CN1482240A - 具有削弱的3′-5′核酸外切酶活性的热稳定性的或热激活性的dna聚合酶分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及带有削弱的3′－5′核酸外切酶(“校正”)活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，用于其合成的方法，其使用的方法，以及含有其的试剂盒。此酶在很多的重组DNA技术特别是通过聚合酶链式反应(PCR)的核酸扩增中是有用的。

Description

具有削弱的3’-5’核酸外切酶活性的 热稳定性的或热激活性的DNA聚合酶分子
发明领域
本发明涉及具有削弱的3’-5’核酸外切酶(“校正”)活性的热稳定性的或热激活性的DNA聚合酶，它们的合成方法，它们的应用方法，和包含它们的试剂盒。其是在许多重组DNA技术，特别是通过聚合酶链式反应(PCR)的核酸扩增中应用的酶。
发明背景
DNA聚合酶以从5’到3’的方向用互补模板DNA链和引物从三磷酸脱氧核苷(核苷酸)在延长链的3’-羟基自由端顺序地增加核苷酸而合成DNA分子。模板链通过Watson-Crick碱基对确定核苷酸增加的顺序。在细胞中，在DNA修补合成和复制中涉及DNA聚合酶。参见，例如Komberg等.，1992，DNA合成，W.H.Freeman，纽约；Alberts等，1994，细胞分子生物学，第三版，Garland出版社，纽约。
许多分子克隆技术和方案都包括由DNA聚合酶在体外反应催化而合成DNA。例如，DNA聚合酶被用于DNA标记和DNA测序反应，使用35S-，32P-，33P-或荧光标记核苷酸。聚合酶链式反应(PCR)技术是一种最通用的广泛使用的DNA合成技术，由美国专利No.4,683,202；4,683,195；4,800,159；和14,965,188公开，PCR策略，1995 Innis等(编著)，学院出版社，中有所讨论，它们全文在此引作参考。
最有特点的DNA聚合酶是大肠杆菌(Escherichia coli)DNA聚合酶I(Eco PolI)。Eco Pol I和一些与其同源的DNA聚合酶具有三种酶的功能：i) 5’-3’核酸外切酶活性，ii)3’-5’核酸外切酶活性，iii)DNA合成活性。后两种功能的克列诺片段(EcoPolIK)位于蛋白的羧基末端。可以用枯草杆菌蛋白酶处理EcoPolI的酶制剂，产生缺少5’-3’核酸外切酶活性的EcoPol IK。参见Brown等1982，生物化学杂志(JBiol.Chem.)，257：1965-72；Joyce等，1982，生物化学杂志，257：1958-64；Joyce等，1983，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)80：1830-34；Klenow等，1970，Pro.Natl.Acad.Sci.USA 65：168-75；Komberg，1974；Setlow，P.等，1972，生物化学杂志，247：224-31；Setlow等，1972，生物化学杂志，247：232-40；Steitz等，1987，蛋白质工程，第20章，pp.227-35，Oxender等(编著).Alan R.Liss，纽约。
Eco Pol I K的晶体结构分析显示为其肽链被折叠成完全不同的两个结构域，较小的区域有200个氨基酸残基，是3’-5’核酸外切酶区域，另一个区域有400个氨基酸残基，是DNA合成区域。参见Ollis等，1985，自然杂志(Nature)313：762-66。3’-5’核酸外切酶活性位点和DNA合成的活性位点大约由30埃分开。参考上述文献。DNA合成活性位点与包含单链5’延申端的双链DNA和三磷酸脱氧核苷(dNTP)连接，而3’-5’核酸外切酶活性位点与单链DNA和单磷酸脱氧核苷(dNMP)连接。参见上述文献。由Bemat等预测大量DNA聚合酶中存在保守的3’-5’核酸外切酶活性位点，1989，细胞(Cell)59：219-28；Blanco等，1992，基因(cell)112：139-44；Reha-Krantz，1992，基因(Gene)112：133-37。
Eco Pol I的DNA合成区域被克隆，表达，并分别表征3’-5’和5’-3’核酸外切酶区域。如上述讨论一样，DNA合成区域包括大约400个氨基酸。在DNA合成区域聚合酶活性比Eco Pol I K中的小50倍。参见Derbyshire等，1993，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，21：5439-48。
来自各种生物体的热稳定性的或热激活性DNA聚合酶已经在文献中被广泛公开了。详细的例子包括来自真菌Thermus的不同种的DNA聚合酶，参见美国专利No.5,466,591，特别是在美国专利No.4,889,818，5,352,600和5,079,352中描述的来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq DNA聚合酶)，来自真菌Thermatoga maritima(Tma DNA聚合酶)的DNA聚合酶在美国专利No.5,374,553和5,420,029中公开。
嗜温的大肠杆菌和嗜热的T.maritima都是真菌。如大肠杆菌的DNA聚合酶I一样，Tma DNA聚合酶具有5’-3’的核酸外切酶活性和3’-5’的核酸外切酶活性。相反，来自Thermus的DNA聚合酶也是嗜热的真菌，但仅具有5’-3’核酸外切酶活性。热稳定和热活性DNA聚合酶和它们的相关活性的综述参见Abramson，1995，PCR策略(PCR Strategies)，Innis等(编著)，学院出版社，Inc。缺少3’-5’核酸外切酶活性的大量的原始的突变体形式，真菌热稳定或热活性DNA聚合酶在美国专利No.6,015,668，5,39,301，5,988,614，5,882,904，5,489,523中公开。
虽然Eco Pol I和Tma DNA聚合酶具有同样的三种酶的活性，和相同的普通域的结构，但它们是非常不同的酶。例如，Eco Pol I和Tma DNA聚合酶具有完全不同的氨基酸序列。特别地，即使当间隙插入到它们的序列中使它们的排列最优化，这两种蛋白的3’-5’核酸外切酶功能域也仅有大约33％相同。而且，这两种酶表现出不同的特异活性和对化学变性条件的抗性不同。从它们的自然体内环境分离的纯化的酶中观察到这些区别，它们一定是酶本身的氨基酸序列的不同而导致的。
初生态DNA链由3’-5’核酸外切酶活性“校正”合成，首先从中除去模板链中错配的核苷酸，从而增加了DNA合成的重现精度。然而，强3’-5’核酸外切酶活性的存在对体外的聚合反应特别是PCR是存在问题的，其中3’-5’核酸外切酶活性的存在降低扩增的效率。参见Bames，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：2216-20。
为了避免3’-5’核酸外切酶活性的有害效应，有人曾尝试应用缺少3’-5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶。Taq聚合酶天然缺少这种活性。其它的DNA聚合酶已经通过基因工程将其消除。参见，如，美国专利No.6,015,668，5,939,301，5,988,614，5,882,904和5,489,523。在这些申请中的酶工作的高复制重现精度是不必须的，例如，在PCR中用于扩增DNA测序反应的模板，大小分析，限制性酶分析和以探针为基础的分析。
然而，其它聚合反应，如，扩增用于克隆的一个DNA片段的PCR，需要较高的保真度水平。在保留3’-5’核酸外切酶活性的优点时又降低与其相关的问题的努力中，使用两种不同的DNA聚合酶的混合物。在混合物中的一种聚合酶具有野生型水平的3’-5’核酸外切酶活性。另一种缺少此活性。这两种聚合酶的比率可以调整为产生所期望的3’-5’核酸外切酶与DNA聚合酶活性的比率。参见Cheng等，1994，Proc.NatlAcad.Sci.USA91：5695-99；Barnes，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：2216-20；Cheng，1995，“更长的PCR扩增”，PCR策略(Innis等，编著)，学院出版社，San Diego 313-24；Cheng等，1995，适用的PCR方法(PCRMeth.Applic.)4：294-98；美国专利No.5,512,462，5,436,149和5,556,772和PCT专利申请公开WO94/26766。这个联合技术可以用来完成3’-5’核酸外切酶活性的期望量的要求，但价格昂贵，必须一步一步地优化组合，从而消耗时间。其要求DNA聚合酶活性和每个酶制剂的3’-5’核酸外切酶活性被仔细地校准，这样才能在正确的剂量下混合这两种聚合酶以产生3’-5’核酸外切酶活性与DNA聚合酶活性的期望比率。故，本领域需要一种快速和经济的方法来产生具有预期的3’-5’核酸外切酶活性水平的，并具有期望的3’-5’核酸外切酶与DNA聚合酶活性的比率的DNA聚合酶试剂。
发明内容
本发明描述了令人惊讶地产生了一种削弱了3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性的DNA聚合酶。这种削弱了3’-5’核酸外切酶活性的酶可以广泛应用于聚合酶反应。
一方面，本发明提供了一种表现为削弱了3’-5’核酸外切酶活性的分离的热稳定性或热激活性的DNA聚合酶。在一个实施方案中，其热稳定性或热激活性聚合酶是一种修饰的热稳定性或热激活性DNA聚合酶。在另一个实施方案中，这种修饰的热稳定性DNA聚合酶是一种突变的热稳定性DNA聚合酶。在另一个实施方案中，这种修饰的热稳定性或热激活性DNA聚合酶所具有的3’-5’核酸外切酶活性是相应的没有修饰的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的活性的大约0.1％到大约65％之间，其中核酸外切酶的活性是由实施例3中的所述的标准试验测定的。在另一个实施方案中，修饰的热稳定性或热激活性DNA聚合酶具有的3’-5’核酸外切酶活性是相应的没有修饰的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的活性的大约1％到大约30％之间。在另一实施方案中，修饰的热稳定性或热激活性DNA聚合酶具有的3’-5’核酸外切酶活性是相应的没有修饰的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的活性的大约3％到大约20％之间。在另一实施方案中，修饰的热稳定性或热激活性DNA聚合酶具有的3’-5’核酸外切酶活性是相应的没有修饰的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的活性的大约3％到大约10％之间。在另一实施方案中，修饰的热稳定性或热激活性DNA聚合酶具有的3’-5’核酸外切酶活性是相应的没有修饰的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的活性的大约3％到大约5％之间。
在另一方面，本发明提供了一种分离的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，其具有6.5个或更少的单位，但大于0，单位(U)/pmol3’-5’核酸外切酶活性，其活性用下述实施例3中的标准试验测定。在一个实施方案中，修饰的热稳定性或热激活性DNA聚合酶具有3’-5’核酸外切酶活性为大约0.4到3.0U/pmol之间。在另一实施方案中，修饰的热稳定性或热激活性DNA聚合酶具有3’-5’核酸外切酶活性为大约0.4到1.6U/pmol之间。
在另一方面，本发明提供了一种分离的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，其中热稳定性或热激活性DNA聚合酶具有5’-3’DNA聚合酶活性和3’-5’核酸外切酶活性，其聚合酶活性和核酸外切酶活性的比率大于1。在一个实施方案中，热稳定性或热激活性DNA聚合酶的5’-3’DNA聚合酶活性与3’-5’核酸外切酶活性的比率大约为3.0到50之间。在另一实施方案中，热稳定性或热激活性DNA聚合酶的5’-3’DNA聚合酶活性与3’-5’核酸外切酶活性的比率大约为6.0到25.0之间。
在另一方面，热稳定性或热激活性DNA聚合酶具有削弱的3’-5’核酸外切酶活性。在一个实施方案中，热稳定性或热激活性DNA聚合酶是一种修饰的热稳定性或热激活性DNA聚合酶。在另一实施方案中，这种修饰的热稳定性DNA聚合酶是一种热稳定性型DNA聚合酶的突变体。
在另一方面，本发明提供一种修饰的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，其中无论是单链DNA还是双链DNA3’-5’核酸外切酶活性均被优先削弱。在一个实施方案中，修饰的热稳定性型DNA聚合酶是一种热稳定性型DNA聚合酶的突变体。
在另一方面，具有削弱的3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶是从嗜热真菌Thermotoga中分离出来的。然而在另一方面，其嗜热真菌是Thermotoga maritima(Tma)。在另一方面，嗜热真菌是Thermotoganeapolitana。
一方面，具有削弱的3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶是从嗜热真菌Thermosipho中分离出来的。在一个实施方案中，嗜热真菌是Thermosipho africanus。
另一方面，具有削弱的3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶是从嗜热真菌Aquifex中分离出来的。在一个实施方案中，其嗜热真菌是Aquifex pyrophilus。在另一实施方案中，其嗜热真菌是Aquifex aeolieus。
另一方面，具有削弱的3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶是从原始嗜热菌Thermococcus中分离出来的。在一个实施方案中，所述原始嗜热菌是Thermococcus barossi。在另一实施方案中，所述原始嗜热菌是Thermococcus litoralis。在另一实施方案中，所述原始嗜热菌是Thermococcusgorgonarius(“Tgo”)。
另一方面，具有削弱的3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶是从原始嗜热菌Pyrococcus中分离出来的。在一个实施方案中，所述原始嗜热菌是Pyrococcus furiosus。在另一实施方案中，所述原始嗜热菌是Pyrococcus sp.GB-D。在另一实施方案中，所述原始嗜热菌是Pyrococcus woesei。在另一实施方案中，所述原始嗜热菌是Pyrococcus abyssi。
另一方面，具有削弱的3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶是从原始嗜热菌Pyrodictium中分离出来的。在一个实施方案中，所述原始嗜热菌是Pyrodictium abyssi。在另一实施方案中，所述原始嗜热菌是Pyrodictium occultum。
另一方面，本方面提供一种分离的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，其包括3’-5’核酸外切酶功能域并具有削弱的3’-5’核酸外切酶活性大约为6.5或更少，但大于0，U/pmol，由实施例3所述的标准试验测定而得，其中所述3’-5’核酸外切酶功能域包括基元序列：
a)一个通式为DX1EX2X3SX4的EXO I基元，其中
D为天冬氨酸残基，
X1为任何氨基酸残基，或没有残基，
E为谷氨酸残基，
X2为任何氨基酸残基，
X3为任何氨基酸残基，
S为丝氨酸残基，和
X4为任何氨基酸残基，或
b)一个通式为X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO：1)的EXO II基元，其中
X5为任何氨基酸残基，
X6为任何氨基酸残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为任何氨基酸残基，
X9为苯丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为任何氨基酸残基，
X11为任何氨基酸残基，
X12为任何氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，和
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基，或
c)一个通式为DX15X16X17X18X19YX20X21X22X23(SEQ ID NO：2)的EXO IIa基元，其中
D为天冬氨酸残基，
X15为脯氨酸，丙氨酸，亮氨酸或苏氨酸残基，
X16为亮氨酸或甲硫氨酸残基，
X17为亮氨酸或异亮氨酸残基，
X18为任何氨基酸残基，
X19为丙氨酸或丝氨酸残基，
Y为酪氨酸残基，
X20为亮氨酸，异亮氨酸或缬氨酸残基，
X21为亮氨酸或色氨酸残基，
X22为天冬氨酸残基，天冬酰胺残基，谷氨酸残基或谷氨酰胺残基，和
X23为脯氨酸或丝氨酸残基，或
d)一个通式为X24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34X35X36(SEQ ID NO：3)的EXO III基元，其中
X24为脯氨酸或丙氨酸残基，
X25为任何氨基酸残基，
X26为谷氨酸，天冬氨酸或脯氨酸残基，
X27为赖氨酸，精氨酸或谷氨酸残基，
X28为任何氨基酸残基，
X29为任何氨基酸残基，
X30为谷氨酸，精氨酸或天冬酰胺残基，
X31为任何氨基酸残基，
X32为丝氨酸，丙氨酸或半胱氨酸残基，
X33为任何氨基酸残基，
 X34为谷氨酸或苏氨酸残基，
 X35为任何氨基酸残基，和
 X36为丙氨酸残基。
另一方面，本发明提供一种分离的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，其包括3’-5’核酸外切酶功能域并且具有5’-3’聚合酶活性和削弱的3’-5’核酸外切酶活性，其中用实施例3中的聚合酶试验测定的5’-3’聚合酶活性的U/pmol，与由实施例3所述的标准试验测定的3’-5’核酸外切酶活性的U/pmol之比，大约在1到100之间，所述的3’-5’核酸外切酶的功能域包括序列基元：
a)一个通式为DX1EX2X3SX4的EXOI基元，其中
D为天冬氨酸残基，
X1为任何氨基酸残基，或没有残基，
E为谷氨酸残基，
X2为任何氨基酸残基，
X3为任何氨基酸残基，
S为丝氨酸残基，和
X4为任何氨基酸残基，或
b)一个通式为X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO：1)的EXOII基元，其中
X5为任何氨基酸残基，
X6为任何氨基酸残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为任何氨基酸残基，
X9为苯丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为任何氨基酸残基，
X11为任何氨基酸残基，
X12为任何氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，和
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基，或
c)一个通式为DX15X17X18X19YX20X21X22X23(SEQ ID NO：2)的EXO IIa基元，其中
D为天冬氨酸残基，
X15为脯氨酸，丙氨酸，亮氨酸或苏氨酸残基，
X16为亮氨酸或甲硫氨酸残基，
X17为亮氨酸或异亮氨酸残基，
X18为任何氨基酸残基，
X19为丙氨酸或丝氨酸残基，
Y为酪氨酸残基，
X20为亮氨酸，异亮氨酸或缬氨酸残基，
X21为亮氨酸或色氨酸残基，
X22为天冬氨酸残基，天冬酰胺残基，谷氨酸残基或谷氨酰胺残基，和
X23为脯氨酸或丝氨酸残基，或
d)一个通式为X24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34X35X36(SEQ ID NO：3)的EXO III基元，其中
X24为脯氨酸或丙氨酸残基，
X25为任何氨基酸残基，
X26为谷氨酸，天冬氨酸或脯氨酸残基，
X27为赖氨酸，精氨酸或谷氨酸残基，
X28为任何氨基酸残基，
X29为任何氨基酸残基，
X30为谷氨酸，精氨酸或天冬酰胺残基，
X31为任何氨基酸残基，
X32为丝氨酸，丙氨酸或半胱氨酸残基，
X33为任何氨基酸残基，
X34为谷氨酸或苏氨酸残基，
X35为任何氨基酸残基，和
X36为丙氨酸残基。
另一方面，本发明提供了一种修饰的热稳定性和热激活性DNA聚合酶，其中所述修饰的聚合酶包括3’-5’核酸外切酶功能域，热稳定性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性是修饰前的大约0.1％到65％，所述的3’-5’核酸外切酶功能域包括序列基元：
a)一个通式为DX1EX2X3SX4的EXOI基元，其中
D为天冬氨酸残基，
X1为任何氨基酸残基，或没有残基，
E为谷氨酸残基，
X2为任何氨基酸残基，
X3为任何氨基酸残基，
S为丝氨酸残基，和
X4为任何氨基酸残基，或
b)一个通式为X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO：1)的EXO II基元，其中
X5为任何氨基酸残基，
X6为任何氨基酸残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为任何氨基酸残基，
X9为苯丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为任何氨基酸残基，
X11为任何氨基酸残基，
X12为任何氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基，或
c)一个通式为DX15X16X17X18X19YX20X21X22X23(SEQ ID NO：2)的EXO IIa基元，其中
D为天冬氨酸残基，
X15为脯氨酸，丙氨酸，亮氨酸或苏氨酸残基，
X16为亮氨酸或甲硫氨酸残基，
X17为亮氨酸或异亮氨酸残基，
X18为任何氨基酸残基，
X19为丙氨酸或丝氨酸残基，
Y为酪氨酸残基，
X20为亮氨酸，异亮氨酸或缬氨酸残基，
X21为亮氨酸或色氨酸残基，
X22为天冬氨酸残基，天冬酰胺残基，谷氨酸残基或谷氨酰胺残基，和
X23为脯氨酸或丝氨酸残基，或
d)一个通式为X24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34X35X36(SEQ ID NO：3)的EXO III基元，其中
X24为脯氨酸或丙氨酸残基，
X25为任何氨基酸残基，
X26为谷氨酸，天冬氨酸或脯氨酸残基，
X27为赖氨酸，精氨酸或谷氨酸残基，
X28为任何氨基酸残基，
X29为任何氨基酸残基，
X30为谷氨酸，精氨酸或天冬酰胺残基，
X31为任何氨基酸残基，
X32为丝氨酸，丙氨酸或半胱氨酸残基，
X33为任何氨基酸残基，
X34为谷氨酸或苏氨酸残基，
X35为任何氨基酸残基，和
X36为丙氨酸残基。
一方面，本发明分离的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括符合上述通式的特定氨基酸残基任意重组的EXO I，EXO II，EXO IIa，或EXO III功能域。
另一方面，本发明分离的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括在氨基末端到羧基末端的顺序为至少两组，三组或一组所述的序列基元(a)，(b)，(c)和(d)。
另一方面，本发明修饰的热稳定性和热激活性DNA聚合酶包括3’-5’核酸外切酶功能域并且具有用下面的实施例3的标准试验测定的大约6.5或更少，但大于0，U/pmol的削弱的3’-5’核酸外切酶活性，其中所述的3’-5’核酸外切酶功能域与图1A强调的3’-5’核酸外切酶功能域(SEQ ID NO：85)序列同一性大于约80％但小于100％。
另一方面，本发明修饰的热稳定性和热激活性DNA聚合酶包括3’-5’核酸外切酶功能域并且具有用下面的实施例3的标准试验测定的大约6.5或更少，但大于0 U/pmol的削弱的3’-5’核酸外切酶活性，其中所述的修饰的DNA聚合酶与图1A(SEQ ID NO：85)的序列的序列同一性大于约80％但小于100％。
另一方面，本发明修饰的热稳定性和热激活性DNA聚合酶包括3’-5’核酸外切酶功能域并且具有用下面的实施例3的标准试验测定的大约6.5或更少，但大于0，U/pmol的削弱的3’-5’核酸外切酶活性，其中所述的3’-5’核酸外切酶功能域与未被修饰的The DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶的功能域的序列同一性大于约80％但小于100％。在一个实施方案中，未被修饰的Tne DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶的功能域包括图2所显示的序列(SEQ ID NO：88)。
另一方面，本发明修饰的热稳定性和热激活性DNA聚合酶包括3’-5’核酸外切酶功能域并且具有下面实施例3的标准试验测定的大约6.5或更少，但大于0，U/pmol的削弱的3’-5’核酸外切酶活性，其中所述的DNA聚合酶与未被修饰的Tne DNA聚合酶的氨基酸序列的序列同一性大于约80％但小于100％。未被修饰的Tne DNA聚合酶的氨基酸序列可以，例如，包括美国专利No.5,948,614提供的Tne聚合酶的氨基酸序列。
另一方面，本发明修饰的热稳定性和热激活性DNA聚合酶包括3’-5’核酸外切酶功能域并且具有用下面的实施例3的标准试验测定的大约6.5或更少，但大于0，U/pmol的削弱的3’-5’核酸外切酶活性，其中所述的3’-5’核酸外切酶功能域与未被修饰的Taf DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域的序列同一性大于约80％但小于100％。在一个实施方案中，未被修饰的Taf DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶的功能域包括图3所显示的序列(SEQ ID NO：89)。
另一方面，本发明修饰的热稳定性和热激活性DNA聚合酶包括3’-5’核酸外切酶功能域并且具有用下面的实施例3的标准试验测定的大约6.5或更少，但大于0，U/pmol的削弱的3’-5’核酸外切酶活性，其中所述的DNA聚合酶与未被修饰的Taf DNA聚合酶的氨基酸序列的序列同一性大于约80％但小于100％。未被修饰的Taf DNA聚合酶的氨基酸序列可以，例如，包括美国专利No.5,968,799提供的TafDNA聚合酶的氨基酸序列。
另一方面，本发明热稳定性和热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXO I基元，其中
DX1EX2X3SX4，其中
D为天冬氨酸残基，
X1为任何氨基酸残基，或没有残基，
E为谷氨酸残基，
X2为苏氨酸残基，
X3为任何氨基酸残基，
S为丝氨酸残基，和
X4为任何氨基酸残基(SEQ ID NO：4)；
或其中
D为天冬氨酸残基，
X1为任何氨基酸残基，或没有残基，
E为谷氨酸残基，
X2为苏氨酸残基，
X3为苏氨酸残基，
S为丝氨酸残基，和
X4为亮氨酸残基(SEQ ID NO：5)；
或其中
D为天冬氨酸残基，
X1为任何氨基酸残基，或没有残基，
E为谷氨酸残基，
X2为苏氨酸残基，
X3为任何氨基酸残基，
S为丝氨酸残基，和
X4为亮氨酸残基(SEQ ID NO：6)；
或其中
D为天冬氨酸残基，
X1为任何氨基酸残基，或没有残基，
E为谷氨酸残基，
X2为任何氨基酸残基，
X3为任何氨基酸残基，
S为丝氨酸残基，和
X4为亮氨酸残基(SEQ ID NO：7)；
或其中
D为天冬氨酸残基，
X1为任何氨基酸残基，或没有残基，
E为谷氨酸残基，
X2为任何氨基酸残基，
X3为苏氨酸残基，
S为丝氨酸残基，和
X4为亮氨酸残基(SEQ ID NO：8)；
或其中
D为天冬氨酸残基，
X1为亮氨酸残基，
E为谷氨酸残基，
X2为苏氨酸残基，
X3为丝氨酸残基，
S为丝氨酸残基，和
X4为亮氨酸残基(SEQ ID NO：9)；
另一方面，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXO II基元，其中
X5为任何氨基酸残基，
X6为任何氨基酸残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为赖氨酸残基，
X9为苯丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为任何氨基酸残基，
X11为任何氨基酸残基，
X12为任何氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基(SEQ ID NO：10)；
或其中
X5为无电荷的极性残基，
X6为任何氨基酸残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为赖氨酸残基，
X9为苯丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为任何氨基酸残基，
X11为任何氨基酸残基，
X12为任何氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基(SEQ ID NO：11)；
或其中
X5为无电荷的极性残基，
X6为无电荷的极性残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为赖氨酸残基，
X9为苯丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为任何氨基酸残基，
X11为任何氨基酸残基，
X12为任何氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基(SEQ ID NO：12)；
或其中
X5为无电荷的极性残基，
X6为无电荷的极性残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为赖氨酸残基，
X9为苯丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为酸性残基，
X11为任何氨基酸残基，
X12为任何氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基(SEQ D NO：13)；
或其中
X5为无电荷的极性残基，
X6为无电荷的极性残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为赖氨酸残基，
X9为苯丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为酸性残基，
X11为任何氨基酸残基，
X12为任何氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基(SEQ ID NO：14)；
或其中
X5为谷氨酰胺残基，
X6为天冬酰胺残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为赖氨酸残基，
X9为苯丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为天冬氨酸残基，
X11为任何氨基酸残基，
X12为任何氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基(SEQ ID NO：15)；
或其中
X5为谷氨酰胺残基，
X6为天冬酰胺残基，
X7为亮氨酸残基，
X8为赖氨酸残基，
X9为苯丙氨酸残基，
X10为天冬氨酸残基，
X11为酪氨酸残基，
X12为赖氨酸残基，
X13为缬氨酸残基和，
X14为亮氨酸残基(SEQ ID NO：16)；
另一方面，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXO II基元，其中X5是一种无极性的残基，如丙氨酸残基。在一个实施方案中，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXO II基元，其中X8是赖氨酸残基。在另一实施方案中，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXO II基元，其中X5是一个无极性的残基并且X8是赖氨酸残基。
另一方面，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXO II基元，其中：
X5为无极性的残基，
X6为不带电荷的极性残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为赖氨酸残基，
X9为苯丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为酸性残基，
X11为任何氨基酸残基，
X12为任何氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，和
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基(SEQ ID NO：17)；
或其中
X5为丙氨酸残基，
X6为不带电荷的极性残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为赖氨酸残基，
X9为苯丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为酸性残基，
X11为任何氨基酸残基，
X12为任何氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，和
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基(SEQ ID NO：18)；
或其中
X5为丙氨酸残基，
X6为天冬酰胺残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为赖氨酸残基，
X9为苯丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为天冬氨酸残基，
X11为任何氨基酸残基，
X12为任何氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，和
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基(SEQ ID NO：19)。
另一方面，本发明的热稳定性或热激活性的DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXO II基元，其中
X5为丙氨酸残基，
X6为天冬酰胺残基，
X7为亮氨酸残基，
X8为赖氨酸残基，
X9为苯丙氨酸残基，
X10为天冬氨酸残基，
X11为酪氨酸残基，
X12为赖氨酸残基，
X13为缬氨酸残基，和
X14为亮氨酸残基(SEQ ID NO：20)。
在一个实施方案中，这样一种热稳定性或热激活性DNA聚合酶包括由Q384A突变株修饰的图4A所描述的3’-5’核酸外切酶功能域的氨基酸序列(SEQID NO：96)。在另一实施方案中，这样一种热稳定性或热激活性DNA聚合酶包括由Q384A突变株修饰的图4A所描述的氨基酸序列(SEQ ID NO：97)。
另一方面，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXO II基元，其中X6是非极性的氨基酸残基。
另一方面，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXO II基元，其中
X5为无电荷的极性残基，
X6为非极性残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为赖氨酸残基，
X9为苯丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为酸性残基，
X11为任何氨基酸残基，
X12为任何氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，和
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基(SEQ ID NO：21)；
或其中
X5为谷氨酰胺残基，
X6为丙氨酸残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为赖氨酸残基，
X9为苯丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为天冬氨酸残基，
X11为任何氨基酸残基，
X12为任何氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，和
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基(SEQ ID NO：22)。
另一方面，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXO II基元，其中
X5为谷氨酰胺残基，
X6为丙氨酸残基，
X7为亮氨酸残基，
X8为赖氨酸残基，
X9为苯丙氨酸残基，
X10为天冬氨酸残基，
X11为酪氨酸残基，
X12为赖氨酸残基，
X13为缬氨酸残基，和
X14为亮氨酸残基(SEQ ID NO：23)。
在一个实施方案中，这样一种热稳定性或热激活性DNA聚合酶包括由N385A突变株修饰的图4A所描述的3’-5’核酸外切酶功能域的氨基酸序列(SEQID NO：98)。在另一实施方案中，这样一种热稳定性或热激活性DNA聚合酶包括由N385A突变株修饰的图4A所描述的氨基酸序列(SEQ ID NO：99)。
另一方面，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXO II基元，其中X10是谷氨酸残基。
另一方面，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXOII基元，其中
X5为无电荷的极性残基，
X6为无电荷的极性残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为赖氨酸残基，
X9为苯丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为谷氨酸残基，
X11为任何氨基酸残基，
X12为任何氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，和
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基(SEQ ID NO：24)；
或其中
X5为谷氨酰胺残基，
X6为天冬酰胺残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为赖氨酸残基，
X9为苯丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为谷氨酸残基，
X11为任何氨基酸残基，
X12为任何氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，和
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基(SEQ ID NO：25)。
另一方面，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXOII基元，其中
X5为谷氨酰胺残基，
X6为天冬酰胺残基，
X7为亮氨酸残基，
X8为赖氨酸残基，
X9为苯丙氨酸残基，
X10为谷氨酸残基，
X11为酪氨酸残基，
X12为赖氨酸残基，
X13为缬氨酸残基，和
X14为亮氨酸残基(SEQ ID NO：26)。
在一个实施方案中，这样一种热稳定性或热激活性DNA聚合酶包括由D389E突变株修饰的图4A所描述的3’-5’核酸外切酶功能域的氨基酸序列(SEQ IDNO：159)。在另一实施方案中，这样一种热稳定性或热激活性DNA聚合酶包括由D389E突变株修饰的图4A所描述的氨基酸序列(SEQ ID NO：175)。
另一方面，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXOII基元，其中X10是谷氨酸残基。
另一方面，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXOII基元，其中X5是一种非极性残基，X6是一种非极性残基。
另一方面，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXOII基元，其中
X5为非极性残基，
X6为非极性残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为赖氨酸残基，
X9为苯丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为酸性残基，
X11为任何氨基酸残基，
X12为任何氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，和
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基(SEQ ID NO：27)；
或其中
X5为丙氨酸残基，
X6为丙氨酸残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为赖氨酸残基，
X9为苯丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为天冬氨酸残基，
X11为任何氨基酸残基，
X12为任何氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，和
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基(SEQ ID NO：28)。
另一方面，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXO II基元，其中
X5为丙氨酸残基，
X6为丙氨酸残基，
X7为亮氨酸残基，
X8为赖氨酸残基，
X9为苯丙氨酸残基，
X10为天冬氨酸残基，
X11为酪氨酸残基，
X12为赖氨酸残基，
X13为缬氨酸残基，和
X14为亮氨酸残基(SEQ ID NO：29)。
在一个实施方案中，这样一种热稳定性或热激活性DNA聚合酶包括由Q384AN385A双突变株修饰的图4A所描述的3’-5’核酸外切酶功能域的氨基酸序列(SEQ ID NO：100)。在另一实施方案中，这样一种热稳定性或热激活性DNA聚合酶包括由Q3 84AN385A双突变株修饰的图4A所描述的氨基酸序列(SEQID NO：101)。
另一方面，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXO IIA基元，其中
D为天冬氨酸残基，
X15为苏氨酸残基，
X16为甲硫氨酸残基，
X17为异亮氨酸残基，
X18为丙氨酸残基，
X19为丙氨酸残基，
Y为酪氨酸残基，
X20为亮氨酸残基，
X21为亮氨酸残基，
X22为谷氨酸残基，和
X23为脯氨酸残基(SEQ ID NO：30)。
另一方面，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXOIII基元，如上所述，其中X35是酸性氨基酸残基。
另一方面，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXOIII基元，其中
X24为脯氨酸残基，
X25为缬氨酸，亮氨酸或异亮氨酸残基，
X26为谷氨酸，天冬氨酸或脯氨酸残基，
X27为赖氨酸，精氨酸残基，
X28为丙氨酸或缬氨酸残基，
X29为丙氨酸或缬氨酸残基，
X30为谷氨酸，或天冬酰胺残基，
X31为无电荷的极性氨基酸残基，
X32为丝氨酸或半胱氨酸残基，
X33为半胱氨酸或氨基乙酸残基，
X34为谷氨酸或苏氨酸残基，
X35为天冬氨酸残基，和
X36为丙氨酸残基(SEQ ID NO：31)，
或其中
X24为脯氨酸残基，
X25为缬氨酸残基，
X26为谷氨酸残基，
X27为赖氨酸残基，
X28为丙氨酸残基，
X29为丙氨酸残基，
X30为天冬酰胺残基，
X31为酪氨酸残基，
X32为丝氨酸残基，
X33为半胱氨酸残基，
X34为谷氨酸残基，
X35为天冬氨酸残基，和
X36为丙氨酸残基(SEQ ID NO：32)。
另一方面，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXO III基元，其中X31是非极性的残基。在一个实施方案中，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXOIII基元，其中X31是非极性的残基，X35是酸性残基。
一方面，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXOIII基元，其中
X24为脯氨酸残基，
X25为缬氨酸，亮氨酸或异亮氨酸残基，
X26为谷氨酸，天冬氨酸或脯氨酸残基，
X27为赖氨酸，或精氨酸残基，
X28为丙氨酸或缬氨酸残基，
X29为丙氨酸或缬氨酸残基，
X30为谷氨酸或天冬酰胺残基，
X31为非极性残基，
X32为丝氨酸或半胱氨酸残基，
X33为半胱氨酸或氨基乙酸残基，
X34为谷氨酸或苏氨酸残基，
X35为天冬氨酸残基，和
X36为丙氨酸残基(SEQ ID NO：33)。
一方面，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能域包括一个EXOIII基元，其中
X24为脯氨酸残基，
X25为缬氨酸残基，
X26为谷氨酸残基，
X27为赖氨酸残基，
X28为丙氨酸残基，
X29为丙氨酸残基，
X30为天冬酰胺残基，
X31为丙氨酸残基，
X32为丝氨酸残基，
X33为半胱氨酸残基，
X34为谷氨酸残基，
X35为天冬氨酸残基，和
X36为丙氨酸残基(SEQ ID NO：34)。
另一方面，本发明提供了一种具有削弱的3’-5’核酸外切酶的嵌合热稳定性或热激活性DNA聚合酶，所述的聚合酶包括氨基末端部分和羧基末端部分，氨基末端部分从第一DNA聚合酶的氨基末端部分衍生，羧基末端部分从第二DNA聚合酶衍生。在一个实施方案中，所述的带有减弱的3`-5`核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶含有衍生自第一个热稳定性或热激活性DNA聚合酶的氨基末端部分的氨基末端部分以及衍生自第二个热稳定性或热激活性DNA聚合酶的羧基端部分的羧基末端部分，所述第二聚合酶优选的是显示3`-5`核酸外切酶活性的。在另外一个实施方案中，上述的被削弱了3’-5’核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，上述的氨基端和/或羧基端部分衍生于栖热菌属(Thermus)种的一种DNA聚合酶。在另一个实施方案中，上述的被削弱了3’-5’核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，上述的氨基端和/或羧基端部分衍生于栖热袍菌属(Thermotoga)种的一种DNA聚合酶。在另一个实施方案中，上述的被削弱了3’-5’核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，上述的氨基端和/或羧基端部分或另一部分衍生于栖热菌属种的一种DNA聚合酶，并且,其它的末端部分或另一部分衍生于栖热袍菌属种的一种DNA聚合酶；例如，在一个实施方案中，氨基端部分衍生于栖热菌属种的一种DNA聚合酶，羧基端部分衍生于栖热袍菌属种的一种DNA聚合酶。在另一个实施方案中，上述的被削弱了3’-5’核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，氨基端部分来源于栖热菌属种并含有一个5’-3’核酸外切酶结构域，羧基端部分来源于栖热袍菌属种并含有一个3’-5’核酸外切酶结构域和一个聚合酶结构域。在另一个实施方案中，上述的被削弱了3’-5’核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，氨基端部分来源于栖热菌属种并含有一个5’-3’核酸外切酶结构域而且与来源于栖热菌属种的DNA聚合酶的相应氨基端部分有高于约80％的序列同一性，上述的羧基端部分与来源于栖热袍菌属种的DNA聚合酶的相应羧基端部分有高于约80％低于100％的序列同一性。在另一个实施方案中，上述的栖热菌属种为Thermus sp.Z05，上述的栖热袍菌属种为海栖热袍菌(Thermotoga maritima)。在另一个实施方案中，嵌合热稳定性或热激活性DNA聚合酶包含如图所示被一个或多个突变所修饰的图4的氨基酸序列(SEQ ID NO：90)。在另一个实施方案中，嵌合热稳定性或热激活性DNA聚合酶包含如图所示被一个或多个突变所修饰的图5的氨基酸序列(SEQID NO：107)。在另一个实施方案中，嵌合热稳定性或热激活性的被削弱了3’-5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶包含一个氨基端部分，一个中间部分，和一个羧基端部分。在另一个实施方案中，上述的被削弱了3’-5’核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，氨基端部分含有一个5’-3’核酸外切酶结构域。在另一个实施方案中，上述的被削弱了3’-5’核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，中间部分含有一个3’-5’核酸外切酶结构域。在另一个实施方案中，上述的被削弱了3’-5’核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，羧基端部分包含了一个聚合酶结构域。在另外一个实施方案中，上述的被削弱了3’-5’核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，氨基端和羧基端部分衍生自来源于栖热菌属种的一种聚合酶。在另一个实施方案中，上述的被削弱了3’-5’核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，氨基端和/或羧基端与来源于栖热菌属种的聚合酶的相应氨基端和/或羧基端部分有高于80％的序列同一性。在另外一个实施方案中，上述的被削弱了3’-5’核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，中间部分衍生自来源于栖热袍菌属种的一种聚合酶。在另一个实施方案中，上述的被削弱了3’-5’核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，中间部分与来源于栖热袍菌属种的相应聚合酶有高于80％低于100％的序列同一性。在另外一个实施方案中，上述的被削弱了3’-5’核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，氨基端和羧基端部分衍生自来源于栖热菌属种的一种聚合酶，并且中间部分来源于栖热袍菌属种。在另一个实施方案中，上述的被削弱了3’-5’核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，栖热菌属种为Thermussp.Z05，栖热袍菌属种为海栖热袍菌。在另一个实施方案中，嵌合热稳定性或热激活性DNA聚合酶包含如图所示被一个或多个突变所修饰的图6的氨基酸序列(SEQ DNO：130)。在另一个实施方案中，嵌合热稳定性或热激活性DNA聚合酶包含如图所示被一个或多个突变所修饰的图7的氨基酸序列(SEQ IDNO：148)。
在其它方面，本发明分离的热稳定性或热激活性DNA聚合酶用如下实施例3所述的标准试验测得其表现出大约6.5或更少但大于0，U/pmol的削弱的3’-5’核酸外切酶活性，其与未修饰的Tma DNA聚合酶的3’-5核酸外切酶结构域有高于约80％低于100％的序列同一性。在一个实施方案中，本发明分离的热稳定性或热激活性DNA聚合酶用如下实施例3所述的标准试验测得其表现出大约6.5或更少但大于0U/pmol的削弱的3’-5’核酸外切酶活性，其与未修饰的Tma DNA聚合酶有高于约80％低于100％的序列同一性。未修饰的Tma DNA聚合酶的氨基酸序列比如可以包含图1A的氨基酸序列(SEQ ID NO：85)。
在其它方面，本发明分离的热稳定性或热激活性DNA聚合酶用如下实施例3所述的标准试验测得其表现出大约6.5或更少但大于0U/pmol的削弱的3’-5’活性，其与未修饰的Tne DNA聚合酶的3’-5核酸外切酶结构域有高于约80％低于100％的序列同一性。在一个实施方案中，未修饰的Tne DNA聚合酶的3’-5核酸外切酶结构域包含图2所示的序列(SEQ ID NO：88)。在另一个实施方案中，本发明分离的热稳定性或热激活性DNA聚合酶用如下实施例3所述的标准试验测得其表现出大约6.5或更少但大于0U/pmol的削弱的3’-5’活性，其与未修饰的Tne DNA聚合酶有高于约80％低于100％的序列同一性。未修饰的Tne DNA聚合酶的氨基酸序列比如可以包含公开于美国专利No.5948614的一种TneDNA聚合酶的氨基酸序列。
在其它方面，本发明分离的热稳定性或热激活性DNA聚合酶用如下实施例3所述的标准试验测得其表现出大约6.5或更少但大于0U/pmol的削弱的3’-5’活性，其与未修饰的TafDNA聚合酶的3’-5核酸外切酶结构域有高于约80％低于100％的序列同一性。在一个实施方案中，未修饰的Taf DNA聚合酶的3’-5核酸外切酶结构域包含图3所示的序列(SEQ ID NO：89)。在另一个实施方案中，本发明分离的热稳定性或热激活性DNA聚合酶用如下实施例3所述的标准试验测得其表现出大约6.5或更少但大于0U/pmol的削弱的3’-5’活性，其与未修饰的Taf DNA聚合酶有高于约80％低于100％的序列同一性。未修饰的Taf DNA聚合酶的氨基酸序列比如可以包含公开于美国专利No.5,968,799的一种TafDNA聚合酶的氨基酸序列。
在其它方面，本发明提供了分离的具有表现出削弱的3’-5’活性的3’-5’核酸外切酶结构域的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，其中，用U/pmol表示的5’-3’聚合酶活性与用U/pmol表示的3’-5’核酸外切酶活性的比值介于约1到100之间，两种酶的活性测定采用下面实施例3所描述的方法，而且，3’-5’核酸外切酶结构域与未修饰的Tma DNA聚合酶的3’-5核酸外切酶结构域有高于约80％低于100％的序列同一性。在一个实施方案中，本发明提供了分离的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，其与未修饰的Tma DNA聚合酶有高于约80％低于100％的序列同一性，其中，用U/pmol表示的5’-3’聚合酶活性与用U/pmol表示的3’-5’核酸外切酶活性的比值介于约1到100之间，两种酶的活性测定采用下面实施例3所描述的方法。未修饰的Tma DNA聚合酶的氨基酸序列比如可以包含图1A的氨基酸序列(SEQ ID NO：85)。
在其它方面，本发明分离的热稳定性或热激活性DNA聚合酶具有3’-5’核酸外切酶结构域并且表现出削弱的3’-5’活性，其中，用U/pmol表示的5’-3’聚合酶活性与用U/pmol表示的3’-5’核酸外切酶活性的比值介于约1到100之间，两种酶的活性测定采用下面实施例3所描述的方法，而且，3’-5’核酸外切酶结构域与未修饰的Tne DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶结构域有高于约80％低于100％的序列同一性。在一个实施方案中，未修饰的Tne DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶结构域包含图2所示的序列(SEQ ID NO：88)。在另一个实施方案中，本发明分离的热稳定性或热激活性DNA聚合酶表现削弱的3’-5’活性，其中，用U/pmol表示的5’-3’聚合酶活性与用U/pmol表示的3’-5’核酸外切酶活性的比值介于约1到100之间，两种酶的活性测定采用下面实施例3所描述的方法，所述聚合酶与未修饰的Tne DNA聚合酶有高于约80％低于100％的序列同一性。未修饰的Tne DNA聚合酶的氨基酸序列比如可以包含公开于美国专利No.5,948,614的一种Tne聚合酶的氨基酸序列。
在其它方面，本发明分离的热稳定性或热激活性DNA聚合酶具有3’-5’核酸外切酶结构域并且表现削弱的3’-5’活性，其中，用U/pmol表示的5’-3’聚合酶活性与用U/pmol表示的3’-5’核酸外切酶活性的比值介于约1到100之间，两种酶的活性测定采用下面实施例3所描述的方法，而且，3’-5’核酸外切酶结构域与未修饰的Taf DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶结构域有高于约80％低于100％的序列同一性。在一个实施方案中，未修饰的Taf DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶结构域包含图3所示的序列(SEQ ID NO：89)。在另一个实施方案中，本发明分离的热稳定性或热激活性DNA聚合酶表现削弱的3’-5’活性，其中，用U/pmol表示的5’-3’聚合酶活性与用U/pmol表示的3’-5’核酸外切酶活性的比值介于约1到100之间，两种酶的活性测定采用下面实施例3所描述的方法，所述聚合酶与未修饰的Taf DNA聚合酶有高于约80％低于100％的序列同一性。未修饰的Taf DNA聚合酶包含公开于美国专利No.5,968,799中提供的一种TafDNA聚合酶的氨基酸序列。
在其它方面，本发明提供了包含表现出削弱的3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的混合物。在一个实施方案中，该混合物用如下实施例3所述的标准试验测得具有大约6.5或更少但大于0U/pmol的削弱的3’-5’核酸外切酶活性。在另一个实施方案中，该混合物用U/pmol表示的5’-3’聚合酶活性与用U/pmol表示的3’-5’核酸外切酶活性的比值介于约1到100之间，采用如下实施例3所描述的方法测定。
在其它方面，本发明提供了包含编码削弱的3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶序列的核酸。在一个实施方案中，本发明提供了包含编码削弱了3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶序列的质粒。在另一个实施方案中，质粒为一个表达载体。在另一个实施方案中，表达载体使得在微生物中表达削弱了3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶。在另一个实施方案中，微生物为细菌。在另一个实施方案中，细菌为大肠杆菌(E.coli)。
在其它方面，本发明提供了经遗传工程方法处理而含有和/或表达包含编码削弱了的3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的序列的核酸的细胞。在一个实施方案中，细胞包含包括编码削弱了3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶序列的质粒。在另一个实施方案中，质粒是一个表达载体，其使得在细胞中表达削弱了3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶。在另一个实施方案中，所述细胞是一种微生物。在另一个实施方案中，所述微生物是细菌大肠杆菌。
在其它方面，本发明提供了生产削弱了3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的方法，该方法包括在能够使得表达削弱了3’-5’核酸外切酶活性的热激活性DNA聚合酶的条件下培养能够表达编码削弱了3’-5’核酸外切酶活性的热激活性DNA聚合酶的核酸的细胞并且从细胞分离具有削弱的3’-5’核酸外切酶活性的热激活性DNA聚合酶的步骤。在一个实施方案中，细胞为微生物。在另一个实施方案中，微生物为细菌。在另一个实施方案中，细菌为大肠杆菌。在另一个实施方案中，细胞包含一个表达载体，其含有削弱了3’-5’核酸外切酶活性的热激活性DNA聚合酶。
在其它方面，本发明提供了复制DNA分子的方法，该方法包括在能够使得热稳定性或热激活性DNA聚合酶复制DNA分子的条件下温育DNA分子和本发明热稳定性或热激活性DNA聚合酶的步骤。DNA分子可以是任何种类的DNA分子，例如，cDNA分子，基因组DNA分子，单链DNA分子或双链DNA分子。在一个实施方案中，削弱了3’-5’核酸外切酶活性的热激活性DNA聚合酶被用来例如通过PCR扩增DNA分子。在另一个实施方案中，具有需要水平的3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶被选择出来以满足特殊的实施条件，例如，金属离子的类型和浓度，盐的类型和浓度，目的核酸的长度和/或不管目的分子为单链DNA，双链DNA或RNA。
在其它方面，本发明提供了选择削弱了3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的方法，该方法包括检测热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性并且如果它具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性则选择该聚合酶的步骤。在一个实施方案中，热稳定性或热激活性DNA聚合酶为被修饰的热稳定性或热激活性DNA聚合酶。在另一个实施方案中，被修饰的热稳定性或热激活性DNA聚合酶为一个突变的热稳定性或热激活性DNA聚合酶。在另一个实施方案中，如果3’-5’核酸外切酶活性在参考的聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性水平的大约0.1％和大约65％之间则将该热稳定性或热激活性DNA聚合酶选择出来，用下列实施例3的标准试验检测。在另一个实施方案中，3’-5’核酸外切酶活性在参考的聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性水平的大约0.1％和大约30％之间的热稳定性或热激活性DNA聚合酶被选择出来。在另一个实施方案中，3’-5’核酸外切酶活性在参考的聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性水平的大约3.0％和大约20％之间的热稳定性或热激活性DNA聚合酶被选择出来。在另一个实施方案中，3’-5’核酸外切酶活性在参考的聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性水平的大约3.0％和大约10％之间的热稳定性或热激活性DNA聚合酶被选择出来。在另一个实施方案中，3’-5’核酸外切酶活性在参考的聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性水平的大约3.0％和大约5％之间的热稳定性或热激活性DNA聚合酶被选择出来。在另一个实施方案中，用下列实施例3的标准试验检测活性水平在6.5或更小但大于0单位/pmol之间的热稳定性或热激活性DNA聚合酶被选择出来。在另一个实施例中，5’-3’DNA聚合酶活性与3’-5’核酸外切酶活性的比值介于约1到100之间的突变热稳定性或热激活性DNA聚合酶被选择出来，其中用下面实施例3描述的方法检测酶的活性。
在其它方面，本发明提供了包含至少一种削弱了3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒进一步包含用于复制DNA分子的试剂。在另一个实施例中，试剂用于在PCR扩增中复制DNA分子。在一个实施方案中，试剂为缓冲液。在另一个实施方案中，试剂一种引引物。在另一个实施方案中，试剂为脱氧核糖核苷酸。在另一个实施方案中，试剂为双脱氧核糖核苷酸。
在其它方面，本发明提供了包含第一种具有削弱的3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶和第二种热稳定性或热激活性DNA聚合酶的DNA聚合酶混合物。在一个实施方案中，第二种热稳定性或热激活性DNA聚合酶较第一种热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性低。在另一个实施方案中，第二种热稳定性或热激活性DNA聚合酶基本上没有3’-5’核酸外切酶活性。在另一个实施方案中，第二种热稳定性或热激活性DNA聚合酶较第一种热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性高。在另一个实施方案中，用下面实施例3描述的标准试验检测酶的活性，混合物的3’-5’核酸外切酶活性大约6.5或更小但大于0单位/pmol。
在其它方面，本发明提供了用热稳定性或热激活性DNA聚合酶混合物复制DNA分子的方法，该方法包括在能够使得DNA聚合酶复制DNA分子的条件下用第一种具有削弱的3’-5’核酸外切酶活性的聚合酶和第二种热稳定性或热激活性DNA聚合酶温育DNA分子的步骤。在一个实施方案中，在PCR扩增中利用聚合酶混合物复制DNA。
本发明的组合物和方法比以前可获得的组合物和方法具有几个优点。本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶优于没有3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，因为本发明的聚合酶允许模板DNA序列的高保真复制和扩增。本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶优于具有高3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，因为本发明的聚合酶通过减少副产物无效反应的发生允许被复制模板的较少的降解，引物的较少降解和/或更有效地利用dNTPs和其它反应组分。本发明的突变的热稳定性或热激活性DNA聚合酶优于具有和不具有3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的混合物，因为本发明的聚合酶需要较少的处理和校准因此更有效并且生产和使用的成本更低。另外，令人惊讶的是，人们也发现PCR需要的本发明的聚合酶比以前需要的酶的混合物少。本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶混合物优于以前获得的混合物因为其需要模板依赖的5`-3`DNA聚合酶活性与3`-5`核酸外切酶活性的比率得到较好的控制以及因为其使得产生其中ssDNA核酸外切酶和dsDNA核酸外切酶活性的水平被分别调整的混合物。
附图的简要描述
附图1A表示海栖热袍菌(Tma)DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：g5)。3`-5核酸外切酶区域位于大约氨基酸残基292到487处(SEQ ID NO：86)，其中残基被加下划线。附图1B代表编码附图1A氨基酸序列的核酸序列(SEQID NO：87)。
附图2表示来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)(Tne)DNA聚合酶的3`-5`核酸外切酶区域的氨基酸序列(SEQ ID NO：88)。
附图3表示来自非州栖热袍菌(Thermotoga africanus)(Taf)DNA聚合酶的3`-5`核酸外切酶区域的氨基酸序列(SEQ ID NO：89)。
附图4A表示嵌合热稳定性DNA聚合酶CS5的氨基酸序列(SEQ ID NO：90)。3`-5`核酸外切酶区域从大约残基292延伸到大约487残基，其中的残基被加下划线(SEQ ID NO：91)。残基1-291(SEQ ID NO：92)衍生自Z05 DNA聚合酶并且残基292-893(SEQ ID NO：93)衍生自TmaDNA聚合酶，通过箭头来显示。第二轮诱变期间导入的氨基酸残基直接显示在其替换的残基上，其用黑体表示：L329A(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：94；整个蛋白，SEQ ID NO：95)，Q384A(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：96；整个蛋白，SEQ ID NO：97)，N385A(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：98；整个蛋白，SEQ ID NO：99)，Q384AN385A(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：100；整个蛋白，SEQ ID NO：101)，D389E(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：102；整个蛋白，SEQ ID NO：103)，以及Y464A(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：104；整个蛋白，SEQID NO：105)。附图4B表示编码CS5的核酸序列(SEQ ID NO；106)。
附图5A表示嵌合热稳定性DNA聚合酶CS6的氨基酸序列(SEQ ID NO：107)。3`-5`核酸外切酶区域从大约残基292延伸到大约487残基，其中的残基被加下划线(SEQ ID NO：108)。残基1-291(SEQ ID NO：109)衍生自Z05DNA聚合酶且残基292-893(SEQ ID NO：110)衍生自TmaDNA聚合酶，通过箭头来显示，除了残基323-325被用序列ALA替换。第一轮诱变期间导入的氨基酸残基替代直接显示在其替换的残基上，其用黑体表示：DEE(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：111；整个蛋白，SEQ ID NO：112)，DDE(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：113；整个蛋白，SEQ ID NO：114)，DKE(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：115；整个蛋白，SEQ ID NO：116)，DNE(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：117；整个蛋白，SEQ ID NO：118)，DQE(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：119；整个蛋白，SEQ ID NO：120)，DHE(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：121；整个蛋白，SEQ ID NO：122)，DLD(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：123；整个蛋白，SEQ ID NO：124)，ELD(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：125；整个蛋白，SEQ ID NO：126)，ELE(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：127；整个蛋白，SEQ ID NO：128)。附图5B表示编码CS6的核酸序列(SEQ ID NO：129)。
附图6A表示嵌合热稳定性DNA聚合酶CS7的氨基酸序列(SEQ ID NO：130)。3`-5`核酸外切酶区域从大约残基292延伸到大约487残基，其中的残基被加下划线(SEQ ID NO：131)。残基1-291(SEQ ID NO：132)和485-894(SEQ IDNO：133)衍生自Z05 DNA聚合酶，并且残基292-484(SEQ ID NO：134)衍生自Tma DNA聚合酶，通过箭头来显示。与在第二轮诱变期间导入到CS5中的那些类似的氨基酸残基取代直接显示在其替换的残基上，其用黑体表示：L329A(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：135；整个蛋白，SEQ ID NO：136)，Q384A(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：137；整个蛋白，SEQ ID NO：138)，N385A(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：139；整个蛋白，SEQ ID NO：140)，Q384A N385A(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：141；整个蛋白，SEQ ID NO：142)，D389E(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：143；整个蛋白，SEQ ID NO：144)，以及Y464A(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：145；整个蛋白，SEQID NO：146)。附图6B表示编码CS7的核酸序列(SEQ ID NO：147)。
附图7A表示嵌合热稳定性DNA聚合酶CS8的氨基酸序列(SEQ IDNO：148)。3`-5`核酸外切酶区域从大约残基292延伸到大约487残基，其中的残基被加下划线(SEQ ID NO：149)。残基1-291(SEQ ID NO：150)和残基485-894(SEQ ID NO：151)衍生自Z05DNA聚合酶且残基292-484(SEQID NO：152)衍生自TmaDNA聚合酶，通过箭头来显示，除了残基323-325被残基ALA替换。与在第二轮CS5诱变期间导入的那些类似的氨基酸残基替代直接显示在其替换的残基上，其用黑体表示：DEE(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：153；整个蛋白，SEQ ID NO：154)，DDE(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：155；整个蛋白，SEQ ID NO：156)，DKE(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：157；整个蛋白，SEQ ID NO：158)，DNE(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：159；整个蛋白，SEQ ID NO：160)，DQE(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：161；整个蛋白，SEQ ID NO：162)，DHE(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：163；整个蛋白，SEQ ID NO：164)，DLD(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：165；整个蛋白，SEQ ID NO：166)，ELD(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：167；整个蛋白，SEQ ID NO：168)，ELE(3`-5`核酸外切酶区域，SEQ ID NO：169；整个蛋白，SEQ ID NO：170)。附图7B表示编码CS8的核酸序列(SEQ ID NO：171)。
附图8显示了来自EcoDNA聚合酶的3`-5`核酸外切酶区域和其它A家族DNA聚合酶的氨基酸序列的序列比对：Tth(SEQ ID NO：172)，Tca(SEQ ID NO：173)，Z05(SEQ ID NO：174)，Taq(SEQ ID NO：175)，Tfl(SEQ ID NO：176)，Tfi(SEQID NO：177)，Sps17(SEQ ID NO：178)，Dra(SEQ ID NO：179)，HSP-B-7(SEQ IDNO：180)，Bst(SEQ ID NO：181)，Bca(SEQ ID NO：182)，大肠杆菌(SEQ ID NO：183)，Tma(SEQ ID NO：184)，Tne(SEQ ID NO：185)，Taf(SEQ ID NO：186)，HSP-A(SEQ ID NO：187)。Exo I(SEQ ID NO：203)，Exo II(SEQ ID NO：188)，Exo IIa(SEQID NO：189)和Exo III(SEQ ID NO：190)基元被用黑体显示在Tma序列中。
附图9A和9B表示利用本发明的突变DNA聚合酶进行1.7kb HIV模板的逆转录酶/PCR扩增的生长曲线。
附图10显示了附图9的逆转录酶PCR扩增的扩增产物的电泳分析的照片。
附图11显示为Eco Pol IIB家族DNA聚合酶与一些其它B家族DNA聚合酶(SEQ ID NO：191-202)的序列比对。
本发明的详细描述
为了有助于本发明的理解，术语的定义如下。
术语“细胞”，“细胞系”，和“细胞培养物”可以相互替换使用并且所有这些定义包括后代。因此，“转化体”或“转化细胞”包括原代转化细胞和来自不同转化次数的细胞的培养物。所有的后代可能在DNA内含物上不完全一致，因为有意或随意的突变。与筛选自原代转化细胞具有相同功能的突变体后代包括在转化体的定义中。细胞可以是原核的或真核的。
术语“调控序列”是指在特定的宿主微生物中的可操作地连接编码序列的表达所必需的DNA序列。适宜于原核生物的调控序列，例如，包括启动子，选择性的一个操纵子序列，核糖体结合位点，正向的逆调控元件(参见US专利4666848，这里引作参考)，以及可能的其它序列。已知真核细胞利用启动子，聚腺苷酸化信号，以及增强子。
术语“表达克隆”是指含有目的编码序列和可操作连接的调控序列的DNA序列，使得用这些序列转化的宿主能够产生编码的蛋白。术语“表达系统”是指用这些表达克隆转化的宿主。为了实现转化，表达克隆可被包括在载体上，然而，相关的DNA也可被整合到宿主染色体中。
术语“基因”是指含有蛋白，多肽或前体的产生所必需的调控和编码序列的DNA序列。
术语“可操作地连接”是指编码序列的定位使得调控序列启动编码序列编码的蛋白的表达。因此，一个编码序列“可操作地连接”一个调控序列是指一种结构，其中的编码序列可在调控序列的引导下被表达。
这里使用的术语“寡核苷酸”被定义为一种分子，其由两个或多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成。其精确的大小依赖许多因素，其依次依赖寡核苷酸的最佳功能或用途。寡核苷酸可被通过许多合适的方法来制备，包括，例如，适当的序列的克隆和限制以及通过化学方法直接合成，例如Narang等人的磷酸三酯法，1979，Meth.Enzymol.68：90--99；磷酸二酯法，Brown等人，1979，Meth.Enzymol.68：109-151；二乙基磷酸氨化法，Beaucage等，1981，TetrahedronLett.22：1859-1862；以及固体载体法，US专利4458066，各自在这里引作参考。合成方法的综述被Goodchild提供，1990，Bioconjugate Chemistryl(3)：165-187，这里引作参考。
这里使用的术语“引物”是指一种寡核苷酸，其当被置于引物延伸被启动的条件下时能够充当合成启动点的作用。互补于被启动的核酸链的引物延伸产物的合成在所需的四种不同的核苷三磷酸和热稳定的或热激活DNA聚合酶存在的条件下在合适的缓冲液中在适当的温度下被启动。“缓冲液”包括辅因子(例如二价金属离子)和盐(提供合适的离子强度)，调整到所期望的pH。
杂交于基因序列的非编码链的引物(相当于，是编码链的子序列)被称为“上游”或“正向”引物，杂交于基因序列的编码链的引物被称为“下游”或“反向”引物。
术语“限制性核酸内切酶”和“限制性酶”是指酶，典型地是细菌来源的，其在或接近特异性核苷酸序列处切割双链DNA。
具有相同侧链的氨基酸残基家族被在此定义。这些家族包括氨基酸，其带有碱性侧链(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸，半胱氨酸，甘氨酸)，β-支链侧链(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)以及芳香侧链(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。
术语“热稳定性聚合酶”是指一种酶，其对热稳定，是热抗性的并且在施加升高的温度对于双链核酸的变性必要的时间后仍保持对随后的引物延伸反应作用的充分的活性。核酸变性所必需的加热条件是本领域公知的且例证于US专利4965188和4889818中，其在此引作参考。这里所用的，热稳定性聚合酶适用于温度循环反应例如PCR中。
术语“热激活的聚合酶”是指一种酶，其在确保特异性启动和引物延伸所必需的高温度下是激活的(例如，55-80℃)。
术语“校正活性”是指具有3`-5`核酸外切酶活性的分子也具有5`-3`DNA聚合活性。
对于DNA聚合酶活性来说，“酶促反应”是指核苷酸的正确方式的组合催化形成引物延伸产物，其互补于一个模板核酸链。DNA聚合酶活性被表示为单位/pmol，其通过下述实施例3所述的聚合酶试验来测定。1单位的聚合酶活性被定义为利用下述实施例3所提供的聚合酶反应条件在30分钟内将10nmoldNMP整合到TCA-可沉降的DNA产物中所需要的酶活的量。
对于3`-5`核酸外切酶活性而言，“酶促反应”是指通过磷酸二酯键的水解的催化，一个核酸链，多核苷酸或寡聚物的3`核苷酸残基的依次去除。1单位的3`-5`核酸外切酶活性催化将50pmol的单链NJS40寡核苷酸在下述实施例3的标准试验条件下15分钟内转化为较短长度的寡核苷酸。
对于5`-3`核酸外切酶活性而言，“酶促反应”是指通过磷酸二酯键的水解的催化，一个核酸链，多核苷酸或寡核苷酸的5`核苷酸残基的依次去除。1单位的5`-3`核酸外切酶活性被定义以及5`-3`核酸外切酶活性的测定被提供在US专利5795762中。
此处所用的，氨基酸序列中的“点突变”是指单个氨基酸取代，单个氨基酸插入或单个氨基酸缺失。点突变优选被通过编码DNA中的合适密码子的改变来导入到氨基酸序列中。单一的氨基酸在序列中被表示为AN，其中的A是序列中氨基酸的标准一字母符号，且N是在序列中的位置。氨基酸序列中的突变被表示为A1NA2，其中A1是在未突变的蛋白序列中氨基酸的标准一字母符号，A2是在突变的蛋白序列中氨基酸的标准一字母符号，N是氨基酸序列中的位置。例如，G46D突变表示在氨基酸位置46处甘氨酸变化为天冬氨酸残基。当指从蛋白质衍生的结构域中的突变时，氨基酸位置编号基于从中衍生包括突变的区域的全长蛋白。因此，在本发明中，来自栖热菌属(Thermus)种属DNA聚合酶的蛋白的区域中的突变根据全长栖热菌属DNA聚合酶序列编号，而从TmaDNA聚合酶衍生的区域中的突变根据全长TmaDNA聚合酶序列编号。DNA序列中核苷酸和点突变的表示是类似的。然而，当指代嵌合蛋白或编码嵌合蛋白的核酸时，氨基酸残基或核酸被连续编数。
术语“肽”，“多肽”以及“蛋白”在这里是可互换使用的。术语“核酸”和“多核苷酸”是互换使用的。氨基酸序列从氨基端到羧基端被描述，除非另有描述。单链核酸序列被记为5`到3`，除非另有描述。双链核酸序列的上链是5`到3`，且下链为3`到5`，除非另有描述。
此处所用的，“嵌合”蛋白是指一种蛋白，其氨基酸序列表示一种至少来自两个不同蛋白的氨基酸序列的子序列的融合产物。嵌合蛋白优选地不是由氨基酸序列的直接处理来产生，但是，而是由编码嵌合氨基酸序列的“嵌合”基因表达。在本发明的一个实施方案中，提供一种嵌合蛋白，其由衍生自栖热菌属DNA聚合酶的氨基端(N-末端)区域和衍生自Tma DNA聚合酶的羧基端(C-末端)区域构成。N-末端区域是指从N端(氨基酸位置1处)延伸到中间氨基酸的一个区域。类似地，C-末端区域是指从中间氨基酸延伸到C端的一个区域。
除非另有说明，氨基酸序列同一性利用BLAST算法来确定，描述在Altschul等，J.Mol.Biol.215，403-410，(1990)以及Karlin等.，PNAS USA 90：5873-5787(1993)。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序，其被描述在Altschul等，Methods in Enzymology，266：460-480(1996)。WU-BLAST-2程序使用一些检索参数，大部分被设置为默认值。可调整的参数被设置为下列的值：重叠跨度＝1，重叠分数＝o.125，字符阈值(T)＝11。HSP S和HSP S2参数为动态的值且根据特定序列的组成和目的序列被检索的特定数据库的组成通过程序本身被设定；然而这些值可被调整来增加敏感度。氨基酸序列同一性的百分比的值通过匹配相同的残基的数除以比对区域的“较长”序列的残基的总数来确定。“较长的”序列是一个在比对范围中具有最大实际残基的序列(由WU-Blast-2导入的最大化比对分值的缺口被忽略)。百分氨基酸序列同源性的测定基于同源氨基酸残基的数目与氨基酸残基的总数的关系。
百分(％)核酸序列同一性被定义为与序列的核苷酸残基相同的候选序列的核苷酸残基的百分比。除非另有描述，百分核酸序列同一性通过利用WU-BLAST-2设置为缺省值的BLASTN模式计算，重叠跨度和重叠分数分别被设置为1和0.125。比对可能包括待比对的序列的缺口的导入。百分核酸序列同源性的测定基于与核苷总数相关的同源核苷的数目。对于核酸序列和氨基酸序列两者而言，“％同源性”和“％序列同源性”是可以与“％相似性”和“％序列相似性”互换使用的。
这里的活性是“削弱的”是指其小于100％但利用下面的实施例3的标准测定方法仍是可测定的。如果活性减少到小于全能性酶的活性的0.1％，则活性是“失活的”或“基本上失活的”。
本发明的热稳定性和热激活性DNA聚合酶
本发明提供了新的组合物，其为具有削弱的3`-5`核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶。本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶是，例如，比以前的热稳定性或热激活性DNA聚合酶更适宜用于基于PCR的扩增方法中，例如，基于PCR的用于克隆的DNA片段的扩增。本发明的改进的PCR扩增方法包括这些热稳定性或热激活性DNA聚合酶的使用。产生具有削弱的校正活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的方法，编码它们的DNA序列以及表达它们的载体也被提供。
1.具有削弱的3`-5`核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶
在一方面，本发明提供了一种具有削弱的3`-5`核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶。在一个实施方案中，聚合酶来自嗜热真细菌。在另一个实施方案中，嗜热真细菌是栖热袍菌属的一个种。在另一个实施方案中，嗜热真细菌是海栖热袍菌(Tma)。在另一个实施方案中，嗜热真细菌是那不勒斯栖热袍菌。在另一个实施方案中，嗜热真细菌是栖热腔菌(Thermosipho)属的一个种。在另一个实施方案中，嗜热真细菌是非州栖热腔菌(Thermosiphoafricanus)。在另一个实施方案中，嗜热真细菌是产热菌(Aquifex)属的一个种。在另一个实施方案中，嗜热真细菌是嗜火产液菌(Aquifex pyrophilus)。在另一个实施方案中，嗜热真细菌是Aquifex aeolieus。
在另一方面，聚合酶来自嗜热古细菌。在一个实施方案中，嗜热古细菌是热球菌(Thermococcus)属的一个种。在另一个实施方案中，嗜热古细菌是Thermococcus barossi。在另一个实施方案中，嗜热古细菌是Thormococcuslitoralis。在另一个实施方案中，嗜热古细菌是Thermococcus gorgonarius。在另一个实施方案中，嗜热古细菌是火球菌(Pyrococcus)属的一个种。在另一个实施方案中，嗜热古细菌是激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)。在另一个实施方案中，嗜热古细菌是pyrococcus sp.GB-D。在另一个实施方案中，嗜热古细菌是pyrococcus woesei。在另一个实施方案中，嗜热古细菌是Pyrococcus abyssi。在另一个实施方案中，嗜热古细菌是热网菌(Pyrodictium)属的一个种。在另一个实施方案中，嗜热古细菌是Pyrodictium abyssi。另一个实施方案中，嗜热古细菌是隐蔽热网菌(Pyrodictium occultum)。
在另一个方面，本发明提供了包括一或多个减小3`-5`核酸外切酶活性的定点突变(单个氨基酸取代，插入或缺失突变)的热稳定性或热激活性DNA聚合酶。在一个实施方案中，突变体热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3`-5`核酸外切酶活性通过实施例3的标准试验测定在野生型DNA聚合酶的大约0.1％和大约65％之间。在另一个实施方案中，突变体热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3`-5`核酸外切酶活性在野生型DNA聚合酶的大约1.0％和大约30％之间。在另一个实施方案中，突变体聚合酶的3`-5`核酸外切酶活性在野生型DNA聚合酶的大约3.0％和大约20％之间。在另一个实施方案中，突变聚合酶的3`-5`核酸外切酶活性在野生型DNA聚合酶的大约3.0％和大约10％之间。在另一个实施方案中，突变聚合酶的3`-5`核酸外切酶活性在野生型DNA聚合酶的大约3.0％和大约5％之间。
在另一方面，突变体聚合酶的3`-5`核酸外切酶活性是野生型DNA聚合酶的50％或更少但大于0％，通过使用实施例4的双链DNA底物和First VariantAssay测定。在另一个实施方案中，突变体聚合酶的3`-5`核酸外切酶活性在野生型DNA聚合酶的大约4％和大约35％之间。在另一个实施方案中，突变体聚合酶的3`-5`核酸外切酶活性在野生型DNA聚合酶的大约4％和大约17％之间。
在另一方面，突变体聚合酶的3`-5`外切酶活性是在野生型DNA聚合酶的大约0.1％和大约70％之间，通过使用实施例4的含有错配的双链DNA底物和Second Variant Assay测定。在另一个实施方案中，突变体聚合酶的3`-5`核酸外切酶活性在野生型DNA聚合酶的大约10％和大约50％之间。在另一个实施方案中，突变体聚合酶的3`-5`核酸外切酶活性在野生型DNA聚合酶的大约10％和大约30％之间。
在另一方面，本发明提供了一种具有通过实施例3的标准试验测定的大约6.5U/pmol或更低但大于0U/pmol的3`-5`核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶。在一个实施方案中，热稳定性或热激活性DNA聚合酶具有在大约0.4和大约3.0U/pmol之间的3`-5`核酸外切酶活性。在另一个实施方案中，热稳定性或热激活性DNA聚合酶具有在大约0.4和大约1.6U/pmol之间的3`-5`核酸外切酶活性。
在另一方面，本发明提供了一种具有通过实施例4的双链DNA底物和FirstVariant Assay测定的大约5.5U/pmol或更低但大于0U/pmol的3`-5`核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶。在一个实施方案中，热稳定性或热激活性DNA聚合酶具有在大约0.5和大约3.6U/pmol之间的3`-5`核酸外切酶活性。在另一个实施方案中，热稳定性或热激活性DNA聚合酶具有在大约0.5和大约1.9U/pmol之间的3`-5`核酸外切酶活性。
在另一方面，本发明提供了一种具有通过实施例4含有错配的双链DNA底物和Second Variant Assay测定的大约0.01U/pmol和12.0U/pmol之间的3`-5`核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶。在一个实施方案中，热稳定性或热激活性DNA聚合酶具有在大约1.0和大约7.0U/pmol之间的3`-5`核酸外切酶活性。在另一个实施方案中，热稳定性或热激活性DNA聚合酶具有在大约1.5和大约5.0U/pmol之间的3`-5`核酸外切酶活性。
在另一方面，本发明提供了一种具有5`-3`模板依赖的DNA聚合酶活性与3`-5`核酸外切酶活性的比率在大约1和100之间的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，其中聚合酶活性和3`-5`核酸外切酶活性的测定如实施例3所述。在一个实施方案中，5`-3`模板依赖的DNA聚合酶活性与3`-5`核酸外切酶活性的比率在约3.0和约50之间。在另一个实施方案中，5`-3`模板依赖的DNA聚合酶活性与3`-5`核酸外切酶活性的比率在约6.0和约25.0之间。
在另一方面，本发明提供了一种具有5`-3`模板依赖的DNA聚合酶活性与3`-5`核酸外切酶活性的比率在大约1和100之间的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，其中聚合酶活性测定如实施例3所述且3`-5`核酸外切酶活性通过实施例4的双链DNA底物和First Variant Assay测定。在一个实施方案中，5`-3`模板依赖的DNA聚合酶活性与3`-5`核酸外切酶活性的比率在约2.0和约50之间。在另一个实施方案中，5`-3`模板依赖的DNA聚合酶活性与3`-5`核酸外切酶活性的比率在约5.0和约25.0之间。
在另一方面，本发明提供了一种具有5`-3`模板依赖的DNA聚合酶活性与3`-5`核酸外切酶活性的比率在约0.75和10之间的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，其中聚合酶活性测定如实施例3所述且3`-5`核酸外切酶活性通过实施例4的含有错配的双链DNA底物和Second Variant Assay测定。在一个实施方案中，5`-3`模板依赖的DNA聚合酶活性与3`-5`核酸外切酶活性的比率在大约12和大约5.0之间。在另一个实施方案中，5`-3`模板依赖的DNA聚合酶活性与3`-5`核酸外切酶活性的比率在大约2.0和大约4.5之间。
在本发明的另一方面，具有削弱的3`-5`核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶衍生自Tma DNA聚合酶。在本发明的一个实施方案中，具有削弱的3`-5`核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶衍生自包括Tma 3`-5`核酸外切酶活性区域的Tmermus/Thermatoga嵌合DNA聚合酶。Tma DNA聚合酶是具有3`-5`核酸外切酶活性的热稳定性和热激活性酶。参见US专利5624833和5374553。显示于附图1的Tma DNA聚合酶的大约292到大约484氨基酸残基含有3`-5`核酸外切酶区域。在另一个实施方案中，本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶在Tma DNA聚合酶的3`-5`核酸外切酶区域含有一或多个突变。在另一个实施方案中，突变体Tma DNA聚合酶在L329处含有一个突变。在另一个实施方案中，突变为L329A。在另一个实施方案中，突变体Tma DNA聚合酶在D389处含有一个突变。在另一个实施方案中，突变为D389E。在另一个实施方案中，突变体Tma DNA聚合酶在Q384处含有一个突变。在另一个实施方案中，突变为Q384A。在另一个实施方案中，突变体Tma DNA聚合酶在N385处含有一个突变。在另一个实施方案中，突变为N385A。在另一个实施方案中，突变体Tma DNA聚合酶在Q384和N385处含有突变。在另一个实施方案中，突变为Q384A N385A。
产生削弱的3`-5`核酸外切酶活性的这些或其它氨基酸位置处的其它突变可被通过使用标准技术和此处的核酸外切酶活性测定来产生和测定突变来鉴定。一种产生具有削弱的3`-5`核酸外切酶活性的突变体Tma DNA聚合酶的方法是缺失一或多个氨基酸残基或突变氨基酸使其具有不同的化学特性。例如，一个具有酸性测链的氨基酸残基例如天冬氨酸可被替换成具有碱性的，不带电荷的极性的，非极性的，β支链的或芳香基侧链的残基。维持氨基酸的带电特性的取代突变也可以削弱3`-5`核酸外切酶活性，例如，改变天冬氨酸残基为谷氨酸残基。
产生突变体热稳定性或热激活性DNA聚合酶的另外的方法是在已知的或预期影响聚合酶3`-5`核酸外切酶活性的残基附近改变聚合酶。例如，一或多个氨基酸残基可被插入，缺失或取代在聚合酶的3`-5`核酸外切酶区域中关键残基的附近。可选择地，一个或多个残基可被插入，缺失或取代与蛋白的主要序列的关键残基不相邻但与聚合酶的三级结构的关键残基相邻的地方。此方法特别有助于当关键残基本身的突变引起聚合酶的3`-5`中关键残基外切酶活性比所期望的减少要大时，或引起其它的问题，例如聚合酶的错误折叠。
除了上文所描述的定点诱变技术外，作为一个选择，更加随机的诱变技术也可以用来制备本发明的突变的热稳定性或热激活性DNA聚合酶。例如，将插入、缺失和/或替换突变导入到Tma DNA聚合酶的任意位点，而不考虑上文所讨论的关键残基，乃至该蛋白的功能域结构。在一个实施方案中，突变被随机导入到整个Tma DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能区。在另一个实施方案中，突变被随机导入到整个DNA聚合酶分子中。然后如实施例的描述检测每一种突变聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性，挑选具有理想3’-5’核酸外切酶活性水平的突变聚合酶备用。
本发明的突变的热稳定性或热激活性DNA聚合酶也可以通过向Tma DNA聚合酶中导入一个以上的突变来制备。例如，两个或两个以上的突变，其中的每一个突变自身不足以降低该突变聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性，它们在聚合酶分子中组合而将3’-5’核酸外切酶活性降低到理想范围。可选择地，优先降低Trma DNA聚合酶对ssDNA底物的3’-5’核酸外切酶活性的一个或多个突变与优先降低Tma DNA聚合酶对dsDNA底物的3’-5’核酸外切酶活性的一个或多个突变在一个聚合酶分子中组合。
本发明的突变的热稳定性或热激活性DNA聚合酶也可以通过缺失、插入、替换或重排多个相邻残基以产生3’-5’核酸外切酶活性被减弱的突变DNA聚合酶来制备。
并不是Tma DNA聚合酶的每个氨基酸的每一个突变都会产生具有理想的3’-5’核酸外切酶活性水平的突变的热稳定性或热激活性DNA聚合酶。有的突变并不能充分地降低3’-5’核酸外切酶活性，有的降低得太多。例如，美国专利No.6,015,668；5,939,301和5,948,614描述了在Tma和TneDNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能区将金属结合的天冬氨酸改变为丙氨酸残基的突变，这些突变将这些酶的3’-5’核酸外切酶活性降低到可检测水平以下，本发明不包括这些突变。相似地，美国专利No.5,882,904描述了在Thermococcus barossi中将天冬氨酸改变成丙氨酸的类似突变，美国专利No.5489523教导了伍氏热球菌(Pyrococcus wosei)DNA聚合酶的双突变D141A E143A，这些突变的聚合酶都完全不能检测到3’-5’核酸外切酶活性。因此，本领域的普通技术人员能够理解，必需检验每一种突变的热稳定性或热激活性DNA聚合酶以检测其3’-5’核酸外切酶活性。检测3’-5’核酸外切酶活性的方法见下文。其它的方法是本领域公知的，例如，参见Reemont等，1986，Proteinsl：66；Derbyshire等，1991，EMBOJ.16：17和Derbyshire等，1995，Methods in Enzymology 262：363-85。
另一方面，本发明提供了一种突变的Tma DNA聚合酶，该聚合酶具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性且含有影响Tma DNA聚合酶一种或多种属性的一个或多个突变。例如，这些属性包括但不限于：Tma DNA聚合酶区别dNTPs和dNTP类似物或衍生物的能力，参见，如美国专利No.5,939,292和5,614,365，5’-3’核酸外切酶活性，参见，如美国专利No.6,228,628；5,466,591和5,420,029，热稳定性，冷稳定性，参见，如美国专利No.6,214,557，制备的容易程度和费用，持续合成能力，聚合速率等。
通过在编码基因序列中插入合适的突变而实现氨基酸序列的突变，DNA序列中的这种突变利用本领域公知的技术来实现，进一步的描述见下文。
另一个方面，本发明提供了一种具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，该聚合酶已经被化学修饰。参见，例如美国专利No.6,183,998。在一个实施方案中，该化学修饰是翻译后修饰。在另一个实施方案中，修饰的氨基酸残基是本文鉴定的对于3’-5’核酸外切酶活性重要的或关键的残基。该翻译后修饰可以在体内或体外进行。翻译后修饰的例子包括但不限于：用蛋白酶处理和氨基酸残基的磷酸化作用、糖基化作用和酰基化作用。参见，例如Molecular Biology of the cell 1994，(Alberts等编)，第三版，GarlandPublishing，New York。
上文所讨论的有关TamDNA聚合酶的每一种类型的突变和修饰可以被导入到其它的热稳定性或热激活性DNA聚合酶中而产生本发明的突变热稳定性或热激活性DNA聚合酶。基于氨基酸序列排列，将DNA聚合酶分组，根据与大肠杆菌DNA聚合酶I、II和III的同源性命名为A、B和C家族。参见，例如Ito等，Nucl.Acids Res.19：4045-47，在此全文引为参考。栖热袍菌属(Thermotoga)和栖热菌属(Thermus)种的DNA聚合酶是A家族DNA聚合酶的成员，该家族还包括大肠杆菌DNA聚合酶I。家族A DNA聚合酶中的保守氨基酸已经被鉴定。图8(SEQ ID NO：172-187)显示了TamDNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能区区域的氨基酸序列与其它的A家族DNA聚合酶的氨基酸序列的排比。由于A家族DNA聚合酶的氨基酸的保守性，对一种DNA聚合酶，如大肠杆菌DNA聚合酶I或Tma DNA聚合酶中影响3’-5’核酸外切酶活性的氨基酸进行的鉴定加上本文的教导，可以基于序列排列对其它的家族A DNA聚合酶中影响3’-5’核酸外切酶活性的氨基酸进行鉴定。保守序列基元Exo I、Exo II、Exo IIa和ExoIII如图8所示。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的突变体热稳定或热激活家族A DNA聚合酶。在另一个实施方案中，具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶在Exo I、Exo II、Exo IIa或Exo III中具有一个突变。在另一个实施方案中，该突变位于Exo I、Exo II或Exo III中。
根据本发明，已经鉴定了许多具有3’-5’核酸外切酶活性被减弱的DNA聚合酶的嗜热种，代表性的真细菌种包括：海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitina)，参见，如美国专利No.6,077,664；6,015,668；6,001,645和5,912,155，非洲栖热腔菌(thermosiphoafricanus)，参见，如5,968,799；Hot Spring family A。
通过对比其氨基酸序列可以鉴定这些DNA聚合酶内的相应氨基酸和区域。相应既指序列间一致的(保守的)氨基酸，也指那些不一致，但将其对比排列使总体序列达到相似性最大化的氨基酸。
利用这种对比法，本领域的普通技术人员能够检测A家族的热稳定性或热激活性DNA聚合酶中那些与上文所讨论的Tma DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能区或关键残基相应的残基。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种突变的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，该聚合酶在相应于Tma的L329残基的残基处具有一个突变。在另一个实施方案中，相应于Tma的L329残基的该残基突变为丙氨酸。在另一个实施方案中，本发明提供了一种突变的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，该聚合酶在相应于Tma的D389残基的残基处具有一个突变。在另一个实施方案中，相应于Tma的D389残基的该残基突变为谷氨酸。在另一个实施方案中，本发明提供了一种突变的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，该聚合酶在相应于Tma的Q384残基的残基处具有一个突变。在另一个实施方案中，相应于Tma的Q384残基的该残基突变为丙氨酸。在另一个实施方案中，本发明提供了一种突变的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，该聚合酶在相应于Tma的N385残基的残基处具有一个突变。在另一个实施方案中，相应于Tma的N385残基的该残基突变为丙氨酸。在另一个实施方案中，本发明提供了一种突变的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，该聚合酶在相应于Tma的Q385和N385残基的残基处具有突变。在另一个实施方案中，相应于Tma的Q384和N385残基的各个残基突变为丙氨酸。
嗜热真细菌的其它种已经被鉴定，并保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209)和德意志微生物保藏中心(DSM，Macheroder Weg 1b，D-38142 Braunschweig，Germany)。如同下文的描述，DNA聚合酶及编码这些酶的基因可以用常规的方式从保藏的菌株中分离得到并测序。利用如GAP程序(Accelrys，Madison，WI)，对具有Tma DNA聚合酶的氨基酸序列的嗜热真细菌A家族DNA聚合酶的氨基酸序列进行的常规序列对比，使得嗜热真细菌的DNA聚合酶序列能够用来产生本发明的突变DNA聚合酶。
本发明的另一个方面，具有3’-5’核酸外切酶活性的商业上可用的热稳定性或热激活性DNA聚合酶被用来制备具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的突变热稳定性或热激活性DNA聚合酶。具有相当高的3’-5’核酸外切酶活性的商业上可用的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的例子包括VENTR和DEEPVENTRDNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly MA)和Pfu DNA聚合酶(Stratagene，San Diego，CA)。
另一个方面，本发明的突变的热稳定性或热激活性DNA聚合酶来源于一种在嗜温微生物中天然发现的DNA聚合酶，该聚合酶已经被突变或改造成热稳定性或热激活性DNA聚合酶，参见，例如Sanchez-Ruiz等，2001，TrendsBiotechnol.19：132-35；Fonta，1991，Curr Opin Biotechnol.2：551-60；Nosoh等，1990，Trends Biotechnol.8：16-20；Pace，1990，Trends Biotechnol.8：93-98和Peters，1998，Science 281：368-69。在一个实施方案中，该聚合酶是家族A DNA聚合酶。在另一个实施方案中，该嗜温微生物是嗜温真细菌。在另一个实施方案中，该嗜温真细菌是大肠杆菌，参见villobrandt deng，2000，Protein Eng.9：645-54。
2、本发明的嵌合蛋白
另一个方面，本发明提供了一种具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的嵌合的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，所述的聚合酶含有一个氨基末端部分和一个羧基末端部分，其中的氨基末端部分衍生于第一DNA聚合酶的氨基末端部分，羧基末端部分衍生于第二DNA聚合酶。在一个实施方案中，所述的具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶含有一个氨基末端部分和一个羧基末端部分，其中氨基末端部分衍生于第一热稳定性或热激活性DNA聚合酶的氨基末端部分，羧基末端部分衍生于第二热稳定性或热激活性DNA聚合酶，所述的第二聚合酶优选的是具有3’-5’核酸外切酶活性的聚合酶。在另一个实施方案中，在具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，所述的氨基末端和/或羧基末端来源于栖热菌属的一种DNA聚合酶。在另一个实施方案中，在具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，所述的氨基末端和/或羧基末端来源于栖热袍菌属的一种DNA聚合酶。在另一个实施方案中，在具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，所述的氨基末端和/或羧基末端来源于栖热菌属的一种DNA聚合酶，另一个末端部分来源于栖热袍菌属的一种DNA聚合酶；例如，在一个实施方案中，该氨基末端部分来源于栖热菌属的一种DNA聚合酶，羧基末端部分来源于栖热袍菌属的一种DNA聚合酶。在另一个实施方案中，在具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，氨基末端部分来源于栖热菌属并含有5’-3’核酸外切酶功能区，羧基末端部分来源于栖热袍菌属并含有3’-5’核酸外切酶功能区和聚合酶功能区。在另一个实施方案中，在具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，氨基末端部分来源于栖热菌属并含有5’-3’核酸外切酶功能区，且与来自栖热菌属的DNA聚合酶的相应氨基末端部分具有高于约80％的序列同一性，羧基末端部分与来自栖热袍菌属的DNA聚合酶的相应羧基末端部分具有高于约80％的序列同一性。在另一个实施方案中，所述的栖热菌属是Thermus sp.Z05，所述的栖热袍菌属是海栖热袍菌。在另一个实施方案中，嵌合的热稳定性或热激活性DNA聚合酶含有图4的氨基酸序列，该序列被图中所示的一个或多个突变修饰。在另一个实施方案中，嵌合的热稳定性或热激活性DNA聚合酶含有图5的氨基酸序列，该序列被图中所示的一个或多个突变修饰。在另一个具体实施方案中，具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的嵌合的热稳定性或热激活性DNA聚合酶含有一个氨基末端部分、一个中间部分和一个羧基末端部分。在另一个实施方案中，在具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，氨基末端部分含有5’-3’核酸外切酶功能区。在另一个实施方案中，在具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，中间部分含有3’-5’核酸外切酶功能区。在另一个实施方案中，在具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，羧基末端部分含有聚合酶功能区。在另一个实施方案中，在具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，羧基末端部分和氨基末端部分衍生于来自栖热菌属的聚合酶。在另一个实施方案中，在具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，氨基末端和/或羧基末端与来自栖热菌属的聚合酶的相应氨基和/或羧基末端部分具有高于80％的序列同一性。在另一个实施方案中，在具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，中间部分衍生自来源于栖热袍菌属的聚合酶。在另一个实施方案中，在具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，中间部分与相应的来自栖热袍菌属的聚合酶具有高于80％，但低于100％的序列同一性。在另一个实施方案中，在具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，羧基末端部分和氨基末端部分衍生自来源于栖热菌属的聚合酶，中间部分来源于栖热袍菌属。在另一个实施方案中，在具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，栖热菌属是Thermus sp.Z05，栖热菌属是海栖热袍菌。在另一个实施方案中，嵌合的热稳定性或热激活性DNA聚合酶含有图6的氨基酸序列，该序列被图中所示的一个或多个突变修饰。在另一个实施方案中，嵌合的热稳定性或热激活性DNA聚合酶含有图7的氨基酸序列，该序列被图中所示的一个或多个突变修饰。
另一个方面，具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶含有得自两种或两种以上的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的序列。在一个实施方案中，该嵌合聚合酶在其N末端含有一个衍生自来源于第一菌株的DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶功能区，在其C末端含有一个DNA聚合酶功能区和一个衍生自来源于第二菌株DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶功能区。在另一个实施方案中，第一菌株和第二菌株是细菌菌种。在另一个实施方案中，第一菌株和第二菌株是嗜热菌种。在另一个实施方案中，第一菌株是栖热菌种。在另一个实施方案中，栖热菌种是水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)。在另一个实施方案中，栖热菌种是Thermus flavus(Tfl)。在另一个实施方案中，栖热菌种是嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth)。在另一个实施方案中，栖热菌种是栖热菌种Z05(TZ05)。在另一个实施方案中，栖热菌种是Thermus caldofilus species17(Tsps17)。在另一个实施方案中，栖热菌种是Thermus caldofilus(Tca)。在另一个实施方案中，第二菌株是栖热袍菌属。在另一个实施方案中，栖热袍菌属是海栖热袍菌(Tma)。在另一个实施方案中，第一菌株是TZ05，第二菌株是Tma。
本发明的另一方面，具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的嵌合的热稳定性或热激活性DNA聚合酶含有得自一种热稳定性或热激活性DNA聚合酶和得自另一种蛋白的序列，其中得自另一种蛋白的序列给予嵌合蛋白一种有益属性。在一个实施方案中，该有益属性影响嵌合蛋白的表达、纯化、稳定性、半衰期、对蛋白酶的敏感性、翻译后修饰、酶学活性或热稳定性。
来自栖热菌属菌种的DNA聚合酶与Tma DNA聚合酶在整体结构上是相似的，在这些DNA聚合酶中，该酶的5’核酸酶和DNA聚合酶活性存在于该蛋白的不连续区域(活性区)。表1列出了有代表性的栖热菌属DNA聚合酶，TaqDNA聚合酶和Tma DNA聚合酶的可能的活性区。可以参见美国专利No.5,420,029。Tma DNA聚合酶中编码3’-5’核酸外切酶活性的区域与TaqDNA聚合酶中的相应区域在长度上的差异导致或相应于TaqDNA聚合酶中3’-5’核酸外切酶活性的缺乏。表1
活性区(大致的氨基酸位点)
                 5’-3’外切    3’-5’外切         聚合酶
Taq DNA聚合酶    1-289          ---                 423-832
Tma DNA聚合      1-291          292-484             485-893
酶
栖热菌属DNA聚合酶与Tma DNA聚合酶间存在相当大的氨基酸序列相似性，例如，利用默认的参数值通过GAP计算机程序(Accelrys，Madison，WI)比较有代表性的栖热菌属DNA聚合酶，TaqDNA聚合酶和Tma DNA聚合酶的氨基酸序列，表明一致的氨基酸序列大约占整个氨基酸序列的44％，相似的氨基酸序列大约占整个氨基酸序列的66％。
由于Tma与栖热菌属DNA聚合酶的总体结构和序列的相似性，因此可以构建Tma/栖热菌属嵌合酶，该嵌合酶保留了总体结构和Tma DNA聚合酶中存在的活性区域。在一个实施方案中，该嵌合酶含有Tma DNA聚合酶的C末端区域和栖热菌属DNA聚合酶的N末端区域。在另一个实施方案中，本发明的嵌合酶相当于一种突变的Tma DNA聚合酶，其中的5’-3’核酸外切酶功能区已经被栖热菌属DNA聚合酶的相应区域替换。该“相应区域”在这儿是通过氨基酸序列对比定义的，如同美国专利No.6,228,628中的描述。
本发明的另一个方面，来自Tma DNA聚合酶的区域的第一个氨基酸开始于这样的氨基酸，该氨基酸紧接着与栖热菌属DNA聚合酶序列的最后一个氨基酸相应的氨基酸，并含有Tma DNA聚合酶序列的其它部分(直到第893位氨基酸)。Tma DNA聚合酶的完整氨基酸序列在图1A中被提供(SEQ ID NO：85)。优选地，将来自栖热菌属DNA聚合酶的氨基酸序列与来自Tma DNA聚合酶的氨基酸序列在这样一个位点连接，在该位点两个氨基酸序列是一致的或相似的。例如，一个实施方案由来自TaqDNA聚合酶的氨基酸1-190和来自TmaDNA聚合酶的氨基酸191-893构成。Tma DNA聚合酶的氨基酸190与TaqDNA聚合酶的氨基酸190一致，嵌合酶的Tma DNA聚合酶部分开始于下一个氨基酸，即氨基酸191。
在这两种DNA聚合酶相一致的区域中，来自于栖热菌属DNA聚合酶的最后一个氨基酸的确定在该区域内是任意的。例如，因为在TaqDNA聚合酶和Tma DNA聚合酶中氨基酸191和192是相同的(且在栖热菌属DNA聚合酶中是保守的)，所以含有TaqDNA聚合酶的氨基酸1-190的嵌合蛋白就不能与含有TaqDNA聚合酶的氨基酸1-191或1-192的嵌合蛋白区分开。考虑到该酶的原始来源，实施例中所描述的本发明的具体实施方式含有TaqDNA聚合酶的氨基酸1-190。
本发明的另一个方面，该嵌合DNA聚合酶由嵌合基因编码，在该嵌合基因中，编码Tma DNA聚合酶序列的区域至少通过大约存在于全长Tma DNA聚合酶基因的密码子133-137处的另一个核糖体结合位点，优选地通过甲硫氨酸140起始密码子，该区域被编码来自栖热菌属DNA聚合酶的相应区域的基因序列替换。在全长Tma DNA聚合酶基因中这种可选择性的核糖体结合位点和起始密码子的存在使得从氨基酸140处起始的截短的Tma DNA聚合酶优先表达。正如下文所描述的那样，Tma DNA聚合酶基因的这个区域的替换有利于全长嵌合蛋白的有效表达。因此，在本发明的嵌合DNA聚合酶的一个实施方案中，来自栖热菌属DNA聚合酶的N末端区域替换了Tma DNA聚合酶的一个区域，该区域至少包含了氨基酸137，优选地包含了氨基酸140。
每种栖热菌属DNA聚合酶与Tma DNA聚合酶的氨基酸1-137相应的区域可以根据美国专利No.6,228,628所提供的氨基酸序列对比法得到。例如，TaqDNA聚合酶与Tma DNA聚合酶的氨基酸1-137相应的区域是氨基酸1-142，TaqDNA聚合酶与Tma DNA聚合酶的M140相应的氨基酸是L145。因此，N末端区域来自TaqDNA聚合酶的具体实施方式至少含有Tma DNA聚合酶的氨基酸1-142，优选为氨基酸1-145。相似地，对于N末端区域来自另一种栖热菌属DNA聚合酶的具体实施方式来说，栖热菌属DNA聚合酶与TmaDNA聚合酶的氨基酸1-137和140相应的区域可以根据美国专利No.6,228,628所提供的氨基酸序列对比法得到。
本领域的普通技术人员能够理解：次要的突变、插入或缺失可以被导入到一个DNA聚合酶中而不改变该酶功能上的性质，在实现任何意图和目的上该突变酶与未突变酶是等同的。例如，我们知道缺失TaqDNA聚合酶的几个N末端氨基酸并不改变该酶的功能属性。相似地，我们知道在许多氨基酸位点进行的取代突变并不产生本质的影响。根据本发明的目的，含有不改变该酶功能上的性质的次要突变的DNA聚合酶等同于未突变的DNA聚合酶。
3、热稳定性或热激活性DNA聚合酶的混合物
另一个方面，本发明提供了一种含有许多种热稳定性或热激活性DNA聚合酶的混合物，其中至少有一种聚合酶具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性，如同上文的描述。在一个实施方案中，至少有一种聚合酶具有基本失活的3’-5’核酸外切酶活性。
另一个方面，利用下文实施例3中所描述标准测定法(Standard Assay)测定，该混合物的3’-5’核酸外切酶活性大约为6.5单位/pmol或更低，但高于0单位/pmol。在一个实施方案中，该混合物的3’-5’核酸外切酶活性大约在0.4-3.0单位/pmol之间。在另一个实施方案中，该混合物的3’-5’核酸外切酶活性大约在0.4-1.6单位/pmol之间。
另一个方面，混合物中模板依赖性5’-3’DNA聚合酶活性与3’-5’核酸外切酶活性的比例大约为1-100，其中用实施例3中所描述的聚合酶测定法测定聚合酶活性，用下文实施例3中所描述的标准测定法测定3’-5’核酸外切酶活性。在一个实施方案中，混合物中模板依赖性5’-3’DNA聚合酶活性与3’-5’核酸外切酶活性的比例大约为3.0-50。在另一个实施方案中，混合物中模板依赖性5’-3’DNA聚合酶活性与3’-5’核酸外切酶活性的比例大约为6.0-25.0。
4、本发明的DNA聚合酶的优点
本发明的突变的热稳定性或热激活性DNA聚合酶比文献中所描述的热稳定性或热激活性DNA聚合酶具有显著的进步。具体地，本发明的DNA聚合酶提供如下性能组合：
(1)与野生型的热稳定性或热激活性DNA聚合酶相比减少了引物的降解；
(2)与野生型的热稳定性或热激活性DNA聚合酶相比能更有效地利用dNTP，减少无产物的“空”反应；
(3)与没有3’-5’核酸外切酶活性的野生型热稳定性或热激活性DNA聚合酶相比能增加复制的保真度；
(4)与热稳定性或热激活性DNA聚合酶混合物相比减少了操作过程和费用；
(5)在重组表达系统中DNA聚合酶能被容易地并高效地表达，因此有利于该酶的商业化生产；和
(6)相对于热稳定的高保真的古细菌(archae proofreading)DNA聚合酶，本发明的DNA聚合酶能容易地与三磷酸核苷类似物结合。
本发明的DNA聚合酶所具有的这些属性的组合在PCR中特别有用，并产生相对改进的效果。
(1)减少引物的降解
在体外使用具有强烈ssDNA3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶时，该聚合酶会降解引物。这会影响反应的两个方面：第一，这会降低反应中的引物浓度；第二，这会部分地产生不同长度的降解引物。由于引物对其靶序列的特异性是由该引物的序列和长度直接决定的，截短的引物对其特定靶序列的特异性就可能降低。同时这还会导致目标序列复制降低和假序列或非目标序列复制增加。加热使DNA链分离、双链变性，在接着进行的以其作为模板的聚合反应循环中，ssDNA3’-5’核酸外切酶活性的存在还可能导致合成链的末端长度变小。因为引物与这些末端结合，所以它们长度的减小也就减小了其与引物结合的长度，这很可能会导致目的PCR产物量的减少和假PCR产物量的增加。这些影响对于PCR特别麻烦，因为扩增的靶序列与扩增的假序列的比例的减小会导致反应的特异性降低，从而降低目标检测的敏感性。
本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶因为具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性水平而克服了这个问题。
(2)减少空反应
热稳定性或热激活性DNA聚合酶的dsDNA核酸外切酶活性可以导致到达线性模板末端的聚合酶“空转”。情况是这样的：它通过重复的聚合循环到达模板的末端，然后水解合成链刚刚完成的末端残基。这种聚合和水解循环降低了反应混合物中的dNTP浓度，增加了反应混合物中的焦磷酸浓度，降低了后续循环的反应效率，于是降低了产物的产量。
本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶因为具有减弱的dsDNA 3’-5’核酸外切酶活性而克服了这个问题。在一个实施方案中，本发明的突变聚合酶具有3’-5’核酸外切酶活性，利用实施例3的单链DNA底物和标准测定法进行测定，该活性大约是野生型酶活性的0.1％-65％。在另一个实施方案中，本发明的突变聚合酶所具有的3’-5’核酸外切酶活性大约是野生型酶活性的1％-30％。在另一个实施方案中，本发明的突变聚合酶所具有的3’-5’核酸外切酶活性大约是野生型酶活性的3％-20％。在另一个实施方案中，本发明的突变聚合酶所具有的3’-5’核酸外切酶活性大约是野生型酶活性的3％-10％。在另一个实施方案中，本发明的突变聚合酶所具有的3’-5’核酸外切酶活性大约是野生型酶活性的3％-5％。
(3)高水平的保真度
为了克服热稳定性或热激活性DNA聚合酶3’-5’核酸外切酶活性的有害影响，以前的尝试是使用没有或基本没有3’-5’核酸外切酶活性的突变聚合酶，或者使用该活性天然缺失的聚合酶。这种方法具有其固有的问题，没有3’-5’核酸外切酶活性的聚合酶比具有该活性的聚合酶产生更高的错误率。例如，对于PCR的某些应用，克隆扩增序列保持低的错误率是重要的。另外，3’-5’核酸外切酶活性的存在提高了对更长的靶物进行扩增和/或逆转录酶效率，因为核苷酸的错误插入能被纠正。因此，完全缺乏校读活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶较不适合于这些应用。
本发明通过提供分离的具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶而克服了这个问题。如今已经证实减弱水平的3’-5’活性通过有效去除错误插入的dNTP能足够提高较长模板的PCR效率，因此利于使用较长的PCR和RT-PCR。
(4)减少操作
被用于克服与强烈的3’-5’核酸外切酶活性相关的问题的另一个方法是将具有野生型水平校读活性的聚合酶与基本上没有校读活性的聚合酶混合。通过调节混合物中这两种聚合酶的比例我们可以得到校读活性与聚合酶活性的理想比例。虽然该方法已经被成功运用，但有其自身的缺点。对于每种酶的每种制剂必须准确测定这两种酶的3’-5’核酸外切酶活性和聚合酶活性，然后计算所需每种酶的量。而且，对于每一种反应，必须加入正确量的每种酶。这个方法还要求这两种酶具有相当的贮藏稳定性。因此，使用酶混合物进行反应需要更多的操作，这样就增加了费用，降低了效率。
本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶克服了这些问题，在一个实施方案中，本发明提供了一种具有理想校读活性与聚合酶活性比例的单个聚合酶。在每一个反应中只需加入一种酶，出乎意料地，我们还发现当使用本发明的酶代替酶混合物时需要的酶总量减少。
(5)表达的效率
如上文所述，本发明的一个方面提供了一种与突变的Tma DNA聚合酶相应的嵌合酶其中的5’核酸酶功能区已经被来自栖热菌属的DNA聚合酶的相应区域替换。该酶由与突变的Tma DNA聚合酶基因相应的嵌合基因表达，其中编码5’核酸酶功能区的基因的区域已经被来自栖热菌属的DNA聚合酶基因的相应区域替换。该嵌合基因的一个非常大的优点是它能在重组表达系统中比TmaDNA聚合酶基因更有效地表达全长DNA聚合酶。
由于截短形式的蛋白的优先表达，全长DNA聚合酶从含有全长天然TmaDNA聚合酶基因序列的重组表达系统表达是有问题的，参见美国专利No.5,420,029。称为Met140 Tma的该截短蛋白由全长蛋白的氨基酸140-893组成，从位点140处的甲硫氨酸开始翻译产生。在密码子133-137处推断的核糖体结合位点的存在进一步表明了该截短蛋白产生于内部甲硫氨酸处开始的翻译。Met140Tma截短蛋白的优先表达使全长Tma DNA聚合酶的表达和纯化产生相当大的困难。
在本发明的一个实施方案中，嵌合DNA聚合酶基因中含有栖热菌属DNA聚合酶基因序列，其相应于至少含有大约在全长Tma DNA聚合酶基因的密码子133-137处的另一个核糖体结合位点，优选地含有内部起始密码子，即密码子140处的区域。于是，该Tma DNA聚合酶基因序列中直到包含核糖体结合位点和，优选地，负责Met140 Tma的翻译的起始密码子的区域，已被栖热菌属DNA聚合酶基因的相应区域替换。栖热菌属DNA聚合酶基因的该相应区域并不提供截短蛋白的非需要的内部起始。所以，含有嵌合DNA聚合酶基因的重组表达系统专有地表达全长的嵌合DNA聚合酶。
(6)三磷酸核苷类似物的插入
另一个方面，相对于热稳定的校正古细菌DNA聚合酶(例如：VENTTM，DEEPVENTTM，Pfu，Pwo，Poc，Pab，Tgo等)，本发明的热稳定性或热激活性校正DNA聚合酶能忍受和容易地插入三磷酸核苷类似物，如dUTP和dITP。这是因为这些聚合酶不受模板链中存在的dUTMP或dIMP或存在的dUTP或dITP的抑制。相反，上述热稳定的校正古细菌DNA聚合酶或含有校正古细菌DNA聚合酶的混合物受模板链中存在的dUTMP或dIMP或存在的dUTP或dITP的抑制。因此，利用dUTP和dTTP或替换dTTP或利用dITP和dGTP或替换dGTP的许多优点可以利用本发明的酶，而不是古细菌热稳定DNA聚合酶实现。参见，例如PCR Applications：Protocols for functional Genomics，1991，Innis等.(编)，Academic Press，San Diego，pages4，5，142和143。因此，以前所描述的古细菌DNA聚合酶或含有古细菌DNA聚合酶的混合物不能利用dUTP或dITP进行引物延伸或PCR扩增。在一个实施方案中，本发明的热稳定和热激活DNA聚合酶适于利用这些类似物。
5、本发明的DNA聚合酶的制备
编码Tma DNA聚合酶的基因在美国专利No.5,420,029和5,466,591中被描述，该Tma DNA聚合酶基因的核苷酸序列和编码的蛋白的全长氨基酸序列在那里也被描述。专利‘029的实施例5中描述了起始于质粒pTma01(ATCCNo.68471，保藏于1990年11月7日，于1998年5月22再次保藏，保藏号为ATCCNo.98764)和pTma04(ATCC No.68472，保藏于1990年11月7日，于1998年5月22再次保藏，保藏号为ATCC No.98765)，含有全长Tma DNA聚合酶基因的不同质粒构建体，如质粒pTma12-1和pTma13。任何这些表达质粒都适合作为Tma DNA聚合酶基因的来源。
其它的具有3’-5’核酸外切酶活性，能突变成本发明的聚合酶的热稳定性或热激活性DNA聚合酶包括，  但不限于在美国专利No.6,077,664；6,015,668；6,001,645和5,912,155(那不勒斯栖热袍菌)，美国专利No.6,066,483；5,874,282；5,834,253；5,747,298；6,013,451和5,830,714，美国专利No.5,882,904和5,602,011(Thermococcus barossi)，美国专利No.5,322，785和5,210,036(Thermococcus litoralis)，美国专利No.5,948,663和5,866,395；Dabrowski等，1998，Protein Expr Purif 14：131-38(激烈热球菌)，参见，例如美国专利No.5,834，285(Pyrococcus sp.GB-D)和Dabrowski(1998)(伍氏热球菌)中描述的那些。
另一个方面，本发明的DNA聚合酶是嵌合酶，该嵌合酶含有衍生自栖热菌属DNA聚合酶的部分和衍生自Tma DNA聚合酶的部分。在一个实施方案中，本发明的DNA聚合酶是嵌合酶，该嵌合酶由衍生自栖热菌属DNA聚合酶的部分和衍生自Tma DNA聚合酶的部分构成。该嵌合酶是由嵌合基因制备的，即编码嵌合酶的DNA，该DNA由衍生自栖热菌属DNA聚合酶基因的部分和衍生自Tma DNA聚合酶基因的部分构成。该嵌合基因是用分子生物学领域公知的标准基因操作技术由栖热菌属DNA聚合酶基因和Tma DNA聚合酶基因制得的，详细描述见下文。
许多栖热菌属的DNA聚合酶的编码基因，包括DNA聚合酶基因的核苷酸序列和编码的蛋白的氨基酸序列都已经被描述。这些基因的许多可以从公用质粒中得到，其它栖热菌属的这种基因可以从宿主生物中得到，利用美国专利No.5,079,352；5,618,711；5,455,170；5,405,774和5,466,591中描述的方法，在此分别引为参考。
编码TaqDNA聚合酶的基因在美国专利No.5,079,352和5,466,591中被描述，TaqDNA聚合酶基因的核苷酸序列和编码的蛋白的全长氨基酸序列在那儿也被描述。专利‘352的实施例V-VII描述了起始于质粒pFC83(ATCCNo.67422，保藏于1987年5月29日，于1998年5月22再次保藏，保藏号为ATCCNo.98763)和pFC85(ATCC No.67421，保藏于1987年5月29日，于1998年5月22再次保藏，保藏号为ATCC No.98762)，含有全长TaqDNA聚合酶基因的不同表达质粒构建体，如质粒pLSG1、pLSG2、pSYC1578，pLSG5和pLSG6。任何这些表达载体都适合作为TaqDNA聚合酶基因的来源。
编码TthDNA聚合酶的基因、获得该基因的方法和含有该基因的表达质粒在美国专利No.5,618,711和5,466,591中被描述。
编码TZ05DNA聚合酶的基因、获得该基因的方法和含有该基因的表达质粒在美国专利No.5,455,170和5,466,591中被描述。
编码Tsps17DNA聚合酶的基因、获得该基因的方法和含有该基因的表达质粒在美国专利No.5,405,774和5,466,591中被描述。
TflDNA聚合酶基因在Akhmetzjanov等，1992，Nucleic Acids Research 20：5839中被描述，在此全文引为参考。
TfiDNA聚合酶基因可以利用参考专利中描述的方法从ATCC43280中得到，还可参见1984，FEMS Microbiol.Lett.22：149-53。
TcaDNA聚合酶基因在Kwon，1997，Mol.Cells 7：264-71中被描述，核苷酸序列可以在EMBL/GenBank中获得，登记号为No.U62584。
其它的栖热菌属DNA聚合酶基因可以用上文所引用的专利中描述的技术从下列ATCC保藏物中得到：ATCC43814和43815，参见Alfredsson，1986，Appl.Environ.Microbiol.52：1313-16；ATCC27978，参见Ramaley，1970，J.Bacteriol.114：556-62；1973；ibid.103：527-528；ATCC31674，参见美国专利No.4,442,214和4,480,036；ATCC35948(T.ruber，参见Loginova，1984，Int.J.Syst.Bacterio1.34：498-99)。在此所有的参考文献全文引为参考。
其它的栖热菌属DNA聚合酶基因可以用上文所引用的专利中描述的技术从下列德意志微生物保藏中心(DSM)的保藏物中得到：DSM：1279(NUM：2244)，参见Loginova等，1975，Izv.Akad.Nauk SSSR Ser.Biol.：304-07；DSM：579；DSM：625(NUM：2248)，参见Degryse等，1978，Arch.Microbiol.189：196；DSM：1279(NUM：3844)，参见Loginova等，1984，Int.J.Syst.Bacteriol：498-99；和DSM：625(NUM：1002)，参见Brock等，1969，J.Bateriol：289-97。在此所有的参考文献全文引为参考。
已经被描述的其它栖热菌属包括奥费氏栖热菌(Toshimai)，参见Williams等，1996，Int.J.Syst.Bacteriol.46：403-08；Tsilvanus和喜温稍热菌(Tchliarophilus)，参见Tenreiro等，1995，Int.J.Syst.Bacteriol.45：633-39；水管致黑栖热菌(Tscotoductus)，参见Tenreiro等，1995，ResMicrobiol.146：315-24：和红色稍热菌(T.ruber)，参见Shadrina等，1982，Mikrobiologiia 51：611-15；在此所有的参考文献全文引为参考。
根据本说明书的教导和公知技术，本领域的普通技术人员能够用DNA聚合酶基因制备任何含有嵌合基因，适于在任何不同宿主系统中表达本发明的嵌合的DNA聚合酶的表达载体。
一个方面，本发明的嵌合酶含有来自205 DNA聚合酶的氨基酸1-291和具有合适突变而使相关的3’-5’核酸外切酶活性降低的来自Tma DNA聚合酶的氨基酸292-893。在一个实施方案中，本发明的嵌合酶由来自205 DNA聚合酶的氨基酸1-291和具有合适突变而使相关的3’-5’核酸外切酶活性降低的来自Tma DNA聚合酶的氨基酸292-893构成。这些具体实施方式可以由Z05DNA聚合酶和Tma DNA聚合酶基因直接构建，也可以从上文所描述的保藏的质粒中得到或从宿主微生物中回收。
由于遗传密码冗余，有代表性的是，大量的DNA序列编码任何给定的氨基酸序列，在这个意义上来说，它们是等价的。正如下文所描述的，基于表达载体待插入的宿主细胞偏好的密码子利用情况，可能期望在某个表达载体中选择一种或另一种等价的DNA序列。本发明的意图是包含所有编码该嵌合酶的DNA序列。因此，本发明的嵌合基因不限于只包含来自一种野生型栖热菌种及Tma DNA聚合酶基因的序列，还包含了编码本发明的嵌合DNA聚合酶的任何一种DNA序列。
本发明的酶的生产是通过利用一种重组表达克隆来进行的。重组表达克隆的构建、表达克隆对宿主细胞的转化、以及转化后的宿主细胞在启动表达的条件下的培养，都可以运用本领域所熟知的分子生物学技术以多种方式进行。上述各步骤的方法在下面进行一般性描述并在实施例中具体描述。
一个可操作的表达克隆通过在表达载体中将编码序列可操作地连接于一合适的调控序列而构建。该载体可以设计在宿主细胞中自主复制或者整合到宿主细胞的染色体中。所得的克隆用来转化合适的宿主，在适于编码序列表达的条件下培养转化后的宿主。从培养基或细胞中分离表达的蛋白，尽管在某些情况下蛋白的回收和纯化可能不是必需的。
构建包含编码序列和合适的调控序列的合适的克隆采用的是本领域所熟知的标准连接及酶切技术。一般地，分离的质粒、DNA序列或人工合成的寡聚核苷酸被剪切、修饰并按预期的方式再连接。如果正常青况下不存在，可以在编码序列的末端添加合适的限制性酶切位点以有利于表达克隆的构建。
位点特异性的DNA剪切是通过用一种合适的限制性内切酶(或酶)在本领域通常理解的条件下处理并根据商业来源的限制性内切酶的制造商的具体规定来进行的。参见，例如，Amersham产品目录(Arlington Heights，IL)，RocheMolecular Biochemicals(Indianapolis，IN)，以及New England Biolabs(Beverly，MA)。一般而言，大约1μg质粒或其它DNA用一单位的酶在大约20μl缓冲液中进行剪切；在下面的例子中，通常采用过量的限制性内切酶以保证DNA的完全消化。有代表性的是在特定酶的最佳温度下保温大约1-2个小时。每次保温完毕，通过苯酚和氯仿抽提除去蛋白；之后还可以进行乙醚抽提并用乙醇沉淀从含水级分中回收DNA。如果需要，还可以运用标准技术通过聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳对剪切的片段进行大小分离。参见例如Maxam等，1980，Methods in Enzymology 65：499-560。
带有单链“突出”(“overhang”)末端的限制性内切酶剪切的DNA片段可以通过大肠杆菌E.coli DNA聚合酶I大片段(Klenow)在四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)存在的条件下进行如下处理钝末端化(双链末端)，在50mM Tris，pH 7.6，50mMNaCl，10mM MgCl2，10mM DTT及5-10μM dNTPs中，在20-25℃，保温时间大约是15-25分钟。即使4种dNTPs都存在，Klenow片段能够填补5’突出末端，而消化掉突出的3’单链。如果需要，可以在突出末端的特性所限定的范围内通过添加一种或多种选择的dNTPs对其进行选择性修补。Klenow处理后，混合物用苯酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。用S1核酸酶也能得到相似的结果，因为在合适的条件下用S1核酸酶处理可导致核酸任何单链部分的水解。
连接是在15-30μl体积中在下述标准条件和温度下进行的：20mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，10mM DTT，33μg/ml BSA，10-50mM NaCl，或者与40μM ATP和0.01-0.02(韦氏)单位的T4DNA连接酶在0℃连接(用于连接带有互补单链末端的片段)或者与1mM ATP和0.3-0.6单位的T4DNA连接酶在14℃连接(用于平端连接)。带有互补末端的片段的分子间连接通常在33-10014μg/ml总DNA浓度(5-100nM总末端浓度)下进行。平端分子间连接(通常采取20-30倍摩尔过量分子的接头，可选的)在1μM总末端浓度下进行。
在载体构建中，载体片段通常由细菌或小牛肠碱性磷酸酶(BAP或CIAP)处理以除去5’磷酸基并防止载体的再连接或再构建。BAP和CIAP的消化条件是本领域公知的，而且实验流程通常伴随着商业来源的BAP和CIAP酶一同出版。为了回收核酸片段，制备物用苯酚-氯仿抽提并用乙醇沉淀以除去磷酸酶并纯化DNA。作为选择，如果存在合适的酶切位点，可以在连接前后用限制性内切酶消化以阻止不希望的载体片段的再连接。
质粒构建体的正确连接可以运用本领域已知的任何合适的方法来验证。在下面列举的构建步骤中，质粒构建体的正确连接已经被证实，首先用连接混合物转化合适的宿主，比如大肠杆菌菌株DG101(ATCC 47043)或DG116(ATCC53606)。成功的转化子通过氨苄青霉素、四环素或其它抗生素抗性或敏感性或者通过其它标记来筛选，视质粒构建体的模式而定，这是本领域公知的。然后根据Clewell等，1969，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 62：1159的方法从转化子中制备质粒，可选择地随之进行氯霉素扩增，参见Clewell，1972，J.Bacteriol.110：667。可选择地，质粒DNA可以利用Bethesda Research Laboratories出版物Focus 5(2)第11页的“酸碱”抽提法制备，而且通过将该实验流程中的第12步到第17步替换为CsCl/溴化乙锭超速离心DNA可以获得非常纯的质粒DNA。作为另一种可选择的方法，商业来源的质粒DNA分离试剂盒，比如HISPEEDTM，QIAFILTERTM和QIAGEN质粒DNA分离试剂盒(Qiagen，Valencia CA)可以根据零售商提供的实验流程来使用。分离的DNA可以通过限制性内切酶消化和/或Sanger等的双脱氧方法测序进行分析，Sanger等，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463，该方法在Messing等，1981，Nuc.Acids Res.9：309中有进一步的描述，或者通过Maxam等的方法进行分析，Maxam等，1980，Methods in Enzymology 65：499。
调控序列、表达载体和转化方法都有赖于所用的表达基因的宿主细胞的类型。一般说来，原核、酵母、昆虫或哺乳动物细胞都可用作宿主。原核宿主通常是生产重组蛋白最有效和最方便的，所以优选用来表达所述的蛋白。
表达重组蛋白最常使用的原核细胞就是大肠杆菌。不过，也可以用大肠杆菌以外的微生物菌株重组表达蛋白，例如芽孢杆菌属(bacilli)，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，假单胞杆菌属(Pseudomonas)和沙门氏杆菌属(Salmonella)的不同菌种，以及其它细菌菌株。在这样的原核系统中，一般使用包含复制位点和来自宿主或与宿主相容的菌种调控序列的质粒载体。
为了表达在大多数细菌启动子控制下的构建体，大肠杆菌K12株MM294可以用来作为宿主，在大肠杆菌基因库中心(Genetic Stock Center)获取号为GCSC#6135。为了表达带有PLNRBS或PLT7RBS调控序列的表达载体，可以使用大肠杆菌K12株MC1000λ溶原性细菌，N7N53cI857 SusP80，ATCC 39351。于1987年4月7日保藏在ATCC的大肠杆菌DG116(ATCC 53606)和于1985年3月29日保藏在ATCC的大肠杆菌KB2(ATCC 53075)也是很有用的宿主细胞。至于M13嗜菌体重组体，使用的是易受嗜菌体侵染的大肠杆菌菌株，比如大肠杆菌K12株DG98(ATCC 39768)。DG98株于1984年7月13日保藏在ATCC。
举例来说，如Bolivar等，1977，Gene 2：95的描述，大肠杆菌有代表性地由pBR322衍生物转化。质粒pBR322含有氨苄青霉素和四环素抗性基因。这些药物抗性标记在构建所需的载体时要么被保留要么被破坏，以有助于检测所需的重组物的存在。通常采用的原核调控序列，例如用于转录起始的启动子，任选地带有一个操纵子，连同一个核糖体结合位点序列，包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统，见Chang等，1977，Nature 198：1056；色氨酸(trp)启动子系统，见Goeddel等，1980，Nuc.Acids Res.8：4057；以及λ来源的PL启动子，见Shimatake等，1981，Nature 292：128；和N基因核糖体结合位点(NRBS)。一种可转座的调控系统序列盒在美国专利号4711845中阐述，该专利在1987年12月8日公开。该序列盒包含一个可操作地连接于NRBS的PL启动子，而NRBS依次位于第3种DNA序列上游，并带有至少一个限制性酶切位点，以使其在NRBS序列的3’端6个碱基对的范围内被剪切。同样有用的是Chang等在欧洲专利公开No.196864中描述的磷酸酶A(phoA)系统，发表于1986年10月8日。不过，任何已有的与原核细胞相容的启动子系统都可以用来构建本发明的表达载体。
除了细菌之外，真核微生物，比如酵母，也可以用来作为重组宿主细胞。实验室菌株酿酒酵母(Saccharmyces cerevisiae)、贝克氏酵母是最常用的，尽管通常也使用一定数目的其它菌株。尽管使用2μ复制起始原点的载体很常见，见Broach，1983，Meth.Enz.101：307，其它适于酵母表达的质粒载体也是已知的，参见Stinchcomb等，1979，Nature 282：39；Tschempe等，1980，Gene 10：157；及Clarke等，1983，Meth.Enz.101：300。酵母载体的调控序列包括合成糖酵解酶的启动子，见Hess等，1968，J.Adv.Enzyme Reg.7：149；Holland等，1978，Biotechnology 17：4900；及Holland等，1981，J.Biol.Chem.256：1385。本领域已知的另外的启动子包括3-磷酸甘油激酶的启动子，见-Hitzeman等，1980，J.Biol.Chem.255：2073，以及其它糖酵解酶的启动子，比如甘油醛3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶以及葡萄糖激酶。其它的具有通过生长条件调控转录这一额外优势的启动子是乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶(Holland，同上)的启动子区域。
当终止子序列置于编码序列的3’末端时也可以用来增强表达。这样的终止子被发现位于酵母来源的基因的编码序列的3’端未翻译区。任何一个包含与酵母相容的启动子、复制原点及其它调控序列的载体都适于用来构建酵母表达载体。
该编码序列也可以在来源于多细胞有机体的真核宿主细胞培养物中予以表达。参见Cell&Tissue Culture：Laboratory Procedures，Wiley，Doyle等编辑(1993)。可用的宿主细胞系包括COS-7、COS-A2、CV-1、鼠细胞比如鼠骨髓瘤细胞N51和VERO、HeLa细胞、以及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。用于这些细胞的表达载体一般包括能与哺乳动物细胞相容的启动子和调控序列，比如象常用的来自猿猴病毒40(SV40)的早期和晚期启动子，见Fiers等，1978，Nature 273：113，或其它病毒启动子例如来源于多瘤病毒、腺病毒2、牛乳头状瘤病病毒(BPV)、或禽类肉瘤病毒的启动子，或免疫球蛋白启动子及热休克启动子。一个利用BPV载体系统在哺乳动物系统中表达DNA的系统已在美国专利No.4419446中公开。对该系统的修饰在美国专利No.4601978中予以描述。关于哺乳动物细胞宿主系统转化的一般概念已由Axel在美国专利No.4399216中予以描述。“增强子”区域在优化表达中也很重要；通常，它们是位于启动子区域上游的一些序列。如果需要，复制原点可自病毒来源获得。不过，整合到染色体中是真核细胞中DNA复制的常见机制。
植物细胞也可用作宿主，而且与植物细胞相容的调控序列也可使用，例如胭脂碱合酶启动子和腺苷酰化信号序列，见Depicker等，1982，J.Mol.Appl.Gen.1：561。利用杆状病毒载体提供的调控序列使用昆虫细胞的表达系统也已有描述，见Miller等，Genetic Engineering(1986)，Setlow等，PlenumPublishing，Vol.8，pp.277-97。基于昆虫细胞的表达可以在草地夜蛾(Spodopterafrugipeida)中实现。上述系统也能成功地生产重组酶。
依据所用的宿主细胞，利用适合这些细胞的标准技术进行转化。使用氯化钙进行的钙处理，如Cohen，1972，在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：2110中所描述的，被用于原核细胞及其它具有坚固的细胞壁屏障的细胞。用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)进行的感染被用于某些植物细胞，见Shaw等，1983，Gene 23：315。至于哺乳动物细胞，优选Grahamet等，1978，Virology 52：546的磷酸钙沉积法。酵母的转化是根据Van Solingen等，1977，J.Bact.130：946和Hsiao等，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：3829的方法进行的。
修饰编码本发明的酶的DNA序列而不改变其所编码的蛋白的氨基酸序列以提供一个，比方说，更适应于宿主细胞密码子利用的序列是可能的。对初始的5-6个密码子进行这样的修饰可以提高表达效率。为提高表达效率而修饰过而又编码相同的氨基酸序列的DNA序列被认为是等价的，全都包括在本发明之中。
大量引物指导的位点特异性的诱变方法已经存在，且为本领域熟知的，参见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，1989，第二版，第15.51章，“寡核苷酸介导的诱变”，在此引用作为参考。可用聚合酶链式反应(PCR)进行位点特异性诱变。在本领域另外一个标准技术中，用人工合成的编码所需突变的寡核苷酸作为引物，以指导合成单链载体中所含的核酸序列的互补链，例如pBSM13+衍生物，作为模板用以合成突变引物的延伸产物。突变DNA转化进宿主细菌，转化的细菌培养物涂平板并被鉴定。对修饰载体的鉴定可以包括将筛选的转化子的DNA转移到硝化纤维素膜或其它膜上，然后将“揭膜”(lifts)与酶促合成的突变引物在特定的温度下杂交，该温度允许与修饰后序列准确配对的杂交但是防止与原始未突变链杂交。随后培养包含了能与探针杂交的DNA的转化子(该DNA的序列一般通过序列分析加以确认)，并作为修饰后的DNA的保藏库。
一旦蛋白在重组宿主细胞中表达了，就可能希望纯化该蛋白。很多纯化步骤都可以用来纯化本发明的重组热稳定或热激活的DNA聚合酶。例子包括美国专利No.4889818、5352600和5079352中描述的纯化Taq DNA聚合酶的方法；美国专利No.5618711和5310652中描述的纯化来自嗜热栖热杆菌(Thermusthermophilis)(Tth)DNA聚合酶的方法；美国专利No.5374553和5420029中描述的纯化Tma DNA聚合酶的方法。纯化这些DNA聚合酶的方法在美国专利No.5466591中也有描述。所有上述专利都在此引用作为参考。
本发明的一个方面，所述的DNA聚合酶在大肠杆菌，一种中温菌宿主细胞中表达。由于大肠杆菌宿主的大多数蛋白是热敏的，所述的重组热稳定或热激活的DNA聚合酶可以通过热失活裂解物原液而大量富集。该步骤是在存在足够量的盐(有代表性地是0.2-0.4M硫酸铵)的条件下进行的，以降低DNA聚合酶与其它细胞裂解蛋白相互间的离子作用。在一个实施方案中，纯化的DNA聚合酶的活性是通过下面实施例3中描述的方法进行分析的。
为了保持长期稳定，纯化的DNA聚合酶必须储存在含有一种或多种非离子型聚合物洗涤剂的缓冲溶液中。这样的洗涤剂通常具有大约100到25000优选大约4000到200000道尔顿范围的分子量，并在pH值从大约3.5到大约9.5优选从大约4到8.5时使酶稳定。所述洗涤剂的例子包括那些在McCutcheon’sEmulsifiers ＆ Detergents北美版(1983)的295-298页具体给出的，由MCPublishing公司McCutcheon分部出版，地址175 Rock Road，Glen Rock，NJ(USA)，其公开的全部内容在此引用作为参考。在一个实施方案中，洗涤剂选自：乙氧基脂肪醇醚和月桂醚、乙氧基烷基苯酚、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、修饰的乙氧基和/或丙氧基直链醇、聚乙二醇一油酸化合物、多乙氧基醚化合物、以及酚脂肪醇醚。在另一个实施方案中，洗涤剂选自：Tween 20TM，来自ICI Americas Inc.(Wilmington，DE)公司的一种多聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐甘油一月桂酸酯，以及IconolTMNP-40，来自BASF Wyandotte Corp.(Parsippany，NJ)公司的一种乙氧基烷基苯酚(壬基)。
6.本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的用途
本发明的热稳定或热激活酶可以用于必需或需要具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的任何目的。在一个实施方案中，本发明的酶被用于PCR。使用该PCR的应用例子包括，例如，直接克隆基因组DNA或cDNA、体外诱变和DNA的设计、法医样品的遗传指纹图谱分析、传染因子存在的鉴定、产前遗传病的诊断、等位基因序列多样性的分析、RNA转录本结构的分析、基因组足迹分析法、以及基因组DNA和cDNA的直接核苷酸序列测序。参见例如Current Protocols In Molecular Biology，2001，Ausubel等(编辑)，John Wiley ＆ Sons，第15章；以及PCR Strategies，1995，Innis等(编辑)，AcademicPress，Inc.，在此全文引用作为参考。
7.试剂盒
本发明的热稳定性或热激活性DNA聚合酶适于制备试剂盒。运用公知的技术，包含本发明突变DNA聚合酶的试剂盒能够用于可检测的标记DNA分子、测序DNA、或扩增DNA分子，根据组成试剂盒的内含物而定。这样的试剂盒可以包含一个分隔成室的承载装置，以在密闭的空间内接收一个或多个诸如瓶、试管及其它类似的容器装置。每一个这样的容器装置盛有进行DNA测序、DNA标记或DNA扩增所必需的成分或成分混合物。
用于DNA测序的试剂盒可以包含一定数目的容器装置。例如，第一个容器装置可以，包含本发明的足够纯的热稳定性或热激活性DNA聚合酶样品，第二个容器装置可以包含一种或数种类型的合成DNA模板的互补DNA分子所需的核苷酸，第三个容器装置可以包含一种或数种不同类型的双脱氧核苷三磷酸。除了上述的容器装置之外，该试剂盒还可以包括含有一种或数种DNA引物的额外的容器装置。
用于DNA扩增的试剂盒可以包含，比方说，含有本发明的足够纯的突变DNA聚合酶的第一个容器装置，以及含有单独类型的核苷酸或核苷酸混合物的一个或数个额外的容器装置。扩增DNA的试剂盒中可以包括、也可以不包括各种引物。
如果需要，本发明的试剂盒还可以包括含有可检测的标记核苷酸的容器装置，该标记的核苷酸可用于DNA分子的合成及测序。可选多种标记物中的一种来检测这样的核苷酸。说明性的标记物包括，但不局限于，放射性同位素、荧光标记物、化学发光标记物、生物发光标记物和酶标记物，以及其它任何一种直接或间接标记核苷酸或核酸的标记物。
在以下非限制性的实施例中，除非另外指出，所有百分比对于固体而言均为重量百分比，而对于液体来说则为体积百分比。
实施例1：pCS6和pCS5的突变
该实施例描述了热稳定及热激活DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶结构域的定点突变。
在第一轮的诱变中，采用定点诱变方法来改变热稳定DNA聚合酶的残基，这些残基要么是已知的对于协调二价金属阳离子具有重要作用的、Klenow片段高保真结构域中活性位点的同源残基，要么就是位于这些同源残基之间。见Derbyshire等，1995，Methods In Enzymology 262：363-85，在此全文引用作为参考。利用了编码突变的嵌合热稳定DNA聚合酶CS6的质粒pCS6，见图5。CS6是嵌合热稳定DNA聚合酶CS5的一种突变型，见图4。CS5的N-末端部分为来自栖热菌种Z05(Thermus species Z05)DNA聚合酶N-末端的291个残基，编码其5’-3’核酸外切酶活性，见美国专利No.6228628。CS5的其余部分为来自TmaDNA聚合酶C-末端的602个残基，具有其3’-5’核酸外切酶活性及DNA聚合酶活性。除了在其3’-5’核酸外切酶结构域具有突变D323A和E325A以外(除非另外具体指出，自始至终都是使用野生型Tma酶的残基编号)，CS6与CS5是相同的。正如这里所显示的，这些突变导致CS6没有可检测的3’-5’核酸外切酶活性。
以323位和325位的酸性残基以及324位的亮氨酸残基为靶，每一个突变(D323E除外，如下所述)都利用相同的基本方法进行。如表2所示，人工合成简并的寡聚核苷酸对。每对中的一个简并寡聚核苷酸是11个残基(11-mer)，另一个是17个残基。除了简并的核苷酸，每对寡聚核苷酸中11个残基与该对中17个残基的寡聚核苷酸中的11个核苷酸序列完全互补。至于D323E突变，如表2所示，设计了一对非简并的互补寡聚核苷酸。每对中的简并寡聚核苷酸在退火条件下混合以便寡聚核苷酸彼此之间完全互补，包括在其简并位点上，退火形成一个11对残基的双链DNA且其两侧一端具有3’-TA臂(overhang)、另一端具有5’-CTAG臂，如表2所示。这些末端分别与限制性内切酶Sgf I和Spe I产生的末端相适配。这样，每种退火反应都产生一些如表2所示的完全互补并且退火的寡聚核苷酸对混合物。
随后将5μg pCS6在25μl反应体系中37℃消化2.5小时，该体系包含15单位的限制性内切酶Spe I、50mM Tris·HCl、10mM MgCl2、100mM NaCl、pH7.5。通过75℃加热10分钟使酶失活，然后冷却到室温。再加入15单位的限制性内切酶Sgf I，继续在37℃保温2小时。然后将反应液在25℃储存过夜。这些步骤使得pCS6线性化并移去了编码323位和325位酸性残基(在pCS6中是突变的)以及324位的亮氨酸残基的密码子，而且也留下了与退火的简并引物对的末端相适配的末端。
在另外的反应中，0.5pmol的每种退火的寡聚核苷酸对混合物与0.1pmol的线性化pCS6及0.5单位的T4DNA连接酶(Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala Sweden)在其提供的缓冲溶液中混合并于4℃下保温过夜。
然后将每种连接混合物1μl(20ng)利用GENE PULSERTM电转化仪(Bio-RadLaboratories，Hercules CA)基本上根据制造商的说明来转化大肠杆菌DG116。电击的细胞由1ml SOC培养基稀释，并于30℃振荡培养1小时。50或100μl的等份重悬细胞涂布于添加了100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，以便筛选转化的细胞，然后培养过夜。
对每种转化挑取5个克隆进行PCR扩增和酶切分析以鉴别其含有哪一种突变的pCS6质粒，如果有的话。每个克隆悬浮于50-主混合物中(master mix)，该混合物含有PCR缓冲液II(PE-Applied BioSystems，Redwood City，CA)，40μMdNTP混合物及CS4和CS1A引物各20pmol。
CS1A：GTATGTAGTACGCTTCCTTTGGTTTGAA  (SEQ ID NO：35)
CS4： TGGCTTTGGGAGAAGTACGGCCT       (SEQ ID NO：36)
每个克隆扩增的DNA由表3所示的鉴定性限制性内切酶矩阵消化，以确定其是否正确地引入了合成的寡聚核苷酸，如果是，引入的又是哪一个突变序列。酶切位点模式正确的克隆随之在插入区域进行测序分析，以保证所选择的每个待进一步应用的质粒都只引入了所需的突变。表2
                           第一轮所用的寡聚核苷酸
简并寡聚核苷酸对(简并位点标示为粗体小写字母) 突变 杂合的突变寡聚核苷酸对
Cs6 5′  CGACGAa/tGAGA(SEQ ID NO：37)CS7 3′  TAGCTGCTt/aCTCTGATC(SEQ ID NO；38) L324-＞EL324-＞D 5′ CGACGAAGAGA(SEQ ID NO：39)3′  TAGCTGCTTCTCTGATC(SEQ ID NO：40)5′  CGACGATGAGA(SEQ ID NO：41)3′  TAGCTGCTACTCTGATC(SEQ ID NO：42)
CS8 5′    TGATa/cAGGAAA(SEQ ID NO：43)Cs9 3′    TAACTAt/gTCCTTTGATC(SEQ ID NO：44) L324-＞KL324-＞Q 5′  TGATAAGGAAA(SEQ ID NO：45)3′  TAACTATTCCTTTGATC(SEQ ID NO：46)5′  TGATCAGGAAA(SEQID NO：47)3′  TAACTAGTCCTTTGATC(SEQID NO：48}
CS10 5 ′ CGATa/cATGAAA(SEQID No：49)Cs11 3′  TAGCTAt/gTACTTTGATC(SEQ ID NO：50) L324-＞NL324-＞H 5′  CGATAATGAAA(SEQID NO：51)3′  TAGCTATTACTTTGATC(SEQ ID NO：52)5′  CGATCATGAAA(SEQ ID NO：53)3′  TAGCTAGTACTTTGATC(SEQ ID NO：54)
CS12 5′   TGAc/gCTGGATA(sEQ ID NO：55)CS13 3 ′  TAACTg/cGACCTAAGATC(SEQ ID NO：56) E325-＞DD323-＞E，E325-＞D 5′  TGACCTGGATA(SEQID NO：57)3′  TAACTGGACCTATGATC(SEQ ID NO：58)5′  TGAGCTGGATA(SEQID NO：59)3′  TAACTCGACCTATGATC(SEQ ID NO；60)
CS14 5′    TGAGCTTGAGA(SEQ ID NO：61)CS15 3′    TAACTCGAACTCTGATC(SEQ ID NO：62) D323-＞E 5′  TGAGCTTGAGA(SEQ ID NO：63)3′  TAACTCGAACTCTGATC(SEQID NO：64)
表3Tma L324 E/D/K/N/Q/H及323/325突变酶的限制性内切酶位点
L324突变酶(D323E325) BsmA I Cla I* Taq I* Bcl I@A321 Bcl I@D323 EarI BspHI
    E + - + + - + -
    D + - + + - - -
    K - - - - - - -
    N - + + + - - -
    Q - - - - + + -
    H -  + + + + + +
  X23L324X325 BstN I Alu I Sml I
    D-L-D + - - - - - -
    E-L-D - + - - - - -
    E-L-E - + + - - - -
    亲本酶 BsmA IBstN I Cla ITaq I Sml I Bcl I@A321 Bcl II@D323 EarI BspHI
CS5(D-L-E) - + - - - - -
CS6(A-L-A) - - - +还有SgfI+ - - -
*在Dam+大肠杆菌中无；在PCR产物及Dam-大肠杆菌中有。
在第二轮的突变中，以那些已知的或者据猜测与3’-5’核酸外切酶活性底物结合有关的残基为靶，利用了基于PCR的定点诱变方法。如表4所示，每一个突变都设计了引物对，每个引物对允许扩增pCS5中聚合酶编码基因的一部分。只有一个引物对用于L329A突变，在这个突变中，该对中的一个引物在扩增子中引入突变，两个引物在其末端附近都含有限制性酶切位点，使得它们能够亚克隆到用同样酶消化的pCS5中，从而产生编码携带L329A突变的Z05-Tma杂合DNA聚合酶的表达质粒。第二轮突变中其它的每一个突变的产生都使用了2个引物对。对于每一个突变，每对引物中的一个包含了所需的突变，但除此之外与pCS5是互补的；每对中的另一个引物是与pCS5的某部分完全互补的。用pCS5作模板以每对引物各自进行PCR，这些反应产生了大约有35个核苷酸重叠的扩增子，扩增子重叠的部分含有所需的突变。接着进行另外一个PCR扩增，其中混合了两个部分重叠的扩增子、并且使用了每对引物中的侧翼序列引物(例如，不包含突变序列的各个引物对的单独扩增引物)。该反应得到了一个大的扩增子，它由先前的PCR所产生的两个部分重叠的扩增子组成。所述的侧翼序列引物被设计成与聚合酶编码基因中含有有利于克隆的限制性酶切位点的那部分互补。扩增子及pCS5随之用那些限制性内切酶消化、混合并连接，以产生含有所需突变的表达质粒。连接产物被用来按前述方法转化大肠杆菌。如上所述，利用表5所列的酶切位点对成功的突变进行核实。
表4
第二轮所用的引物
突变 正向引物(改变的密码子以粗体小写字母标示) 反向引物
L329A  CS20GAAACTAGTTCCgctGATCCTTTCGA(SEQID NO：65)  CS36GAAAAGAGAAGGACATGAGCTCTTGGTAA(sEQ ID NO：66)
突变 突变引物 侧翼序列引物
Y464A Cs21(正向重叠引物)AGAAAAAGCtGCGAAtgcaTCCTGTGAAGATGCAGA          (SEQ ID NO：67)Cs22(反向重叠引物)CTGCATCTTCACAGGAtgcaTTCGCaGCTTTTTCTA          (SEQ ID NO：69) CS37TTTCCAGATCTGCCTCGTGGAGTTTTAA(SEQ ID NO：68)CS35ACCAAGAGCTCATGTCCTTCTCTTTTCCG(SEQID NO：70)
Q384A  Cs23(正向重叠引物)CGTTGGTgccAATTTGAAATTCGATTACAA(SEQID NO：71)Cs24(反向重叠引物)TGTAATCGAATTTCAAATTggCACCAACGA(SEQ ID NO：72) CS36GAAAAGAGAAGGACATGAGCTCTTGGTAA(SEQID NO：66)AW964GGAAACTAGTTCCCTCGATCC(SEQID NO：73)
N385A Cs25(正向重叠引物)CGTTGGTCAGgCCTTGAAATTCGATTACAA(sEQID NO：74)Cs26(反向重叠引物)TGTAATCGAATTTCAAggcCTGACCAACGA(SEQ ID NO：75) CS36GAAAA(AGAAGGACATGAGCTCTTGGTAA(SEQ ID NO：66)AW964GGAAACTAGTTCCCTCGATCC(SEQ ID NO：73)
Q384AN385A CS27(正向重叠引物)CGTTGGTgccgCTCTGAAATTCGATTACAA(SEQ ID NO：76) CS36GAAAAGAGAAGGACATGAGCTCTTGGTAA(SEQ ID NO：66)
Cs28(反向重叠引物)TGTAATCGAATTTCAgAgCggcACCAACGA(SEQ ID NO：77) AW964GGAAACTAGTTCCCTCGATCC(SEQ ID NO：73)
D389E Cs29(正向重叠引物)TGAAATTCGAgTACAAGGTGTTGATGGTGAA               (SEQ ID NO：78)Cs30(反向重叠引物)CAACACCTTGTAcTCGAATTTCAAA(SEQ ID NO：79) CS36GAAAAGAGAAGGACATGAGCTCTTGGTAA(SEQ ID NO：66)AW964GGAAACTAGTTCCCTC(GATCC(sEQID NO：73)
表5
第二轮所用的引物及其限制性内切酶位点
引物 克隆酶切位点 筛选酶切位点
CS20    (SEQ ID NO：65) spe I MspAl I
CS36    (SEQ ID NO：66) Sac I
CS21    (SEQ ID NO：67) Bsm I，Nsi I
CS37    (SEQ ID NO：68) BglII
CS35    (SEQ ID NO：70) Sac I
CS22    (SEQ ID NO：69) Bsm I，Nsi I
CS23    (SEQ ID NO：71) Ban I
CS24    (SEQ ID NO：72) Ban I
AW964   (SEQ ID NO：73) Spe I
CS25    (SEQ ID NO：74) Stu I
CS26    (SEQ ID NO：75) Stu I
CS27    (SEQ ID NO：76) Ban I，BsrB I
CS28    (SEQ ID NO：77) Ban I，BsrB I
CS29    (SEQ ID NO：78) Tat I，Rsa I
CS30    (SEQ ID NO：79) Tat I，Rsa I
实施例2：突变热稳定DNA聚合酶的生产和纯化
上述连接所得的质粒含有在λPL启动子调控下的聚合酶基因。用该质粒转化包含cI857(热不稳定型)λ抑制子的宿主细胞(DG116，ATCC#53606)。转化了含有野生型或突变聚合酶基因的质粒的DG116细胞被用来接种10ml添加氨苄青霉素(100μg/ml)的标准摇瓶培养基(SFM；由葡萄糖、维生素B1、酪蛋白水解物及基本培养基组成)，在30℃，250rpm过夜生长。用5ml过夜培养物接种450ml SFM+氨苄青霉素培养基并于30℃，250rpm摇床培养直到培养物OD600达到0.6-0.8。随后将培养物转移到37℃，250rpm过夜生长，以获取温度诱导表达的聚合酶。参见例如美国专利No.5079352、5420029和5618711。3000×g离心15分钟收集过夜培养物沉淀。
沉淀重悬于30ml裂解缓冲液中(50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA，1mM DTT，1mM Pefabloc，1μg/ml亮抑酶肽，0.2mM TLCK)，并且用弗氏压碎器在16000磅/平方英寸(psi)裂解细胞。细胞裂解悬浮液加入0.2M(NH4)2SO4并在75℃加热15分钟以使大肠杆菌宿主蛋白失活和变性。加热的抽提液于0℃冷却15分钟，加入0.6％聚乙烯胺以沉淀宿主DNA，并于16000×g离心30分钟。澄清的提取液加载到预先由50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA，1mMDTT，0.2M(NH4)2SO4平衡好的2ml苯基琼脂糖柱子上。柱子用6ml平衡液冲洗，然后用2ml含50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA，1mM DTT的溶液冲洗，最后用2ml含50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA，1mM DTT，20％乙二醇的溶液冲洗。蛋白用50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA，1mM DTT，2.5尿素洗脱。洗脱液中加入100mM KCl并加载到预先由25mM Tris-HCl，pH7.5，1mMEDTA，1mM DTT，100mM KCl平衡好的2ml肝素琼脂糖柱子上。柱子用6ml平衡液冲洗，并用6ml含25mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA，1mM DTT，400mM KCl的溶液洗脱。最终的洗脱液通过透析和稀释加入20mM Tris-HCl，pH8.0，0.1mM EDTA，1mM DTT，100mM KCl，0.2％吐温20，50％体积比的甘油，并储存于-20C。
实施例3：3’-5’核酸外切酶活性的标准分析
以下的实施例提供了测定热稳定性或热激活性DNA聚合酶3’-5’核酸外切酶活性的标准分析方法以及1单位3’-5’核酸外切酶活性的定义。
为了比较CS5突变衍生物的3’-5’核酸外切酶活性，对羧基荧光素(FAM)标记的单链寡聚核苷酸底物NJS40的降解进行了测量。
NJS40：FAM-GCGCTAGGGCTGGCAAGTGTAGCGGTCAC  (SEQID NO：80)
标准分析方法(40μl体系)在50mM Tricine，pH8.3，25mM KOAc，5％重量/体积比的DMSO，0.5mM Mn(OAc)2及5％(体积比)酶储存缓冲液组份(在反应液中：1mM Tris，pH8.0，0.005mM EDTA，0.05mM DTT，5mM KCl，0.025％吐温20，2.5％甘油)中含有4pmol(100nM)EAM标记的单链寡聚核苷酸NJS40。通过加入NJS40和Mn(OAc)2而起始反应，并在63℃保温15分钟，通过加入40μl 50mMEDTA而终止反应。调整酶浓度和反应时间以得到线性化结果。反应在起始寡聚核苷酸大约有1-20％转化为较短产物的范围内呈线性，对应的酶浓度是0.5-10毫单位；酶浓度总是小于底物浓度。反应终止液用甲酰胺稀释到0.1nM寡聚核苷酸并通过毛细管电泳(ABI3100，Applied Biosystems，Foster City，CA)进行分析。起始大小的及降解的寡聚核苷酸的峰高用GENESCANTM软件(AppliedBiosystems，Foster City，CA)测定。寡聚核苷酸转化为较短寡聚核苷酸的pmol数等于
{1-(15分钟后剩余的Pn相对量)}×(反应起始时Pn的pmol数)
其中Pn是指具有原始长度n的底物寡聚核苷酸(NJS40)。15分钟后剩余的Pn相对量是通过测量相应于起始大小的寡聚核苷酸的峰高并除以所有峰高的总和来确定的。因而该分析测量了NJS40寡聚核苷酸3’末端核苷酸的释放速率。在标准分析条件下，1单位3’-5’核酸外切酶活在15分钟内催化50pmol单链NJS40寡聚核苷酸转化为更短的寡聚核苷酸。
利用该标准分析方法对由上述方法制得的突变DNA聚合酶进行了表征。分析结果示于表6标记为“ssDNA”的一栏中。
利用美国专利No.4889818教导的分析方法对每个突变体的聚合酶活性进行了测量。简言之，保存在储存缓冲液中(20mM Tris，0.1mM EDTA，1mM DTT，100mM KCl，0.5％吐温20，50％甘油)的一定量的酶储物在酶稀释液中(25mMTris-HCl，pH8.0，50mM KCl，1mMβ-巯基乙醇，0.5％吐温20，0.5％NP40，100μg/ml明胶)稀释以在每个分析中产生大约0.02到0.1单位的聚合酶活性。5μl稀释酶加到45μl反应缓冲液中(25mM TAPS，pH9.4，50mM KCl，2mMMgCl2，1mMβ-巯基乙醇，200μMd(GTA)TP，100μMα-33P-dCTP，30μg活化的鲑鱼精DNA(“活化的”DNA是用DNA酶I部分水解直到5％的DNA转化为酸溶性片段后所得的天然制备物))。反应在74℃保温10分钟，然后用10μl60mMEDTA终止。每种终止液50μl加到含有1mlpH8.0的2mMEDTA及50μg/ml载体DNA(通过21号标准针孔剪切过的鲑鱼精DNA)的试管中。加入1ml 20％的三氯乙酸(TCA)和2％焦磷酸钠并将试管在涡流振荡器上温和振荡，再将试管置于冰上温育10到20分钟以使DNA完全沉淀。沉淀的DNA由多头真空抽滤装置上的GF/C过滤器收集。过滤器先用5％TCA和1％焦磷酸钠各冲洗3次、再用20％TCA冲洗3次、最后用95％乙醇冲洗3次。两个空白过滤器用相似的步骤进行了处理，以确定仪器的背景误差。利用OMNIFLUOR(Packard BioScience B.V，Groningen，The Netherland)和一个LS6000ICTM闪烁计数器(Beckman Coulter，Fullerton CA)对沉淀DNA中结合的放射性进行了量化。1个单位的聚合酶活性定义为在上文提供的分析条件下在30分钟内TCA沉淀的DNA中总共结合10nmol的dNMP所需的酶活量。
实施例4：测量3’-5’核酸外切酶活性的变形分析方法
还利用两种变形的标准分析方法对上述的突变热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性进行了标示。除了各自利用了不同的底物之外，这两种变形分析方法与标准分析是相同的。正如标准分析中那样，在每个变形分析中，测量了寡聚核苷酸NJS40的3’末端的核苷酸释放速率。不过，在变形分析中，NJS40杂合了一个互补寡聚核苷酸。第一个变形分析采用了一个完全配对的双链DNA底物：
NJS40：3′FAM-GCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCAC(SRQ ID NO：80)
NJS43：5′pAGCGATCCCGCGACCGTTCACATCGCCAGTGCGACGCGCATTGGTGGTGTGGGCGGCGCC
                                                     (SEQ ID NO：81)
在表6标记为“dsDNA”的一栏中提供了利用第一个变形分析方法对上述突变体分析所得的结果。
第二个变形分析采用了含有一对错配碱基的一个双链DNA底物：
NJS40：3′FAM-GCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCAC(SEQ ID NO：80)
NJS44：5′pAGCGATCCCGCGACCGTTCACATCGCCAGTTCGACGCGCATTGGTGGTGTGGGCGGCGCC
                                                     (SEQ ID NO：82)
在表6标记为“含错配碱基的dsDNA”的一栏中提供了利用第二个变形分析方法对上述突变体分析所得的结果。
                                                                            表6第一轮和第二轮突变体的聚合酶活性和3’-5’核酸外切酶活性
    5’-3’聚合酶     3’-5’核酸外切酶
    ssDNA     dsDNA     含错配碱基的dsDNA
  酶     特异性酶活性U/pmol     速率#pM/s    特异性酶活性U/pmol ％   聚合酶/3’外切比例 速率pM/s 特异性酶活性U/pmol     ％     聚合酶/3’外切比例   速率pM/s   特异性酶活性U/pol     ％     聚合酶/3’外切比例
  CSS     8.6     136.1     9.9   100.0     0.9   154.7     11.3     100.0     0.8     228.1     16.6     100.0     0.5
  Y464A     14.7     0.2     0.0   0.1     1008.0   0.2     0.0     0.1     1008.0     0.2     0.01     0.1     1008.0
  D389E     13.0     2.2     1.6   16.2     8.1   25.5     1.9     16.5     7.0     66.8     4.9     29.3     2.7
  L329A     6.4     14.5     1.1   10.7     6.1   12.1     0.9     7.8     7.3     44.1     3.2     19.3     2.0
  Q384A-N385A 7.7 5.1 0.4 3.7 20.9 63 0.5 4.1 16.9 24.8 1.8 10.9 4.3
  Q384A     13.0     31.1     2.3   22.9     5.8   36.7     2.7     23.7     4.9     104.4     7.6     45.8     1.7
  N385A     11.8     48.4     3.5   35.6     3.4   59.7     4.3     38.6     2.7     145.6     10.6     63.8     1.1
  L324Q     8.2     37     2.7   27.2     3.0   49.8     3.6     32.2     2.3     94.8     6.9     41.6     1.2
  L324H     10.3     46.3     3.4   34.0     3.1   54.3     3.9     35.1     2.6     99.6     7.2     43.7     1.4
  L324E     7.1     65.6     4.8   48.2     1.5   56.8     4.1     36.7     1.7     102.4     7.4     44.9     1.0
  L324D     8.6     83.4     6.1   61.3     1.4   61     4.4     39.4     1.9     130.6     9.5     57.3     0.9
  L324K     8.0     46.9     34   34.5     2.4   69.4     5.0     44.9     1.6     127.1     9.2     55.7     0.9
  L324N     8.3     55.1     4.0   40.5     2.1   72.7     5.3     47.0     1.6     152.4     11.1     66.8     0.8
#速率是值0.25nM酶的速率。
实施例5：突变的热稳定性或热激活性DNA聚合酶与突变的大肠杆菌DNA聚合酶3’-5’核酸外切酶活性的比较
该实施例表明突变的热稳定性或热激活性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性不能够从相似的Eco DNA Pol I突变聚合酶所具有的酶学特性推断出来。表7给出了第二轮突变聚合酶与相似的大肠杆菌Pol I突变体3’-5’核酸外切酶活性的比较。
表7
    大肠杆菌*Pol I突变体与CS5第二轮突变体的比较残基校正活性(％野生型)
大肠杆菌中的突变 双链DNA    单链DNA  CS5中的突变     双链DNA     单链DNA
    Y497A     5.6％     2.9％     Y464A     0.1％     0.1％
    L361A     4.0     37     L329A     7.8     10.7
    D424E     4.0     8.3     D389E     16.5     16.2
    Q419A     23     20     Q384A     23.7     22.9
*基于Derbyshire等，1995，Methods In Enzymology 262：363-85的方法
Figure A0313123300841
来自表6
表7给出的结果表明，相对于相应的野生型酶的活性，在Eco和CS5 DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶结构域中相似的突变通常对这些酶的校正活性带来不同的效果。Eco Q419A突变和CS5 Q384A突变之间的比较显示在这两个酶中的相似突变能够相似地影响其3’-5’核酸外切酶活性。然而，对于某些相似突变，却观察到酶活性具有明显的差别。在某些突变对中，该差别仅仅是数量上的。举例来说，Eco Y497A突变较之于CS5 Y464A突变对ssDNA和dsDNA两种底物的残余酶活都相对要大得多。其它的一些相似突变则显示了质的区别。举例来说，Eco L361A和D424E突变对ssDNA底物都比对dsDNA底物具有高得多的活性。不过，相似的CS5突变(分别为L329A和D389E)对ssDNA和dsDNA两种底物的残余活性都差不多。
实施例6：利用具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的突变热稳定DNA聚合酶进行PCR
利用HIV抗药性分析方法测试了突变体酶Y464A，D389E，L329A，Q484A/N385A，Q384A，N385A和L324Q的逆转录酶/PCR活性。用120单位CS6(不具有可检测的3’-5’核酸外切酶活性)和5单位CS5(具有野生型3’-5’核酸外切酶活性)的混合物作为对照。采用1.7kbHIVr分析条件(50mM Tricine pH8.3，45mM KOAc pH7.5，0.9mM Mn(OAc)2，5％DMSO，0.2mM d(AGC)TP，0.3mMdUTP，0.03mM dTTP，0.2x SYBR Green I，G46E CS5/CS6酶混合物(5/125单位)或60或30单位聚合酶活性的各种突变体酶，1单位UNG，和0.4-M各种(-1)2’-氨基修饰的引物(RN326和RN328)以及动力热循环，见Myers等，2000，AntiviralTherapy 5：Abstract 49)以特异性的灵敏的扩增这些蛋白酶的基因和HIV逆转录酶基因的前400个密码子。
RN326：GAGGGGTATTGACAAACTCCCACTCAGGAATCXA  (X＝2’氨基脱氧胞嘧啶核苷酸)
(SEQ ID NO：83)
RN328：GCG3AATTTTCTTCAGAGCAGACCAGAGCCAAXA(X＝2’氨基脱氧胞嘧啶核苷酸)
(SEQ ID NO：84)
利用GENEAMPTM 5700 SDS热循环仪(PE Biosystems，Foster City，CA)按以下热循环步骤进行：50℃2分钟，60℃60分钟，95℃1分钟，随之在95℃20秒、58℃15秒、65℃1分45秒循环4次，随后在90℃ 20秒、58℃15秒、65℃1分45秒循环36次，随后65℃10分钟结束。图9显示了PCR扩增的增长曲线。还用相同的步骤对不同数量的酶进行了扩增并用凝胶电泳进行了分析。PCR后酶100μl反应液中取5μl加样到1％琼脂糖凝胶中，基本上按照Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，1989，第二版描述的方法进行电泳。凝胶用1μg/ml溴化乙锭溶液染色，所得的凝胶显示于图10。在图10中，第20、40和48泳道＝作为分子量标记的BstII消化的λDNA(New England Biolabs，Beverly，MA)；第36-38及58-60泳道＝阴性对照(5U CS5，125U CS6，无模板)；第33-35及55-57泳道＝阳性对照(5UCS5，125U CS6)；第1-3泳道＝60UY464ACS5；第4-6泳道＝30UY464ACS5；第7-9泳道＝60U D389E CS5；第10-12泳道＝30U D389E CS5；第13-15泳道＝60U L329A CS5；第16-18泳道＝30U L329A CS5；第21-23泳道＝60UQ384A-N385ACS5；第24-26泳道＝30UQ384A-N385ACS5；第27-29泳道＝60U Q3g4A CS5；第30-32泳道＝30U Q384A CS5；第41-43泳道＝60U N385ACS5；第44-46泳道＝30U N385A CS5；第49-51泳道＝60U L324Q CS5；第52-54泳道＝30U L329Q CS5(其中所有单位均指DNA聚合酶活性)。
根据其CT值(图9)、以及通过对扩增产物的凝胶分析(图10)所检测到的它们所产生的特异和非特异扩增产物来判断突变体酶。这些结果表明那些具有大于3％但是小于20％野生型校正活性的突变体(正如利用上文实施例3中描述的标准分析方法所测量的)能够很好地对1.7kb HIV RNA模板进行逆转录PCR扩增。这些突变体还具有在0.4-1.6U/pmol之间的特异性酶活性，以及大于6.0但是小于25.0U pol/U eXo的聚合酶活性比3’-5’核酸外切酶活性比例，这些酶活性是用实施例3中描述的方法测量的，而且产生的PCR结果可以比得上利用CS5和CS6的混合物得到的结果。根据对其扩增产物的凝胶分析来判断，Q384A CS5和N385A CS5也能较好地进行逆转录PCR扩增，尽管不如根据其GT值判断的那样好。
实施例7：减弱热稳定或热激活A家族DNA聚合酶3’-5’核酸外切酶活性的位点特异性突变的靶残基的鉴别
该实施例提供了一种方法，用于鉴别热稳定或热激活A家族DNA聚合酶中能够被突变而且可以通过实验检测出具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的突变体的那些残基。
在其3’-5’核酸外切酶位点与DNA结合成复合物的大肠杆菌Pol I的X射线衍射结构(见Brautigan等，1998，J.Mol.Biol.277：363-77)利用XSAE程序的“3D＞序列接触”(“3D＞sequence contacts”)特性(见Higgins等，1992，Cabios8，189-91)进行分析，以鉴别所选的蛋白中(PolI；1kfs.pdb，A链)那些距DNA底物(1kfs.pdb，B链)5A范围之内的所有残基。利用该方法，在大肠杆菌Pol I中鉴别出了表8中的残基。通过对聚合酶序列对比情况的检查(例如象图8中所示的)，可以在热稳定或热激活A家族DNA聚合酶中鉴别出相似残基。然后通过例如前面实施例3所描述的标准分析方法，这些候选残基可以被突变并检测是否具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性。
表8
大肠杆菌PolI的侯选残基
D355  T356
E357  T358
S360  L361
Q419  N420
K422  Y423
M443  R455
H456  D457
M458  D459
F473  E474
Q483  F486
Y497  D501
E541  S658
Y659  H660
实施例8：具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的B家族突变DNA聚合酶的鉴别
正如本文所公开的，本领域技术人员在当前所披露的内容的指导下，可以显而易见的制备具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的A家族突变DNA聚合酶，举例来说，在其3’-5’核酸外切酶结构域产生相应于本文所描述的在Tma DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶结构域所产生的突变。这样一种基于序列的方法在设计具有减弱的校正活性的B家族突变DNA聚合酶方面仅仅具有局限性的应用，因为在Tma DNA聚合酶和B家族DNA聚合酶3’-5’核酸外切酶结构域之间唯一具有相当程度的序列相似性的区域是“DXE’金属结合基序。不过，X射线衍射晶体学研究表明A家族和B家族聚合酶的3’-5’核酸外切酶结构域具有相似的三维结构。见Zhao等，1999，Structure Fold Des.7：1189-99、Karam等，2000，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol.64：65-96、Hopfner等，1999，Proc Natl Acad SciUSA 96：3600-5、Wang等，1997，Cell 89：1087-99。所以建立了一种基于结构的方法来鉴别那些可被突变以产生具有减弱的校正活性的B家族DNA聚合酶的残基。
图11提供了大肠杆菌PolIIDNA聚合酶、B家族聚合酶与一定数量的其它B家族DNA聚合酶序列之间的对比。并不是基于残基的保守性即意味着它们对于校正功能很重要这一假设，就简单地鉴别出那些在所有或者几乎所有所述蛋白中保守的残基，而是仔细研究了分离自嗜菌体RB69的B家族DNA聚合酶3’-5’核酸外切酶结构域的三维结构(Shamoo等，1999，Cell 99：155-66；结构可在PDB ID No.1 CLQ序号下自蛋白数据库得到(Berman等2000，NucleicAcids Res.28：235-42))，并将其与Tma的校正结构域进行了比较。每个蛋白中预计可能与其校正结构域所结合的单链DNA序列的3’末端核苷酸接触的所有残基都已经被鉴别了。图11中的信息及序列对比被用来鉴别其它B家族DNA聚合酶中的相似残基，如图9所示，见下文。这些数据意味着在这些特定位点的突变会产生具有减弱的3’-5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶分子。
表9
 RB69的残基 Tgo的残基 PocI的残基 KODI的残基 推测的功能
    F123     Y146     Y191     Y146 与碱基P(n-1)环
    F221     F214     F253     F214 结合碱基P(n-1)的糖基
    S287     T272     M309     T272 与P(n-1)和P(n-2)的磷酸二酯键之间形成H键
上述的实施例，既有预见性又具真实性，仅仅是以阐释本发明的方式被提供的，而不是在任何方面用来限制本发明的保护范围的。
本文所引述的所有参考文献都是全文引用。

Claims (4)

1.一种分离的含有一个3`-5`核酸外切酶区域并且通过标准试验测定显示出削弱的大约6.5或更低但大于0U/pmol的3`-5`核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，其中所述的3`-5`核酸外切酶区域含有选自下列序列基元的一个序列基元：
(a)一个具有通式DX1EX2X3SX4的序列基元，其中
D为天冬氨酸残基，
X1为任意氨基酸残基，或没有残基，
E为谷氨酸残基，
X2为任意氨基酸残基，
X3为任意氨基酸残基，
S为丝氨酸残基，和
X4为任意氨基酸残基，
或
(b)一个具有通式X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14的序列基元(SEQ ID NO：1)，其中：
X5为任意氨基酸残基，
X6为任意氨基酸残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为任氨基酸残基，
X9为苯基丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为任意氨基酸残基，
X11为任意氨基酸残基，
X12为任意氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，和
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基，或
(c)一个具有通式DX15X16X17X18X19YX20X21X22X23的序列基元(SEQ IDNO：2)，其中：
D为天冬氨酸残基，
X15为脯氨酸，丙氨酸，亮氨酸或苏氨酸残基，
X16为亮氨酸或甲硫氨酸残基，
X17为亮氨酸或异亮氨酸残基，
X18为任意氨基酸残基，
X19为丙氨酸或丝氨酸残基，
Y为酪氨酸残基，
X20为亮氨酸残基，异亮氨酸残基或缬氨酸残基，
X21为亮氨酸残基或色氨酸残基，
X22为天冬氨酸残基，天冬酰胺残基，谷氨酸残基或谷氨酰胺残基，和
X23为脯氨酸残基或丝氨酸残基，或
(d)一个具有通式X24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34X35X36的序列基元(SEQID NO：3)，其中：
X24为脯氨酸或丙氨酸残基，
X25为任意氨基酸残基，
X26为谷氨酸，天冬氨酸或脯氨酸残基，
X27为赖氨酸，精氨酸或谷氨酸残基，
X28为任意氨基酸残基，
X29为任意氨基酸残基，
X30为谷氨酸，精氨酸或天冬酰胺残基，
X31为任意氨基酸残基，
X32为丝氨酸，丙氨酸或半胱氨酸残基，
X33为任意氨基酸残基，
X34为谷氨酸或苏氨酸残基，
X35为任意氨基酸残基，和
X36为丙氨酸残基。
2.一种分离的含有一个3`-5`核酸外切酶区域并且具有5`-3`聚合酶活性和削弱的3`-5`核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，其中所述的以U/pmol表示的5`-3`聚合酶活性和所述的以U/pmol表示的3`-5`核酸外切酶活性的比率在大约100和1之间，酶活性测定如实施例3所述，并且所述的3`-5`核酸外切酶区域含有选自下列序列基元的一个序列基元：
(a)一个具有通式DX1EX2X3SX4的序列基元，其中
D为天冬氨酸残基，
X1为任意氨基酸残基，或没有残基，
E为谷氨酸残基，
X2为任何氨基酸残基，
X3为任意氨基酸残基，
S为丝氨酸残基，和
X4为任意氨基酸残基，
或
(b)一个具有通式X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14的序列基元(SEQ ID NO：1)，其中：
X5为任意氨基酸残基，
X6为任意氨基酸残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为任意氨基酸残基，
X9为苯丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为任意氨基酸残基，
X11为任意氨基酸残基，
X12为任意氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基，或
(c)一个具有通式DX15X16X17X18X19YX20X21X22X23的序列基元(SEQ IDNO：2)，其中：
D为天冬氨酸残基，
X15为脯氨酸，丙氨酸亮氨酸或苏氨酸残基，
X16为亮氨酸或甲硫氨酸残基，
X17为亮氨酸或异亮氨酸残基，
X18为任意氨基酸残基，
X19为丙氨酸或丝氨酸残基，
Y为酪氨酸残基，
X20为亮氨酸残基，异亮氨酸残基或缬氨酸残基，
X21为亮氨酸残基或色氨酸残基，
X22为天冬氨酸残基，天冬酰胺残基，谷氨酸残基或谷氨酰胺残基，和
X23为脯氨酸残基或丝氨酸残基，或
(d)一个具有通式X24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34X35X36的序列基元(SEQID NO：3)，其中：
X24为脯氨酸或丙氨酸残基，
X25为任意氨基酸残基，
X26为谷氨酸，天冬氨酸或脯氨酸残基，
X27为赖氨酸，精氨酸或谷氨酸残基，
X28为任意氨基酸残基，
X29为任意氨基酸残基，
X30为谷氨酸，精氨酸或天冬酰胺残基，
X31为任意氨基酸残基，
X32为丝氨酸，丙氨酸或半胱氨酸残基，
X33为任意氨基酸残基，
X34为谷氨酸或苏氨酸残基，
X35为任意氨基酸残基，和
X36为丙氨酸残基。
3.一种分离的修饰的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，其中所述的修饰的聚合酶含有3`-5`核酸外切酶区域，具有修饰之前的热稳定性DNA聚合酶通过标准试验测定的3`-5`核酸外切酶活性的大约0.1到65％，并且所述的3`-5`核酸外切酶区域含有选自下列序列基元的一个序列基元：
(a)一个具有通式DX1EX2X3SX4的序列基元，其中
D为天冬氨酸残基，
X1为任意氨基酸残基，或没有残基，
E为谷氨酸残基，
X2为任何氨基酸残基，
X3为任意氨基酸残基，
S为丝氨酸残基，和
X4为任意氨基酸残基，或
(b)一个具有通式X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14的序列基元(SEQ ID NO：1)，其中：
X5为任意氨基酸残基，
X6为任意氨基酸残基，
X7为半胱氨酸或亮氨酸残基，
X8为任何氨基酸残基，
X9为苯丙氨酸或酪氨酸残基，
X10为任意氨基酸残基，
X11为任意氨基酸残基，
X12为任意氨基酸残基，
X13为异亮氨酸或缬氨酸残基，
X14为亮氨酸或苯丙氨酸残基，或
(c)一个具有通式DX15X16X17X18X19YX20X21X22X23的序列基元(SEQ IDNO：2)，其中：
D为天冬氨酸残基，
X15为脯氨酸，丙氨酸亮氨酸或苏氨酸残基，
X16为亮氨酸或甲硫氨酸残基，
X17为亮氨酸或异亮氨酸残基，
X18为任意氨基酸残基，
X19为丙氨酸或丝氨酸残基，
Y为酪氨酸残基，
X20为亮氨酸残基，异亮氨酸残基或缬氨酸残基，
X21为亮氨酸残基或色氨酸残基，
X22为天冬氨酸残基，天冬酰胺残基，谷氨酸残基或谷氨酰胺残基，和
X23为脯氨酸残基或丝氨酸残基，或
(d)一个具有通式X24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34X35X36的序列基元(SEQID NO：3)，其中：
X24为脯氨酸或丙氨酸残基，
X25为任意氨基酸残基，
X26为谷氨酸，天冬氨酸或脯氨酸残基，
X27为赖氨酸，精氨酸或谷氨酸残基，
X28为任意氨基酸残基，
X29为任意氨基酸残基，
X30为谷氨酸，精氨酸或天冬酰胺残基，
X31为任意氨基酸残基，
X32为丝氨酸，丙氨酸或半胱氨酸残基，
X33为任意氨基酸残基，
X34为谷氨酸或苏氨酸残基，
X35为任意氨基酸残基，和
X36为丙氨酸残基。
4.一种分离的修饰的含有一个3`-5`核酸外切酶区域并显示出削弱的大约6.5或更低但大于0U/pmol的3`-5`核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性DNA聚合酶，其中所述的3`-5核酸外切酶区域与未修饰的Tma DNA聚合酶的3`-5`核酸外切酶区域有大于约80％但小于100％的序列同一性。
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