CN104293928A - 一种定量核酸外切酶i活性测定方法 - Google Patents

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徐晓昱
王静
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Abstract

本发明公开了一种定量核酸外切酶I活性测定方法，所述方法包括以下步骤：首先提供与单链DNA模板互补的引物，随后加入核酸外切酶I进行外切反应；外切反应后，加入单链DNA模板并退火，形成单链DNA模板/引物复合物；其后加入聚合酶，合成双链DNA；接着测定反应体系中单链或双链DNA的相对量，并由测定结果推导出核酸外切酶I活性程度，其中核酸外切酶I活性程度与反应体系中双链DNA的量成反比。与现有技术相比，本发明的方法无放射性污染，操作简单便捷，可以对核酸外切酶Ⅰ活性进行定量的检测分析。

Description

一种定量核酸外切酶I活性测定方法
技术领域
本发明属于生化技术领域，具体来说涉及一种定量核酸外切酶I活性测定方法。 
背景技术
核酸外切酶I（Exonuclease I, ExoI）是单链特异性3’→5’核酸外切酶，从ssDNA的3’-OH末端分解生成5’-单核苷酸。对单链DNA的特异性非常高，不分解双链DNA及RNA。 
核酸外切酶I对单链DNA的高度特异性，使其成为分子生物学领域中一种非常重要的工具酶，应用非常广泛。例如，在PCR反应完成后，在产物中直接加入核酸外切酶I和虾碱性磷酸酶，降解剩余的引物和dNTP。消化过的PCR产物经过80℃加热后，即可直接进行测序反应而不需要纯化。 
标准的核酸外切酶I测活方法采用放射性同位素法。核酸外切酶I以3’末端[3H]标记的单链寡核苷酸为底物，生成带[3H]标记的dNTP。产物经TCA沉淀后，用whatman滤纸过滤，以实现[3H]标记的dNTP和寡核苷酸的分离。通过测定酸可溶性产物中的放射性同位素的量，计算核酸外切酶I的活性。放射性同位素法存在易产生放射性污染、步骤多、周期长的缺陷，难以实现高通量、自动化。 
发明内容
本发明的目的在于建立了一种简便、快速、非放射性且定量的核酸外切酶I测活方法，其原理如图1所示。 
具体来说，本发明采用如下技术方案： 
一种定量核酸外切酶I活性测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：首先提供与单链DNA模板互补的引物，随后加入核酸外切酶I进行外切反应；外切反应后，加入单链DNA模板并退火，形成单链DNA模板/引物复合物；其后加入聚合酶，合成双链DNA；接着测定反应体系中单链或双链DNA的相对量，并由测定结果推导出核酸外切酶I活性程度，其中核酸外切酶I活性程度与反应体系中双链DNA的量成反比。
优选地，双链DNA或单链DNA的相对量是利用荧光染料，通过荧光法测得的，并且双链DNA或单链DNA的相对量是以荧光强度表示的。更优选，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料，例如可在市面上商购获得的picogreen染料。 
优选地，所采用的单链DNA模板是单链环状DNA模板。更优选，所采用的单链DNA模板是M13噬菌体单链DNA，以便于建立标准测定方法。 
作为标准测定方法的一个实例，所采用的聚合酶为Taq酶。 
本发明的优点： 
1. 无放射性污染；
2. 操作步骤简单，重复性好，稳定性强，反应迅速；
3. 可以对核酸外切酶Ⅰ活性进行定量的检测分析，便于操作。
附图说明
图1是本发明测定方法原理图。 
图2是核酸外切酶Ⅰ活性-荧光强度曲线图。 
具体实施方式
本发明建立了一种简便、快速、非放射性且定量的核酸外切酶I测活方法，其原理如图1所示。 
如图1所示，加入单链DNA，如M13 ssDNA后，单链DNA引物可与其形成匹配的模板/引物复合物，如M13模板/引物复合物，Taq酶可以模板/引物复合物如M13模板/引物复合物为底物，进行聚合反应，生成M13双链DNA。M13双链DNA可被双链特异性的picogreen染料结合，产生荧光。ExoI酶可降解单链DNA引物，从而减少M13模板/引物复合物的量。ExoI酶的活性在一定范围内同M13模板/引物复合物的量成反比；而在DNA聚合酶活性一定的情况下，M13模板/引物复合物的量同荧光强度成正比。因此，本发明将ExoI酶的测活体系同DNA聚合酶测活体系偶联起来，在一定范围内，ExoI酶的活性同荧光强度成反比。 
本发明人进一步证明了上述假设，从而建立了非放射性、简便、快速且可以定量的核酸外切酶Ⅰ测活方法。 
作为本发明测定方法的一个实例，一个采用M13单链DNA作为单链模板的本发明测定方法包括如下基本步骤： 
M13单链DNA：M13mp18单链DNA (NEB)；
单链DNA引物：M13引物5’-aagccatccgcaaaa-3’;
1. ExoⅠ反应：
2. 聚合酶反应：
3. picogreen荧光检测：
向反应产物中加入0.5 μl picogreen染料（invitrogen P11495）；用荧光酶标仪检测，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm。
5. 标准曲线绘制及待测样品酶活计算： 
标准品活力单位(U)的log值为横坐标，荧光强度为纵坐标，用GraphPad Prism5做非线性回归曲线。根据待测样品荧光强度，软件即可自动回算出待测样品的酶活(U/μl)。
下面将结合具体实施例来进一步说明本发明。 
实施例1. “荧光法”测定核酸外切酶Ⅰ活性的可行性验证 
M13单链DNA：M13mp18单链DNA (NEB)；
单链RNA引物：M13引物5’-aagccatccgcaaaa-3’;
核酸外切酶Ⅰ：NEB M0293L，来源自重组大肠杆菌(E. coli)菌株，携带克隆自大肠杆菌的核酸外切酶Ⅰ基因。
核酸外切酶Ⅰ反应： 
 
温度 时间
37℃ 30分钟
4℃ 保持
DNA聚合酶反应：
*1-12号管加入对应管号的核酸外切酶Ⅰ反应产物。
温度 时间
72℃ 30分钟
4℃ 保持。
picogreen荧光检测 
向反应产物中加入0.5 μl picogreen染料（invitrogen P11495）；用荧光酶标仪检测，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm。检测结果如下表：
这一结果表明：
a. M13模板/引物复合物可被Taq酶催化聚合反应，生成M13双链DNA；
b. 核酸外切酶Ⅰ可以将单链DNA引物（M13引物）降解。在一定范围内，核酸外切酶Ⅰ的活性与M13模板/引物复合物的量成负相关，而M13模板/引物复合物的量又显然与picogreen荧光强度成正相关，因此核酸外切酶Ⅰ的活性与荧光强度成负相关，这点已被上表的结果所证明。
通过本实施例，我们将核酸外切酶Ⅰ的反应同DNA聚合酶反应偶联起来，可以实现对核酸外切酶Ⅰ活性的快速、简便的表征，为后续核酸外切酶Ⅰ活性的精确测定奠定了基础。本方法的原理如图1所示。 
实施例2. 核酸外切酶Ⅰ活性-荧光强度曲线的绘制及EC50计算 
以2#-12#的核酸外切酶Ⅰ活性单位单位(mU)的log值为横坐标，荧光强度为纵坐标，用GraphPad Prism5做非线性回归曲线。我们发现，这些数据点可以很好地拟合出一条倒S型曲线，如图2所示。
通过多次重复实验并计算曲线的半最大效应浓度 (EC50)，我们发现，EC50值在多次实验间保持稳定： 
实验 EC50 (mU)
1 4.071
2 4.059
3 4.112
4 3.989
5 4.266
 
平均值 (U) 4.10
标准差SD (U) 0.10
变异系数 CV (%) 2.52
因此，这一EC50值可作为本方法即“荧光法”的活性定义。即在实施例1的反应体系中，使荧光强度达到最大值一半的核酸外切酶Ⅰ酶量定义为1个荧光法单位（Fluoresence Unit, FU）；1 FU=4.10 mU。
上面结合附图和具体实施例对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。 

Claims (7)

1. 一种定量核酸外切酶I活性测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：首先提供与单链DNA模板互补的引物，随后加入核酸外切酶I进行外切反应；外切反应后，加入单链DNA模板并退火，形成单链DNA模板/引物复合物；其后加入聚合酶，合成双链DNA；接着测定反应体系中单链或双链DNA的相对量，并由测定结果推导出核酸外切酶I活性程度，其中核酸外切酶I活性程度与反应体系中双链DNA的量成反比。
2. 如权利要求1所述的定量核酸外切酶I活性测定方法，其特征在于，双链DNA或单链DNA的相对量是利用荧光染料，通过荧光法测得的，并且双链DNA或单链DNA的相对量是以荧光强度表示的。
3. 如权利要求2所述的定量核酸外切酶I活性测定方法，其特征在于，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料。
4. 如权利要求3所述的定量核酸外切酶I活性测定方法，其特征在于，所采用的染料是picogreen染料。
5. 如权利要求1所述的定量核酸外切酶I活性测定方法，其特征在于，所采用的单链DNA模板是单链环状DNA模板。
6. 如权利要求5所述的定量核酸外切酶I活性测定方法，其特征在于，所采用的单链DNA模板是M13噬菌体单链DNA。
7. 如权利要求1所述的定量核酸外切酶I活性测定方法，其特征在于，所采用的聚合酶为Taq酶。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108195919A (zh) * 2017-09-22 2018-06-22 北京师范大学 基于酶水解能力的基片表面hp dna发卡构型的定量评测及背景信号消除方法
CN109652501A (zh) * 2017-10-12 2019-04-19 深圳华大智造科技有限公司 一种检测核酸酶对特定碱基3′-5′外切活性的方法和试剂盒
CN110904187A (zh) * 2019-11-05 2020-03-24 翌圣生物科技（上海）有限公司 一种Taq酶活性测定方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HEIDI TVEIT AND TOM KRISTENSEN，: "Fluorescence-Based DNA Polymerase Assay", 《ANAL. BIOCHEM.》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108195919A (zh) * 2017-09-22 2018-06-22 北京师范大学 基于酶水解能力的基片表面hp dna发卡构型的定量评测及背景信号消除方法
CN108195919B (zh) * 2017-09-22 2020-01-03 北京师范大学 基于酶水解能力的基片表面hp dna发卡构型的定量评测及背景信号消除方法
CN109652501A (zh) * 2017-10-12 2019-04-19 深圳华大智造科技有限公司 一种检测核酸酶对特定碱基3′-5′外切活性的方法和试剂盒
CN110904187A (zh) * 2019-11-05 2020-03-24 翌圣生物科技（上海）有限公司 一种Taq酶活性测定方法

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