CN104263831A - 一种简便快速的碱性磷酸酶活性测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种简便快速的碱性磷酸酶活性测定方法，所述方法包括：获得一条链的5'端磷酸化的双链线性DNA，然后以该双链线性DNA为底物在碱性磷酸酶存在下在反应体系中反应，将反应获得的具有5'端去磷酸化的双链线性DNA的反应物在足量λ核酸外切酶存在下在反应体系中反应，反应完成后测定反应体系中单链DNA或双链DNA的相对量，并由该检测结果推导出碱性磷酸酶的活性程度。该方法与现有技术的方法相比，操作简单快速，可实现高通量、自动化的活性测定，并且灵敏度高，可检测到10mU的碱性磷酸酶。

Description

一种简便快速的碱性磷酸酶活性测定方法
技术领域
本发明属于生化技术领域，具体来说涉及一种简便快速的碱性磷酸酶活性测定方法。
背景技术
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP) 是一类水解酶，可在核苷酸、蛋白质、生物碱等分子上去除磷酸基，进行去磷酸化作用，在碱性环境下最为有效，故得名碱性磷酸酶。碱性磷酸酶是基因工程技术以及分子生物学研究中一类非常重要的工具酶，其非特异性催化DNA和RNA的5'和3'末端磷酸单酯去磷酸化，但不降解磷酸二酯和三酯键。此外，碱性磷酸酶可水解核糖和脱氧核糖核苷三磷酸(rNTPs和dNTPs)。在分子生物学研究中可用于去除DNA和RNA的磷酸化末端，以便后续的克隆和末端标记。克隆中线性质粒DNA去磷酸化后可防止自连。该酶作用于5'末端，无论其为凸端、凹端或平端。碱性磷酸酶还可降解PCR反应中多余的dNTPs，此PCR产物可直接用于DNA测序和SNP分析。
标准的测活方法采用对硝基苯磷酸钠(pNPP)法，其反应方程式如下：
pNPP（无色）+H2O               pNP（黄色）+HPO4 2-
通过分光光度法测定产物pNP的含量，进而计算出碱性磷酸酶的活性。这种基于显色的方法步骤较多，反应时间要求控制精确，难以实现高通量、自动化。
发明内容
本发明的目的是建立一种简便、快速的碱性磷酸酶测活方法。本发明原理如图1所示。
具体来说，本发明采用以下技术方案：
一种简便快速的碱性磷酸酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：获得一条链的5'端磷酸化的双链线性DNA，然后以该双链线性DNA为底物在碱性磷酸酶存在下在反应体系中反应，将反应获得的具有5'端去磷酸化的双链线性DNA的反应物在足量λ核酸外切酶存在下在反应体系中反应，反应完成后测定反应体系中单链DNA或双链DNA的相对量，并由该检测结果推导出碱性磷酸酶的活性程度。
优选地，双链DNA或单链DNA的相对量是利用荧光染料，通过荧光法测得的，并且双链DNA或单链DNA的相对量是以荧光强度表示的。更优选，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料。
在一个实施方案中，所采用的染料是成熟的商用双链DNA特异性荧光染料，例如picogreen染料。
优选地，所采用的双链线性DNA模板是以λDNA为底物，在正向和反向引物的存在下通过PCR扩增获得的线性双链DNA，以便于建立标准的检测方法，其中所用的正向和反向引物中的一者的5’端具有磷酸化基团。在一个实施方案中，所用正向引物为5’-aataacgtcggcaactttgg-3’，反向引物为5’-gttacgccaccagtcatcct-3’。
本发明的优点：
1. 操作步骤简单快速，可实现高通量、自动化的活性测定。
2. 灵敏度高，可检测到10 mU的碱性磷酸酶。
附图说明
图1是本发明的测定原理图。
图2是利用本发明测定方法获得荧光活性曲线图。
具体实施方式
本发明的目的是建立一种简便、快速的碱性磷酸酶测活方法。本发明原理如图1所示。
如图所示，碱性磷酸酶可以一端磷酸化的双链DNA转化为非磷酸化的双链DNA。λ核酸外切酶可以特异性的将磷酸化双链DNA降解为单链DNA，而不降解非磷酸化的双链DNA。picogreen染料特异性的结合双链DNA，产生荧光，而不能结合单链DNA，从而不能产生荧光。碱性磷酸酶的活性在一定范围内同去磷酸化双链DNA的量成正比，因此其活性就可以用Picogreen荧光强度来进行测定。
实施例1. 荧光法测定碱性磷酸酶活性方法的建立
1. 磷酸化双链DNA的制备
引物F（5’磷酸化修饰）：5’-aataacgtcggcaactttgg-3’；
引物R：5’-gttacgccaccagtcatcct-3’；
PCR模板：λ DNA
PCR反应：
组分 体积
DDW 至50μl
10x Taq缓冲液 5
dNTP (10 mM) 1μl
引物F (10 μM) 2μl
引物R (10 μM) 2μl
λ DNA 10 ng
Taq酶 1 U
PCR产物用酚氯仿抽提，乙醇沉淀的方式纯化。纯化的PCR产物用A260测定浓度。
2. 碱性磷酸酶反应：
组分 体积
DDW 至20μl
10x CIAP缓冲液 2
磷酸化PCR产物 100 ng
牛小肠碱性磷酸酶（CIAP） 0-1024 mU
温度 时间
37℃ 30分钟
4℃ 保持
3. λ核酸外切酶反应：
组分 体积
DDW 至50μl
10x λ核酸外切酶缓冲液 5
碱性磷酸酶反应产物 20μl
λ核酸外切酶 5 U
温度 时间
37℃ 30分钟
4℃ 保持
4. picogreen荧光检测：
向反应产物中加入0.5 μl picogreen染料（invitrogen P11495）；用荧光酶标仪检测，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm。检测结果如下表：
碱性磷酸酶酶量 (mU) 荧光数值
1024 2233.
512 2236.
256 2286.
128 2290.
64 2110.
32 1579.
16 994.
8 673.
4 522.
2 452.
1 417.
0.5 397
0 346
这一结果表明，磷酸化的双链DNA可被碱性磷酸酶去磷酸，且去磷酸程度呈现剂量依赖性。
以碱性磷酸酶活性单位(mU)的log值为横坐标，荧光强度为纵坐标，用GraphPad Prism5做非线性回归曲线。我们发现这些数据点可以很好地拟合出一条S型曲线，如图2所示。
通过多次重复实验并计算曲线的半最大效应浓度 (EC50)，我们发现，EC50值在多次实验间保持稳定：
实验 EC50 (mU)
1 23.95
2 22.44
3 23.20
4 24.67
平均值 (mU) 23.57
标准差SD (mU) 0.83
变异系数 CV (%) 3.53
因此，这一EC50值可作为本方法的活性定义。即在实施例1的反应体系中，使荧光强度达到最大值一半的碱性磷酸酶酶量定义为1个荧光法单位（Fluoresence Unit, FU）；1 FU=23.57 mU（pNPP法单位）。
上面结合附图和具体实施例对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (6)

1. 一种简便快速的碱性磷酸酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：获得一条链的5'端磷酸化的双链线性DNA，然后以该双链线性DNA为底物在碱性磷酸酶存在下在反应体系中反应，将反应获得的具有5'端去磷酸化的双链线性DNA的反应物在足量λ核酸外切酶存在下在反应体系中反应，反应完成后测定反应体系中单链DNA或双链DNA的相对量，并由该检测结果推导出碱性磷酸酶的活性程度。
2. 如权利要求1所述的简便快速的碱性磷酸酶活性测定方法，其特征在于，双链DNA或单链DNA的相对量是利用荧光染料，通过荧光法测得的，并且双链DNA或单链DNA的相对量是以荧光强度表示的。
3. 如权利要求2所述的简便快速的碱性磷酸酶活性测定方法，其特征在于，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料。
4. 如权利要求3所述的简便快速的碱性磷酸酶活性测定方法，其特征在于，所采用的染料是picogreen染料。
5. 如权利要求1所述的简便快速的碱性磷酸酶活性测定方法，其特征在于，所采用的双链线性DNA模板是以λDNA为底物，在正向和反向引物的存在下通过PCR扩增获得的线性双链DNA，其中所用的正向和反向引物中的一者的5’端具有磷酸化基团。
6. 如权利要求5所述的简便快速的碱性磷酸酶活性测定方法，其特征在于，所用正向引物为5’-aataacgtcggcaactttgg-3’，反向引物为5’-gttacgccaccagtcatcct-3’。
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