CN110872607A - 一种检测碱性磷酸酶的荧光生物传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测碱性磷酸酶荧光传感器及其制备方法。所述方法借助碱性磷酸酶（CIP）在碱性条件下会发挥磷酸水解酶的性质，将DNA 3' 端的‑P转变为‑OH；再利用末端转移酶（TdT）将脱氧核苷酸（dTTP）加尾到DNA 3' 端的羟基上，形成一条3'端带脱氧胸腺核苷酸长链的单链DNA；之后插入3'端纯腺嘌呤单链DNA探针与其杂交形成双链；最后结合SYBR Green I对双链DNA的特异性结合产生高强度荧光而其游离态不产生荧光的特质，通过检测SYBR Green I的荧光强度达到定量分析碱性磷酸酶活性的目的。本发明的方法操作简单、样品消耗量较少且灵敏度和选择性高。

Description

一种检测碱性磷酸酶的荧光生物传感器及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种检测碱性磷酸酶的免标记荧光传感器的制备，属于荧光生物传感技术领域。
背景技术
碱性磷酸酶是一种非特异性的磷酸单酯酶，是一组同工酶，在碱性环境下为磷酸水解酶。碱性磷酸酶广泛分布于生物的骨骼、肝脏、肝脏、肠胃等组织器官之中。人体内正常的碱性磷酸酶含量在40U/L-145U/L之间，当相关疾病发生时，生物血清中碱性磷酸酶的活性也会随之发生变化，如患上骨恶性肿瘤时，人血清中碱性磷酸酶的浓度会出现病理性升高，超过正常值。因此碱性磷酸酶的活性检测在生物疾病诊断中有很重要的作用。
目前的主要检测碱性磷酸酶的方法有荧光法和比色法。比色法成本较低且操作便捷，对仪器设备和实验环境要求较低，但是检测限普遍偏高。比色法中最便捷的为L.Zhang等人开发的试纸条检测法，过程无需其他设备，但是检测限偏高,无法满足医疗临床需求。荧光法与比色法相比，信号强度大、灵敏度高、检测限较低，但是通常需要引入各式各样的纳米粒子与探针辅助检测，直接导致荧光法检测操作复杂、耗材严重的同时又非常耗时，因此，发展一种高灵敏度、高选择性且操作简便的碱性磷酸酶检测方法是很必要的。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供检测碱性磷酸酶的荧光生物传感器及其制备方法。其可用于血清样品中碱性磷酸酶活性的简便和高灵敏检测，图1为本发明的检测碱性磷酸酶活性的工作原理图。
本发明通过以下技术方案实现的：
一种检测碱性磷酸酶活性的荧光传感器的制备步骤如下：
（1）利用碱性磷酸酶（CIP）在碱性条件下会发挥磷酸水解酶的性质，将单链DNA（简写为Probe 1）3'端的-P转变为-OH；
（2）利用末端转移酶（TdT）将脱氧核苷酸（dTTP）加尾到DNA3'端的羟基上，形成一条3'端带脱氧胸腺核苷酸长链的单链DNA；
（3）加入3'端纯腺嘌呤单链DNA（简写为Poly A）与上一步的带脱氧胸腺核苷酸长链的单链DNA进行碱基互补配对，形成双链DNA。
（4）加入SYBR Green I， SYBR Green I嵌入形成的双链DNA结构中，产生了较强的荧光强度；利用SYBR Green I的荧光信号与碱性磷酸酶的浓度的关联性，获得工作曲线，从而对样品中的碱性磷酸酶活性进行检测。
其中步骤（1）中单链DNA （Probe 1）序列从左到右5’到3’： GGC GGC GGC GGC GGCGGC GGC GGC G – P；
所述Poly A的序列为：5’-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA A-3’；
其中步骤（1）中单链DNA （Probe 1）羟基化的方法如下：将Probe 1（10 μL，1μM）、不同浓度CIP（1 μL）和1× NEBuffer 2缓冲液混合，总体积维持50 μL，37℃下恒温孵育60min。
其中步骤（2）中羟基化的单链DNA加尾的方法如下：往步骤（1）中加入TdT（1 μL，35U/μL）、5x TdTBuffer（10 μL）、dTTP（1 μL，100mM）和1x NEBuffer 2缓冲液混合，总体积维持80 μL，37℃下恒温孵育120min。
其中步骤（3）中形成双链DNA的方法如下：将步骤（2）制备的样品灭活后加入PolyA（10μL，10μM）和1x NEBuffer 2缓冲液，总体积维持100 μL，25℃恒温孵育时间为120min。
所述灭活方法为：将样品管封口后，80℃水浴10min，自然冷却到室温。
其中步骤（4）样品混匀后，避光放置15min后再进行荧光强度的测定。
采用上述的技术方案，本发明具有的有益效果是：
（1）本发明方案采用免标记荧光法，制备过程简单，样品消耗量较少，无需利用大型复杂仪器。
（2）碱性磷酸酶（CIP）检测结果具有较高的灵敏度和选择性，且在人血清样本中的检测表明其在临床诊断中具有广阔应用前景。
附图说明
图1为本发明的检测碱性磷酸酶活性的工作原理图。
图2为不同浓度碱性磷酸酶相应的荧光强度的变化。
图3为本发明方法的检测特异性结果。
具体实施方式
10μM的单链DNA（Probe 1）的配制：采用离心法让Probe 1（1OD）管内DNA沉积在管底，加入440μL1×NEBuffer 2缓冲液稀释，振荡器混匀，放入-20℃冰箱冷藏保存。
1μM 的Probe 1的配制：取20μL Probr1（10μM）溶液，用180 μL1× NEBuffer 2缓冲液稀释，振荡器混匀，放入-20℃冰箱冷藏保存。
10μM 的3'端纯腺嘌呤单链DNA（Poly A）的配制：采用离心法让Poly A（1OD）管内DNA沉积在管底，加入330μL1× NEBuffer 2稀释，振荡器混匀，放入-20℃冰箱冷藏保存。
碱性磷酸酶（CIP）的配制：将浓度为10U/μL（107 U/L）的CIP原液用1× NEBuffer2缓冲液进行稀释，配制成所需的CIP浓度。
实施例1
利用碱性磷酸酶活性制备双链DNA体系。
（1）单链DNA （Probe 1）羟基化：
首先将10 μL浓度为1μM 的Probe 1和1 μL不同浓度（1×10-5~ 0.01U/μL）的CIP加入39 μL1×NEBuffer 2缓冲液中，用小型离心机将管壁附着液体汇集在管底，圆周振荡器混匀，然后在多振幅轨道恒温培养振荡器中37℃恒温60min。
（2）羟基化Probe 1单链DNA加尾：
将1 μL 浓度为35 U/μL的 TdT、10 μL 的5×TdTBuffer和1 μL浓度为100mM 的dTTP加入（1）样品管中，补充1×NEBuffer 2缓冲液至总体积80μL，用小型离心机将管壁附着液体汇集在管底，圆周振荡器混匀，然后避光条件下在多振幅轨道恒温培养振荡器中37℃恒温120min。
（3）灭活：
将（2）步骤制备的样品管封口膜密封关口后，进行10min 80℃水浴。结束灭活后，需要等到样品自然冷却至室温后才能进行下一步操作。
（4）形成双链DNA：
往上述样品管加入10μL浓度为10μM 的Poly A，补充1×NEBuffer 2缓冲液至总体积100μL，用小型离心机将管壁附着液体汇集在管底，圆周振荡器混匀，在多振幅轨道恒温培养振荡器中25℃恒温120min。
实施例2
标准曲线的绘制
（1）将由不同浓度的碱性磷酸酶（CIP）制得的双链DNA溶液中加入5μL 200×SYBRGreen I, 补充1×NEBuffer 2缓冲液至总体积200μL，用小型离心机将管壁附着液体汇集在管底，圆周振荡器混匀。
（2）避光室温放置15min。
（3）样品注入石英微量比色皿，放入FL4600荧光光谱仪检测，根据不同浓度碱性磷酸酶下各体系的荧光强度，获得碱性磷酸酶的活性与荧光强度关系方程式，此线性方程可用于待测样品碱性磷酸酶的活性检测。
如图2所示，随着碱性磷酸酶的浓度增加，相对应的荧光强度也随之增大。线性方程式为：I=731.3C+4859.0，R 2=0.9943。
本发明可以实现对碱性磷酸酶活性的定量检测。
实施例3
人血清样本中碱性磷酸酶活性的测定。
（1）将人血清样本用1×NEBuffer 2稀释十倍后进行实验。
（2）将Probe 1（10 μL，1μM）和10μL稀释后的人血清样本加30 μL1×NEBuffer 2缓冲液中，用小型离心机将管壁附着液体汇集在管底，圆周振荡器混匀，然后在多振幅轨道恒温培养振荡器中37℃恒温60min。
（3）将TdT（1 μL，35 U/μL）、5×TdTBuffer（10 μL）、dTTP（1 μL，100mM）加入（2）步骤制得的样品中，补充1×NEBuffer 2缓冲液至总体积80μL，用小型离心机将管壁附着液体汇集在管底，圆周振荡器混匀，然后避光条件下在多振幅轨道恒温培养振荡器中37℃恒温120min。
（4）将（3）步骤的样品管封口膜密封关口后，进行10min 80℃水浴。结束灭活后，需要等到样品自然冷却至室温后才能进行下一步操作。
（5）往（4）步骤制得的样品中加入10μL Poly A（浓度为10μM），补充1×NEBuffer 2缓冲液至总体积100μL，用小型离心机将管壁附着液体汇集在管底，圆周振荡器混匀，在多振幅轨道恒温培养振荡器中25℃恒温120min。
（6）往（5）步骤制得的样品加入5μL 200×SYBR Green I， 补充1x NEBuffer 2缓冲液至总体积200μL，用小型离心机将管壁附着液体汇集在管底，圆周振荡器混匀。避光室温放置15min。将样品注入石英微量比色皿，放入荧光光谱仪检测。
记录待测样品的荧光强度，代入标准曲线中，获得待测样品的碱性磷酸酶的活性。
实施例4
为了检测本发明的方法对碱性磷酸酶检测的特异性，将本发明中所使用的碱性磷酸酶换成其它干扰物质，分别为透明质酸酶和尿素酶，其中碱性磷酸酶的浓度为4 ×10-7 U/μL，透明质酸酶的浓度为4 ×10-6U/μL，尿素酶的浓度为3.9 ×10-6 U/μL，干扰组分的浓度均为样品浓度的10倍。
如图3所示，加入了碱性磷酸酶的一组样品中检测到明显增加的荧光信号，但其它干扰物质的荧光强度与空白溶液基本相同，这表明了该体系对碱性磷酸酶的选择性较好，可用于碱性磷酸酶的特异性检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种检测碱性磷酸酶的荧光生物传感器及其制备方法
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggcggcggcg gcggcggcgg cggcg 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 25

Claims (6)

1.一种检测碱性磷酸酶的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：
（1）单链DNA Probe 1羟基化：利用碱性磷酸酶在碱性条件下会发挥磷酸水解酶的性质，将单链DNA探针3'端的-P转变为-OH；
（2）羟基化Probe 1单链DNA加尾：利用末端转移酶将脱氧核苷酸加尾到DNA 3'端的羟基上，形成一条3'端带脱氧胸腺核苷酸长链的单链DNA；
（3）形成双链DNA：加入3'端纯腺嘌呤单链DNA Poly A与步骤（2）的带脱氧胸腺核苷酸长链的单链DNA进行碱基互补配对，形成双链DNA；
（4）加入SYBR Green I， SYBR Green I嵌入形成的双链DNA结构中，产生了较强的荧光强度；利用SYBR Green I的荧光信号与碱性磷酸酶的浓度的关联性，获得工作曲线，从而对样品中的碱性磷酸酶含量进行检测；
步骤（1）所述单链DNA Probe 1序列为：5’-GGC GGC GGC GGC GGC GGC GGC GGC G-P-3’，
所述Poly A的序列为：5’-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA A-3’。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述单链DNA Probe 1羟基化的方法为：将Probe 1、碱性磷酸酶和1×NEBuffer 2缓冲液混合，总体积维持50 μL，37℃下恒温孵育60min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述中羟基化Probe 1单链DNA加尾的方法如下：往步骤（1）中加入末端转移酶、5×TdTBuffer、dTTP和1×NEBuffer 2缓冲液混合，总体积维持80 μL，37℃下恒温孵育120min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中形成双链DNA的方法如下：将步骤（2）制备的样品灭活后加入Poly A和1×NEBuffer 2缓冲液，总体积维持100 μL，25℃恒温孵育时间为120min。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述灭活方法为：将样品管封口后，80℃水浴10min，自然冷却到室温。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）方法具体如下：在步骤（3）双链DNA体系中加入200×SYBR Green I, 补充1×NEBuffer 2缓冲液至总体积200μL，用小型离心机将管壁附着液体汇集在管底，圆周振荡器混匀，避光放置15min后再进行荧光强度的测定。
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