地保护T7启动子不被λ核酸外切酶消化。剩余的T7启动子在T7RNA聚合酶的催化下进行转录反应，从而产生大量的单链RNA(ssRNA)。为了检测产生的单链RNA转录物并进一步扩增荧光信号，我们使用双特异性核酸酶(DSN)和Taqman探针。双特异性核酸酶(DSN)是一种只能切割DNA/RNA双链体中的DNA链，但对RNA链没有影响的酶。Taqman探针在5'末端用FAM荧光标记，在其3'末端用Eclipse标记，由于荧光共振能量转移(FRET)效应，FAM的荧光被Eclipse淬灭。生成的转录产物单链RNA与Taqman探针互补，形成RNA-DNA异源双链体。加入双链特异性核酸酶(DSN)后，Taqman探针被消化，释放出荧光基团FAM，从而产生非常明显的荧光发射。同时，RNA从RNA-DNA异源双链体中释放出来，与新的Taqman探针结合，启动下一轮的DSN消化反应，产生高于107倍的信号增强。由于极其特异的靶向转录反应和高效的RNA--Taqman探针循环反应介导的双信号放大，本方法能够以超高灵敏度对碱性磷酸酶的活性进行简单，快速和选择性的检测。
如图2所示，碱性磷酸酶的去磷酸化作用保护T7启动子不被λ核酸外切酶消化进而激活转录反应是关键点。为了证实这一点，用SYBR Gold染色剂将消化和转录产物染色，并通过12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析。如图2所示，加入5个单位每升的碱性磷酸酶，可观察到T7启动子-模板链的异源双链体和转录产物RNA的不同条带(图2A，泳道2)，表明碱性磷酸酶的去磷酸化能够保护T7启动子且激活转录扩增反应。相反，当不存在碱性磷酸酶时，观察不到T7启动子-模板链的异源双链体和转录产物RNA的两个条带，仅能观察到模板单链的条带(图2A，泳道1)，表明磷酸化的T7启动子完全被λ核酸外切酶消化并释放出模板单链，因此不能激活转录反应。
为了验证碱性磷酸酶引发了双链特异性核酸酶切割Taqman探针，用凝胶成像来检测来自切割产物的FAM发射。如图2B所示，不存在碱性磷酸酶时，观察不到FAM条带(图2B，泳道1)，这由于在Taqman探针中Eclipse对FAM的完全猝灭。相反，加入碱性磷酸酶后可以观察到明显的FAM条带(图2B，泳道2)，这表明当碱性磷酸酶存在时，Taqman探针可以被有效切割并产生FAM荧光发射。
为了验证本技术方案用于荧光检测碱性磷酸酶活性的可行性，我们测量存在和不存在碱性磷酸酶时的FAM的荧光发射光谱。如图2C所示，当存在5个单位每升的碱性磷酸酶时，产生明显增强的荧光信号(ALP)，比不存在碱性磷酸酶时的对照组的荧光强度高12.5倍以上(Control)。为了进一步证明碱性磷酸酶引发的荧光产生，反应溶液立即通过Bio-RadChemiDoc MP成像系统(图2C，插图)成像。当存在5个单位每升的碱性磷酸酶时，可以观察到明显增强的荧光信号(图2C，插图，右侧管)，而无碱性磷酸酶时观察不到明显的荧光信号(图2C，插图，左侧管)。这些结果清晰地表明我们所提出的方法可用于高效地检测碱性磷酸酶的活性。
如图3所示，为了评估本技术方案检测碱性磷酸酶(ALP)的灵敏度，我们在最佳实验条件下探究不同浓度碱性磷酸酶所对应的荧光强度。图3A为不同浓度的碱性磷酸酶在0至50个单位每升的范围内对应的荧光发射光谱，图中曲线由下到上浓度依次增加。520纳米处的荧光强度随着碱性磷酸酶浓度的增加而逐渐增加(图3B)。荧光强度与碱性磷酸酶浓度从0.05个单位每升到1个单位每升范围内呈现良好的线性关系(图3B)。回归方程为F＝535.29+5345.3C，相关系数(R2)为0.9905，其中F为520纳米处的荧光强度，C为碱性磷酸酶的浓度。根据3σ/K的方法，检测限(LOD)计算为0.02个单位每升，其中σ是对照组的标准偏差(SD)，K是线性回归曲线的斜率。值得注意的是，本方法的灵敏度明显优于大多数报道的碱性磷酸酶的测定方法。比基于甜菜碱修饰的聚乙烯亚胺的荧光测定法(100个单位每升)高5000倍，比基于金纳米粒子的比色测定法(32个单位每升)高1600倍，比基于DNA底物的电化学测定法(100个单位每升)高5000倍。这种超高灵敏度可归因于以下：(1)过量磷酸化T7启动子被λ核酸外切酶消化而产生低的背景，(2)T7RNA聚合酶介导的转录扩增反应的高效性，(3)双链特异性核酸酶辅助的信号放大。这足以说明本技术方案的检测灵敏度之高。
如图4所示，为了评估本技术方案的特异性，我们用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG，5个单位每升)，CpG甲基转移酶(M.SssI，5个单位每升)，葡萄糖氧化酶(GO，10毫克每升)，过氧化氢酶(10毫克每升)，链霉亲和素(SA，10毫克每升)和牛血清白蛋白(BSA，10毫克每升)作为负对照进行特异性实验。尿嘧啶DNA糖基化酶是DNA糖基化酶中的一种，能够切除受损DNA的尿嘧啶碱基。M.SssI能够特异性地甲基化CpG序列内的所有胞嘧啶残基。过氧化氢酶可以催化过氧化氢(H2O2)分解为水(H2O)和氧气(O2)。链酶亲和素和牛血清白蛋白是两种常用的蛋白。理论上，这些样品均不能催化5'磷酸化的T7启动子链去磷酸化，从而保护T7启动子不被λ核酸外切酶消化，因此不能发生转录反应且检测不到荧光信号。如图4所示，只有加入靶标碱性磷酸酶时才能观察到明显的荧光信号(图4，红色柱)。相反，加入以上的干扰蛋白，仅能产生非常低的荧光信号，与没有任何蛋白加入的对照组(Control)相比，荧光强度没有明显变化，由此表明，本技术方案具有高度特异性，能够区分靶标碱性磷酸酶和其他不相关蛋白。
如图5所示，为了测试本技术方案用于检测碱性磷酸酶的动力学参数的性能，在0至100纳摩尔每升的范围内，测定不同浓度的双链DNA底物对应的初始速度(V)，其数据符合米氏(Michaelis-Menten)方程：
Figure BDA0001617750060000091
其中Vmax代表最大初始速度，[S]代表双链DNA底物的浓度，Km是米氏常数。如图5所示，初始速度随着底物浓度从0到100纳摩尔每升的增加而逐渐增加。Vmax计算为1584.35min-1，Km确定为55.56纳摩尔每升。这些结果表明，我们所提出的方法适于碱性磷酸酶的酶活动力学分析。
如图6所示，为了检测本技术方案能否用于检测碱性磷酸酶的抑制剂，我们使用钒酸钠(Na3VO4)作为抑制剂，钒酸钠是一种竞争性的碱性磷酸酶抑制剂，其通过与酶的活性位点结合有效地抑制碱性磷酸酶的活性。碱性磷酸酶的相对活性(RA)按照以下方法测量：
Figure BDA0001617750060000101
其中F0表示碱性磷酸酶不存在时的荧光强度，Ft是5个单位每升的碱性磷酸酶存在时的荧光强度，Fi是5个单位每升的碱性磷酸酶和钒酸钠共同存在时的荧光强度。如图6所示，随着浓度从0增加到20微摩尔每升，碱性磷酸酶的相对活性显著降低。计算得到Na3VO4的半抑制浓度(IC50，即将碱性磷酸酶的活性降低50％所需的抑制剂浓度)为3.52微摩尔每升。值得注意的是，IC50是一个相对值，其值随不同的底物类型和底物浓度的变化而变化，因此它并不是比较不同底物的抑制剂作用的合适参数。相反，抑制常数(Ki)是一个给定的抑制剂常数，可用于评估不同方法的抑制效率。Ki的值可通过Cheng-Prusoff方程来确定：
Figure BDA0001617750060000102
根据动力学分析(图5)得到的Km和[S]值，Ki值计算为1.25微摩尔每升，这与通过以对硝基苯酚为底物的分光光度测定法(1.5微摩尔每升)结果一致。这些结果清晰地表明，我们所提出的检测方法对碱性磷酸酶的抑制检测具有很高的可靠性和准确性，在抑制剂药物的筛选中具有巨大的潜力。
如图7所示，为了探究本技术方案对实际样品的检测，我们测量来自人胚肾293细胞(HEK)和人子宫颈癌(HeLa)细胞这两种不同细胞系的碱性磷酸酶的活性。如图7A所示，与无任何细胞提取物的对照组(Control)的低背景信号相比，加入来自HEK细胞和HeLa细胞的提取物时，能够检测到明显增强的荧光信号。很明显，HeLa细胞提取物的荧光信号比HEK细胞提取物的荧光信号高2.59倍，说明碱性磷酸酶在不同类型细胞系中的表达水平不同，这与之前报道的结果一致，因此，所提出的方法可用于区分癌细胞和非癌细胞之间的碱性磷酸酶的表达。此外，当添加碱性磷酸酶抑制剂Na3VO4时，HEK细胞和HeLa细胞所产生的荧光信号都显著降低，表明荧光信号是由内源性碱性磷酸酶产生的。为了进一步探究内源性碱性磷酸酶的检测灵敏度，我们检测不同的HeLa细胞个数对应的荧光信号。如图7B所示，在对数形式下，HeLa细胞数目在5至105个细胞的范围内与荧光强度呈线性关系。线性方程为F＝183.29+1010.13log10N(R2＝0.9985)，其中F是荧光强度，N是HeLa细胞的数量。根据3σ/K方法计算检测限(LOD)为2个细胞，其中σ是对照组的标准偏差(SD)，K是线性回归曲线的斜率。值得注意的是，虽然已经报道了许多方法用来检测活细胞中的碱性磷酸酶活性，但是，我们所提出的方法是首次定量检测碱性磷酸酶活性的方法，且检测限极低(2个细胞)。这些结果表明，本技术方案能够高度准确和灵敏地检测癌细胞中内源性碱性磷酸酶的活性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 一种检测碱性磷酸酶的试剂盒及其方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
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taacactgtc tggtaaagat ggccctatag tgagtcgta 39
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
taacactgtc tggtaaagat gg 22

Claims (20)

1.一种检测碱性磷酸酶的试剂盒，其特征在于：包括与碱性磷酸酶反应的双链DNA底物、Taqman探针、引发Taqman探针的循环切割的双链特异性核酸酶；所述双链DNA底物由5'-磷酸化的T7启动子单链和模板双链体结合得到；
所述磷酸化的T7启动子序列为5’-磷酸-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’；
所述模板序列为5’-TAA CAC TGT CTG GTA AAG ATG GCC CTA TAG TGA GTC GTATTA-3’；
所述Taqman探针序列为5’-FAM-TAA CAC TGT CTG GTA AAG ATG G-Eclipse-3’；所述Taqman探针在5'末端用FAM荧光标记，在其3'末端用Eclipse标记。
2.根据权利要求1所述的检测碱性磷酸酶的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括双链特异性核酸酶缓冲液，所述缓冲液的组成为：50mmol/L的pH 8.0的Tris-HCl，5mmol/L的氯化镁，1mmol/L的二硫苏糖醇。
3.根据权利要求2所述的检测碱性磷酸酶的试剂盒，其特征在于：Tris-HCl、氯化镁、二硫苏糖醇的体积比为48-52:3-6:0.6-1.4。
4.根据权利要求1所述的检测碱性磷酸酶的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括5'-磷酸化的T7启动子单链和模板双链体结合所用的Tris-EDTA缓冲液和退火缓冲液；所述退火缓冲液为5mmol/L的pH 8.0的Tris-HCl和50mmol/L的氯化钠。
5.根据权利要求4所述的检测碱性磷酸酶的试剂盒，其特征在于：退火缓冲液中Tris-HCl和氯化钠的体积比为0.3-0.7:3-7。
6.一种非疾病诊断治疗目的的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：所述方法使用权利要求1所述试剂盒，具体步骤为：
1)5 '-磷酸化的T7启动子的去磷酸化
将碱性磷酸酶和100nmol/L的双链DNA底物，Cut Smart缓冲液混合，孵育后灭活得到混合溶液A；然后，将1单位的λ核酸外切酶加入到以上混合溶液A中得到混合溶液B，混合溶液B进行先孵育之后，再进行后孵育将λ核酸外切酶灭活，得到混合溶液C；
2)转录反应
取一定体积D的步骤1)中得到的混合溶液C，其中含有一定量的λ核酸外切酶消化产物，在RNA生产系统中反应，得到转录产物溶液E；
3)互补配对
取一定体积F的步骤2)得到的转录产物溶液E、双链特异性核酸酶缓冲液、20个单位的RNA酶抑制剂和600nmol/L的Taqman探针在一定体积的溶液G中反应；
4)荧光检测
荧光光谱用装备有氙灯作为激发光源的荧光分光光度计进行测量，用490纳米的激发波长，在500-650纳米的范围内记录荧光光谱，激发和发射狭缝分别设定为5.0和5.0纳米。
7.根据权利要求6所述的非疾病诊断治疗目的的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤1)中得到混合溶液A前孵育的温度为30-40℃；孵育的时间为20-40分钟。
8.根据权利要求6所述的非疾病诊断治疗目的的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤1)中得到混合溶液A前灭活的温度为60-70℃；灭活的时间为3-7分钟。
9.根据权利要求6所述的非疾病诊断治疗目的的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤1)中混合溶液B先孵育的温度为30-40℃；孵育的时间为20-40分钟。
10.根据权利要求6所述的非疾病诊断治疗目的的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤1)中混合溶液B后孵育的温度为80-100℃；孵育的时间3-7分钟。
11.根据权利要求6所述的非疾病诊断治疗目的的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤2)中反应温度为30-40℃；反应时间为50-70分钟。
12.根据权利要求6所述的非疾病诊断治疗目的的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤1)中的Cut Smart缓冲液的组成为：50mmol/L的醋酸钾，20mmol/L的pH7.9的Tris-Ac，10mmol/L的醋酸镁，100ug/L的牛血清白蛋白。
13.根据权利要求12所述的非疾病诊断治疗目的的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：醋酸钾、Tris-Ac、醋酸镁和牛血清白蛋白的体积比为5:2:1:1。
14.根据权利要求6所述的非疾病诊断治疗目的的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤1)中混合溶液A、步骤2)中的体积含量D、步骤3)中的体积含量F、步骤3)中的溶液G的体积比为3-5：5-7：0.8-1.2：5-7。
15.根据权利要求6所述的非疾病诊断治疗目的的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤1)中的双链DNA底物与Cut Smart缓冲液的体积比为0.8-1.2：1-3。
16.根据权利要求6所述的非疾病诊断治疗目的的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤2)中混合溶液C与λ核酸外切酶消化产物的体积比为4-6：0.8-1.2。
17.根据权利要求6所述的非疾病诊断治疗目的的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤3)中体积F、双链特异性核酸酶缓冲液和Taqman探针的体积比为0.8-1.2：1-3：1-2。
18.根据权利要求6所述的非疾病诊断治疗目的的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤3)中反应温度为50-60℃；反应时间为30-50分钟。
19.根据权利要求6所述的非疾病诊断治疗目的的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：双链DNA底物储备溶液的制备方法，具体步骤为：
将寡核苷酸用10×Tris-EDTA缓冲液稀释制备储备溶液，1微摩尔每升的T7启动子链与1微摩尔每升的模板链在退火缓冲液中孵育，随后缓慢冷却至室温，形成的双链DNA底物储存在3-5℃使用。
20.根据权利要求6所述的非疾病诊断治疗目的的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：在退火缓冲液中孵育的温度为90-100℃；孵育的时间为3-7分钟。
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