ES2389711T3

ES2389711T3 - ADN polimerasa termoestable o termoactiva con actividad exonucleasa 3' a 5' atenuada

Info

Publication number: ES2389711T3
Application number: ES10172676T
Authority: ES
Inventors: Nancy J. Schönbrunner; Thomas W. Myers; David H. Gelfand
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2002-04-02
Filing date: 2003-03-31
Publication date: 2012-10-30
Anticipated expiration: 2023-03-31
Also published as: US20040005599A1; JP4034684B2; CN1482240B; JP2006311867A; US7148049B2; EP2272952B1; EP2272952A1; EP1350841A3; EP1350841B1; EP1350841A2; JP4585996B2; JP2003304870A; CN1482240A; ATE557083T1; EP2272952B8

Abstract

AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada que comprende un dominio de exonucleasa 3' a 5'derivada de una eubacteria termofílica del género Thermotoga, en la que dicho dominio de exonucleasa 3' a 5'comprende un motivo de secuencia que presenta la fórmula X5X6X7XSX9XlOX11X12X13X14 (SEC ID nº 1), en la que:X5 es un residuo alanina, X6 es un residuo alanina o un residuo asparagina, X7 es un residuo leucina, Xs es unresiduo lisina, Xg es un residuo fenilalanina, XlO es un residuo aspartato, X11 es un residuo tirosina, X12 es un residuolisina, X13 es un residuo valina y X14 es un residuo leucina, en la que dicha AON polimerasa muestra una actividad deexonucleasa 3' a 5' atenuada, de aproximadamente 6,5 ó inferior, aunque superior a O U/pmol, en la que una unidadde actividad de exonucleasa 3' a 5' cataliza la conversión de 50 pmoles de un oligonucleótido de cadena sencilla deSEC ID nº 80 u oligonucleótidos de menor longitud, en 15 minutos a 63ºC, midiendo las actividades enzimáticasutilizando el ensayo estándar de actividad de exonucleasa 3' a 5', que mide la degradación de un oligonucleótido decadena sencilla marcado en el extremo 5' y/o en el que dicha AON polimerasa presenta una actividad de polimerasa5' a 3' y una actividad de exonucleasas 3' a 5' atenuada, en la que la proporcion de dicha actividad de polimerasa 5'a 3' en U/pmol a dicha actividad de exonucleasa 3' a 5' en U/pmol es de entre aproximadamente 100 Y 1, en la queuna unidad de actividad de exonucleasa 3' a 5' cataliza la conversión de 50 pmoles de un oligonucleótido de cadenasencilla de SEC ID nº 80 u oligonucleótidos de menor longitud, en 15 minutos a 63ºC, y una unidad de actividad depolimerasa 5' a 3' es la cantidad de actividad enzimática necesaria para incorporar 10 nmoles de dNMP en productode AON precipitable con TCA en 30 minutos a 74ºC, midiendo las actividades enzimáticas utilizando el ensayoestándar para la actividad de exonucleasa 3' a 5', que mide la degradación de un oligonucleótido de cadena sencillamarcado en el extremo 5' y las condiciones indicadas en el Ejemplo 3 para la actividad de polimerasa 5' a 3', y/o enla que dicha AON polimerasa presenta aproximadamente 0,1% a 65% de la actividad de la exonucleasa 3' a 5' de laAON polimerasa termoestable o termoactiva no modificada correspondiente, en la que una unidad de exonucleasa 3'a 5' cataliza la conversión de 50 pmoles de un oligonucleótido de cadena sencilla de SEC ID nº 80 enoligonucleótidos de menor longitud, en 15 minutos a 63ºC, midiendo las actividades enzimáticas utilizando el ensayoestándar para la actividad de exonucleasa 3' a 5', que mide la degradación de un oligonucleótido de cadena sencillamarcado en el extremo 5'.

Description

ADN polimerasa termoestable o termoactiva con actividad exonucleasa 3' a 5' atenuada

CAMPO DE LA INVENCiÓN

La presente invención se refiere a ADN polimerasas termoestables o termoactivas con actividad exonucleasa 3' a 5' ("correctora de errores") atenuada, a métodos de síntesis de las mismas, a métodos para la utilización de las mismas y a kits que comprenden las mismas. Los enzimas resultan útiles en muchas técnicas de ADN recombinante, especialmente en la amplificación de ácidos nucleicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

Las ADN polimerasas sintetizan moléculas de ADN en la dirección 5' a 3' a partir de desoxinucleósidos trifosfato (nucleótidos) utilizando una cadena molde de ADN complementaria y un cebador mediante la adición sucesiva de nucleótidos al grupo 3'-hidroxilo libre de la cadena en crecimiento. La cadena molde determina el orden de adición de los nucleótidos según apareamiento de bases de Watson-Crick. En las células, las ADN polimerasas participan en la reparación, síntesis y replicación del ADN. Ver, por ejemplo, Kornberg et al., DNA Synthesis, W.H. Freeman, New York, 1992; Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 3a edición, Garland Press, New York, 1994.

Muchas técnicas y protocolos moleculares de clonación implican la síntesis de ADN en reacciones in vitro catalizadas por ADN polimerasas. Por ejemplo, las ADN polimerasas se utilizan en reacciones de marcaje del ADN y de secuenciación del ADN, utilizando nucleótidos marcados con 35S, 32p, 33p o fluorescentemente. Unas de las técnicas de síntesis de ADN más versátiles y más ampliamente utilizadas, la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se da a conocer en las patentes US nº 4.683.202, nº 4.683.195, nº 4.800.159 y nº 4.965.188 y se comenta en PCR Strategies, Innis et al. (editores), Academic Press, Inc., 1995.

La ADN polimerasa mejor caracterizada es la ADN polimerasa I de Escherichia coli (Eco Poi 1). La Eco Poi I y varias ADN polimerasas homólogas a la misma presentan tres funciones enzimáticas: i) una actividad exonucleasa 5' a 3', ii) una actividad exonucleasa 3' a 5', e iii) una actividad de síntesis de ADN. Las dos últimas funciones se sitúan hacia el extremo carboxi-terminal de la proteína, dentro de un fragmento "Klenow" (EcoPol I K). Pueden tratarse preparaciones enzimáticas de EcoPol I con subtilisina para rendir un Eco Poi I K sin la actividad de exonucleasas 5' a 3'. Ver Brown et al., J. Biol. Chem. 257: 1965-72, 1982; Joyce et al., J. Biol. Chem. 257: 1958-64; Joyce et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1830-34, 1983; Klenow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 65: 168-75, 1970; Kornberg, 1974; Setlow P. et al., J. Biol. Chem. 247: 224-31, 1972; Setlow et al., J. Biol. Chem. 247: 232-40, 1972; Steitz et al., en: Protein Engineering, capítulo 20, páginas 227 a 35, 1987; Oxender et al. (editores), Alan R. Liss, New York.

El análisis de la estructura cristalina de EcoPol I K ha demostrado que su cadena peptídica se encuentra plegada en dos dominios diferentes, siendo el dominio más pequeño, de 200 residuos aminoácidos, el dominio de exonucleasa 3' a 5', y el otro dominio, de 400 residuos aminoácidos, el dominio de síntesis de ADN.Ver Ollis et al., Nature 313:762-66, 1985. Los sitios activos de las actividades de exonucleasa 3' a 5' y de síntesis del ADN se encuentran separados por aproximadamente 30 angstroms. Ver id. El sitio activo de síntesis de ADN se une al ADN de doble cadena que contiene una extensión 5' de cadena sencilla y desoxinucleósido trifosfato (dNTP), mientras que el sitio activo de exonucleasa 3' a 5' se une a ADN de cadena sencilla y a desoxinucleósido monofosfato (dNMP). Ver id. La existencia de un sitio activo de exonucleasa 3' a 5' conservado presente en varias ADN polimerasas fue predicho por Bernat et al., Cell 59: 219-28, 1989; Blanco et al., Gene 112: 139-44, 1992; Reha-Krantz, Gene 112: 133-37, 1992.

El dominio de síntesis de ADN de EcoPol I ha sido clonado, expresado y caracterizado independientemente de los dominios de exonucleasa 3' a 5' y 5' a 3'. Tal como se ha comentado anteriormente, el dominio de síntesis de ADN contiene aproximadamente 400 aminoácidos. La actividad de polimerasa en el dominio de síntesis de ADN es 50 veces inferior a la de EcoPol I K. Ver Derbyshire et al., Nucleic Acids Res. 21 :5439-48, 1993.

Las ADN polimerasas termoestables y termoactivas derivadas de una diversidad de organismos han sido descritas ampliamente en la literatura. Entre los ejemplos particulares se incluyen ADN polimerasas de una diversidad de especies del género de eubacteria Thermus; ver la patente US nº 5.466.591, en particular de Thermus aquaticus (ADN polimerasa Taq), descrita en las patentes US nº 4.889.818, nº 5.352.600 y nº 5.079.352, y la ADN polimerasa de la especie de eubacteria Thermotoga maritima (ADN polimerasa Tma), descrita en las patentes US nº 5.374.553 y nº 5.420.029.

Tanto E. coli, un mesófilo, como T. maritima, un termófilo, son eubacterias. Al igual que la ADN polimerasa I de E. coli, la ADN polimerasa Tma presenta tanto una actividad de exonucleasa 5' a 3' como una actividad de exonucleasa 3' a 5'. En contraste, las ADN polimerasas de las especies de Thermus, que también son eubacterias termofílicas, presentan únicamente actividad de exonucleasa 5' a 3'. Puede encontrarse una revisión de las ADN polimerasas termoestables y termoactivas, y sus actividades asociadas, en Abramson, 1995, en: PCR Strategies, Innis et al. (editores), Academic Press, Inc. Las formas mutantes de varias ADN polimerasas de arqueobacterias y eubacterias termoestables o termoactivas que no presentan una actividad de exonucleasa 3' a 5' se describen en las patentes US nº 6.015.668, nº 5.939.301, nº 5.988.614, nº 5.882.904 y nº 5.489.523.

Aunque EcoPol I y la ADN polimerasa Tma presentan las mismas tres actividades enzimáticas y la misma estructura general del dominio, son enzimas muy diferentes. Por ejemplo, EcoPol I y la ADN polimerasa Tma presentan secuencias de aminoácidos muy diferentes. En particular, incluso tras la introducción de huecos en sus secuencias para optimizar su alineación, los dominios de exonucleasa 3' a 5' de dichas dos proteínas sólo son idénticas aproximadamente al 33%. Además, los dos enzimas muestran diferentes actividades específicas y diferente resistencia a las condiciones de desnaturalización química. Debido a que dichas diferencias se observan en enzimas purificados que han sido apartados de sus ambientes in vivo naturales, deben responder a diferencias en las secuencias de aminoácidos de los enzimas mismos.

La actividad de exonucleasa 3' a 5' "corrige" la cadena naciente de ADN a medida que se va sintetizando y preferentemente elimina nucleótidos de la misma que no se aparean correctamente con la cadena molde, incrementando de esta manera la fidelidad de la síntesis del ADN. Sin embargo, la presencia de una actividad de exonucleasa 3' a 5' robusta puede resultar problemática para las reacciones de polimerización in vitro, en particular la PCR, en la que la presencia de una actividad de exonucleasa 3' a 5' reduce la eficiencia de la amplificación. Ver Barnes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :2216-20, 1994.

Se han realizado esfuerzos para evitar los efectos deletéreos de la actividad de exonucleasa 3' a 5' mediante la utilización de un enzima de ADN polimerasa que no presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5'. La polimerasa Taq no presenta naturalmente dicha actividad. Otras ADN polimerasas han sido manipuladas genéticamente para eliminarla. Ver, por ejemplo, las patentes US nº 6.015.668, nº 5.939.301, nº 5.988.614, nº 5.882.904 y nº 5.489.523. La patente US nº 6.228.628 da a conocer determinados residuos aminoácidos en la ADN polimerasa Tma considerados críticos para la actividad de exonucleasa 3' a 5', en la que en particular las mutaciones D323A y E325A se ha demostrado que esencialmente eliminan la actividad de exonucleasa 3' a 5'. Dichos enzimas funcionan en aplicaciones en las que resulta innecesaria una mayor fidelidad de la replicación, por ejemplo en una PCR utilizada para amplificar un molde para reacciones de secuenciación del ADN, análisis de tamaños, análisis de enzimas de restricción o análisis basados en sondas.

Sin embargo, otras reacciones de polimerización, por ejemplo PCR para amplificar un fragmento de ADN para la clonación, requieren un nivel de fidelidad más alto. En un esfuerzo para reducir los problemas asociados a la actividad de exonucleasa 3' a 5', conservando simultáneamente sus beneficios, se han utilizado mezclas de dos ADN polimerasas diferentes. Una polimerasa en la mezcla presenta un nivel de tipo salvaje de actividad de exonucleasa 3' a 5'. La otra no presenta dicha actividad. Se manipula la proporción de las dos polimerasas con el fin de producir la proporción deseada de actividades de exonucleasa 3' a 5' y de ADN polimerasa. Ver Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :5695-99, 1994; Barnes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :2216-20, 1994; Cheng, "Longer PCR Amplifications", en: PCR Strategies (Innis et al., editores), Academic Press, San Diego 313-24, 1995; Cheng et al., PCR Meth. Applic. 4: 294-98,1995; patentes US nº 5.512.462, nº 5.436.149 y nº 5.556.772 y solicitud de patente PCT nº de publ. WO 94/26766. Aunque dicha técnica de mezcla puede utilizarse para conseguir el nivel deseado de actividad de exonucleasa 3' a 5', resulta caro, laborioso y debe optimizarse para cada lote. Requiere que las actividades de ADN polimerasa y de exonucleasa 3' a 5' de cada preparación enzimática sean cuidadosamente calibradas de manera que las dos polimerasas puedan mezclarse en las cantidades correctas para producir la proporción deseada de actividad de exonucleasa 3' a 5' a actividad de ADN polimerasa. De esta manera, existe una necesidad en la técnica de un método rápido y económico de producción de un reactivo de ADN polimerasa con un nivel deseado de actividad de exonucleasa 3' a 5' y una proporción deseada de actividades de exonucleasa 3' a 5' a ADN polimerasa.

DESCRIPCiÓN RESUMIDA DE LA INVENCiÓN

La presente invención describe la inesperada generación de una ADN polimerasa termoestable o termoactiva con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada. La actividad de exonucleasa 3' a 5' permite que dichos enzimas resulten útiles en un amplio abanico de reacciones de polimerización.

En un aspecto, la presente invención proporciona una ADN polimerasa termoestable o termoactiva aislada que muestra una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada. En una realización, la polimerasa termoestable o termoactiva es una ADN polimerasa termoestable o termoactiva modificada. En otra realización, la ADN polimerasa termoestable modifiada es una ADN polimerasa termoestable mutante. En otra realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva modificada presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' de entre aproximadamente 0,1% Y aproximadamente 65% de la de una ADN polimerasa termoestable o termoactiva no modificada correspondiente, en la que la actividad de exonucleasa se determina utilziando el ensayo estándar descrito en el Ejemplo 3. En otra realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva modificada presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' de entre aproximadamente 1 % Y aproximadamente 30% de la de una ADN polimerasa termoestable o termoactiva no modificada correspondiente. En otra realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva modificada presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' de entre aproximadamente 3% y aproximadamente 20% de la de una ADN polimerasa termoestable o termoactiva no modificada correspondiente. En otra realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva modificada presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' de entre aproximadamente 3% y aproximadamente 10% de la de una ADN polimerasa termoestable o termoactiva no modificada correspondiente. En otra realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva modificada presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' de entre aproximadamente 3% y aproximadamente 5% de la de una ADN polimerasa termoestable o termoactiva no modificada correspondiente.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una ADN polimerasa termoestable o termoactiva aislado que presenta 6,5 unidades o menos, aunque más de 0, unidades (U)/pmol de actividad de exonucleasa 3' a 5', medidas utilizando el ensayo estándar descrito posteriormente, en el Ejemplo 3. En una realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva modificada presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' de entre aproximadamente 0,4 y 3,0 U/pmol. En otra realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva modificada presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' de entre aproximadamente 0,4 y 1,6 U/pmol.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una ADN polimerasa termoestable o termoactiva aislada, en la que la ADN polimerasa termoestable o termoactiva presenta una actividad de ADN polimerasa 5' a 3' y una actividad de exonucleasa 3' a 5' y la proporción de la actividad de polimerasa a la actividad de exonucleasa es superior a 1. En una realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva presenta una proporción de actividad de ADN polimerasa 5' a 3' a actividad de exonucleasa 3' a 5' de entre aproximadamente 3,0 y 50. En otra realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva presenta una proporción de actividad de ADN polimerasa 5' a 3' a actividad de exonucleasa 3' a 5' de entre aproximadamente 6,0 y 25,0.

En otro aspecto, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva presenta una actividad atenuada de exonucleasa 3' a 5'. En una realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva es una ADN polimerasa termoestable o termoactiva modificada. En otra realización, la ADN polimerasa termoestable modifiada es una ADN polimerasa termoestable mutante. En otro aspecto, la invención proporciona una ADN polimerasa termoestable o termoactiva modificada en la que la actividad de exonucleasa 3' a 5' de ADNmc o ADNbc preferentemente se encuentra atenuada. En una realización, la ADN polimerasa termoestable modificada es una ADN polimerasa termoestable mutante.

En otro aspecto, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada se deriva de una eubacteria termofílica del género Thermotoga. En todavía otro aspecto, la eubacteria termofílica es Thermotoga maritima (Tma). En otro aspecto, la eubacteria termofílica es Thermotoga neapolitana.

Se da a conocer además que la ADN polimerasa termoestable o termoactiva con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada se deriva de una eubacteria termofílica del género Thermosipho. Se da a conocer además que la eubacteria termofílica es Thermosipho africanus.

Se da a conocer además que la ADN polimerasa termoestable o termoactiva con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada se derivada de una eubacteria termofílica del género Aquifex. Se da a conocer además que la eubacteria termofílica es Aquifex pyrophilus. Se da a conocer además que la eubacteria termofílica es Aquifex aeolieus.

Se da a conocer además que la ADN polimerasa termoestable o termoactiva con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada se deriva de una arqueobacteria termofílica del género Thermococcus. Se da a conocer además que la arqueobacteria termofílica es Thermococcus barossi. Se da a conocer además que la arqueobacteria termofílica es Thermococcus litoralis. Se da a conocer además que la arqueobacteria termofílica es Thermococcus gorgonarius ("Tgo").

Se da a conocer además que la ADN polimerasa termoestable o termoactiva con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada se deriva de una arqueobacteria termofílica del género Pyrococcus. Se da a conocer además que la arqueobacteria termofílica es Pyrococcus furiosus. Se da a conocer además que la arqueobacteria termofílica es Pyrococcus sp. GB-D. Se da a conocer además que la arqueobacteria termofílica es Pyrococcus woesei. Se da a conocer además que la arqueobacteria termofílica es Pyrococcus abyssi.

Se da a conocer además que la ADN polimerasa termoestable o termoactiva con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada se derivada de una arqueobacteria termofílica del género Pyrodictium. Se da a conocer además que la arqueobacteria termofílica es Pyrodictium abyssi. Se da a conocer además que la arqueobacteria termofílica es Pyrodictium occultum.

En otro aspecto, la invención proporciona una AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada que comprende un dominio de exonucleasa 3' a 5' derivada de una eubacteria termofílica del género Thermotoga y que muestra una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada de aproximadamente 6,5 ó inferior, aunque superior a 0, U/pmol, medida utilizando el ensayo estándar del Ejemplo 3, en el que dicho dominio de exonucleasa 3' a 5' comprende el motivo de secuencia.

(b) un motivo EXO II que presenta la fórmula X5X6X7XSX9XlOX11X12X13X14 (SEC ID nº 1), en la que, X5 es un residuo glutamina o alanina, X6 es un residuo alanina, X7 es un residuo leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina, XlO es un residuo aspartato, X11 es un residuo tirosina, X12 es un residuo lisina, X13 es un residuo valina y X14 es un residuo leucina,

: o en la que, X5 es un residuo alanina, X6 es un residuo asparagina, X7 es un residuo leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina, XlO es un residuo aspartato, X11 es un residuo tirosina, X12 es un residuo lisina, X13 es un residuo valina, y X14 es un residuo leucina,

: o en la que, X5 es un residuo glutamina, X6 es un residuo asparagina, X7 es un residuo leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina, XlO es un residuo glutamato, X11 es un residuo tirosina, X12 es un residuo lisina, X13 es un residuo valina, y X14 es un residuo leucina.

En otro aspecto, la invención proporciona una AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada que comprende un dominio de exonucleasa 3' a 5' derivado de una eubacteria termofílica del género Thermotoga y que presenta una actividad de polimerasa 5' a 3' y una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, en la que la proporción entre dicha actividad de polimerasa 5' a 3' en U/pmol, medida utilizando el ensayo de polimerasa en el Ejemplo 3, y dicha actividad de exonucleasa 3' a 5' en U/pmol, medida tal como se indica utilizando el ensayo estándar en el Ejemplo 3, se encuentra comprendida entre aproximadamente 1 y 100, Y dicho dominio de exonucleasa 3' a 5' comprende el motivo de secuencia.

(b) un motivo EXO II que presenta la fórmula X5X6X7XSX9XlOX11X12X13X14 (SEC ID nº 1), en la que, X5 es un residuo glutamina o alanina, X6 es un residuo alanina, X7 es un residuo leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina, XlO es un residuo aspartato, X11 es un residuo tirosina, X12 es un residuo lisina, X13 es un residuo valina, y X14 es un residuo leucina,

o en la que, X5 es un residuo alanina, X6 es un residuo asparagina, X7 es un residuo leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina,

XlO es un residuo aspartato, Xll es un residuo tirosina, X12 es un residuo lisina, X13 es un residuo valina, y X14 es un residuo leucina,

o en la que, X5 es un residuo glutamina, X6 es un residuo asparagina, X7 es un residuo leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina, XlO es un residuo glutamato, Xll es un residuo tirosina, X12 es un residuo lisina, X13 es un residuo valina, y X14 es un residuo leucina.

En todavía otro aspecto, la invención proporciona una AON polimerasa termoestable o termoactiva modificada en la que dicha polimerasa modificada comprende un dominio de exonucleasa 3' a 5' derivada de la eubacteria termofílica del género Thermotoga, presenta aproximadamente 0,1% a 65% de la actividad de exonucleasa 3' a 5' de la AON polimerasa termoestable antes de la modificación y dicho dominio de exonucleasa 3' a 5' comprende el motivo de secuencia.

(b) un motivo EXO II que presenta la fórmula X5X6X7XSX9XlOXllX12X13X14 (SEC ID nº 1), en la que, X5 es un residuo glutamina o alanina, X6 es un residuo alanina, X7 es un residuo leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina, XlO es un residuo aspartato, Xll es un residuo tirosina, X12 es un residuo lisina, X13 es un residuo valina y X14 es un residuo leucina,

: o en la que, X5 es un residuo alanina, X6 es un residuo asparagina, X7 es un residuo leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina, XlO es un residuo aspartato, Xll es un residuo tirosina, X12 es un residuo lisina, X13 es un residuo valina, y X14 es un residuo leucina,

: o en la que, X5 es un residuo glutamina, X6 es un residuo asparagina, X7 es un residuo leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina, XlO es un residuo glutamato, Xll es un residuo tirosina, X12 es un residuo lisina, X13 es un residuo valina, y X14 es un residuo leucina.

Se da a conocer además una AON polimerasa termoestable o termoactiva modificada en la que dicha polimerasa modificada comprende un dominio de exonucleasa 3' a 5' y dicho dominio de exonucleasa 3' a 5' comprende:

(a) un motivo EXO I que presenta la fórmula OX1EX2X3SX4, en la que O es un residuo aspartato, Xl es cualquier residuo aminoácido, o ningún residuo, E es un residuo glutamato, X2 es cualquier residuo aminoácido, X3 es cualquier residuo aminoácido, S es un residuo serina, y X4 es cualquier residuo aminoácido, o

(c) un motivo EXO II que presenta la fórmula OX15X16X17X18X19YX20X21X22X23 (SEC ID nº 2), en la que O es un residuo aspartato, X15 es un residuo prolina, alanina, leucina o treonina, X16 es un residuo leucina o metionina, X17 es un residuo leucina o isoleucina, X18 es cualquier residuo aminoácido, X19 es un residuo alanina o serina, y es un residuo tirosina, X20 es un residuo leucina, isoleucina o valina, X2l es un residuo leucina o triptófano, X22 es un residuo aspartato, asparagina, glutamato o glutamina, y X23 es un residuo prolina o serina, o

(d) un motivo EXO III que presenta la fórmula X24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34X35X36 (SEC ID nº 3), en la

que X24 es un residuo prolina o alanina, X25 es cualquier residuo aminoácido, X26 es un residuo glutamato, aspartato o prolina, X27 es un residuo lisina, arginina o glutamato, X28 es cualquier residuo aminoácido, X29 es cualquier residuo aminoácido, X30 es un residuo glutamato, arginina o asparagina, X3l es cualquier residuo aminoácido, X32 es un residuo serina, alanina o cisteína, X33 es cualquier residuo aminoácido, X34 es un residuo glutamato o treonina, X35 es cualquier residuo aminoácido, y X36 es un residuo alanina.

Se da a conocer además que el dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada de la invención comprende un dominio EXO 1, EXO 11, EXO Ila o EXO III que presenta cualquier combinación de residuos aminoácidos particulares consistente con las fórmulas anteriormente indicadas.

Se da a conocer además que el dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada de la invención comprende por lo menos dos, tres o cada uno de dichos motivos de secuencia (a), (b), (c) y

(d) en un orden amino-terminal a carboxi-terminal.

En otro aspecto, una AON polimerasa termoestable o termoactiva modificada de la invención comprende un dominio de exonucleasa 3' a 5' y muestra una actividad de exonucleasa 3' a 5' de aproximadamente 6,5 ó inferior, aunque superior a O, U/pmol, medida utilizando el ensayo estándar del Ejemplo 3, posteriormente, en el que dicho dominio de exonucleasa 3' a 5' presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80%, aunque inferior a 100%, respecto al dominio de exonucleasa 3' a 5' que se encuentra subrayado en la figura 1A (SEC ID nº 85).

En otro aspecto, una AON polimerasa termoestable o termoactiva modificada de la invención comprende un dominio de exonucleasa 3' a 5' y muestra una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada de aproximadamente 6,5 ó inferior, aunque superior a O, U/pmol, medida utilizando el ensayo estándar del Ejemplo 3, posteriormente, en el que dicha AON polimerasa modificada presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80%, aunque inferior a 100%, respecto a la secuencia de la figura 1A (SEC ID nº 85).

En otro aspecto, una AON polimerasa termoestable o termoactiva modificada de la invención comprende un dominio de exonucleasa 3' a 5' y muestra una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada de aproximadamente 6,5 ó inferior, aunque superior a O, U/pmol, medida utilizando el ensayo estándar del Ejemplo 3, posteriormente, en el que dicho dominio de exonucleasa 3' a 5' presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80%, aunque inferior a 100%, respecto al dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa Tne no modificada. En una realización, el dominio de exonucleasa 3' a 5' de la AON polimerasa Tne comprende la secuencia mostrada en la figura 2 (SEC ID nº 88).

En otro aspecto, una AON polimerasa termoestable o termoactiva modificada de la invención comprende un dominio de exonucleasa 3' a 5' y muestra una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada de aproximadamente 6,5 ó inferior, aunque superior a O, U/pmol, medida utilizando el ensayo estándar del Ejemplo 3, posteriormente, en el que dicha AON polimerasa modificada presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80%, aunque inferior a 100%, respecto a la secuencia de aminoácidos de la AON polimerasa Tne no modificada. La secuencia de aminoácidos de una AON polimerasa Tne no modificada puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una polimerasa Tne proporcionada en la patente US nº 5.948.614.

Se da a conocer además que una AON polimerasa termoestable o termoactiva modificada de la invención comprende un dominio de exonucleasa 3' a 5' y muestra una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada de aproximadamente 6,5 ó inferior, aunque superior a O, U/pmol, medida utilizando el ensayo estándar del Ejemplo 3, posteriormente, en el que dicho dominio de exonucleasa 3' a 5' presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80%, aunque inferior a 100%, respecto al dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa Taf no modificada. En una realización, el dominio de exonucleasa 3' a 5' de la AON polimerasa Taf comprende la secuencia mostrada en la figura 3 (SEC ID nº 89).

Se da a conocer además que una AON polimerasa termoestable o termoactiva modificada de la invención comprende un dominio de exonucleasa 3' a 5' y muestra una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada de aproximadamente 6,5 ó inferior, aunque superior a O, U/pmol, medida utilizando el ensayo estándar del Ejemplo 3, posteriormente, en el que dicha AON polimerasa presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80%, aunque inferior a 100%, respecto a la secuencia de aminoácidos de la AON polimerasa Taf no modificada. La secuencia de aminoácidos de una AON polimerasa Taf no modificada puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una AON polimerasa Taf proporcionada en la patente US nº 5.968.799.

Se da a conocer además que el dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada de la invención comprende un motivo EXO 1, en la que,

OX1EX2X3SX4, en la que,

O es un residuo aspartato,

Xl es cualquier residuo aminoácido, o ningún residuo,

E es un residuo glutamato,

X2 es un residuo treonina,

X3 es cualquier residuo aminoácido,

S es un residuo serina, y

X4 es cualquier residuo aminoácido (SEC ID nº 4),

: o en la que, O es un residuo aspartato, X1 es cualquier residuo aminoácido, o ningún residuo, E es un residuo glutamato, X2 es un residuo treonina, X3 es un residuo treonina, S es un residuo serina, y X4 es un residuo leucina (SEC ID nº 5),

: o en la que, O es un residuo aspartato, X1 es cualquier residuo aminoácido, o ningún residuo, E es un residuo glutamato, X2 es un residuo treonina, X3 es cualquier residuo aminoácido, S es un residuo serina, y X4 es un residuo leucina (SEC ID nº 6),

: o en la que, O es un residuo aspartato, X1 es cualquier residuo aminoácido, o ningún residuo, E es un residuo glutamato, X2 es cualquier residuo aminoácido, X3 es cualquier residuo aminoácido, S es un residuo serina, y X4 es un residuo leucina (SEC ID nº 7),

: o en la que, O es un residuo aspartato, Xl es cualquier residuo aminoácido, o ningún residuo, E es un residuo glutamato, X2 es cualquier residuo aminoácido,

X3 es un residuo treonina, S es un residuo serina, y X4 es un residuo leucina (SEC ID nº 8), o en la que O es un residuo aspartato, Xl es un residuo leucina, E es un residuo glutamato, X2 es un residuo treonina, X3 es un residuo serina, S es un residuo serina, y X4 es un residuo leucina (SEC ID nº 9).

Se da a conocer además que el dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa termoestable o termoactiva de la invención comprende un motivo EXO 11, en el que

X5 es cualquier residuo aminoácido, X6 es cualquier residuo aminoácido, X7 es un residuo cisteína o leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina o tirosina. XlO es cualquier residuo aminoácido, Xll es cualquier residuo aminoácido, X12 es cualquier residuo aminoácido, X13 es un residuo isoleucina o valina, y X14 es un residuo leucina o fenilalanina (SEC ID nº 10),

o en la que, X5 es un residuo polar no cargado, X6 es cualquier residuo aminoácido, X7 es un residuo cisteína o leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina o tirosina, XlO es cualquier residuo aminoácido, Xll es cualquier residuo aminoácido, X12 es cualquier residuo aminoácido, X13 es un residuo isoleucina o valina, y X14 es un residuo leucina o fenilalanina (SEC ID nº 11), o en la que, X5 es un residuo polar no cargado, X6 es un residuo polar no cargado, X7 es un residuo cisteína o leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina o tirosina. XlO es cualquier residuo aminoácido, Xll es cualquier residuo aminoácido, X12 es cualquier residuo aminoácido, X13 es un residuo isoleucina o valina, y X14 es un residuo leucina o fenilalanina (SEC ID nº 12), o en la que, X5 es un residuo polar no cargado. X6 es un residuo polar no cargado, X7 es un residuo cisteína o leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina o tirosina, XlO es un residuo ácido, Xll es cualquier residuo aminoácido, X12 es cualquier residuo aminoácido, X13 es un residuo isoleucina o valina, y X14 es un residuo leucina o fenilalanina (SEC ID nº 13), o en la que, X5 es un residuo polar no cargado, X6 es un residuo polar no cargado, X7 es un residuo cisteína o leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina o tirosina, XlO es un residuo ácido, Xll es cualquier residuo aminoácido,

X12 es cualquier residuo aminoácido, X13 es un residuo isoleucina o valina, y X14 es un residuo leucina o fenilalanina (SEC ID nº 14), o en la que X5 es un residuo glutamina, X6 es un residuo asparagina, X7 es un residuo cisteína o leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina o tirosina, XlO es un residuo aspartato, X11 es cualquier residuo aminoácido, X12 es cualquier residuo aminoácido, X13 es un residuo isoleucina o valina, y X14 es un residuo leucina o fenilalanina (SEC ID nº 15), o en la que X5 es un residuo glutamina, X6 es un residuo asparagina, X7 es un residuo leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina, XlO es un residuo aspartato, X11 es un residuo tirosina, X12 es un residuo lisina, X13 es un residuo valina, y X14 es un residuo leucina (SEC ID nº 16).

Se da a conocer además que el dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa termoestable o termoactiva de la invención comprende un motivo EXO 11, en el que X5 es un residuo no polar, tal como un residuo alanina. En una realización, el dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa termoestable o termoactiva de la invención comprende un motivo EXO II en el que Xs es un residuo lisina. En otra realización, el dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa termoestable o termoactiva de la invención comprende un motivo EXO II en el que X5 es un residuo no polar y Xs es un residuo lisina.

Se da a conocer además que el dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa termoestable o termoactiva

de la invención comprende un motivo EXO 11, en el que

X5 es un residuo no polar,

X6 es un residuo polar no cargado,

X7 es un residuo cisteína o leucina,

Xs es un residuo lisina,

X9 es un residuo fenilalanina o tirosina,

XlO es un residuo ácido,

X11 es cualquier residuo aminoácido,

X12 es cualquier residuo aminoácido,

X13 es un residuo isoleucina o valina, y

X14 es un residuo leucina o fenilalanina (SEC ID nº 17),

: o en la que, X5 es un residuo alanina, X6 es un residuo polar no cargado, X7 es un residuo cisteína o leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina o tirosina, XlO es un residuo ácido, X11 es cualquier residuo aminoácido, X12 es cualquier residuo aminoácido, X13 es un residuo isoleucina o valina, y X14 es un residuo leucina o fenilalanina (SEC ID nº 18),

: o en la que, X5 es un residuo alanina, X6 es un residuo asparagina, X7 es un residuo cisteína o leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina o tirosina,

XlO es un residuo aspartato, X11 es cualquier residuo aminoácido, X12 es cualquier residuo aminoácido, X13 es un residuo isoleucina o valina, y X14 es un residuo leucina o fenilalanina (SEC ID nº 19).

de la invención comprende un motivo EXO 11, en el que

X5 es un residuo alanina,

X6 es un residuo asparagina,

X7 es un residuo leucina,

Xs es un residuo lisina,

Xg es un residuo fenilalanina,

XlO es un residuo aspartato,

X11 es un residuo tirosina,

X12 es un residuo lisina,

X13 es un residuo valina, y

X14 es un residuo leucina (SEC ID nº 20).

Se da a conocer además que dicha AON polimerasa termoestable o termoactiva comprende la secuencia de aminoácidos del dominio de exonucleasa 3' a 5' ilustrada en la figura 4A modificada por una mutación 0384A (SEC ID nº 96). Se da a conocer además que dicha AON polimerasa termoestable o termoactiva comprende la secuencia de aminoácidos de la figura 4A modificado por una mutación 0384A (SEC ID nº 97).

Se da a conocer además que el dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa termoestable o termoactiva de la invención comprende un motivo EXO 11, en el que X6 es un residuo aminoácido no polar.

X5 es un residuo polar no cargado,

X6 es un residuo no polar,

X7 es un residuo cisteína o leucina,

Xs es un residuo lisina,

Xg es un residuo fenilalanina o tirosina,

XlO es un residuo ácido,

X11 es cualquier residuo aminoácido,

X12 es cualquier residuo aminoácido,

X13 es un residuo isoleucina o valina, y

X14 es un residuo leucina o fenilalanina (SEC ID nº 21),

o en la que, X5 es un residuo glutamina, X6 es un residuo alanina, X7 es un residuo cisteína o leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina o tirosina, XlO es un residuo aspartato, X11 es cualquier residuo aminoácido, X12 es cualquier residuo aminoácido, X13 es un residuo isoleucina o valina, y X14 es un residuo leucina o fenilalanina (SEC ID nº 22).

de la invención comprende un motivo EXO 11, en el que

X5 es un residuo glutamina,

X6 es un residuo alanina,

X7 es un residuo leucina,

Xs es un residuo lisina,

Xg es un residuo fenilalanina,

RlO es un residuo aspartato,

X11 es un residuo tirosina,

X12 es un residuo lisina,

X13 es un residuo valina, y X14 es un residuo leucina (SEC ID nº 23).

En una realización, dicha AON polimerasa termoestable o termoactiva comprende la secuencia de aminoácidos del dominio de exonucleasa 3' a 5' ilustrada en la figura 4A modificada por una mutación N385A (SEC ID nº 98). En otra realización, dicha AON polimerasa termoestable o termoactiva comprende la secuencia de aminoácidos de la figura 4A modificada por una mutación N385A (SEC ID nº 99).

Se da a conocer además que el dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa termoestable o termoactiva de la invención comprende un motivo EXO 11, en el que XlO es un residuo glutamato.

de la invención comprende un motivo EXO 11, en el que

X5 es un residuo polar no cargado,

X6 es un residuo polar no cargado,

X7 es un residuo cisteína o leucina,

Xs es un residuo lisina,

Xg es un residuo fenilalanina o tirosina,

XlO es un residuo glutamato,

X11 es cualquier residuo aminoácido,

X12 es cualquier residuo aminoácido,

X13 es un residuo isoleucina o valina, y

X14 es un residuo leucina o fenilalanina (SEC ID nº 24),

o en la que, X5 es un residuo glutamina, X6 es un residuo asparagina, X7 es un residuo cisteína o leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina o tirosina, XlO es un residuo glutamato, X11 es cualquier residuo aminoácido, X12 es cualquier residuo aminoácido, X13 es un residuo isoleucina o valina, y X14 es un residuo leucina o fenilalanina (SEC ID nº 25).

de la invención comprende un motivo EXO 11, en el que,

X5 es un residuo glutamina,

X6 es un residuo asparagina,

X7 es un residuo leucina,

Xs es un residuo lisina,

Xg es un residuo fenilalanina,

XlO es un residuo glutamato,

X11 es un residuo tirosina,

X12 es un residuo lisina,

X13 es un residuo valina, y

X14 es un residuo leucina (SEC ID nº 26).

Se da a conocer además que dicha AON polimerasa termoestable o termoactiva comprende la secuencia de aminoácidos del dominio de exonucleasa 3' a 5' ilustrada en la figura 4A modificado por una mutación 0389E (SEC ID nº 159). En otra realización, dicha AON polimerasa termoestable o termoactiva comprende la secuencia de aminoácidos de la figura 4A modificada por una mutación 0389E (SEC ID nº 175).

Se da a conocer además que el dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa termoestable o termoactiva de la invención comprende un motivo EXO 11, en el que X5 es un residuo no polar y X6 es un residuo no polar.

Se da a conocer además que el dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa termoestable o termoactiva de la invención comprende un motivo EXO 11, en el que, X5 es un residuo no polar,

1 O

X6 es un residuo no polar, X7 es un residuo cisteína o leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina o tirosina, XlO es un residuo ácido, Xll es cualquier residuo aminoácido, X12 es cualquier residuo aminoácido, X13 es un residuo isoleucina o valina, y X14 es un residuo aminoácido leucina o fenilalanina (SEC ID nº 27),

o en la que, X5 es un residuo alanina, X6 es un residuo alanina, X7 es un residuo cisteína o leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina o tirosina, XlO es un residuo aspartato, Xll es cualquier residuo aminoácido, X12 es cualquier residuo aminoácido, X13 es un residuo isoleucina o valina, y X14 es un residuo leucina o fenilalanina (SEC ID nº 28).

de la invención comprende un motivo EXO 11, en el que,

X5 es un residuo alanina,

X6 es un residuo alanina,

X7 es un residuo leucina,

Xs es un residuo lisina,

Xg es un residuo fenilalanina,

XlO es un residuo aspartato,

Xll es un residuo tirosina,

X12 es un residuo lisina,

X13 es un residuo valina, y

X4 es un residuo leucina (SEC ID nº 29).

En una realización, dicha AON polimerasa termoestable o termoactiva comprende la secuencia de aminoácidos del dominio de exonucleasa 3' a 5' ilustrada en la figura 4A modificada por una doble mutación 0384A N385A (SEC ID nº 100). En otra realización, dicha AON polimerasa termoestable o termoactiva comprende la secuencia de aminoácidos de la figura 4A modificada por una doble mutación 0384A N385A (SEC ID nº 101).

de la invención comprende un motivo EXO IIA, en el que,

O es un residuo aspartato,

X15 es un residuo treonina,

X16 es un residuo metionina,

X17 es un residuo isoleucina,

X1S es un residuo alanina,

X19 es un residuo alanina,

Yes un residuo tirosina,

X20 es un residuo leucina,

X2l es un residuo leucina,

X22 es un residuo glutamato, y

X23 es un residuo prolina (SEC ID nº 30).

Se da a conocer además que el dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa termoestable o termoactiva de la invención comprende un motivo EXO 111, en el que X35 es un residuo aminoácido ácido.

de la invención comprende un motivo EXO 111, en el que,

X24 es un residuo treonina,

X25 es un residuo valina, leucina o isoleucina,

X26 es un residuo glutamato, aspartato o prolina,

X27 es un residuo lisina o arginina,

X2S es un residuo alanina o valina,

1 O

X29 es un residuo alanina o valina, X30 es un residuo glutamato o asparagina, X31 es un residuo aminoácido polar no cargado, X32 es un residuo serina o cisteína, X33 es un residuo cisteína o glicina, X34 es un residuo glutamato o treonina, X35 es un residuo aspartato, y X36 es un residuo alanina (SEC ID nº 31),

o en la que, X24 es un residuo treonina, X25 es un residuo valina, X26 es un residuo glutamato, X27 es un residuo lisina, X28 es un residuo alanina, X29 es un residuo alanina, X30 es un residuo asparagina, X31 es un residuo tirosina, X32 es un residuo serina, X33 es un residuo cisteína, X34 es un residuo glutamato, X35 es un residuo aspartato, y X36 es un residuo alanina (SEC ID nº 32).

Se da a conocer además que el dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa termoestable o termoactiva de la invención comprende un motivo EXO 111, en el que X31 es un residuo no polar. Se da a conocer además que el dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa termoestable o termoactiva de la invención comprende un motivo EXO 111, en el que X31 es un residuo no polar y X35 es un residuo ácido.

de la invención comprende un motivo EXO 111, en el que,

X24 es un residuo treonina,

X25 es un residuo valina, leucina o isoleucina,

X26 es un residuo glutamato, aspartato o prolina,

X27 es un residuo lisina o arginina,

X28 es un residuo alanina o valina,

X29 es un residuo alanina o valina,

X30 es un residuo glutamato o asparagina,

X31 es un residuo no polar,

X32 es un residuo serina o cisteína,

X33 es un residuo cisteína o glicina,

X34 es un residuo glutamato o treonina,

X35 es un residuo aspartato, y

X36 es un residuo alanina (SEC ID nº 33).

de la invención comprende un motivo EXO 111, en el que,

X24 es un residuo treonina,

X25 es un residuo valina,

X26 es un residuo glutamato,

X27 es un residuo lisina,

X28 es un residuo alanina,

X29 es un residuo alanina,

X30 es un residuo asparagina,

X31 es un residuo alanina,

X32 es un residuo serina,

X33 es un residuo cisteína,

X34 es un residuo glutamato,

X35 es un residuo aspartato, y

X36 es un residuo alanina (SEC ID nº 34).

En otro aspecto, la invención proporciona una AON polimerasa termoestable o termoactiva quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, comprendiendo dicha polimerasa una porción aminoterminal y una

porción carboxiterminal, derivándose la porción aminoterminal de la porción aminoterminal de una primera AON polimerasa y derivándose la porción carboxiterminal de una segunda AON polimerasa. En una realización, dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada comprende una porción aminoterminal derivada de la porción aminoterminal de una primera AON polimerasa termoestable o termoactiva y una porción carboxiterminal derivada de una segunda AON polimerasa termoestable o termoactiva, siendo dicha segunda polimerasa una que muestra una actividad de exonucleasa 3' a 5'. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, dicha porción aminoterminal y/o carboxiterminal se deriva de una AON polimerasa de una especie de Thermus. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, dicha porción aminoterminal y/o carboxiterminal se deriva de una AON polimerasa de una especie de Thermotoga. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5', la porción aminoterminal y/o carboxiterminal u otra porción se deriva de una AON polimerasa de una especie de Thermus y la otra porción terminal u otra porción se deriva de una AON polimerasa de una especie de Thermotoga; por ejemplo, en una realización, la porción aminoterminal se deriva de una AON polimerasa de una especie de Thermus y la porción carboxiterminal se deriva de una AON polimerasa de una especie de Thermotoga. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, la porción aminoterminal se deriva de una especie de Thermus y comprende un dominio de exonucleasa 5' a 3' y la porción carboxiterminal se deriva de una especie de Thermotoga y comprende un dominio de exonucleasa 3' a 5' y un dominio de polimerasa. En otra realización, en dicha AON polimerasa con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, la porción aminoterminal se deriva de una especie de Thermus y comprende un dominio de exonucleasa 5' a 3' y presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80% respecto a una porción aminoterminal correspondiente de la AON polimerasa de la especie de Thermus, y dicha porción carboxiterminal presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80%, aunque inferior a 100%, respecto de la porción carboxiterminal correspondiente de la AON polimerasa de la especie de Thermotoga. En otra realización, dicha especie de Thermus es Thermus sp. Z05 y dicha especie de Thermotoga es Thermotoga maritima. En otra realización, la AON polimerasa termoestable o termoactiva quimérica comprende la secuencia de aminoácidos de la figura 4 (SEC ID nº 90) modificada con una o más de las mutaciones indicadas en la figura. En otra realización, la AON polimerasa termoestable o termoactiva quimérica comprende la secuencia de aminoácidos de la figura 5 (SEC ID nº 107) modificada por una o más de las mutaciones indicadas en la figura. En otra realización, la AON polimerasa termoestable o termoactiva quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada comprende una porción aminoterminal, una porción intermedia y una porción carboxiterminal. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, la porción aminoterminal comprende un dominio de exonucleasa 5' a 3'. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, la porción intermedia comprende un dominio de exonucleasa 3' a 5'. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, la porción carboxiterminal comprende un dominio de polimerasa. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, la porción carboxiterminal y la porción aminoterminal se derivan de una polimerasa de una especie de Thermus. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, el extremo aminoterminal y/o carboxiterminal presenta una identidad de secuencia superior a 80% respecto de una porción aminoterminal y/o carboxiterminal correspondiente de una polimerasa de una especie de Thermus. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, la porción intermedia se deriva de una polimerasa de una especie de Thermotoga. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, la porción intermedia presenta una identidad de secuencia superior al 80%, aunque inferior al 100%, respecto de la polimerasa correspondiente de una especie de Thermotoga. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, una porción amino y una porción carboxi se derivan de una polimerasa de una especie de Thermus y una porción intermedia se deriva de una especie de Thermotoga. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, la especie de Thermus es Thermus sp. Z05 y la especie de Thermotoga es

Thermotoga maritima. En otra realización, la AON polimerasa termoestable o termoactiva quimérica comprende la secuencia de aminoácidos de la figura 6 (SEC ID nº 130) modificada por una o más de las mutaciones indicadas en la figura. En otra realización, la AON polimerasa termoestable o termoactiva quimérica comprende la secuencia de aminoácidos de la figura 7 (SEC ID nº 148) modificada por una o más de las mutaciones indicadas en la figura.

En otro aspecto, una AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada de la invención que muestra una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada de aproximadamente 6,5 ó inferior, aunque superior a O, U/pmol, medida utilizando el ensayo estándar del Ejemplo 3, posteriormente, presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80%, aunque inferior a 100%, respecto del dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa Tma no modificada. En una realización, una AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada de la invención que muestra una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada de aproximadamente 6,5 ó inferior, aunque superior a O, U/pmol, medida utilizando el ensayo estándar del Ejemplo 3, posteriormente, presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80%, aunque inferior a 100%, respecto de la AON polimerasa Tma no modificada. La secuencia de aminoácidos de la AON polimerasa Tma no modificada puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la figura 1A (SEC ID nº 85).

En otro aspecto, una AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada de la invención que muestra una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada de aproximadamente 6,5 ó inferior, aunque superior a O, U/pmol, medida utilizando el ensayo estándar del Ejemplo 3, posteriormente, presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80%, aunque inferior a 100%, respecto del dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa Tne no modificada. En una realización, el dominio de exonucleasa 3' a 5' de la AON polimerasa Tne no modificada comprende la secuencia mostrada en la figura 2 (SEC ID nº 88). En otra realización, una AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada de la invención que muestra una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada de aproximadamente 6,5 ó inferior, aunque superior a O, U/pmol, medida utilizando el ensayo estándar del Ejemplo 3, posteriormente, presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80%, aunque inferior a 100%, respecto de la AON polimerasa Tne no modificada. La secuencia de aminoácidos de la AON polimerasa Tne no modificada puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una polimerasa Tne proporcionada en la patente US nº 5.948.614.

Se da a conocer además que una AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada de la invención que muestra una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada de aproximadamente 6,5 ó inferior, aunque superior a O, U/pmol, medida utilizando el ensayo estándar del Ejemplo 3, posteriormente, presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80%, aunque inferior a 100%, respecto del dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa Taf no modificada. Se da a conocer además que el dominio de exonucleasa 3' a 5' de la AON polimerasa Taf no modificada comprende la secuencia mostrada en la figura 3 (SEC ID nº 89). Se da a conocer además que una AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada de la invención que muestra una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada de aproximadamente 6,5 ó inferior, aunque superior a O, U/pmol, medida utilizando el ensayo estándar del Ejemplo 3, posteriormente, presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80%, aunque inferior a 100%, respecto de la AON polimerasa Taf no modificada. La secuencia de aminoácidos de la AON polimerasa Taf no modificada puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una AON polimerasa Taf proporcionada en la patente US nº 5.968,799.

En otro aspecto, la invención proporciona una AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada que presenta un dominio de exonucleasa 3' a 5' que muestra una actividad 3' a 5' atenuada, en la que la proporción de actividad de polimerasa 5' a 3' en U/pmol y la actividad de exonucleasa 3' a 5' en U/pmol, en la que ambas actividades enzimáticas se determinan tal como se indica en el Ejemplo 3, posteriormente, se encuentra comprendida entre aproximadamente 1 y 100, Y el dominio de exonucleasa 3' a 5' presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80%, aunque inferior a 100%, respecto del dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa Tma no modificada. En una realización, la invención proporciona una AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada que presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80%, aunque inferior a 100%, respecto de una AON polimerasa Tma no modificada, en la que la proporción entre la actividad de polimerasa 5' a 3' en U/pmol y la actividad de exonucleasa 3' a 5' en U/pmol, en la que ambas actividades enzimáticas se determinan tal como se indica en el Ejemplo 3, posteriormente, se encuentra comprendida entre aproximadamente 1 y 100. La secuencia de aminoácidos de la AON polimerasa Tma no modificada puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la figura 1A (SEC ID nº 85).

En otro aspecto, una AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada de la invención que presenta un dominio de exonucleasa 3' a 5' y muestra una actividad 3' a 5' atenuada, en la que la proporción entre la actividad de polimerasa 5' a 3' en U/pmol y la actividad de exonucleasa 3' a 5' en U/pmol, en la que ambas actividades enzimáticas se determinan tal como se indica en el Ejemplo 3, posteriormente, se encuentra comprendida entre aproximadamente 1 y 100, Y el dominio de exonucleasa 3' a 5' presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80%, aunque inferior a 100%, respecto del dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa Tne no modificada. En una realización, el dominio de exonucleasa 3' a 5' de la AON polimerasa Tne comprende la secuencia mostrada en la figura 2 (SEC ID nº 88). En otra realización, una AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada de la invención muestra una actividad 3' a 5' atenuada, en la que la proporción entre la actividad de polimerasa 5' a 3' en U/pmol y la actividad de exonucleasa 3' a 5' en U/pmol se encuentra comprendida entre aproximadamente 1 y 100, medida utilizando los ensayos indicados en el Ejemplo 3, y la polimerasa presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80%, aunque inferior a 100%, respecto de una AON polimerasa Tne no modificada. La secuencia de aminoácidos de la AON polimerasa Tne no modificada puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una polimerasa Tne proporcionada en la patente US nº 5.948.614.

Se da a conocer además que una AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada de la invención que presenta un dominio de exonucleasa 3' a 5' y muestra una actividad 3' a 5' atenuada, en la que la proporción entre la actividad de polimerasa 5' a 3' en U/pmol y la actividad de exonucleasa 3' a 5' en U/pmol, en la que ambas actividades enzimáticas se determinan tal como se indica en el Ejemplo 3, posteriormente, se encuentra comprendida entre aproximadamente 1 y 100, Y el dominio de exonucleasa 3' a 5' presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80%, aunque inferior a 100%, respecto del dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa Taf no modificada. Se da a conocer además que el dominio de exonucleasa 3' a 5' de la AON polimerasa Taf no modificada comprende la secuencia mostrada en la figura 3 (SEC ID nº 89). Se da a conocer además que una AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada de la invención muestra una actividad 3' a 5' atenuada, en la que la proporción entre la actividad de polimerasa 5' a 3' en U/pmol y la actividad de exonucleasa 3' a 5' en U/pmol se encuentra comprendida entre aproximadamente 1 y 100, medida utilizando los ensayos indicados en el Ejemplo 3, y la polimerasa presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80%, aunque inferior a 100%, respecto de una AON polimerasa Taf no modificada que comprende la secuencia de aminoácidos de una AON polimerasa Taf proporcionada en la patente US nº 5.968.799.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una mezcla de AON polimerasas termoestables o termoactivas que comprende una AON polimerasa termoestable o termoactiva de la invención que muestra una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada. En una realización, dicha mezcla presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' de aproximadamente 6,5 ó inferior, aunque superior a O, U/pmol, medida utilizando el ensayo estándar indicado en el Ejemplo 3, posteriormente. En otra realización, dicha mezcla presenta una proporción de actividad de polimerasa 5' a 3' en U/pmol a actividad de exonucleasa 3' a 5' en U/pmol que se encuentra comprendida entre aproximadamente 1 y 100, medida utilizando los ensayos indicados en el Ejemplo 3, posteriormente.

En otro aspecto, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica una AON polimerasa termoestable o termoactiva con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada. En una realización, la presente invención proporciona plásmidos que comprenden una secuencia que codifica una AON polimerasa termoestable o termoactiva con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada. En otra realización, el plásmido es un vector de expresión. En otra realización, el vector de expresión permite la expresión de la AON polimerasa termoestable o termoactiva con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada en un microorganismo. En otra realización, el microorganismo es una bacteria. En otra realización, la bacteria es Escherichia coli.

En otro aspecto, la presente invención proporciona células manipuladas para que contengan y/o expresen un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una AON polimerasa termoestable o termoactiva con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada. En una realización, la célula comprende un plásmido que comprende una secuencia que codifica la AON polimerasa termoestable o termoactiva con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada. En otra realización, el plásmido es un vector de expresión que permite la expresión de la AON polimerasa termoestable o termoactiva con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada en la célula. En otra realización, la célula es un microorganismo. En otra realización, el microorganismo es una bacteria, tal como Escherichia coli.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos de producción de una AON polimerasa termoestable o termoactiva de la invención con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, que comprende las etapas de incubar una célula capaz de expresar un ácido nucleico codificante de la AON polimerasa termoactiva con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada bajo condiciones que permitan la expresión de la AON polimerasa termoactiva con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada y separar las AON polimerasas termoactivas con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada de la célula. En una realización, la célula es un microorganismo. En otra realización, el microorganismo es una bacteria. En otra realización, la bacteria es Escherichia coli. En otra realización, la célula comprende un vector de expresión que comprende las AON polimerasas termoactivas con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos de replicar una molécula de AON, que comprenden las etapas de incubar la molécula de AON con una AON polimerasa termoestable o termoactiva de la invención bajo condiciones que permitan que la AON polimerasa termoestable o termoactiva replique la molécula de AON. La molécula de AON puede ser cualquier tipo de molécula de AON, por ejemplo una molécula de AONc, una molécula de AON genómico, una molécula de AON de cadena sencilla o una molécula de AON de doble cadena. En una realización, la AON polimerasa termoactiva con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada se utiliza para amplificar la molécula de AON, por ejemplo mediante PCR. En otra realización, una AON polimerasa termoestable o termoactiva con un nivel deseado de actividad de exonucleasa 3' a 5' se selecciona para ajustarse a las condiciones de una aplicación particular, por ejemplo al tipo y concentración de ion metálico, al tipo y concentración de sal, a la longitud del ácido nucleico diana y/o a si la molécula diana es, por ejemplo, un AON de cadena sencilla, un AON de doble cadena o un ARN.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para seleccionar una AON polimerasa termoestable o termoactiva con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, que comprende las etapas de someter a ensayo la actividad de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa termoestable o termoactiva y seleccionar la polimerasa en el caso de que presente una actividad de exonucleasas 3' a 5' atenuada. En una realización, la AON polimerasa termoestable o termoactiva es una AON polimerasa termoestable o termoactiva modificada. En otra realización, la AON polimerasa termoestable o termoactiva modificada es una AON polimerasa termoestable o termoactiva mutante. En otra realización, la AON polimerasa termoestable o termoactiva se selecciona en el caso de que presente un nivel de actividad de exonucleasa 3' a 5' que se encuentre comprendido entre aproximadamente 0,1% Y

1 O

aproximadamente 65% del nivel de actividad de exonucleasa 3' a 5' de una polimerasa de referencia, medida utilizando el ensayo estándar del Ejemplo 3, posteriormente. En otra realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva se selecciona en el caso de que presente un nivel de actividad de exonucleasa 3' a 5' que se encuentre comprendido entre aproximadamente 1,0% Y aproximadamente 30% del nivel de actividad de exonucleasa 3' a 5' de la polimerasa de referencia. En otra realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva se selecciona en el caso de que presente un nivel de actividad de exonucleasa 3' a 5' que se encuentre comprendido entre aproximadamente 3,0% y aproximadamente 20% del nivel de actividad de exonucleasa 3' a 5' de la polimerasa de referencia. En otra realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva se selecciona en el caso de que presente un nivel de actividad de exonucleasa 3' a 5' que se encuentre comprendido entre aproximadamente 3,0% y aproximadamente 10% del nivel de actividad de exonucleasa 3' a 5' de la polimerasa de referencia. En otra realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva se selecciona en el caso de que presente un nivel de actividad de exonucleasa 3' a 5' que se encuentre comprendido entre aproximadamente 3,0% y aproximadamente 5% del nivel de actividad de exonucleasa 3' a 5' de la polimerasa de referencia. En otra realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva se selecciona en el caso de que presente un nivel de actividad de entre 6,5 y un nivel inferior, aunque superior a 0, unidades/pmol, medido utilizando el ensayo estándar del Ejemplo. En otra realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva mutante se selecciona en el caso de que presente una proporción de actividad de ADN polimerasa 5' a 3' a actividad de exonucleasa 3' a 5' de entre aproximadamente 1 y 100, en el que las actividades enzimáticas se miden utilizano los ensayos indicados en el Ejemplo 3, posteriormente.

En otro aspecto, la presente invención proporciona kits que comprenden por lo menos una ADN polimerasa termoestable o termoactiva con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada. En una realización, el kit comprende además un reactivo útil para replicar una molécula de ADN. En otra realización, el reactivo resulta útil para replicar una molécula de ADN en una amplificación por PCR. En otra realización, el reactivo es un tampón. En otra realización, el reactivo es un cebador. En otra realización, el reactivo es un desoxirribonucleótido. En otra realización, el reactivo es un dideoxirribonucleótido.

En otro aspecto, la invención proporciona mezclas de ADN polimerasas que comprende una primera ADN polimerasa termoestable o termoactiva con una actividad de exonucleasas 3' a 5' atenuada y una segunda ADN polimerasa termoestable o termoactiva. En una realización, la segunda ADN polimerasa termoestable o termoactiva presenta menos actividad de exonucleasa 3' a 5' que la primera ADN polimerasa termoestable o termoactiva. En otra realización, la segunda ADN polimerasa termoestable o termoactiva no presenta esencialmente actividad de exonucleasa 3' a 5'. En otra realización, la segunda ADN polimerasa termoestable o termoactiva presenta más actividad de exonucleasa 3' a 5' que la primera ADN polimerasa termoestable o termoactiva. En otra realización, la mezcla presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' de aproximadamente 6,5 ó inferior, aunque superior a 0, unidades/pmol, medida utilizando el ensayo estándar del Ejemplo 3, posteriormente.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos de replicacion de una molécula de ADN que utilizan una mezcla de ADN polimerasas termoestables o termoactivas, que comprenden las etapas de incubar la molécula de ADN con una primera polimerasa con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada y una segunda ADN polimerasa termoestable o termoactiva bajo condiciones que permitan que las ADN polimerasas repliquen la molécula de ADN. En una realización, el ADN se replica utilizando la mezcla de polimerasas en una amplificación por PCR.

Las composiciones y métodos de la invención ofrecen varias ventajas sobre las composiciones y métodos anteriormente disponibles. Las ADN polimerasas termoestables o termoactivas de la invención son superiores a las ADN polimerasas termoestables o termoactivas que no presentan actividad de exonucleasa 3' a 5' debido a que las polimerasas de la invención permiten una fidelidad de replicación y amplificación más elevadas de una secuencia de ADN molde. Las ADN polimerasas termoestables o termoactivas de la invención son superiores a las ADN polimerasas termoestables o termoactivas con actividades de exonucleasa 5' a 3' robustas debido a que las polimerasas de la invención permiten una menor degradación del molde que debe replicarse, una menor degradación de los cebadores y/o una utilización más eficiente de los dNTPs y otros componentes de reacción, al reducir la aparición de improductivas reacciones "inactivas". Las ADN polimerasas termoestables o termoactivas mutantes de la invención son superiores a las mezclas de ADN polimerasas termoestables o termoactivas con y sin actividades de exonucleasa 3' a 5' debido a que las polimerasas de la invención requieren menores manipulación y calibración y, por lo tanto, resultan más eficientes y menos costosas de preparar y utilizar. Además, inesperadamente, se ha encontrado que la PCR requiere un menor número de las polimerasas de la invención que de la mezcla de enzimas utilizada anteriormente. Las mezclas de enzimas termoestables o termoactivas de la presente invención resultan superiores a las mezclas anteriormente disponibles debido a que permiten un control más fino de la proporción entre la actividad de ADN polimerasas 5' a 3' dependiente del molde y la actividad de exonucleasa 3' a 5' y debido a que permiten crear mezclas en las que las actividades de ADNmc exonucleasa y de ADNbc exonucleasa se modulan independientemente.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS La figura 1A presenta la secuencia de aminoácidos de la AON polimerasa de Thermotoga maritima (Tma) (SEC ID nº 85). El dominio de exonucleasa 3' a 5' se encuentra entre aproximadamente los residuos aminoácidos 292 y 487 (SEC ID nº 86), los cuales se encuentran subrayados. La figura 1 B presenta la secuencia de ácidos nucleicos (SEC ID nº 87) que codifica la secuencia de aminoácidos de la figura 1A.

La figura 2 presenta una secuencia de aminoácidos de la región del dominio de exonucleasa 3' a 5' de la AON polimerasa de Thermotoga neapolitana (Tne) (SEC ID nº 88).

La figura 3 presenta una secuencia de aminoácidos de la región del dominio de exonucleasa 3' a 5' de la AON polimerasa de Thermosipho africanus (Taf) (SEC ID nº 89).

La figura 4A presenta la secuencia de aminoácidos de la AON polimerasa termoestable quimérica CS5 (SEC ID nº 90). El dominio de exonucleasa 3' a 5' se extiende entre aproximadamente el residuo 292 y aproximadamente el residuo 487, encontrándose estos residuos subrayados (SEC ID nº 91). Los residuos 1 a 291 (SEC ID nº 92) se derivan de la AON polimerasa Z05 y los residuos 292 a 893 (SEC ID nº 93) se derivan de la AON polimerasa Tma, tal como indican las flechas. Las sustituciones de residuos aminoácidos introducidas durante la segunda ronda de mutagénesis aparecen directamente sobre los residuos que sustituyen, los cuales se indican en negrita: L329A (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 94; proteína completa, SEC ID nº 95). Q384A (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 96; proteína completa, SEC ID nº 97). N385A (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 98; proteína completa, SEC ID nº 99), Q384A N385A (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 100; proteína completa, SEC ID nº 101), 0389E (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 102, proteína completa, SEC ID nº 103) e Y464A (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 104; proteína completa, SEC ID nº 105). La figura 4B presenta la secuencia de ácidos nucleicos que codifica CS5 (SEC ID nº 106).

La figura 5A presenta la secuencia de aminoácidos de la AON polimerasa termoestable quimérica CS6 (SEC ID nº 107). El dominio de exonucleasa 3' a 5' se extiende entre aproximadamente el residuo 292 y aproximadamente el residuo 487, encontrándose estos residuos subrayados (SEC ID nº 108). Los residuos 1 a 291 (SEC ID nº 109) se derivan de la AON polimerasa Z05 y los residuos 292 a 893 (SEC ID nº 110) se derivan de la AON polimerasa Tma, tal como indican las flechas, excepto en que los residuos 323 a 325 han sido sustituidos por la secuencia ALA. Las sustituciones de residuos aminoácidos introducidas durante la primera ronda de mutagénesis aparecen directamente sobre los residuos que sustituyen, los cuales se indican en negrita: OEE (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 111; proteína completa, SEC ID nº 112), OOE (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 113; proteína completa, SEC ID nº 114), OKE (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 115; proteína completa, SEC ID nº 116), ONE (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 117; proteína completa, SEC ID nº 118), OQE (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 119; proteína completa, SEC ID nº 120), OHE (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 121; proteína completa, SEC ID nº 122), OLO (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 123; proteína completa, SEC ID nº 124), ELO (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 125; proteína completa, SEC ID nº 126), ELE (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 127; proteína completa, SEC ID nº 128).

La figura 5B presenta la secuencia de ácidos nucleicos que codifica CS6 (SEC ID nº 129).

La figura 6A presenta la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 130) de la AON polimerasa termoestable quimérica CS7. El dominio de exonucleasa 3' a 5' se extiende entre aproximadamente el residuo 292 y aproximadamente el residuo 487, encontrándose estos residuos subrayados (SEC ID nº 131). Los residuos 1 a 291 (SEC ID nº 132) y 484 a 894 (SEC ID nº 133) se derivan de la AON polimerasa Z05 y los residuos 292 a 484 (SEC ID nº 134) se derivan de la AON polimerasa Tma, tal como indican las flechas. Las sustituciones de residuos aminoácidos análogas a las introducidas en CS5 durante la segunda ronda de mutagénesis aparecen directamente sobre los residuos que sustituyen, los cuales se indican en negrita: L329A (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 135; proteína completa, SEC ID nº 136), Q384A (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 137; proteína completa, SEC ID nº 138). N385A (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 139; proteína completa, SEC ID nº 140), Q384A N385A (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 141; proteína completa, SEC ID nº 142), 0389E (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 143; proteína completa, SEC ID nº 144) e Y464A (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 145; proteína completa, SEC ID nº 146). La figura 6B presenta la secuencia de ácidos nucleicos que codifica CS7 (SEC ID nº 147).

La figura 7A presenta la secuencia de aminoácidos de la AON polimerasa termoestable quimérica CS8 (SEC ID nº 148). El dominio de exonucleasa 3' a 5' se extiende entre aproximadamente el residuo 292 y aproximadamente el residuo 487, encontrándose estos residuos subrayados (SEC ID nº 149). Los residuos 1 a 292 (SEC ID nº 150) y 485 a 894 (SEC ID nº 151) se derivan de la AON polimerasa Z05 y los residuos 292 a 484 (SEC ID nº 152) se derivan de la AON polimerasa Tma, tal como indican las flechas, excepto en que los residuos 323 a 325 han sido sustituidos por la secuencia ALA. Las sustituciones de residuos aminoácidos análogas a las introducida durante la segunda ronda de mutagénesis de CS5 aparecen directamente sobre los residuos que sustituyen, los cuales se indican en negrita: OEE (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 153; proteína completa, SEC ID nº 154), OOE (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 155; proteína completa, SEC ID nº 156), OKE (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 157; proteína completa, SEC ID nº 158), ONE (domiio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 159; proteína completa, SEC ID nº 160), OQE (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 161; proteína completa, SEC ID nº 162), OHE (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 163; proteína completa, SEC ID nº 164), OLO (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 165; proteína completa, SEC ID nº 166), ELO (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 167; proteína completa, SEC ID nº 168), ELE (dominio de exonucleasa 3' a 5', SEC ID nº 169; proteína completa, SEC ID nº 170). La figura 7B presenta la secuencia de ácidos nucleicos que codifica CS8 (SEC ID nº 171).

La figura 8 presenta una alineación de secuencias de una secuencia de aminoácidos de la región del dominio de exonucleasa 3' a 5' de la AON polimerasa Eco con otras AON polimerasas de la familia A: Tth (SEC ID nº 172), Tca (SEC ID nº 173), Z05 (SEC ID nº 174), Taq (SEC ID nº 175), Tfl (SEC ID nº 176), Tfi (SEC ID nº 177), Sps17 (SEC ID nº 178), Ora (SEC ID nº 179), HSP-B-7 (SEC ID nº 180), Bst (SEC ID nº 181), Bca (SEC ID nº 182), E. coli (SEC ID nº 183), Tma (SEC ID nº 184), Tne (SEC ID nº 185), Taf (SEC ID nº 186), HSP-A (SEC ID nº 187). Los motivos Exo I (SEC ID nº 203), Exo II (SEC ID nº 188), Exo Ila (SEC ID nº 189) y Exo III (SEC ID nº 190) se indican en negrita en la secuencia de Tma.

Las figuras 9A y 9B presentan curvas de crecimiento de una amplificación por transcriptasa inversa/PCR de un molde de VIH de 1,7 kb utilizando las AON polimerasas mutantes de la invención.

La figura 10 presenta fotografías de análisis de electroforesis de los productos de amplificación de las amplificaciones por PCR con transcriptasa inversa de la figura 9.

La figura 11 presenta una alineación de secuencias de la AON polimerasa de familia B EcoPol II con varias otras AON polimerasas de la familia B (SEC ID nº 191-202).

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN

Con el fin de facilitar la comprensión de la invención, se definen varios términos a continuación.

Los términos "células", "línea celular" y "cultivo celular" pueden utilizarse intercambiablemente y todas dichas designaciones incluyen la progenie. De esta manera, las expresiones "transformantes" o "células transformadas" incluye la célula transformada primaria y los cultivos derivados a partir de la misma con independencia del número de transferencias. Toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en su contenido de AON, debido a mutaciones deliberadas o naturales. La progenie mutante que presenta la misma funcionalidad para la que se criba en la célula originalmente transformada se encuentra comprendida en la definición de transformantes. Las células pueden ser procarióticas o eucarióticas.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de AON necesarias para la expresión de una secuencia codificante operablemente ligada en un organismo húesped particular. Entre las secuencias de control que resultan adecuadas para los procariotas se incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, un sitio de unión ribosómica, elementos retrorreguladores positivos (ver la patente US nº 4.666.848) y posiblemente otras secuencias. Es conocido que las células eucarióticas utilizan promotores, señales de poliadenilación e intensificadores.

La expresión "clon de expresión" se refiere a secuencias de AON que contienen una secuencia codificante deseada y secuencias de control en ligamiento operable, de manera que los huéspedes transformados con dichas secuencias son capaces de producir las proteínas codificadas. La expresión "sistema de expresión" se refiere a un huésped transformado con un clon de expresión. Para llevar a cabo la transformación, el clon de expresión puede incluirse en un vector; sin embargo, el AON relevante también puede integrarse en el cromosoma del huésped.

El término "gen" se refiere a una secuencia de AON que comprende secuencias de control y codificantes que resultan necesarias para la producción de una proteína, polipéptido o precursor.

La expresión "operable mente ligado" se refiere a la posición de la secuencia codificante, de manera que las secuencias de control funcionan controlando la expresión de la proteína codificada por la secuencia codificante. De esta manera, una secuencia codificante "operablemente ligada" a secuencias de control se refiere a una configuración en la que las secuencias codificantes pueden expresarse bajo la dirección de una secuencia de control.

El término "oligonucleótido" tal como se utiliza en la presente memoria se define como una molécula que comprende dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos. El tamaño exacto depende de muchos factores, que, a su vez, dependen de la función última o utilización del oligonucleótido. Pueden prepararse oligonucleótidos mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, la clonación y restricción de secuencias apropiadas y la síntesis química directa mediante un método tal como el método del fosfotriéster de Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; el método del fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109-151, 1979; el método de la dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981; Y el método en soporte sólido de la patente US nº 4.458.066. Se proporciona una revisión de los métodos de síntesis en Goodchild, Bioconjugate Chemistry 1(3):165-187,1990.

El término "cebador" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un oligonucleótido capaz de actuar como punto de inicio de síntesis al situarlo bajo condiciones en las que se inicia la extensión del cebador. La síntesis de un producto de extensión de cebador que es complementario a una cadena de ácidos nucleicos se inicia en presencia de los cuatro nucleósidos tri fosfato diferentes requeridos y una ADN polimerasa termoestable o termoactiva en un tampón apropiado a una temperatura adecuada. Un "tampón" incluye cofactores (tales como iones metálicos divalentes) y sal (para proporcionar la fuerza iónica apropiada) ajustados al pH deseado.

Un cebador que se hibrida a la cadena no codificante de una secuencia génica (análogamente, es una subsecuencia de la cadena codificante) se denomina en la presente memoria cebador "cadena arriba" o "directo". Un cebador que se hibrida a la cadena codificante de una secuencia génica se denomina en la presente memoria cebador "cadena abajo" o "inverso".

Las expresiones "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a enzimas, típicamente de origen bacteriano, que cortan ADN de doble cadena en una secuencia de nucleótidos específica o en una posición próxima a la misma.

Las familias de residuos aminoácidos que presentan cadenas laterales similares se definen en la presente memoria. Entre estas familias se incluyen aminoácidos que presentan cadenas laterales básicas (por ejemplo lisina, arginina e histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo ácido aspártico y ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo asparagina, glutamina, serina, treonina y tirosina), cadenas laterales no polares (por ejemplo alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano, cisteína y glicina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo treonina, valina e isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo tirosina, fenilalanina, triptófano e histidina).

La expresión "polimerasa termoestable" se refiere a un enzima que es estable frente al calor, es resistente al calor y conserva suficiente actividad para llevar a cabo reacciones posteriores de extensión de cebador tras someterlas a las temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para desnaturalizar ácidos nucleicos de doble cadena. Las condiciones de calentamiento necesarias para la desnaturalización de ácidos nucleicos son bien conocidas de la técnica y se ejemplifican en las patentes US nº 4.965.188 y nº 4.889.818. Tal como se utiliza en la presente memoria, una polimerasa termoestable resulta adecuada para la utilización en una reacción de ciclado térmico, tal como la PCR.

La expresión "polimerasa termoactiva" se refiere a un enzima que es activo a las temperaturas elevadas necesarias para garantizar el cebado específico y la extensión de cebadores (por ejemplo 55ºC a 80ºC).

La expresión "actividad correctora de errores" se refiere a una actividad de exonucleasa 3' a 5' que presenta una molécula que también presenta una actividad de ADN polimerasa 5' a 3'.

Para una actividad de ADN polimerasa, "actividad enzimática" se refiere a la catálisis de la combinación de los nucleótidos de la manera correcta para formar productos de extensión de cebador que son complementarios a una cadena molde de ácidos nucleicos. Las actividades de ADN polimerasa se expresan como unidades/pmol medidas utilizando el ensayo de polimerasa que se ensaya posteriormente, en el Ejemplo 3. Una unidad de actividad de polimerasa se define como el nivel de actividad enzimática requerido para incorporar un total de 10 nmoles de dNMP en producto de ADN precipitable con TCA en 30 minutos utilizando las condiciones de ensayo de polimerasa proporcionadas posteriormente, en el Ejemplo 3.

Para una actividad de exonucleasa 3' a 5', la expresión "actividad enzimática" se refiere a la eliminación en serie de los residuos nucleótidos situados más hacia el extremo 3' de una cadena de ácidos nucleótidos, polinucleótido u oligómero mediante catálisis de la hidrólisis del enlace fosfodiéster. Una unidad de actividad de exonucleasa 3' a 5' cataliza la conversión de 50 pmoles de oligonucleótido NJS40 de cadena sencilla en oligonucleótidos de menor longitud en 15 minutos bajo las condiciones de ensayo estándar enseñadas en el Ejemplo 3, posteriormente.

Para una actividad de exonucleasa 5' a 3', la expresión "actividad enzimática" se refiere a la eliminación en serie de los residuos nucleótidos situados más hacia el extremo 5' de una cadena de ácidos nucleótidos, polinucleótido u oligónucleótido mediante catálisis de la hidrólisis del enlace fosfodiéster. Se define una unidad de actividad de exonucleasa 5' a 3' y se proporciona un ensayo para medir la actividad de exonucleasa 5' a 3' en la patente US nº

5.795.762.

Tal como se utiliza en la presente memoria, una "mutación puntual" en una secuencia de aminoácidos se refiere a la sustitución de un solo aminoácido, a la inserción de un solo aminoácido o a la deleción de un solo aminoácido. Preferentemente se introduce una mutación puntual en una secuencia de aminoácidos mediante un cambio de codón adecuado en el ADN codificante. Los aminoácidos individuales en una secuencia se representan en la presente memoria como AN, en donde A es el símbolo estándar de una letra para el aminoácido en la secuencia y N es la posición en la secuencia. Las mutaciones dentro de una secuencia de aminoácidos se representan en la presente memoria como Al NA2, en donde Al es el símbolo estándar de una letra para el aminoácido en la secuencia de proteína no mutada, A2 es el símbolo estándar de una letra para el aminoácido en la secuencia de proteína mutada y N es la posición en la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, una mutación G46D representa un cambio de glicina a un residuo aspartato en la posición aminoácida 46. En referencia a mutaciones en un dominio derivado de una proteína, las posiciones aminoácidas se numeran basándose en la secuencia de longitud completa de la proteína a partir de la cual se derivó la región que comprende la mutación. De esta manera, en la presente invención, las mutaciones en la región de la proteína que se derivan de una ADN polimerasa de una especie de Thermus se han numerado según la secuencia de la ADN polimerasa de especie de Thermus de longitud completa, mientras que las mutaciones en la región derivada de la ADN polimerasa Tma se han numerado según la secuencia de la ADN polimerasa Tma de longitud completa. Las representaciones de los nucleótidos y mutaciones puntuales en las secuencias de ADN son análogas. Sin embargo, al hacer referencia a una proteína quimérica o a un ácido nucleico codifican te de una proteína quimérica, los residuos aminoácidos o los ácidos nucleicos se numeran contiguamente.

Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se utilizan intercambiablemente. Las expresiones "ácido nucleico" y "polinucleótido" se utilizan intercambiable mente. Las secuencias de aminoácidos se escriben de extremo aminoterminal a extremo carboxiterminal, a menos que se indique lo contrario. Las secuencias de ácidos nucleicos de cadena sencilla se escriben 5' a 3', a menos que se indique lo contrario. La cadena superior de una secuencia de ácidos nucleicos de doble cadena se escribe 5' a 3', y la cadena inferior se escribe 3' a 5', a menos que se indique lo contrario.

Tal como se utiliza en la presente memoria, una proteína "quimérica" se refiere a una proteína cuya secuencia de aminoácidos representa un producto de fusión de subsecuencias de las secuencias de aminoácidos de por lo menos dos proteínas diferentes. Una proteína quimérica preferentemente no se produce mediante manipulación directa de las secuencias de aminoácidos sino que se expresa a partir de un gen "quimérico" que codifica la secuencia de aminoácidos quimérica. En una realización de la presente invención, se proporciona una proteína quimérica que consiste de una región aminoterminal (N-terminal) derivada de una ADN polimerasa de especie de Thermus y una región carboxiterminal (e-terminal) derivada de la ADN polimerasa Tma. La región N-terminal se refiere a una región que se extiende entre el extremo N-terminal (posición aminoácida 1) Y un aminoácido interno. De manera similar, la región e-terminal se refiere a una región que se extiende desde un aminoácido interno y el extremo e-terminal.

A menos que se indique lo contrario, la identidad de secuencia de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo BLAST, descrito en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1999, Y Karlin et al., PNAS USA 90:5873-5787, 1993. Un programa BLAST particularmente útil es el programa WU-BLAST-2 que se describe en Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480, 1996. WU-BLAST-2 utiliza varios parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales se fijan en los valores por defecto. Los parámetros ajustables se fijan en los valores siguientes: overlap span=1 (extensión del solapamiento), overlap fraction=0,125 (fracción de solapamiento), word threshold (T)=11 (umbral de palabra). Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos y son fijados por el programa mismo dependiendo de la composición de la secuencia particular y de la composición de la base de datos particular en la que se está buscando la secuencia de interés; sin embargo, los valores pueden ajustarse para incrementar la sensibilidad. Se determina un valor de porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos a partir del número de residuos idénticos correspondientes dividido por el número total de residuos de la secuencia "más larga" en la región alineada. La secuencia "más larga" es la que presenta el máximo de residuos reales en la región alineada (los huecos introducidos por WU-Blast-2 para maximizar la puntuación de alineación se ignoran). El porcentaje de homología de secuencia de aminoácidos se determina basándose en el número de residuos aminoácidos homólogos en relación al número total de residuos aminoácidos.

Se define el porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácidos nucleicos como el porcentaje de residuos nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos nucleótidos de la secuencia. A menos que se indique lo contrario, el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se calcula utilizando el módulo BLASTN de WU-BLAST-2 programado con los parámetros por defecto, con extensión de solapamiento y fracción de solapamiento fijados en 1 y 0,125, respectivamente. La alineación puede incluir la introducción de huecos en las secuencias que deben alinearse. El porcentaje de homología de secuencias de ácidos nucleicos se determina

1 O

basándose en el número de nucleósidos homólogos en relación al número total de nucleósidos. Para las secuencias tanto de ácidos nucleicos como de aminoácidos, "% de homología" y "% de homología de secuencias" se utilizan intercambiablemente con "% de similitud" y "% de similitud de secuencias".

Tal como se utiliza en la presente memoria, una actividad se encuentra "atenuada" en el caso de que sea inferior al 1 00% pero todavía medible utilizando el ensayo estándar descrito en el Ejemplo 3, posteriormente. Una actividad se encuentra "inactivada" o "esencialmente inactivada" en el caso de que se reduzca a menos de 0,1% de la actividad del enzima totalmente funcional.

ADN polimerasas termoestables y termoactivas de la invención

La presente invención proporciona nuevas composiciones que son ADN polimerasas termoestables o termoactivas con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada. Las ADN polimerasas termoestables o termoactivas de la invención resultan, por ejemplo, más adecuadas y deseables que las ADN polimerasas termoestables o termoactivas anteriores para la utilización en los métodos de amplificación basados en la pCR, tales como la amplificación basada en la PCR de un fragmento de ADN para la clonación. Entre los métodos de amplificación por PCR mejorados se incluyen la utilización de dichas ADN polimerasas termoestables o termoactivas. También se proporcionan métodos de preparación de las ADN polimerasas termoestables o termoactivas con actividad correctora de errores atenuada, secuencias de ADN codificantes de los mismos y vectores para la expresión de los mismos.

1. ADN polimerasas termoestables o termoactivas con actividad exonucleasa 3' a 5' atenuada

En un aspecto, la presente invención proporciona una ADN polimerasa termoestable o termoactiva aislada que muestra una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada. En una realización, la polimerasa es de una eubacteria termofílica. En otra realización, la eubacteria termofílica es una especie del género Thermotoga. En otra realización, la eubacteria termofílica es Thermotoga maritima (Tma). En otra realización, la eubacteria termofílica es Thermotoga neapolitana. En otra realización, la eubacteria termofílica es una especie del género Thermosipho. En otra realización, la eubacteria termofílica es Thermosipho africanus. En otra realización, la eubacteria termofílica es una especie del género Aquifex. En otra realización, la eubacteria termofílica es Aquifex pyrophilus. En otra realización, la eubacteria termofílica es Aquifex aeolieus.

En otro aspecto, la polimerasa es de una arqueobacteria termofílica. En una realización, la arqueobacteria termofílica es una especie del género Thermococcus. En otra realización, la arqueobacteria termofílica es Thermococcus barossi. En otra realización, la arqueobacteria termofílica es Thermococcus litoralis. En otra realización, la arqueobacteria termofílica es Thermococcus gorgonarius. En otra realización más, la arqueobacteria termofílica es una especie del género Pyrococcus. En otra realización, la arqueobacteria termofílica es Pyrococcus furiosus. En otra realización, la arqueobacteria termofílica es Pyrococcus sp. GB-D. En otra realización, la arqueobacteria termofílica es Pyrococcus woesei. En otra realización, la arqueobacteria termofílica es Pyrococcus abyssi. En otra realización, la arqueobacteria termofílica es una especie del género Pyrodictium. En otra realización, la arqueobacteria termofílica es Pyrodictium abyssi. En otra realización, la arqueobacteria termofílica es Pyrodictium occultum.

En otro aspecto, la invención proporciona una ADN polimerasa termoestable o termoactiva que comprende una o más mutaciones puntuales (sustitución de un solo aminoácido, mutaciones por inserción o por deleción) que reducen su actividad de exonucleasa 3' a 5'. En una realización, la actividad de exonucleasa 3' a 5' de la ADN polimerasa termoestable o termoactiva mutante es de entre aproximadamente 0,1% Y aproximadamente 65% la de la ADN polimerasa de tipo salvaje medida utilizando el ensayo estándar del Ejemplo 3. En otra realización, la actividad de exonucleasa 3' a 5' de la ADN polimerasa termoestable o termoactiva mutante es de entre aproximadamente 1,0% Y aproximadamente 30% la de la ADN polimerasa de tipo salvaje. En otra realización, la actividad de exonucleasa 3' a 5' de la polimerasa mutante es de entre aproximadamente 3,0% y aproximadamente 20% la de la ADN polimerasa de tipo salvaje. En otra realización, la actividad de exonucleasa 3' a 5' de la polimerasa mutante es de entre aproximadamente 3,0% y aproximadamente 10% la de la ADN polimerasa de tipo salvaje. En otra realización, la actividad de exonucleasa 3' a 5' de la polimerasa mutante es de entre aproximadamente 3,0% y aproximadamente 5,0% la de la ADN polimerasa de tipo salvaje.

En otro aspecto, la actividad de exonucleasa 3' a 5' de la polimerasa mutante es de 50% o inferior, aunque superior a 0%, de la de la ADN polimerasa de tipo salvaje, medida utilizando el sustrato de ADN de doble cadena y el primer ensayo variante del Ejemplo 4. En una realización, la actividad de exonucleasa 3' a 5' de la polimerasa mutante es de entre aproximadamente 4% y aproximadamente 35% la de la ADN polimerasa de tipo salvaje. En otra realización, la actividad de exonucleasa 3' a 5' de la polimerasa mutante es de entre aproximadamente 4% y aproximadamente 17% la de la ADN polimerasa de tipo salvaje.

En otro aspecto, la actividad de exonucleasa 3' a 5' de la polimerasa mutante es de entre aproximadamente 0,1% Y aproximadamente 70%, de la de la ADN polimerasa de tipo salvaje, medida utilizando el sustrato de ADN de doble cadena que contenía desapareamientos y el segundo ensayo variante del Ejemplo 4. En una realización, la actividad de exonucleasa 3' a 5' de la polimerasa mutante es de entre aproximadamente 10% Y aproximadamente 50% la de la ADN polimerasa de tipo salvaje. En otra realización, la actividad de exonucleasa 3' a 5' de la polimerasa mutante es de entre aproximadamente 10% Y aproximadamente 30% la de la ADN polimerasa de tipo salvaje.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una ADN polimerasa termoestable o termoactiva que presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' de aproximadamente 6,5 U/pmol o inferior, aunque superior a °U/pmol, medida utilizando el ensayo estándar del Ejemplo 3. En una realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' de entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 3,0 unidades/pmol. En otra realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' de entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 1,6 unidades/pmol.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una ADN polimerasa termoestable o termoactiva que presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' de aproximadamente 5,5 U/pmol o inferior, aunque superior a °U/pmol, medida utilizando el sustrato de ADN de doble cadena y el primer ensayo variante del Ejemplo 4. En una realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva presenta una actividad de exonucleasa 4' a 5' de entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 3,6 unidades/pmol. En otra realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' de entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 1,9 unidades/pmol.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una ADN polimerasa termoestable o termoactiva que presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' de aproximadamente 0,01 y 12,0 U/pmol, medida utilizando el sustrato de ADN de doble cadena que contenía desapareamientos y el segundo ensayo variante del Ejemplo 4. En una realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' de entre aproximadamente 1,0 Y aproximadamente 7,0 unidades/pmol. En otra realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' de entre aproximadamente 1,5 Y aproximadamente 5,0 unidades/pmol.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una ADN polimerasa termoestable o termoactiva que presenta una proporción de actividad de ADN polimerasa 5 a 3' dependiente de molde a actividad de exonucleasa 3' a 5' de entre aproximadamente 1 y 100, en la que la actividad de polimerasa y la actividad de exonucleasa 3' a 5' se miden tal como se describe en el Ejemplo 3. En una realización, la proporción de actividad de ADN polimerasa 5' a 3' dependiente de molde a actividad de exonucleasa 3' a 5' es de entre aproximadamente 3,0 y aproximadamente 50. En otra realización, la proporción de actividad de ADN polimerasa 5' a 3' dependiente de molde a actividad de exonucleasa 3' a 5' es de entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 25,0.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una ADN polimerasa termoestable o termoactiva que presenta una proporción de actividad de ADN polimerasa 5' a 3' dependiente de molde a actividad de exonucleasa 3' a 5' de entre aproximadamente 1 y 100, en la que la actividad de polimerasa se mide tal como se describe en el Ejemplo 3 y la actividad de exonucleasa 3' a 5' se mide utilizando el sustrato de ADN de doble cadena y el primer ensayo variante del Ejemplo 4. En una realización, la proporción de actividad de ADN polimerasa 5' a 3' dependiente de molde a actividad de exonucleasa 3' a 5' es de entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 50. En una realización, la proporción de actividad de ADN polimerasa 5' a 3' dependiente de molde a actividad de exonucleasa 3' a 5' es de entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 25,0.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una ADN polimerasa termoestable o termoactiva que presenta una proporción de actividad de ADN polimerasa 5' a 3' dependiente de molde a actividad de exonucleasa 3' a 5' de entre aproximadamente 0,75 Y 10, en la que la actividad de polimerasa se mide tal como se describe en el Ejemplo 3 y la actividad de exonucleasa 3' a 5' se mide utilizando el sustrato de ADN de doble cadena que contiene desapareamientos y el segundo ensayo variante del Ejemplo 4. En una realización, la proporción de actividad de ADN polimerasa 5' a 3' dependiente de molde a actividad de exonucleasa 3' a 5' es de entre aproximadamente 1,2 Y aproximadamente 5,0. En otra realización, la proporción de actividad de ADN polimerasa 5' a 3' dependiente de molde a actividad de exonucleasa 3' a 5' es de entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,5.

En otro aspecto de la invención, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada se deriva de la ADN polimerasa Tma. En una realización de la invención, la ADN polimerasa termoestable

o termoactiva con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada se deriva de una ADN polimerasa quimérica de Thermus/Thermatoga que incluye un dominio de exonucleasa 3' a 5' de Tma. La ADN polimerasa Tma es un enzima termoestable y termoactivo con actividad de exonucleasa 3' a 5'. Ver las patentes US nº 5.624.833 y nº 5.374.553. Los residuos aminoácidos aproximadamente 292 a aproximadamente 484 de la ADN polimerasa Tma ilustrada en la figura 1 comprenden el dominio de exonucleasa 3' a 5'. En otra realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva de la presente invención comprende una o más mutaciones en el dominio de exonucleasa 3' a 5' de la ADN polimerasa Tma. En otra realización, la ADN polimerasa Tma mutante comprende una mutación en L329. En otra realización, la mutación es L329A. En otra realización, la ADN polimerasa Tma mutante comprende una mutación en 0389. En otra realización, la mutación es D389E. En otra realización, la ADN polimerasa Tma mutante comprende una mutación en 0384. En otra realización, la mutación es 0384A. En otra realización, la ADN polimerasa Tma mutante comprende una mutación en N385. En otra realización, la mutación es N385A. En otra realización, la ADN polimerasa Tma mutante comprende mutaciones en 0384 y N385. En otra realización, las mutaciones son 0384A N385A.

Otras mutaciones en dichas posiciones u otras posIciones de aminoácidos que resultan en una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada pueden identificarse mediante la creación y ensayo de los mutantes utilizando técnicas estándares y los ensayos de actividad de exonucleasa que se enseñan en la presente memoria. Un método de preparación de una ADN polimerasa Tma mutante con actividad de exonucleasa 3' a 5' reducida es delecionar uno o más residuos aminoácidos o mutarlos en un aminoácido que presente una propiedad química diferente. Por ejemplo, un residuo aminoácido que presenta una cadena lateral ácida, tal como aspartato puede modificarse por un residuo que presente una cadena lateral básica, polar no cargada, no polar, de ramificación 13 o aromática. Las mutaciones por sustitución que conservan la propiedad de carga del amioácido también pueden atenuar la actividad de exonucleasa 3' a 5', por ejemplo sustituyendo un residuo aspartato por un residuo glutamato.

Otro método de generación de ADN polimerasas termoestables o termoactivas mutantes es la realización de cambios en la polimerasa en una posición próxima a un residuo que es conocido o se sospecha que afecta a la actividad de exonucleasa 3' a 5' de la polimerasa. Por ejemplo, pueden insertarse, delecionarse o sustituirse uno o más residuos aminoácidos en posición contigua a un residuo crítico en el dominio de exonucleasa 3' a 5' de la polimerasa. Alternativamente, pueden insertarse, delecionarse o sustituirse uno o más residuos que no son contiguos a un residuo crítico en la secuencia primaria de la proteína pero que son contiguos al residuo crítico en la estructura terciaria de la polimerasa. Este método resulta particularmente favorable en el caso de que la mutación del residuo crítico mismo provoque una reducción mayor de la deseada de la actividad de exonucleasa 3' a 5' de la polimerasa, o provoque otros problemas, tales como el plegamiento incorrecto de la polimerasa.

A modo de alternativa a las técnicas de mutagénesis sitio-dirigida indicadas anteriormente, pueden utilizarse técnicas de mutagénesis más aleatorias para generar las ADN polimerasas termoestables o termoactivas mutantes de la invención. Por ejemplo, pueden introducirse mutaciones por inserción, deleción y/o sustitución en la ADN polimerasa Tma en cualquier posición, con independencia de los residuos críticos comentados anteriormente, o incluso de la estructura de dominios de la proteína. En una realización, las mutaciones se introducen aleatoriamente en todo el dominio de exonucleasa 3' a 5' de la ADN polimerasa Tma. En otra realización, las mutaciones se introducen aleatoriamente en la totalidad de la molécula de ADN polimerasa. Cada polimerasa mutagenizada seguidamente puede someterse a ensayo para la actividad de exonucleasa 3' a 5', tal como se indica en los ejemplos, y las polimerasas mutantes que presentan el nivel deseado de actividad de exonucleasa 3' a 5' seguidamente puede seleccionarse para su utilización.

Las ADN polimerasas termoestables o termoactivas mutantes según la invención también pueden prepararse mediante la introducción de más de una mutación en la ADN polimerasa Tma. Por ejemplo, pueden combinarse dos

o más mutaciones, cada una de las cuales por sí sola no reduce suficientemente la actividad de exonucleasa 3' a 5' de la polimerasa mutante, en una molécula de polimerasa, con el fin de reducir la actividad de exonucleasa 3' a 5' hasta un valor comprendido en el intervalo deseado. Alternativamente, puede combinarse una o más mutaciones que reducen preferentemente la actividad de exonucleasa 3 a 5' de la ADN polimerasa Tma sobre un sustrato de ADNmc en una molécula de polimerasa con una o más mutaciones que reducen preferentemente la actividad de exonucleasa 3' a 5' de la ADN polimerasa Tma sobre un sustrato de ADNbc.

Las ADN polimerasas termoestables o termoactivas mutantes según la invención también pueden prepararse mediante la deleción, inserción, sustitución o reorganización de una pluralidad de residuos contiguos, con la condición de que la ADN polimerasa mutante presente una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada.

No cada mutación de cada aminoácido de la ADN polimerasa Tma resultará en una ADN polimerasa termoestable o termoactiva mutante con el nivel deseado de actividad de exonucleasa 3' a 5'. Algunas mutaciones no reducirán la actividad de exonucleasa 3' a 5' en grado suficiente, mientras que otras la reducirán en exceso. Por ejemplo, las patentes US nº 6.015.668, nº 5.939.301 y nº 5.948.614 describen mutaciones de un asparato ligante de metal a un residuo alanina en el dominio de exonucleasa 3' a 5' de las ADN polimerasas Tma y Tne. Estas mutaciones reducen las actividades de exonucleasa 3' a 5' de estos enzimas hasta niveles inferiores a los detectables, y por lo tanto no se encuentran comprendidas en la presente invención. De manera similar, la patente US nº 5.882.904 describe una mutación aspartato a alanina análoga en Thermococcus barossi, y la patente US nº 5.489.523 enseña el doble mutante D141A E143A de las ADN polimerasas de Pyrococcus wosei. Las dos polimerasas mutantes presentan una actividad de exonucleasa 3' a 5' virtualmente indetectable. De esta manera, el experto en la materia apreciará que resulta necesario someter a ensayo cada ADN polimerasa termoestable o termoactiva mutante para determinar su actividad de exonucleasa 3' a 5'. Posteriormente se proporcionan métodos de ensayo de la actividad de exonucleasa 3' a 5'. Otros métodos son bien conocidos de la técnica. Ver, por ejemplo, Freemont et al., Proteins 1 :66, 1986; Derbyshire et al., EMBO J. 16:17, 1991, YDerbyshire et al., Methods in Enzymology 262:363-85, 1995.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una ADN polimerasa Tma mutante que presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada y que comprende una o más mutaciones que afectan a una o más propiedades de la ADN polimerasa Tma. Entre los ejemplos de dichas propiedades se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la capacidad de la ADN polimerasa Tma de discriminar entre los dNTP y los análogos o derivados de dNTP; ver, por ejemplo, las patentes US nº 5.939.292 y nº 5.614.365; la actividad de exonucleasa 3' a 5'; ver, por ejemplo, las patentes US nº 6.228.628, nº 5.466.591 y nº 5.420.029; la termoestabilidad y la estabilidad en frío; ver, por ejemplo, la patente US nº 6.214.557; la facilidad o el coste de fabricación, la procesividad, la tasa de polimerización, etc.

Se consiguen mutaciones en la secuencia de aminoácidos mediante la incorporación de mutaciones apropiadas en la secuencia génica codificante. Dichas mutaciones en la secuencia de ADN se llevan a cabo utilizando técnicas bien conocidas de la técnica, tal como se describe en mayor detalle posteriormente.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una ADN polimerasa termoestable o termoactiva que presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada que ha sido químicamente modificada. Ver, por ejemplo, la patente US nº 6.183.998. En una realización, la modificación química es una modificación post-traduccional. En otra realización, el residuo aminoácido modificado es uno que se identifica en la presente memoria como importante o crítico para la actividad de exonucleasa 3' a 5'. La modificación post-traduccional puede llevarse a cabo in vitro o in vivo. Entre los ejemplos de modificaciones post-traduccionales se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, el procesamiento por una proteasa y la fosforilación, glucosilación y acilación de residuos aminoácidos. Ver, por ejemplo, Molecular Biology of the Cell, (Alberts et al., editores), 3a edición, Garland Publishing, New York, 1994.

Cada uno de los tipos de mutación y modificación comentados anteriormente en referencia a la ADN polimerasa Tma pueden introducirse en otras ADN polimerasas termoestables o termoactivas con el fin de generar ADN polimerasas termoestables o termoactivas mutantes de la presente invención. Basándose en las alineaciones de las secuencias de aminoácidos, las ADN polimerasas se han clasificado en las familias A, B Y C según su homología con las ADN polimerasas 1, II Y III de E. coli. Ver, por ejemplo, Ito et al., Nucl. Acids Res. 19:4045-47. Las ADN polimerasas de especies de Thermotoga y de Thermus son miembros de las ADN polimerasas de la familia A, que también incluye la ADN polimerasa I de E. coli. Los aminoácidos que se encuentran conservados en las ADN polimerasas de la familia A han sido identificados. En la figura 8 (SEC ID nº 172-187) se muestra una alineación de una secuencia de aminoácidos de la región del dominio de exonucleasa 3' a 5' de la ADN polimerasa Tma con las secuencias de aminmoácidos dde las otras ADN polimerasas de la familia A Debido a la conservación de los aminoácidos entre las ADN polimerasas de la familia A, la identificación de los aminoácidos que afectan a la actividad de exonucleasa 3' a 5' en una ADN polimerasa, tal como la ADN polimerasa I de E. coli o la ADN polimerasa Tma, conjuntamente con las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria, permite la identificación de aminoácidos que afectan a la actividad de exonucleasa 3' a 5' en otras ADN polimerasas de la familia A basándose en una alineación de secuencias. Los motivos de secuencia conservados Exo 1, Exo 11, Exo Ila y Exo III se indican en la figura 8. De esta manera, en una realización, la presente invención proporciona una ADN polimerasa de la familia A termoestable o termoactiva mutante con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada. En otra realización, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada presenta una mutación en Exo 1, Exo 11, Exo Ila o Exo 111. En otra realización, la mutación se encuentra en Exo 1, Exo 110 Exo 111.

Se ha identificado un gran número de especies termofílicas que presentan ADN polimerasas con una actividad de exonucleasa 3' a 5' que pueden atenuarse según la presente invención. Entre las especies eubacterianas representativas se incluyen Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana; ver, por ejemplo, las patentes US nº 6.077.664, nº 6.015.668, nº 6.001.645 y nº 5.912.155; Termosipho africanus; ver, por ejemplo, la patente US nº 5.968.799; familia A Hot Spring.

Pueden identificarse aminoácidos y regiones correspondientes dentro de dichas ADN polimerasas mediante alineación de las secuencias de aminoácidos de las mismas. La correspondencia se refiere tanto a los aminoácidos que son idénticos (conservados) en las secuencias y a los aminoácidos que no son idénticos, pero que se han alineado para maximizar la similitud de secuencias global.

Utilizando dichas alineaciones, el experto en la materia podrá determinar qué residuos en una ADN polimerasa termoestable o termoactiva de la familia A corresponden al dominio de exonucleasa 3' a 5' o los residuos críticos comentados anteriormente de la ADN polimerasa Tma. De esta manera, en una realización, la invención proporciona una ADN polimerasa termoestable o termoactiva mutante que comprende una mutación en un residuo correspondiente al residuo L329 de Tma. En otra realización el residuo correspondiente al residuo L329 de Tma se encuentra mutado en alanina. En otra realización, la invención proporciona una ADN polimerasa termoestable o termoactiva mutante que comprende una mutación en un residuo correspondiente al residuo 0389 de Tma. En otra realización, el residuo correspondiente al residuo 0389 de Tma se encuentra mutado en glutamato. En otra realización, la invención proporciona una ADN polimerasa termoestable o termoactiva mutante que comprende una mutación en un residuo correspondiente al residuo 0384 de Tma. En otra realización el residuo correspondiente al residuo 0384 de Tma se encuentra mutado en alanina. En otra realización, la invención proporciona una ADN polimerasa termoestable o termoactiva mutante que comprende una mutación en un residuo correspondiente al residuo N385 de Tma. En otra realización, el residuo correspondiente al residuo N385 de Tma se encuentra mutado en alanina. En otra realización, la invención proporciona una ADN polimerasa termoestable o termoactiva mutante que comprende mutaciones en residuos correspondientes a los residuos 0384 y N385 de Tma. En otra realización, cada uno de los residuos correspondientes a los residuos 0384 y N385 de Tma se encuentran mutados en alanina.

Se han identificado especies adicionales de eubacterias termofílicas y se encuentran disponibles de depósitos tales como la American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) Y el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM, Macheroder Weg 1b, 0-38124, Braunschweig, Alemania). Tal como se comenta posteriormente, las ADN polimerasas y los genes codificantes de las mismas pueden recuperarse a partir de las cepas depositadas y secuenciarse de modo rutinario. Una alineación de secuencia rutinaria de la secuencia de aminoácidos de una ADN polimerasa de familia A de una eubacteria termofílica con la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa Tma utilizando, por ejemplo, el programa GAP (Accelrys, Madison, WI), permite la utilización de una secuencia de ADN polimerasa de eubacteria termofílica de una ADN polimerasa mutante de la presente invención.

En otro aspecto de la presente invención, una ADN polimerasa termoestable o termoactiva disponible comercialmente con actividad de exonucleasa 3' a 5' se utiliza para generar una ADN polimerasa termoestable o termoactiva mutante con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada. Entre los ejemplos de ADN polimerasa termoestables o termoactivas disponibles comercialmente que presentan una actividad de exonucleasa 3' a 5' sustancial se incluyen ADN polimerasas VENT R® and DEEP VENT R® (New England Biolabs, Beverly, MA) y ADN polimerasa Pfu (Stratagene, San Diego, CA).

En otro aspecto, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva mutante de la invención se deriva a partir de una ADN polimerasa que se encuentra naturalmente en un organismo mesofílico y que ha sido mutada o manipulada para foramr un enzima termoestable o termoactivo. Ver, por ejemplo, Sánchez-Ruíz et al., Trends Biotechnol. 19:132-35, 2001; Fontana, Curro Opino Biotechnol. 2:551-60, 1991; Nosoh et al., Trends Biotechnol. 8-16-20, 1990; Pace, Trends Biotechnol. 8:93-98, 1990, y Peters, Science 281 :368-69, 1998. En una realización, la polimerasa es una ADN polimerasa de la familia A. En otra realización, el organismo mesofílico es una eubacteria mesofílica. En otra realización, la eubacteria mesofílica es E. coli. Ver Villbrandt et al., Protein Eng. 9:645-54, 2000.

2. Proteínas quiméricas de la invención

En otro aspecto, la invención proporciona una ADN polimerasa termoestable o termoactiva quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, comprendiendo dicha polimerasa una porción aminoterminal y una porción carboxiterminal, derivándose la porción aminoterminal de la porción aminoterminal de una primera ADN polimerasa y derivándose la porción carboxiterminal de una segunda ADN polimerasa. En una realización, dicha ADN polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada comprende una porción aminoterminal derivada de la porción aminoterminal de una primera ADN polimerasa termoestable o termoactiva y una porción carboxiterminal derivada de una segunda ADN polimerasa termoestable o termoactiva, siendo dicha segunda polimerasa una que muestra una actividad de exonucleasa 3' a 5'. En otra realización, en dicha ADN polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, dicha porción aminoterminal y/o carboxiterminal se deriva de una ADN polimerasa de una especie de Thermus. En otra realización, en dicha ADN polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, dicha porción aminoterminal y/o carboxiterminal se deriva de una ADN polimerasa de una especie de Thermotoga. En otra realización, en dicha ADN polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5', la porción aminoterminal y/o carboxiterminal u otra porción se deriva de una ADN polimerasa de una especie de Thermus y la otra porción terminal u otra porción se deriva de una ADN polimerasa de una especie de Thermotoga; por ejemplo, en una realización, la porción aminoterminal se deriva de una ADN polimerasa de una especie de Thermus y la porción carboxiterminal se deriva de una ADN polimerasa de una especie de Thermotoga. En otra realización, en dicha ADN polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, la porción aminoterminal se deriva de una especie de Thermus y comprende un dominio de exonucleasa 5' a 3' y la porción carboxiterminal se deriva de una especie de Thermotoga y comprende un dominio de exonucleasa 3' a 5' y un dominio de polimerasa. En otra realización, en dicha ADN polimerasa con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, la porción aminoterminal se deriva de una especie de Thermus y comprende un dominio de exonucleasa 5' a 3' y presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80% respecto a una porción aminoterminal correspondiente de la ADN polimerasa de la especie de Thermus, y dicha porción carboxiterminal presenta una identidad de secuencia superior a aproximadamente 80% respecto de la porción carboxiterminal correspondiente de la ADN polimerasa de la especie de Thermotoga. En otra realización, dicha especie de Thermus es Thermus sp. Z05 y dicha especie de Thermotoga es Thermotoga maritima. En otra realización, la AON polimerasa termoestable o termoactiva quimérica comprende la secuencia de aminoácidos de la figura 4 (SEC ID nº 130) modificada por una o más de las mutaciones indicadas en la figura. En otra realización, la AON polimerasa termoestable o termoactiva quimérica comprende la secuencia de aminoácidos de la figura 5 (SEC ID nº 130) modificada por una o más de las mutaciones indicadas en la figura. En otra realización, la AON polimerasa termoestable o termoactiva quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada comprende una porción aminoterminal, una porción intermedia y una porción carboxiterminal. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, la porción aminoterminal comprende un dominio de exonucleasa 5' a 3'. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, la porción intermedia comprende un dominio de exonucleasa 3' a 5'. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, la porción carboxiterminal comprende un dominio de polimerasa. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, la porción carboxiterminal y la porción aminoterminal se derivan de una polimerasa de una especie de Thermus. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, el extremo aminoterminal y/o carboxiterminal presenta una identidad de secuencia superior a 80% respecto de una porción aminoterminal y/o carboxiterminal correspondiente de una polimerasa de una especie de Thermus. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, la porción intermedia se deriva de una polimerasa de una especie de Thermotoga. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, la porción intermedia presenta una identidad de secuencia superior al 80%, aunque inferior al 100%, respecto de la polimerasa correspondiente de una especie de Thermotoga. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, una porción ami no y una porción carboxi se derivan de una polimerasa de una especie de Thermus y una porción intermedia se deriva de una especie de Thermotoga. En otra realización, en dicha AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, la especie de Thermus es Thermus sp. Z05 y la especie de Thermotoga es Thermotoga maritima. En otra realización, la AON polimerasa termoestable o termoactiva quimérica comprende la secuencia de aminoácidos de la figura 6 (SEC ID nº 130) modificada por una o más de las mutaciones indicadas en la figura. En otra realización, la AON polimerasa termoestable o termoactiva quimérica comprende la secuencia de aminoácidos de la figura 7 (SEC ID nº 130) modificada por una o más de las mutaciones indicadas en la figura.

En otro aspecto, la AON polimerasa quimérica con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada comprende secuencias de dos o más AON polimerasas termoestables o termoactivas. En una realización, la polimerasa quimérica comprende en su extremo N-terminal un dominio de exonucleasa 5' a 3' derivado de una AON polimerasa de una primera especie y en su extremo C-terminal un dominio de AON polimerasa y un dominio de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa de una segunda especie. En otra realización, la primera especie y la segunda especie son especies bacterianas. En otra realización, la primera especie y la segunda especie son especies termofílicas. En otra realización, la primera especie es una especie de Thermus. En otra realización, la especie de Thermus es Thermus aquaticus (Taq). En otra realización, la especie de Thermus es Thermus flavus (Tfl). En otra realización, la especie de Thermus es Thermus thermophilus (Tth). En otra realización, la especie de Thermus es Thermus especie Z05 (TZ05). En otra realización, la especie de Thermus es Thermus especie 17 (Tsps17). En otra realización, la especie de Thermus es Thermus flavus (Tfl). En otra realización, la segunda especie es una especie de Thermotoga. En otra realización, la especie de Thermotoga es Thermotoga maritima (Tma). En otra realización, la primera especie es TZ05 y la segunda especie es Tma.

En otro aspecto de la presente invención, la AON polimerasa termoestable o termoactiva quimérica con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada comprende secuencias de una AON polimerasa termoestable o termoactiva y de otra proteína, en la que las secuencias de la otra proteína proporcionan una propiedad beneficiosa a la proteína quimérica. En una realización, la propiedad beneficiosa afecta a la expresión, purificación, estabilidad, vida media, susceptibilidad frente a las proteasas, modificación post-traduccional, actividad enzimática o termoestabilidad de la proteína quimérica.

Las AON polimerasas de las especies del género Thermus y la AON polimerasa Tma son similares en su estructura global. En dichas AON polimerasas, las actividades de 5'-nucleasa y de AON polimerasa de estos enzimas se encuentran presentes en regiones discretas de la proteína (los dominios de actividad). Los dominios de actividad aproximados de una AON polimerasa de especie de Thermus representativa, la AON polimerasa Taq, y la AON polimerasa Tma, se muestran en la Tabla 1. Ver también la patente US nº 5.420.019. La diferencia de longitud entre lar egión que codifica la actividad de exonucleasa 3' a 5' en la AON polimerasa Tma y la región correspondiente en la AON polimerasa Taq contribuye o corresponde a la falta de actividad de exonucleasas 3' a 5' en la AON polimerasa Taq.

Tabla 1 Dominios de actividad (posiciones de aminoácidos aproximadas)

exo 5' a

ADN polimerasa Taq 1-289 exo 3' a 5' de polimerasa

3'

423-832

ADN polimerasa Taq 1-291 292-484 485-893

Existe una similitud significativa entre las secuencias de aminoácidos de las ADN polimerasas de la especie de Thermus y de la ADN polimerasa Tma. Por ejemplo, una comparación entre las secuencias de aminoácidos de una ADN polimerasa de una especie de Thermus representativa, la ADN polimerasa Taq, y la ADN polimerasa Tma utilizando el programa informático GAP (Accelrys, Madison, WI) con los valores por defecto de los parámetros, indica que las secuencias de aminoácidos son aproximadamente 44% idénticas y 66% similares a lo largo de la totalidad de las secuencias de aminoácidos.

Debido a la similitud estructural global y de secuencias de las ADN polimerasas Tma y de una especie de Thermus, puede construirse un enzima quimérico Tma/Thermus que conserva la estructura global y los dominios de actividad presentes en las ADN polimerasa Tma. En una realización, el enzima quimerico comprende la región C-terminal de la ADN polimerasa Tma y la región N-terminal de una ADN polimerasa de una especie de Thermus. En otra realización, el enzima quimérico de la presente invención corresponde a una ADN polimerasa Tma mutada, en la que el dominio de exonucleasa 5' a 3' ha sido sustituido por el dominio correspondiente de una ADN polimerasa de una especie de Thermus. La expresión "dominio correspondiente" se define en la presente memoria como una alineación de secuencias de aminoácidos tal como se proporciona en la patente US nº 6.228.628.

En otro aspecto de la invención, el primer aminoácido de la región de la ADN polimerasa Tma se inicia con el aminoácido siguiente al aminoácido que correspondiente al último aminoácido de la secuencia de la ADN polimerasa de la especie de Thermus, y contiene el resto (hasta el aminoácido 893) de la secuencia de la ADN polimerasa Tma. La secuencia de aminoácidos de una ADN polimerasa Tma completa se proporciona en la figura 1A (SEC ID nº 85). Preferentemente, la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa de la especie de Thermus se une a una secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa Tma en un punto en el que las dos secuencias de aminoácidos son idénticas o similares. Por ejemplo, una realización consiste de los aminoácidos 1 a 190 de la ADN polimerasa Taq y los aminoácidos 191 a 893 de la ADN polimerasa Tma. El aminoácido 190 de la ADN polimerasa Tma corresponde al aminoácido 190 de la ADN polimerasa Taq, y la porción de ADN polimerasa Tma del enzima quimérico se inicia con el siguiente aminoácido, el aminoácido 191.

En las regiones en las que las dos ADN polimerasas son idénticas, la identificación del último aminoácido de la ADN polimerasa de la especie de Thermus es arbitraria dentro de la región. Por ejemplo, debido a que los aminoácidos 191 Y 192 son idénticos en la ADN polimerasa Taq y en la ADN polimerasa Tma (y se encuentran conservadas en las ADN polimerasa de las especies de Thermus) , una proteína quimérica que contenga los aminoácidos 1 a 190 de la ADN polimerasa Taq será indistinguible de las proteínas quiméricas que contengan los aminoácidos 1 a 191 ó 1 a 192 de la ADN polimerasa Taq. Se hace referencia a la realización de la invención descrita en los ejemplos como conteniendo los aminoácidos 1 a 190 de la ADN polimerasa Taq, en vista de la derivación original del enzima.

En un aspecto de la presente invención, la ADN polimerasa quimérica se encuentra codificada por un gen quimérico en el que la región codificante de la secuencia de la ADN polimerasa Tma hasta por lo menos el sitio de unión ribosómica alternativo presente en aproximadamente los codones 133 a 137 en el gen de longitud completa de la ADN polimerasa Tma, y preferentemente hasta el codón de inicio 140 de metionina, se sustituyeN por una secuencia génica codificante de la región correspondiente de una ADN polimerasa de una especie de Thermus. La presencia en el gen de la ADN polimerasa Tma de longitud completa de dicho sitio de unión ribosómica alternativo y el codón de inicio resulta en la expresión preferente de una ADN polimerasa Tma truncada que se inicia con el aminoácido

140. Tal como se indica posteriormente, la sustitución de esta región del gen de la ADN polimerasa Tma resulta útil para la expresión eficiente de la proteína quimérica de longitud completa. De esta manera, en una realización de la ADN polimerasa quimérica de la invención, la región N-terminal de una ADN polimerasa de una especie de Thermus sustituye una región de la ADN polimerasa Tma que comprende por lo menos hasta el aminoácido 137, y preferentemente hasta el aminoácido 140.

La región de cada ADN polimerasa de especie de Thermus que corresponde a los aminoácidos 1 a 137 de la ADN polimerasa Tma se obtiene a partir de una alineación de secuencias de aminoácidos tal como se proporciona en la patente US nº 6.228.628. Por ejemplo, la región de la ADN polimerasa Taq que corresponde a los aminoácidos 1 a 137 de la ADN polimerasa Tma está formado por los aminoácidos 1 a 142, y el aminoácido de la ADN polimerasa Taq que corresponde a M140 de la ADN polimerasa Tma es L 145. De esta manera, las realizaciones en las que la región N-terminal procede de la ADN polimerasa Taq comprenden por lo menos los aminoácidos 1 a 142, y preferentemente los aminoácidos 1 a 145, de la ADN polimerasa Taq. De manera similar, para las realizaciones en las que la región N-terminal procede de otra ADN polimerasa de una especie de Thermus, la región de la ADN polimerasa de una especie de Thermus que corresponde a los aminoácidos 1 a 137 y 140 de la ADN polimerasa

1 O

Tma se obtiene a partir de la alineación de secuencias proporcionada en la patente US nº 6.228.628.

El experto en la materia reconocerá que pueden introducirse mutaciones, adiciones o deleciones menores en una ADN polimerasa, que no alteran las propiedades funcionales del enzima, y que dicho enzima mutado resulta equivalente, a todos los efectos, al enzima no mutado. Por ejemplo, es conocido que una deleción en la ADN polimerasa Taq de varios aminoácidos N-terminales no altera las propiedades funcionales del enzima. De manera similar, es conocido que las mutaciones por sustitución en muchas de las posiciones de aminoácido aparentemente no presentan esencialmente ningún efecto. A los efectos de la presente invención, las ADN polimerasas que contienen mutaciones menores que no alteran las propiedades funcionales del enzima se consideran equivalentes a la ADN polimerasa no mutada.

3. Mezclas de ADN polimerasas termoestables o termoactivas

En otro aspecto, la presente invención proporciona una mezcla que comprende una pluralidad de ADN polimerasa termoestables o termoactivas, en la que por lo menos una de las polimerasas presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, tal como se ha indicado anteriormente. En una realización, por lo menos una de las polimerasas presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' esencialmente inactivada.

En un aspecto, la mezcla presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' de aproximadamente 6,5 ó inferior, aunque superior a 0, U/pmol, medida utilizando el ensayo estándar indicado en el Ejemplo 3, posteriormente. En una realización, la mezcla presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' comprendida entre aproximadamente 0,4 y 3,0 unidades/pmol. En otra realización, la mezcla presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5' comprendida entre aproximadamente 0,4 y 1,6 unidades/pmol.

En otro aspecto, la mezcla presenta una proporción de actividad de ADN polimerasa 5' a 3' dependiente del molde a actividad de exonucleasa 3' a 5' comprendida entre aproximadamente 1 y 100, en la que la actividad de polimerasa se mide utilizando el ensayo de polimerasa indicado posteriormente, en el Ejemplo 3, y la actividad de exonucleasa 3' a 5' se mide utilizando el ensayo estándar indicado en el Ejemplo 3, posteriormente. En una realización, la mezcla presenta una proporción de actividad de ADN polimerasa 5' a 3' dependiente del molde a actividad de exonucleasa 3' a 5' comprendida entre aproximadamente 3,0 y 50. En otra realización, la mezcla presenta una proporción de actividad de ADN polimerasa 5' a 3' dependiente del molde a actividad de exonucleasa 3' a 5' comprendida entre aproximadamente 6,0 y 25,0.

4. Ventajas de la ADN polimerasa de la invención

La ADN polimerasa termoestable o termoactiva mutante de la invención representa una mejora significativa respecto a las ADN polimerasas termoestables o termoactivas descritas en la literatura. En particular, la ADN polimerasa de la invención proporciona la combinación de propiedades siguiente:

(1): degradación reducida de los cebadores en comparación con la ADN polimerasa termoestable o termoactiva de tipo salvaje,

(2): utilización más eficiente de los dNTP, reducción de la improductivas reacción "inactivas", en comparación con las ADN polimerasas termoestables o termoactivas de tipo salvaje,

(3): fidelidad de replicación incrementada en comparación con las ADN polimerasas termoestables o termoactivas mutantes sin una actividad de exonucleasa 3' a 5',

(4): menores manipulación y coste en comparación con mezclas de ADN polimerasas termoestables o termoactivas,

(5): la ADN polimerasa puede expresarse fácil y eficientemente a nivel elevado en un sistema de expresión recombinante, facilitando de esta manera la producción comercial del enzima, y

(6): las ADN polimerasas de la invención incorporan fácilmente análogos de nucleósido trifosfato, en contraste con las ADN polimerasas correctoras de errores termoestables de arqueobacterias.

La combinación de las propiedades que presenta la ADN polimerasa de la invención resulta particularmente útil en la PCR, y proporciona resultados significativamente mejoradas.

(1) Degradación reducida de los cebadores

En las aplicaciones in vitro con una ADN polimerasa termoestable o termoactiva con una actividad robusta de exonucleasa 3' a 5' de ADNmc, la polimerasa degrada los cebadores. Esto afecta a la reacción de dos maneras. En primer lugar, reduce la concentración de cebadores en la reacción. En segundo lugar, crea cebadores parcialmente degradados de diversas longitudes. Debido a que la especificidad de un cebador para su diana la especifica directamente la secuencia y longitud del cebador, los cebadores acortados pueden presentar una menor especificidad para sus secuencias diana particulares. Esto puede provocar simultáneamente una reducción de la replicación de la secuencia deseada y un incremento de la replicación de secuencias espurias o no deseadas. Con el calentamiento para provocar la separación de las cadenas de ADN y la desnaturalización del dúplex, la presencia de la actividad de exonucleasa 3' a 5' de ADNmc también puede provocar una reducción de la longitud de los extremos de las cadenas sintetizadas, que en rondas posteriores de polimerización actuarán como moldes. Debido a que los cebadores se unen a dichos extremos, una reducción de su longitud reduce la fuerza de su unión a los cebadores. Esto también puede provocar una reducción de la cantidad del producto de PCR deseado y un incremento de la cantidad de productos de PCR espurios. Estos efectos resultan particularmente problemáticos para la PCR, en la que una reducción de la proporción de secuencia diana amplificada a secuencias espurias amplificadas puede reducir la especificidad de la reacción y, de esta manera, reducir la sensibilidad de la detección de la diana.

Las ADN polimerasas termoestables o termoactivas de la presente invención superan dicho problema al presentar un nivel atenuado de actividad de exonucleasa 3' a 5'.

(2) Reducción de las reacciones inactivas

La actividad de exonucleasa de ADNbc de las ADN polimerasas termoestables o termoactivas puede provocar que la polimerasa "se inactive" al alcanzar el final de un molde lineal. Es decir, pasa por ciclos repetidos de polimerización hasta el extremo del molde, hidrolizando después los residuos en el extremo recién completado de la cadena sintetizada. Este ciclo de polimerización e hidrólisis reduce la concentración de dNTP e incrementa la concentración de pirofosfato en la mezcla de reacción, reduciendo la eficiencia de reacción de los ciclos posteriores. En consecuencia, el rendimiento de producto puede reducirse.

Las ADN polimerasas termoestables o termoactivas de la presente invención superan dicho problema al presentar un nivel atenuado de actividad de exonucleasa 3' a 5'. En una realización, las polimerasas mutantes de la invención presentan una actividad de exonucleasa 3' a 5' que es de entre aproximadamente 0,1% Y aproximadamente 65% de la actividad del enzima de tipo salvaje, medida utilizando el sustrato de ADN de cadena sencilla y el ensayo estándar del Ejemplo 3. En otra realización, las polimerasas mutantes de la invención presentan una actividad de exonucleasa 3' a 5' que es de entre aproximadamente 1% y aproximadamente 30% de la actividad del enzima de tipo salvaje. En otra realización, las polimerasas mutantes de la invención presentan una actividad de exonucleasa 3' a 5' que es de entre aproximadamente 3% y aproximadamente 20% de la actividad del enzima de tipo salvaje. En otra realización, las polimerasas mutantes de la invención presentan una actividad de exonucleasa 3' a 5' que es de entre aproximadamente 3% y aproximadamente 10% de la actividad del enzima de tipo salvaje. En otra realización, las polimerasas mutantes de la invención presentan una actividad de exonucleasa 3' a 5' que es de entre aproximadamente 3% y aproximadamente 5% de la actividad del enzima de tipo salvaje.

(3) Elevado nivel de fidelidad

Los intentos anteriores para superar los efectos deletéreos de la actividad de la exonucleasa 3' a 5' de las ADN polimerasa termoestables o termoactivas han utilizado polimerasas mutantes con una actividad de exonucleasa 3' a 5' nula o esencialmetne nula, o polimerasas que no presentan naturalmente esta actividad. Este enfoque puede generar sus propios problemas. Las polimerasas sin actividad de exonucleasa 3' a 5' presentan una tasa de errores más alta que las polimerasa que sí presentan esta actividad. Para determinadas aplicaciones de PCR, por ejemplo, en las que debe clonarse la secuencia amplificada, resulta importante que la tasa de errores se mantenga baja. Además, la presencia de una actividad de exonucleasa 3' a 5' incrementa la eficiencia de la amplificación y/o de la transcriptasa inversa para las dianas más largas debido a que puede corregirse la incorporación errónea de nucleótidos. De esta manera, las ADN polimerasa termoestables o termoactivas que no presentan actividad correctora de errores en absoluto resultan menos adecuadas para dichas aplicaciones.

La presente invención supera dicho problema al proporcionar ADN polimerasas termoestables o termoactivas aisladas que presentan una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada. Ahora se ha determinado que un nivel atenuado de actividad 3' a 5' resulta suficiente para incrementar la eficiencia de la PCR de moldes más largos mediante la eliminación eficiente de los dNTP insertados erróneamente y facilita de esta manera unas PCR y RTPCR más largas.

(4) Manipulación reducida

Otro enfoque que se ha utilizado para superar los problemas asociados a una actividad robusta de exonucleasa 3' a 5' es mezclar una polimerasa con un nivel de tipo salvaje de actividad correctora de errores con una polimerasa que esencialmente no presenta actividad correctora de errores. Puede conseguirse la proporción deseada de actividad correctora de errores a actividad de polimerasa mediante la manipulación de la proporción entre dichas dos polimerasas en la mezcla. Aunque este enfoque ha sido utilizado con éxito, presenta desventajas. Las actividades de exonucleasa 3' a 5' y de polimerasa de ambos enzimas debe medirse con exactitud para cada preparación de cada enzima, y después debe calcularse la cantidad de cada enzima. A continuación, para cada reacción, debe añadirse la cantidad correcta de cada enzima. Este enfoque también requiere que ambos enzimas presenten una estabilidad de almacenamiento comparable. De esta manera, las reacciones que utilizan mezclas de enzimas requieren más manipulaciones, lo que incrementa los costes y reduce la eficiencia.

Las ADN polimerasas termoestables o termoactivas de la presente invención superan dichos problemas al proporcionar, en una realización, una sola polimerasa que presenta la proporción deseada de actividad correctora de errores a actividad de polimerasa. Únicamente resulta necesario añadir un solo enzima a cada reacción. Inesperadamente, también se ha descubierto que resulta necesario menos de enzima total al utilizar las polimeraas de la invención en lugar de una mezcla de enzimas.

(5) Eficiencia de expresión

Tal como se ha indicado anteriormente, en un aspecto la presente invención proporciona un enzima quimérico que corresponde a una ADN polimerasa Tma mutada, en la que el dominio de nucleasa 5' ha sido sustituido por el dominio correspondiente de una ADN polimerasa de una especie de Thermus. El enzima se expresa a partir de un gen quimérico que corresponde a un gen de ADN polimerasa Tma mutada, en el que la región del gen que codifica el dominio de nucleasa 5' ha sido sustituido por la región correspondiente del gen de ADN polimerasa de una especie de Thermus. Una ventaja significativa del gen quimérico es que permite la expresión de una ADN polimerasa de longitud completa en un sistema de expresión recombinante de manera mucho más eficiente de lo que resulta posible con el gen de ADN polimerasa Tma.

La expresión de una ADN polimerasa de longitud completa a partir de un sistema de expresión recombinante que contiene la secuencia génica de la ADN polimerasa Tma natural de longitud completa resulta problemática debido a la expresión preferente de una forma truncada de la proteína. Ver la patente US nº 5.420.029. La proteína truncada, denomianda Met 140 Tma, consiste de los aminoácidos 140 a 893 de la proteína de longitud completa y aparentemente resulta de la traducción inciada en la metionina de la posición 140. La presencia de un sitio de unión ribosómica putativo en los codones 133 a 137 sugiere además que la proteína truncada resulta de la traducción iniciada en la metionina interna. La expresión preferente de la proteína truncada Met140Tma representa una dificultad significativa en la expresión y pruficación de ADN polimerasa Tma de longitud completa.

En una realización de la presente invención, el gen de la ADN polimerasa quimérica contiene una secuencia génica de ADN polimerasa de una espeice de Thermus en una región correspondiente por lo menos a una región hasta el sitio de unión ribosómica alternativo presente en aproximadamente los codones 133 a 137 del gen de la ADN polimerasa Tma de longitud completa, y preferentemente hasta el codón de inicio interno, el codón 140. De esta manera, la secuencia génica de la ADN polimerasa Tma hasta la región que contiene el sitio de unión ribosómica y, preferentemente, el codón de inicio responsable de la traducción de Met140 Tma, se sustituye por la región correspondiente de un gen de ADN polimerasa de una especie de Thermus. La región correspondiente de un gen de la ADN polimerasa de una especie de Thermus no proporciona el inicio interno no deseable de una proteína truncada. En consecuencia, un sistema de expresión recombinante que contenga el gen de ADN polimerasa quimérica expresa exclusivamente una ADN polimerasa quimérica de longitud completa.

(6) Incorporación de análogos de nucleósido trifosfato

En otro aspecto, las ADN polimerasa correctoras termoestables o termoactivas de la presente invención toleran e incorporan fácilmente análogos de nucleósido trifosfato, tales como dUTP y dITP, en contraste con las ADN polimerasas correctoras termoestables de arqueobacterias (por ejemplo VENT™, DEEPVENT™, Pfu, Pwo, Poc, Pab, Tgo, etc.). Es decir, dichas polimerasas no resultan inhibidas por la presencia de dUTP o dlTP o por la presencia de dUMP o dlMP en una cadena molde. En contraste, las ADN polimerasas correctoras termoestables de arqueobacteria anteriormente indicadas o las mezclas de ADN polimerasas que contienen una ADN polimerasa correctora de arqueobacteria, resultan inhibidas por la presencia de dUTP o dlTP o por la prseencia de dUMP o dlMP en una cadena molde. Por consiguiente, los muchos beneficios de utilizar dUTP conjuntamente o en sustitución de dTTP, o de utilizar dlTP conjuntamente o en sustitución de dGTP, pueden hacerse realidad con los enzimas de la presente invención, pero no con la ADN polimerasa termoestables de arqueobacterias. Ver, por ejemplo, PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Innis et al. (eds), Academic Press, San Diego, páginas 4, 5, 142 Y 143, 1999. De esta manera, aunque las ADN polimerasas de arqueobacterias anteriormente indicadas o mezclas que contienen una ADN polimerasa de arqueobacteria no pueden llevar a cabo la extensión de cebadores o las amplificaciones de PCR con dUTP o dITP, en una realización las ADN polimerasa termoestables y termoactivas de la presente invención son compatibles con la utilización de dichos análogos.

5. Preparación de la ADN polimerasa de la invención

El gen codificante de la ADN polimerasa Tma se describe en las patentes US nº 5.420.029 y nº 5.466.591. La secuencia de nucleótidos del gen de la ADN polimerasa Tma, así como la secuencia de aminoácidos completa de la proteína codificada, se describen en las mismas. El Ejemplo 5 de la patente US nº 5.420.029 describe la construcción de una diversidad de plásmidos que contienen el gen de la ADN polimerasa Tma de longitud completa, partiendo de los plásmidos pTma01 (ATCC nº 68471, depositado el 7 de noviembre de 1990, y redepositado como ATCC nº 98764 el 22 de mayo de 1998) y pTma04 (ATCC nº 68472, depositado el 7 de noviembre de 1990 y redepositado como ATCC nº 98765 el22 de mayo de 1998), tales como pTma12-1 y pTma13. Cualquiera de dichos vectores de expresión resulta adecuado como fuente del gen de la ADN polimerasa Tma.

Entre otras ADN polimerasas termoestables o termoactivas con actividad de exonucleasa 3' a 5' que pueden mutarse para preparar las polimerasas de la invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, aquéllas descritas en las patentes US nº 6.077.664, nº 6.015.668, nº 6.001.645 y nº 5.912.155 (Thermotoga neapolitana); patentes US nº 6.066.483, nº 5.874.282, nº 5.834.253, nº 5.747.298, nº 6.013.451 y nº 5.830.714, nº 5.882.904 y nº 5.602.011 (Thermococcus baross/); patentes US nº 5.322.785 y nº 5.210.036 (Thermococcus litoralis); patentes US nº

5.948.663 y nº 5.866.395; Dabrowski et al., Protein Expr. Purif. 14:131-38, 1998 (Pyrococcus furiosus); ver, por ejemplo, la patente US nº 5.834.285 (Pyrococcus sp. GB-D) y Dabrowski (1998) (Pyrococcus woesel).

En un aspecto, la ADN polimerasa de la invención es un enzima quimérico que comprende una porción derivada de una ADN polimerasa de una especie de Thermus y una porción derivada de una ADN polimerasa Tma. En una realización, la ADN polimerasa de la invención es un enzima quimérico que consiste de una porción derivada de una ADN polimerasa de una especie de Thermus y una porción derivada de una ADN polimerasa Tma. El enzima quimérico se prepara a partir de un gen quimérico, es decir, un ADN que codifica el enzima quimérico, y consiste de una porción derivada del gen de la ADN polimerasa de una especie de Thermus y una porción derivada del gen de la ADN polimerasa Tma. El gen quimérico se produce a partir del gen de la ADN polimerasa de una especie de Thermus y el gen de la ADN polimerasa Tma utilizando técnicas estándares de manipulación genética bien conocidas del campo de la biología molecular, tal como se describe en mayor detalle posteriormente.

Los genes codificantes de las ADN polimerasas de varias especies de Thermus, incluyendo la secuencia de nucleótidos del gen de la ADN polimerasa y la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada, han sido descritos. Algunos de dichos genes pueden obtenerse de plásmidos disponibles públicamente. Los genes de especies adicionales de Thermus pueden obtenerse de organismos huésped utilizando métodos descritos en las patentes US nº 5.079.352, nº 5.618.711, nº 5.455.170, nº 5.405.774 y nº 5.466.591.

El gen codificante de la ADN polimerasa Taq se describe en las patentes US nº 5.079.352 y nº 5.466.591. La secuencia de nucleótidos del gen de la ADN polimerasa Taq, así como la secuencia de aminoácidos completa de la proteína codificada, se describen en las mismas. Los Ejemplos V-VII de la patente US nº 5.079.352 describen la construcción de una diversidad de plásmidos que contienen el gen de la ADN polimerasa Taq de longitud completa, partiendo de los plásmidos pFC83 (ATCC nº 67422, depositado el 29 de mayo de 1987, y redepositado como ATCC nº 98763 el 22 de mayo de 1998) y pFC85 (ATCC nº 67421, depositado el 29 de mayo de 1987 y redepositado como ATCC nº 98762 el 22 de mayo de 1998), tales como pLSG1, pLSG2, pSYC1578, pLSG5 Y pLSG6. Cualquiera de dichos vectores de expresión resulta adecuado como fuente del gen de la ADN polimerasa Taq.

El gen codificante de la ADN polimerasa Tth, los métodos para obtener el gen y los plásmidos de expresión que contiene el gen se describen en las patentes US nº 5.618.711 Ynº 5.466.591.

El gen codificante de la ADN polimerasa TZ05, los métodos para obtener el gen y los plásmidos de expresión que contiene el gen se describen en las patentes US nº 5.455.170 y nº 5.466.591.

El gen codificante de la ADN polimerasa Tsps17, los métodos para obtener el gen y los plásmidos de expresión que contiene el gen se describen en las patentes US nº 5.405.774 y nº 5.466.591.

El gen de la ADN polimerasa Tfl se describe en Akhmetzjanov et al., Nucleic Acids Research 20:5839, 1992.

El gen de la ADN polimerasa Tfi puede recuperarse a partir de ATCC nº 43280 utilizando los métodos escritos en las patentes anteriormente referenciadas. Ver también FEMS Microbiol. Lett. 22:149-53, 1984.

El gen de la ADN polimerasa Tca se describe en Kwon, Mol. Ce lis 7: 264-71, 1997; Yla secuencia de nucleótidos se encuentra disponible bajo el número de acceso EMBL/GenBank U62584.

Pueden recuperarse genes adicionales de ADN polimerasa de especies de Thermus utilizando técnicas descritas en las patentes anteriormente indicadas, a partir de los depósitos de la ATCC siguientes: ATCC nº 43814 y nº 43815. Ver Alfredsson, Appl. Environ. Microbiol. 52:1313-16, 1986; ATCC nº 27978, ver Ramaley, J. Bacteriol. 114:556-62, 1970; ibid. 103:527-528, 1973; ATCC nº 31674, ver las patentes US nº 4.442.214 y nº 4.480.036; ATCC nº 35948 (T. ruber, ver Loginova, Int. J. Syst. Bacteriol. 34:498-99, 1984).

1 O

Pueden recuperarse especies adicionales de Thermus utilizando técnicas descritas en las patentes anteriormente indicadas a partir de los depósitos de la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) siguientes: DSM:1279 (NUM: 2244), ver Loginova et al., Izv. Akad. Nauk SSSR Ser. Biol.: 304-07,1975; DSM:579; DSM:625 (NUM: 2248), ver Degryse et al., Arch. Microbiol. 189:196, 1978; DSM:1279 (NUM: 3844), ver Loginova et al., Int. J. Syst. Bacteriol.; 498-99, 1984; Y DSM:625 (NUM: 1002), ver Brock et al., J. Bacteriol.: 289-97, 1969.

Entre las especies adicionales de Thermus que han sido descritas se incluyen T. oshimai, ver Williams et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 46:403-08, 1996; T. silvanus y T. chliarophilus, ver Tenreiro et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 45:633-39, 1995; T. scotoductus, ver Tenreiro et al., Res. Microbiol. 146:315-24, 1995; y T. ruber, Ver Shadrina et al., Mikrobiologiia 51 :611-15, 1982.

Siguiendo las directrices proporcionadas en la presente memoria, y utilizando únicamente técnicas bien conocidas, el experto en la materia podrá preparar a partir de los genes de ADN polimerasa cualquier número de vectores de expresión que contengan un gen quimérico adecuado para expresar una ADN polimerasa quimérica de la invención en cualquiera de entre una diversidad de sistemas huésped.

En un aspecto, el enzima quimérico de la invención comprende los aminoácidos 1 a 291 de la ADN polimerasa Z05 y los aminoácidos 292 a 893 de la ADN polimerasa Tma adecuadamente mutados para reducir la actividad de exonucleasa 3' a 5' asociada. En una realización, el enzima quimérico de la invención consiste de los aminoácidos 1 a 291 de la ADN polimerasa Z05 y de los aminoácidos 292 a 893 de la ADN polimerasa Tma adecuadamente mutados para reducir la actividad de exonucleasa 3' a 5' asociada. Estas realizaciones pueden construirse directamente a partir de los genes de la ADN polimerasa Z05 y de la ADN polimerasa Tma, obtenidos a partir de los plásmidos depositados que se han indicado anteriormente, o recuperarse a partir de los organismos húesped.

Debido a la redundancia del código genético, típicamente un gran número de secuencias de ADN codifica cualquier secuencia dada de aminoácidos y son, en este sentido, equivalentes. Tal como se indica posteriormente, puede resultar deseable seleccionar una u otra secuencia de ADN equivalente para la utilización en un vector de expresión según el uso preferente de los codones de la célula huésped en la que se insertará el vector de expresión. La presente invención pretende comprender todas las secuencias de ADN que codifican el enzima quimérico. De esta manera, los genes quiméricos de la presente invención no se encuentran limitados a contener únicamente secuencias de genes de ADN polimerasa de una especie de Thermus de tipo salvaje y de Tma, sino que pueden contneer cualesquiera de las secuencias de ADN que codifican una ADN polimerasa quimérica de la presente invención.

La producción del enzima de la invención se lleva a cabo utilizando un clon de expresión recombinante. La construcción del clon de expresión recombinante, la transformación de una célula huésped con el clon de expresión, y el cultivo de la célula huésped transformada bajo condiciones que estimulan la expresión, pueden llevarse a cabo de una diversidad de maneras utilizando técnicas de biología molecular bien conocidas de la técnica. Los métodos para cada una de dichas etapas se describen en general posteriormente y de manera específica en los ejemplos.

Se construye un clon de expresión operable situando la secuencia codificante en ligamiento operable con una secuencia de control adecuada en un vector de expresión. El vector puede diseñarse para replicarse autónomamente en la célula huésped o para integrarse en el ADN cromosómico de la célula huésped. El clon resultante se utiliza para transformar una célula huésped, y el huésped transformado se cultiva bajo condiciones adecuadas para la expresión de la secuencia codificante. La proteína expresada se aísla del medio o de las células, aunque la recuperación y la purificación de la proteína pueden no resultar necesarias en algunos casos.

La construcción de clones adecuados que contienen la secuencia codificante y una secuencia de control adecuada utiliza técnicas estándares de ligación y restricción que son bien conocidas de la técnica. En general, se cortan, modifican y religan en la forma deseada secuencias de ADN u oligonucleótidos sintetizados. Pueden añadirse sitios de restricción adecuados, en caso de no encontrarse disponibles normalmente, a los extremos de la secuencia codificante, de manera que faciliten la construcción de un clon de expresión.

El corte del ADN específico de sitio se lleva a cabo mediante tratamiento con uno o más enzimas de restricción adecuados bajo condiciones generalmente conocidas de la técnica y que especifican los fabricantes de los enzimas de restricción disponibles comercialmente. Ver, por ejemplo, los catálogos de producto de Amersham (Arlington Heights, IL), de Roche Molecular Biochemicals (Indianapolis, IN) y de New England Biolabs (Beverly, MA). En general, se corta aproximadamente 1 ¡Jg de plásmido o de otro ADN con una unidad de enzima en aproximadamente 20 ¡JI de solución tampón; en los ejemplos, posteriormente, generalmente se utiliza un exceso de enzima de restricción para garantizar la digestión completa del ADN. Los tiempos de incubación de aproximadamente una a dos horas a una temperatura que resulte óptima para el enzima particular son típicos. Tras cada incubación, se eliminan las proteínas mediante extracción con fenol y cloroformo; tras esta extracción puede realizarse una extracción con éter y recuperarse el ADN a partir de las fracciones acuosas mediante precipitación con etanol. Si se desea, puede llevarse a cabo la separación por tamaños de los fragmentos cortados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida o de agarosa utilizando técnicas estándares. Ver, por ejemplo, Maxam et al., Methods in Enzymology 65:499-560, 1980.

Los fragmentos de AON cortados con enzimas de restricción con extremos "protuberantes" de cadena sencilla pueden hacerse romos (extremos de doble cadena) mediante tratamiento con el fragmento grande de la AON polimerasa I de E. coli (Klenow) en presencia de los cuatro desoxinucleósidos trifosfato (dNTP) en tiempos de incubación de aproximadamente 15 a 25 minutos a una temperatura de entre 20ºC y 25ºC en Tris 50 mM, pH 7,6, NaCI 50 mM, MgCI2 10 mM, OTT 10 mM y los dNTP 5 a 10 ¡.JM. El fragmento Klenow rellena en los extremo 5' protuberantes, pero recorta las cadenas 3' únicas protuberantes, aunque se encuentren presentes los cuatro dNTP. Si se desea, puede llevarse a cabo la reparación selectiva mediante el suministro de uno o más dNTP seleccionados, dentro de las limitaciones dictadas por la naturaleza de los extremos protuberantes. Tras el tratamiento con Klenow, la mezcla se extrae con fenol/cloroformo y se precipita con etanol. Pueden conseguirse resultados similares utilizando la nucleasa S1, debido a que el tratamiento bajo condiciones apropiadas con nucleasa S1 resulta en la hidrólisis de cualquier porción de una cadena de ácido nucleico.

Las ligaciones se llevan a cabo en volúmenes de 15 a 30 ¡.JI bajo las condiciones y temperaturas estándares siguientes: Tris-CI 20 mM, pH 7,5, MgCI2 10 mM, OH 10 mM, BSA 33 ¡.Jg/ml, NaCI 10 a 50 mM, y ATP 40 ¡.JM Y 0,01 a 0,02 unidades (Weiss) de AON ligasa de T4 a O"C (para la ligación de fragmentos con extremos de una cadena complementarios) o ATP 1 mM y 0,3 a 0,6 unidades de AON ligasa de T 4 a 14"C (para la ligación de "extremos romos"). Las ligaciones intermoleculares de fragmentos con extremos complementarios habitualmente se llevan a cabo a concentraciones de AON total de entre 33 y 100 ¡.Jg/ml (concentración de extremos total de entre 5 y 100 nM). Las ligaciones intermoleculares de extremos romos (habitualmente utilizando un exceso molar de 20 a 30 veces de conectores, opcionalmente) se llevan a cabo a una concentración de extremo total de 1 ¡.JM).

En la construcción del vector, el fragmento de vector habitualmente se trata con fosfatasa alcalina intestinal bacteriana o bovina (BAP o CIAP) para eliminar el fosfato 5' y evitar la religación y reconstrucción del vector. Las condiciones de la digestión con BAP y CIAP son bien conocidas de la técnica, y habitualmente los enzimas BAP y CIAP disponibles comercialmente se acompañan de protocolos publicados. Para recuperar los fragmentos de ácidos nucleicos, la preparación se extrae con fenolcloroformo y se precipitan con etanol para eliminar la fosfatasa y purificar el AON. Alternativamente, la religación de los fragmentos de vector no deseados puede evitarse mediante la digestión con enzima de restricción antes o después de la ligación, en caso de que se encuentren disponibles sitios de restricción apropiados.

Las ligaciones correctas para la construcción de plásmidos pueden confirmarse utilizando cualquier método adecuado conocido de la técnica. En la construcción indicada posteriormente, las ligaciones correctas para la construcción de plásmidos se confirman en primer lugar transformando un huésped adecuado, tal como E. coli cepa OG101 (ATCC nº 47043) o E. coli cepa OG116 (ATCC nº 53606), con la mezcla de ligación. Los transformantes exitosos se seleccionan a partir de la resistencia o sensibilidad a la ampicilina, tetraciclina u otro antibiótico, mediante la utilización de otros marcadores, dependiendo del modo de construcción del plásmido, tal como es conocido de la técnica. A continuación, los plásmidos de los transformantes se preparan según el método de Clewell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62:1159, 1969, opcionalmente tras la amplificación con cloranfenicol. Ver Clewell,

J. Bacteriol. 110:667, 1972. Alternativamente, puede prepararse plásmido de AON utilizando el método de extracción "base-ácido" en la página 11 de la publicación de los Bethesda Research Laboratories Focus 5(2) y puede obtenerse AON plasmídico muy puro sustituyendo las etapas 12 a 17 del protocolo por la ultracentrifugación en CsCI/bromuro de etidio del AON. A modo de otra alternativa, puede utilizarse un kit de aislamiento de AON plasmídico disponible comercialmente, por ejemplo los kits de aislamiento de AON plasmídico HISPEEO™, QIAFILTER™ y QIAGEN® (Qiagen, Valencia, CA) siguiendo los protocolos proporcionados por el proveedor. El AON aislado se analiza mediante digestión con enzimas de restricción y/o se secuencia mediante el método dideoxi de Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463, 1977, tal como se describe en mayor detalle en Messing et al., Nuc. Acids Res. 9:309, 1981, o mediante el método de Maxam et al., Methods in Enzymology 65:499, 1980.

Las secuencias de control, vectores de expresión y métodos de transformación dependen del tipo de célula huésped utilizado para expresar el gen. Generalmente se utilizan como huéspedes células procarióticas, de levadura, de insecto o de mamífero. Los huéspedes procarióticos son, en general, los más eficientes y convenientes para la producción de proteínas recombinantes y son, por lo tanto, preferentes para la expresión de la proteína. El procariota utilizado más frecuentemente para expresar proteínas recombinantes es E. coli. Sin embargo, también pueden utilizarse cepas microbianas diferentes de E. coli, tales como bacilos, por ejemplo Bacillus subtilis, diversas especies de Pseudomonas y Salmonella, y otras cepas bacterianas, para la expresión bacteriana de la proteína. En dichos sistemas procarióticos, típicamente se utilizan vectores plasmídos que contienen sitios de replicación y secuencias de control derivadas del huésped o de una especie compatible con el huésped.

Para la expresión de construcciones bajo el control de la mayoría de promotores bacterianos, puede utilizarse como huésped E. coli K12 cepa MM294, obtenida del E. coli Genetic Stock Center bajo el nº GCSC 6135. Para los vectores de expresión con la secuencia de control PLNRBS o PLT7RBS, puede utilizarse el lisógeno lambda de E. coli K12 cepa MC1000, N7N53cl857 SusPso, ATCC nº 39531. También son células huésped útiles E. coli DG116, depositada en la ATCC (ATCC nº 53606) el 7 de abril de 1987, y E. coli KB2, depositada en la ATCC (ATCC nº 53075) el 29 de marzo de 1985. Para los recombinantes del fago M13, se utilizan cepas de E. coli susceptible a la infección por fagos, tales como E. coli K12 cepa DG98 (ATCC nº 39768). La cepa DG98 fue depositada en la ATCC el 13 de julio de 1984.

Por ejemplo, E. coli típicamente se transforma utilizando derivados de pBR322, descritos por Bolivar et al., Gene 2:95, 1977. El plásmido pBR322 contiene genes de resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina. Estos marcadores de resistencia a fármacos pueden conservarse o destruirse durante la construcción del vecxtor deseado y de esta manera ayudar a detectar la presencia de un recombinante deseado. Entre las secuencias de control procarióticas utilizadas comúnmente, es decir, un promotor para el inicio de la transcripción, opcionalmente con un operador, conjuntamente con una secuencia de sitio de unión ribosómica, se incluyen los sistemas de promotor ¡3-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (Iac); ver Chang et al., Nature 198:1056, 1977; el sistema de promotor triptófano (trp), ver Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8:4057, 1980; Y el promotor PL derivado de lambda, ver Shimatake et al., Nature 292:128, 1981, Y el sitio de unión ribosómica del gen N (NRBS). Se da a conocer un casete de sistema de control portátil en la patente US nº 4.711.845, publicada el 8 de diciembre de 1987. Este casete comprende un promotor PL operablemente ligado al NRBS, a su vez situado cadena arriba de una tercera secuencia de ADN que presenta por lo menos un sitio de restricción que permite el corte a menos de seis pares de bases en dirección 3' de la secuencia NRBS. También resulta útil el sistema de la fosfatasa A (phoA) descrito por Chang et al., en la publicación de patente europea nº 196.864, publicada el 8 de octubre de 1986. Sin embargo, puede utilizarse cualquier sistema de promotor disponible compatible con procariotas, para construir un vector de expresión de la invención.

Además de bacterias también pueden utilizarse microbios eucarióticos, tales como levaduras, como células huésped recombinantes. Con más frecuencia se utilizan cepas de laboratorio de Saccharomyces cerevisiae, levadura de panadería, aunque también se encuentran comúnmente disponibles algunas otras cepas. Aunque los vectores que utilizan el origen de replicación 21J son comunes; ver Broach, Meth. Enz. 101 :307, 1983, se conocen otros vectores plasmídicos adecuados para la expresión en levaduras. Ver, por ejemplo, Stinchcomb et al., Nature 282:39, 1979; Tschempe et al., Gene 10:157, 1980; y Clarke et al., Meth. Enz. 101 :300, 1983. Entre las secuencias de control para los vectores levadura se incluyen promotores para la síntesis de enzimas glucolíticos. Ver Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; Holland et al., Biotechnology 17:4900, 1978; Y Holland et al., J. Biol. Chem. 256:1385, 1981. Entre los promotores adicionales conocidos de la técnica se incluyen el promotor de la 3fosfogliceratoquinasa; ver Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980, y aquellos de otros enzimas glucolíticos, tales como la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la glucosa-6-fosfato isomerasa, la 3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucoquinasa. Otros promotores que presentan la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento son las regiones de promotor de la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, los enzimas degradativos asociados al metabolismo del nitrógeno y los enzimas responsables de la utilización de la maltosa y la galactosa (Holland, supra).

También pueden utilizarse secuencias de terminados para intensificar la expresión al situarlas en el extremo 3' de la secuencia codificante. Dichos terminadores se encuentran en la región 3' no traducida después de las secuencias codificantes en los genes derivados de levaduras. Cualquier vector que contenga un promotor compatible con levaduras, origen de replicación y otras secuencias de control resulta adecuado para la utilización en la construcción de vectores de expresión de levadura.

La secuencia codificante también puede expresarse en cultivos de células huésped eucarióticas derivadas a partir de organismos multicelulares. Ver, por ejemplo, Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, Wiley; Doyle et al., editores, 1993. Entre las líneas de células huésped útiles se incluyen COS-7, COS-A2, CV-1, células murinas tales como los mielomas murinos N51 y VERO, las células HeLa y las células de ovario de hámster chino (CHO). Entre los vectores de expresión para dichas células ordinariamente se incluyen los promotores y secuencias de control compatibles con las células de mamífero, tales como, por ejemplo, los promotores temprano y tardío comúnmente utilizados del virus del simio 40 (SV 40); ver Fiers et al., Nature 273:113, 1978, u otros promotores víricos, tales como los derivados del polioma, del adenovirus 2, del virus del papiloma bovino (BVP) o del virus del sarcoma aviar,

o promotores inmunoglobulina y promotores de choque térmico. Un sistema para expresar ADN en sistema de mamífero utilizando un sistema vector de BPV se da a conocer en la patente estadounidense nº 4.419.446. Se describe una modificación de este sistema en la patente US nº 4.601.978. Se describen aspectos generales de las transformaciones del sistema de células huésped de mamífero en Axel, patente US nº 4.399.216. Las regiones "intensificado ras" también resultan importantes para optimizar la expresión; éstas son, generalmente, secuencias presentes cadena arriba de la región promotora. Los orígenes de replicación pueden obtenerse, en caso necesario, de fuentes víricas. Sin embargo, la integración en el cromosoma es un mecanismo común de replicación del ADN en eucariotas.

También pueden utilizarse células vegetales como huéspedes, y se encuentran disponibles secuencias de control compatibles con las células vegetales, tales como el promotor de la nopalina sintasa y las secuencias de señal de poliadenilación; ver Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1 :561, 1981. También se han descrito sistemas de expresión que utilizan células de insecto con los sistemas de control proporcionados por vectores baculovirus. Ver Miller et al., Genetic Engineering, 1986; Setlow et al., editores, Plenum Publishing, vol. 8, páginas 277 a 97. La expresión basada en células de insecto puede llevarse a cabo en Spodoptera frugiperda. Estos sistemas también resultan útiles para producir enzimas recombinantes.

Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se lleva a cabo utilizando técnicas estándares apropiadas para dichas células. El tratamiento con cloruro de calcio, tal como se describe en Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110, 1971, es utilizado por procariotas u otras células que contienen barreras de pared celular sustanciales. Se utiliza la infección por Agrobacterium tumefaciens para determinadas células vegetales; ver Shaw et al., Gene 23:315,1983. Para las células de mamífero, el método de precipitación con fosfato de calcio de Grahamet et al., Virology 52:546, 1978, resulta preferente. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo según el método de van Solingen et al., J. Bact. 130:946, 1977, y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3829, 1979.

Puede resultar deseable modificar la secuencia del ADN codificante del enzima de la invención con el fin de proporcionar, por ejemplo, una secuencia más compatible con el uso de codones de la célula huésped sin modificar la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada. Dichas modificaciones de los 5-6 codones iniciales podrían mejorar la eficiencia de la expresión. Las secuencias de ADN que han sido modificadas para mejorar la eficiencia de la expresión, pero que codifican la misma secuencia de aminoácidos, se considera que son equivalentes y que se encuentran comprendidas en la presente invención.

Se encuentra disponible una diversidad de métodos de mutagénesis específica de sitio dirigida por cebadores que son conocidos de la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989, segunda edición, capítulo 15.51, "Oligonucleotide-mediated mutagenesis" [Mutagénesis mediada por oligonucleótidos]. Puede llevarse a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para llevar a cabo una mutagénesis específica de sitio. En otra técnica ahora estándar de la técnica, se utiliza un oligonucleótido sintético codificante de la mutación deseada como cebador para dirigir la síntesis de una secuencia complementaria de ácidos nucleicos contenida en un vector de cadena sencilla, tal como derivados de pBSM13+, que sirve como molde para la construcción del producto de extensión del cebador mutagenizante. El ADN mutagenizado se transforma en una bacteria huésped y se siembran cultivos de las bacterias transformadas y se identifican. La identificación de los vectores modificados puede implicar la transferencia del ADN de los transformantes seleccionados a un filtro de nitrocelulosa u otra membrana y la hibridación de las extracciones con un cebador mutagénico sintético fosforilado, a una temperatura que permita la hibridación de una secuencia exactamente complementaria a la secuencia modificada, pero que evite la hibridación con la cadena no mutagenizada original. Los transformantes que contienen ADN que se hibrida con la sonda seguidamente se cultivan (la secuencia del ADN generalmente se confirma mediante secuenciación) y sirve como reservorio del ADN modificado.

Tras expresar la proteína en una célula huésped recombinante, puede resultar deseable la purificación de la proteína. Puede utilizarse una diversidad de procedimientos de purificación para purificar la ADN polimerasa termoestable o termoactiva recombinante de la invención. Entre los ejemplos se incluyen los métodos para purificar la ADN polimerasa Taq descrita en las patentes US nº 4.889.818, nº 5.352.600 y nº 5.079.352; los métodos para purificar la ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth) descritos en las patentes US nº 5.618.711 y nº 5.310.652; Y los métodos para purificar la ADN polimerasa Tma descritos en las patentes US nº 5.374.553 y nº

5.420.029. Los métodos para purificar dichas ADN polimerasas también se describen en la patente US nº 5.466.591.

En un aspecto de la invención, la expresión de la ADN polimerasa se lleva a cabo en E. coli, que es una célula huésped bacteriana mesofílica. Debido a que la mayoría de proteínas del huésped E. coli son sensibles al calor, la ADN polimerasa termoestable o termoactiva recombinante puede enriquecerse sustancialmente mediante inactivación por calor del lisado crudo. Esta etapa se lleva a cabo en presencia de una cantidad suficiente de sal (típicamente sulfato amónico 0,2 a 0,4 M) para reducir las interacciones iónicas de la ADN polimerasa con otras proteínas del lisado celular. En una realización, la actividad de la ADN polimerasa purificada se somete a ensayo utilizando el método descrito posteriormente, en el Ejemplo 3.

Para la estabilidad a largo plazo, el enzima ADN polimerasa purificado debe almacenarse en un tampón que contenga uno o más detergentes poliméricos no iónicos. Dichos detergentes generalmente son aquellos que presentan un peso molecular comprendido en el intervalo de entre aproximadamente 100 Y 250.000, preferentemente de entre aproximadamente 4.000 y 200.000 daltons, y estabilizar el enzima a un pH de entre aproximadamente 3,5 y aproximadamente 9,5, preferentemente entre aproximadamente 4 y 8,5. Entre los ejemplos de dichos detergentes se incluyen aquellos especificados en las páginas 295 a 298 de McCutcheon's Emulsifiers & Detergentes, North American edition, 1983, publicado por la división McCutcheon de MC Publishing Co., 175 Rock Road, Glen Rock, NJ, USA. En una realización, los detergentes se seleccionan de entre el grupo que comprende éteres de alcohol graso etoxilado y éteres laurílicos, alquilfenoles etoxilados, compuestos de octilfenoxi-polietoxietanol, alcoholes de cadena lineal oxietilados y/o oxipropilados modificados, compuestos de monooleato de polietilenglicol, compuestos polisorbato y éteres de alcohol graso fenólico. En otra realización, los detergentes se seleccionan de entre el grupo que comprende Tween 20TM, un monolaurato de sorbitán polioxietilado (20) de ICI Americas Inc. (Wilmington, DE) e Iconol™ NP-40 y alquilfenol (nonilo) etoxilado de BASF Wyandotte Corp. (Pasippany, NJ).

6. Usos de las ADN polimerasas termoestables o termoactivas de la invención

El enzima termoestable o termoactivo de la presente invención puede utilizarse con cualquier fin en el que resulte necesario o deseable una ADN polimerasa termoestable o termoactiva con una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada. En una realización, el enzima se utiliza para una PCR. Entre los ejemplos de aplicaciones que utilizan la PCR se incluyen, por ejemplo, la clonación directa a partir de ADN genómico o ADNc, en la mutagénesis in vitro y en la manipulación del ADN, en la obtención de huellas genéticas de muestras forenses, en ensayos para la presencia de agentes infecciosos, en el diagnóstico prenatal de enfermedades genéticas, en el análisis de variaciones alélicas de una secuencia, en el análisis de la estructura de los transcritos de ARN, en la obtención de huellas genómicas, y en la secuenciación directa de nucleótidos del ADN genómico o de ADNc. Ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (eds.), John Wiley & Sons, capítulo 15,2001, Y PCR Strategies, Innis et al. (eds), Academic Press, Inc., 1995.

7. Kits

Las ADN polimerasas termoestables o termoactivas de la invención resultan adecuadas para la preparación de un kit. Los kits que comprenden las ADN polimerasas mutantes de la invención pueden utilizarse para marcar detectablemente moléculas de ADN, la secuenciación de ADN o la amplificación de moléculas de ADN mediante técnicas bien conocidas, dependiendo del contenido del kit. Dichos kits pueden comprender un medio portador, compartimentalizado para alojar en espacios próximos entre sí uno o más medios receptores, tales como viales, probetas y similares. Cada uno de dichos medios recipientes comprende componentes o una mezcla de componentes necesarios para llevar a cabo la secuenciación de ADN, el marcaje de ADN o la amplificación de ADN.

Un kit para la secuenciación del ADN puede comprender varios medios receptores. Un primer medio recipiente puede contener, por ejemplo, una muestra sustancialmente purificada de una ADN polimerasa termoestable o termoactiva de la invención. Un segundo medio recipiente puede contener uno o más tipos de nucleótidos necesarios para sintetizar una molécula de ADN complementaria al ADN molde. Un tercer recipiente puede contener uno o más tipos diferentes de dideoxinucleótidos trifosfato. Además de los medios recipientes anteriormente indicados, pueden incluirse medios recipientes adicionales en el kit que contengan uno o más cebadores de ADN.

Un kit utilizado para amplificar el ADN comprende, por ejemplo, un primer medio recipiente que contiene una ADN polimerasa mutante sustancialmente pura de la presente invención y uno o más medios recipientes adicionales que contienen un único tipo de nucleótido o mezclas de nucleótidos. Pueden incluirse o no diversos cebadores en un kit para amplificar ADN.

Si se desea, el kit de la presente invención también puede incluir medios recipientes que contengan nucleótidos marcados detectablemente que pueden utilizarse durante la síntesis o secuenciación de una molécula de ADN. Puede utilizarse uno de entre varios marcadores disponibles para detectar dichos nucleótidos. Entre los marcajes ilustrativos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, isótopos radioactivos, marcajes fluorescentes, marcajes quimioluminiscentes, marcajes bioluminiscentes y marcajes enzimáticos o cualquier otro marcaje para marcar directa

o indirectamente un nucleótido o ácido nucleico.

En los ejemplos no limitativos siguientes, todos los porcentajes se expresan en peso en el caso de los sólidos, y en volumen en el caso de los líquidos, a menos que se indique lo contrario.

Ejemplo 1: Mutagénesis de pCS6 y pCS5

El presente ejemplo describe la mutagénesis sitio-dirigda del dominio de exonucleasa 3' a 5' de una ADN polimerasa termoestable y termoactiva.

En una primera ronda de mutagénesis, se utilizó un enfoque de mutagénesis sitio-dirigda para alterar residuos en una ADN polimerasa termoestable que son residuos homólogos que es conocido que son importantes para coordinar cationes metálicos divalentes en el sitio activo del dominio corrector de errores del fragmento Klenow, o que se encuentran situados entre los residuos homólogos. Ver Derbyshire et al., Methods in Enzymology 262:36385, 1995. Se utilizó el plásmido pCS6, codificante de la ADN polimerasa termoestable quimérica mutante CS6. Ver la figura 5. CS6 es una forma mutante de la AON polimerasa termoestable quimérica CS5. Ver la figura 4. La porción N-terminal de CS5 son los 291 residuos N-terminales de la AON polimerasa de Thermus especie Z05, codificante de su actividad de exonucleasa 3' a 5'. Ver la patente US nº 6.228.628. El resto de CS5 son los 602 residuos Cterminales de la AON polimerasa Tma, que comprende sus actividades de exonucleasa 3' a 5' y sus actividades de AON polimerasa. CS6 es idéntico a CS5 excepto en que presenta las mutaciones 0323A y E325A (en lo sucesivo se utiliza la numeración de los residuos del enzima Tma de tipo salvaje, a menos que se indique lo contrario) en el dominio de exonucleasa 3' a 5'. Tal como se muestra en la presente memoria, dichas mutaciones provocan que CS6 no presente actividad de exonucleasa 3' a 5' detectable.

Las dianas eran los residuos ácidos en las posiciones 323 y 325 Y el residuo leucina en la posición 324. Cada mutación (excepto la mutación 0323E, tal como se explica posteriormente) se generó utilizando el mismo método básico. Se sintetizaron parejas de oligonucleótidos degenerados, tal como se muestra en la Tabla 2. Un oligonucleótido degenerado de cada pareja era un 11-mero y el otro era un 17-mero. Aparte de los nucleótidos degenerados, el 11-mero de cada pareja de oligonucleótidos era perfectamente complementario a una subsecuencia de 11 nucleótidos del 17-mero de cada pareja. Para la mutación 0323E, se diseñó una pareja no degenerada de oligonucleótidos complementarios, tal como se muestra en la Tabla 2. Se mezclaron los oligonucleótidos degenerados de cada pareja bajo condiciones de hibridación, de manera que los oligonucleótidos que eran perfectamente complementarios entre sí, incluyendo en sus posiciones degeneradas, se hibridasen formando una fibra 11-mera de AONbc flanqueada en un extremo por un extremo protuberante 3'-TA Y en el otro extremo por un extremo protuberante 5'-CTAG, tal como se muestra en la Tabla 2. Estos extremos son compatibles con los extremos generados por los enzimas de restricción Sgl y Spel, respectivamente. De esta manera, cada reacción de hibridación produjo una mezcla de parejas de oligonucleótidos perfectamente complementarios e hibridados, tal como se muestra en la Tabla 2.

A continuación, se digirieron cinco ¡Jg de pCS6 en una reacción de 25 ¡JI que comprendía 15 unidades del enzima de restricción Spel, Tris·HCI 50 mM, MgCI2 10 mM, NaCI 100 mM, pH 7,5, a 37ºC durante 2,5 horas. El enzima se inactivó por calentamiento a 75ºC durante 10 minutos y después se enfrió hasta la temperatura ambiente. A continuación se añadieron 15 unidades del enzima de restricción Sgfl y se continuó la incubación durante 2 horas a 37ºC. Seguidamente la reacción se reservó durante la noche a 25ºC. Estas etapas linearizaron pCS6 y eliminaron los codones codificantes de los dos residuos ácidos en 323 y 325 (que se encuentran mutados en pCS6) y la leucina en la posición 324. También dejó extremos que eran compatibles con los extremos de las parejas de cebadores degenerados hibridados.

En reacciones separadas, se mezclaron 0,5 pmoles de cada una de las mezclas de parejas de oligonucleótidos hibridados con 0,1 pmoles del pCS6 linearizado y 0,5 unidades de la AON ligasa de T4 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) en el tampón suministrado y se incubaron durante la noche a 4ºC.

A continuación, se utilizó un ¡JI (20 ng) de cada mezcla d eligación para transformar E. coli cepa OG116 utilizando un electroporador GENE PULSER™ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) esencialmente siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células electroporadas se diluyeron con 1 mi de medio SOC y después se incubaron durante 1 hora a 30ºC bajo agitación. Se sembraron alícuotas de 50 ó 100 ¡JI de las células resuspendidas en placas LB con 100 ¡Jg/ml de ampicilina añadida, para seleccionar las células transformadas, y se incubaron durante la noche.

Para cada transformación, se recolectaron cinco colonias para la amplificación por PCR y se llevó a cabo un análisis de restricción para determinar qué plásmidos pCS6 mutados contenían, si contenían alguno. Se suspendió cada colonia en 50 ¡JI de mezcla maestra que contenía el tampón II para PCR (PE-Applied BioSystems, Redwood City, CA), mezcla de dNTPs 40 ¡JM Y20 pmoles de cada uno de los cebadores CS4 y CS1A.

CS1A: GTATGTAGTACGCTTCCTTTGGTTTGAA (SEC ID nº 35) CS4: TGGCTTTGGGAGAAGTACGGCCT (SEC ID nº 36)

Se digirió AON amplificado de cada colonia con una serie diagnóstica de enzimas de restricción, tal como se muestra en la Tabla 3, con el fin de determinar si habían incorporado correctamente un oligonucleótido sintético y, en caso de haberlo incorporado, qué secuencia mutante había sido incorporada. Los clones que presentaban el patrón correcto de sitios de restricción seguidamente se secuenciaron en la región de la inserción para garantizar que cada plásmido seleccionado para su uso posterior incorporase únicamente las mutaciones deseadas.

Tabla 2 Tabla 3

Oligonucleótidos utilizados en la Ronda I

Parejas de oligos degenerados (posiciones degeneradas en minúscula negrita): Mutación Parejas de oligos mutagénicos hibridados

CS6 5' CGACGAa/tGAGA (SEC ID nº 37) CS7 3' TAGCTGCTt/aCTCTGATC (SEC ID nº 38): L324-> E L324-> O 5' CGACGAAGAGA (SEC ID nº 39) 3' TAGCTGCTTCTCTGATC (SEC ID nº 40) 5' CGACGATGAGA (SEC ID nº 41) 3' TAGCTGCTACTCTGATC (SEC ID nº 42)

CS8 5' TGATa/cAGGAAA (SEC ID nº 43) CS9 3' TAACTAt/gTCCTTTGATC (SEC ID nº 44): L324-> K L324-> Q 5' TGATAAGGAAA (SEC ID nº 45) 3' TAACTATTCCTTTGATC (SEC ID nº 46) 5' TGATCAGGAAA (SEC ID nº 47) 3' TAACTAGTCCTTTGATC (SEC ID nº 48)

CS10 5' CGATa/cATGAAA (SEC ID nº 49) CS11 3' TAGCTAt/gTACTTTGATC (SEC ID nº 50): L324-> N L324-> H 5' CGATAATGAAA (SEC ID nº 51) 3' TAGCTATTACTTTGATC (SEC ID nº 52) 5' CGATCATGAAA (SEC ID nº 53) 3' TAGCTAGTACTTTGATC (SEC ID nº 54)

CS12 5' TGAc/gCTGGATA (SEC ID nº 55) CS13 3' TAACTg/cGACCTAAGATC (SEC ID nº 56): E325-> O 0323-> E; E325-> O 5' TGACCTGGATA (SEC ID nº 57) 3' TAACTGGACCTATGATC (SEC ID nº 58) 5' TGAGCTGGATA (SEC ID nº 59) 3' TAACTCGACCTATGATC (SEC ID nº 60)

CS14 5' TGAGCTTGAGA (SEC ID nº 61) CS15 3' TAACTCGAACTCTGATC (SEC ID nº 62): 0323-> E 5' TGAGCTTGAGA (SEC ID nº 63) 3' TAACTCGAACTCTGATC (SEC ID nº 64)

Sitios de enzima de restricción en mutantes Tma L324 E/O/K/N/Q/H y 323/325

Mutante L324 (0323 E325): BsmAI Clal* Taql* Bcll @A321 Bcll @0323 Earl BspH I

E: + - + + - + -

O: + - + + - - -

K: - - - - - - -

N: - + + + - - -

Q: - - - - + - -

H: - + + + + - +

X323L324 X325: BstNI Alul Smll

O-L-O: + - - - - - -

E-L-O: - + - - - - -

E-L-E: - + + - - - -

Parentales: BsmAI BstNI Clal Taql Smll Bcll en A321 Bclll en 0323 Earl BspHI

CS5 (O-L-E): - + - - - - -

CS6 (A-L-A): - - - + también Sgfl+ - - -

* No había en E. coli Oam+; sí había en los productos de PCR y en E. coli Oam-.

En una segunda ronda de mutagénesis, se utilizó un procedimiento de mutagénesis sitio-dirigida basada en PCR para dirigir los residuos que es conocido o que se sospecha que contribuyen a la unión del sustrato a la actividad de exonucleasa 3' a 5'. Se diseñaron parejas de cebadores para cada mutagénesis, tal como se muestra en la Tabla 4. Cada pareja de cebadores permitió la amplificación de una porción del gen codificante de polimerasa de pCS5. Únicamente se utilizó una pareja de cebadores para la mutación L329A. Para esta mutación, un cebador de la pareja

introdujo una mutación en el amplicón, y ambos cebadores contenían sitios de restricción próximos a sus extremos que les permitieron ser subclonados en pCS5 que había sido digerido con los mismos enzimas, generando de esta manera un plásmido de expresión codificante de la ADN poilmerasa híbrida Z05-Tma con la mutación L329A. Se utilizaron dos parejas de cebadores para crear cada una de las mutaciones restantes en la segunda ronda de 5 mutagénesis. Para cada mutación, un cebador en cada pareja contenía la mutación deseada pero de otra manera era complementario a pCS5. El otro cebador de cada pareja era perfectamente complementario a una porción de pCS5. Se llevó a cabo una PCR utilizando pCS5 como el molde, separadamente para cada pareja de cebadores. Estas reacciones produjeron amplicones que se solapan en aproximadamente 35 nucleótidos. La porción solapante de los amplicones contenía la mutación deseada. A continuación, se llevó a cabo otra amplificación por PCR en la 10 que se mezclaron dos amplicones parcialmente solapantes y se utilizaron los cebadores de secuencia flanqueante de cada pareja (es decir, los cebadores de amplificación respectivos de cada pareja que no comprendían la secuencia mutante). Esta reacción resultó en un amplicón de gran tamaño que consistía de los dos amplicones parcialmente solapantes producidos mediante las PCR anteriores. Los cebadores de secuencia flanqueante se diseñaron para que fuesen complementarios a las porciones del gen codificante de polimerasa que presentaban

15 sitios de restricción útiles para la clonación. El amplicón y pCS5 seguidamente se digirieron con dichos enzimas de restricción, se mezclaron y se ligaron, produciendo un plásmido de expresión que contenía la mutación deseada. Los productos de ligación se utilizaron para transformar las células de E. coli indicadas anteriormente. El éxito de las mutagénesis se verificó utilizando los sitios de restricción listados en la Tabla 5, tal como se ha indicado anteriormente.

Tabla 4

Cebadores utilizados en la Ronda II

Mutación: Cebador directo (codón o codones modificados en minúscula negrita) Cebador inverso

L329A: CS20 GAAACTAGTTCCgctGATCCTTTCGA (SEC ID nº 65) CS36 GAAAAGAGAAGGACATGAGCTCTTGGTAA (SEC ID nº 66)

Mutación: Cebadores mutagénicos Cebadores de secuencia flanqueante

Y464A: CS21 (cebador directo solapante) AGAAAAAGCtGCGAAtgcaTCCTGTGMGAT GCAGA (SEC ID nº 67) CS22 (cebador inverso solapante) CTGCATCTTCACAGGAtgcaTTCGCaGCTTT TTCTA (SEC ID nº 69) CS37 TTTCCAGATCTGCCTCGTGGAGTTTTAA (SEC ID nº 68) CS35 ACCMGAGCTCATGTCCTTCTCTTTTCCG (SEC ID nº 70)

0384A: CS23 (cebador directo solapante) CGTTGGTgccAATTTGAMTTCGATTACAA (SEC ID nº 71) CS24 (cebador inverso solapante) TGTAATCGAATTTCAAATTggcACCAACGA (SEC ID nº 72) CS36 GMAAGAGAAGGACATGAGCTCTTGGTAA (SEC ID nº 66) AW964 GGMACTAGTTCCCTCGATCC (SEC ID nº 73)

N385A: CS25 (cebador directo solapante) CGTTGGTCAGgccTTGAAATTCGATTACAA (SEC ID nº 74) CS26 (cebador inverso solapante) TGTAATCGAATTTCAAggcCTGACCAACGA (SEC ID nº 75) CS36 GAAAAGAGAAGGACATGAGCTCTTGGTAA (SEC ID nº 66) AW964 GGAAACTAGTTCCCTCGATCC (SEC ID nº 73)

0384A N385A: CS27 (cebador directo solapante) CGTTGGTgccgcTcTGAAATTCGATTACAA (SEC ID nº 76) CS28 (cebador inverso solapante) TGTAATCGAATTTCAgAgcggcACCAACGA (SEC ID nº 77) CS36 GAAAAGAGAAGGACATGAGCTCTTGGTAA (SEC ID nº 66) AW964 GGMACTAGTTCCCTCGATCC (SEC ID nº 73)

D389E: CS29 (cebador directo solapante) TGAMTTCGAgTACAAGGTGTTGATGGTGAA (SEC ID nº 78) CS30 (cebador inverso solapante) CAACACCTTGTACTCGAATTTCAAA (SEC ID nº 79) CS36 GMAAGAGAAGGACATGAGCTCTTGGTAA (SEC ID nº 66) AW964 GGAAACTAGTTCCCTCGATCC (SEC ID nº 73)

Tabla 5

Cebadores de Ronda II y sitios de restricción de los mismos

Cebador: Sitios de restricción para la clonación Sitios de restricción para el cribado

CS20 (SEC ID nº 65): Spel MspAII

CS36 (SEC ID nº 66): Sacl

CS21 (SEC ID nº 67): Bsml, Nsil

CS37 (SEC ID nº 68): Bglll

CS35 (SEC ID nº 70): Sacl

CS22 (SEC ID nº 69): Bsml, Nsil

CS23 (SEC ID nº 71): Banl

CS24 (SEC ID nº 72): Banl

AW964 (SEC ID nº 73): Spel

CS25 (SEC ID nº 74): Stul

CS26 (SEC ID nº 75): Stul

CS27 (SEC ID nº 76): Banl, BsrBI

CS28 (SEC ID nº 77): Banl, BsrBI

CS29 (SEC ID nº 78): Tatl, Rsal

CS30 (SEC ID nº 79): Tatl, Rsal

Ejemplo 2: Producción y purificación de AON polimerasas termoestables mutantes

Los plásmidos resultantes de la ligación indicados anteriormente contenían el gen de polimerasa bajo el control del promotor APL. Las células huésped (OG116, ATCC nº 53606) que contenían un represor A cl857 (termolábil) se transformaron con los plásmidos. Las células OG116 transformadas con los plásmidos que contenían el gen de polimerasa de tipo salvaje o mutagenizado se utilizaron para inocular 10 mi de medio de matraz estándar (SFM, que 10 comprende glucosa, vitamina B1, casaminoácidos y medio mínimo) con ampicilina (100 ¡.Jg/ml) y se cultivaron durante la noche a 30ºC, 250 rpm. Se utilizaron 5 mi del cultivo de durante la noche para inocular 450 mi de SFM + ampicilina y se agitaron a 30ºC, 250 rpm, hasta que el cultivo alcanzó una 00600 de entre 0,6 y 0,8. A continuación, se transfirió el cultivo a 37ºC y se cultivó durante la noche a 250 rpm para conseguir una expresión inducida por la temperatura de la polimerasa. Ver, por ejemplo, las patentes US nº 5.079.352, nº 5.420.029 y nº 5.618.711. El cultivo

15 de durante la noche se peletizó a 3.000xg durante 15 minutos.

Los pellets se resuspendieron en 30 mi de tampón de lisis (Tris-HCI 50 mM, pH 7,5, EOTA 10 mM, OTT 1 mM, Pefabloc 1 mM, leupeptina 1 ¡.Jg/ml, TLCK 0,2 mM) y las células se lisaron con una prensa francesa a 16.000 psi. La suspensión celular lisada se llevó a (NH4)2S04 0,2 M Y se calentó a 75ºC durante 15 minutos para inactivar y 20 desnaturalizar las proteínas del huésped E. coli. Los extractos calientes se enfriaron a OºC durante 15 minutos, se ajustaron a polietilenamina al 0,6% para precipitar el AON del huésped y se centrifugaron a 16.000xg durante 30 minutos. Los extractos clarificados se cargaron en una columna de 2 mi de fenilsefarosa preequilibrada con Tris-HCI 50 mM, pH 7,5, EOTA 10 mM, OTT 1 mM, (NH4)2S04 0,2 M. La columna se lavó con 6 mi de tampón de equilibrado, seguido de un lavado de 2 mi con Tris-HCI 50 mM, pH 7,5, EOTA 10 mM, OTT 1 mM y un lavado final con 2 mi de 25 Tris-HCI 50 mM, pH 7,5, EOTA 10 mM, OH 1 mM, etilenglicol al 20%. La proteína se eluyó en Tris-HCI 50 mM, pH 7,5, EOTA 10 mM, OTT 1 mM, urea 2,5 M. El eluido se ajustó a KCI 100 mM y se cargó en una columna de 2 mi de heparina-sefarosa preequilibrada con Tris-HCI 25 mM, pH 7,5, EOTA 1 mM, OTT 1 mM, KC 100 mM. La columna se lavó con 6 mi de tampón de equilibrado y se eluyó con 6 mi de Tris-HC125 mM, pH 7,5, EOTA 1 mM, OTT 1 mM, KCI 400 mM. El eluido final se ajustó a Tris-HCI 20 mM, pH 8,0, EOTA 0,1 mM, KCI 100 mM, OH 1 mM, Tween-20 al

30 0,2%, glicerol al 50% v/v mediante diálisis y dilución, y se almacenó a -20ºC.

Ejemplo 3: Ensayo estándar para la actividad de exonucleasa 3' a 5' Para comparar las actividades de exonucleasa 3' a 5' de los derivados mutantes de CS5, se midió la degradación del sustrato oligonucleótido monocatenario NJS40 marcado con carboxifluoresceína (FAM).

NJS40: FAM-GCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCAC (SEC ID nº 80)

El ensayo estándar (40 ¡.JI) contenía 4 pmoles (100 nM) de oligonucleótido monocatenario NJS40 marcado con FAM en tricina 50 mM, pH 8,3, KOAc 25 mM, OMSO al 5% p/v, Mn(OAc}2 0,5 mM y contribuciones al 5% (v/v) de tampón de almacenamiento enzimático (en la reacción: Tris 1 mM, pH 8,0, KCI 5 mM, EOTA 0,005 M, Tween-20 al 0,025%, OTT 0,05 mM, glicerol al 2,5%). Las reacciones se iniciaron mediante la adición de NJS40 y Mn(OAc}2 y se incubaron a 63ºC durante 15 minutos. Las reacciones se desactivaron mediante la adición de 40 ¡.JI de EOTA 50 mM. Se ajustaron la concentración de enzima y los tiempos de reacción para alcanzar la linealidad. La reacción es lineal en un intervalo de aproximadamente 1 a 20% de conversión del oligonucleótido inicial en producto más corto, correspondiente a 0,5 a 10 miliunidades de enzima; la concentración de enzima en todo momento era inferior a la concentración de sustrato. Las soluciones de reacción desactivada se diluyeron en formamida hasta 0,1 nM de oligonucleótido y se analizaron mediante electroforesis capilar (ABI 3100, Applied Biosystems, Foster City, CA). La altura máxima del tamaño inicial y los oligonucleótidos degradados se determinaron utilizando el software GENESCAN™ (Applied Biosystems, Foster City, CA). El pmol de oligonucleótido convertido en productos oligonucleótidos más cortos es igual a:

{1 relativa restante tras 5 x (pmol af de reaLCel'On)

en donde Pn es el sustrato oligonucleótido (NJS40) de longitud inicial n. La cantidad relativa de Pn restante tras 15 minutos se determinó midiendo la altura del pico correspondiente al oligonucleótido de tamaño inicial y dividiéndolo por la suma de las alturas de todos los picos. Este ensayo mide de esta manera la tasa de liberación del nucleótido 3'-terminal del oligonucleótido NJS40. Una unidad de actividad de exonucleasa 3' a 5' cataliza la conversión de 50 pmoles de oligonucleótido NJS40 de cadena sencilla en oligonucleótidos de menor longitud en 15 minutos bajo las condiciones de ensayo estándar.

Las polimerasas mutantes preparadas tal como se ha indicado anteriormente se caracterizaron utilizando el ensayo estándar. Los resultados de estos ensayos se presentan en la Tabla 6 bajo las columnas tituladas "AONmc".

Se midió la actividad de polimerasa de cada enzima mutante utilizando el ensayo que se enseña en la patente US nº

4.889.818. Brevemente, se diluyó una cantidad de reserva enzimática en tampón de almacenamiento (Tris 20 mM, KCI 100 mM, EOTA 0,1 mM, Tween-20 al 0,5%, OTT 1 mM, glicerol al 50%) en diluyente para enzima (Tris-HCI 25 mM, pH 8,0, KCI 50 mM, ~-mercaptoetanol 1 mM, Tween-20 al 0,5%, NP40 al 0,5%, gelatina 100 ¡.Jg/ml), rindiendo entre aproximadamente 0,02 y 0,1 unidades de actividad de polimerasa en cada ensayo. Se añadieron cinco micro litros del enzima diluido a 45 ¡.JI de tam~ón de reacción (TAPS 25 mM, pH 9,4, KCI 50 mM, MgCI2 2 mM, ~mercaptoetanol 1 mM, d(GTA}TP 200 ¡.JM, Q-3p-dCTP 100 ¡.JM, 30 ¡.Jg de AON de esperma de salmón activado (el AON "activado" es una preparación nativa de AON tras la hidrólisis parcial con AONasa I hasta que el 5% del AON se ha transferido a la fracción soluble en ácido). La reacción se incubó durante 10 minutos a 74ºC, y después se desactivó con 10 ¡.JI de EOTA 60 mM. Se añadieron 50 ¡.JI de cada reacción desactivada a los tubos que contenían 1 mi de EOTA 2 mM, pH 8,0 con 50 ¡.Jg/ml de AON portador (AON de esperma de salmón que había sido fragmentado mediante paso por una aguja de calibre 21). Se añadieron 1 mi de ácido tricloroacético (TCA) al 20% y pirofosfato sódico al 2% y los tubos se agitaron suavemente utilizando un agitador vórtex. Los tubos se incubaron sobre hielo durante diez a 20 minutos para permitir la precipitación completa del AON. Se recogió el AON precipitado sobre un filtro GF/C en un distribuidor de filtración al vacío. Los filtros se lavaron tres veces cada uno en TCA al 5%, pirofosfato sódico al 1%, después con TCA al 20%, y finalmente con etanol al 95%. Se trataron dos filtros blancos de manera similar con el fin de determinar el fondo del instrumento. Se cuantificó la radioactividad incorporada en el AON precipitado utilizando un OMNIFLUOR® (Packard BioScience B.v., Groningen, Países Bajos) y un contador de centelleo LS6000lC ™ (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Una unidad de actividad de polimerasa se define como la cantidad de actividad enzimática necesaria para incorporar un total de 10 nmoles de dNMP en producto de AON precipitable con TCA, en 30 minutos bajo las condiciones de ensayo proporcionadas anteriormente.

Ejemplo 4: Ensayo estándar para medir la actividad de exonucleasa 3' a 5'

Se utilizaron dos variaciones del ensayo estándar para caracterizar las actividades de exonucleasa 3' a 5' de las AON polimerasas termoestables o termoactivas mutantes indicadas anteriormente. Estos ensayos variantes eran idénticos al ensayo estándar excepto en que cada uno utilizó un sustrato diferente. En cada ensayo variante, tal como en el ensayo estándar, se midió la tasa de liberación del nucleótido 3'-terminal del oligonucleótido NJS40. Sin embargo, en los ensayos variantes, se hibridó NJS40 con un oligonucleótido complementario. El primer ensayo variante utilizó un sustrato de AON de doble cadena que era perfectamente complementario:

NJS40: 3' FAM-GCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCAC (SEC ID nº 80) NJS43:5'pAGCGATCCCGCGACCGTTCACATCGCCAGTGCGACGCGCATTGGTGGTGTGGGCGGCGCC (SEC ID nº 81)

Los resultados para los mutantes indicados anteriormente utilizando el primer ensayo variante se proporcionan en la Tabla 6 bajo las columnas tituladas "AONbc",

El segundo ensayo variante utilizó un sustrato de AON de doble cadena que contenía un apareamiento incorrecto:

NJS40: 3' FAM-GCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCAC (SEC ID nº 80) NJS44: 5' AGCGATCCCGCGACCGTTCACATCGCCAGTTCGACGCGCATTGGTGGTGTGGGCGGCGCC (SEC ID nº 82)

15 Los resultados para los mutantes indicados anteriormente utilizando el segundo ensayo variante se proporcionan en la Tabla 6 bajo las columnas tituladas "AONbc con un apareamiento incorrecto",

Ejemplo 5: Comparación entre las actividades de exonucleasa 3' a 5' de las AON polimerasas termoestables o termoactivas mutantes y las AON polimerasas de E. coli mutantes

Tabla 6 Actividades de polimerasa y de exonucleasa 3' a 5' de los mutan tes de Ronda I y de Ronda II

Polimerasa 5' a 3': Exonucleasa 3' a 5'

ADNmc: ADNbc ADNbc con un apareamiento incorrecto

Enzima: Actividad específica, U/pmol Tasa nº pM/s Actividad específica, U/pmol % Proporción polimerasaJ exo 3' Tasa, pM/s Actividad específica, U/pmol % Proporción polimerasal exo 3' Tasa, pM/s Actividad específica, U/pmol % Proporción polimerasaJ exo 3'

CS5: 8,6 136,1 9.9 100,0 0.9 154,7 11,3 100.0 0,8 228.1 16.6 100.0 0.5

Y464A: 14.7 0,2 0.0 0,1 1008,0 0.2 0,0 0.1 1008.0 0.2 0.01 0.1 1008.0

D389E: 13.0 22 1.6 16,2 8,1 25,5 1,9 16,5 7,0 66.8 4.9 29.3 2.7

L329A: 6,4 14,5 1.1 10,7 6.1 12.1 0,9 7.8 7,3 44.1 3.2 19.3 2.0

Q384A_ N 385A: 7,7 5,1 0.4 3,7 20.9 6.3 0,5 4.1 16,9 24.8 1.8 10.9 4.3

Q384A: 13.0 31,1 2.3 22,9 5,8 36,7 2,7 23,7 4,9 104.4 7.6 45.8 1.7

N385A: 11.8 48,4 3.5 35,6 3.4 59.7 4,3 38,6 2,7 145.6 10.6 63.8 1.1

L324Q: 8,2 37 2,7 27,2 3,0 49,8 3,6 32,2 2,3 94.8 6.9 41.6 1.2

L324H: 10.3 46,3 3.4 34,0 3,1 54,3 3,9 35,1 2,6 99.6 7.2 43.7 1.4

L324E: 7,1 65,6 4.8 48,2 1.5 56.8 4,1 36,7 1,7 102.4 7.4 44.9 1.0

L324D: 8,6 83,4 6.1 61,3 1.4 61 4,4 39,4 1,9 130.6 9.5 57.3 0.9

L324K: 8,0 46,9 3.4 34,5 2,4 69,4 5,0 44,9 1,6 127.1 9.2 55.7 0.9

L324N: 8,3 55,1 4,0 40,5 2,1 72,7 5,3 47,0 1,6 152.4 11.1 66.8 0.8

#Tasa: es para enzima 0,25 nM

El presente ejemplo demuestra que la actividad de exonucleasa 3' a 5' de una AON polimerasa termoestable o termoactiva mutante no puede predecirse a partir de las propiedades enzimáticas de las polimerasas EcoAON Poli mutantes análogas. La Tabla 7 presenta una comparación entre las actividades de exonucleasa 3' a 5' de los mutantes de polimerasa de Ronda II y de los mutantes Poli de E. coli análogos

Tabla 7

Comparación entre los mutantes de Poi I de E. coli* con la actividad correctora de errores residual de mutantes CS5 de Ronda II t (% del tipo salvaje

Mutación en E. coli: AON de doble cadena AON de cadena sencilla Mutación en CS5 AON de doble cadena AON de cadena sencilla

Y497A: 5,6% 2,9% Y464A 0,1% 0,1%

L361A: 4,0 37 L329A 7,8 10,7

0424E: 4,0 8,3 0389E 16,5 16,2

Q419A: 23 20 Q384A 23,7 22,9

*basado en Oerbyshire et al., Methods in Enzymology 262:363-85, 1995 t de la Tabla 6

Los resultados presentados en la Tabla 7 muestran que las mutaciones análogas en los dominios de exonucleasa 3' a 5' de las AON polimerasas Eco y CS% frecuentemente presentan efectos diferentes sobre la actividad correctora de errores de los enzimas, respecto a la actividad correspondiente del enzima de tipo salvaje. La comparación entre el mutante EcoQ419A con el mutante CS5 Q384A muestra que mutaciones análogas en estos dos enzimas pueden afectar a sus actividades de exonucleasa 3' a 5' de manera similar. Sin embargo, para algunos mutantes análogos, se observan diferencias significativas de actividad enzimática. En algunas parejas de mutantes esta diferencia es simplemente cuantitativa. Por ejemplo, el mutante EcoY497A presenta sustancialmente más actividad enzimática residual que la mutación CS5 Y464A en los sustratos tanto de AONbc como de AONmc. Otros mutantes análogos además muestran diferencias cualitativas. Por ejemplo, los mutantes EcoL361A y 0424E presentan ambos una actividad mucho mayor frente a un sustrato de AONmc que frente a un sustrato de AONbc. Sin embargo, los mutantes CS5 análogos (L329A y 0389E, respectivamente) presentan actividades enzimáticas residuales similares contra los sustratos tanto de AONmc como de AONbc.

Ejemplo 6: Utilización de las AON polimerasas termoestables mutantes con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada para la PCR

Los enzimas mutantes Y464E, 0389E, L329A, Q484A/N385A, Q384A, N385A Y L324Q se sometieron a ensayo para la actividad de transcriptasa inversa/PCR utilizando un ensayo de resistencia a fármacos contra el VIH. A modo de control se utilizó una mezcla de 120 unidades de CS6 (que no presenta actividad detectable de exonucleasa 3' a 5') y 5 unidades de CS5 (que presenta actividad de exonucleasa 3' a 5' de tipo salvaje). Se utilizaron las condiciones del ensayo de VIH r de 1,7 kb (tricina 50 mM, pH 8,3, KOAc 45 mM, pH 7,5, Mn(OAc)2 0,9 mM, OMSO al 5%, d(ACTC)TP 0,2 mM, dUTP 0,3 mM, dTTP 0,03 mM, 0,2 x verde SYBR 1, mezcla enzimática G46E CS5/CS6 (5/125 unidades) ó 60 ó 30 unidades de actividad de polimerasa de cada enzima mutante, 1 unidad de UNG y 0,4 _M de cada cebador (-1) 2'-amino-modificado (RN326 y RN328) Y termociclado cinético; ver Myerset et al., Antiviral Therapy 5: resumen nº 49, 2000) para amplificar específica y sensiblemente el gen de proteasa y los primeros 400 codones del gen de la transcriptasa inversa del VIH.

RN326: GAGGGGTATTGACAAACTCCCACTCAGGAATCXA (X=2'amino-dC) (SEC ID nº 83) RN328: GGGAATTTTCTTCAGAGCAGACCAGAGCCAAXA (X=2'amino-dC) (SEC ID nº 84)

Se utilizó un termociclador GENEAMP ™ 5700 SOS (PE Biosystems, Foster City, CA) siguiendo el protocolo de termociclado siguiente: 50ºC durante 2 minutos, 60ºC durante 60 minutos y 95ºC durante 1 minuto, seguido de 4 ciclos de 95ºC, 20 segundos, 58ºC 15 segundos, 65ºC 1 minuto 45 segundos, seguido de 36 ciclos de 90ºC 20 segundos, 58ºC 15 segundos, 65ºC 1 minuto 45 segundos, seguido de 65ºC 10 minutos mantenimiento. Las curvas de crecimiento de las amplificaciones por PCR se muestran en la figura 9. También se llevaron a cabo amplificaciones utilizando el mismo protocolo con diferentes cantidades de enzima y se analizaron utilizando la electroforesis en gel. Se cargaron 5 ¡.JI de cada reacción de 100 ¡.JI en un gel de agarosa al 1 % tras la PCR, que se llevó a cabo esencialmente tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, segunda edición, 1989. Los geles se tiñeron utilizando una solución 1 ¡.Jg/ml de bromuro de etidio. Se muestran los geles resultantes en la figura 10. En la figura 10, carriles 20, 40 Y48 = AON lambda digerido con Bst II

(New England Biolabs, Beverly, MA) como marcador de peso molecular; carriles 36 a 38 y 58 a 60= control negativo (5 U de CS5, 125 U de CS6, sin molde); carriles 33 a 35 y 55 a 57=control positivo (5 U de CS5, 125 U de CS6); carriles 1 a 3=60 U de Y464A CS5; carriles 4 a 6=30 U de Y464A CS5; carriles 7 a 9=60 U de 0389E CS5; carriles 10 a 12=30 U de 0389E CS5; carriles 13 a 15=60 U de L329A CS5; carriles 16 a 18=30 U de L329A CS5; carriles 21 a 23=60 U de 0384A-N385A CS5; carriles 24 a 26=30 U de 0384A-N385A CS5; carriles 27 a 29=60 U de 0384A CS5; carriles 30 a 32=30 U de 0384A CS5; carriles 41 a 43=60 U de N385A CS5; carriles 44 a 46=30 U de N385A CS5; carriles=49 a 51 =60 U de L3240 CS5; carriles 52 a 54=30 U de L3290 CS5 (en las que todas las unidades se refieren a la actividad de AON polimerasa).

Se juzgaron los enzimas mutantes a partir de sus valores de CT (figura 9) y de su rendimiento de productos de amplificación específicos y no específicos, detectados utilizando el análisis en gel de los productos de amplificación (figura 10). Estos resultados demuetsran que los mutantes con actividades correctoras de errores superiores al 3% aunque inferiores al 20% de los niveles del tipo salvaje (medidas utilizando el ensayo estándar descrito en el Ejemplo 3, anteriormente) funcionan mejor para la amplificación por transcripción inversa-PCR del molde de ARN del VIH de 1,7 kb. Estos mutantes también presentaban actividades específicas de entre 0,4 y 1,6 U/pmol, y una proporción de actividad de polimerasa a actividad de exonucleasa 3' a 5' superior a 6,0 aunque inferior a 25,0 U de pol./U de exo., midiendo las actividades enzimáticas tal como se describe en el Ejemplo 3, y rindieron resultados de PCR comparables a los obtenidos con la mezcla de CS5 y CS6. 0384A CS5 YN385A CS5 también funcionaron bien según el análisis en gel de sus productos de amplificación, aunque no tan bien según sus valores de CT.

Ejemplo 7: Identificación de los residuos diana para la mutagénesis sitio-dirigida para atenuar la actividad de exonucleasa 3' a 5' de las AON polimerasas termoestables o termoactivas de familia A

El presente ejemplo proporciona un método para identificar residuos en AON polimerasas termoestables o termoactivas de familia A que pueden mutarse y someterse a ensayo para identificar los mutantes con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada.

La estructura de rayos X de Poi I de E. coli acomplejada con AON en el sitio de exonucleasa 3' a 5' (ver Brautigan et al., J. Mol. Biol. 277:363-77, 1998) se analizó utilizando la funcionalidad "30>sequence contacts" del programa XAE (ver Higgins et al., Cabios 8:189-91, 1992) para identificar todos los residuos de la proteína seleccionada (Poi 1; 1 kfs.pdb, cadena A) que se encuentran a menos de 5 A del sustrato de AON (1 kfs.pdb, cadena B). Utilizando este método, se identificaron los residuos en la Tabla 8 en Poi I de E. coli. Los residuos análogos pueden identificarse en una AON polimerasa termoestable o termoactiva de familia A mediante inspección de una alineación de secuencias de las polimerasas (tal como se muestra en, por ejemplo, la figura 8). Estos residuos candidatos seguidamente pueden mutarse y someterse a ensayo para la actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada utilizando, por ejemplo, el ensayo estándar descrito en el Ejemplo 3, anteriormente.

Tabla 8 Residuos candidatos en Poi I de E. coli

0355: T356

E357: T358

S360: L361

0419: N420

K422: Y423

M443: R455

H456: 0457

M458: 0459

F473: E474

0483: F486

Y497: 0501

E541: S658

Y659: H660

Ejemplo 8: Identificación de mutantes de la AON polimerasa de familia B con actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada

Tal como se da a conocer en la presente memoria, el experto en la materia guiado por la presente exposición podrá preparar fácilmente un mutante de una AON polimerasa de familia A que presente una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada mediante, por ejemplo, la realización de mutaciones en su dominio de exonucleasa 3' a 5' que

corresponden a las mutaciones del dominio de exonucleasa 3' a 5' de la ADN polimerasa Tma descrita en la presente memoria. Dicho enfoque basado en las secuencias al diseño de mutantes de las ADN polimerasas de familia B con actividad correctora de errores atenuada sólo resulta de utilidad limitada debido a que la única región de similitud de secuencias significativa entre los dominios de exonucleasa 3' a 5' de la ADN polimerasa Tma y de la 5 ADN poilmerasa de familia B es el motivo de unión metálico "DXE". Sin embargo, los estudios cristalográficos de rayos X han demostrado que los dominios de exonucleasa 3' a 5' de las polimerasas de familia A y de familia B presentan estructuras tridimensionales similares. Ver Zhao et al., Structure Fold Des. 71 :1189-99, 1999; Karam et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 64:65-96, 2000; Hopfner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3600-5, 1999; Wang et al., Cell 89:1087-99, 1997. Por lo tanto, se desarrolló un método basado en la estructura con el fin de

10 identificar los residuos que pueden mutarse para producir las ADN polimerasas de familia B con actividad correctora de errores atenuada.

La figura 11 presenta una alineación de la ADN polimerasa Poi II de E. coli, una polimerasa de familia B, con las secuencias de algunas otras ADN polimerasas de familia B. En lugar de simplemente identificar aquellos residuos 15 que se encuentran conservados en la totalidad, o prácticamente en la totalidad, de dichas proteínas, bajo la premisa de que su conservación indica que resultan importantes para la función correctora, se examinó la estructura tridimensional del dominio de exonucleasa 3' a 5' de la ADN polimerasa de familia B aislada a partir del bacteriófago RB69 (Shamoo et al., Cell 99:155-66, 1999); estructura disponible del Protein Data Bank (Berman et al., Nucleic Acids Res. 28:235-42, 2000; www.pdb.org/) bajo PDB ID nº 1 CLQ) y se comparó con el dominio corrector de Tma. 20 Se identificaron todos los residuos en cada una de dichas proteínas que se había predicho que contactaban con los nucleótidos 3'-terminales de una secuencia de ADN de cadena sencilla unida al dominio corrector de errores. Se utilizó esta información y la alineación de secuencias en la figura 11 para identificar los residuos análogos en otras ADN polimerasas de familia B, tal como se muestra en la Tabla 9, posteriormente. Estos datos indican que las mutaciones en estas posiciones particulares resultarán en moléculas de ADN polimerasa con actividad de

25 exonucleasa 3' a 5' atenuada.

Tabla 9

Residuo en RB69: Residuo en Tgo Residuo en Pocl Residuo en KODI Función propuesta

F123: Y146 Y191 Y146 Apilado de anillos con base P(n-1)

F221: F214 F253 F214 Unión a azúcar de P(n-1)

S287: T272 M309 T272 Puentes de H con fosfodiéster entre P(n-1) y P(n-2)

Los ejemplos siguientes, tanto proféticos como reales, se proporcionan únicamente a título ilustrativo y no pretenden limitar el alcance de la invención reivindicada en modo alguno.

<110> F. Hoffmann-La Roche AG Roche Diagnostics GmbH

<120> MOLÉCULAS DE ADN POLlMERASA TERMOESTABLE O TERMOACTIVA CON ACTIVIDAD DE EXONUCLEASA 3' A 5' ATENUADA

<130> 21314 EP1-HS

<150> US 60/369,815

<151> 2002-04-02

<160> 203

<170> Patentln versión 3.2

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de motivo EXO II

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (1 ).. (2)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (3).. (3)

<223> Xaa es Cys o Leu

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (4).. (4)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (5).. (5)

<223> Xaa es Phe o Tyr

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (6).. (8)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (9).. (9)

<223> Xaa es lIe o Val

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (10).. (10)

<223> Xaa es Leu o Phe

<400> 1

Xaa Xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> motivo EXOlla de exonucleasa 5' a 3'

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (2).. (2)

<223> Xaa es Pro, Ala, Leu o Thr

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (3).. (3)

<223> Xaa es Leu o Met

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (4).. (4)

<223> Xaa es Leu o lIe

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (5).. (5)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (6).. (6) o Ser

<223> Xaa es Ala o Ser

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (8).. (8)

<223> Xaa es Leu, lIe o Val

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (9).. (9)

<223> Xaa es Leu o Trp

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (10).. (10)

<223> Xaa es Asp, Asn, Glu o Gln

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (11 ).. (11)

<223> Xaa es Pro o Ser

<400> 2

ASp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 W

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> motivo EXO III de exonucleasa 3' a 5'

<220>

<221> MISCJEATURE <222>(1) .. (1)

<223> Xaa es Pro o Ala

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (2) .. (2)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (3).. (3)

<223> Xaa es Glu, Asp o Pro

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (4).. (4)

<223> Xaa es Lys, Arg o Glu

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (5).. (6)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (9).. (9)

<223> Xaa es Ser, Ala o Cys

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (10).. (10)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (11 ).. (11)

<223> Xaa es Glu o Thr

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (12).. (12)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<400> 3

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa xaa Xaa xaa xaaXaa Xaa Ala

1 5 ro

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable <220>

<221> MISCJEATURE

<222> (2).. (2)

<223> Xaa es cualquier aminoácido o ningún aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (5) .. (5)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (7).. (7)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<400> 4

ASp Xaa Glu Thr Xaa Ser Xaa 1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (2).. (2)

<223> Xaa es cualquier aminoácido o ningún aminoácido

<400> 5

Asp Xaa Glu Thr Thr Ser Leu 1 5

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (2).. (2)

<223> Xaa es cualquier aminoácido o ningún aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (5) .. (5)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<400> 6

ASp Xaa Glu Thr Xaa Ser Leu 1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (2).. (2)

<223> Xaa es cualquier aminoácido o ningún aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (4) .. (5)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<400> 7

ASp Xaa Glu Xaa Xaa Ser Leu 1 5

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (2).. (2)

<223> Xaa es cualquier aminoácido o ningún aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (4).. (4)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<400> 8

ASp Xaa Glu Xaa Thr Ser Leu 1 5

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<400> 9 ASp Leu Glu Thr Ser Ser Leu 1 5

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<220> <221> MISCJEATURE

<222> (1) .. (2)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (3).. (3)

<223> Xaa es Cys o Leu

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (5) .. (5)

<223> Xaa es Phe o Tyr

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (6).. (8)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (9).. (9)

<223> Xaa es lIe o Val

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (10).. (10)

<223> Xaa es Leu o Phe

<400> 10

Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<220>

<221> MISCJEATURE <222>(1) .. (1)

<223> Xaa es cualquier residuo polar no cargado

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (2).. (2)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (3).. (3)

<223> Xaa es Cys o Leu

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (5).. (5)

<223> Xaa es Phe o Tyr

<220> <221> MISCJEATURE

<222> (6) .. (8)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (9).. (9)

<223> Xaa es lIe o Val

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (10) .. (10)

<223> Xaa es Leu o Phe

<400> 11

xaa xaa Xaa Lys Xaa xaa xaa xaa xaa Xaa 1 5 ro

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (1 ).. (2)

<223> Xaa es cualquier residuo polar no cargado

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (3).. (3)

<223> Xaa es Cys o Leu

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (5).. (5)

<223> Xaa es Phe o Tyr

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (6).. (8)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (9).. (9)

<223> Xaa es lIe o Val

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (10).. (10)

<223> Xaa es Leu o Phe

<400> 12

xaa Xaa xaa Lys xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa

1 5 ro

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (1 ).. (2)

<223> Xaa es cualquier residuo polar no cargado

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (3).. (3)

<223> Xaa es Cys o Leu

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (5) .. (5)

<223> Xaa es Phe o Tyr

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (6).. (6)

<223> Xaa es cualquier residuo ácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (7).. (8)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (9).. (9) o Val

<223> Xaa es lIe o Val

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (10).. (10)

<223> Xaa es Leu o Phe

<400> 13

Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 ro

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (1 ).. (2)

<223> Xaa es cualquier residuo polar no cargado <220>

<221> MISCJEATURE

<222> (3).. (3)

<223> Xaa es Cys o Leu

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (5).. (5)

<223> Xaa es Phe o Tyr

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (6).. (6)

<223> Xaa es cualquier residuo ácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (7).. (8)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (9).. (9)

<223> Xaa es lIe o Val

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (10).. (10)

<223> Xaa es Leu o Phe

<400> 14

Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (3).. (3)

<223> Xaa es Cys o Leu

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (5).. (5)

<223> Xaa es Phe o Tyr

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (7).. (8)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (9).. (9)

<223> Xaa is lIe o Val <220>

<221> MISCJEATURE

<222> (10).. (10)

<223> Xaa es Leu o Phe

<400> 15

Gln Asn Xaa Lys Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa 1 510

<210>16

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<400> 16

Gln Asn Leu Lys Phe ASp Tyr Lys val Leu

1 5 W

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<220>

<221> MISCJEATURE <222>(1) .. (1)

<223> Xaa es cualquier residuo no polar

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (2).. (2)

<223> Xaa es cualquier residuo polar no cargado

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (3).. (3)

<223> Xaa es Cys o Leu

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (5).. (5)

<223> Xaa es Phe o Tyr

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (6).. (6)

<223> Xaa es cualquier residuo ácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (7).. (8)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (9).. (9)

<223> Xaa es lIe o Val <220>

<221> MISCJEATURE

<222> (10).. (10)

<223> Xaa es Leu o Phe

<400> 17

xaa xaa xaa Lys Xaa xaa xaa Xaa xaa Xaa 1 5 ro

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (2).. (2)

<223> Xaa es cualquier residuo polar no cargado

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (3).. (3)

<223> Xaa es Cys o Leu

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (5).. (5)

<223> Xaa es Phe o Tyr

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (6).. (6)

<223> Xaa es cualquier residuo ácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (7).. (8)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (9).. (9)

<223> Xaa es lIe o Val

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (10).. (10)

<223> Xaa es Leu o Phe

<400> 18

Ala xaa xaa Lys xaa xaa xaa Xaa xaa xaa

1 5 ro

<210> 19

<211> 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 5 <223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<220>

<221> MISCJEATURE

<222>: (3).. (3) 1 O <223> Xaa es Cys o Leu

<220>

<221> MISCJEATURE

<222>: (5) .. (5) 15 <223> Xaa es Phe o Tyr

<220>

<221> MISCJEATURE

<222>: (7).. (8) 20 <223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222>: (9).. (9) 25 <223> Xaa es lIe o Val

<220>

<221> MISCJEATURE

<222>: (10).. (10) o Phe 30 <223> Xaa es Leu o Phe

<400> 19

Ala Asn Xaa Lys xaa ASp xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<400> 20

Ala Asn Leu Lys phe ASp Tyr Lys val Leu 1 5 10

<210> 21

<211> 10

<212> PRT 50 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

55 <220>

<221> MISCJEATURE <222>(1) .. (1)

<223> Xaa es cualquier aminoácido polar no cargado

60 <220>

<221> MISCJEATURE

<222> (2).. (2)

<223> Xaa es cualquier residuo no polar

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (3).. (3)

<223> Xaa es Cys or Leu

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (5).. (5)

<223> Xaa es Phe or Tyr

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (6).. (6)

<223> Xaa es cualquier residuo ácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (7).. (8)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (9).. (9)

<223> Xaa es lIe o Val

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (10).. (10)

<223> Xaa es Leu o Phe

<400> 21

xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 ro

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (3).. (3)

<223> Xaa es Cys o Leu

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (5) .. (5)

<223> Xaa es Phe o Tyr

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (7).. (8)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE <222> (9).. (9) o Val

<223> Xaa es lIe o Val

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (10).. (10)

<223> Xaa es Leu o Phe

<400> 22

Gln Ala Xaa Lys Xaa ASp Xaa Xaa Xaa xaa

1 5 W

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<400> 23

Gln Ala Leu Lys phe ASp Tyr Lys val Leu

1 5 ro

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (1 ).. (2)

<223> Xaa es cualquier residuo polar no cargado

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (3).. (3)

<223> Xaa es Cys o Leu

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (5).. (5)

<223> Xaa es Phe o Tyr

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (7).. (8)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (9).. (9)

<223> Xaa es lIe o Val

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (10).. (10)

<223> Xaa es Leu o Phe <400> 24

xaa Xaa Xaa Lys Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa

1 S ro

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (3).. (3)

<223> Xaa es Cys or Leu

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (5) .. (5)

<223> Xaa es Phe o Tyr

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (6).. (6)

<223> Xaa es cualquier residuo ácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (7).. (8)

<223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (9).. (9)

<223> Xaa es lIe o Val

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (10).. (10)

<223> Xaa es Leu o Phe

<400> 25

Gln Asn Xaa Lys Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 ro

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<400> 26

Gln Asn Leu Lys Phe Glu Tyr Lys val Leu

1 S ro

<210> 27

<211> 10 <220>

<212> PRT <213> Secuencia artificial

5: <220> <223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

1 O: <220> <221> MISCJEATURE <222> (1 ).. (2) <223> Xaa es cualquier residuo no polar

1 5: <220> <221> MISCJEATURE <222> (3).. (3) <223> Xaa es Cys o Leu

20: <220> <221> MISCJEATURE <222> (5).. (5) <223> Xaa es Phe o Tyr

25: <220> <221> MISCJEATURE <222> (6).. (6) <223> Xaa es cualquier residuo ácido

<221> MISCJEATURE

<222>: (7).. (8) 30 <223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222>: (9).. (9) 35 <223> Xaa es lIe o Val

<220>

<221> MISCJEATURE

<222>: (10).. (10) 40 <223> Xaa es Leu o Phe

<400> 27

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

Xaa xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa XaaXaa 1 5 10

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<220>: 55 <221> MISCJEATURE

<222> (3).. (3)

<223> Xaa es Cys o Leu

<220>: 60 <221> MISCJEATURE

<222> (5).. (5)

<223> Xaa es Phe o Tyr <220>

<221> MISCJEATURE

<222>: (7).. (8) 5 <223> Xaa es cualquier aminoácido

<220>

<221> MISCJEATURE

<222>: (9).. (9) 1 O <223> Xaa es lIe o Val

<220>

<221> MISCJEATURE

<222>: (10).. (10) 15 <223> Xaa es Leu o Phe

<400> 28

Ala Ala Xaa Lys Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa

1 S 10

20 <210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<400> 29

Ala Ala Leu Lys Phe ASp Tyr Lys val Leu

1 S 10

<210> 30

<211> 11

<212> PRT 35 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

40 <400> 30

ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu pro1 S ID

45 <210> 31

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

50 <220>

<223> Motivo EXO III de ADN polimerasa de la invención

<220>

<221>: MISCJEATURE 55 <222> (2).. (2)

<223> Xaa es Val Leu o lIe

<220>

<221>: MISCJEATURE 60 <222> (3).. (3)

<223> Xaa es Glu Asp o Pro

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (4).. (4)

<223> Xaa es Lys o Arg

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (5).. (6)

<223> Xaa es Ala o Val

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (7).. (7)

<223> Xaa es Glu o Asp

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (8).. (8)

<223> Xaa es cualquier aminoácido polar no cargado

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (9).. (9)

<223> Xaa es Ser o Cys

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (10).. (10)

<223> Xaa es Cys o Gly

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (11 ).. (11)

<223> Xaa es Glu o Thr

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (12).. (12)

<223> Xaa es Glu o Thr

<400> 31

Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa ASp Ala 1 S W

<210> 32

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<400> 32

Pro val Glu Lys Ala Ala ASp Tyr Ser Cys Glu Asp Ala

1 S W

<210> 33

<211> 13 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (2).. (2)

<223> Xaa es Val, Leu o lIe

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (3).. (3)

<223> Xaa es Glu, Asp o Pro

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (4).. (4)

<223> Xaa es Lys o Arg

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (5).. (6)

<223> Xaa es Ala o Val

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (7).. (7)

<223> Xaa es Glu o Asp

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (8).. (8)

<223> Xaa es cualquier aminoácido no polar

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (9).. (9)

<223> Xaa es Ser o Cys

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (10).. (10)

<223> Xaa es Cys o Gly

<220>

<221> MISCJEATURE

<222> (11 ).. (11)

<223> Xaa es Glu o Thr

<400> 33

Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa ASp Ala 1 5 10

<210> 34

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' de ADN polimerasa termoestable <400> 34

Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Ala Ser Cys Glu ASp Ala 1 5 ID

<210> 35

<211> 28

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 35 15

Gly Thr Ala Thr Gly Thr Ala Gly Thr Ala Cys Gly Cys Thr Thr cys 1 5 10 15

Cys Thr Thr Thr Gly Gly Thr Thr Thr Gly Ala Ala 20 25

<210> 36

<211> 23

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 36

Thr Gly Gly Cys Thr Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly Thr 1 5 10 15

Ala Cys Gly Gly Cys Cys Thr 20

<210> 37

<211> 11

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220> 35 <223> Cebador

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n es la posición degenerada, o 'a' o 't'

<400> 37 cgacgangag a 11

45 <210> 38

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<220> <221> misc_feature

<222> (9).. (9)

<223> n es la posición degenerada, o 'a' o 't'

<400> 38 tagctgctnc tctgatc 17

<210> 39

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 39 cgacgaagag a 11

<210> 40

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 40 tagctgcttc tctgatc 17

<210> 41

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 41 cgacgatgag a 11

<210> 42

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 42 tagctgctac tctgatc 17

<210> 43

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 43 tgatmaggaa a 11

<210> 44

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> misc_feature

<222> (7).. (7)

<223> n es posición degenerada, 'g' o 't'

<400> 44 taactantcc tttgatc 17

<210> 45

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 45 tgataaggaa a 11

<210> 46

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 46 taactattcc tttgatc 17

<210> 47

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 47 tgatcaggaa a 11

<210> 48

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 48 taactagtcc tttgatc 17

<210> 49

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador

<400> 49 cgatmatgaa a 11

<210> 50

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<220>

<221> misc_feature

<222> (7).. (7)

<223> n es posición degenerada, 't' o 'g'

<400> 50 tagctantac tttgatc 17

<210> 51

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 51 cgataatgaa a 11

<210> 52

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 52 tagctattac tttgatc 17

<210> 53

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 53 cgatcatgaa a 11

<210> 54

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador <400> 54 tagctagtac tttgatc 17

<210> 55

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 55 tgasctggat a 11

<210> 56

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 56 taactsgacc taagatc 17

<210> 57

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 57 tgacctggat a 11

<210> 58

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 58 taactggacc tatgatc 17

<210> 59

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 59 tgagctggat a

<210> 60

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 60 taactcgacc tatgatc: 17

<210> 61 <211> 11 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 61 tgagcttgag a: 11

<210> 62 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 62 taactcgaac tctgatc: 17

<210> 63 <211> 11 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 63 tgagcttgag a: 11

<210> 64 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 64 taactcgaac tctgatc: 17

<210> 65 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 65 gaaactagtt ccgctgatcctt tcga: 26

<210> 66

<211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 66

gaaaagagaa ggacatgagc tcttggtaa: 29

<210> 67 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 67

agaaaaagct gcgaatgcat cctgtgaaga tgcaga: 36

<210> 68 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 68 tttccagatc tgcctcgtgg agttttaa: 28

<210> 69 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 69

ctgcatcttc acaggatgca ttcgcagctt tttcta: 36

<210> 70 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 70

accaagagct catgtccttc tcttttccg: 29

<210> 71 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

5: <400> 71 cgttggtgcc gctctgaaat tcgattacaa 30

<210> 72 <211> 30 <212> DNA <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 72 tgtaatcgaa tttcaaattg gcaccaacga: 30

<210> 73 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 73 ggaaactagt tccctcgatc c: 21

<210> 74 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 74 cgttggtcag gccttgaaat tcgattacaa: 30

<210> 75 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 75 tgtaatcgaa tttcaaggcc tgaccaacga: 30

<210> 76 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 76

cgttggtgcc gctctgaaat tcgattacaa: 30

5: <210> 77 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 77 tgtaatcgaa tttcagagcg gcaccaacga: 30

15: <210> 78 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

25: <400> 78 tgaaattcga gtacaaggtg ttgatggtga a <210> 79 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial 31

<220> <223> Cebador

35: <400> 79 caacaccttg tactcgaatt tcaaa 25

<210> 80 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> sustrato oligonucleótido de cadena sencilla NJS40

45: <400> 80 gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca c 31

<210> 81 <211> 60 <212> ADN <213> Secuencia artificial

55: <220> <223> single-stranded oligonucleotide substrate NJS43 <400> 81 agcgatcccg cgaccgttca catcgccagt gcgacgcgca ttggtggtgt gggcggcgcc 60

<210> 82

<211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> sustrato oligonucleótido de cadena sencilla NJS44

<400> 82 agcgatcccg cgaccgttca catcgccagt tcgacgcgca ttggtggtgt gggcggcgcc

<210> 83

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador RN326

<220>

<221> misc_feature

<222> (33).. (33)

<223> n es una 2'-aminodesoxicitosina

<400> 83 gaggggtatt gacaaactcc cactcaggaa tcna 34

<210> 84

<211> 33

<212>ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador RN328

<220>

<221> misc_feature

<222> (32).. (32)

<223> n es una 2'-aminodesoxicitosina

<400> 84 gggaattttc ttcagagcag accagagcca ana 33

<210> 85 <211>893

<212> PRT

<213> Thermotoga maritima

<400> 85

Met Ala Arg Leu phe Leu Phe ASp Gly Thr Ala Leu Ala Tyr Arg Ala 1 5 10 15

Tyr Tyr Ala Leu ASp Arg Ser Leu Ser Thr Ser Thr Gly Ile pro Thr 20 25 30

Asn Ala Thr Tyr Gly Val Ala Arg Met Leu val Arg Phe Ile Lys ASp35 40 45

His Ile Ile val Gly Lys ASp Tyr val Ala val Ala Phe ASp Lys Lys 50 55 60

Ala Ala Thr phe Arg His Lys Leu Leu Glu Thr Tyr Lys Ala Gln Arg65 70 75 80

Pro Lys Thr Pro ASp Leu Leu Ile Gln Gln Leu Pro Tyr rle Lys Lys 85 90 95

Leu val Glu Ala Leu Gly Met LyS val Leu Glu val Glu Gly Tyr Glu 100 105 110

Ala Asp ASp rle Ile Ala Thr Leu Ala val Lys Gly Leu Pro Leu phe115 120 125

Asn Glu Lys rle Lys val Trp Arg rle val Lys Gly rle Ser ASp Leu 145 150 155 160

Glu Leu Tyr ASp Ala Gln Lys val Lys Glu Lys Tyr Gly val Glu Pro 165 170 175

Gln Gln rle Pro ASp Leu Leu Ala Leu Thr Gly ASp Glu rle ASp Asn 180 185 190

rle pro Gly val Thr Gly rle Gly Glu Lys Thr Ala val Gln Leu Leu 195 200 205

Glu Lys Tyr Lys ASp Leu Glu ASp rle Leu Asn His val Arg Glu Leu 210 215 220

Pro Gln Lys Val Arg Lys Ala Leu Leu Arg ASp Arg Glu Asn Ala rle 225 230 235 240

Leu Ser Lys Lys Leu Ala rle Leu Glu Thr Asn val pro rle Glu rle 245 250 255

Asn Trp Glu Glu Leu Arg Tyr Gln Gly Tyr ASp Arg Glu Lys Leu Leu 260 265 270

Pro Leu Leu Lys Glu Leu Glu Phe Ala Ser rle Met Lys Glu Leu Gln 275 280 285

Leu Tyr Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys ASp Leu 290 295 300

val Glu phe Glu LyS Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser pro Ser phe 305 310 315 320

Ala rle Asp Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro Phe Asp Cys ASp rle 325 330 335

val Gly rle Ser val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro 340 345 350

Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys 355 360 365

Lys Leu Lys Glu rle Leu Glu ASp pro Gly Ala Lys rle val Gly Gln 370 375 380

Asn Leu Lys Phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro 385 390 395 400

val Pro Pro Tyr Phe ASp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro

405 410 415

Asn Glu Lys Lys phe Asn Leu ASp Asp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly420 425 430

Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu 435 440 445

phe Gly phe Ser phe Ala ASp val pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr 450 455 460

Ser Cys Glu ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser 465 470 475 480

Leu LyS Leu His Glu Ala ASp Leu Glu Asn val phe Tyr Lys Ile Glu 485 490 495

Met Pro Leu Val Asn val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly val Tyr 500 505 510

val ASp Thr Glu Phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys 515 520 525

Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu Il e Tyr Arg Ile Ala Gly Glu Pro phe 530 535 540

Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln val Ser Arg Ile Leu phe Glu Lys Leu 545 550 555 560

Gly Ile Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly ASp Tyr Ser Thr 565 570 575

Arg Ile Glu val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu Ile Ile Pro 580 585 590

Leu rle Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile 595 600 605

ASp Ala Leu Pro Lys Met val Asn Pro Lys Thr Gly Arg Ile His Ala 610 615 620

Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp625 630 635 640

Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu Ile 645 650 655

Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile val Ser Ala 660 665 670

ASp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile Leu Ala His Leu Ser Gly ASp 675 680 685

Glu Asn leU leU Arg Ala Phe Glu Glu Gly rle ASp val His Thr leu 690 695 700

Thr Ala Ser Arg rle Phe Asn val lys Pro Glu Gl u val Thr Glu Glu 705 710 715 720

Met Arg Arg Ala Gly lys Met val Asn Phe Ser rle rle Tyr Gly val 725 730 735

Thr Pro Tyr Gly leu Ser val Arg leu Gly val Pro Val lys Glu Ala 740 745 750

Glu lys Met rle val Asn Tyr phe val leu Tyr Pro lys val Arg ASp 755 760 765

Tyr rle Gln Arg val val Ser Glu Ala lys Glu lys Gly Tyr val Arg 770 775 780

Thr leu Phe Gly Arg lys Arg ASP rle Pro Gln leu Met Ala Arg ASp 785 790 795 800

Arg Asn Thr Gln Ala Glu Gly Glu Arg rle Ala rle Asn Thr Pro rle 805 810 815

Gln Gly Thr Ala Ala ASp rle rle lys leu Ala Met rle Glu rle ASp820 825 830

Arg Glu Leu Lys Glu Arg lys Met Arg Ser Lys Met rle rle Gln val 835 840 845

His Asp Glu Leu Val Phe Glu val Pro Asn Glu Glu Lys Asp Ala Leu 850 855 860

val Glu leu val Lys ASp Arg Met Thr Asn val val Lys Leu Ser val 865 870 875 880

Pro leu Glu val ASp val Thr rle Gly lys Thr Trp Ser 885 890

<210> 86

<211> 196

<212> PRT 5 <213> Thermotoga maritima

<400> 86

Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys Asp Leu val Glu Phe

1 S 10 15

Glu Lys leu rle Glu Lys leu Arg Glu Ser Pro Ser phe Ala rle Asp 20 25 30

Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp pro Phe ASp Cys ASp rle val Gly rle

35: 40 45

Ser val 50: Ser phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile pro Leu 55 60 His His

Arg Asn Ala Gln Asn 65: Leu Asp Glu Lys Glu val 70 75 Leu Lys Lys Leu Lys80

Glu Ile Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys Ile val 85 90: Gly Gln Asn Leu 95 Lys

Phe ASp Tyr Lys val 100: Leu Met val Lys Gly val 105 Glu Pro val Pro Pro 110

Tyr phe ASp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu 115 UO: Leu Glu pro Asn Glu Lys U5

Lys phe Asn 130: Leu ASp ASp Leu Ala Leu 135 Lys phe Leu Gly Tyr Lys Met 140

Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu Phe Gly phe145 150 155 160

Ser Phe Ala Asp Val Pro val 165: Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys Glu 170 175

ASP Ala ASp Ile Thr Tyr Arg180: Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu 185 190

5: <210> 87 <211> 2682 <212> ADN His Glu Ala ASp195 <213> Thermotoga maritima

<400> 87

atggcgagac tatttctctt tgatggaact gctctggcct acagagcgta ctatgcgctc gatagatcgc tttctacttc caccggcatt cccacaaacg ccacatacgg tgtggcgagg atgctggtga gattcatcaa agaccatatc attgtcggaa aagactacgt tgctgtggct ttcgacaaaa aagctgccac cttcagacac aagctcctcg agacttacaa ggctcaaaga ccaaagactc cggatctcct gattcagcag cttccgtaca taaagaagct ggtcgaagcc cttggaatga aagtgctgga ggtagaagga tacgaagcgg acgatataat tgccactctg gctgtgaagg ggcttccgct ttttgatgaa atattcatag tgaccggaga taaagacatg cttcagcttg tgaacgaaaa gatcaaggtg tggcgaatcg taaaagggat atccgatctg gaactttacg atgcgcagaa ggtgaaggaa aaatacggtg ttgaacccca gcagatcccg gatcttctgg ctctaaccgg agatgaaata gacaacatcc ccggtgtaac tgggataggt gaaaagactg ctgttcagct tctagagaag tacaaagacc tcgaagacat actgaatcat: 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660

gttcgcgaac ttcctcaaaa ggtgagaaaa gccctgcttc gagacagaga aaacgccatt 720 ctcagcaaaa agctggcgat tctggaaaca aacgttccca ttgaaataaa ctgggaagaa 780 cttcgctacc agggctacga cagagagaaa ctcttaccac ttttgaaaga actggaattc 840 gcatccatca tgaaggaact tcaactgtac gaagagtccg aacccgttgg atacagaata 900 gtgaaagacc tagtggaatt tgaaaaactc atagagaaac tgagagaatc cccttcgttc 960 gccatagatc ttgagacgtc ttccctcgat cctttcgact gcgacattgt cggtatctct 1020 gtgtctttca aaccaaagga agcgtactac ataccactcc atcatagaaa cgcccagaac 1080 ctggacgaaa aagaggttct gaaaaagctc aaagaaattc tggaggaccc cggagcaaag 1140 atcgttggtc agaatttgaa attcgattac aaggtgttga tggtgaaggg tgttgaacct 1200 gttcctcctt acttcgacac gatgatagcg gcttaccttc ttgagccgaa cgaaaagaag 1260 ttcaatctgg acgatctcgc attgaaattt cttggataca aaatgacatc ttaccaagag 1320 ctcatgtcct tctcttttcc gctgtttggt ttcagttttg ccgatgttcc tgtagaaaaa 1380 gcagcgaact actcctgtga agatgcagac atcacctaca gactttacaa gaccctgagc 1440 ttaaaactcc acgaggcaga tctggaaaac gtgttctaca agatagaaat gccccttgtg 1500 aacgtgcttg cacggatgga actgaacggt gtgtatgtgg acacagagtt cctgaagaaa 1560 ctctcagaag agtacggaaa aaaactcgaa gaactggcag aggaaatata caggatagct 1620 ggagagccgt tcaacataaa ctcaccgaag caggtttcaa ggatcctttt tgaaaaactc 1680 ggcataaaac cacgtggtaa aacgacgaaa acgggagact attcaacacg catagaagtc 1740 ctcgaggaac ttgccggtga acacgaaatc attcctctga ttcttgaata cagaaagata 1800 cagaaattga aatcaaccta catagacgct cttcccaaga tggtcaaccc aaagaccgga 1860 aggattcatg cttctttcaa tcaaacgggg actgccactg gaagacttag cagcagcgat 1920 cccaatcttc agaacctccc gacgaaaagt gaagagggaa aagaaatcag gaaagcgata 1980 gttcctcagg atccaaactg gtggatcgtc agtgccgact actcccaaat agaactgagg 2040 atcctcgccc atctcagtgg tgatgagaat cttttgaggg cattcgaaga gggcatcgac 2100 gtccacactc taacagcttc cagaatattc aacgtgaaac ccgaagaagt aaccgaagaa 2160 atgcgccgcg ctggtaaaat ggttaatttt tccatcatat acggtgtaac accttacggt 2220 ctgtctgtga ggcttggagt acctgtgaaa gaagcagaaa agatgatcgt caactacttc 2280 gtcctctacc caaaggtgcg cgattacatt cagagggtcg tatcggaagc gaaagaaaaa 2340 ggctatgtta gaacgctgtt tggaagaaaa agagacatac cacagctcat ggcccgggac 2400 aggaacacac aggctgaagg agaacgaatt gccataaaca ctcccataca gggtacagca 2460 gcggatataa taaagctggc tatgatagaa atagacaggg aactgaaaga aagaaaaatg 2520 agatcgaaga tgatcataca ggtccacgac gaactggttt ttgaagtgcc caatgaggaa 2580 aaggacgcgc tcgtcgagct ggtgaaagac agaatgacga atgtggtaaa gctttcagtg 2640 ccgctcgaag tggatgtaac catcggcaaa acatggtcgt ga 2682

<210> 88

<211> 196

<212> PRT 5 <213> Thermotoga neapolitana

<400> 88

Glu Ala Glu Pro Thr Gly Tyr Glu rle val Lys ASp His Lys Thr Phe 1 5 10 15

Glu ASp Leu rle Glu Lys Leu Lys Glu val pro Ser phe Ala Leu ASp 20 25 30

Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro Phe Asn Cys Glu rle val Gly rle 35 40 45

Ser Val Ser Phe Lys Pro Lys Thr Ala Tyr Tyr rle pro Leu His His 50 55 60

Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Thr Leu Val Leu Ser Lys Leu Lys 65 70 75 80

Glu rle Leu Glu ASp Pro Ser Ser Lys rle val Gly Gln Asn Leu Lys 85 90 95

Tyr ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly rle Ser Pro val Tyr Pro 100 105 110

His Phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu Lys115 120 125

Lys Phe Asn Leu Glu ASp Leu Ser Leu Lys Phe Leu Gly Tyr Lys Met 130 135 140

Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Ser pro Leu phe Gly Phe

145 150 155 160

Ser phe Ala ASp val Pro val ASp Lys Ala Ala Asn Tyr Ser cys Glu 165 170 175

ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr LyS rle Leu Ser Met Lys Leu 180 185 190

His Glu Ala Glu 195

<210> 89

<211> 195 5 <212> PRT

<213> Thermosipho africanus

<400> 89

Lys Leu Glu Lys Glu Tyr rle Leu val ASP Asn Glu ASp Lys Leu Lys

1 5 10 15

Lys Leu Ala Glu Glu rle Glu Lys Tyr Lys Thr Phe Ser r1e ASp Thr

20 25 30

G1u Thr Thr Ser Leu ASp pro phe G1u Ala Lys Leu val G1y r1e Ser 35 40 45

r1e Ser Thr Met G1u G1y Lys Ala Tyr Tyr r1e pro val Ser His phe

50 55 60

G1y Ala Lys Asn r1e Ser Lys Ser Leu r1e ASp Lys Phe Leu Lys G1n

65 70 75 80

rle Leu G1n G1u Lys ASp Tyr Asn r1 e val G1y G1n Asn Leu Lys Phe 85 90 95

Asp Tyr G1u r1e phe Lys Ser Met G1y phe Ser pro Asn val pro His 100 105 110

Phe Asp Thr Met r1e Ala Ala Tyr Leu Leu Asn pro ASp G1u Lys Arg

115 UO US

phe Asn Leu G1u G1u Leu Ser Leu Lys Tyr Leu Gly Tyr Lys Met r1e 130 135 140

Ser Phe ASp G1u Leu val Asn G1u Asn val Pro Leu phe G1y Asn ASp 145 150 155 160

phe Ser Tyr val Pro Leu Glu Arg Ala val G1u Tyr Ser Cys G1u Asp165 170 175

Ala ASp Val Thr Tyr Arg r1 e Phe Arg Lys Leu G1y Arg Lys r1e Tyr

180 185 190

G1u Asn G1u 195

<210> 90

<211> 893 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa termoestable quimérica CS5 10

<400> 90

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu phe G1u Pro Lys G1y Arg val Leu Leu 1 S 10 15

val ASp G1y His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gln Ala val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASP Gly Tyr Lys Ala val phe 50 55 60

val val Phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu ASp phe Pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu ¡le Lys Glu Leu Val ASp Leu Leu Gly phe Thr Arg Leu 100 105 110

Glu val Pro Gly Phe Glu Ala ASp ASp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys

115 UO U5

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg ¡le Leu Thr Ala ASp Arg130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu val Ser ASp Arg val Ala val Leu His Pro Glu 145 150 155 160

Gly His Leu ¡le Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys 165 170 175

pro Glu Gln Trp val ASp phe Arg Ala Leu val Gly ASp Pro Ser ASp 180 185 190

Asn Leu Pro Gly val Lys Gly ¡le Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn ¡le Leu Lys Asn Leu ASp Arg 210 215 220

val Lys pro Glu Ser val Arg Glu Arg ¡le Lys Ala His Leu Glu ASp 225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser ASp Leu Pro Leu 245 250 255

Glu val ASp Phe Ala Arg Arg Arg Glu pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg260 265 270

Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly275 280 285

Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg ¡le val Lys ASp Leu 290 295 300

val Glu phe Glu Lys Leu ¡le Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe 305 310 315 320

Ala ¡le Asp Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro phe ASp Cys ASp ¡le

325 330 335 val Gly rle Ser val Ser phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro 340 345 350 Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu val Leu Lys 355 360 365 Lys Leu Lys Glu rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys rle val Gly Gln 370 375 380

Asn Leu Lys phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu pro 385 390 395 400 val pro Pro Tyr phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro

405 410 415 Asn Glu Lys Lys phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly420 425 430 Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser phe Ser phe pro Leu 435 440 445 phe Gly Phe Ser Phe Ala ASp Val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr

450 455 460

Ser Cys Glu ASp Ala ASp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser 465 470 475 480

Leu Lys Leu His Glu Ala ASp Leu Glu Asn val phe Tyr Lys rle Glu 485 490 495

Met Pro Leu val Asn val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly val Tyr 500 505 510

val ASp Thr Glu Phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys 515 520 525

Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu rle Tyr Arg Ile Ala Gly Glu pro phe 530 535 540

Asn rle Asn Ser Pro Lys Gln val Ser Arg rle Leu phe Glu Lys Leu 545 550 555 560

Gly rle Lys pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly ASp Tyr Ser Thr 565 570 575

Arg rle Glu val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu rle rle pro 580 585 590

Leu rle Leu Glu Tyr Arg Lys rle Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile 595 600 605

ASp Ala Leu Pro Lys Met val Asn pro Lys Thr Gly Arg rle His Ala 610 615 620

Ser phe Asn Gl n Th r Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp 625 630 635 640

pro Asn Leu Gln Asn Leu pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu rle 645 650 655

Arg Lys Ala rle val Pro Gln ASp Pro Asn Trp Trp Ile val Ser Ala 660 665 670

ASp Tyr Ser Gln rle Glu Leu Arg rle Leu Ala His Leu Ser Gly ASp675 680 685

Glu Asn Leu Leu Arg Ala Phe Glu Glu Gly Ile Asp Val His Thr Leu 690 695 700

Thr Ala Ser Arg rle phe Asn val Lys pro Glu Glu val Thr Glu Glu 705 710 715 720

Met Arg Arg Ala Gly Lys Met val Asn phe Ser rle rle Tyr Gly val 725 730 735

Thr Pro Tyr Gly Leu Ser val Arg Leu Gly val Pro val Lys Glu Ala 740 745 750

Glu Lys Met rle val Asn Tyr phe val Leu Tyr pro Lys val Arg ASp755 760 765

Tyr rle Gln Arg val val Ser Glu Ala Lys Glu Lys Gly Tyr val Arg770 775 780

Thr Leu phe Gly Arg Lys Arg ASp rle Pro Gln Leu Met Ala Arg ASp785 790 795 800

Arg Asn Thr Gln Ala Glu Gly Glu Arg rle Ala rle Asn Thr Pro rle 805 810 815

Gln Gly Thr Ala Ala ASp rle rle Lys Leu Ala Met rle Glu rle ASp820 825 830

Arg Glu Leu Lys Glu Arg Lys Met Arg Ser Lys Met rle rle Gln val 835 840 845

His ASp Glu Leu val Phe Glu Val Pro Asn Glu Glu Lys ASp Ala Leu 850 855 860

val Glu Leu val Lys ASp Arg Met Thr Asn val val Lys Leu Ser val 865 870 875 880

pro Leu Glu val ASp val Thr rle Gly Lys Thr Trp Ser

885 890

<210> 91 5 <211> 196

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Dominio exonucleolítico de ADN polimerasa de ADN polimerasa termoestable CS5

<400> 91

Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rl e val Lys ASp Leu val Glu phe 1 5 10 15

Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe Ala rle ASp20 25 30

Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro Phe ASp cys ASp rle val Gly rle 35 40 45

Ser val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro Leu His His 50 55 60

Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys Lys Leu Lys

65 70 75 80

Glu rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys rle val Gly Gln Asn Leu Lys85 90 95

Phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu pro val pro pro 100 105 110

Tyr Phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu Lys

115 UO U5

Lys Phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly Tyr Lys Met

130 135 140

Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu phe Gly Phe 145 150 155 160

Ser Phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys Glu 165 170 175

ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu 180 185 190

His Glu Ala ASp 195

<210> 92 5 <211> 291

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Residuos 1 a 291 de ADN polimerasa termoestable quimérica CS5 derivada de la ADN polimerasa z05

<400> 92

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

val ASp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe phe Ala Leu Lys Gly20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gln Ala Val Tyr Gly phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASp Gly Tyr Lys Ala val phe50 55 60

val val phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser phe Arg His Glu Ala Tyr Glu

65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu ASp Phe Pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu ¡le Lys Glu Leu val ASp Leu Leu Gly phe Thr Arg Leu 100 105 110

Glu val Pro Gly Phe Glu Ala ASp ASp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys115 UD U5

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg ¡le Leu Thr Ala ASp Arg 130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu val Ser ASp Arg val Ala val Leu His Pro Glu

145 150 155 160

Gly His Leu ¡le Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys165 170 175

Pro Glu Gln Trp val ASp phe Arg Ala Leu val Gly ASp Pro Ser ASp180 185 190

Asn Leu Pro Gly val Lys Gly rle Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn ¡le Leu Lys Asn Leu ASp Arg210 215 220

val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg rle Lys Ala His Leu Glu Asp

225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu pro Leu

245 250 255

Glu val ASp phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270

Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly 275 280 285

Leu Leu Glu 290

<210> 93 5 <211> 602

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia 292 a 893 de ADN polimerasa termoestable quimérica CS5 derivada de la ADN polimerasa Tma

<400> 93

Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys ASp Leu val Glu phe1 5 10 15

Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser phe Ala rle ASp20 25 30

Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro phe ASp Cys ASp rl e val Gly rle 35 40 45

Ser val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro Leu His His 50 55 60

Ar9 Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys Lys Leu Lys 65 70 75 80

Glu rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys rle val Gly Gln Asn Leu Lys 85 90 95

phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro val Pro Pro 100 105 110

Tyr Phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu Lys 115 120 125

Lys Phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly Tyr Lys Met 130 135 140

Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu phe Gly phe

145 ISO 155 160

Ser Phe Ala Asp Val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys Glu 165 170 175

Asp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu 180 185 190

His Glu Ala Asp Leu Glu Asn Val Phe Tyr Lys rle Glu Met Pro Leu

195 200 205 val Asn val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gl y val Tyr val ASp Thr 210 215 220

Glu phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys Leu Glu Glu 225 230 235 240 Leu Ala Glu Glu rle Tyr Arg rle Ala Gly Glu Pro phe Asn rle Asn

245 250 255 Ser Pro Lys Gln val Ser Arg rle Leu Phe Glu Lys Leu Gly rle Lys 260 265 270 pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly ASp Tyr Ser Thr Arg rle Glu 275 280 285 val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu rle rle Pro Leu rle Leu 290 295 300

Glu Tyr Arg Lys rle Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr rle ASp Ala Leu 305 310 315 320 Pro Lys Met val Asn Pro Lys Thr Gly Arg rle Hi s Ala Ser Phe Asn

325 330 335 Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser ASp Pro Asn Leu 340 345 350 Gln Asn Leu pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu rle Arg Lys Ala 355 360 365 rle val Pro Gln ASp pro Asn Trp Trp rl e val Ser Ala ASp Tyr Ser 370 375 380

Gln rle Glu Leu Arg rle Leu Ala His Leu Ser Gly ASp Glu Asn Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala phe Glu Glu Gly rle Asp Val His Thr Leu Thr Ala Ser

405 410 415 Arg rle Phe Asn val Lys pro Glu Glu val Thr Glu Glu Met Arg Arg 420 425 430 Ala Gly Lys Met val Asn Phe Ser rle rle Tyr Gly Val Thr Pro Tyr 435 440 445 Gly Leu Ser val Arg Leu Gly val Pro val Lys Glu Ala Glu Lys Met

450: 455 460

Ile val 465: Asn Tyr phe val Leu Tyr 470 Pro Lys val Arg ASp Tyr ¡le Gln 475 480

Arg val: Val Ser Glu Ala Lys Glu 485 Lys Gly Tyr Val 490 Arg Thr Leu 495 Phe

Gly Arg Lys Arg ASp ¡le pro Gln 500: Leu Met Ala Arg ASp Arg Asn Thr 505 510

Gln Ala Glu Gly Glu Arg ¡le Ala ¡le Asn Thr 515 520: Pro ¡le Gln Gly Thr 525

Ala Ala ASp ¡le Ile Lys530: Leu Ala Met Ile Glu 535 Ile ASp Arg Glu 540 Leu

Lys Glu Arg Lys Met Arg Ser Lys Met ¡le ¡le Gln Val 545 550 555: His ASp Glu 560

Leu Val: phe Glu val 565 Pro Asn Glu Glu Lys ASp Ala Leu val 570 Glu 575 Leu

val: Lys ASp Arg Met Thr Asn 58 val val 585 Lys Leu Ser val pro Leu Glu 590

val: ASp val Thr ¡le Gly Lys Thr Trp Ser 595 600

5: <210> 94 <211> 196 <212> PRT <213> Secuencia artificial

1 O: <220> <223> Dominio exonucleolítico mutagénesis mutación L329A de ADN polimerasa termoestable quimérica CS5 tras la segunda ronda de

Glu 1: Ser Glu Pro val 5 <400> 94 Gly Tyr Arg rle val 10 Lys ASp Leu val Glu 15 Phe

Glu: Lys Leu rle Glu 20 Lys Leu Arg Glu 25 Ser Pro Ser Phe Ala ¡le ASp 30

Leu: Glu Thr Ser Ser Ala ASP 35 pro 40 phe ASp cys ASp ¡le val 45 Gly ¡le

Ser val 50: Ser phe Lys pro Lys 55 Glu Ala Tyr Tyr rle Pro Leu 60 His His

Arg Asn 65: Ala Gln Asn Leu ASp Glu 70 Lys Glu Val 75 Leu Lys Lys Leu Lys 80

Glu rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys rle Val Gly Gln Asn Leu Lys85 90 95

Phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro val Pro Pro

roo ro5 1ro

Tyr Phe ASp Thr Met ¡le Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu Lys

115 120 125

Lys Phe Asn Leu Asp ASp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly Tyr Lys Met 130 135 140

Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser phe Ser phe Pro Leu phe Gly phe

145 150 155 160

Ser Phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys Glu 165 170 175

ASp Ala ASp ¡le Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu 180 185 190

His Glu Ala ASp

<210> 95

<211> 893

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína completa de ADN polimerasa termoestable quimérica CS5 tras la segunda ronda de mutagénesis 1 O mutación L329A

<400> 95

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Gl u Pro Lys Gly Arg val Leu Leu 1 5 10 15

val ASp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gln Ala val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala val Phe 50 55 60

val val phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu ¡le Lys Glu Leu val ASp Leu Leu Gly phe Thr Arg Leu

100 105

Gl u val Pro Gly Phe Glu Ala ASp Asp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys 115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Gl u val Arg 1le Leu Thr Ala ASp Arg 130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu Val Ser ASp Arg val Ala val Leu His Pro Glu 145 150 155 160

Gly His Leu 1le Thr Pro Gl u Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys 165 170 175

pro Glu Gln Trp val ASp phe Arg Ala Leu val Gly ASp Pro Ser ASp 180 185 190

Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly 1le Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn 1le Leu Lys Asn Leu ASp Arg210 215 220

val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg 1le Lys Ala His Leu Glu ASp225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu Pro Leu 245 250 255

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val ASp Thr Glu Phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys515 520 525

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5: <210> 96 <211> 196 <212> PRT <213> Secuencia artificial

1 O: <220> <223> Dominio exonucleolítico mutagénesis -mutación Q384A <400> 96 de ADN polimerasa termoestable quimérica CS5 tras la segunda ronda de

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~O U5 ~O

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<210> 97

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<213> Secuencia artificial

<220>

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~5 1m U5

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Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu Pro Leu 245 250 255

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5 <400> 98

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

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<223> Proteína completa de ADN polimerasa termoestable quimérica CS5 tras la segunda ronda de mutagénesis mutación N385A

<400> 99

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Leu Ala Leu rle Lys Gl u Leu val ASp Leu Leu Gly phe Thr Arg Leu 100 105 110

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Glu val ASp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg

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<223> Dominio exonucleolítico de la ADN polimerasa termoestable quimérica CS5 tras la segunda ronda de 1 O mutagénesis -mutación Q384A N385A

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Arg Asn Thr Gln Ala Glu Gly Glu Arg Ile Ala Ile Asn Thr Pro Ile 805 810 815

Gln Gly Thr Ala Ala ASp Ile Ile Lys Leu Ala Met Ile Glu Ile ASp820 825 830

Arg Glu Leu 835 Lys Glu Arg Lys Met Arg840 Ser Lys Met Ile Ile Gln val 845

His ASp Glu Leu val phe Glu val pro Asn Glu Glu Lys ASp Ala Leu 850 855 860

val Glu leu Val lys Asp Arg Met Thr Asn val val Lys Leu Ser val 865 870 875 880

pro Leu Glu val ASp val Thr Ile Gly Lys Thr Trp Ser 885 890

5: <210> 102 <211> 196 <212> PRT <213> Secuencia artificial

1 O: <220> <223> Dominio exonucleolítico mutagénesis -mutación D389E de la ADN polimerasa termoestable quimérica CS5 tras la segunda ronda de

<400> 102: Glu Ser Glu 1 Pro Val 5 Gly Tyr Arg Ile val 10 lys ASp Leu val Glu 15 phe

Glu: Lys leu Ile Glu 20 lys leu Arg Glu Ser 25 Pro Ser phe Ala Ile ASp30

leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp35: Pro 40 phe ASp Cys Asp Ile val 45 Gly Ile

Ser val Ser phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro Leu His His 50 55 60

Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys Lys Leu Lys 65 70 75 80

Glu rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys rle val Gly Gln Asn Leu Lys 85 90 95

Phe Glu Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro val Pro Pro 100 105 110

Tyr Phe ASP Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu Lys 115 120 125

Lys Phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly Tyr Lys Met 130 135 140

Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser phe pro Leu phe Gly phe 145 150 155 160

Ser Phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys Glu 165 170 175

ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu

~O ~5 ~O

His Glu Ala ASP 195

<210> 103

<211> 893

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína completa de ADN polimerasa termoestable quimérica CS5 tras la segunda ronda de mutagénesis 1 O mutación D389E

<400> 103

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Gl u Pro Lys Gly Arg val Leu Leu 1 5 10 15

val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr phe phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gln Ala val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45

Lys ~6r Leu Leu Lys Ala ~~u Lys Glu ASp Gly ¡br Lys Ala val phe

val val Phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg H;S Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu ASp Phe Pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu rle Lys Glu Leu val ASp Leu Leu Gly phe Thr Arg Leu 100 105 110

Glu val Pro Gly phe Glu Ala ASp ASp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg rle Leu Thr Ala ASp Arg130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu val Ser ASp Arg val Ala val Leu H;S Pro Glu 145 150 155 160

Gly H;S Leu rle Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys165 170 175

Pro Glu Gln Trp val ASp phe Arg Ala Leu val Gly ASp pro Ser ASp180 185 190

Asn Leu Pro Gly val Lys Gly rle Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn rle Leu Lys Asn Leu ASp Arg210 215 220

val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg rle Lys Ala H;s Leu Glu ASp 225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu Pro Leu 245 250 255

Glu Val ASp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270

Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu phe Gly Ser Leu Leu H;S Glu phe Gly275 280 285

Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys ASp Leu 290 295 300

val Glu phe Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser pro Ser Phe 305 310 315 320

Ala rle ASp Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp pro phe ASp Cys Asp rle 325 330 335

Val Gly rle Ser val Ser phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro

340 345

Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys 355 360 365

Lys Leu Lys Glu rle Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys rl e val Gly Gln 370 375 380

Asn Leu Lys phe Glu Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro 385 390 395 400

Val Pro Pro Tyr Phe Asp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro 405 410 415

Asn Glu Lys Lys phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly 420 425 430

Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser phe Ser phe Pro Leu 435 440 445

Phe Gly phe Ser phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr 450 455 460

Ser Cys Glu ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser

465 470 475 480

Leu Lys Leu His Glu Ala ASp Leu Glu Asn val phe Tyr Lys rle Glu 485 490 495

Met Pro Leu Val Asn val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly val Tyr 500 505 510

val ASp Thr Glu Phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys 515 520 525

Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu rle Tyr Arg rle Ala Gly Glu Pro Phe 530 535 540

Asn rle Asn Ser Pro Lys Gln val Ser Arg rle Leu Phe Glu Lys Leu 545 550 555 560

Gly rle Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly Asp Tyr Ser Thr 565 570 575

Arg rle Glu val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu Hi s Glu rle rle Pro 580 585 590

Leu rle Leu Glu Tyr Arg Lys rle Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr rle 595 600 605

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Arg Lys Ala rle val 660: Pro Gln ASp Pro Asn 665 Trp Trp rle val Ser Ala 670

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Glu Asn 690: Leu Leu Arg Ala Phe Glu Glu Gly 695 rle ASp val 700 His Thr Leu

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Glu Lys: Met Ile val 755 Asn Tyr Phe Val 760 Leu Tyr Pro Lys val 765 Arg ASp

Tyr ¡le Gln Arg val 770: val Ser Glu Ala Lys Glu 775 Lys Gly Tyr val Arg 780

Thr Leu 785: Phe Gly Arg Lys Arg ASp 790 Ile Pro Gln 795 Leu Met Ala Arg ASp 800

Arg Asn: Thr Gln Ala Glu 805 Gly Glu Arg Ile Ala Ile Asn Thr Pro Ile 810 815

Gln Gly Thr Ala Ala ASp 11 e 820: 11 e Lys 825 Leu Ala Met 1le Glu 1le ASp 830

Arg Glu: Leu 835 Lys Glu Arg Lys Met Arg Ser Lys 840 Met 1le rle Gln val 845

val Glu 865: Leu val Lys ASp Arg Met Thr Asn 870 Val val 875 Lys Leu Ser val 880

pro Leu: Glu val Asp val 885 Thr 1le Gly Lys Thr Trp Ser 890

5: <211>196 <212> PRT <210> 104 <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> Dominio exonucleolítico mutagénesis -mutación Y464A de la ADN polimerasa termoestable quimérica CS5 tras la segunda ronda de

<400> 104

Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser pro Ser Phe Ala Ile ASp 20 25 30

Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro Phe ASp Cys ASp Ile val Gly Ile 35 40 45

Ser val Ser Phe Lys pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro Leu His His 50 55 60

Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys Lys Leu Lys

65 70 75 80

Glu Ile Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys Ile Val Gly Gln Asn Leu Lys 85 90 95

phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro val Pro pro 100 105 110

Tyr phe ASp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu Lys115 120 125

Lys phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly Tyr Lys Met 130 135 140

Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser phe Ser Phe Pro Leu Phe Gly Phe 145 150 155 160

Ser phe Ala ASp val pro val Glu Lys Ala Ala Asn Ala Ser Cys Glu 165 170 175

ASp Ala ASp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu 180 185 190

His Glu Ala ASp 195

<210> 105

<211> 893 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína completa de ADN polimerasa termoestable quimérica CS5 tras la segunda ronda de mutagénesis 10 mutación Y464A

<400> 105

Met Lys Ala Met Leu pro Leu phe Glu Pro Lys Gly Arg val Leu Leu 1 5 10 15

val ASp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr phe phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gln Ala val Tyr Gly phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASp Gly Tyr Lys Ala val phe 50 55 60

val val phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu ASp Phe pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu rle Lys Glu Leu val ASp Leu Leu Gly phe Thr Arg Leu 100 105 110

Glu val Pro Gly Phe Glu Ala ASp ASp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys 115 UO U5

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg rle Leu Thr Ala ASp Arg 130 135 140

Asp Leu Tyr Gln Leu val Ser Asp Arg val Ala Val Leu His Pro Glu 145 150 155 160

Gly His Leu rle Thr pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys 165 170 175

Pro Glu Gln Trp val ASp Phe Arg Ala Leu val Gly ASp Pro Ser ASp 180 185 190

Asn Leu Pro Gly val Lys Gly rle Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn rle Leu Lys Asn Leu ASp Arg 210 215 220

val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg rle Lys Ala His Leu Glu ASp 225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu Pro Leu 245 250 255

Glu val ASp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg

260 265 270

Ala phe Leu Glu Arg Leu Glu phe Gly Ser Leu Leu His Glu phe Gly 275 280 285

Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys Asp Leu 290 295 300

val Glu phe Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser pro Ser phe 305 310 315 320

Ala rle ASp Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro Phe ASp Cys ASp rle 325 330 335

val Gly rle Ser val Ser Phe Lys pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro 340 345 350

Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys 355 360 365

Lys Leu Lys Glu rle Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys rle val Gly Gln 370 375 380

Asn Leu Lys phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro 385 390 395 400

val pro pro Tyr phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro 405 410 415

Asn Glu Lys Lys Phe Asn Leu Asp Asp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly 420 425 430

Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser phe Ser Phe Pro Leu 435 440 445

Phe Gly phe Ser phe Ala ASp Val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Ala 450 455 460

Ser Cys Glu Asp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser 465 470 475 480

Leu Lys Leu His Glu Ala ASp Leu Glu Asn Val Phe Tyr Lys rle Glu 485 490 495

Met Pro Leu val Asn val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly val Tyr 500 505 510

val ASp Thr Glu phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly LyS Lys 515 520 525

Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu rle Tyr Arg rle Ala Gly Glu Pro Phe 530 535 540

Asn rle Asn Ser Pro Lys Gln val Ser Arg rle Leu Phe Glu Lys Leu 545 550 555 560

Gly rle Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly ASp Tyr Ser Thr 565 570 575

Arg rl e Glu val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu rle rle Pro 580 585 590

Leu rle Leu Glu Tyr Arg Lys rle Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr rle 595 600 605

ASp Ala Leu Pro Lys Met val Asn pro Lys Thr Gly Arg rle His Ala 610 615 620

Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser ASp 625 630 635 640

Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu !le 645 650 655

Arg Lys Ala rle val pro Gln ASp pro Asn Trp Trp rle val Ser Ala 660 665 670

ASp Tyr Ser Gln rle Glu Leu Arg rle Leu Ala His Leu Ser Gly ASp 675 680 685

Glu Asn Leu Leu Arg Ala phe Glu Glu Gly rle ASp val His Thr Leu 690 695 700

Thr Ala Ser Arg rle Phe Asn val Lys Pro Glu Glu val Thr Glu Glu 705 710 715 720

Met Arg Arg Ala Gly Lys Met val Asn phe Ser rle rle Tyr Gly val 725 730 735

Thr Pro Tyr Gly Leu Ser val Arg Leu Gly val Pro val Lys Glu Ala 740 745 750

Glu Lys Met rle val Asn Tyr Phe val Leu Tyr Pro Lys val Arg ASp 755 760 765

Tyr rle Gln Arg val val Ser Glu Ala Lys Glu Lys Gly Tyr val Arg 770 775 780

Thr Leu Phe Gly Arg Lys Arg Asp rle Pro Gln Leu Met Ala Arg ASp785 790 795 800

Arg Asn Thr Gln Ala Glu Gly Glu Arg rle Ala rle Asn Thr Pro Ile 805 810 815

Gln Gly Thr Ala Ala ASp rle rle Lys Leu Ala Met rle Glu rle ASp

820 825 830

Arg Glu Leu Lys Glu Arg Lys Met Arg Ser Lys Met Ile Ile Gln val 835 840 845

His ASp Glu Leu val Phe Glu val Pro Asn Glu Gl u Lys Asp Ala Leu 850 855 860

val Glu Leu val Lys ASp Arg Met Thr Asn val val Lys Leu Ser val

865 870 875 880

Pro Leu Glu val ASp val Thr Ile Gly Lys Thr Trp Ser 885 890

<210> 106

<211> 2682 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácidos nucleicos codificante de la ADN polimerasa termoestable quimérica CS5 tras la segunda 10 ronda de mutagénesis

<400> 106

atgaaagcta tgttaccatt attcgaaccc aaaggccggg tcctcctggt ggacggccac 60 cacctggcct accgcacctt cttcgccctg aagggcctca ccacgagccg gggcgaaccg 120 gtgcaggcgg tttacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctgaagga ggacgggtac 180 aaggccgtct tcgtggtctt tgacgccaag gccccttcct tccgccacga ggcctacgag 240 gcctacaagg caggccgcgc cccgaccccc gaggacttcc cccggcagct cgccctcatc 300 aaggagctgg tggacctcct ggggtttact cgcctcgagg ttccgggctt tgaggcggac 360 gacgtcctcg ccaccctggc caagaaggcg gaaagggagg ggtacgaggt gcgcatcctc 420 accgccgacc gggaccttta ccagctcgtc tccgaccgcg tcgccgtcct ccaccccgag 480 ggccacctca tcaccccgga gtggctttgg gagaagtacg gccttaagcc ggagcagtgg 540 gtggacttcc gcgccctcgt gggggacccc tccgacaacc tccccggggt caagggcatc 600 ggggagaaga ccgccctcaa gctcctcaag gagtggggaa gcctggaaaa tatcctcaag 660 aacctggacc gggtgaagcc ggaaagcgtc cgggaaagga tcaaggccca cctggaagac 720 cttaagctct ccttggagct ttcccgggtg cgctcggacc tccccctgga ggtggacttc 780 gcccggaggc gggagcctga ccgggaaggg cttcgggcct ttttggagcg cttggagttc 840 ggcagcctcc tccacgagtt cggccttcta gaggagtccg aacccgttgg gtaccgtata 900 gttaaagacc tggttgaatt tgaaaaactc atagagaaac tgagagaatc tccttcgttc 960 gctatcgatt tggaaactag ttccctcgat cctttcgact gcgacattgt cggtatctct 1020 gtgtctttca aaccaaagga agcgtactac ataccactcc atcatagaaa cgcccagaac 1080 ctggacgaaa aagaggttct gaaaaagctc aaagaaattc tggaggaccc cggagcaaag 1140 atcgttggtc agaatttgaa attcgattac aaggtgttga tggtgaaggg tgttgaacct 1200 gttcctcctt acttcgacac gatgatagcg gcttaccttc ttgagccgaa cgaaaagaag 1260 ttcaatctgg acgatctcgc attgaaattt cttggataca aaatgacatc ttaccaagag 1320 ctcatgtcct tctcttttcc gctgtttggt ttcagttttg ccgatgttcc tgtagaaaaa 1380 gcagcgaact actcctgtga agatgcagac atcacctaca gactttacaa gaccctgagc 1440 ttaaaactcc acgaggcaga tctggaaaac gtgttctaca agatagaaat gccccttgtg 1500 aacgtgcttg cacggatgga actgaacggt gtgtatgtgg acacagagtt cctgaagaaa 1560 ctctcagaag agtacggaaa aaaactcgaa gaactggcag aggaaatata caggatagct 1620 ggagagccgt tcaacataaa ctcaccgaag caggtttcaa ggatcctttt tgaaaaactc 1680 ggcataaaac cacgtggtaa aacgacgaaa acgggagact attcaacacg catagaagtc 1740 ctcgaggaac ttgccggtga acacgaaatc attcctctga ttcttgaata cagaaagata 1800 cagaaattga aatcaaccta catagacgct cttcccaaga tggtcaaccc aaagaccgga 1860 aggattcatg cttctttcaa tcaaacgggg actgccactg gaagacttag cagcagcgat 1920 cccaatcttc agaacctccc gacgaaaagt gaagagggaa aagaaatcag gaaagcgata 1980 gttcctcagg atccaaactg gtggatcgtc agtgccgact actcccaaat agaactgagg 2040 atcctcgccc atctcagtgg tgatgagaat cttttgaggg cattcgaaga gggcatcgac 2100 gtccacactc taacagcttc cagaatattc aacgtgaaac ccgaagaagt aaccgaagaa 2160 atgcgccgcg ctggtaaaat ggttaatttt tccatcatat acggtgtaac accttacggt 2220 ctgtctgtga ggcttggagt acctgtgaaa gaagcagaaa agatgatcgt caactacttc 2280 gtcctctacc caaaggtgcg cgattacatt cagagggtcg tatcggaagc gaaagaaaaa 2340 ggctatgtta gaacgctgtt tggaagaaaa agagacatac cacagctcat ggcccgggac 2400 aggaacacac aggctgaagg agaacgaatt gccataaaca ctcccataca gggtacagca 2460 gcggatataa taaagctggc tatgatagaa atagacaggg aactgaaaga aagaaaaatg 2520 agatcgaaga tgatcataca ggtccacgac gaactggttt ttgaagtgcc caatgaggaa 2580 aaggacgcgc tcgtcgagct ggtgaaagac agaatgacga atgtggtaaa gctttcagtg 2640 ccgctcgaag tggatgtaac catcggcaaa acatggtcgt ga 2682

<210> 107

<211> 893 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa termoestable quimérica CS6 10

<400> 107

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

val ASp Gly Hi s His Leu Ala Tyr Arg Thr phe phe Ala Leu Lys Gly20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gl n Ala val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASp Gly Tyr Lys Ala val Phe 50 55 60

val val Phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala pro Thr Pro Glu ASp phe Pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu val ASp Leu Leu Gly phe Thr Arg Leu 100 105 110

Glu val Pro Gly phe Glu Ala ASp ASp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys 115 UO U5

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg Ile Leu Thr Ala ASp Arg130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu val Ser ASp Arg val Ala val "Leu His Pro Glu 145 150 155 160

Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys165 170 175

Pro Glu Gln Trp val ASp Phe Arg Ala Leu val Gly ASp Pro Ser ASp 180 185 190

Asn Leu Pro Gly val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu ASp Arg 210 215 220

val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg rle Lys Ala His Leu Glu ASp 225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu Pro Leu 245 250 255

Glu val ASp phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270

Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly 275 280 285

Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys ASp Leu 290 295 300

val Glu phe Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe 305 310 315 320 Ala 1le Ala Leu Ala Thr Ser Ser Leu ASp Pro Phe ASp cys ASp ¡le 325 330 335

val Gly 1le Ser Val Ser phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr ¡le Pro 340 345 350

Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys 355 360 365

Lys Leu Lys Glu ¡le Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys 11 e val Gly Gln 370 375 380

Asn Leu Lys phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu pro 385 390 395 400

val Pro Pro Tyr Phe Asp Thr Met ¡le Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro 405 410 415

Asn Glu Lys Lys phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly 420 425 430

Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser phe Ser phe Pro Leu 435 440 445

Phe Gly Phe Ser Phe Ala Asp Val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr 450 455 460

Ser cys Glu ASp Ala ASp 1le Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser 465 470 475 480

Leu Lys Leu His Glu Ala ASp Leu Glu Asn val phe Tyr Lys ¡le Glu 485 490 495

Met Pro Leu val Asn val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly val Tyr 500 505 510

val ASp Thr Glu phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys 515 520 525

Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu ¡le Tyr Arg ¡le Ala Gly Glu Pro Phe 530 535 540

Asn ¡le Asn Ser Pro Lys Gln val Ser Arg ¡le Leu phe Glu Lys Leu 545 550 555 560

Gly ¡le Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly ASp Tyr Ser Thr 565 570 575

Arg ¡le Glu val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu ¡le ¡le Pro 580 585 590

Leu ¡le Leu Glu Tyr Arg Lys 1le Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr ¡le

595 600

ASp Ala Leu pro Lys Met val Asn Pro Lys Thr Gly Arg rle H;S Ala 610 615 620

Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp 625 630 635 640

Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu rle 645 650 655

Arg Lys Ala rle val Pro Gln ASp Pro Asn Trp Trp rle val Ser Ala 660 665 670

ASp Tyr Ser Gln rle Glu Leu Arg rle Leu Ala H;S Leu Ser Gly ASp 675 680 685

Glu Asn Leu Leu Arg Ala Phe Glu Glu Gly rle Asp Val His Thr Leu 690 695 700

Thr Ala Ser Arg rle phe Asn val Lys Pro Glu Glu val Thr Glu Glu 705 710 715 720

Met Arg Arg Ala Gly Lys Met Val Asn Phe Ser rle rle Tyr Gly val 725 730 735

Thr Pro Tyr Gly Leu Ser val Arg Leu Gly val Pro val Lys Glu Ala 740 745 750

Glu Lys Met rl e val Asn Tyr phe val Leu Tyr Pro Lys val Arg ASp 755 760 765

Tyr rle Gln Arg val val Ser Glu Ala Lys Glu Lys Gly Tyr val Arg 770 775 780

Thr Leu phe Gly Arg Lys Arg ASp rle pro Gln Leu Met Ala Arg ASp 785 790 795 800

Arg Asn Thr Gln Ala Glu Gly Glu Arg rle Ala rle Asn Thr Pro rle 805 810 815

Gln Gly Thr Ala Ala ASp rl e 11 e Lys Leu Ala Met rle Glu rle ASp 820 825 830

Arg Glu Leu Lys Glu Arg Lys Met Arg Ser Lys Met rle rle Gl n val 835 840 845

His ASp Glu Leu val phe Glu val Pro Asn Glu Glu Lys ASp Ala Leu 850 855 860

val Glu Leu val Lys Asp Arg Met Thr Asn val val Lys Leu Ser Val 865 870 875 880

Pro Leu Glu val ASp val Thr rle Gly Lys Thr Trp Ser 885 890

<210> 108 5 <211>196

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Dominio exonucleolítico de ADN polimerasa termoestable quimérica CS6

<400> 108

Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys ASp Leu Val Glu Phe 1 5 10 15

Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser phe Ala rle Ala 20 2S 30

Leu Ala Thr Ser Ser Leu ASp Pro phe ASp Cys ASp rle Val Gl y rl e 35 40 45

Ser val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle pro Leu Hi s His 50 55 60

Arg AS" Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys Lys Leu Lys 65 70 75 80

Glu rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys rle val Gly Gln Asn Leu Lys 85 90 95

phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu pro val Pro Pro 100 105 110

Tyr Phe Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu Lys 115 120 125

Lys Phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly Tyr Lys Met 130 135 140

Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser phe Ser phe pro Leu phe Gly phe 145 150 155 160

Ser Phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys Glu 165 170 175

ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu 180 185 190

His Glu Ala ASp 195

<210> 109

<211> 291

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 10

<220>

<223> Residuos 1 a 291 de la ADN polimerasa termoestable quimérica CS6 derivada de la ADN polimerasa z05

<400> 109 15

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

val ASp Gly H;S H;S Leu Ala Tyr Arg Thr phe phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gln Ala Val Tyr Gly phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASp Gly Tyr Lys Ala val Phe 50 55 60

val val Phe ASp Ala L yS Ala pro Ser phe Arg H;S Glu Ala Tyr Glu

65 7O 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu ASp Phe pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu rle Lys Glu Leu Val ASp Leu Leu Gly phe Thr Arg Leu 100 105 110

Glu val Pro Gly Phe Glu Ala ASp ASp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg rle Leu Thr Ala ASp Arg 130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu Val Ser ASp Arg Val Ala Val Leu H;s Pro Glu

145 150 155 160

Gly H;S Leu rle Thr pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys 165 170 175

Pro Glu Gln Trp val ASp phe Arg Ala Leu val Gly ASp Pro Ser ASp180 185 190

Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly rle Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn rle Leu L~S Asn Leu ASp Arg 210 215 2 O

Val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg rle Lys Ala H;S Leu Glu ASp 225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser ASp Leu Pro Leu 245 250 255

Glu val ASp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270

Ala phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu H;s Glu Phe Gly 275 280 285

Leu Leu Glu 290

<210> 110 5 <211> 602

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Residuos 292 a 893 de la ADN polimerasa quimérica termoestable CS6 derivada ade la ADN polimerasa Tma

<400> 110

Glu Ser Glu Pro Val Gly Tyr Arg rle val Lys ASp Leu val Glu phe 1 5 10 15

Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser phe Ala rle Ala

20 25 30

Leu Ala Thr Ser Ser Leu Asp Pro Phe ASp cys ASp rl e val Gly rle

35 40 45

Ser val Ser phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro Leu His His 50 55 60

Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys Lys Leu Lys65 70 75 80

Glu rle Leu Glu ASp pro Gly Ala Lys rle val Gly Gln Asn Leu Lys85 90 95

phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro val Pro Pro 100 105 110

Tyr phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu pro Asn Glu Lys115 120 125

Lys phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly Tyr Lys Met 130 135 140

Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu phe Gly phe

145 150 155 160

Ser phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys Glu

165 170 175 Asp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu 180 185 190

His Glu Ala ASp Leu Glu Asn val Phe Tyr Lys Ile Glu Met pro Leu 195 200 205

val Asn val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly val Tyr val ASp Thr 210 215 220

Glu phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys Leu Glu Glu 225 230 235 240

Leu Ala Glu Glu Ile Tyr Arg Ile Ala Gly Glu pro phe Asn Ile Asn 245 250 255

Ser Pro Lys Gln val Ser Arg Ile Leu Phe Glu Lys Leu Gly Ile Lys 260 265 270

Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly ASp Tyr Ser Thr Arg rle Glu 275 280 285

val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu rle rle Pro Leu rle Leu 290 295 300

Glu Tyr Arg Lys rle Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr rle ASp Ala Leu 305 310 315 320

Pro Lys Met val Asn Pro Lys Thr Gly Arg rle His Ala Ser Phe Asn 325 330 335

Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser ASp Pro Asn Leu 340 345 350

Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu rle Arg Lys Ala 355 360 365

rle Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp rl e val Ser Ala Asp Tyr Ser 370 375 380

Gln rle Glu Leu Arg rle Leu Ala His Leu Ser Gly ASp Glu Asn Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala phe Glu Glu Gly rl e ASp val His Thr Leu Thr Ala Ser 405 410 415

Arg rl e Phe Asn val Lys Pro Glu Glu val Thr Glu Glu Met Arg Arg420 425 430

Ala Gly Lys Met Val Asn phe Ser rle Ile Tyr Gly Val Thr Pro Tyr 435 440 445

Gly Leu Ser val Arg Leu Gly Val Pro Val Lys Glu Ala Glu Lys Met

450: 455 460

rle val 465: Asn Tyr phe val Leu 470 Tyr Pro Lys val Arg Asp Tyr475 rle Gln 480

Arg val: val Ser Glu Ala Lys 485 Glu Lys Gly Tyr val Arg Thr 490 Leu 495 phe

Gly Arg Lys Arg ASp 500: rle pro Gln Leu Met Ala Arg ASp Arg Asn 505 510 Thr

Gln: Ala Glu Gly Glu Arg rle Ala rle Asn Thr 515 520 Pro rle Gln Gly Thr 525

Ala Ala ASp530: rle rle Lys Leu 535 Ala Met rle Glu rle ASp Arg Glu 540 Leu

Lys545: Glu Arg Lys Met Arg Ser 550 Lys Met rle Ile Gln Val 555 His Asp Glu 560

Leu: val Phe Glu val 565 Pro Asn Glu Glu Lys Asp Ala Leu 570 Val Glu 575
Leu

val: Lys ASp Arg Met Thr Asn 580 val val 585 Lys Leu Ser val Pro 590 Leu Glu

val: ASp val Thr 595 rle Gly Lys Thr Trp Ser 600

5: <210> 111 <211> 196 <212> PRT <213> Secuencia artificial

1 O: <220> <223> Dominio exonucleolítico de la ADN polimerasa mutagénesis-sustitución DEE de los residuos 323 a 325 termoestable quimérica CS6 tras la primera ronda de

Glu Ser Glu 1: Pro val 5 <400> 111 Gly Tyr Arg Ile val 10 Lys Asp Leu val Glu 15 Phe

Glu Lys: Leu rle Glu 20 Lys Leu Arg Glu 25 Ser pro Ser Phe Ala rle ASp30

Glu Glu Thr Ser Ser Leu ASp35: Pro 40 Phe Asp Cys Asp Ile val 45 Gly Ile

Ser Val 50: Ser phe Lys Pro Lys 55 Glu Ala Tyr Tyr rle Pro Leu 60 His Hi s

Arg Asn Ala Gln Asn 65: Leu ASp Glu 70 Lys Glu Val 75 Leu Lys Lys Leu Lys 80

Glu rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys rle val Gly Gln Asn Leu Lys85 90 95

Phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro val pro Pro 100 105 110

Tyr Phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu Lys115 120 125

Lys Phe Asn Leu Asp Asp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly Tyr Lys Met 130 135 140

Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser phe Pro Leu phe Gly Phe 145 150 155 160

Ser phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser cys Glu 165 170 175

ASp Ala ASp rle Thr Ty~ Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu 180 185 190

His Glu Ala ASp 195

<210> 112

<211> 893

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa termoestable quimérica CS6 tras la primera ronda de mutagénesis -sustitución DEE de los 1 O residuos 323 a 325

<400> 112

Met Lys Ala Met Leu pro Leu phe Glu Pro Lys Gly Arg val Leu Leu 1 5 10 15

val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu pro val Gln Ala val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASp Gly Tyr Lys Ala val Phe 50 55 60

val val phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr pro Glu ASp phe Pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu rle Lys Glu Leu val ASp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu

100 105 110

Glu val pro Gly phe Glu Ala ASp ASp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg rle Leu Thr Ala Asp Arg 130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu val Ser ASp Arg val Ala val Leu His pro Glu 145 150 155 160

Gly His Leu rle Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys 165 170 175

pro Glu Gln Trp val ASp phe Arg Ala Leu val Gly ASp Pro Ser ASp180 185 190

Asn Leu Pro Gly val Lys Gly rle Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn rle Leu Lys Asn Leu ASp Arg210 215 220

val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg rle Lys Ala His Leu Glu ASp225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu Pro Leu 245 250 255

Glu val ASp phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270

Ala phe Leu Glu Arg Leu Glu phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly 275 280 285

Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro Val Gly Tyr Arg rle val Lys Asp Leu 290 295 300

val Glu Phe Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe 305 310 315 320

Ala rle Asp Glu Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro phe Asp Cys Asp rle 325 330 335

val Gly rle Ser val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro 340 345 350

Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys 355 360 365

Lys Leu Lys Glu rle Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys rle val Gly Gln 370 375 380

Asn LeU LyS Phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro 385 390 395 400

Val Pro Pro Tyr phe ASp Thr Met 1le Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro 405 410 415

Asn Glu Lys Lys Phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly420 425 430

Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu 435 440 445

Phe Gly phe Ser Phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr450 455 460

Ser cys Glu ASp Ala ASp 1le Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser 465 470 475 480

Leu Lys Leu His Glu Ala Asp Leu Glu Asn Val Phe Tyr Lys 1le Glu

485 490 495 Met pro Leu val Asn val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly val Tyr500 505 510 val ASp Thr Glu phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys515 520 525 Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu 1le Tyr Arg rle Ala Gly Glu Pro Phe

530 535 540

Asn 1le Asn Ser Pro Lys Gln val Ser Arg rle Leu Phe Glu Lys Leu 545 550 555 560 Gly 1le Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly Asp Tyr Ser Thr

565 570 575 Arg 1le Glu val Leu Gl u Gl u Leu Ala Gly Glu Hi s Glu 1le rle Pro 580 585 590 Leu rle Leu Glu Tyr Arg Lys rle Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr rle 595 600 605 ASp Ala Leu Pro Lys Met val Asn Pro Lys Thr Gly Arg 1le His Ala

610 615 620 Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser ASp

625 630 635 640

pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu rle 645 650 655

Arg Lys Ala rle val pro Gln ASp Pro Asn Trp Trp 11 e val Ser Ala

660 665 670

Asp Tyr Ser Gln Ile Glu LeU Arg Ile Leu Ala His Leu Ser Gly ASp 675 680 685

Glu Asn Leu Leu Arg Ala Phe Glu Glu Gly Ile ASp val His Thr Leu 690 695 700

Thr Ala Ser Arg Ile phe Asn Val Lys pro Glu Gl u val Thr Glu Glu 705 710 715 720

Met Arg Arg Ala Gly Lys Met val Asn Phe Ser Ile Ile Tyr Gly val 725 730 735

Thr Pro Tyr Gly Leu Ser val Arg Leu Gly val Pro val Lys Glu Ala 740 745 750

Glu Lys Met Ile val Asn Tyr phe val Leu Tyr Pro Lys val Arg Asp 755 760 765

Tyr Ile Gln Arg val val Ser Glu Ala Lys Glu Lys Gly Tyr Val Arg 770 775 780

Thr Leu Phe Gly Arg Lys Arg Asp Ile Pro Gln Leu Met Ala Arg ASp785 790 795 800

Arg Asn Thr Gln Ala Glu Gly Glu Arg Ile Ala Ile Asn Thr Pro Ile

805 810 815

Gln Gly Thr Ala Ala Asp Ile Ile Lys Leu Ala Met Ile Glu Ile ASp820 825 830

Arg Glu Leu Lys Glu Arg Lys Met Arg Ser Lys Met Ile Ile Gln val 835 840 845

His Asp Glu Leu val Phe Glu val Pro Asn Glu Glu Lys ASp Ala Leu 850 855 860

val Glu Leu val Lys ASp Arg Met Thr Asn val val Lys Leu Ser val 865 870 875 880

Pro Leu Glu val ASp val Thr Ile Gly Lys Thr Trp Ser

885 890

<210> 113

<211> 196

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominio exonucleolítico de ADN polimerasa quimérica CS6 tras la primera ronda de mutagénesis -sustitución 1 O DDE de los residuos 323 a 325

<400> 113

Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys ASp Leu val Glu phe

1 S 10 15

Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser phe Ala rle ASp20 25 30

ASp Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro phe ASp cys ASp rle val Gly rle 35 40 45

Ser val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro Leu His His SO 55 60

Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu val Leu Lys Lys Leu Lys

65 70 75 80

Glu rle Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys rle Val Gly Gln Asn Leu Lys 85 90 95

Phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro val Pro Pro 100 105 110

Tyr Phe ASp Thr Met ¡le Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu Lys115 120 125

Lys Phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly Tyr Lys Met 130 135 140

Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu Phe Gly Phe

145 ISO 155 160

Ser Phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys Glu H5 UD U5

ASp Ala ASp ¡le Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu 180 185 190

His Glu Ala ASp 195

<210> 114

<211> 893

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa termoestable quimérica CS6 tras la primera ronda de mutagénesis sustitución DDE de 1 O residuos 323 a 325

<400> 114

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu phe Glu Pro Lys Gly Arg val Leu Leu 1 5 10 15

val ASp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr phe Phe Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu pro val Gln Ala val Tyr Gly phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASp Gly Tyr Lys Ala Val Phe 50 55 60

val val phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu rle Lys Glu Leu val ASp Leu Leu Gly phe Thr Arg Leu 100 105 110

Glu val Pro Gly phe Glu Ala ASp ASp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg rle Leu Thr Ala ASp Arg130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu val Ser Asp Arg val Ala Val Leu His Pro Glu 145 150 155 160

Gly His Leu rle Thr pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys165 170 175

Pro Glu Gln Trp val ASp phe Arg Ala Leu val Gly ASp Pro Ser ASp180 185 190

Asn Leu pro Gly val Lys Gly rle Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn rle Leu Lys Asn Leu Asp Arg210 215 220

val Lys pro Glu Ser val Arg Glu Arg ¡le Lys Ala His Leu Glu ASp225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu Pro Leu 245 250 255

Glu Val Asp phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg260 265 270

Ala phe Leu Glu Arg Leu Glu phe Gly Ser Leu Leu His Glu phe Gly275 280 285

Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys Asp Leu 290 295 300

Ala ¡le Asp ASp Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro phe ASp Cys ASp Ile 325 330 335

val Gly Ile Ser val Ser phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro 340 345 350

Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys355 360 365

Lys Leu Lys Glu rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys rl e val Gly Gln 370 375 380

Asn Leu Lys phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly Val Glu Pro 385 390 395 400

val pro Pro Tyr phe ASp Thr Met ¡le Ala Ala Tyr Leu Leu Glu pro 405 410 415

Asn Glu Lys Lys phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly420 425 430

Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu 435 440 445

Phe Gly Phe Ser Phe Ala ASp val pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr450 455 460

Ser Cys Glu ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser 465 470 475 480

Leu Lys Leu His Glu Ala Asp Leu Glu Asn val phe Tyr Lys rle Glu

485 490 495

Met Pro Leu Val Asn val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly val Tyr 500 505 510

val ASp Thr Glu phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys515 520 525

Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Tyr Arg Ile Ala Gly Glu pro phe

530 535 540

Asn rle Asn Ser Pro Lys Gln val Ser Arg rle Leu Phe Glu Lys Leu 545 550 555 560

Gly rle Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly Asp Tyr Ser Thr 565 570 575

Arg rle Glu val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu Ile rle pro

580: 585 590

Leu 1le Leu Glu Tyr Arg Lys 1le Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr 1le 595 600 605

ASp Ala Leu 610: Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg 1le His Ala 615 620

Ser phe Asn Gln Thr G1y Thr Ala Thr G1y Arg Leu Ser Ser Ser ASp 625 630 635 640

Pro Asn Leu G1n Asn Leu Pro Thr Lys Ser G1u G1u G1y Lys G1u 11e 645 650 655

Arg Lys Ala 11 e val 660: Pro G1n Asp Pro Asn Trp Trp 11e Val Ser Ala 665 670

ASp Tyr Ser G1n I1e G1u Leu Arg 11e Leu Ala His Leu Ser G1y Asp675 680 685

G1u Asn Leu Leu Arg Ala Phe G1u G1u G1y 11e ASp val 690 695 700: His Thr Leu

Thr Ala Ser Arg I1e Phe Asn Val 705 710: Lys Pro Glu G1u val Thr G1u G1u 715 720

Met Arg Arg Ala G1y Lys Met val Asn phe Ser I1e 11e Tyr G1y val 725 730 735

Thr Pro Tyr G1y Leu Ser Val 740: Arg Leu G1y val 745 Pro val Lys G1u Ala 750

G1u Lys Met 11 e Val Asn Tyr phe val 755 760: Leu Tyr Pro Lys val Arg ASp765

Tyr 11e G1n Arg Val val Ser G1u Ala Lys Glu Lys G1y Tyr Val Arg770 775 780

Thr Leu 785: phe G1y Arg Lys Arg ASp I1e Pro G1n Leu Met Ala Arg ASp 790 795 800

Arg Asn Thr G1n Ala G1u G1y Glu Arg I1e Ala I1e Asn Thr Pro 11e 80S 810 815

G1n G1y Thr Ala Ala ASp 11e 11e Lys Leu Ala Met 11e G1u I1e ASp 820 825 830

Arg G1u Leu Lys G1u Arg Lys Met Arg Ser Lys Met 11e 1le G1 n val 835 840 845

His ASp G1u 850: Leu Val Phe G1u val 855 pro Asn G1u G1u Lys Asp Ala Leu 860

val G1u Leu val 865: Lys Asp Arg Met Thr Asn val val 870 875 Lys Leu Ser val 880

Pro Leu G1u val Asp val 885: Thr 11e G1y Lys Thr Trp Ser 890

<210> 115

5: <211> 196

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominio exonucleolítico de la ADN polimerasa termoestable quimérica CS6 tras la primera ronda de mutagénesis -sustitución DKE de los residuos 323 a 325

<400> 115

Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rl e val Lys Asp Leu val Glu phe 1 5 10 15

Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser pro Ser Phe Ala rle ASp20 25 30

Lys Glu Thr Ser Ser Leu Asp Pro phe ASp cys Asp rl e val Gly rle 35 40 45

Ser val Ser phe Lys pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle pro Leu His His 50 55 60

Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys Lys Leu Lys65 70 75 80

Glu rle Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys rl e val Gly Gln Asn Leu Lys 85 90 95

Phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro val Pro Pro 100 105 110

Tyr phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu Lys 115 120 125

Lys phe Asn Leu ASp ASP Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly Tyr LyS Met 130 135 140

Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu phe Gly Phe 145 150 155 160

Ser phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys Glu 165 170 175

ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu 180 185 190

His Glu Ala ASp

10 <210>116

<211> 893

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<223> ADN polimerasa termoestable quimérica CS6 tras la primera ronda de mutagénesis -sustitución DKE de los residuos 323 a 325

20 <400> 116

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15

val ASp Gly H;S H;S Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gl n Ala Val Tyr Gly phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASp Gly Tyr Lys Ala val phe 50 55 60

val val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser phe Arg H;S Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu ASp Phe Pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu 100 105 110

Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala LysliS UO U5

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg Ile Leu Thr Ala ASp Arg 130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu val Ser ASp Arg val Ala val Leu H;s pro Glu 145 150 155 160

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Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu ASp Arg210 215 220

val Lys pro Glu Ser val Arg Glu Arg rle Lys Ala His Leu Glu ASp 225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu Pro Leu 245 250 255

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Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys ASp Leu 290 295 300

val Glu phe Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser phe 305 310 315 320

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val Gly rle Ser val Ser phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro 340 345 350

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Lys Leu Lys Glu rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys rle Val Gly Gln 370 375 380

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Leu Lys Leu His Glu Ala Asp Leu Glu Asn val Phe Tyr Lys rle Glu 485 490 495

Met pro Leu val Asn val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly val Tyr

500 505 510

val ASp Thr Glu phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys 515 520 525

Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu ¡le Tyr Arg ¡le Ala Gly Glu Pro Phe 530 535 540

Gly ¡le Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly Asp Tyr Ser Thr 565 570 575

Arg ¡le Glu val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu ¡le ¡le pro 580 585 590

Leu ¡le Leu Glu Tyr Arg Lys ¡le Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr ¡le 595 600 605

ASp Ala Leu pro Lys Met val Asn pro Lys Thr Gly Arg ¡le His Ala 610 615 620

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pro Asn Leu Gln Asn Leu pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu ¡le645 650 655

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Tyr ¡le Gln Arg val val Ser Glu Ala Lys Glu Lys Gly Tyr val Arg770 775 780

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5: <210> 117 <211> 196 <212> PRT <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> Dominio exonucleolítico of ADN polimerasa termoestable mutagénesis -sustitución DNE de los residuos 323 a 325 quimérica CS6 tras la primera ronda de

<400> 117

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115 120 125

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<210> 118

<211> 893

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa termoestable quimérica CS6 tras la primera ronda de mutagénesis residues-sustitución DNE

de los residuos 323 a 325 10

<400> 118

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1 5 10 15

val ASp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr phe phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gln Ala val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala val phe 50 55 60

val val phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu ASp phe pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu rle Lys Glu Leu val ASp Leu Leu Gly phe Thr Arg Leu 100 105 110

Glu val Pro Gly Phe Glu Ala ASp Asp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys 115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg rle Leu Thr Ala ASp Arg 130 135 140

ASp LeU Tyr Gln Leu val Ser ASp Arg val Ala val Leu His Pro Glu 145 150 155 160

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Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn rle Leu Lys Asn Leu ASp Arg 210 215 220

val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg rle Lys Ala His Leu Glu ASp

225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu Pro Leu 245 250 255

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5: <210> 119 <211> 196 <212> PRT <213> Secuencia artificial

1 O: <220> <223> Dominio exonucleolítico of ADN polimerasa termoestable mutagénesis -sustitución DQE de los residuos 323 a 325 quimérica CS6 tras la primera ronda de

<400> 119

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<210> 120

<211> 893

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa termoestable quimérica CS6 tras la primera ronda de mutagénesis -sustitución DQE de los 1 O residuos 323 a 325

<400> 120

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Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gln Ala val Tyr Gly phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASp Gly Tyr Lys Ala val phe

50 55 60

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Leu Ala Leu rle Lys Glu Leu val ASp Leu Leu Gly phe Thr Arg Leu

100 105 110

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Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro Val Gly Tyr Arg rle val Lys ASp Leu 290 295 300

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340 345 350

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5: <210>121 <211> 196 <212> PRT <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> Dominio exonucleolítico of ADN polimerasa termoestable mutagénesis -sustitución DHE de los residuos 323 a 325 quimérica CS6 tras la primera ronda de

<400> 121

1 5 10 15

Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser phe Ala rle ASp 20 25 30

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~~g Asn Ala Gln Asn ~6u Asp Glu Lys Glu ~5l Leu Lys Lys Leu ~Ds

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Tyr Phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu Lys115 120 125

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<210> 122

<211> 893

<212> PRT

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<220>

<223> ADN polimerasa termoestable quimérica CS6 tras la primera ronda de mutagénesis -sustitución DHE de los 1 O residuos 323 a 325

<400> 122

Met Lys Ala Met Leu pro Leu phe Glu Pro Lys Gly Arg val Leu Leu 5 10 15

val ASp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr phe phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gln Ala val Tyr Gly phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala val phe50 55 60

val val phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

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Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu 100 105 110

Glu val pro Gly phe Glu Ala ASp ASp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys

115 UO U5

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg Ile Leu Thr Ala ASp Arg130 135 140

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Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu ASp Arg 210 215 220

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Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu Pro Leu 245 250 255

Glu val ASp phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg

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Ala phe Leu Glu Arg Leu Glu phe Gly Ser Leu Leu His Glu phe Gly 275 280 285

Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg ¡le val Lys ASp Leu 290 295 300

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Leu rle Leu Glu Tyr Arg Lys rle Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr rle 595 600 605

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Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser ASp 625 630 635 640

Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu rle 645 650 655

Arg Lys Ala rle val pro Gln ASp pro Asn Trp Trp rle val Ser Ala 660 665 670

ASp Tyr Ser Gln rle Glu Leu Arg rle Leu Ala His Leu Ser Gly ASp675 680 685

Glu Asn Leu Leu Arg Ala Phe Glu Glu Gly rle ASp val His Thr Leu 690 695 700

Thr Ala Ser Arg rle phe Asn val Lys pro Glu Glu val Thr Glu Glu 705 710 715 720

Met Arg Arg Ala Gly Lys Met val Asn Phe Ser rle rle Tyr Gly val 725 730 735

Thr Pro Tyr Gly Leu Ser val Arg Leu Gly val Pro val Lys Glu Ala 740 745 750

Glu Lys Met rle val Asn Tyr phe val Leu Tyr Pro Lys val Arg ASp755 760 765

Tyr rle Gln Arg val val Ser Glu Ala Lys Glu Lys Gly Tyr val Arg770 775 780

Thr Leu phe Gly Arg Lys Arg ASp rle Pro Gln Leu Met Ala Arg ASp785 790 795 800

Arg Asn Thr Gln Ala Glu Gly Glu Arg rle Ala rle Asn Thr Pro rle 805 810 815

Gln Gly Thr Ala Ala ASp rle rle Lys Leu Ala Met rle Glu rle ASp

820 825 830

Arg Glu: Leu 835 Lys Glu Arg Lys Met Arg Ser 840 Lys Met rle rle Gln val 845

Pro: Leu Gl u val Asp val 885 Thr rle Gly Lys Thr Trp Ser 890

5: <210> 123 <211> 196 <212> PRT <213> Secuencia artificial

1 O: <220> <223> Dominio exonucleolítico of ADN polimerasa termoestable mutagénesis -sustitución DLD de los residuos 323 a 325 <400> 123 quimérica CS6 tras la primera ronda de

Glu Ser Glu 1: Pro val 5 Gly Tyr Arg rle val 10 Lys ASp Leu val Glu 15 phe

Glu: Lys Leu rle Glu 20 Lys Leu Arg Glu Ser 25 pro Ser phe Ala rle ASp30

Leu ASp Thr Ser Ser 35: Leu ASp Pro 40 Phe ASp cys ASp rle val 45 Gly rle

Ser val 50: Ser Phe Lys Pro Lys55 Glu Ala Tyr Tyr rle Pro Leu 60 His His

Arg Asn 65: Ala Gln Asn Leu 70 ASp Glu Lys Glu val 75 Leu Lys Lys Leu Lys80

Glu: rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys85 rle val 90 Gly Gln Asn Leu 95 Lys

Tyr phe ASp Thr Met 115: rle Ala Ala Tyr Leu UO Leu Glu pro Asn U5 Glu Lys

Lys: Phe Asn 130 Leu ASP ASp Leu Ala Leu 135 Lys phe Leu Gly Tyr LyS 140 Met

Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe 145 Ser Phe Ala ASp val 165 150 Pro val Glu Lys Ser phe Pro Leu phe Gly Phe 155 160 Ala Ala Asn Tyr Ser cys Glu 170 175

ASP Ala ASp rle Thr 180 Tyr Arg: Leu Tyr 185 Lys Thr Leu Ser Leu Lys190 Leu

15: His Glu Ala ASp195

<210> 124

<211> 893

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220> 55

<223> ADN polimerasa termoestable quimérica CS6 tras la primera ronda de mutagénesis -sustitución DLD de los

residsuos 323 a 325 10

<400> 124

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu phe Gl u pro Lys Gly Arg val Leu Leu

1 5 10 15 val ASp Gly H;s H;S Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gln Ala val Tyr Gly phe Ala

35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASp Gly Tyr Lys Ala Val Phe 50 55 60

val val phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg H;s Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80 Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr pro Glu ASp phe Pro Arg Gln

85 90 95 Leu Ala Leu rle Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu

100 105 110

Gl u val Pro Gly Phe Glu Ala ASp ASp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys 115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Gl u val Arg rle Leu Thr Ala ASp Arg130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu val Ser ASp Arg val Ala val Leu H;S pro Glu

145 150 155 160

Gly H;S Leu rle Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys

165 170 175 Pro Glu Gln Trp val Asp Phe Arg Ala Leu val Gly ASp pro Ser ASp

180 185 190

Asn Leu Pro Gly val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu ASp Arg 210 215 220

val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu ASP 225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu Pro Leu 245 250 255

Glu val ASp Phe Ala Arg Arg Arg Glu pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270

Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly 275 280 285

Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg Ile val Lys ASp Leu 290 295 300

Val Glu Phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe 305 310 315 320

Ala Ile ASp Leu ASp Thr Ser Ser Leu ASp Pro Phe ASp Cys ASp Ile 325 330 335

val Gly Ile Ser val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile pro 340 345 350

Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys 355 360 365

Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys Ile Val Gly Gln 370 375 380

Asn Leu Lys Phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro 385 390 395 400

val Pro Pro Tyr phe ASp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro 405 410 415

Asn Glu Lys Lys Phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly 420 425 430

Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser phe Ser Phe Pro Leu 435 440 445

Phe Gly Phe Ser phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr 450 455 460

Ser cys Glu ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser 465 470 475 480

Leu Lys Leu His Glu Ala Asp Leu Glu Asn Val Phe Tyr Lys ¡le Glu 485 490 495

Met pro Leu val Asn val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly val Tyr 500 505 510

Val ASp Thr Glu phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys 515 520 525

Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu rle Tyr Arg ¡le Ala Gly Glu Pro Phe 530 535 540

Asn ¡le Asn Ser Pro Lys Gln val Ser Arg rle Leu Phe Glu Lys Leu 545 550 555 560

Gly rle Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly ASp Tyr Ser Thr 565 570 575

Arg rle Glu val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu rle rle pro 580 585 590

Leu rle Leu Glu Tyr Arg Lys rle Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr rle 595 600 605

ASp Ala Leu Pro Lys Met val Asn Pro Lys Thr Gly Arg rle His Ala 610 615 620

Ser phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser ASp 625 630 635 640

Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu rle 645 650 655

Arg Lys Ala rle val Pro Gln ASp Pro Asn Trp Trp rle val Ser Ala 660 665 670

ASp Tyr Ser Gln rle Glu Leu Arg ¡le Leu Ala His Leu Ser Gly Asp675 680 685

Glu Asn Leu Leu Arg Ala phe Glu Glu Gly rle Asp Val His Thr Leu 690 695 700

Met Arg Arg Ala Gly Lys Met val Asn phe Ser rle rle Tyr Gly val 725 730 735

Thr pro Tyr Gly Leu Ser val Arg Leu Gly val Pro val Lys Glu Ala

740 745 750

Glu: Lys Met 755 rl e val Asn Tyr Phe val 760 Leu Tyr pro Lys val 765 Arg Asp

Tyr: rle Gln Arg val 770 val Ser Glu Ala Lys775 Glu Lys Gly Tyr val 780 Arg

Arg Asn: Thr Gln Ala Glu Gly Glu Arg rle Ala rle Asn Thr 805 810 Pro 815 rle

Gln Gly Thr Ala Ala ASp820: rle rle Lys825 Leu Ala Met rle Glu rle 830 ASp

Arg Glu: Leu 835 Lys Glu Arg Lys Met Arg Ser Lys840 Met rle rle Gln 845 val

Pro Leu Glu val: ASp val 885 Thr rle Gly Lys Thr Trp Ser 890

5: <210> 125 <211> 196 <212> PRT <213> Secuencia artificial

1 O: <220> <223> Dominio exonucleolítico of ADN polimerasa termoestable mutagénesis -sustitución ELD de los residuos 323 a 325 quimérica CS6 tras la primera ronda de

<400> 125: Glu Ser Glu 1 Pro val 5 Gly Tyr Arg rl e val 10 Lys ASp Leu val Glu 15 Phe

Glu: Lys Leu rle Glu 20 Lys Leu Arg Glu Ser 25 Pro Ser Phe Ala rle Glu 30

Leu ASp Thr Ser Ser Leu ASp35: Pro 40 phe ASp cys ASp rl e val 45 Gly rle

Ser val 50: Ser Phe Lys Pro Lys55 Glu Ala Tyr Tyr rle Pro Leu 60 His His

Arg Asn 65: Ala Gln Asn Leu 70 ASp Glu Lys Glu Val 75 Leu Lys Lys Leu Lys80

Glu rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys rl e Val Gly Gln Asn Leu Lys85 90 95

phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro val Pro Pro 100 105 110

Tyr phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu Lys

115 120 125

Lys Phe Asn Leu Asp Asp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly Tyr Lys Met 130 135 140

Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser phe Ser phe Pro Leu Phe Gly Phe 145 150 155 160

Ser Phe Ala Asp Val Pro Val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser cys Glu 165 170 175

ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu 180 185 190

His Glu Ala ASp 195

<210> 126

<211> 893

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa termoestable quimérica CS6 tras la primera ronda de mutagénesis -sustitución ELD de los 1 O residuos 323 a 325

<400> 126

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

val ASp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu pro val Gl n Al a Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala val phe SO 55 60

Val val phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala pro Thr Pro Glu ASp Phe Pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu rle Lys Glu Leu Val ASp Leu Leu Gly phe Thr Arg Leu

100 105 110 Glu val Pro Gly phe Glu Ala ASp ASp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg Ile Leu Thr Ala ASp Arg

130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu val Ser ASp Arg val Ala val Leu His Pro Glu 145 150 155 160

Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys165 170 175

pro Glu Gln Trp val ASp phe Arg Ala Leu val Gly ASp Pro Ser ASp 180 185 190

Asn Leu Pro Gly val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu ASp Arg210 215 220

val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu ASp225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu Pro Leu 245 250 255

Glu val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg260 265 270

Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu phe Gly Ser Leu Leu His Glu phe Gly 275 280 285

Leu Leu Glu Glu Ser Glu pro val Gly Tyr Arg Ile val Lys ASp Leu 290 295 300

val Glu phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser pro Ser phe 305 310 315 320

Ala Ile Glu Leu Asp Thr Ser Ser Leu ASp Pro Phe Asp Cys Asp Ile 325 330 335

val Gly Ile Ser val Ser Phe Lys pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro 340 345 350

Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys 355 360 365

Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys Ile val Gly Gln 370 375 380

Asn LeU LyS Phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro 385 390 395 400

Val Pro Pro Tyr phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro 405 410 415

Asn Glu Lys Lys phe Asn Leu ASp Asp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly 420 425 430

Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser phe Ser phe Pro Leu 435 440 445

Phe Gly phe Ser phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr 450 455 460

Ser cys Glu ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser 465 470 475 480

Leu Lys Leu His Glu Ala ASp Leu Glu Asn val phe Tyr Lys rl e Glu 485 490 495

Met Pro Leu val Asn val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly val Tyr500 505 510

val ASp Thr Glu phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys515 520 525

Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu rle Tyr Arg rle Ala Gly Glu Pro Phe 530 535 540

Asn rle Asn Ser Pro Lys Gln val Ser Arg rle Leu phe Glu Lys Leu 545 550 555 560

Gly rle Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly ASP Tyr Ser Thr 565 570 575

Arg rle Glu val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu rle rle Pro 580 585 590

Leu rle Leu Glu Tyr Arg Lys rle Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr rle 595 600 605

ASp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg rle His Ala 610 615 620

Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser ASp625 630 635 640

Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu rle 645 650 655

Arg Lys Ala rle val pro Gln ASp Pro Asn Trp Trp Ile val Ser Ala

660: 665 670

ASp Tyr Ser Gln 675: Ile Glu Leu Arg680 rle Leu Ala His Leu Ser Gly ASp685

Glu Asn Leu 690: Leu Arg Ala Phe Glu 695 Glu Gly Ile ASp val 700 His Thr Leu

Thr Ala Ser Arg705: rle phe Asn 710 val Lys Pro Glu 715 Glu val Thr Glu Glu 720

Met Arg Arg Ala Gly Lys725: Met val Asn Phe Ser rle Ile Tyr Gly val 730 735

Glu Lys: Met 755 Ile val Asn Tyr phe val 760 Leu Tyr Pro Lys765 val Arg ASp

Tyr Ile Gln Arg val 770: val Ser Glu Ala Lys775 Glu Lys Gly Tyr Val 780 Arg

Thr Leu 785: phe Gly Arg Lys Arg ASp790 Ile Pro Gln 795 Leu Met Ala Arg Asp800

Arg Asn: Thr Gln Ala Glu 805 Gly Glu Arg Ile Ala rle Asn Thr Pro rle 810 815

Gln Gly Thr Ala Ala ASp820: Ile rle Lys825 Leu Ala Met Ile Glu ¡le ASp830

Pro Leu: Glu val Asp val 885 Thr ¡le Gly Lys Thr Trp Ser 890

5: <210> 127 <211>196 <212> PRT <213> Secuencia artificial

1 O: <220> <223> Dominio exonucleolítico of ADN polimerasa termoestable mutagénesis -sustitución ELE de los residuos 323 a 325 <400> 127 quimérica CS6 tras la primera ronda de

Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys ASp Leu val Glu Phe

1 5 10 15

Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe Ala Ile Glu 20 25 30

Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro phe ASp cys ASp rl e val Gly Ile 35 40 45

Ser val Ser phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro Leu His His 50 55 60

Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu Val Leu Lys Lys Leu Lys65 70 75 80

Glu Ile Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys Ile val Gly Gln Asn Leu Lys85 90 95

phe Asp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro val Pro Pro 100 105 110

Tyr Phe Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu Lys115 120 125

Lys Phe Asn Leu Asp ASp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly Tyr Lys Met 130 135 140

Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu phe Gly phe 145 150 155 160

Ser phe Ala Asp Val Pro Val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys Glu 165 170 175

ASp Ala ASp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu

~O ~5 ~O

His Glu Ala Asp 195

<210> 128

<211> 893

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa termoestable quimérica CS6 tras la primera ronda de mutagénesis -sustitución ELE de los 1 O residuos 323 a 325

<400> 128

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg val Leu Leu 1 5 10 15

val ASp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe phe Ala Leu Lys Gly20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gln Ala val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASp Gly Tyr Lys Ala val phe 50 55 60

val val Phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala pro Thr Pro Glu ASp Phe Pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu rle Lys Glu Leu val ASp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu

roo ro5 liO

Glu val Pro Gly phe Glu Ala ASp ASp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys li5 UO U5

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Gl u Val Arg rle Leu Thr Ala ASp Arg 130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu val Ser ASp Arg val Ala val Leu His Pro Glu 145 150 155 160

Gly His Leu rle Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys 165 170 175

Pro Glu Gln Trp val ASp Phe Arg Ala Leu val Gly Asp Pro Ser ASp 180 185 190

Asn Leu Pro Gly val Lys Gly rle Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn rle Leu Lys Asn Leu ASp Arg 210 215 220

val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg rle Lys Ala His Leu Glu ASp225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu Pro Leu 245 250 255

Glu Val ASp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg260 265 270

Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu phe Gly Ser Leu Leu His Glu phe Gly 275 280 285

Leu Leu Glu Glu Ser Glu pro Val Gly Tyr Arg rle val Lys ASp Leu 290 295 300

val Glu phe Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser pro Ser phe 305 310 315 320

Ala rle Glu Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro phe ASp Cys ASp rle 325 330 335

val Gly rle Ser val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro 340 345 350

Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu val Leu Lys 355 360 365

Lys Leu Lys Glu rle Leu Glu ASp pro Gly Ala Lys rle val Gly Gln 370 375 380

Asn Leu Lys phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro 385 390 395 400

val Pro pro Tyr Phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro 405 410 415

Asn Glu Lys Lys Phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly 420 425 430

Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser phe Ser phe pro Leu 435 440 445

phe Gly phe Ser phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr450 455 460

Ser Cys Glu ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser 465 470 475 480

Leu Lys Leu His Glu Ala ASp Leu Glu Asn val Phe Tyr Lys rle Glu 485 490 495

Met Pro Leu val Asn val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly val Tyr 500 505 510

val ASp Thr Glu phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys 515 520 525

Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu rle Tyr Arg rle Ala Gly Glu Pro Phe 530 535 540

Asn rle Asn Ser Pro Lys Gln val Ser Arg rle Leu phe Glu Lys Leu 545 550 555 560

Gly rle Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly ASp Tyr Ser Thr 565 570 575

Arg rle Glu val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu rle rle pro

580: 585 590

Leu rle Leu Glu Tyr Arg Lys rle Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr rle 595 600 605

Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu rle 645 650 655

ASp Tyr Ser Gln rle Glu Leu Arg rle Leu Ala His Leu Ser Gly ASp675 , 680 685

Thr Ala Ser Arg rle phe Asn val 705 710: Lys Pro Glu Glu val 715 Thr Glu Glu 720

Met Arg Arg Ala Gly Lys Met val 725: Asn phe Ser ¡le ¡le Tyr Gly val 730 735

Glu Lys Met rle val 755: Asn Tyr phe val 760 Leu Tyr pro Lys val 765 Arg ASp

Tyr ¡le Gln Arg val 770: val Ser Glu Ala Lys Glu Lys Gly Tyr val Arg 775 780

Thr Leu 785: Phe Gly Arg Lys Arg ASp rle Pro Gln Leu Met Ala Arg ASp 790 795 800

Arg Asn Thr Gln Ala Glu Gly Glu Arg rle Ala rle Asn Thr Pro rle 805 810 815

Gln Gly Thr Ala Ala ASp rle 820: rle Lys Leu Ala Met rle Glu rle ASp 825 830

Arg Glu Leu Lys Glu Arg Lys Met Arg Ser Lys Met rle rle Gln val 835 840 845

His ASp Glu Leu Val Phe Glu val Pro Asn Glu Glu Lys Asp Ala Leu 850 855 860 val Glu Leu val Lys ASp Arg Met Thr Asn val val Lys Leu Ser val 865 870 875 880

Pro Leu Glu val: ASp val 885 Thr rle Gly Lys Thr Trp Ser 890

5: <210> 129 <211> 2682 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácidos nucleicos codificante de ADN polimerasa quimérica termoestable CS6

<400> 129

atgaaagcta tgttaccatt attcgaaccc aaaggccggg tcctcctggt ggacggccac 60 cacctggcct accgcacctt cttcgccctg aagggcctca ccacgagccg gggcgaaccg 120 gtgcaggcgg tttacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctgaagga ggacgggtac 180 aaggccgtct tcgtggtctt tgacgccaag gccccttcct tccgccacga ggcctacgag 240 gcctacaagg caggccgcgc cccgaccccc gaggacttcc cccggcagct cgccctcatc 300 aaggagctgg tggacctcct ggggtttact cgcctcgagg ttccgggctt tgaggcggac 360 gacgtcctcg ccaccctggc caagaaggcg gaaagggagg ggtacgaggt gcgcatcctc 420 accgccgacc gggaccttta ccagctcgtc tccgaccgcg tcgccgtcct ccaccccgag 480 ggccacctca tcaccccgga gtggctttgg gagaagtacg gccttaagcc ggagcagtgg 540 gtggacttcc gcgccctcgt gggggacccc tccgacaacc tccccggggt caagggcatc 600 ggggagaaga ccgccctcaa gctcctcaag gagtggggaa gcctggaaaa tatcctcaag 660 aacctggacc gggtgaagcc ggaaagcgtc cgggaaagga tcaaggccca cctggaagac 720 cttaagctct ccttggagct ttcccgggtg cgctcggacc tccccctgga ggtggacttc 780 gcccggaggc gggagcctga ccgggaaggg cttcgggcct ttttggagcg cttggagttc 840 ggcagcctcc tccacgagtt cggccttcta gaggagtccg aacccgttgg gtaccgtata 900 gttaaagacc tggttgaatt tgaaaaactc atagagaaac tgagagaatc tccttcgttc 960 gcgatcgctc ttgcgactag ttccctcgat cctttcgact gcgacattgt cggtatctct 1020 gtgtctttca aaccaaagga agcgtactac ataccactcc atcatagaaa cgcccagaac 1080 ctggacgaaa aagaggttct gaaaaagctc aaagaaattc tggaggaccc cggagcaaag 1140 atcgttggtc agaatttgaa attcgattac aaggtgttga tggtgaaggg tgttgaacct 1200 gttcctcctt acttcgacac gatgatagcg gcttaccttc ttgagccgaa cgaaaagaag 1260 ttcaatctgg acgatctcgc attgaaattt cttggataca aaatgacatc ttaccaagag 1320 ctcatgtcct tctcttttcc gctgtttggt ttcagttttg ccgatgttcc tgtagaaaaa 1380 gcagcgaact actcctgtga agatgcagac atcacctaca gactttacaa gaccctgagc 1440 ttaaaactcc acgaggcaga tctggaaaac gtgttctaca agatagaaat gccccttgtg 1500 aacgtgcttg cacggatgga actgaacggt gtgtatgtgg acacagagtt cctgaagaaa 1560 ctctcagaag agtacggaaa aaaactcgaa gaactggcag aggaaatata caggatagct 1620 ggagagccgt tcaacataaa ctcaccgaag caggtttcaa ggatcctttt tgaaaaactc 1680 ggcataaaac cacgtggtaa aacgacgaaa acgggagact attcaacacg catagaagtc 1740 ctcgaggaac ttgccggtga acacgaaatc attcctctga ttcttgaata cagaaagata 1800 cagaaattga aatcaaccta catagacgct cttcccaaga tggtcaaccc aaagaccgga 1860 aggattcatg cttctttcaa tcaaacgggg actgccactg gaagacttag cagcagcgat 1920 cccaatcttc agaacctccc gacgaaaagt gaagagggaa aagaaatcag gaaagcgata 1980 gttcctcagg atccaaactg gtggatcgtc agtgccgact actcccaaat agaactgagg 2040 atcctcgccc atctcagtgg tgatgagaat cttttgaggg cattcgaaga gggcatcgac 2100 gtccacactc taacagcttc cagaatattc aacgtgaaac ccgaagaagt aaccgaagaa 2160 atgcgccgcg ctggtaaaat ggttaatttt tccatcatat acggtgtaac accttacggt 2220 ctgtctgtga ggcttggagt acctgtgaaa gaagcagaaa agatgatcgt caactacttc 2280 gtcctctacc caaaggtgcg cgattacatt cagagggtcg tatcggaagc gaaagaaaaa 2340 ggctatgtta gaacgctgtt tggaagaaaa agagacatac cacagctcat ggcccgggac 2400 aggaacacac aggctgaagg agaacgaatt gccataaaca ctcccataca gggtacagca 2460 gcggatataa taaagctggc tatgatagaa atagacaggg aactgaaaga aagaaaaatg 2520 agatcgaaga tgatcataca ggtccacgac gaactggttt ttgaagtgcc caatgaggaa 2580 aaggacgcgc tcgtcgagct ggtgaaagac agaatgacga atgtggtaaa gctttcagtg 2640 ccgctcgaag tggatgtaac catcggcaaa acatggtcgt ga 2682

<210> 130

<211> 894 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa quimérica termoestable eS? codifican te de secuencia de aminoácidos 10

<400> 130

Met Lys Ala Met Leu pro Leu phe Glu pro Lys Gly Arg val Leu Leu

1 5 10 15

val ASp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala val phe 50 55 60

val val phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80 Ala Tyr LyS Ala Gly Arg Ala pro Thr Pro Glu ASp phe pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu rle Lys Glu Leu val ASp Leu Leu Gly phe Thr Arg Leu 100 105 110

Glu val Pro Gly phe Glu Ala ASp ASp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg rle Leu Thr Ala Asp Arg130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu val Ser ASp Arg val Ala val Leu His Pro Glu 145 150 155 160

Gly His Leu rle Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys165 170 175

Pro Glu Gln Trp val ASp phe Arg Ala Leu val Gly ASp pro Ser ASp 180 185 190

Asn Leu pro Gly val Lys Gly rle Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn rle Leu Lys Asn Leu ASp Arg210 215 220

val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg rle Lys Ala His Leu Glu ASp225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu Pro Leu 245 250 255

Glu val ASp phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg

260 265 270

Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu phe Gly 275 280 285

Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys ASp Leu 290 295 300

val Glu Phe Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser phe 305 310 315 320

Ala rle ASp Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp pro phe ASp Cys ASp rle 325 330 335

val Gly rle Ser val Ser phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro 340 345 350

Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys

355 360 365

Lys Leu Lys Glu rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys rle val Gly Gln 370 375 380

Asn Leu Lys Phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro 385 390 395 400

val Pro Pro Tyr phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu pro 405 410 415

Asn Glu Lys Lys phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly 420 425 430

Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser phe Ser phe Pro Leu 435 440 445

Phe Gly phe Ser phe Ala ASp Val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr450 455 460

Ser Cys Glu ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser 465 470 475 480

Leu Lys Leu His Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr Gln Glu val Glu

485 490 495

Lys Pro Leu Ser Arg val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly val Arg

500 505 510

Leu ASp val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu Leu Ala Glu Glu 515 520 525

rle Arg Arg Leu Glu Glu Glu val phe Arg Leu Ala Gly His Pro phe 530 535 540

Asn Leu Asn Ser Arg ASp Gln Leu Glu Arg val Leu Phe ASp Glu Leu 545 550 555 560

Arg Leu pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr 565 570 575

Ser Ala Ala val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro rle Val Glu 580 585 590

Lys rle Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn Thr Tyr val 595 600 605

ASp Pro Leu Pro Gly Leu val His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr 610 615 620

Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser ASp625 630 635 640 Pro Asn Leu Gln Asn rle pro rle Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg rle 645 650 655

Arg Arg Ala phe val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu Val Ala Leu ASp 660 665 670

Tyr Ser Gln rle Glu Leu Arg val Leu Ala His Leu Ser Gly ASp Glu 675 680 685

Asn Leu rle Arg val Phe Gln Glu Gly Lys ASp rle His Thr Gln Thr 690 695 700

Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Ser Pro Glu Ala val Asp Pro Leu Met 705 710 715 720

Arg Arg Ala Ala Lys Thr val Asn phe Gly val Leu Tyr Gly Met Ser 725 730 735

Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala rle pro Tyr Glu Glu Ala val 740 745 750

Ala phe rle Glu Arg Tyr phe Gln Ser phe pro Lys val Arg Ala Trp 755 760 765

rle Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly Tyr val Glu Thr 770 775 780

Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr val Pro ASp Leu Asn Ala Arg val Lys785 790 795 800

Ser val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro val Gln 805 810 815

Gly Thr Ala Ala ASp Leu Met Lys Leu Ala Met val Lys Leu phe Pro 820 825 830

His Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln val His ASp Glu 835 840 845

Leu Leu Leu Glu Ala pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu val Ala Ala Leu 850 855 860

Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu 865 870 875 880

val Gl u val Gl y r 1 e Gly Glu ASp Trp Leu Ser Ala Lys Gly 885 890

<210>131

<211> 196 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominio exonucleolítico of ADN polimerasa quimérica termoestable eS? 10

<400> 131

Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg ¡le val Lys Asp Leu val Glu Phe 1 5 10 15

Glu Lys Leu ¡le Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser phe Ala rle ASp 20 25 30

Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro phe ASp cys ASp rl e val Gly rle 35 40 45

Ser val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle pro Leu His His 50 55 60

Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu Val Leu Lys Lys Leu Lys 65 70 75 80

Glu ¡le Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys rle val Gly Gln Asn Leu Lys 85 90 95

phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro val Pro Pro 100 105 110

Tyr Phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu Lys 115 120 125

Lys phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly Tyr Lys Met 130 135 140

Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu Phe Gly Phe 145 150 155 160

Ser Phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys Glu 165 170 175

ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu 180 185 190

His Glu Glu Lys 195

<210> 132

<211> 291 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Residuos 1 a 291 of ADN polimerasa quimérica termoestable eS? derivada de la ADN polimerasa Z05 10

<400> 132

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg val Leu Leu 1 5 10 15

val ASp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gl n Ala val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASp Gly Tyr Lys Ala Val Phe 50 55 60

val val phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu ASp Phe Pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu val ASp Leu Leu Gly phe Thr Arg Leu 100 105 110

Glu val Pro Gly Phe Glu Ala ASp ASp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys

115 120 125 Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala ASp Arg 130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu val Ser ASp Arg val Ala val Leu His Pro Glu

145 150 155 160

Gly His Leu Ile Thr pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys

165 170 175

Pro Glu Gln Trp val ASP phe Arg Ala Leu val Gly ASp pro Ser ASp180 185 190

Asn Leu pro Gly val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu ASp Arg210 215 220

val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu ASp225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASP Leu Pro Leu 245 250 255

Glu val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg260 265 270

Ala phe Leu Glu Arg Leu Glu phe Gly Ser Leu Leu His Glu phe Gly275 280 285

Leu Leu Glu 290

<210> 133

<211> 409 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Residuos 485 a 894 de la ADN polimerasa termoestable quimérica eS? derivada de la ADN polimerasa Z05 10

<400> 133

Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr Gln Glu val Glu Lys Pro Leu Ser Arg 1 5 10 15

val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly val Arg Leu ASp Val Ala Tyr 20 25 30

Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu Leu Ala Glu Glu rle Arg Arg Leu Glu 35 40 45

Glu Glu val phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg 50 55 60

Asp Gln Leu Glu Arg val Leu phe ASp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu 65 70 75 80

Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala val Leu 85 90 95

Glu Ala Leu ArÓ Glu Ala Hi s Pro rle val Glu Lys rle Leu Gln His 10 105 110

Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly 115 120 125

Leu val His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr Arg phe Asn Gln Thr 130 135 140

Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn 145 150 155 160

rle Pro rle Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg rle Arg Arg Ala Phe Val 165 170 175

Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln rle Glu 180 185 190

Leu Arg val Leu Ala His Leu Ser Gly ASp Glu Asn Leu rle Arg Val 195 200 205

Phe Gln Glu Gly Lys Asp rle His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe 210 215 220

Gly val Ser Pro Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys 225 230 235 240

Thr val Asn phe Gly val Leu Tyr Gly Met Ser Ala H;S Arg Leu Ser 245 250 255

Gln Glu Leu Ala rle Pro Tyr Glu Glu Al a val Ala phe rle Glu Arg 260 265 270

Tyr Phe Gln Ser phe Pro Lys val Arg Ala Trp rle Glu Lys Thr Leu 275 280 285

Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly Tyr val Glu Thr Leu phe Gly Arg Arg 290 295 300

Arg Tyr val Pro ASp Leu Asn Ala Arg val Lys Ser val Arg Glu Ala 305 310 315 320

Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala ASp325 330 335

Leu Met Lys Leu Ala Met val Lys Leu phe pro H;S Leu Arg Glu Met 340 345 35

Gly Ala Ar~ Met Leu Leu Gln Val H;S ASp Glu Leu Leu Leu Glu Ala 35 360 365

Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met 370 375 380

Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala val Pro Leu Glu Val Gl u val Gly rle 385 390 395 400

Gly Glu ASp Trp Leu Ser Ala Lys Gly405

<210> 134

<211> 193 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Residuos 292 a 484 of ADN polimerasa quimérica termoestable eS? derivada de la ADN polimerasa Tma 10

<400> 134

Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys ASp Leu val Glu Phe 1 5 10 15

Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser pro Ser phe Ala rle Asp 20 25 30

Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro Phe ASp Cys ASp rle val Gly rle

35 40 45

Ser val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro Leu His His 50 55 60

Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu val Leu Lys Lys Leu Lys65 70 75 80

Glu rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys rl e val Gly Gln Asn Leu Lys85 90 95

phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro val Pro Pro 100 105 110

Tyr phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu Lys115 120 125

Lys Phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly Tyr Lys Met 130 135 140

Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser phe Ser phe Pro Leu phe Gl y phe145 150 155 160

Ser phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys Glu 165 170 175

Asp Ala Asp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu 180 185 190

His

<210> 135

<211> 196

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominio exonucleolítico de ADN polimerasa termoestable eS? tras la segunda ronda de mutagénesis 1 O sustitución L329A

<400> 135

Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rl e val Lys ASp Leu val Glu phe 1 5 10 15

Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser pro Ser phe Ala rle ASp20 25 30

Leu Glu Thr Ser Ser Ala ASp Pro Phe ASp cys ASp rle Val Gly rle 35 40 45

Ser Val Ser phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro Leu His His 50 55 60

Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu Val Leu Lys Lys Leu Lys 65 70 75 80

Glu ¡le Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys ¡le val Gly Gln Asn Leu Lys 85 90 95

Phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu pro val pro pro 100 105 110

Tyr Phe ASp Thr Met ¡le Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu Lys 115 120 125

Lys Phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly Tyr Lys Met 130 135 140

Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser phe Ser phe Pro Leu phe Gly phe 145 150 155 160

Ser phe Ala ASp Val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys Glu 165 170 175

ASp Ala ASp ¡le Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu 180 185 190

His Glu Glu Lys195

<210> 136

<211> 894 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa termoestable eS? tras la segunda ronda de mutagénesis -sustitución L329A 10

<400> 136

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu phe Glu Pro Lys Gly Arg val Leu Leu 1 S 10 15

val ASp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr phe phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gln Ala val Tyr Gly phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASp Gly Tyr Lys Ala val Phe 50 SS 60

val val phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu ASp phe Pro Arg Gln

85 90

Leu Ala Leu rle Lys Glu Leu val ASp Leu Leu Gly phe Thr Arg Leu

WO W5 1ro

Glu val Pro Gly phe Glu Ala ASp ASp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg rle Leu Thr Ala ASp Arg130 135 140

Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg val Ala val Leu His Pro Glu

145 150 155 160 Gly His Leu rle Thr pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys

165 170 175 Pro Glu Gln Trp val ASp Phe Arg Ala Leu val Gly ASp Pro Ser ASp

180 185 190 Asn Leu Pro Gly val Lys Gly rle Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu

195 200 205 Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn rle Leu Lys Asn Leu ASp Arg210 215 220

val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg rle Lys Ala H;S Leu Glu ASp225 230 235 240 Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu Pro Leu

245 250 255 Glu val ASp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg

260 265 270 Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly275 280 285 Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro val -'J 'J' ... Ile val ......... Leu

r.lv Tvr Arn I \le: Acn

!1 -J

290 295 300

val Glu phe Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Ar~ Glu Ser Pro Ser Phe 305 310 31 320

Ala rle ASp Leu Glu Thr Ser Ser Ala ASp Pro Phe Asp Cys ASp rle 325 330 335

val Gly rle Ser val Ser Phe Lys pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro 340 345 350

Leu H;S H;s Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys355 360 365 Lys Leu Lys Glu rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys rle val Gly Gln 370 375 380

Asn Leu Lys phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro 385 390 395 400

val Pro Pro Tyr phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro 405 410 415

Asn Glu Lys Lys phe Asn Leu ASp Asp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly 420 425 430

Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser phe Pro Leu 435 440 445

phe Gly phe Ser Phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr 450 455 460

Ser Cys Glu ASp Ala Asg Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser 465 47 475 480

Leu Lys Leu His Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr Gln Glu Val Glu 485 490 495

Lys Pro Leu Ser Arg val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly val Arg 500 505 510

Leu ASp val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu Leu Ala Glu Glu 515 520 525

Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu val phe Arg Leu Ala Gly His Pro phe 530 535 540

Asn Leu Asn Ser Arg ASp Gln Leu Glu Arg val Leu phe ASp Glu Leu 545 550 555 560

Arg Leu pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr 565 570 575

Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His pro rle val Glu 580 585 590

Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn Thr Tyr val 595 600 605

ASp Pro Leu Pro Gly Leu val His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr 610 615 620

Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp 625 630 635 640 Pro Asn Leu Gln Asn ¡le Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile 645 650 655

Arg Arg Ala Phe val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu val Ala Leu ASp660 665 670

Tyr Ser Gln ¡le Glu Leu Arg val Leu Ala His Leu Ser Gly ASp Glu 675 680 685

Asn Leu ¡le Arg val Phe Gln Glu Gly Lys ASp ¡le His Thr Gln Thr 690 695 700

Ala Ser Trp Met phe Gly val Ser Pro Glu Ala val ASp Pro Leu Met 705 710 715 720

Arg Arg Ala Ala L~S Thr val Asn Phe Gly val Leu Tyr Gly Met Ser 7 5 730 735

Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala ¡le Pro Tyr Glu Glu Ala Val

740 745 750

Ala Phe ¡le Glu Arg Tyr phe Gln Ser Phe Pro Lys val Arg Ala Trp 755 760 765

¡le Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly Tyr val Glu Thr 770 775 780

Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr val Pro ASp Leu Asn Ala Arg val Lys785 790 795 800

Ser val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala phe Asn Met Pro val Gln

805 810 815

Gly Thr Ala Ala ASp Leu Met Lys Leu Ala Met val Lys Leu phe Pro 820 825 830

His Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln val His ASp Glu 835 84 845

Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu Val Ala Ala Leu 850 855 860

Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu 865 870 875 880

val Glu val Gly ¡le Gly Glu ASp Trp Leu Ser Ala Lys Gly885 890

<210> 137

<211> 196

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominio exonucleolítico de ADN polimerasa termoestable eS7 tras la segunda ronda de mutagénesis 1 O sustitución Q384A

<400> 137

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Ser val Ser phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle pro Leu His His 50 55 60

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<210> 138

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<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa termoestable eS? tras la segunda ronda de mutagénesis de la sustitución Q384A 10

<400> 138

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu phe Glu Pro Lys Gly Arg val Leu Leu

1 5 10 15

val ASp Gly H;S H;S Leu Ala Tyr Arg Thr phe phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gln Ala val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASp Gly Tyr Lys Ala val phe 50 55 60

val val phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu ASp phe Pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu 100 105 110

Glu val Pro Gly Phe Glu Ala ASp ASp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys115 UO U5

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg rle Leu Thr Ala ASp Arg 130 135 140

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Gly H;S Leu rle Thr pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys 165 170 175

Pro Glu Gln Trp val ASp phe Arg Ala Leu Val Gly ASp Pro Ser ASp180 185 190

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Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser Asp Leu Pro Leu 245 250 255

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Leu phe Gly Arg Arg Arg Tyr val Pro ASp Leu Asn Ala Arg val Lys

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Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu Val Ala Ala Leu 850 855 860

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val Glu val Gly Ile Gly Glu ASp Trp Leu Ser Ala Lys Gly 885 890

<210> 139

<211> 196

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<223> Dominio exonucleolítico de ADN polimerasa termoestable eS? tras la segunda ronda de mutagénesis sustitución N385A

<400> 139 10

Glu Ser Glu pro val Gly Tyr Arg rl e val Lys ASp Leu val Glu phe 1 5 10 15

Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser pro Ser phe Ala rle ASp20 25 30

Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp pro phe ASp cys ASp rle val Gly rle 35 40 45

Ser val Ser phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro Leu His His 50 55 60

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phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro val Pro Pro 100 105 110

Tyr phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu pro Asn Glu Lys

115 UO U5

Lys Phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly Tyr Lys Met 130 135 140

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Ser phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys Glu 165 170 175

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<210> 140 15 <211> 894

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 55 20 <223> ADN polimerasa termoestable eS? tras la segunda ronda de mutagénesis -sustitución N385A

<400> 140

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu phe Glu Pro Lys Gly Arg val Leu Leu 1 5 10 15

val ASp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu pro val Gl n Ala val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASp Gly Tyr Lys Ala val phe 50 55 60

val val Phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu ASp Phe Pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu rle Lys Glu Leu val ASp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu 100 105 110

Glu val pro Gly phe Glu Ala ASp ASp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys 115 UO U5

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg rle Leu Thr Ala ASp Arg 130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu val Ser ASp Arg val Ala Val Leu His Pro Glu 145 150 155 160

Gly His Leu rle Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys 165 170 175

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val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg rle Lys Ala H;S Leu Glu ASp 225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu Pro Leu 245 250 255

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Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys Asp Leu 290 295 300

val Glu Phe Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser phe305 310 315 320

Ala rle ASp Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro phe ASp cys ASp rle 325 330 335

val Gly rle Ser val Ser phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro 340 345 350

Leu H;S H;s Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu Val Leu Lys 355 360 365

Lys Leu Lys Glu rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys rle val Gly Gln 370 375 380

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Ser Cys Glu ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser 465 470 475 480 Leu LyS Leu His Glu Glu Lys Leu LeU Trp Leu Tyr Gln Glu val Glu 485 490 495

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val Glu val Gly rle Gly Glu ASp Trp Leu Ser Ala Lys Gly885 890

<210> 141

<211> 196

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominio exonucleolítico de ADN polimerasa termoestable eS? tras la segunda ronda de mutagénesis 1 O sustitución Q384A N385A

<400> 141

Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys ASp Leu val Glu phe1 5 10 15

Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser phe Ala Il e ASp 20 25 30

Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro Phe ASp Cys ASp rl e val Gly rle 35 40 45

Ser val Ser phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro Leu His His 50 55 60

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Ser phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys Glu

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ASp Ala ASp ¡le Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu 180 185 190

His Glu Glu Lys

<210> 142

<211> 894 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa termoestable eS? tras la segunda ronda de mutagénesis -sustitución Q384A N385A 10

<400> 142

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Gl u Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

val ASp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gl n Ala val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45

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Leu Ala Leu ¡le Lys Glu Leu val ASp Leu Leu Gly phe Thr Arg Leu 100 lOS 110

Glu val Pro Gly phe Glu Ala ASp ASp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys

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245 250 255 Glu val ASp phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg

260 265 270 Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu phe Gly

275 280 285 Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys ASp Leu 290 295 300

val Glu phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser pro Ser phe

305 310 315 320

Ala rle ASp Leu Glu Thr Ser Ser Leu Asp Pro phe ASp Cys ASp rle

325 330 335 val Gly rle Ser val Ser phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle pro340 345 350 Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys355 360 365 Lys Leu Lys Glu rle Leu Glu ASp pro Gly Ala Lys rl e val Gly Ala

370 375 380

Ala Leu Lys phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro 385 390 395 400

val pro Pro Tyr Phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro 405 410 415

Asn Glu Lys Lys phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly420 425 430

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Ser Cys Glu ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser

465 470 475 480

Leu Lys Leu His Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr Gln Glu val Glu 485 490 495

Lys Pro Leu Ser Arg val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly val Arg500 505 510

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Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn Thr Tyr val 595 600 605

ASp Pro Leu Pro Gly Leu val His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr 610 615 620

Arg phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser ASp625 630 635 640

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Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu 675 680 685

Asn Leu rle Arg val Phe Gln Glu Gly Lys Asp rle His Thr Gln Thr 690 695 700

A 1 a Ser Trp Met phe Gly val Ser pro Glu Ala val ASP Pro Leu Met 705 710 715 720

Arg Arg Ala Ala Lys Thr val Asn phe Glbval Leu Tyr Gly Met Ser

725 73 735

Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala rle pro Tyr Glu Gl u Ala val 740 745 750

Ala phe rle Glu Arg Tyr phe Gln Ser phe Pro Lys val Arg Ala Trp 755 760 765

rle Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly Tyr val Glu Thr 770 775 780

Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr val Pro ASP Leu Asn Ala Arg Val Lys

785 790 795 800

Ser val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala phe Asn Met Pro val Gln 805 810 815

Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu phe Pro 820 825 830

His Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln val His ASp Glu

835 840 845

Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu val Ala Ala Leu 850 855 860

Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu 865 870 875 880

val Glu val Gly rle Gly Glu ASp Trp Leu Ser Ala Lys Gly885 890

<210> 143

<211> 196

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominio exonucleolítico de ADN polimerasa termoestable eS? tras la segunda ronda de mutagénesis 1 O sustitución D389E

<400> 143

Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys ASp Leu val Glu Phe 1 5 10 15

Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser phe Ala rle ASp

20 25 30

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ASp Ala Asp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu

~O ~5 ~O

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<210> 144

<211> 894 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa termoestable eS? tras la segunda ronda de mutagénesis -sustitución D389E 10

<400> 144

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg val Leu Leu 1 5 10 15

val ASp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr phe phe Ala Leu Lys Gly20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gln Ala Val Tyr Gly phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASp Gly Tyr Lys Ala val Phe 50 55 60

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Leu Ala Leu ¡le Lys Glu Leu val Asp Leu Leu Gly phe Thr Arg Leu 100 105 110

Glu val Pro Gly Phe Glu Ala ASp ASp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg ¡le Leu Thr Ala ASp Arg130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu val Ser ASp Arg val Ala val Leu His Pro Glu 145 150 155 160

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Pro Glu Gln Trp val ASp Phe Arg Ala Leu val Gly ASp Pro Ser ASp180 185 190

Asn Leu pro Gly val Lys Gly rle Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn ¡le Leu Lys Asn Leu Asp Arg210 215 220

val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg ¡le Lys Ala His Leu Glu ASp225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu Pro Leu 245 250 255

Glu Val ASp phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg260 265 270

Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu phe Gly Ser Leu Leu His Glu phe Gly 275 280 285

Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys ASp Leu 290 295 300

val Glu phe Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser pro Ser phe305 310 315 320 Ala rle ASp Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro phe ASp Cys AS~ rle 325 330 33

Val Gly rle Ser val Ser phe Lys pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle pro 340 345 350

Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Gl u Val Leu Lys 355 360 365

Lys Leu Lys Glu rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys rl e val Gly Gln 370 375 380

Asn Leu Lys Phe Glu Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro 385 390 395 400

val Pro pro Tyr phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu pro 405 410 415

Asn Glu Lys Lys phe Asn Leu ASP ASP Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly420 425 430

Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser phe Ser phe Pro Leu 435 440 445

phe Gly phe Ser phe Ala ASp val pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr450 455 460

Ser Cys Glu ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser 465 470 475 480

Leu Lys Leu His Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr Gln Glu val Glu 485 490 495

Lys Pro Leu Ser Arg val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly val Arg500 505 510

Leu Asp val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu Leu Ala Glu Glu 515 520 525

Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu val phe Arg Leu Ala Gly His Pro phe 530 535 540

Asn Leu Asn Ser Arg ASp Gln Leu Glu Arg val Leu Phe ASp Glu Leu 545 550 555 560

Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr 565 570 575

Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val Glu 580 585 590

Lys rle Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn Thr Tyr val 595 600 605

ASp Pro Leu Pro Gly Leu val His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr 610 615 620

Arg phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser ASp 625 630 635 640

Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr pro Leu Gly Gln Arg Ile 645 650 655

Arg Arg Ala Phe val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu val Ala Leu ASp660 665 670

Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg val Leu Ala His Leu Ser Gly ASp Glu 675 680 685

Asn Leu Ile Arg val phe Gln Glu Gly Lys ASp Ile His Thr Gln Thr 690 695 700

Ala Ser Trp Met phe Gly val Ser Pro Glu Ala Val ASP Pro Leu Met

705 710 715 720

Arg Arg Ala Ala Lys Thr val Asn Phe Gly val Leu Tyr Gly Met Ser 725 730 735

Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Val 7W ~5 7~

Ala Phe ¡le Glu Arg Tyr phe Gln Ser phe pro Lys val Arg Ala Trp 755 760 765

Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly Tyr Val Glu Thr 770 775 780

Leu phe Gly Arg Arg Arg Tyr val pro ASP Leu Asn Ala Arg val Lys785 790 795 800

Ser val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala phe Asn Met Pro val Gln 805 810 815

Gly Thr Ala Ala ASp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro 820 825 830

H;S Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln val H;S ASp Glu

835 84 845

Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu val Ala Ala Leu 850 855 860

Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala val Pro Leu Glu 865 870 875 880

val Glu val Gly Ile Gly Glu ASp Trp Leu Ser Ala Lys Gly885 890

<210> 145 5 <211> 196

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

10 <223> Dominio exonucleolítico de ADN polimerasa termoestable eS? tras la segunda ronda de mutagénesis sustitución Y464A

<400> 145

Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys ASp Leu val Glu Phe 1 5 10 15

Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser phe Ala rle ASp 20 25 30

Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp pro Phe ASp Cys ASp rl e val Gly rle 35 40 45

Ser val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle pro Leu H;s H;S 50 55 60

Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu val Leu Lys Lys Leu Lys65 70 75 80

Glu rle Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys rle val Gly Gln Asn Leu Lys85 90 95

phe Asp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro val Pro Pro 100 105 110

Tyr phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu Lys115 120 125

Lys Phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly Tyr Lys Met 130 135 140

Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser phe Ser Phe Pro Leu phe Gly phe

145 150 155 160

Ser Phe Ala ASp val pro Val Glu Lys Ala Ala Asn Ala Ser Cys Glu

165 170 175

ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu 180 185 190

H;S Glu Glu Lys195

5 <210> 146

<211> 894

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> ADN polimerasa termoestable e5? tras la segunda ronda de mutagénesis -sustitución Y464A

<400> 146

Met Lys Ala Met Leu pro Leu phe Glu Pro Lys Gly Arg val Leu Leu 1 5 10 15

val ASp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr phe Phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu pro val Gl n Ala val Tyr Gly phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASp Gly Tyr Lys Ala val phe 50 55 60

val val Phe ASp Ala Lys Ala pro Ser phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu rle Lys Glu Leu Val ASp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu 100 105 110

Glu val pro Gly Phe Glu Ala ASp ASp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg rle Leu Thr Ala ASp Arg130 135 140

ASP Leu Tyr Gln Leu val Ser ASP Arg val Ala val Leu His pro Glu

145 150 155 160

Gly His Leu rle Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys165 170 175

Pro Glu Gln Trp val ASp phe Arg Ala Leu val Gly ASp Pro Ser ASp 180 185 190

Asn Leu Pro Gly val Lys Gly rle Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn rle Leu Lys Asn Leu ASp Arg210 215 220

val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg rle Lys Ala His Leu Glu ASp225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu Pro Leu

245 250 255

Glu val ASp phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg260 265 270

Ala phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly

275 280 285 Leu Leu Glu Gl u Ser Gl u Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys ASp Leu 290 295 300

val Glu Phe Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser phe305 310 315 320 Ala rle ASp Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro phe ASp cys ASp rle

325 330 335 val Gly rle Ser val Ser phe Lys pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro 340 345 350 Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys355 360 365 Lys Leu Lys Glu rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys rle val Gly Gln 370 375 380

405 410 415 Asn Glu Lys Lys Phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly420 425 430 Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser phe pro Leu 435 440 445 Phe Gly phe Ser phe Ala Asp val Pro Val Glu Lys Ala Ala Asn Ala

450 455 460

Ser Cys Glu ASp Ala ASp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser 465 470 475 480 Leu Lys Leu His Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr Gln Glu val Glu

485 490 495 Lys Pro Leu Ser Arg val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly val Arg 500 505 510 Leu ASp val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu Leu Ala Glu Glu

515 520 525

rle Arg Arg Leu Glu Glu Glu val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe 530 535 540

Asn Leu Asn Ser Arg ASp Gln Leu Glu Arg val Leu phe ASp Glu Leu 545 550 555 560

Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr 565 570 575

Ser Ala Ala val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His pro rle Val Glu 580 585 590

Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn Thr Tyr val 595 600 605

ASp pro Leu pro Gly Leu val His pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr 610 615 620

Ar~ Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Ar~ Leu Ser Ser Ser ASp62 630 63 640

Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro rle Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg rle 645 650 655

Arg Arg Ala Phe val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu val Ala Leu ASp660 665 670

Tyr Ser Gln rle Glu Leu Arg val Leu Ala His Leu Ser Gly ASp Glu

675 680 685

Asn Leu rle Arg val phe Gln Glu Gly Lys ASp rle His Thr Gln Thr 690 695 700

Ala Ser Trp Met Phe Gly val Ser Pro Glu Ala val Asp Pro Leu Met 705 710 715 720

Arg Arg Ala Ala Lys Thr val Asn Phe Gly val Leu Tyr Gly Met Ser 725 730 735

Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala rle Pro Tyr Glu Glu Ala val 740 745 750

Ala phe rle Glu Arg Tyr phe Gln Ser phe pro Lys val Arg Ala Trp 755 760 765

rle Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly Tyr val Glu Thr 770 775 780

Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr val pro ASp Leu Asn Ala Arg val Lys785 790 795 800

Ser val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala phe Asn Met Pro Val Gln 805 810 815

Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro 820 825 830

His Leu Ar~ Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gl n val His Asp Glu

83 84 845

Leu Leu Leu Glu Ala pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu val Ala Ala Leu 850 855 860

Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala val Pro Leu Glu

865 870 875 880

val Glu val Gly rle Gly Glu ASp Trp Leu Ser Ala Lys Gly885 890

<210>147 5 <211> 2685

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Secuencia de ácidos nucleicos codificante de ADN polimerasa termoestable quimérica eS7

<400> 147

atgaaagcta tgttaccatt attcgaaccc aaaggccggg tcctcctggt ggacggccac 60 cacctggcct accgcacctt cttcgccctg aagggcctca ccacgagccg gggcgaaccg 120 gtgcaggcgg tttacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctgaagga ggacgggtac 180 aaggccgtct tcgtggtctt tgacgccaag gccccttcct tccgccacga ggcctacgag 240 gcctacaagg caggccgcgc cccgaccccc gaggacttcc cccggcagct cgccctcatc 300 aaggagctgg tggacctcct ggggtttact cgcctcgagg ttccgggctt tgaggcggac 360 gacgtcctcg ccaccctggc caagaaggcg gaaagggagg ggtacgaggt gcgcatcctc 420 accgccgacc gggaccttta ccagctcgtc tccgaccgcg tcgccgtcct ccaccccgag 480 ggccacctca tcaccccgga gtggctttgg gagaagtacg gccttaagcc ggagcagtgg 540 gtggacttcc gcgccctcgt gggggacccc tccgacaacc tccccggggt caagggcatc 600 ggggagaaga ccgccctcaa gctcctcaag gagtggggaa gcctggaaaa tatcctcaag 660 aacctggacc gggtgaagcc ggaaagcgtc cgggaaagga tcaaggccca cctggaagac 720 cttaagctct ccttggagct ttcccgggtg cgctcggacc tccccctgga ggtggacttc 780 gcccggaggc gggagcctga ccgggaaggg cttcgggcct ttttggagcg cttggagttc 840 ggcagcctcc tccacgagtt cggccttcta gaggagtccg aacccgttgg gtaccgtata 900 gttaaagacc tggttgaatt tgaaaaactc atagagaaac tgagagaatc tccttcgttc 960 gctatcgatt tggaaactag ttccctcgat cctttcgact gcgacattgt cggtatctct 1020 gtgtctttca aaccaaagga agcgtactac ataccactcc atcatagaaa cgcccagaac 1080 ctggacgaaa aagaggttct gaaaaagctc aaagaaattc tggaggaccc cggagcaaag 1140 atcgttggtc agaatttgaa attcgattac aaggtgttga tggtgaaggg tgttgaacct 1200 gttcctcctt acttcgacac gatgatagcg gcttaccttc ttgagccgaa cgaaaagaag 1260 ttcaatctgg acgatctcgc attgaaattt cttggataca aaatgacatc ttaccaagag 1320 ctcatgtcct tctcttttcc gctgtttggt ttcagttttg ccgatgttcc tgtagaaaaa 1380 gcagcgaact actcctgtga agatgcagac atcacctaca gactttacaa gaccctgagc 1440 ttaaaactcc acgaggaaaa gcttctttgg ctctaccaag aggtggaaaa gcccctctcc 1500 cgggtcctgg cccacatgga ggccaccggg gtaaggctgg acgtggccta tctaaaggcc 1560 ctttccctgg agcttgcgga ggagattcgc cgcctcgagg aggaggtctt ccgcctggcg 1620 ggccacccct tcaacctgaa ctcccgtgac cagctagagc gggtgctctt tgacgagctt 1680 aggcttcccg ccctgggcaa gacgcaaaag acggggaagc gctccaccag cgccgcggtg 1740 ctggaggccc tcagggaggc ccaccccatc gtggagaaga tcctccagca ccgggagctc 1800 accaagctca agaacaccta cgtggacccc ctcccgggcc tcgtccaccc gaggacgggc 1860 cgcctccaca cccgcttcaa ccagacagcc acggccacgg gaaggctctc tagctccgac 1920 cccaacctgc agaacatccc catccgcacc cccttgggcc agaggatccg ccgggccttc 1980 gtggccgagg cgggatgggc gttggtggcc ctggactata gccagataga gctccgggtc 2040 ctcgcccacc tctccgggga cgagaacctg atcagggtct tccaggaggg gaaggacatc 2100 cacacccaga ccgcaagctg gatgttcggc gtctccccgg aggccgtgga ccccctgatg 2160 cgccgggcgg ccaagacggt gaacttcggc gtcctctacg gcatgtccgc ccataggctc 2220 tcccaggagc ttgccatccc ctacgaggag gcggtggcct ttatagagcg ctacttccaa 2280 agcttcccca aggtgcgggc ctggatag3.a aagaccctgg o_ggaggggag gaagcggggc 2340 tacgtggaaa ccctcttcgg aagaaggcgc tacgtgcccg acctcaacgc ccgggtgaag 2400 agcgtcaggg aggccgcgga gcgcatggcc ttcaacatgc ccgtccaggg caccgccgcc 2460 gacctcatga agctcgccat ggtgaagctc ttcccccacc tccgggagat gggggcccgc 2520 atgctcctcc aggtccacga cgagctcctc ctggaggccc cccaagcgcg ggccgaggag 2580 gtggcggctt tggccaagga ggccatggag aaggcctatc ccctcgccgt gcccctggag 2640 gtggaggtgg ggatcgggga ggactggctt tccgccaagg gctga 2685

<210> 148

<211> 894 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa quimérica termoestable eS8 10

<400> 148

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15

val ASp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr phe Phe Ala Leu Lys Gly

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gln Ala val Tyr Gly phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe 50 55 60

val val phe ASP Ala Lys Ala Pro Ser phe Arg H;S Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu rle Lys Glu Leu val ASp Leu Leu Gly phe Thr Arg Leu 100 105 110

Glu val Pro Gly Phe Glu Ala ASp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg rle Leu Thr Ala ASp Arg130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu val Ser Asp Arg val Ala val Leu His Pro Glu 145 150 155 160

Gly His Leu rle Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys 165 170 175

Pro Glu Gln Trp val ASp Phe Arg Ala Leu val Gly Asp Pro Ser ASp 180 185 190

Asn Leu pro Gly val Lys Gly rle Gly Glu Lys Thr Ala Leu LyS Leu 195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn rle Leu Lys Asn Leu Asp Arg210 215 220

val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg rle LyS Ala His Leu Glu AsO 225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser Asp Leu Pro Leu 245 250 255

Glu val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg260 265 270

Ala phe Leu Glu Arg Leu Glu phe Gly Ser Leu Leu H;S Glu phe Gly 275 280 285

Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg ¡le val Lys ASP Leu

290 295 300

val Glu Phe Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe

305 310 315 320

Ala rle Ala Leu Ala Thr Ser Ser Leu ASp Pro Phe ASP Cys ASP rle

325 330 335 val Gly rle Ser val Ser phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle pro 340 345 350 Leu H;S H;s Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys355 360 365 Lys Leu Lys Glu rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys rl e val Gly Gln 370 375 380

405 410 415

Asn Glu Lys LyS Phe Asn Leu ASP ASP Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly

420 425 430

Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu

435 440 445

phe Gly phe Ser Phe Ala Asp Val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr

450 455 460

Ser cys Glu ASp Ala Asp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser 465 470 475 480 Leu Lys Leu H;s Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr Gln Glu val Glu

485 490 495 Lys Pro Leu Ser Arg val Leu Ala H;s Met Glu Ala Th r Gl y val Arg500 505 510 Leu Asp val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu Leu Ala Glu Glu 515 520 525 rle Arg Arg Leu Glu Glu Glu val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro phe530 535 540 Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg val Leu Phe Asp Glu Leu

545 550 555 560 Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr

565 570 575

Lys rle Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn Thr Tyr val

595 600 605 ASp Pro Leu Pro Gly Leu val His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr

610 615 620

Arg phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp625 630 635 640 Pro Asn Leu Gln Asn rle Pro rle Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg rle

645 650 655 Arg Arg Ala phe val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu val Ala Leu Asp

660 665 670 Tyr Ser Gln rle Glu Leu Arg val Leu Ala His Leu Ser Gly ASp Glu

675 680 685 Asn Leu Ile Arg val Phe Gln Glu Gly Lys ASp Ile His Thr Gln Thr

690 695 700 Ala Ser Trp Met phe Gly val Ser Pro Glu Ala val ASp Pro Leu Met

705 710 715 720 Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn phe Gly val Leu Tyr Gly Met Ser

725 730 735 Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala rle pro Tyr Glu Glu Ala val

740 745 750 Ala Phe rle Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys val Arg Ala Trp

755 760 765 rle Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly Tyr val Glu Thr

770 775 780 Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr val Pro ASp Leu Asn Ala Arg Val Lys

785 790 795 800 Ser val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro val Gln 805 810 815 Gly Thr Ala Ala ASP Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro 820 825 830 His Leu Ar~ Glu Met Gly Ala ArO Met Leu Leu Gln val His Asp Glu 83 84 845 Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu Val Ala Ala Leu

850 855 860

Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala val Pro Leu Glu

865 870 875 880

val Glu val Gly rle Gly Glu ASp Trp Leu Ser Ala Lys Gly

885 890

<210> 149 <211>197

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de exonucleasa 3' a 5' of ADN polimerasa termoestable quimérica eS8

10 <400> 149

Glu Glu Ser Glu pro Val Gly Tyr Arg ¡le val Lys ASp Leu val Glu 1 5 10 15

phe Glu Lys Leu ¡le Glu Lys Leu Arg Glu Ser pro Ser Phe Ala ¡le20 25 30

Ala Leu Ala Thr Ser Ser Leu ASp Pro Phe Asp Cys ASp ¡le val Gly35 40 45

¡le Ser val Ser phe Lys pro Lys Glu Ala Tyr Tyr ¡le pro Leu His 50 SS 60

His Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys Lys Leu 65 70 75 80

Lys Glu ¡le Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys ¡le val Gly Gln Asn Leu 85 90 95

Lys Phe ASP Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro val pro 100 105 110

Pro Tyr Phe ASp Thr Met ¡le Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu 115 120 125

Lys Lys Phe Asn Leu ASp ASP Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly Tyr Lys130 135 140

Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu phe Gly145 150 155 160

Phe Ser phe Ala ASP val pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser cys 165 170 175

Glu Asp Ala ASp ¡le Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys180 185 190

Leu His Glu Glu Lys

<220>

<223> Residuos 1 a 291 of ADN polimerasa quimérica termoestable eS8 -secuencia derivada de la ADN polimerasa Z05

5 <400> 150

Met Lys Ala Met Leu pro Leu phe Glu Pro Lys Gly Arg val Leu Leu

1 5 10 15 val ASp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr phe Phe Ala Leu Lys Gly

20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu pro val Gln Ala val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASp Gly Tyr Lys Ala val phe

50 55 60 val val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu

65 70 75 80 Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu ASp Phe Pro Arg Gln 85 90 95 Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu

100 105 110 Glu Val Pro Gly phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys

115 120 125 Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala ASp Arg

130 135 140 ASp Leu Tyr Gln Leu val Ser ASp Arg val Ala Val Leu His Pro Glu

145 150 155 160 Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys

165 170 175 Pro Glu Gln Trp val ASP Phe Arg Ala Leu val Gly Asp Pro Ser ASp

180 185 190 Asn Leu Pro Gly val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205 Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn rle Leu Lys Asn Leu ASp Arg

210 215 220 val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu ASp

225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASP Leu pro Leu

245 250 255 Glu val ASp phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg

260 265 270 Ala phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu phe Gly

275 280 285 Leu Leu Glu

<210>151

<211> 409 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Residuos 485 a 894 de ADN polimerasa quimérica termoestable eS8, secuencia derivada de la ADN 10 polimerasa z05

<400> 151

val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly val Arg Leu ASP val Ala Tyr 20 25 30

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<210> 152

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 152

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His

5 <210> 153

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> Dominio exonucleolítico of ADN polimerasa quimérica eS8 tras la segunda ronda de mutagénesis sustitución DEE de los residuos 323 a 325

<400> 153 15

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180 185 190

Leu His Glu Glu Lys

<210> 154

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<220>

<223> ADN polimerasa quimérica eS8 tras la segunda ronda de mutagénesis -sustitución DEE de los residuos 323

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<400> 154

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<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominio exonucleolítico of ADN polimerasa quimérica eS8 tras la segunda ronda de mutagénesis 10 sustitución DDE de los residuos 323 a 325

<400> 155

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<210> 156

<211> 894

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<220>

<223> ADN polimerasa quimérica eS8 tras la segunda ronda de mutagénesis -sustitución DDE de los residuos 323 a325

<400> 156

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<223> ADN polimerasa quimérica eS8 tras la segunda ronda de mutagénesis -sustitución DKE de los residuos 323

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<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominio exonucleolítico of ADN polimerasa quimérica eS8 tras la segunda ronda de mutagénesis 10 sustitución DNE de los residuos 323 a 325

<400> 159

1 5 10 15

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pro Tyr phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu 115 120 125

Lys Lys phe Asn Leu Asp Asp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly Tyr Lys

130 135 140 Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser phe Ser Phe Pro Leu Phe Gly

145 150 155 160 Phe Ser Phe Ala ASp val pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys

165 170 175 Glu Asp Ala Asp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys

180 185 190 Leu H;S Glu Glu Lys

<210> 160 5 <211> 894

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

10 <223> Residuos 292 a 484 de la secuencia de la ADN polimerasa quimérica termoestable eS8 derived de la ADN polimerasa Tma

<400> 160

val ASp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASp Gly Tyr Lys Ala val phe50 55 60

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu ASp Phe Pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu

100 105 110 Glu val pro Gly phe Glu Ala ASp ASp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys

115 120 125 Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg Ile Leu Thr Ala ASp Arg

130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu val Ser ASP Arg val Ala Val Leu His Pro Glu 145 150 155 160 Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys

165 170 175 pro Glu Gln Trp Val ASp Phe Arg Ala Leu val Gly ASp Pro Ser ASp180 185 190 Asn Leu Pro Gly val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu

195 200 205 Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg

210 215 220 val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp

225 230 235 240 Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser Asp Leu pro Leu

245 250 255 Glu val ASp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg

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275 280 285 Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg Ile val Lys ASp Leu

290 295 300

val Glu Phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe

305 310 315 320

Ala Ile ASp Asn Glu Thr Ser Ser Leu Asp Pro phe ASp Cys ASp Ile 325 330 335

340 345 350

Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASP Glu Lys Glu val Leu Lys355 360 365

Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu ASP Pro Gly Ala Lys Ile val Gly Gln 370 375 380

Asn Leu Lys phe ASP Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu pro385 390 395 400

val Pro Pro Tyr Phe Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro

405 410 415 Asn Glu Lys Lys Phe Asn Leu ASP ASp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly

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435 440 445 Phe Gly Phe Ser Phe Ala Asp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr450 455 460

485 490 495 Lys Pro Leu Ser Arg val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly val Arg

500 505 510

Leu Asp val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu Leu Ala Glu Glu 515 520 525

Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro phe53 535 540

Asn Leu Asn Ser Arg ASp Gln Leu Glu Arg val Leu Phe ASp Glu Leu 545 550 555 560

Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr 565 570 575

Ser Ala Ala val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile val Glu 580 585 590

Lys Ile Leu Gln H;S ArgGlu Leu Thr Lys Leu Lys Asn Thr Tyr val 595 600 605

ASp Pro Leu Pro Gly Leu val H;s Pro Arg Thr Gly Arg Leu H;S Thr 610 615 620

pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile

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675 680 685 Asn Leu Ile Arg val Phe Gln Glu Gly Lys ASp rle His Thr Gln Thr

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705 710 715 720 Arg Arg Ala Ala Lys Thr val Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser

725 730 735 Ala H;S Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala rle Pro Tyr Glu Glu Ala val

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785 790 795 800 Ser val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala phe Asn Met Pro Val Gln

805 810 815 Gly Thr Ala Ala ASp Leu Met Lys Leu Ala Met val Lys Leu Phe Pro

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835 840 845 Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu val Ala Ala Leu

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865 870 875 880

val Glu val Gly Ile Gly Glu ASp Trp Leu Ser Ala Lys Gly885 890

<210> 161

<211>197

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5 <220>

<223> Dominio exonucleolítico of ADN polimerasa quimérica eS8 tras la segunda ronda de mutagénesis sustitución DQE de los residuos 323 a 325

<400> 161 10

Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg Ile val Lys ASp Leu val Glu 1 5 10 15

Phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe Ala Ile 20 25 30

ASp Gln Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro Phe ASp Cys ASp Ile val Gly35 40 45

rle Ser val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro Leu His 50 55 60

His Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu val Leu Lys Lys Leu 65 70 75 80

Lys Glu 1le Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys 1le val Gly Gln Asn Leu 85 90 95

Lys Phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro val Pro 100 105 110

pro Tyr Phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu

115 120 125 Lys Lys Phe Asn Leu Asp ASp leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly Tyr Lys

130 135 140 Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser phe Ser phe Pro leu Phe Gly

145 150 155 160 Phe Ser Phe Ala Asp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys

165 170 175

Glu ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr lys Thr Leu Ser leu lys180 185 190

Leu His Glu Glu Lys 195

<210> 162

<211> 894 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Dominio exonucleolítico de la ADN polimerasa quimérica eS8 tras la segunda ronda de mutagénesis sustitución DQE de los residuos 323 a 325

<400> 162

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg val Leu Leu 1 5 10 15

val ASP Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASP Gly Tyr Lys Ala val phe 50 55 60

val val Phe ASP Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr pro Glu ASP Phe pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly phe Thr Arg Leu 100 105 110

Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala ASp ASp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg Ile Leu Thr Ala ASp Arg130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu val Ser ASp Arg val Ala val Leu His Pro Glu 145 150 155 160

Gly His Leu rle Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys165 170 175

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Asn Leu Pro Gly val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn rle Leu Lys Asn Leu Asp Arg210 215 220

val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg rle Lys Ala His Leu Glu ASp 225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu Pro Leu 245 250 255

Ala phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly275 280 285

Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg Il e val Lys Asp Leu

290 295 300

val Glu Phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Ar~ Glu Ser Pro Ser Phe 305 310 31 320 Ala Ile ASp Gln Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro Phe ASp Cys ASp Ile

325 330 335 val Gly Ile Ser val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro 340 345 350 Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu val Leu Lys355 360 365 Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys Ile val Gly Gln 370 375 380

405 410 415 Asn Glu Lys Lys Phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly420 425 430 Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu 435 440 445 phe Gly phe Ser Phe Ala ASp Val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr 450 455 460 Ser Cys Glu ASP Ala ~~!? Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser

465 4/U 475 480

Leu Lys Leu His Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr Gln Glu val Glu 485 490 495

Lys Pro Leu Ser Arg val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly val Arg500 505 510

Leu ASp val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu Leu Ala Glu Glu 515 520 525

Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe 530 535 540

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Ser Ala Ala val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro ¡le val Glu

580 585 590 Lys ¡le Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn Thr Tyr val 595 600 605 ASp Pro Leu Pro Gly Leu val His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr 610 615 620

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645 650 65 Arg Arg Ala phe val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu Val Ala Leu Asp660 665 670 Tyr Ser Gln ¡le Glu Leu Arg val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu 675 680 685 Asn Leu ¡le Arg val Phe Gln Glu Gly Lys ASp rle His Thr Gln Thr 690 695 700

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725 730 735 Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala ¡le Pro Tyr Glu Glu Ala Val

740 745 750

Ala phe ¡le Glu Arg Tyr phe Gln Ser Phe Pro Lys val Arg Ala Trp 755 760 765

¡le Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly Tyr val Glu Thr 770 775 780

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Ser val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala phe Asn Met Pro val Gln 805 810 815

820 825 830

His Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln val His Asp Glu

835 840 845 Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu val Ala Ala Leu

850 855 860

Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr pro Leu Ala val pro Leu Glu 865 870 875 880 val Glu val Gly Ile Gly Glu ASp Trp Leu Ser Ala Lys Gly

885 890

<210> 163

<211>197 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

10 <223> ADN polimerasa quimérica e58 tras la segunda ronda de mutagénesis -sustitución DHE de los residuos 323 a 325

<400> 163

Phe Glu Lys Leu 1le Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser phe Ala 1le 20 25 30

ASp His Glu Thr Ser Ser Leu Asp Pro Phe Asp Cys ASp 11 e val Gly

35 40 45

Ile Ser Val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro Leu His SO SS 60

H;S Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys Lys Leu 65 70 75 80

Lys Glu 1le Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys 1le val Gly Gln Asn Leu 85 90 95

Lys Phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro val Pro 100 105 110

Pro Tyr Phe Asp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu leu Glu Pro Asn G1u

115 120 125 Lys L~S Phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly Tyr Lys

1 O 135 140 Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu Phe Gly

145 150 155 160

Phe Ser Phe Ala Asp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys

165 170 175

Glu ASp Ala ASp 1le Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys

180 185 190

Leu His Glu Glu Lys

5 <210> 164

<211> 894

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 10 <220>

<223> ADN polimerasa quimérica eS8 tras la segunda ronda de mutagénesis residues 323-325 DHE substitution

<400> 164

val Asp Gly H;S H;S Leu Ala Tyr Arg Thr phe phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gln Ala val Tyr Gly phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASp Gly Tyr Lys Ala val phe50 55 60

val val Phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg H;s Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

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Leu Ala Leu rle Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu

100 105 110

Glu val Pro Gly phe Glu Ala Asp ASp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg rle Leu Thr Ala ASp Arg

130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg val Ala Val Leu H;s Pro Glu

145 150 155 160

Gly H;S Leu rle Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys165 170 175

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Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn rle Leu Lys Asn Leu Asp Arg210 215 220

val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg rle Lys Ala H;s Leu Glu ASp225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser Asp Leu Pro Leu 245 250 255

Glu val ASp phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270

Ala phe Leu Glu Arg Leu Glu phe Gly Ser Leu Leu H;S Glu phe Gly 275 280 285

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val Glu Phe Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser phe 305 310 315 320

Ala Ile Asp H;s Glu Thr Ser Ser Leu Asp Pro Phe Asp Cys Asp rle 325 330 335

val Gly rle Ser val Ser phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro 340 345 350

Leu H;s H;s Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys 355 360 365

Lys Leu Lys Glu rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys rle val Gly Gln 370 375 380

Asn Leu Lys Phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro 385 390 395 400

val Pro Pro Tyr phe ASp Thr Met Ile Ala Ala Tvr Leu Leu Glu Pro

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405 410 415

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Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser phe Pro Leu 435 440 445

Phe Gly phe Ser Phe Ala Asp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr 450 455 460

Ser Cys Glu ASp Ala ASp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser

465 470 475 480

Leu Lys Leu His Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr Gln Glu val Glu

485 490 495 Lys Pro Leu Ser Arg val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg

sao 505 510 Leu ASp val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu Leu Ala Glu Glu

515 520 525 Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe 530 535 540 Asn Leu Asn Ser Arg ASP Gln Leu Glu Arg val Leu Phe ASp Glu Leu

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565 570 575 Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val Glu 580 585 590 Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn Thr Tyr val

595 600 605 ASp Pro Leu pro Gly Leu val His pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr 610 615 620 Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser ASp

625 630 635 640 Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile

645 650 655 Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu Val Ala Leu ASp

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675 680 685 Asn Leu Ile Arg val Phe Gln Glu Gly Lys ASP Ile His Thr Gln Thr

690 695 700 Ala Ser Trp Met phe Gly val Ser Pro Glu Ala Val ASp Pro Leu Met

705 710 715 720

Arg Arg Ala Ala Lys Thr val Asn Phe Gly val Leu Tyr Gly Met Ser 725 730 735

740 745 750

Ala phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys val Arg Ala Trp 755 760 765

rle Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly Tyr val Glu Thr 770 775 780

Leu phe Gly Arg Arg Arg Tyr val Pro ASp Leu Asn Ala Arg Val Lys 785 79 795 800

Ser val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln 805 810 815

Gly Thr Ala Ala ASp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro 820 825 830

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Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Gl u Val Ala Ala Leu 850 855 860

Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr pro Leu Ala val Pro Leu Glu 865 870 875 880

val Glu val Gly rle Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Gly 885 890

<210> 165

<211> 197 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominio exonucleolítico of ADN polimerasa quimérica eS8 tras la segunda ronda de mutagénesis 10 sustitución DLD de los residuos 323 a 325

<400> 165

phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe Ala Ile 20 25 30

ASP Leu ASp Thr Ser Ser Leu ASP pro Phe ASp Cys ASp Ile val Gly 35 40 45

rle Ser val Ser phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile pro Leu His 50 55 60

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Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg Ile val Lys ASp Leu val Glu

1 5 10 15

phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe Ala Ile 20 25 30

ASp Leu ASp Thr Ser Ser Leu ASp Pro Phe ASp Cys ASp Ile val Gly 35 40 45

Ile Ser val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile pro Leu H;S 50 55 60

His Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu Val Leu Lys Lys Leu

65 70 75 80

<210> 166 5 <211> 894

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

10 <223> ADN polimerasa quimérica eS8 tras la segunda ronda de mutagénesis -sustitución DLD de los residuos 323 a325

<400> 166

val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro val Gln Ala val Tyr Gly phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu ASp Gly Tyr Lys Ala val Phe 50 55 60

val val Phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu ASP Phe Pro Arg Gln 85 90 95

100 105 110

Glu val Pro Gly Phe Glu Ala ASP ASp val Leu Ala Thr Leu Ala LysliS UO U5

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val Arg Ile Leu Thr Ala ASp Arg

130 135 140 ASP Leu Tyr Gln Leu val Ser ASP Arg val Ala val Leu His Pro Glu

145 150 155 160 Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys

165 170 175 pro Glu Gln Trp val ASp Phe Arg Ala Leu val Gly ASp Pro Ser ASp

180 185 190 Asn Leu Pro Gly val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu

195 200 205 Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg

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225 230 235 240 Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu Pro Leu

245 250 255 Glu val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg

260 265 270 Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly

275 280 285 Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg Ile val Lys Asp Leu

290 295 300 val Glu Phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe

305 310 315 320 Ala Ile Asp Leu ASp Thr Ser Ser Leu ASp pro phe ASp cys ASp Ile 325 330 335 val Gly Ile Ser val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro

340 345 350 Leu His H;s Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASP Glu Lys Glu val Leu Lys355 360 365 Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys Ile Val Gly Gln

370 375 380

val pro pro Tyr phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu pro

405 410 415

Asn Glu Lys L~S phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly

4 O 425 430 Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser phe Ser Phe Pro Leu

435 440 445 phe Gly Phe Ser Phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr

450 455 460 Ser cys Glu ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser

465 470 475 480 Leu Lys Leu His Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr Gln Glu val Glu

485 490 495 Lys Pro Leu Ser Arg val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly val Arg500 505 510 Leu ASp val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu leu Ala Glu Glu

515 520 525 rle Arg Arg Leu Glu Glu Glu val phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe

530 535 540 Asn leu Asn Ser Arg ASp Gln leu Glu Arg val leu phe ASp Glu Leu

545 550 555 560 Arg Leu pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr 565 570 575 Ser Ala Ala val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala H;s Pro rle Val Glu

580 585 590 Lys rle Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn Thr Tyr val 595 600 605 ASp Pro Leu pro Gly Leu val H;S Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr

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625 630 635 640 Pro Asn Leu Gln Asn rle Pro rle Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg rle

645 650 655

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Asn Leu ¡le Arg val Phe Gln Glu Gly Lys Asp ¡le His Thr Gln Thr 690 695 700

Ala Ser Trp Met phe Gly val Ser Pro Glu Ala val Asp Pro Leu Met 705 710 715 720

Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly val Leu Tyr Gly Met Ser 725 730 735

Ala H;S Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala ¡le Pro Tyr Glu Glu Ala val 740 745 750

Ala phe ¡le Glu Arg Tyr Phe Gln Ser phe Pro Lys val Arg Ala Trp 755 760 765

¡le Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly Tyr val Glu Thr 770 775 780

Leu phe Gly Arg Arg Arg Tyr val Pro Asp Leu Asn Ala Arg val Lys785 79 795 800

Ser val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala phe Asn Met Pro val Gln 805 810 815

Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met val Lys Leu phe Pro 820 825 830

His Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln val His ASp Glu 835 84 845

Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Gl u val Ala Ala Leu 850 855 860

Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala val Pro Leu Glu

865 870 875 880

val Glu val Gly ¡le Gly Glu ASp Trp Leu Ser Ala Lys Gly885 890

<210> 167

<211>197 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominio exonucleolítico of ADN polimerasa quimérica eS8 tras la segunda ronda de mutagénesis 10 sustitución ELD de los residuos 323 a 325

<400> 167

1 5 10 15

Phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe Ala rle

20 25 30 Glu Leu Asp Thr Ser Ser Leu Asp pro Phe ASP Cys ASp rle val Gly

35 40 45 rle Ser val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr rle Pro Leu His 50 55 60 His Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Gl u val Leu Lys Lys Leu

65 70 75 80 Lys Glu rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys Ile Val Gly Gln Asn Leu

85 90 95 Lys phe Asp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu pro val pro

100 105 110

Pro Tyr phe ASP Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu pro Asn Glu

115 120 125 Lys Phe Asn Leu ASp ASP Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly Tyr Lys

L~S

1 O 135 140

Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe pro Leu phe Gly145 150 155 160 Phe Ser Phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys

165 170 175 Glu ASp Ala Asp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys

180 185 190 Leu His Glu Glu Lys

<210> 168

<211> 894 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa quimérica eS8 tras la segunda ronda de mutagénesis -sustitución ELD de los residuos 323 10 a 325

<400> 168

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu phe Glu Pro Lys Gly Arg val Leu Leu 1 5 10 15

val ASp Gly His H;S Leu Ala Tyr Arg Thr phe phe Ala Leu Lys Gly

20 25

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu pro val Gln Ala val Tyr Gly phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala val Phe 50 55 60

val val Phe ASp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg Hi s Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln 85 90 95

Leu Ala Leu ¡le Lys Glu Leu val ASp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu 100 105 110

Glu val Pro Gly phe Glu Ala ASp Asp val Leu Ala Thr Leu Ala Lys115 120 125

Lys Ala Glu Arg Gl u Gly Tyr Gl u val Arg ¡le Leu Thr Ala Asp Arg130 135 140

ASp Leu Tyr Gln Leu val Ser ASp Arg val Ala val Leu His pro Glu 145 150 155 160

Gly His Leu ¡le Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys

165 170 175

Pro Glu Gln Trp val ASp phe Arg Ala Leu val Gly Asp pro Ser ASp180 185 190

Asn Leu Pro Gly val Lys Gly ¡le Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu

195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn ¡le Leu Lys Asn Leu ASp Arg210 215 220

val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg ¡le Lys Ala His Leu Glu Asp

225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser Asp Leu pro Leu

245 250 255

Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg

260 265 270

Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu phe Gly 275 280 285

Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg ¡le val Lys ASp Leu 290 295 300

val Glu Phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe

305 310 315 320 Ala Ile Glu Leu ASp Thr Ser Ser Leu ASp pro Phe ASp Cys ASp Ile

325 330 335 val Gly Ile Ser val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro

340 345 350 Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp Glu Lys Glu val Leu Lys355 360 365 Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys Ile val Gly Gln 370 375 380

435 440 445 Phe Gly Phe Ser phe Ala ASp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr450 455 460 Ser Cys Glu ASp Ala Asp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser

465 470 475 480 Leu Lys Leu His Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr Gln Glu val Glu

485 490 495 Lys Pro Leu Ser Arg val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly val Arg500 505 510 Leu ASp val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu Leu Ala Glu Glu 515 520 525 Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu val phe Arg Leu Ala Gly His Pro phe53 535 540 Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg val Leu Phe ASp Glu Leu

545 550 555 560

Arg Leu pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr 565 570 575

Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn Thr Tyr val 595 600 605

ASp Pro Leu Pro Gly Leu val His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr

610 615 620 Arg phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser ASp

625 630 635 640 Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile 645 650 655 Arg Arg Ala Phe val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu val Ala Leu ASp660 665 670 Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg val Leu Ala His Leu Ser Gly ASp Glu

675 680 685 Asn Leu Ile Arg val Phe Gln Glu Gly Lys Asp rle His Thr Gln Thr 690 695 700 Ala Ser Trp Met phe Gly val Ser Pro Glu Ala val Asp Pro Leu Met

705 710 715 720 Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly val Leu Tyr Gly Met Ser

725 730 735 Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Ala val

740 745 750 Ala Phe Ile Glu Arg Tyr phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala Trp

755 760 765 Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly Tyr val Glu Thr

770 775 780

Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr val Pro Asp Leu Asn Ala Arg Val lys785 790 795 800 Ser val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala phe Asn Met Pro val Gln

805 810 815 Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met val Lys Leu Phe Pro

850 855 860

Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala val Pro Leu Glu

865 870 875 880

val Glu val Gly Ile Gly Glu ASP Trp Leu Ser Ala Lys Gly

885 890

<210> 169

<211>197 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominio exonucleolítico of ADN polimerasa quimérica eS8 tras la segunda ronda de mutagénesis 10 sustitución ELE de los residuos 323 a 325

<400> 169

Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg rle val Lys Asp Leu val Glu

1 5 10 15

Phe Glu Lys Leu rle Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe Ala rle

20 25 30

Glu Leu Glu Thr Ser Ser Leu ASp Pro phe ASp Cys ASp rle val Gly

35 40 45

rle Ser val Ser phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro Leu His

50 55 60

His Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu val Leu Lys Lys Leu

65 70 75 80

Lys Glu rle Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys rle val Gly Gln Asn Leu

85 90 95

Lys phe ASp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro val Pro

100 105 110

Pro Tyr Phe Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu

115 UO U5

Lys L~S phe Asn Leu ASp ASp Leu Ala Leu Lys phe Leu Gly Tyr Lys

1 O 135 140

Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu phe Gly

145 150 155 160

Phe Ser Phe Ala Asp val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys

165 170 175

Glu Asp Ala ASp rle Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys

180 185 190

Leu His Glu Glu Lys

<210> 170

<211> 894

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa quimérica eS8 tras la segunda ronda de mutagénesis -sustitución ELE de los residuos 323

5: a325

<400> 170

Met 1: Lys Ala Met Leu 5 Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg val 10 Leu 15 Leu

val: ASp Gly His 20 His Leu Ala Tyr Arg Thr 25 phe Phe Ala Leu 30 Lys Gly

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu 35: Pro val 40 Gln Ala Val Tyr Gly 45 Phe Ala

Lys Ser Leu 50: Leu Lys Ala Leu 55 Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala val 60 phe

val 65: val Phe Asp Ala Lys Ala 70 Pro Ser Phe Arg Hi s 75 Glu Ala Tyr Glu 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala 85: Pro Thr Pro Glu Asp phe 90 Pro Arg Gln 95

Leu Ala Leu: rle Lys100 Glu Leu val ASp105 Leu Leu Gly Phe Thr Arg110 Leu

Glu Val: Pro Gly115 Phe Glu Ala Asp Asp Val 120 Leu Ala Thr Leu Ala Lys125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu val 130 135: Arg rle Leu Thr Ala ASp Arg140

ASp145: Leu Tyr Gln Leu val Ser Asp Arg val 150 Ala Val 155 Leu His Pro Glu 160

Gly His: Leu rle Thr 165 Pro Glu Trp Leu Trp Glu 170 Lys Tyr Gly Leu 175 Lys

pro Glu Gln Trp val ASp phe Arg Ala Leu val 180 185: Gly ASP Pro Ser ASp190

Asn: Leu Pro Gly val 195 Lys Gly rle Gly Glu 200 Lys Thr Ala Leu 205 Lys Leu

Leu: Lys Glu Trp Gly Ser Leu 210 215 Glu Asn rle Leu Lys Asn 220 Leu ASp Arg

val Lys Pro Glu Ser val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu ASp

225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg val Arg Ser ASp Leu pro Leu

245 250 255

Glu val ASP Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro ASp Arg Glu Gly Leu Arg

260 265 270 Ala phe Leu Glu Arg Leu Glu phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly275 280 285 Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro val Gly Tyr Arg Ile val Lys ASp Leu

290 295 300

val Glu Phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser pro Ser phe305 310 315 320 Ala Ile Glu Leu Glu Thr Ser Ser Leu Asp Pro Phe Asp Cys Asp Ile

325 330 335 val Gly Ile Ser val Ser Phe Lys pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro

340 345 350

Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu val Leu Lys

355 360 365 Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu ASp Pro Gly Ala Lys Ile val Gly Gln

370 375 380 Asn Leu Lys Phe Asp Tyr Lys val Leu Met val Lys Gly val Glu Pro

385 390 395 400 val Pro Pro Tyr Phe ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu pro

405 410 415 Asn Glu Lys Lys Phe Asn Leu ASp Asp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly

420 425 430 Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu

435 440 445 phe Gly phe Ser phe Ala ASP val Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr

450 455 460

Ser Cys Glu Asp Ala ASp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser

465 470 475 480

Leu Lys Leu His Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr Gln Glu val Glu 485 490 495

Leu ASp val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu Leu Ala Glu Glu

515 520 525 rle Arg Arg Leu Glu Glu Glu val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe 530 535 540 Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg val Leu phe ASp Glu Leu

545 550 555 560 Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr

565 570 575 Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His pro ¡le val Glu

580 585 590 Lys ¡le Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn Thr Tyr val 595 600 605 ASp Pro Leu Pro Gly Leu val His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr

610 615 620 Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser ASp

625 630 635 640 Pro Asn Leu Gln Asn ¡le Pro rle Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg ¡le

645 650 655 Arg Arg Ala Phe val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu val Ala Leu Asp660 665 670 Tyr Ser Gln ¡le Glu Leu Arg val Leu Ala His Leu Ser Gly ASp Glu

675 680 685 Asn Leu ¡le Arg val Phe Gln Glu Gly Lys Asp ¡le His Thr Gln Thr 690 695 700 Ala Ser Trp Met phe Gly val Ser Pro Glu Ala val ASp Pro Leu Met

705 710 715 720 Arg Arg Ala Ala Lys Thr val Asn Phe Gly val Leu Tyr Gly Met Ser 725 730 735 Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala ¡le Pro Tyr Glu Glu Ala val

740 745 750 Ala Phe ¡le Glu Arg Tyr Phe Gln Ser phe Pro Lys val Arg Ala Trp 755 760 765 ¡le Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly Tyr val Glu Thr

770 775 780

Ser val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro val Gln 805 810 815

Gly Thr Ala Ala ASp Leu Met Lys Leu Ala Met val Lys leu Phe Pro 820 825 830

His leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met leu leu Gln val H;s ASP Glu 835 840 845

Leu Leu leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu val Ala Ala leu 850 855 860

Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro leu Ala Val Pro Leu Glu

865 870 875 880

val Glu val Gly ¡le Gly Glu ASp Trp Leu Ser Ala Lys Gly885 890

<210> 171

<211> 2685 5 <212>ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Ácido nucleico codificante de la ADN polimerasa termoestable quimérica eS8 10

<400> 171

atgaaagcta tgttaccatt attcgaaccc aaaggccggg tcctcctggt ggacggccac 60 cacctggcct accgcacctt cttcgccctg aagggcctca ccacgagccg gggcgaaccg 120 gtgcaggcgg tttacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctgaagga ggacgggtac 180 aaggccgtct tcgtggtctt tgacgccaag gccccttcct tccgccacga ggcctacgag 240 gcctacaagg caggccgcgc cccgaccccc gaggacttcc cccggcagct cgccctcatc 300 aaggagctgg tggacctcct ggggtttact cgcctcgagg ttccgggctt tgaggcggac 360 gacgtcctcg ccaccctggc caagaaggcg gaaagggagg ggtacgaggt gcgcatcctc 420 accgccgacc gggaccttta ccagctcgtc tccgaccgcg tcgccgtcct ccaccccgag 480 ggccacctca tcaccccgga gtggctttgg gagaagtacg gccttaagcc ggagcagtgg 540 gtggacttcc gcgccctcgt gggggacccc tccgacaacc tccccggggt caagggcatc 600 ggggagaaga ccgccctcaa gctcctcaag gagtggggaa gcctggaaaa tatcctcaag 660 aacctggacc gggtgaagcc ggaaagcgtc cgggaaagga tcaaggccca cctggaagac 720 cttaagctct ccttggagct ttcccgggtg cgctcggacc tccccctgga ggtggacttc 780 gcccggaggc gggagcctga ccgggaaggg cttcgggcct ttttggagcg cttggagttc 840 ggcagcctcc tccacgagtt cggccttcta gaggagtccg aacccgttgg gtaccgtata 900 gttaaagacc tggttgaatt tgaaaaactc atagagaaac tgagagaatc tccttcgttc 960

gtgtctttca aaccaaagga agcgtactac ataccactcc atcatagaaa cgcccagaac 1080

ctggacgaaa aagaggttct gaaaaagctc aaagaaattc tggaggaccc cggagcaaag 1140

atcgttggtc agaatttgaa attcgattac aaggtgttga tggtgaaggg tgttgaacct 1200

gttcctcctt acttcgacac gatgatagcg gcttaccttc ttgagccgaa cgaaaagaag 1260

ttcaatctgg acgatctcgc attgaaattt cttggataca aaatgacatc ttaccaagag 1320

ctcatgtcct tctcttttcc gctgtttggt ttcagttttg ccgatgttcc tgtagaaaaa 1380

gcagcgaact actcctgtga agatgcagac atcacctaca gactttacaa gaccctgagc 1440

ttaaaactcc acgaggaaaa gcttctttgg ctctaccaag aggtggaaaa gcccctctcc 1500

cgggtcctgg cccacatgga ggccaccggg gtaaggctgg acgtggccta tctaaaggcc 1560

ctttccctgg agcttgcgga ggagattcgc cgcctcgagg aggaggtctt ccgcctggcg 1620

ggccacccct tcaacctgaa ctcccgtgac cagctagagc gggtgctctt tgacgagctt 1680

aggcttcccg ccctgggcaa gacgcaaaag acggggaagc gctccaccag cgccgcggtg 1740

ctggaggccc tcagggaggc ccaccccatc gtggagaaga tcctccagca ccgggagctc 1800

accaagctca agaacaccta cgtggacccc ctcccgggcc tcgtccaccc gaggacgggc 1860

cgcctccaca cccgcttcaa ccagacagcc acggccacgg gaaggctctc tagctccgac 1920

cccaacctgc agaacatccc catccgcacc cccttgggcc agaggatccg ccgggccttc 1980

gtggccgagg cgggatgggc gttggtggcc ctggactata gccagataga gctccgggtc 2040

ctcgcccacc tctccgggga cgagaacctg atcagggtct tccaggaggg gaaggacatc 2100

cacacccaga ccgcaagctg gatgttcggc gtctccccgg aggccgtgga ccccctgatg 2160

cgccgggcgg ccaagacggt gaacttcggc gtcctctacg gcatgtccgc ccataggctc 2220

tcccaggagc ttgccatccc ctacgaggag gcggtggcct ttatagagcg ctacttccaa 2280

agcttcccca aggtgcgggc ctggatagaa aagaccctgg aggaggggag gaagcggggc 2340

tacgtggaaa ccctcttcgg aagaaggcgc tacgtgcccg acctcaacgc ccgggtgaag 2400

agcgtcaggg aggccgcgga gcgcatggcc ttcaacatgc ccgtccaggg caccgccgcc 2460

gacctcatga agctcgccat ggtgaagctc ttcccccacc tccgggagat gggggcccgc 2520

atgctcctcc aggtccacga cgagctcctc ctggaggccc cccaagcgcg ggccgaggag 2580

gtggcggctt tggccaagga ggccatggag aaggcctatc ccctcgccgt gcccctggag 2640

gtggaggtgg ggatcgggga ggactggctt tccgccaagg gctga 2685

<210> 172

<211> 100 5 <212> PRT

<213> Thermus thermophilus

<400> 172

Gly Leu Lys ASP Leu Lys Glu val Arg Gly leu leu Ala lys ASp Leu

20 25 30

Ala val leu Ala Ser Arg Glu Gly leu ASP leu val Pro Gly Asp ASp35 40 45

pro Met Leu Leu Ala Tyr leu leu ASP pro Ser Asn Thr Thr Pro Glu 50 55 60

Gly val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu ASp Ala Ala His 65 70 75 80

Arg Ala leu leu Ser Glu Arg leu His Arg Asn leu leu Lys Arg Leu 85 90 95

Glu Gly Glu Glu 100

<210> 173 5 <211> 100

<212> PRT

<213> Thermus caldofilus

<400> 173 10

Ala Ala Cys Arg ASp Gly Arg val His Arg Ala Ala ASp Pro Leu Ala 1 5 10 15

Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu val Arg Gly Leu Leu Ala Lys Asp Leu 20 25 30

Ala val Leu Ala Ser Arg Glu Gly Leu ASp Leu val Pro Gly Asp Asp 35 40 45

Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu ASp Pro Ser Asn Thr Thr Pro Glu

50 55 60

Gly val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu ASp Ala Ala His 65 70 75 80

Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu His Arg Asn Leu Leu Lys Arg leu 85 90 95

Gln Gly Glu Glu 100

<210> 174

<211> 100 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> <223> ADN polimerasa de z05

<400> 174

Ala Ala Cys Lys Glu Gly Arg Val His Arg Ala Lys ASp Pro Leu Ala

1 5 10 15

Gly Leu Lys ASp Leu Lys Glu val Arg Gly Leu Leu Ala Lys ASP Leu 20 25 30

Ala val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu ASp Leu Ala Pro Ser ASp ASp 3S 40 45

Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu ASp Pro Ser Asn Thr Thr pro Glu 50 55 60

Gly val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu Asp Ala Ala H; s

65 70 75 80

Arg Ala Leu Leu Ala Glu Arg Leu Gln Gln Asn Leu Leu Glu Arg Leu 85 90 95

Lys Gly Glu Glu

100 5

<210> 175

<211> 100

<212> PRT

<213> Thermus aquaticus 10

<400> 175

Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg val His Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Lys1 5 10 15

Ala Leu Arg ASp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu Ala Lys ASp Leu 20 25 30

Ser val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly ASp ASp 35 40 45

Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu ASp Pro Ser Asn Thr Thr Pro Glu 50 55 60

Gly val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu Glu Ala Gly Glu 65 70 75 80

Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu phe Ala Asn Leu Trp Gly Arg Leu 85 90 95

Glu Gly Glu Glu 100

<210> 176

<211> 100

<212> PRT

<213> Thermus flavus

<400> 176

Ala Gly Ala Trp Glu Gly Arg Leu His Arg Ala Gln ASp Pro Leu Arg1 5 10 15

Gly Leu Arg ASp Leu Lys Gly val Arg Gly rle Leu Ala Lys ASp Leu 20 25 30

Ala Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu ASp Leu Phe Pro Glu ASp ASp35 40 45

Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu ASp Pro Ser Asn Thr Thr Pro Glu 50 55 60

Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu ASp Ala Gly Glu 65 70 75 80

Arg Ala Leu Leu Ala Glu Arg Leu Phe Gln Thr Leu Lys Glu Arg Leu 85 90 95

LyS Gly Glu Glu

10 <210> 177

<211> 100

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> ADN polimerasa Tfi

<400> 177

Ala Gly Ala Lys Glu Gly Arg val His Arg Ala Glu Asp pro val Gly

1 5 10 15

Ala Leu Lys ASp Leu Lys Glu rle Arg Gly Leu Leu Ala Lys ASp Leu

20 25 30

Ser val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Arg Glu rle Pro Pro Gly ASp ASp35 40 45

Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Gly Asn Thr Asn pro Glu

50 55 60

Gly val Ala Arg Arg tyr Gly Gly Glu Trp Lys Glu ASp Ala Ala Ala

65 70 75 80

Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu Trp Gln Ala Leu tyr Pro Arg val

85 90 95

Ala Glu Glu Glu

<210> 178

<211> 100 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa Sps17 10

<400> 178

Ala Gly Ala Lys Glu Gly Arg val His Arg Ala Glu ASp Pro val Gly1 5 10 15

Ala Leu Lys ~6P Leu Lys Glu Ile ~5g Gly Leu Leu Ala ~bs ASp Leu

Ser val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Arg Glu Ile pro Pro Gly ASp ASP 35 40 45

Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu ASp Pro Gly Asn Thr Asn Pro Glu 50 55 60

Gly val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Lys Glu ASp Ala Ala Ala 65 70 75 80

Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu Trp Gln Ala Leu Tyr Pro Arg Val 85 90 95

Ala Glu Glu Glu 100

<210> 179 15 <211> 118

<212> PRT <213> Secuencia artificial

<220>

<223> AON polimerasa Ora

<400> 179

Thr lys lys Glu Gln Lys Ala Leu Glu lys Ala Gln Lys ASp Ala Glu 1 5 10 15

lys Ala Arg Ala Lys Leu Arg Glu Gln Phe Pro Ala Thr Val ASp Glu 20 25 30

Ala Glu phe val Gly Gln Arg Thr val Thr Ala Ala Ala Ala Lys Ala 35 40 45

Leu Ala Ala His leu Ser val Arg Gly Thr val val Glu Pro Gly Asp50 55 60

ASP Pro Leu Leu Tyr Ala Tyr Leu leu Asp Pro Ala Asn Thr Asn Met

65 70 75 80

Pro val val Ala Lys Arg Tyr Leu Asp Arg Glu Trp Pro Ala Asp Ala 85 90 95

Pro Thr Arg Ala Ala rle Thr Gly His Leu Val Arg Glu Leu Pro Pro

100 105 110

Leu Leu ASP Asp Ala Arg

<210> 180

<211> 129

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<223> AON polimerasa HSP-B-7

<400> 180

Asn Arg Leu Arg ASp Ala Thr Leu His Gly val Ala Leu Ala val Ala 1 5 10 15

Ser ASp Arg Ala val Trp Leu Glu Leu Gly Gly Ser Leu phe Leu Pro 20 25 30

Glu Pro Leu Thr Arg Leu Leu Asn ASp Pro Gln Arg Ala Arg Al a Val 35 40 45

Trp Asp Leu Lys Thr Glu cys Leu Leu Leu Arg Gly Ala Gly rle ASpSO 55 60

Ala Arg pro Ala His Phe ASp Ala Leu Leu Ala Ala Tyr Leu Trp Gln

65 70 75 80

pro Ser Arg Ala Ala Tyr Thr Leu Asp Trp Leu Cys Glu ASP val Leu

85 90 95

Arg Leu Arg Leu Pro Asp ASp Pro Asp Ala Arg Pro Ala Ala Glu Ala 100 105 110

cys Ala Leu Leu Met Leu Gln Pro Arg Leu Arg ASP rle Leu His Arg115 120 125

Glu

<210> 181

<211> 153 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa Bst 10

<400> 181

Ala Leu val val Glu val val Gly ASp Asn Tyr His His Ala Pro rle

1 5 10 15

val Gly rle Ala Leu Ala Asn Glu Arg Gly Arg Phe Phe Leu Arg Pro 20 25 30

Thr Lys Lys Lys Thr Met phe ASp Ser Lys Arg Ala Ala val Ala Leu 50 55 60

Lys Trp Lys Gly rle Glu Leu Arg Gly val val Phe ASP Leu Leu Leu 65 70 75 80

Ala Ala Tyr Leu Leu ASp Pro Ala Gln Ala Ala Gly ASP val Ala Ala 85 90 95

val Ala Lys Met H;S Gln Tyr Glu Ala val Arg Ser ASp Glu Ala val 100 105 110

Tyr Gly Lys Gly Ala Lys Arg Thr val Pro Asp Glu pro Thr Leu Ala 115 120 125

Glu H;S Leu Ala Arg Lys Ala Ala Ala rle Trp Ala Leu Glu Glu Pro 130 135 140

Leu Met ASp Glu Leu Arg Arg Asn Glu 145 150

<210> 182

<211> 153 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa Bca 10

<400> 182

1 5 10 15

val Gly rle Ala val val Asn Glu His Gly Arg phe phe Leu Arg Pro

20 25 30

Glu Thr Ala Leu Ala ASp Pro Gln phe val Ala Trp Leu Gly ASp Glu 35 40 45

Thr Lys Lys Lys Ser Met Phe ASp Ser Lys Arg Ala Ala val Ala Leu 50 55 60

Lys Trp Lys Gly rle Glu Leu Cys Gly val Ser Phe ASp Leu Leu Leu 65 70 75 80

Ala Ala Tyr Leu Leu ASp pro Ala : Gln Gly val ASp ASp val Ala Ala 85 90 95

Ala Ala Lys Met Lys Gln Tyr Glu Ala val Arg Pro ASp Glu Ala val

100 105 110 Tyr Gly Lys Gly Ala Lys Arg Ala val Pro ASp Glu Pro val Leu Ala

115 120 125 Glu His Leu val Arg Lys Ala Ala Ala ¡le Trp Ala Leu Glu Arg Pro

130 135 140 phe Leu Asp Glu Leu Arg Arg Asn Glu

145 150

<210> 183 5 <211>174

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 183

Asn rle Ser Ala Asn Leu val Gly Leu Ser Phe Ala rle Glu Pro Gly20 25 30

val Ala Ala Tyr rle pro val Ala His ASp Tyr Leu ASp Ala Pro ASp 35 40 45

Gln rle Ser Arg Glu Arg Ala Leu Glu Leu Leu Lys Pro Leu Leu Glu 50 55 60

ASp Glu Lys Ala Leu Lys val Gly Gln Asn Leu Lys Tyr ASp Arg Gly65 70 75 80

rle Leu Ala Asn Tyr Gly rle Gl u Leu Arg Gly rle Ala Phe Asp Thr 85 90 95

Met Leu Glu Ser Tyr rle Leu Asn Ser val Ala Gly Arg His ASp Met 100 105 110

Ae;n Arn Trn I ve; H;s I ve; Phe Glu

••-1"'" Ser Leu Ala Glu ... ...... Leu -J -Thr Ile Thr 115 ~ 120 125

-J-

Glu rle Ala Gly Lys Gly Lys Asn Gln Leu Thr Phe Asn Gln rle Ala 130 135 140

Leu Glu Glu Ala Gly Arg Tyr Ala Ala Glu ASp Ala ASp val Thr Leu 145 150 155 160

Gln Leu His Leu Lys Met Trp Pro Asp Leu Gln Lys His Lys165 170

<210> 184

<211> 173 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Thermatoga maritima 10

<400> 184

Pro Phe ASP Cys ASP Ile val Gly Ile Ser val Ser Phe Lys Pro Lys20 25 30

Glu Ala Tyr Tyr rle pro Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu ASp35 40 45

Glu Lys Glu val Leu Lys Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu ASp Pro Gly 50 55 60

Ala Lys rle val Gly Gln Asn Leu Lys phe ASP Tyr Lys val Leu Met

65 70 75 80

val Lys Gly val Glu Pro val Pro Pro Tyr Phe Asp Thr Met Ile Ala 85 90 95

Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu Lys Lys phe Asn Leu ASp ASp Leu

100 105 110

Ala Leu Lys phe Leu Gly Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met 115 120 125

Ser Phe Ser Phe Pro Leu Phe Gly Phe Ser Phe Ala ASp Val Pro val 130 135 140

Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser cys Glu ASp Ala ASp rle Thr Tyr Arg 145 150 155 16

Leu Tyr Lys Thr Leu Ser Leu Lys Leu His Glu Ala ASp165 170

<210> 185

<211> 173 5 <212> PRT

<213> Thermotoga neapolitana

<400> 185

Lys Glu val Pro Ser phe Ala Leu Asp Leu Glu Thr Ser Ser Leu Asp 1 5 10 15

Pro Phe Asn Cys Glu Ile val Gly Ile Ser val Ser Phe Lys Pro Lys 20 25 30

Thr Ala Tyr Tyr Ile Pro Leu His His Arg Asn Ala His Asn Leu Asp35 40 45

Glu Thr Leu Val Leu Ser Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu Asp Pro Ser

50 55 60

Ser Lys rle val Gly Gln Asn Leu Lys Tyr ASP Tyr Lys val Leu Met 65 70 75 80

val Lys Gly rle Ser Pro val Tyr Pro His Phe ASp Thr Met rle Ala 85 90 95

Ala Tyr Leu Leu Glu pro Asn Glu Lys Lys phe Asn Leu Glu ASp Leu 100 105 110

Ser Leu Lys Phe Leu Gly Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met 115 120 125

Ser phe Ser Ser Pro Leu Phe Gly Phe Ser phe Ala ASP val Pro val 130 135 140

ASp Lys Ala Ala Glu Tyr Ser Cys Glu ASp Ala Asp rle Thr Tyr Arg145 150 155 160

Leu Tyr Lys rle Leu Ser Met Lys Leu His Glu Ala Glu 165 170

<210> 186

<211> 173 5 <212> PRT

<213> Thermosipho africanus

<400> 186

Pro Phe Gl u Ala Lys Leu Val Gly rle Ser Ile Ser Thr Met Glu Gly

20 25 30 Lys Ala Tyr Tyr Ile pro val Ser His Phe Gly Ala Lys Asn rle Ser 35 40 45 Lys Ser Leu rle Asp Lys Phe Leu Lys Gln rle Leu Gln Glu Lys ASp50 55 60 Tyr Asn rle val Gly Gln Asn Leu Lys Phe ASp Tyr Glu rle Phe Lys

65 70 75 80 Ser Met Gly Phe Ser Pro Asn val Pro His Phe Asp Thr Met rl e Ala 85 90 95 Ala Tyr Leu Leu Asn Pro ASP Glu Lys Arg Phe Asn Leu Glu Glu Leu

100 105 110 Ser Leu Lys Tyr Leu Gly Tyr Lys Met Ile Ser Phe ASp Glu Leu val 115 120 125 Asn Glu Asn Val Pro Leu Phe Gly Asn ASP Phe Ser Tyr val Pro Leu 130 135 140

Glu Arg Ala val Glu Tyr Ser Cys Glu ASp Ala ASp val Thr Tyr Arg145 150 155 160 Ile Phe Arg Lys Leu Gly Arg Lys rle Tyr Glu Asn Glu

165 170

<210> 187 5 <211> 168

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> ADN polimerasa HSP-A

<400> 187

ASp Pro Arg Asp Ala Gln Leu Val Gly rle Gly cys Cys Trp Ser Glu 20 25 30

Arg Asp val Ala Tyr Leu Pro rl e Gly His Arg Gln Gly Ser Asn Leu 35 40 45

ASp Trp Asn Leu val Lys Gln Ser Leu Gln Pro rle Trp Glu ASp Pro 50 55 60

Ser Arg pro Lys Ser Leu Gln Asn cys Lys Tyr ASp Leu Ser Ile phe 65 70 75 80

Arg Ala His Gly rle Arg Leu Gln Gly rle Gln Phe Asp Pro Met Leu 85 90 95

Ala Ser Tyr val Leu Asn Pro Glu Ala Ser His Asn Leu Ala ASp Leu 100 105 110

Ala Ala Thr Tyr Leu Asn Leu pro Thr Thr Ala Ser His Glu Leu Leu 115 120 125

Gly Lys Ala Glu Ser Ile Ala ASp Leu pro rle Pro Lys val Ala Glu 130 135 140

Tyr Cys Gly Thr ASp Ala Tyr Cys Ala Tyr Arg Leu Val Pro Ile Leu 145 150 155 160

Thr Glu Lys Leu Gln Gln Thr ASp 165

<210> 188 5 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> motivo EXO II de la ADN polimerasa Tma

<400> 188

Gln ASn Leu LyS phe ASp Tyr Lys val 1 5

<210> 189

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 20

<220>

<223> motivo EXO Ila de la ADN polimerasa Tma

<400> 189

ASp Thr Met rle Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro 1 5 W

5 <210>190

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> motivo EXO III de la ADN polimerasa Tma

<400> 190

Pro val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr Ser Cys Glu ASp Ala

1 S 10

<210>191

<211> 773

<212> PRT 20 <213> Thermococcus gorgonarius

<400> 191

Met rle Leu ASp Thr Asp Tyr rle Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val rle 1 5 10 15

Arg rle Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys rle ASp Tyr ASp Arg 20 25 30

Asn phe Glu Pro Tyr rle Tyr Ala Leu Leu Lys ASP ASp Ser Ala rle 35 40 45

Glu ASp val Lys Lys rle Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Thr val Arg50 55 60

val val Arg Ala Glu Lys val Lys Lys Lys phe Leu Gly Arg Pro rle 65 70 75 80

Glu val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln ASP val Pro Ala rle 85 90 95

Arg Asp Lys rle Lys Glu His Pro Ala val val Asp rle Tyr Glu Tyr

100 105

ASp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile ASp Lys Gly Leu Ile Pro 115 120 125

Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe ASp Ile Glu Thr 130 135 140

Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile 145 150 155 160

Ser Tyr Ala ASp Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Asn Ile

165 170 175 ASp Leu Pro Tyr val ASp val val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys180 185 190 Arg Phe Leu Lys val val Lys Glu Lys ASp pro Asp val Leu Ile Thr 195 200 205 Tyr Asn Gly Asp Asn Phe ASp phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Ser Glu 210 215 220

Lys Leu Gly val Lys Phe Ile Leu Gly Arg Glu Gly Ser Glu Pro Lys225 230 235 240 Ile Gln Arg Met Gly ASp Arg phe Ala val Glu val Lys Gly Arg Ile

245 250 255 His Phe Asp Leu Tyr Pro val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr

260 265 270 Tyr Thr Leu Glu Ala val Tyr Glu Ala Ile phe Gly Gln Pro Lys Glu 275 280 285 Lys val Tyr Ala Glu Glu Ile Ala Gln Ala Trp Glu Thr Gly Glu Gly

290 295 300

Leu Glu Arg val Ala Arg Tyr Ser Met Glu ASP Ala Lys val Thr Tyr 305 310 315 320 Glu Leu Gly Lys Glu phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu

325 330 335

val Gly Gln Ser Leu Trp ASp val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350

val Glu Trp phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala 355 360 365

Pro Asn Lys Pro Asp Glu Arg Glu Leu Ala Arg Arg Arg Glu Ser Tyr 370 375 380

val Tyr Leu ASp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His 405 410 415

Asn val Ser Pro ASP Thr Leu Asn Arg Glu Gly cys Glu Glu Tyr ASp420 425 430

val Ala pro Gln val Gly His Lys Phe Cys Lys ASp Phe Pro Gly Phe 435 440 445

Ile Pro Ser Leu Leu Gly ASp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys val Lys450 455 460

Lys Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Lys Lys Leu Leu Asp465 470 475 480

Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser phe Tyr Gly Tyr 485 490 495

Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser 500 505 510

val Thr Ala Trp Gly Arg Gln Tyr Ile Glu Thr Thr Ile Arg Glu Ile 515 520 525

Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys val Leu Tyr Ala Asp Thr ASp Gly phe530 535 540

Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala ASp Ala Glu Thr val Lys Lys Lys Ala 545 550 555 560

Lys Glu phe Leu ASp Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu 565 570 575

Leu Glu Tyr Glu Gly phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys 580 585 590

Lys Tyr Ala val Ile ASp Glu Glu ASp Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu 595 600 605

Glu Ile Val Arg Arg ASp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala 610 615 620

Arg val Leu Glu Ala rle Leu Lys His Gly ASp val Glu Glu Ala val

625 630 635 640

Arg Ile val Lys Glu val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu val Pro

645 650 655 pro Glu Lys Leu val Ile Tyr Glu Gln Ile Thr Arg ASp Leu Lys ASP

Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala val Ala Lys Arg Leu Ala Ala 675 680 685

Arg Gly Ile Lys Ile Arg Pro Gly Thr val Ile Ser Tyr Ile val Leu 690 695 700

Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly ASp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe 705 710 715 720

ASp Pro Ala Lys His Lys Tyr ASp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln 725 730 735

val Leu Pro Ala val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys 740 745 750

Glu ASp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln val Gly Leu Gly Ala Trp 755 760 765

Leu Lys Pro Lys Thr 770

<210> 192

<211> 863 5 <212> PRT

<213> Pyrococcus furiosus

<220>

<221>: misc_feature 10 <222> (789) .. (789)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221>: misc_feature 15 <222> (795) .. (795)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221>: misc_feature 20 <222> (804) .. (804)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221>: misc_feature 25 <222> (832) .. (832)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<400> 192

Met Ile Leu ASp val Asp Tyr Ile Thr Glu Glu Gly Lys Pro val Ile

1 5 10 15

Arg Leu Phe Lys Lys Glu Asn Gly Lys phe Lys rle Glu His ASp Arg 20 25 30

Thr Phe Arg pro Tyr rle Tyr Ala Leu Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ile 35 40 45

rle val Asp val Glu Lys Val Glu Lys Lys Phe Leu Gly Lys Pro rle 65 70 75 80

Thr val Trp Lys Leu Tyr Leu Glu His pro Gln ASp val Pro Thr rle 85 90 95

Arg Glu Lys val Arg Glu His Pro Ala val val ASp rle Phe Glu Tyr100 105 110

Asp 1le Pro phe Ala Lys Arg Tvr Leu rle ASp Lys Glv Leu Ile pro 115 120 125

Met Glu Gly Glu Glu Glu Leu Lys rle Leu Ala Phe ASp rle Glu Thr 130 135 140

Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Lys Gly Pro Ile Ile Met Ile 145 150 155 160

Ser Tyr Ala ASp Glu Asn Glu Ala Lys val 1le Thr Trp Lys Asn Ile 165 170 175

ASp Leu Pro Tyr val Glu val val Ser Ser Glu Arg Glu Met Ile Lys180 185 190

Arg phe Leu Arg 1le Ile Arg Glu Lys ASp pro ASP Ile 11 e val Thr 195 200 205

Tyr Asn Gly ASp Ser Phe ASp Phe Pro Tyr Leu Ala Lys Arg Ala Glu 210 215 220

Lys Leu Gly Ile Lys Leu Thr 1le Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys225 230 235 240

Met Gln Arg rle Gly Asp Met Thr Ala val Glu val Lys Gly Arg 1le 245 250 255

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260 265 270 Tyr Thr Leu Glu Ala val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Lys Pro Lys Glu 275 280 285 Lys val Tyr Ala Asp Glu Ile Ala Lys Ala Trp Glu Ser Gly Glu Asn 290 295 300

Leu Glu Arg val Ala Lys Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Ala Thr Tyr 305 310 315 320 Glu Leu Gly Lys Glu phe Leu Pro Met Glu Ile Gln Leu Ser Arg Leu

325 330 335

val Gly Gln Pro Leu Trp Asp val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350

val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Gl u Arg Asn Gl u Val Ala 355 360 365

Pro Asn Lys pro Ser Glu Glu Glu Tyr Gln Arg Arg Leu Arg Glu Ser 370 375 380

Tyr Thr Gly Gly Phe val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu Trp Glu Asn 385 390 395 400

rle val Tyr Leu Asp Phe Arg Ala Leu Tyr Pro Ser rle rle rle Thr 405 410 415

His Asn val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Leu Glu Gly Cys Lys Asn Tyr420 425 430

ASp rle Ala Pro Gln val Gly His Lys Phe Cys Lys ASp rle Pro Gly 435 440 445

Phe Ile Pro Ser Leu Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys rle 450 455 460

Lys Thr Lys Met Lys Glu Thr Gln Asp Pro rle Glu Lys rle Leu Leu 465 470 475 480

Asp Tyr Arg Gln Lys Ala rle Lys Leu Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly 485 490 495

Tyr Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu 500 505 510

Ser val Thr Ala Trp Gly Arg Lys Tyr rle Glu Leu Val Trp Lys Glu 515 520 525

Leu Glu Glu Lys phe Gly phe Lys val Leu Tyr rle ASp Thr ASp Gly530 535 540

Leu Tyr Ala Thr rle Pro Gly Gly Glu Ser Glu Glu rle Lys Lys Lys 545 550 555 560

Ala Leu Glu Phe Val Lys Tyr rle Asn Ser Lys Leu Pro Gly Leu Leu 565 570 575

Glu Leu Glu Tyr Glu Gly phe Tyr Lys Arg Gly Phe phe val Thr Lys 580 585 590

Lys Arg Tyr Ala Val rle ASp Glu Glu Gly Lys val rle Thr Arg Gly 595 600 605

Ala Arg Val Leu Glu Thr ¡le Leu Lys His Gly ASP val Glu Glu Ala 625 630 635 640

val Arg ¡le val Lys Gl u val ¡le Gln Lys Leu Ala Asn Tyr Glu rle 645 650 655

Pro Pro Gl u Lys Leu Ala ¡le Tyr Glu Gln ¡le Thr Arg Pro Leu His 660 665 670

Glu Tyr Lys Ala ¡le Gly Pro H;s val Ala Val Ala Lys Lys Leu Ala 675 680 685

Ala Lys Gly val Lys ¡le Lys Pro Gly Met val ¡le Gly Tyr ¡le val 690 695 700

Leu Arg Gly ASp Gly Pro ¡le Ser Asn Arg Ala ¡le Leu Ala Glu Glu 705 710 715 720

Tyr ASp Pro Lys Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr ¡le Glu Asn 725 730 735

Gln val Leu Pro Ala val Leu Arg ¡le Leu Glu Gly Phe Gly Tyr Arg740 745 750

Lys Glu ASP Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln val Gly Leu Thr Ser 755 760 765

Trp Leu Asn ¡le Lys Lys Ser Thr Pro Trp Arg Lys ¡le Asn Gly Trp 770 775 780

rle Thr H;s Phe Xaa Leu Leu Ser Glu Gln xaa Glu Asn cys Glu Ser 785 790 795 800

Ser Glu Gln Xaa Glu Asn Cys Glu ¡le Asn Ala Leu ¡le Gly Asn Met 805 810 815

Glu Asn Thr Ser Glu Thr Gly Thr Arg Cys H;s Glu Ser Glu Gln Xaa 820 825 830

Glu Asn Cys Glu Ala Asn Ala Leu Tyr Ser ¡le Ser Trp Glu ¡le Asn 835 840 845

Thr Glu Arg Phe Ala Cys Glu Met Ala ¡le Asn Pro Ala Gly Glu 850 855 860

<210> 193

<211> 775 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 193

Arg val phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr ASP Arg20 25 30

Thr phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys ASp ASp Ser Ala Ile 35 40 45

Glu ASp val Lys Lys val Thr Ala Lys Arg His Gly Thr val val Lys50 55 60

val Lys Arg Ala Glu Lys val Gln Lys Lys phe Leu Gly Arg Pro Ile 65 70 75 80

Glu val Trp Lys Leu Tyr Phe Asn His Pro Gln ASp val Pro Ala Ile 85 90 95

Arg ASP Arg ¡le Arg Ala His Pro Ala val val ASP Ile Tyr Glu Tyr

100 105 110 ASp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile ASp Lys Gly Leu Ile Pro 115 120 125 Met Glu Gly ASp Glu Glu Leu Thr Met Leu Ala phe ASP Ile Glu Thr 130 135 140

Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Thr Gly Pro Ile Leu Met Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Ala ASp Gly Ser Glu Ala Arg val ¡le Thr Trp Lys Lys Ile

165 170 175 ASp Leu Pro Tyr val Asp val val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys180 185 190 Arg Phe Leu Arg val val Arg Glu Lys ASP pro ASp val Leu Ile Thr 195 200 205 Tyr Asn Gly ASP Asn phe ASP Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu 210 215 220 Glu Leu Gly Ile Lys Phe Thr Leu Gly Arg ASP Gly Ser Glu Pro Lys

225 230 235 240 Ile Gln Arg Met Gly ASp Arg phe Ala val Glu val Lys Gly Arg Ile 245 250 255 His Phe ASp Leu Tyr Pro val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr

Tyr Thr LeU Glu Ala Val Tyr Glu Ala val phe Gly Lys Pro Lys Glu 275 280 285

Lys val Tyr Ala Glu Glu rle Ala Gln Ala Trp Glu Ser Gly Glu Gly290 295 300

Leu Glu Arg val Ala Arg Tyr Ser Met Glu ASp Ala Lys val Thr Tyr 305 310 315 320

Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu

325 330 335 rle Gly Gln Ser Leu Trp ASp val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350 val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Asn Glu Leu Ala 355 360 365 Pro Asn Lys pro ASp Glu Arg Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gly Gly Tyr 370 375 380

Ala Gly Gly Tyr val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp ASp Asn rle 385 390 395 400 val Tyr Leu ASp phe Arg Ser Leu Tyr pro Ser rle rle rle Thr His

405 410 415 Asn Val Ser Pro ASp Thr Leu Asn Arg Glu Gly cys Lys Glu Tyr ASp

420 425 430 val Ala Pro Glu val Gly His Lys Phe Cys Lys ASP phe Pro Gly Phe 435 440 445 rle Pro Ser Leu Leu Gly ASp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys rle Lys450 455 460 Arg Lys Met Lys Ala Thr Val ASP Pro Leu Glu Lys Lys Leu Leu ASP

465 470 475 480

Tyr Arg Gln Arg Ala rle Lys rle Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly Tyr485 490 495

Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser 500 505 510

val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr rle Glu Met val Ile Arg Glu Leu 515 520 525

Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys val Leu Tyr Ala ASp Thr ASp Gly Leu 530 535 540

Lys Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Pro Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu 565 570 575

Leu Glu Tyr Glu Gly phe Tyr val Arg Gly phe Phe val Thr Lys Lys580 585 590

Lys Tyr Ala Val Ile ASP Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu 595 600 605

Glu rle val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala 610 615 620

Arg val Leu Glu Ala rle leu lys His Gly ASp Val Glu Glu Ala Val

625 630 635 640

Arg rle val Lys Glu val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu val Pro 645 650 655

Pro Glu Lys Leu val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Arg ASp660 665 670

Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His val Ala val Ala lys Arg Leu Ala Ala 675 680 685

Arg Gly val LyS rle Arg Pro Gly Thr val rle Ser Tyr rle val Leu 690 695 700

Lys Gly Ser Gly Arg rle Gly Asp Arg Ala rle Pro Ala ASp Glu Phe

705 710 715 720

ASp Pro Thr Lys His Arg Tyr ASP Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln 725 730 735

val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Lys Ala Phe Gly Tyr Arg lys740 745 750

Glu ASp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Lys Gln val Gly Leu Gly Ala Trp 755 760 765

Leu Lys val Lys Gly Lys Lys 770 775

<210> 194

<211> 774 5 <212> PRT

<213> Thermococcus litoralis

<400> 194

Met rle leu Asp Thr Asp Tyr rle Thr Lys ASp Gly Lys Pro Ile rle 1 5 10 15

Arg Ile phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys rle Glu Leu ASp Pro

20 25 30

His phe Gln Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp ASp Ser Ala Ile

35 40 45 Glu Glu Ile Lys Ala Ile Lys Gly Glu Arg His Gly Lys Thr Val Arg

50 55 60 val Leu ASp Ala val Lys val Arg Lys Lys Phe Leu Gly Arg Glu val

65 70 75 80 Glu val Trp Lys Leu Ile Phe Glu His Pro Gln ASp val Pro Ala Met

85 90 95 Arg Gly Lys Ile Arg Glu His pro Ala val val ASp Ile Tyr Glu Tyr100 105 110 ASP Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro

115 120 125

Met Glu Gly ASp Glu Glu Leu Lys Leu Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr 130 135 140

Phe Tyr His Glu Gly Asp Glu phe Gly Lys Gly Glu Ile Ile Met rle 145 150 155 160

Ser Tyr Ala ASp Glu Glu Glu Ala Arg Val rle Thr Trp Lys Asn rle 165 170 175

Asp Leu Pro Tyr val Asp val val Ser Asn Glu Arg Glu Met rle Lys180 185 190

Arg Phe val Gln val val Lys Glu Lys ASp Pro Asp val Ile Ile Thr 195 200 205

Tyr Asn Gly ASp Asn phe ASp Leu Pro Tyr Leu rle Lys Arg Ala Glu 210 215 220

Lys Leu Gly val Arg Leu val Leu Gly Arg Asp Lys Glu His Pro Glu 225 230 235 240

Pro Lys rle Gln Arg Met Gly Asp Ser Phe Ala val Glu Ile Lys Gly245 250 255

Arg rle His phe ASP Leu phe Pro val val Arg Arg Thr rle Asn Leu 260 265 270

Pro Thr Tyr Thr Leu Glu Ala val Tyr Glu Ala val Leu Gly Lys Thr 275 280 285

Glu Ser Met Lys Lys Leu Ala Gln Tyr Ser Met Glu ASp Ala Arg Ala

305 310 315 320 Thr Tyr Glu Leu Gly Lys Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala

325 330 335 Lys Leu Ile Gly Gln Ser val Trp ASp val Ser Arg Ser Ser Thr Gly

340 345 350

Asn Leu val Glu Trp Tyr Leu Leu Arg val Ala Tyr Ala Arg Asn Glu 355 360 365

Leu Ala Pro Asn Lys Pro ASp Glu Glu Glu Tyr Lys Arg Arg Leu Arg370 375 380

Thr Thr Tyr Leu Gly Gly Tyr val Lys Glu pro Glu Lys Gly Leu Trp385 390 395 400

Glu Asn rle Ile Tyr Leu ASP phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser rle Ile 405 410 415

val Thr His Asn val Ser Pro Asp Thr Leu Glu Lys Glu Gly Cys Lys

420 425 430 Asn Tyr ASp val Ala Pro Ile val Gly Tyr Arg Phe Cys Lys ASP phe

435 440 445 Pro Gly Phe rle Pro Ser Ile Leu Gly ASp Leu Ile Ala Met Arg Gln

450 455 460 ASP Ile Lys Lys Lys Met Lys Ser Thr rle Asp Pro Ile Glu Lys Lys

465 470 475 480 Met Leu Asp Tyr Arg Gln Arg Ala rle Lys Leu Leu Ala Asn Ser Tyr

485 490 495 Tyr Gly Tyr Met Gly Tyr Pro Lys Ala Arg Trp Tyr Ser Lys Glu Cys

500 505 510 Ala Glu Ser val Thr Ala Trp Gly Arg H;S Tyr Ile Glu Met Thr Ile

515 520 525 Arg Glu Ile Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys val Leu Tyr Ala Asp Thr

530 535 540 ASp Gly Phe Tyr Ala Thr Ile Pro Gly Glu Lys Pro Glu Leu rle Lys

545 550 555 560

565 570 575

Leu Leu Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Leu Arg Gly Phe Phe val

580 585 590 Thr Lys Lys Arg Tyr Ala val rle ASp Glu Glu Gly Ar~ rle Thr Thr 595 600 60 Arg Gly Leu Glu val val Ar~ Arg ASp Trp Ser Glu rle Ala Lys Glu 610 61 620 Thr Gln Ala Lys val Leu Glu Ala rle Leu Lys Glu Gly Ser val Glu

625 630 635 640 Lys Ala val Glu val val Arg ASp val val Glu Lys rle Ala Lys Tyr645 650 655 Arg val pro Leu Glu Lys Leu val rle His Glu Gln rle Thr Arg ASp

660 665 670 Leu Lys ASp Tyr Lys Ala rle Gly Pro His val Ala rle Ala Lys Arg

675 680 685 Leu Ala Ala Arg Gly rle Lys val Lys Pro Gly Thr rle rle Ser Tyr

690 695 700 rle val Leu Lys Gly Ser Gly Lys rle Ser ASp Arg val rle Leu Leu

705 710 715 720 Thr Glu Tyr ASp Pro Arg Lys His Lys Tyr ASP Pro ASp Tyr Tyr rle

725 730 735 Glu Asn Gln val Leu Pro Ala val Leu Arg rle Leu Glu Ala Phe Gly

740 745 750 Tyr Arg Lys Glu ASp Leu Arg Tyr Gln Ser Ser Lys Gln Thr Gly Leu

755 760 765 ASp Ala Trp Leu Lys Arg

<210> 195

<211> 887 5 <212> PRT

<213> Methanococcus voltae

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (838) .. (838)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> misc_feature <222> (844) .. (844) <223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

5: <220> <221> misc_feature <222> (853) .. (853) <223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

10: <400> 195

1 5 10 15

lys Asn Cys Gly leu Lys Lys pro Glu Ile Asn Leu Gln Lys Glu Cys

20 25 30 Glu Phe Lys pro Tyr Phe Tyr val Asp Thr Ser Glu Pro lys Glu Ile 35 40 45 Tyr ASp Tyr leu ASp Gly Leu Asn Gln Glu Ile ASp Leu lys lys Leu 50 55 60 Glu Pro Glu Phe Glu Asn Asn Thr Ser leu Lys val Gln ASp leu Ile

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85 90 95 Asn Gly Lys ASp Ile Ser Glu val Ser ASp Phe lys Asn Lys Lys Glu

100 105 110 Arg Lys rle cys Lys val Tyr val Lys Tyr pro Asn His val Lys Ile

115 120 125 Ile Arg Glu Tyr Phe lys Glu Phe Gly Lys Ser Tyr Glu Phe Asp Ile 130 135 140

Pro Phe Leu Arg Arg Tyr Met Ile ASp Gln Asp Ile val Pro Ser Ala 145 150 155 160 Lys Tyr Ser Glu ASp Asn Lys Ile Asp Asn Ser Ile Pro Glu Leu Asn

165 170 175 Cys Ile Ala phe ASp Met Glu Leu Tyr Cys Lys Lys Glu pro Asn Ala

~O ~5 ~O

Lys Lys ASp Pro rle Ile Met val Asn Leu phe Ser Lys ASp Tyr Gln

195 200 205 Lys val Ile Thr Tyr Lys Lys Phe Glu Asn Ser Glu Tyr Asn Gly Cys

210 215 220

val ASp Tyr val Lys ASp Glu Lys Glu Leu rle Gln Lys Thr Ile Glu

225 230 235 240

245 250 255

ASp phe Pro Tyr Leu Lys Lys Arg Ala Asn Ile Tyr Glu rle Glu Leu

260 265 270 ASp phe ASp Asn Ala Ser Asn Ser Gln Gln Pro Gln Ile Ile Lys Ile 275 280 285 Ser Lys Gly Gly rle Asn Arg Lys Ser Lys rle Pro Gly rle rle His 290 295 300

rle Asp Leu Tyr Pro rle Ala Arg Lys Leu Leu Asn Leu Thr Lys Tyr305 310 315 320 Lys Leu Glu Asn val val Gln Glu Leu Phe Lys rle Asn Lys Glu Ala

325 330 335 val ASp Tyr Gly ASp Ile Pro Lys Met Trp Glu Thr Glu ASp Thr Thr

340 345 350 Leu Leu Arg Tyr Ala Tyr Glu Asp Ala Leu Tyr Thr Tyr Lys Met Gly355 360 365 Asn Tyr Phe Leu Pro Leu Glu rle Met Phe Ser Arg rle val Asn Gln

370 375 380 Pro Leu Tyr Asp Thr Ser Arg Met Asn Ser Ser Gln Met val Glu Phe

385 390 395 400 Leu Leu Leu Lys Ar~ Ser phe Glu Gln Asn Met Ile Ser Pro Asn Arg40 410 415 Pro Ser Ser Ser Ser Tyr Arg Glu Arg Ala Lys Phe Ser Tyr Glu Gly

420 425 430 Gly Tyr val Arg Glu Pro Leu Lys Gly rle Gln Glu Asp rle val Ser

435 440 445 Leu ASp phe Met Ser Leu Tyr Pro Ser rle Leu rle Ser His Asn rle

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485 490 495 His rle Lys Met Leu Leu Lys ASp Lys rle Gln Lys Asn Glu Phe Asp500 505 510 Glu Glu Tyr Ser Arg Leu Glu His Glu Gln Lys Ser rle Lys val Leu

515 520 525

Ser ASp Lys Cys Ala Glu Met val Thr Gly Leu Gly Arg Lys Tyr rle 545 550 555 560

Gln Glu Thr rle Glu Lys Ala Glu Glu Phe Gly Phe Lys val rle Tyr565 570 575

Ala ASP Thr ASp Gly Phe Tyr Ala Lys Trp ASp Tyr Asp Lys Leu Gln

580 585 590 Lys Gly Lys Lys Glu Glu Asn Asp Lys Ser ASp Lys Leu Ser Asn Leu 595 600 605 Pro Lys Leu Ser Lys Glu Glu Leu rle rle Leu Thr Lys Lys Phe Leu 610 615 620

Lys Gly rle Asn Glu Glu Leu Pro Glu Gly Met Glu Leu Glu Phe Glu 625 630 635 640 Gly His Phe Lys Arg Gly Leu Phe val Thr Lys Lys Lys Tyr Ala Leu

645 650 655 rle Glu Asp Asp Gly His rle val val Lys Gly Leu Glu val val Arg

660 665 670 Arg ASp Trp Ser Asn rle Ala Lys ASp Thr Gln Gln Ala val Ile Arg 675 680 685 Ala Leu Leu Glu ASp Gly Asp val Asn Leu Ala Lys Lys Ile Ile Lys690 695 700 Asn Thr rle Asp Asn Leu Lys Lys Gly Asn rle ASp Lys Asn ASp Leu

705 710 715 720 Leu rle His Thr Gln Leu Thr Lys Asn Ile Glu Glu Tyr Lys Ser Thr 725 730 735 Ala Pro His Ile Glu val Ala Lys Lys rle Lys Gln Arg Gly Asp Ser 740 745 750 val Arg val Gly Asp val rle Ser Tyr Ile rle val Lys Gly Ser Arg755 760 765 Ser rle Ser Glu Arg Ala Glu Leu Leu Glu Tyr Ala Gly Asp Tyr Asp770 775 780 rle Asn Tyr Tyr rle ASp Asn Gln val Leu Pro Pro val rle Arg rle

785 790 795 800

Gln Phe Lys Leu ASp Gln Phe Met Thr Pro Trp Arg Lys Ile Asn Gly

820 825 830 Trp Ile Thr His phe Xaa Leu Leu Ser Glu Gln Xaa Glu Asn cys Glu

835 840 845

Ser Ser Glu Gln Xaa Glu Asn Cys Glu Ile Asn Ala Leu Ile Gly Asn 850 855 860

Met Glu Asn Thr Ser Glu Thr Gly Thr Gly Cys Gly Leu Ala Ser Thr 865 870 875 880

Ser Arg Ser pro Ala Gly Glu 885

<210> 196

<211> 856 5 <212> PRT

<213> Bacteriófago RB69

<400> 196

Glu Arg Tyr rle ASP Ser Asn Gly Arg Glu Arg Thr Arg Glu val Glu 20 25 30

Tyr Lys Pro Ser Leu Phe Ala His Cys Pro Glu Ser Gln Ala Thr Lys

35 40 45

Tyr phe ASp Ile Tyr Gly Lys Pro Cys Thr Arg Lys Leu phe Ala Asn 50 55 60

Met Arg ASp Ala Ser Gln Trp rle Lys Arg Met Glu ASp rle Gly Leu

65 70 75 80

Glu Ala Leu Gly Met Asp ASp Phe Lys Leu Ala Tyr Leu Ser Asp Thr 85 90 95

Tyr Asn Tyr Glu rle Lys Tyr ASp His Thr Lys rle Arg val Ala Asn 100 105 110

Phe ASp rle Glu val Thr Ser Pro ASp Gly Phe Pro Glu Pro Ser Gln

115 120 125

Ala Lys His Pro rle ASp Ala rle Thr His Tyr ASp Ser rle ASp Asp

130 135 140

Arg Phe Tyr val Phe ASp Leu Leu Asn Ser Pro Tyr Gly Asn val Glu 145 150 155 160

165 170 175

Glu val Pro Ser Glu rle rle ASP Lys rle rle Tyr Met pro Phe ASp

180 185 190 Asn Glu Lys Glu Leu Leu Met Glu Tyr Leu Asn Phe Trp Gln Gln Lys

195 200 205

Thr pro val rle Leu Thr Gly Trp Asn val Glu Ser Phe ASP rle Pro

210 215 220 Tyr val Tyr Asn Arg rle Lys Asn Ile Phe Gly Glu Ser Thr Ala Lys

225 230 235 240 Arg Leu Ser Pro His Arg Lys Thr Arg val Lys val Ile Glu Asn Met

245 250 255 Tyr Gly Ser ArO Glu Ile Ile Thr Leu Phe Gly rle Ser val Leu ASp

26 265 270 Tyr Ile ASp Leu Tyr Lys Lys phe Ser phe Thr Asn Gln Pro Ser Tyr 275 280 285 Ser Leu ASp Tyr Ile Ser Glu Phe Glu Leu Asn val Gly Lys Leu Lys

290 295 300

Tyr ASp Gly pro rle Ser Lys Leu Arg Glu Ser Asn H;S Gln Arg Tyr305 310 315 320 Ile Ser Tyr Asn Ile Ile ASp val Tyr Arg val Leu Gln Ile ASp Ala

325 330 335 Lys Arg Gln Phe Ile Asn Leu Ser Leu ASp Met Gly Tyr Tyr Ala Lys

340 345 350 Ile Gln Ile Gln Ser val phe Ser Pro Ile Lys Thr Trp ASp Ala Ile

355 360 365 Ile Phe Asn Ser Leu Lys Glu Gln Asn Lys val rle pro Gln Gly Arg

370 375 380 Ser His Pro val Gln Pro Tyr pro Gly Ala phe val Lys Glu Pro Ile

385 390 395 400

Pro Asn Arg Tyr Lys Tyr Val Met Ser Phe ASp Leu Thr Ser Leu Tyr

405 410 415

Pro Ser rle rle Arg Gln val Asn rle Ser Pro Glu Thr rle Ala Gly420 425 430

435 440 445

Arg Pro Ser ASp val Tyr Ser Cys Ser Pro Asn Gly Met Met Tyr Tyr 450 455 460

Lys Asp Arg ASP Gly val val pro Thr Glu rle Thr Lys val Phe Asn

465 470 475 480

Gln Arg Lys Glu H;S Lys Gly Tyr Met Leu Ala Ala Gln Arg Asn Gly

485 490 495 Glu rle rle Lys Glu Ala Leu H;s Asn Pro Asn Leu Ser val ASp Glu 500 505 510 Pro Leu Asp val Asp Tyr Arg phe ASp Phe Ser ASp Glu rle Lys Glu

515 520 525 Lys rle Lys Lys Leu Ser Ala Lys Ser Leu Asn Glu Met Leu phe Arg

530 535 540 Ala Gln Arg Thr Glu Val Ala Gly Met Thr Ala Gln Ile Asn Arg Lys

545 550 555 560

Leu Leu rle Asn Ser Leu Tyr Gly Ala Leu Gly Asn val Trp phe Arg

565 570 575 Tyr Tyr Asp Leu Arg Asn Ala Thr Ala Ile Thr Thr Phe Gly Gln Met 580 585 590 Ala Leu Gln Trp rle Glu Arg Lys val Asn Glu Tyr Leu Asn Glu val

595 600 605 Cys Gly Thr Glu Gly Glu Ala Phe val Leu Tyr Gly Asp Thr Asp Ser

610 615 620 rle Tyr val Ser Ala Asp Lys Ile Ile ASp Lys val Gly Glu Ser Lys

625 630 635 640 phe Arg ASp Thr Asn H;S Trp val Asp Phe Leu Asp Lys Phe Ala Arg645 650 655 Glu Arg Met Glu Pro Ala Ile ASp Arg Gly phe Arg Glu Met Cys Glu

660 665 670

Tyr Met Asn Asn Lys Gln His Leu Met Phe Met Asp Ar~ Glu Ala rle

675 680 68

Ala Gly Pro Pro Leu Gly Ser Lys Gly Ile Gly Gly Phe Trp Thr Gly 690 695 700

Lys Lys Arg Tyr Ala Leu Asn val Trp Asp Met Glu Gly Thr Arg Tyr705 710 715 720

Ser Ala Asn Asn Ile Ala Lys Tyr ASp val Gly Gly Phe Pro Gly pro 740 745 750

lys Cys Pro Phe His rle Arg Gly rle Leu Thr Tyr Asn Arg Ala Ile

755 760 765

Lys Gly Asn rle ASP Ala Pro Gln val val Glu Gly Glu Lys val Tyr

770 775 780

val Leu pro Leu Arg Glu Gly Asn Pro Phe Gly ASp Lys Cys rle Ala 785 790 795 800

Trp pro Ser Gly Thr Glu rle Thr ASP Leu rle Lys ASp ASp val Leu 805 810 815

His Trp Met ASp Tyr Thr val Leu Leu Glu Lys Thr Phe rle Lys Pro 820 825 830

Leu Glu Gly Phe Thr Ser Ala Ala Lys Leu ASp Tyr Glu Lys Lys Ala 835 840 845

Ser Leu Phe ASp Met Phe ASp Phe 850 855

<210> 197

<211> 898 5 <212> PRT

<213> Bacteriófago T4

<400> 197

Met Lys Glu Phe Tyr ¡le Ser ¡le Glu Thr val Gly Asn Asn ¡le val

1 5 10 15

Glu Arg Tyr ¡le Asp Glu Asn Gly Lys Glu Arg Thr Arg Glu val Glu 20 25 30

Tyr Leu Pro Thr Met phe Arg His Cys Lys Glu Glu Ser Lys Tyr Lys 35 40 45

Asp Ile Tyr Gly Lys Asn Cys Ala Pro Gln Lys Phe Pro Ser Met Lys 50 55 60

ASp Ala Arg ASp Trp Met Lys Arg Met Glu ASp ¡le Gly Leu Glu Ala

65 70 75 80

Leu Gly Met Asn ASp Phe Lys Leu Ala Tyr rle Ser ASp Thr Tyr Gly85 90 95

rle Glu val Thr Gly Asp Lys phe Pro ASp Pro Met Lys Ala Glu Tyr

li5 UO U5

Glu rle Asp Ala rle Thr His Tyr Asp Ser rle Asp Asp Arg Phe Tyr 130 135 140

val phe ASp Leu Leu Asn Ser Met Tyr Gly Ser val Ser Lys Trp Asp 145 150 155 160

Ala Lys Leu Ala Ala Lys Leu ASP Cys Glu Gly Gly Asp Glu Val Pro 165 170 175

Gln Glu rle Leu ASp Arg val rle Tyr Met Pro phe ASp Asn Glu Arg180 185 190

ASp Met Leu Met Glu Tyr rle Asn Leu Trp Glu Gln Lys Arg Pro Ala 195 200 205

rle Phe Thr Gly Trp Asn Ile Glu Gly phe ASp val Pro Tyr rle Met 210 215 220

Asn Arg val Lys Met rle Leu Gly Glu Arg Ser Met Lys Arg phe Ser 225 230 235 240

Pro rle Gly Arg val Lys Ser Lys Leu Ile Gln Asn Met Tyr Gly Ser 245 250 255

Lys Glu rle Tyr Ser rle ASp Gly val Ser rle Leu ASp Tyr Leu ASp260 265 270

Leu Tyr Lys Lys Phe Ala Phe Thr Asn Leu Pro Ser Phe Ser Leu Glu 275 280 285

Ser val Ala Gln H;S Glu Thr Lys Lys Gly Lys Leu Pro Tyr ASp Gly 290 295 300

Pro rle Asn Lys Leu Arg Glu Thr Asn His Gln Arg Tyr rle Ser Tyr 305 310 315 320

Asn rle rle Asp val Glu Ser val Gln Ala rle ASP Lys rle Arg Gly 325 330 335

Phe rle Asp Leu val Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Ala Lys Met Pro phe 340 345 350

Ser Gly val Met Ser Pro rle Lys Thr Trp Asp Ala rle rle Phe Asn 355 360 365

Ser Leu Lys Gly Glu His Lys val rle Pro Gln Gln Gly Ser His val

370 375 380

Lys Gln Ser Phe Pro Gly Ala phe Val phe Glu Pro Lys Pro rle Ala 385 390 395 400

Arg Arg Tyr rle Met Ser Phe Asp Leu Thr Ser Leu Tyr Pro Ser rle 405 410 415

rle Arg Gln val Asn rle Ser Pro Glu Thr rle Arg Gly Gln Phe Lys420 425 430

val His Pro Ile His Glu Tyr rle Ala Gly Thr Ala Pro Lys Pro Ser 435 440 445

ASp Glu Tyr Ser cys Ser Pro Asn Gly Trp Met Tyr ASp Lys His Gln 450 455 460

Glu Gly rle Ile Pro Lys Glu rle Ala Lys val phe Phe Gln Arg Lys465 470 475 480

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Lys Lys rle Ile Met Lys Gly Ala Gly Ser Cys Ser Thr Lys Pro Glu 500 505 510

val Glu Arg Tyr val Lys phe Ser ASp ASp Phe Leu Asn Glu Leu Ser 515 520 525

Asn Tyr Thr Glu Ser val Leu Asn Ser Leu rle Glu Glu Cys Glu Lys530 535 540

Ala Ala Thr Leu Ala Asn Thr Asn Gln Leu Asn Arg Lys rle Leu rle 545 550 555 560

Asn Ser Leu Tyr Gly Ala Leu Gly Asn rle His phe Arg Tyr Tyr ASp565 570 575

Leu Arg Asn Ala Thr Ala rle Thr rle Phe Gly Gln val Gly Ile Gln 580 585 590

Trp Ile Ala Arg Lys rle Asn Glu Tyr Leu Asn Lys Val cys Gly Thr 595 600 605

Asn ASp Glu ASp Phe Ile Ala Ala Gly ASP Thr ASp Ser val Tyr val 610 615 620

Cys val ASp Lys val Ile Glu Lys val Gly Leu ASp Arg phe Lys Glu 625 630 635 640

Gln Asn Asp Leu val Glu phe Met Asn Gln Phe Gly Lys Lys Lys Met 645 650 655

Asn Arg Glu H;S Leu Met H;S Met Asp Arg Glu Ala Ile Ser Cys Pro 675 680 685

Pro Leu Gly Ser Lys Gly val Gly Gly phe Trp Lys Ala Lys Lys Arg690 695 700

Tyr Ala Leu Asn Val Tyr ASp Met Glu ASp Lys Arg Phe Ala Glu Pro 705 710 715 720

His Leu Lys Ile Met Gly Met Glu Thr Gln Gln Ser Ser Thr Pro Lys

725 730 735 Ala val Gln Glu Ala Leu Glu Glu Ser Ile Arg Arg Ile Leu Gln Glu

740 745 750 Gly Glu Glu Ser val Gln Glu Tyr Tyr Lys Asn Phe Glu Lys Glu Tyr

755 760 765 Arg Gln Leu ASp Tyr Lys val Ile Ala Glu val Lys Thr Ala Asn ASp

no ns 780

Ile Ala Lys Tyr ASp ASp Lys Gly Trp Pro Gly phe Lys cys Pro phe785 790 795 800 H;S Ile Arg Gly val Leu Thr Tyr Arg Arg Ala val Ser Gly Leu Gly

805 810 815 val Ala Pro Ile Leu Asp Gly Asn Lys val Met val Leu Pro Leu Arg820 825 830 Glu Gly Asn Pro Phe Gly Asp Lys cys Ile Ala Trp Pro Ser Gly Thr 835 840 845 Glu Leu Pro Lys Glu Ile Arg Ser Asp val Leu Ser Trp Ile Asp H;s

850 855 860 Ser Thr Leu Phe Gln Lys Ser Phe val Lys Pro leu Ala Gly Met cys

865 870 875 880 Glu Ser Ala Gly Met ASp Tyr Glu Glu Lys Ala Ser Leu Asp phe Leu 885 890 895 phe Gly

<210> 198 <211>759

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 198

Met Ala Gln Ala Gly phe Ile Leu Thr Arg His Trp Arg ASp Thr Pro

1 5 10 15

Gln Gly Thr Gl u val ser phe Trp Leu Ala Thr ASp Asn Gly Pro Leu

20 25 30 Gl n val Thr Leu Ala Pro Gln Glu Ser val Ala Phe Ile Pro Ala Asp35 40 4S Gln val Pro Arg Ala Gln His Ile Leu Gln Gly Glu Gln Gly phe Arg50 55 60 Leu Thr Pro Leu Ala Leu Lys ASp Phe His Arg Gln Pro val Tyr Gly

65 70 75 80 Leu Tyr Cys Arg Ala His Arg Gln Leu Met Asn Tyr Glu Lys Arg Leu

85 90 95 Arg Glu Gly Gly val Thr val Tyr Glu Ala Asp Val Arg Pro Pro Glu

100 105 110

Arg Tyr Leu Met Glu Arg Phe Ile Thr Ser Pro val Trp val Glu Gly 115 120 125

Asp Met His Asn Gly Thr Ile val Asn Ala Arg Leu Lys Pro His Pro 130 135 140

Asp Tyr Arg Pro Pro Leu Lys Trp val Ser Ile Asp Ile Glu Thr Thr

145 150 155 160 Arg His Gly Glu Leu Tyr Cys Ile Gly Leu Glu Ala Cys Gly Gln Arg165 170 175 Ile Val Tyr Met Leu Gly Pro Glu Asn Gly Asp Ala Ser Ser Leu Asp

180 185 190 phe Glu Leu Glu Tyr val Ala Ser Arg Pro Gln Leu Leu Glu Lys Leu 195 200 205 Asn Ala Trp Phe Ala Asn Tyr ASp Pro Asp val Ile Ile Gly Trp Asn

210 215 220

val val Gln phe ASp Leu Arg Met Leu Gln Lys His Ala Glu Arg Tyr225 230 235 240

Arg Leu Pro Leu Arg Leu Gly Arg ASp Asn Ser Glu Leu Glu Trp Arg

245 250 255

Glu His Gly phe Lys Asn Gly val phe phe Ala Gln Ala Lys Gly Arg260 265 270

Ser Ser Phe Ser Leu Glu Tnr val Ala Gln Glu Leu Leu Gly Glu Gly290 295 300

Lys Ser Ile ASp Asn Pro Trp ASp Arg Met Asp Glu Ile ASp Arg Arg 305 310 315 320

Phe Ala Glu Asp Lys Pro Ala Leu Ala Thr Tyr Asn Leu Lys ASp Cys325 330 335

Glu Leu val Thr Gln Ile Pne H;S Lys Thr Glu Ile Met pro Phe Leu 340 345 350

Leu Glu Arg Ala Tnr val Asn Gly Leu Pro val ASp Arg H;s Gly Gly

. 355 360 365 Ser val Ala Ala Phe Gly H;s Leu Tyr Phe Pro Arg Met H;s Arg Ala

370 375 380

Gly Tyr val Ala Pro Asn Leu Gly Glu val Pro Pro His Ala Ser Pro 385 390 395 400 Gly Gly Tyr val Met Asp Ser Arg pro Gly Leu Tyr ASP Ser val Leu

405 410 415

val Leu ASP Tyr Lys Ser Leu Tyr pro Ser Ile Ile Arg Tnr phe Leu

420 425 430 rle ASP pro val Gly Leu val Glu Gly Met Ala Gln Pro ASP Pro Glu

435 440 445 His Ser Tnr Glu Gly pne Leu ASP Ala Trp Phe Ser Arg Glu Lys His

450 455 460 Cys Leu Pro Glu Ile val Thr Asn Ile Trp His Gly Arg Asp Glu Ala

465 470 475 480

Lys Arg Gln Gly Asn Lys Pro Leu Ser Gln Ala Leu Lys Ile Ile Met

485 490 495 Asn Ala phe Tyr Gly Val Leu Gly Thr Thr Ala Cys Arg pne Phe Asp

500 505 510

Pro Arg Leu Ala Ser Ser Ile Thr Met Arg Gly His Gln Ile Met Arg515 520 525

Gln Tnr Lys Ala Leu Ile Glu Ala Gln Gly Tyr ASp val Ile Tyr Gly

530 535 540

545 550 555

Glu Ala Ala Lys Ile Gly Arg Ala leu val Gln His Val Asn Ala Trp 565 570 575

Trp Ala Glu Thr Leu Gln lys Gln Ar~ leu Thr Ser Ala Leu Glu leu 580 58 590

Glu Tyr Glu Thr His Phe Cys Arg Phe leu Met Pro Thr Ile Arg Gly595 60 605

Ala ASp Thr Gly Ser Lys Lys Arg Tyr Ala Gly leu Ile Gln Glu Gly610 615 620

ASp lys Gln Arg Met val phe Lys Gly Leu Glu Thr val Arg Thr ASp625 630 635 640

Trp Thr pro Leu Ala Gln Gln Phe Gln Gln Glu Leu Tyr Leu Arg Ile

645 650 655

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Leu Met Ala Gly Glu Leu ASp Ala Arg Leu val Tyr Arg Lys Arg Leu 675 680 685

Arg Arg Pro Leu Ser Glu Tyr Gln Arg Asn val Pro Pro His val Arg

690 695 700

Ala Ala Arg leu Ala ASp Glu Glu Asn Gln Lys Arg Gly Arg pro Leu 705 710 715 720

Gln Tyr Gln Asn Arg Gly Thr Ile lys Tyr val Trp Thr Thr Thr Gly725 730 735

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Ser ASp Pro pro Pro Phe Tyr 755

<210> 199

<211> 1170 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (1121) .. (1121)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> misc_feature

<222> (1127) .. (1127)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

5 <220>

<221> misc_feature

<222> (1136) .. (1136)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

10 <400> 199

Arg Ala Arg Gly Gly Leu Trp Asp ASp ASp ASP Ala Pro Trp Pro Ser

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165 170 175

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210 215 220

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370 375 380

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485 490 495 leu Gln Asn Gly Asn ASp Gln Thr Arg Arg Arg leu Ala Val Tyr Cys500 505 510 leu lys Asp Ala Tyr leu Pro Leu Arg Leu Leu Glu Arg Leu Met Val

515 520 525

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Gly Thr Ala Gln Lys Leu Gly Leu Thr Glu ASp Gln Phe rle Arg Thr 625 630 635 640

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Glu Leu Ala Lys Glu Thr ASp Pro Leu Arg Arg Gln val Leu ASp Gly675 680 685

Arg Gln Leu Ala Leu Lys Val Ser Ala Asn Ser val Tyr Gly Phe Thr 690 695 700

Gly Ala Gln val Gly Lys Leu Pro Cys Leu Glu rle Ser Gln Ser val 705 710 715 720

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805 810 815

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965 970 975

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1070 1075 1080

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<210> 200

<211> 774

<212> PRT

<213> Pyrococcus kodakaraensis 5

<400> 200

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Arg Ile phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr ASp Arg 20 25 30

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Glu Glu val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr val val Thr 50 55 60

val Lys Arg val Glu Lys val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro val 65 70 75 80

Glu val Trp Lys Leu Tyr phe Thr His Pro Gln ASp val pro Ala Ile 85 90 95

Arg ASp Lys Ile Arg Glu His Pro Ala val Ile ASp Ile Tyr Glu Tyr 100 105 110

ASp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile ASp Lys Gly Leu val pro 115 120 125

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Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile

145 150 155 160

Ser Tyr Ala ASp Glu Glu Gly Ala Arg val rle Thr Trp Lys Asn val 165 170 175

ASp Leu pro Tyr val ASp val val Ser Thr Glu Arg Glu Met rle Lys 180 185 190

Arg phe Leu Arg val val Lys Glu Lys ASp Pro ASp val Leu rle Thr 195 200 205

Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu 210 215 220

Lys Leu Gly rle Asn Phe Ala Leu Gly Arg ASp Gly Ser Glu Pro Lys225 230 235 240

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Lys val Tyr Ala Glu Glu Ile Thr Thr Ala Trp Glu Thr Gly Glu Asn 290 295 300

Leu Glu Arg val Ala Arg Tyr Ser Met Glu ASp Ala Lys val Thr Tyr 305 310 315 320

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340 345 350

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485 490 495 Tyr Gly Tyr Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser 500 505 510 val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr rle Thr Met Thr rle Lys Glu rle

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Arg val Leu Glu Ala Leu Leu Lys ASp Gly ASp val Glu Lys Ala val 625 630 635 640 Arg Ile val Lys Glu val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu val pro

645 650 655 Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg ASp Leu Lys ASp660 665 670 Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala val Ala Lys Arg Leu Ala Ala

675 680 685 Arg Gly val Lys Ile Arg Pro Gly Thr val Ile Ser Tyr Ile val Leu

690 695 700

ASP pro Thr Lys His Lys Tyr ASP Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln 725 730 735

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Glu ASP leu Arg Tyr Gln lys Thr Arg Gln val Gly Leu Ser Ala Trp755 760 765

leu Lys Pro Lys Gly Thr

<210> 201

<211> 804 5 <212> PRT

<213> Pyrococcus abyssei

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (804) .. (804)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<400> 201

Met pro Glu Ala 1le Glu Phe Val Leu Leu ASp Ser Ser Tyr Glu Ile 1 5 10 15

val Gly Lys Glu Pro val Ile Ile Leu Trp Gly val Thr Leu ASp Gly 20 25 30

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Leu Ile ser Arg ASP Tyr Glu Gly Lys Ala Glu Glu val val Ala Ala 50 55 60

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val Ser Lys Lys Tyr phe Gly Arg pro Arg Lys Ala val LyS val rhr 85 90 95

Thr val Ile Pro Glu Ser val Arg Glu Tyr Arg Glu Ala val Lys Lys

100 105 110

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Arg Ala Glu Asn Ala Gly Arg Ser Pro Gly Phe Arg Val ASp Ser val

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Ile Lys Asp Ser Lys Gly Asn Glu Lys Leu Leu Glu Ala Asn Asn Tyr210 215 220

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Arg Arg val Gly Ala Glu Pro Ser Met Ser val Tyr Gly His val Ser 275 280 285

val Gln Gly Arg Leu Asn val Asp Leu Tyr Asn Tyr val Glu Glu Met 290 295 300

His Glu rle Lys val Lys Thr Leu Glu Glu val Ala Glu Tyr Leu Gly305 310 315 320

val Met Arg Lys Ser Glu Arg val leu rle Glu. Trp Trp Arg rle Pro 325 330 335

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rle Lys Tyr Asn Val Gly Pro ASp Thr Ile Ile ASp ASP Pro Ser Glu 450 455 460

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Phe Arg Arg Ser Pro Ser Gly Phe Phe Lys Thr val Leu Glu Asn leu

485 490 495

rle Ala Leu Arg Lys Gln val Arg Glu Lys Met Lys Glu phe pro Pro 500 505 510

ASp Ser Pro Glu Tyr Arg rle Tyr Asp Glu Arg Gln Lys Ala leu lys515 520 525

val Leu Ala Asn Ala Ser Tyr Gly Tyr Met Gly Trp val H;s Ala Arg530 535 540

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leu Ile Leu Ser Ala rle Glu Tyr Ala Arg Lys leu Gly leu lys Val

565 57 575

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val Lys lys leu rle Glu phe val Glu Lys Gln leu Gly Phe Glu rle 595 600 605

Lys rle Asp Lys val Tyr Lys Arg val Phe Phe Thr Glu Ala Lys Lys 610 615 620

Arg Tyr val Gly Leu Leu Glu ASp Gly Arg Met ASp Ile val Gly Phe 625 630 635 640

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Lys Val Ala Glu rle rle Leu lys Thr Gly ASp rle Asn Arg Ala rle 660 665 670

Ser Tyr rle Arg Glu val val Arg Lys Leu Arg Glu Gly Lys Ile Pro 675 680 685

rle Thr Lys Leu val rle Trp Lys Thr leu Thr lys Arg rle Glu Glu 690 695 700

Tyr Glu His Glu Ala pro His val Thr Ala Ala Arg Arg Met Lys Glu

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Lys Gly Hi s Gly Ser rle Ser Ser Arg Ala Tyr Pro Tyr Phe Met Val

740 745 750

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Ala Lys Lys Xaa

<210> 202

<211> 804 5 <212> PRT

<213> Pyrococcus occultum

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (804) .. (804)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<400> 202

Met Thr Glu Thr rle Glu Phe val Leu Leu ASP Ser Ser Tyr Glu Ile 1 5 10 15

Leu Gly Lys Glu pro val val ¡le Leu Trp Gly rle Thr Leu Asp Gly20 25 30

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Leu Ile Ala Arg Gly Tyr Glu ASP Met val Glu Glu ¡le Ala Ala Ser

m 55 m

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85 90 9S

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100 . 105 110

¡le Glu Gly val Glu ASp Ser Leu Glu Ala ASp rle Arg Phe Ala Met 115 120 125

Arg Tyr Leu rle ASp Lys Arg Leu Tyr Pro phe Thr val Tyr Arg rle 130 135 140

Pro val Glu ASp Ala Gly Arg Asn Pro Gly Phe Arg val ASp Arg val 145 150 155 160

Tyr Lys val Ala Gly Asp Pro Glu Pro Leu Ala Asp rle Thr Arg rle

165 170 175 ASp Leu pro Pro Met Arg Leu val Ala Phe Asp rle Glu val Tyr Ser

180 185 190 Arg Arg Gly Ser Pro Asn Pro Ala Arg Asp Pro val rle rle val Ser

195 200 205 Leu Arg Asp Ser Glu Gly Lys Glu Arg Leu rle Glu Ala Glu Gly His 21 215 220

Asp ASp Arg Arg val Leu Arg Gl u phe val Glu Tyr val Arg Ala Phe 225 230 235 240 ASp Pro ASp rle rle val Gly Tyr Asn Ser Asn His phe ASp Trp Pro

245 250 255 Tyr Leu Met Glu Arg Ala Arg Arg Leu Gly rle Lys Leu Asp Val Thr

260 265 270 Arg Arg val Gly Ala Glu Pro Thr Thr Ser val Tyr Gly His val Ser 275 280 285 val Gln Gly Arg Leu Asn val ASp Leu Tyr ASP Tyr Ala Glu Glu Met

290 295 300 Pro Glu rle Lys Met Lys Thr Leu Glu Glu val Ala Glu Tyr Leu Gly

305 310 315 320 val Met Lys Lys Ser Glu Arg val Ile Ile Glu Trp Trp Arg Ile Pro 325 330 335 Glu Tyr Trp ASp ASp Glu Lys Lys Arg Gln Leu Leu Glu Arg Tyr Ala

340 345 350 Leu ASp ASp Val Arg Ala Thr Tyr Gly Leu Ala Glu Lys Met Leu pro355 360 365 Phe Ala Ile Gln Leu Ser Thr val Thr Gly val Pro Leu ASp Gln val

370 375 380 Gly Ala Met Gly val Gly Phe Arg Leu Glu Trp Tyr Leu Met Arg Ala

385 390 395 400

Ala Tyr ASp Met Asn Glu leu val pro Asn Arg val Glu Arg Arg Gly

405 410 415 Glu Ser Tyr Lys Gly Ala val val leu lys Pro Leu Lys Gly val His 420 425 430 Glu Asn val val Val Leu Asp Phe Ser Ser Met Tyr Pro Ser ¡le Met 435 440 445 ¡le lys Tyr Asn val Gly Pro Asp Thr rle val Asp Asp Pro Ser Glu 450 455 460 Cys pro lys Tyr Gly Gly cys Tyr val Ala Pro Glu val Gly His Arg

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530 535 540

Trp Tyr Cys Lys Arg Cys Ala Glu Ala Val Thr Ala Trp Gly Arg Asn 545 550 555 560 leu ¡le leu Thr Ala ¡le Glu Tyr Ala Arg lys leu Gly leu Lys val

565 57 575 rle Tyr Gly Asp Thr ASP Ser leu Phe val val Tyr Asp lys Glu lys

580 585 590 val Glu lys leu ¡le Glu Phe val Glu Lys Glu leu Gly phe Glu ¡le595 600 605 Lys ¡le ASp Lys ¡le Tyr lys Lys Val Phe Phe Thr Glu Ala lys Lys

610 615 620

Arg Tyr val Gly leu Leu Glu Asp Gly Arg ¡le ASp ¡le val Gly Phe 625 630 635 640

Glu Ala val Arg Gly ASp Trp Cys Glu Leu Ala Lys Glu val Gln Glu 645 650 655

Lys Ala Ala Glu ¡le val leu Asn Thr Gly Asn val ASp Lys Ala ¡le660 665 670

Ser Tyr rle Arg Glu val ¡le Lys Gln Leu Arg Glu Gly Lys val Pro 675 680 685

¡le Thr Lys Leu ¡le ¡le Trp Lys Thr Leu Ser Lys Arg ¡le Glu Glu 690 695 700

Tyr Glu H;s ASp Ala Pro H;s val Met Ala Ala Arg Arg Met Lys Glu 705 710 715 720

Ala Gly Tyr Glu Val Ser Pro Gly ASp Lys val Gly Tyr val ¡le val 725 730 735

Lys Gly Ser Gly Ser val Ser Ser Arg Ala Tyr pro Tyr Phe Met val 740 745 750

ASP Pro Ser Thr ¡le Asp val Asn Tyr Tyr ¡le Asp H;s Gln ¡le val 755 760 765

Pro Ala Ala Leu Arg ¡le Leu Ser Tyr phe Gly val Thr Glu Lys Gln 770 775 780

Leu Lys Ala Ala Ala Thr Val Gln Arg Ser Leu Phe ASp Phe phe Ala

785 790 795 800 Ser Lys Lys Xaa

<210> 203

<211> 7 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> motivo EXO I de la ADN polimerasa Tma 10

<400> 203

ASp Leu Glu Thr Ser Ser Leu

1 5

Claims

REIVINDICACIONES

1. AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada que comprende un dominio de exonucleasa 3' a 5' derivada de una eubacteria termofílica del género Thermotoga, en la que dicho dominio de exonucleasa 3' a 5' comprende un motivo de secuencia que presenta la fórmula X5X6X7XSX9XlOX11X12X13X14 (SEC ID nº 1), en la que: X5 es un residuo alanina, X6 es un residuo alanina o un residuo asparagina, X7 es un residuo leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina, XlO es un residuo aspartato, X11 es un residuo tirosina, X12 es un residuo lisina, X13 es un residuo valina y X14 es un residuo leucina, en la que dicha AON polimerasa muestra una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, de aproximadamente 6,5 ó inferior, aunque superior a OU/pmol, en la que una unidad de actividad de exonucleasa 3' a 5' cataliza la conversión de 50 pmoles de un oligonucleótido de cadena sencilla de SEC ID nº 80 u oligonucleótidos de menor longitud, en 15 minutos a 63ºC, midiendo las actividades enzimáticas utilizando el ensayo estándar de actividad de exonucleasa 3' a 5', que mide la degradación de un oligonucleótido de cadena sencilla marcado en el extremo 5' y/o en el que dicha AON polimerasa presenta una actividad de polimerasa 5' a 3' y una actividad de exonucleasas 3' a 5' atenuada, en la que la proporcion de dicha actividad de polimerasa 5' a 3' en U/pmol a dicha actividad de exonucleasa 3' a 5' en U/pmol es de entre aproximadamente 100 Y 1, en la que una unidad de actividad de exonucleasa 3' a 5' cataliza la conversión de 50 pmoles de un oligonucleótido de cadena sencilla de SEC ID nº 80 u oligonucleótidos de menor longitud, en 15 minutos a 63ºC, y una unidad de actividad de polimerasa 5' a 3' es la cantidad de actividad enzimática necesaria para incorporar 10 nmoles de dNMP en producto de AON precipitable con TCA en 30 minutos a 74ºC, midiendo las actividades enzimáticas utilizando el ensayo estándar para la actividad de exonucleasa 3' a 5', que mide la degradación de un oligonucleótido de cadena sencilla marcado en el extremo 5' y las condiciones indicadas en el Ejemplo 3 para la actividad de polimerasa 5' a 3', y/o en la que dicha AON polimerasa presenta aproximadamente 0,1% a 65% de la actividad de la exonucleasa 3' a 5' de la AON polimerasa termoestable o termoactiva no modificada correspondiente, en la que una unidad de exonucleasa 3' a 5' cataliza la conversión de 50 pmoles de un oligonucleótido de cadena sencilla de SEC ID nº 80 en oligonucleótidos de menor longitud, en 15 minutos a 63ºC, midiendo las actividades enzimáticas utilizando el ensayo estándar para la actividad de exonucleasa 3' a 5', que mide la degradación de un oligonucleótido de cadena sencilla marcado en el extremo 5'.