CN104313132A - 一种t4 dna聚合酶活性测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种T4 DNA聚合酶活性测定方法，所述方法包括：在无dNTP存在的情况下，在以双链线性DNA模板为底物的反应体系中加入T4 DNA聚合酶，反应完成后检测双链DNA的相对量，由此测出T4 DNA聚合酶的外切酶活性，并使T4 DNA聚合酶的外切酶活性与聚合酶活性相关，得到T4 DNA聚合酶的聚合酶活性程度。本发明通过便利地测量外切酶活性，利用T4 DNA聚合酶的外切酶活性与聚合酶活性的相关性测量聚合酶活性。与现有技术的方法相比，无放射性污染，操作简单快速，并且克服了外切酶活性对聚合酶活性测定的干扰，得到的结果因此更准确。
Description
技术领域
本发明属于生化技术领域，具体来说涉及一种T4 DNA聚合酶活性测定方法。
背景技术
T4 DNA聚合酶由T4噬菌体聚合酶I基因编码，具有5’-3’聚合酶活性以及3’-5’外切酶活性。T4 DNA聚合酶是基因工程技术中一种重要的工具酶，可用于双链DNA末端的平滑化。在高通量测序（next generation sequencing）文库构建的过程中，片段化的DNA末端首先需要用T4 DNA聚合酶平滑化，再经过T4多聚核苷酸激酶加磷酸后，才能与双链DNA接头进行连接。
标准的T4 DNA聚合酶测活方法采用放射性同位素法。T4 DNA聚合酶可以催化将32P标记的dNTP掺入到小牛胸腺DNA中。经过TCA沉淀、whatman滤纸过滤，通过测定酸不溶性物质中放射性的含量，计算聚合酶活性。这种方法易产生放射性污染，且步骤多、周期长，难以实现高通量、自动化。
Seville等（Biotechniques. 1996 Oct；21(4):664）建立了一种基于荧光的DNA聚合酶活性测定方法，其原理如图1所示。
DNA聚合酶可以M13单链环状DNA为模板催化聚合反应，生成M13双链环状DNA。双链环状DNA产物可以被双链DNA特异性的picogreen染料结合，产生荧光，从而测定DNA聚合酶活性。
但是本发明人发现，这种方式不适用于T4 DNA聚合酶的活性测定。因为T4 DNA聚合酶具有很强的3’-5’外切酶活性，在该测活体系中，3’-5’外切酶活性会在很大程度上抵消聚合酶活性，造成聚合酶活性难以测定。
发明内容
本发明的目的在于建立一种非放射性、简便、快速的外切酶活性测定方法，其原理如图2所示。
具体来说，本发明采用的是以下技术方案：
一种T4 DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：在无dNTP存在的情况下，在以双链线性DNA模板为底物的反应体系中加入T4 DNA聚合酶，反应完成后检测双链DNA的相对量，由此测出T4 DNA聚合酶的外切酶活性，并使T4 DNA聚合酶的外切酶活性与聚合酶活性相关，得到T4 DNA聚合酶的聚合酶活性程度。
优选地，双链DNA的相对量是利用荧光染料，例如仅与双链DNA或仅与单链DNA结合的荧光染料，通过荧光法测得的，并且双链DNA的相对量是以荧光强度表示的。
更优选，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料，更优选为市售的成熟商用荧光染料，例如picogreen染料。
在一个实施方案中，本发明方法中所采用的双链线性DNA模板是以λDNA为底物，在正向和反向引物的存在下通过PCR扩增获得的线性双链DNA，以便建立一种标准的测量方法。
在一个进一步的实施方案中，所用正向引物为5’-aataacgtcggcaactttgg-3’，反向引物为5’-gttacgccaccagtcatcct-3’。
本发明的优点：
1. 无放射性污染；
2. 操作步骤简单快速，无需TCA沉淀、洗涤、干燥、洗脱步骤；可实现高通量、自动化的活性测定。
3. 建立了T4 DNA聚合酶的外切酶活性和聚合酶活性的定量关系，通过方便的测定外切酶活性，克服了外切酶活性对聚合酶活性测定的干扰，测量结果更准确。
附图说明
图1是现有技术中测定DNA聚合酶活性的技术原理图。
图2是本发明的测定T4 DNA聚合酶活性的技术原理图。
图3是现有技术的荧光法测定大肠杆菌pol I和T4 DNA聚合酶获得的荧光酶活曲线图。
图4是利用本发明的方法测定T4 DNA聚合酶获得的荧光酶活曲线图。
图5是不同来源的T4 DNA聚合酶的荧光酶活曲线图。
具体实施方式
在dNTP缺失的情况下，T4 DNA聚合酶失去聚合活性，但保留强的3’-5’外切酶活性，可从双链DNA的两个3’末端向内进行降解，表现出单纯的核酸外切酶的活性。因为T4 DNA聚合酶的聚合酶活性和外切酶活性分属不同结构域，（MICHELLE et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90, pp. 2579-2583, April 1993)，本发明人假设，其聚合酶活性和外切酶活性的比例是一个恒定的值，可以通过测定其外切酶活性来推算出其聚合酶活性。本发明首先建立了一种非放射性、简便、快速的外切酶活性测定方法，其原理如图2所示。
如图所示，在无dNTP存在的情况下，T4 DNA聚合酶可以从双链DNA的3’端开始降解，从而降低双链DNA的量。通过双链特异性的picogreen染料就可以测定T4 DNA聚合酶的外切酶活性。
本发明人进一步证明了上述假设，从而建立了非放射性、简便、快速的T4 DNA聚合酶测定方法。
下面将结合具体实施例来具体说明本发明。
实施例1. 荧光法测定T4 DNA聚合酶的聚合酶活性
M13模板/引物复合物的制备：
M13单链DNA：M13mp18单链DNA (NEB)；
引物：M13引物5’-aagccatccgcaaaaatgacctct-3’；
M13模板/引物复合物：将M13mp18单链DNA同M13引物按摩尔比1:1混合，在退火缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl）中，70℃加热5分钟后，缓慢降至室温，使模板引物退火。
2. 聚合酶反应
3. picogreen荧光检测：
向反应产物中加入0.5 μl picogreen染料（invitrogen P11495）；用荧光酶标仪检测，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm。检测结果如下表：
| 大肠杆菌DNA聚合酶I酶量 (mU) | 荧光数值 |
| 800.00 | 2288. |
| 400.00 | 2199. |
| 200.00 | 2119. |
| 100.00 | 1949. |
| 50.00 | 1673. |
| 25.00 | 1300. |
| 12.50 | 966. |
| 6.25 | 676. |
| 3.13 | 567. |
| 1.56 | 472. |
| 0.78 | 422. |
| 0.39 | 400. |
| 0 | 380 |
| T4 DNA聚合酶I酶量 (mU) | 荧光数值 |
| 800.00 | 512. |
| 400.00 | 475. |
| 200.00 | 485. |
| 100.00 | 431. |
| 50.00 | 376. |
| 25.00 | 321. |
| 12.50 | 347. |
| 6.25 | 376. |
| 3.13 | 328. |
| 1.56 | 379. |
| 0.78 | 356. |
| 0.39 | 366. |
| 0 | 380. |
以聚合酶活性单位(mU)的log值为横坐标，荧光强度为纵坐标，用GraphPad Prism5做非线性回归曲线。如图3所示。
如图3所示，E.coli pol I的活性-荧光强度可以很好的拟合出一条S型曲线，且荧光最大值与最小值的比值大于6，显示了本实施例方法良好的信噪比(S/B, signal/baseline)。而T4 DNA聚合酶由于3’-5’外切酶活性过强，因此在本方法中严重干扰了聚合酶活性的测定，表现为荧光值和信噪比都过低，曲线无法正常拟合(R2<0.99)。因此本实施例方法不适用于T4 DNA聚合酶的聚合酶活性测定。
实施例2. 荧光法测定T4 DNA聚合酶中外切酶活性方法的建立
1.双链DNA底物的制备
引物F：5’-aataacgtcggcaactttgg-3’；
引物R：5’-gttacgccaccagtcatcct-3’；
PCR模板：λ DNA
PCR反应：
| 组分 | 体积 |
| DDW | 至50μl |
| 10x Taq缓冲液 | 5 |
| dNTP (10 mM) | 1μl |
| 引物F (10 μM) | 2μl |
| 引物R (10 μM) | 2μl |
| λ DNA | 10 ng |
| Taq酶 | 1 U |
PCR产物用酚氯仿抽提，乙醇沉淀的方式纯化。纯化的PCR产物用A260测定浓度。
3.外切酶反应：
| 组分 | 体积 |
| DDW | 至50μl |
| 10x T4缓冲液 | 5 |
| PCR产物 | 100 ng |
| T4 DNA聚合酶(NEB M0203) | 0-1024 mU |
| 温度 | 时间 |
| 37℃ | 30分钟 |
| 4℃ | hold |
4. picogreen荧光检测：
向反应产物中加入0.5 μl picogreen染料（invitrogen P11495）；用荧光酶标仪检测，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm。检测结果如下表：
| T4 DNA聚合酶酶量 (mU) | 荧光数值 |
| 1024 | 140. |
| 512 | 173. |
| 256 | 191. |
| 128 | 320. |
| 64 | 500. |
| 32 | 670. |
| 16 | 851. |
| 8 | 1018. |
| 4 | 1122. |
| 2 | 1167. |
| 1 | 1272. |
| 0.5 | 1265. |
| 0 | 1256 |
这一结果表明，双链DNA可被T4 DNA聚合酶的外切酶活性降解，且降解程度呈现剂量依赖性。
以T4 DNA聚合酶活性单位(mU)的log值为横坐标，荧光强度为纵坐标，用GraphPad Prism5做非线性回归曲线。我们发现这些数据点可以很好地拟合出一条倒S型曲线，如图4所示。
通过多次重复实验并计算曲线的半最大效应浓度 (EC50)，我们发现，EC50值在多次实验间保持稳定：
| 实验 | EC50 (mU) |
| 1 | 29.59 |
| 2 | 24.45 |
| 3 | 28.77 |
| 4 | 26.32 |
| 平均值 (U) | 27.28 |
| 标准差SD (U) | 2.03 |
| 变异系数 CV (%) | 7.44 |
实施例3. 不同来源T4 DNA聚合酶活性-荧光强度标准曲线的绘制及“荧光法”活性定义
我们又选择了两种商品化T4 DNA聚合酶并自行表达纯化T4 DNA聚合酶。自制T4 DNA聚合酶克隆自T4噬菌体DNA聚合酶I基因，克隆至pET28a表达载体并转化大肠杆菌BL21进行表达。表达产物采用常规层析方法纯化至约95%的纯度。所有T4 DNA聚合酶活性均用标准放射性同位素掺入法测定。国际单位(IU)定义为：1小时内使1 nmol同位素标记的dATP掺入酸不溶性沉淀物所需的酶量定义为1个单位(U)。按照实施例1的方法，绘制活性-荧光强度标准曲线并计算EC50。结果如下：
| 厂家 | 货号 | EC50 (mU) |
| NEB | M0203 | 27.28±2.03 |
| Takara | 2040A | 24.36±2.13 |
| Enzymatics | P7080L | 29.46±4.08 |
| 自制 | -- | 28.96±3.15 |
| 平均 | 27.52±1.99 |
上述结果表明，不同来源的T4 DNA聚合酶的外切酶活性同聚合酶活性的比例（用EC50表示）是一个恒定的值。因此，这一EC50值可作为本方法的聚合酶活性定义。即在实施例1的反应体系中，使荧光强度达到最大值一半的T4 DNA聚合酶酶量定义为1个荧光法单位（Fluoresence Unit, FU）；1 FU=27.52 mU（放射性法）。
上面结合附图和具体实施例对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (6)
1. 一种T4 DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：在无dNTP存在的情况下，在以双链线性DNA模板为底物的反应体系中加入T4 DNA聚合酶，反应完成后检测双链DNA的相对量，由此测出T4 DNA聚合酶的外切酶活性，并使T4 DNA聚合酶的外切酶活性与聚合酶活性相关，得到T4 DNA聚合酶的聚合酶活性程度。
2. 如权利要求1所述的T4 DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，双链DNA的相对量是利用荧光染料，通过荧光法测得的，并且双链DNA的相对量是以荧光强度表示的。
3. 如权利要求2所述的T4 DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料。
4. 如权利要求3所述的T4 DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，所采用的染料是picogreen染料。
5. 如权利要求1所述的T4 DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，所采用的双链线性DNA模板是以λDNA为底物，在正向和反向引物的存在下通过PCR扩增获得的线性双链DNA。
6. 如权利要求5所述的T4 DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，所用正向引物为5’-aataacgtcggcaactttgg-3’，反向引物为5’-gttacgccaccagtcatcct-3’。
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