一种3’-5’外切酶活性测定方法
技术领域
本发明属于生化技术领域,具体来说涉及一种3’-5’外切酶活性测定方法。
背景技术
PfuDNA聚合酶(简称Pfu)是一种来源于嗜热菌强烈炽热球菌(Pyrococcusfuriosus)的高度热稳定的DNA聚合酶。Pfu具有两种活性:5’-3’聚合酶活性以及3’-5’外切酶活性(或称校对活性)。Pfu的3’-5’外切酶活性非常强,可以降解DNA合成链中碱基错配的核苷酸,大大增加了碱基配对的正确率,保证了DNA合成的高度忠实性。因此,该酶是目前耐热DNA聚合酶中保真度最高的酶,适合使用在那些需要高精确度的PCR应用中,包括克隆、基因表达和突变分析。
Pfu的高3’-5’外切酶活性虽然可以带来高的保真度,但同时也会引起一些副作用。3’-5’外切酶活性会降解引物,特别是溶液中没有dNTP的情况下。所以,在配制PCR反应体系时,最好在冰上操作,且Pfu必须是最后加入到反应体系中,并立即进行PCR反应。另外,Pfu扩增产物为平端。如果需要进行TA克隆的话,需要首先将PCR产物纯化,去掉Pfu,再进行加A尾反应;否则,Pfu的3’-5’外切酶活性会将加上的A切掉,导致TA克隆失败。因此,业内一直希望找到一种可逆的封闭Pfu3’-5’外切酶活性的方法,旨在不改变Pfu高保真度的前提下,减少甚至消除3’-5’外切酶活性带来的副作用,以提高Pfu相关应用的便利性。
但是找到在找到相应的封闭活性方法之前,首先要解决的一个问题是如何建立3’-5’外切酶活性的方法。标准的测活方法采用放射性同位素法,即首先合成一条3’末端带3H标记dATP的单链寡核苷酸。3’-5’外切酶活性可将[3H]-dATP切除。再经过TCA沉淀、过滤,通过测定酸可溶性物质中放射性的含量,计算3’-5’外切酶活性。这种方法易产生放射性污染,且步骤多、周期长,难以实现高通量、自动化,因此为筛选带来了困难。
发明内容
本发明建立了一种简便、快速、非放射性的3’-5’外切酶测活方法,利用该方法,可以快速大量的筛选目标产物,为寻找针对该3’-5’外切酶活性的封闭试剂提供了一种可靠简便的途径。
具体来说,本发明采用的技术方案如下:
一种3’-5’外切酶活性测定方法,其特征在于,所述方法包括:首先根据单链模板合成有3’错配的引物,将引物与单链模板混合并退火,接着在该反应液中加入3’-5’外切酶活性进行3’碱基外切反应,然后加入足量没有3’-5’外切酶活性的聚合酶延长引物直至获得双链DNA,随后检测反应体系中双链DNA的相对量,并根据检测结果推导出3’-5’外切酶活性程度。
其中,反应体系中双链DNA的相对量可以通过检测双链DNA的量或者单链DNA的量而得到。
优选地,反应体系中单链DNA的存在量的检测是利用仅与双链DNA或仅与单链DNA结合的荧光染料,更优选采用双链DNA特异性荧光染料,在一个实施方案中,本发明方案中采用的是当前在本领域中已经成熟使用的商购picogreen染料。在此,双链DNA的相对量是以荧光强度表示的。
本发明测定方法中所采用的单链模板可以选用任何适合的单链模板,优选采用环状单链DNA,这样在聚合反应结束后,可以得到闭合的环状双链体,处理技术成熟,并且环状双链体可以避免对后续测量的干扰。在一个优选实施方案中,所采用的单链模板是M13噬菌体单链DNA,简称M13。M13是在生化技术中广泛使用的一种单链DNA载体,因此可以此为基础建立一种标准的测量技术。
所述测定方法中错配引物中3’错配的数目优选是1个。
在一个优选实施方案中,所采用的引物序列是5’-aagccatccgcaaaaatgacctcta-3’,其中加下划线的碱基表示错配碱基。
所加入的没有3’-5’外切酶活性的聚合酶可以采用任何适合的DNA聚合酶,在一个优选实施方案中,所采用的没有3’-5’外切酶活性的聚合酶是指Taq酶。
在另一实施方案中,所要测定的3’-5’外切酶活性是指具有3’-5’外切酶活性的Pfu酶。
本发明的优点:
1.无放射性污染;
2.操作步骤简单快速,无需TCA沉淀、洗涤、干燥、洗脱步骤;可实现高通量、自动化的活性测定;
3.可以用来针对3’-5’外切酶活性进行阻断活性筛选。
附图说明
图1是本发明的测定方法的原理图。
图2是外切酶活性与荧光强度之间的关系图。
具体实施方式
要筛选到针对3’-5’外切酶活性的封闭试剂,例如单克隆抗体,必须首先建立测定3’-5’外切酶活性的方法。标准的测活方法采用放射性同位素法,即首先合成一条3’末端带3H标记dATP的单链寡核苷酸。3’-5’外切酶活性可将[3H]-dATP切除。再经过TCA沉淀、whatman滤纸过滤,通过测定酸可溶性物质中放射性的含量,计算3’-5’外切酶活性。这种方法易产生放射性污染,且步骤多、周期长,难以实现高通量、自动化。
本发明建立了一种简便、快速、非放射性的3’-5’外切酶测活方法,其原理如图1所示。
首先制备一种末端不匹配的模板/引物,例如M13模板/错配引物复合物。3’-5’外切酶活性可将末端不匹配的碱基切除,从而将末端不匹配的模板/引物如M13模板/错配引物复合物转化为末端匹配的模板/引物复合物如M13模板/引物复合物。无3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶可以M13模板/引物复合物为底物,进行聚合反应,生成M13双链DNA。M13双链DNA可被双链特异性的picogreen染料结合,产生荧光。而M13模板/错配引物复合物不能作为无3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶的底物;picogreen染料不能结合单链DNA,从而不能产生荧光。
3’-5’外切酶的活性在一定范围内与M13模板/引物复合物的量成正比;而在DNA聚合酶活性一定的情况下,M13模板/引物复合物的量同荧光强度成正比。因此,本发明将3’-5’外切酶的测活体系同DNA聚合酶测活体系偶联起来。
下面将结合具体实施例来详细说明本发明。
实施例1
1.M13模板/引物复合物的制备:
M13单链DNA:M13mp18单链DNA(NEB);
引物:M13引物5’-aagccatccgcaaaaatgacctct-3’;
M13模板/引物复合物:将M13mp18单链DNA同M13引物按摩尔比1:1混合,在退火缓冲液(10mMTris-HClpH8.0,50mMNaCl)中,70℃加热5分钟后,缓慢降至室温,使模板引物退火。
2.M13模板/错配引物复合物的制备:
M13单链DNA:M13mp18单链DNA(NEB);
引物:M13错配引物5’-aagccatccgcaaaaatgacctcta-3’;(下划线表示该碱基与模板不匹配)
M13模板/错配引物复合物:将M13mp18单链DNA同M13错配引物按摩尔比1:1混合,在退火缓冲液(10mMTris-HClpH8.0,50mMNaCl)中,70℃加热5分钟后,缓慢降至室温,使模板引物退火。
3.3’-5’核酸外切酶反应:
4.DNA聚合酶反应:
*1-12号管加入对应管号的3’-5’外切酶反应产物。
5.picogreen荧光检测
向反应产物中加入0.5μlpicogreen染料(invitrogenP11495);用荧光酶标仪检测,激发波长为480nm,发射波长为520nm。检测结果如下表:
这一结果表明:
a.M13模板/引物复合物可被Taq酶催化聚合反应,生成M13双链DNA(13#);
b.由于M13错配引物的3’末端同M13单链DNA模板是不匹配的,因此Taq酶不能催化其生成M13双链DNA(14#);
c.3’-5’外切酶活性可将末端不匹配的碱基切除,从而将M13模板/错配引物复合物转化为末端匹配的M13模板/引物复合物。在一定范围内,3’-5’外切酶活性与M13模板/引物复合物的量成正相关,而M13模板/引物复合物的量又显然与picogreen荧光强度成正相关,因此3’-5’外切酶的活性与荧光强度成正相关,这点已被上表的结果所证明。
d.15号数值与13号相比没有明显差异,说明聚合酶反应体系中的Taq酶量是足量的;上一步反应带入的Pfu酶的聚合酶活性不会对第二步的反应产生明显影响。因此,最终荧光强度只与3’-5’外切酶活性相关。
通过本实施例,我们将3’-5’外切酶反应同DNA聚合酶反应偶联起来,可以实现对3’-5’外切酶活性的快速、简便的表征,为后续3’-5’外切酶活性的精确测定奠定了基础。本方法的原理如图1所示。
实施例2.3’-5’外切酶活性-荧光强度曲线的绘制及EC50计算
以2#-12#的Pfu活性单位单位(mU)的log值为横坐标,荧光强度为纵坐标,用GraphPadPrism5做非线性回归曲线。我们发现,这些数据点可以很好地拟合出一条S型曲线,如图2所示。
通过多次重复实验并计算曲线的半最大效应浓度(EC50),我们发现,EC50值在多次实验间保持稳定:
平均值 (mU) |
17.75 |
标准差SD (U) |
0.47 |
变异系数 CV (%) |
2.65 |
因此,这一EC50值可作为本方法中Pfu3’-5’外切酶活性定义。即在实施例1的反应体系中,使荧光强度达到最大值一半的酶量定义为1个3’-5’外切酶活性单位(exounit);1exoU=17.75mU(polymeraseunit)。
上面结合附图和具体实例对本发明的实施方式作了详细的说明,但是本发明不限于上述实施方式,在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。