JP2003304870A

JP2003304870A - 弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活性ｄｎａポリメラーゼ

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Publication number: JP2003304870A
Application number: JP2003099762A
Authority: JP
Inventors: Nancy J Schoenbrunner; ジェイ．シェーンブルンナーナンシー; Thomas W Myers; ダブリュ．マイヤーズトーマス; David H Gelfland; エイチ．ゲルフランドデービッド
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2002-04-02
Filing date: 2003-04-02
Publication date: 2003-10-28
Anticipated expiration: 2023-04-02
Also published as: US20040005599A1; JP4034684B2; CN1482240B; JP2006311867A; US7148049B2; EP2272952B1; EP2272952A1; EP1350841A3; ES2389711T3; EP1350841B1; EP1350841A2; JP4585996B2; CN1482240A; ATE557083T1; EP2272952B8

Abstract

(57)【要約】【課題】ＰＣＲ等に用いた場合、高い忠実度で、高い複
製効率で、迅速かつ経済的に核酸合成を行なうことを可
能にしうる熱安定性または熱活性DNAポリメラーゼ、を
提供すること。【解決手段】弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
呈する、単離された熱安定性又は熱活性DNAポリメラー
ゼ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、弱化３’−５’エ
キソヌクレアーゼ（「校正」）活性を有する熱安定性又
は熱活性DNAポリメラーゼ、それらの合成方法、それら
の使用方法及びそれらを含有したキットに関する。前記
酵素は、多くのDNA組換技術において役に立ち、とりわ
けポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による核酸の増幅に有用
である。

【０００２】

【従来の技術】DNAポリメラーゼは、相補的鋳型DNA鎖と
プライマーとを用いて、伸長する鎖の遊離３’-ヒドロ
キシル基に対してヌクレオチドを逐次的に付加すること
により、デオキシヌクレオシド三リン酸（ヌクレオチ
ド）の５’から３’への方向にDNA分子を合成する。鋳
型鎖は、ワトソン−クリック(Watson-Crick)塩基対を介
したヌクレオチドの付加の順序を決定する。細胞におい
て、DNAポリメラーゼは、DNAの修復合成及びDNAの複製
に関与する。例えば、非特許文献１、非特許文献２を参
照のこと。

【０００３】多数の分子クローニング技術及びプロトコ
ールには、DNAポリメラーゼにより触媒されたインビト
ロ反応でのDNA合成を含む。例えば、³⁵S-標識化、³²P-
標識化、³³P-標識化又は蛍光−標識化ヌクレオチドのい
ずれかを用いて、DNA標識及びDNAシークエンシング反応
にDNAポリメラーゼが用いられる。最も多目的でかつ最
も汎用されているDNA合成技術の一つであるポリメラー
ゼ連鎖反応(PCR)技術は、特許文献１、特許文献２、特
許文献３及び特許文献４に開示されており、非特許文献
３中で論じられ、参照によりそれらの全体が本明細書に
取り込まれる。

【０００４】最も詳細にキャラクタライズされたDNAポ
リメラーゼは、大腸菌のDNAポリメラーゼI(Eco Pol I)
である。Eco Pol I及びそれと相同的ないくつかのDNAポ
リメラーゼは、三つの酵素の機能： i)５’−３’エキソヌクレアーゼ活性、 ii)３’−５’エキソヌクレアーゼ活性、及び iii)DNA合成活性、を有する。後者のii)及びiii)の二つの機能は、タンパ
ク質のカルボキシ末端の方の「クレノー」フラグメント
(Eco Pol I K)内に局在する。Eco Pol Iの酵素調製物を
ズブチリシンで処理すると、５’−３’エキソヌクレア
ーゼ活性のないEco Pol I Kを得ることができる。非特
許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献
７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非
特許文献１１を参照こと。

【０００５】Eco Pol I Kの結晶構造解析は、そのペプ
チド鎖が、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインであ
る200アミノ酸残基のより小さいドメインと、DNA合成ド
メインである400アミノ酸残基の他方のドメインとの二
つの異なるドメインに折りたたまれていることを示す。
非特許文献１２を参照のこと。３’−５’エキソヌクレ
アーゼの活性の活性部位とDNA合成活性の活性部位と
は、約30オングストローム離れている。上掲を参照のこ
と。３’−５’エキソヌクレアーゼの活性部位は、一本
鎖DNA及びデオキシヌクレオシド一リン酸(dNMP)と結合
するのに対して、DNA合成の活性部位は、一本鎖の５’
伸長部分を含む二本鎖DNA及びデオキシヌクレオシド三
リン酸(dNTP)と結合する。上掲を参照のこと。保存され
た３’−５’エキソヌクレアーゼ活性部位の存在が多数
のDNAポリメラーゼに存在することが、ベルナット(Bern
at)ら（非特許文献１３）、ブランコ(Blanco)ら（非特
許文献１４）、レーアクランツ(Reha-Krantz)（非特許
文献１５）によって予測された。

【０００６】Eco Pol IのDNA合成ドメインは、その３’
−５’エキソヌクレアーゼドメイン及び５’−３’エキ
ソヌクレアーゼドメインとは独立してクローン化され、
発現され、キャラクタライズされている。上記の通り、
DNA合成ドメインは、約400アミノ酸を含む。DNA合成ド
メインでのポリメラーゼ活性は、Eco Pol I Kでの活性
よりも50倍低い。非特許文献１６を参照のこと。

【０００７】様々な生物由来の熱安定性及び熱活性DNA
ポリメラーゼが、広い範囲の文献に記載されている。具
体例としては、真正細菌であるサーマス(Thermus)属の
様々な種由来のDNAポリメラーゼ（特許文献５を参照の
こと）が挙げられ、特に、特許文献６、特許文献７及び
特許文献８に記載されるサーマス・アクアティカス(The
rmus aquaticus)由来のDNAポリメラーゼ（Taq DNAポリ
メラーゼ）並びに特許文献９及び特許文献１０に開示さ
れる真正細菌の種のサーモトガ・マリティマ(Thermotog
a maritima)由来のDNAポリメラーゼ（Tma DNAポリメラ
ーゼ）が挙げられる。

【０００８】中温菌である大腸菌と、好熱菌であるT.マ
リティマは共に真正細菌である。大腸菌DNAポリメラー
ゼIのように、Tma DNAポリメラーゼは５’−３’エキソ
ヌクレアーゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性の両方を有する。対照的に、好熱性真正細菌でもある
サーマス・スピーシーズ由来のDNAポリメラーゼは５’
−３’エキソヌクレアーゼ活性のみを有する。熱安定性
及び熱活性DNAポリメラーゼとそれらに随伴する活性に
ついての総説は、非特許文献１７に見出される。３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く、古細菌若しくは真
正細菌の熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼの多数の
変異体は、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１
３、特許文献１４、特許文献１５に記載されている。

【０００９】Eco Pol I及びTma DNAポリメラーゼは、同
じ三つの酵素活性を有し、同じ一般的なドメイン構造を
有するが、これらは非常に異なる酵素である。例えば、
EcoPol IとTma DNAポリメラーゼとは、非常に異なるア
ミノ酸配列を有する。特に、これらの配列にギャップを
いれて、これらのアラインメントの最適化を行なって
も、これらの二つのタンパク質の３’−５’エキソヌク
レアーゼドメインは、わずか33％しか一致しない。さら
に、この二つの酵素は異なる比活性を示し、そして化学
的な変性条件下に対して異なる耐性を示す。天然のイン
ビボ環境から取り出された精製酵素において、これらの
相違点が観察されるため、これらの相違点は、酵素自体
のアミノ酸配列における差異によって引き起こされるの
であろう。

【００１０】３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、合
成された際に発生したDNA鎖を「校正」し、鋳型鎖とミ
スマッチであるヌクレオチドをそこから優先的に除去
し、それにより、DNA合成の忠実度を向上させる。しか
しながら、強固な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の
存在は、インビトロ重合反応、特にPCRにとって問題と
なる可能性があり、PCRにおいて３’−５’エキソヌク
レアーゼ活性が存在することは、複製効率の低下を招
く。非特許文献１８を参照のこと。

【００１１】３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く
DNAポリメラーゼ酵素を用いることで、３’−５’エキ
ソヌクレアーゼ活性の悪影響を避けるという試みがなさ
れてきた。天然のTaqポリメラーゼは、３’−５’エキ
ソヌクレアーゼ活性を欠いている。他のDNAポリメラー
ゼは、遺伝子工学的に、３’−５’エキソヌクレアーゼ
活性が除去されている。例えば、特許文献１６、特許文
献１７、特許文献１８、特許文献１９及び特許文献２０
を参照のこと。これらの酵素は、複製のより高い忠実度
を必要としない応用、例えば、DNAのシークエンシング
反応、サイズ解析、制限酵素解析又はプローブに基づく
解析のための鋳型を増幅するために用いられるPCRにお
いて作用する。

【００１２】しかしながら、他の重合反応、例えば、ク
ローニングのためのDNAフラグメントを増幅するためのP
CRでは、より高いレベルの忠実度が要求される。その利
益を保持しつつ、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に
関連する欠点を低減させることを目的として、二つの異
なるDNAポリメラーゼの混合物が用いられている。混合
物中の一方のポリメラーゼは、野生型のレベルの３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。他方はこの活性
を欠いている。二つのポリメラーゼの比率を操作して、
DNAポリメラーゼ活性に対する３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性の比率を所望の比率とする。非特許文献１
９、非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２
２、特許文献２１、特許文献２２、特許文献２３、特許
文献２４を参照のこと。この混合技術を用いて所望量の
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を達成することがで
きるものの、この技術は高価であり、時間を要し、逐次
処理を基準として最適化される必要がある。前記の二つ
のポリメラーゼを、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性
のDNAポリメラーゼ活性に対する所望の比率が得られる
正確な量で混合できるように、それぞれの酵素調製物の
DNAポリメラーゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性を慎重に較正する必要がある。したがって、所望
のレベルの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、
DNAポリメラーゼ活性に対する３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性の所望の比率を有するDNAポリメラーゼ試薬
を製造するための迅速かつ経済的な方法が、求められて
いる。

【００１３】

【特許文献１】米国特許第4,683,202号

【特許文献２】米国特許4,683,195号

【特許文献３】米国特許第4,800,159号

【特許文献４】米国特許第4,965,188号

【特許文献５】米国特許第5,466,591号

【特許文献６】米国特許第4,889,818号

【特許文献７】米国特許第5,352,600号

【特許文献８】米国特許第5,079,352号

【特許文献９】米国特許第5,374,553号

【特許文献１０】米国特許第5,420,029号

【特許文献１１】米国特許第6,015,668号

【特許文献１２】米国特許第5,939,301号

【特許文献１３】米国特許第5,988,614号

【特許文献１４】米国特許第5,882,904号

【特許文献１５】米国特許第5,489,523号

【特許文献１６】米国特許第6,015,668号

【特許文献１７】米国特許第5,939,301号

【特許文献１８】米国特許第5,988,614号

【特許文献１９】米国特許第5,882,904号

【特許文献２０】米国特許第5,489,523号

【特許文献２１】米国特許第5,512,462号

【特許文献２２】米国特許第5,436,149号

【特許文献２３】米国特許第5,556,772号

【特許文献２４】国際出願公開第94/26766号パンフレッ
ト

【非特許文献１】コーンバーグ(Kornberg)ら、1992、DN
A Synthesis、ダブリュー．エイチ．フリーマン(W. H.
Freeman)、ニューヨーク

【非特許文献２】アルバーツ(Alberts)ら、1994、Molec
ular Biology of the Cell、第3版、ガーランド・プレ
ス(Garland Press)社、ニューヨーク

【非特許文献３】PCR Strategies、1995、インニス(Inn
is)ら（編）、アカデミック・プレス社(Academic Pres
s, Inc.)

【非特許文献４】ブラウン(Brown)ら、1982、J. Biol.
Chem. 257: 1965-72

【非特許文献５】ジョイス(Joyce)ら、1982、J. Biol.
Chem. 257: 1958-64；

【非特許文献６】ジョイスら、1983、Proc Natl Acad S
ci USA 80: 1830-34

【非特許文献７】クレノー(Klenow)ら、1970、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 65: 168-75

【非特許文献８】コーンバーグ、1974；

【非特許文献９】セットロウ．ピー(Setlow, P.)ら、19
72、J. Biol. Chem. 247: 224-31

【非特許文献１０】セットロウら、1972、J. Biol. Che
m. 247: 232-40；

【非特許文献１１】スタイツ(Steitz)ら、1987、Protei
n Engineering、第20章、第227-35頁、オクセンダー(Ox
ender)ら編、アラン・アール・リス(Alan R. Liss)社、
ニューヨーク

【非特許文献１２】オルリス(Ollis)ら、1985、Nature
313: 762-66

【非特許文献１３】ベルナット(Bernat)ら、1989、Cell
59: 219-28

【非特許文献１４】ブランコ(Blanco)ら、1992、Gene 1
12: 139-44

【非特許文献１５】レーアクランツ(Reha-Krantz)、199
2、Gene 112: 133-37

【非特許文献１６】ダービーシャー(Derbyshire)ら、19
93、Nucleic Acids Res. 21: 5439-48を参照のこと。

【非特許文献１７】エイブラムソン(Abramson)、1995、
PCR Strategies、インニスら（編）、アカデミック・プ
レス社

【非特許文献１８】バーンズ(Barnes)、1994、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 91: 2216-20

【非特許文献１９】チェン(Cheng)ら、1994、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 91: 5695-99

【非特許文献２０】バーンズ、1994、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 91:2216-20；

【非特許文献２１】チェン、1995、PCR Strategies中の
「より長いPCR増幅(Longer PCR Amplification)」（イ
ンニスら編）、アカデミック・プレス社、サンディエゴ
313-24

【非特許文献２２】チェンら、1995、PCR Meth. Appli
c. 4:294-98

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＰＣＲ等に
用いた場合、高い忠実度で、高い複製効率で、迅速かつ
経済的に核酸合成を行なうことを可能にしうる弱化３’
−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性または
熱活性DNAポリメラーゼ、弱化３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性を有する修飾熱安定性または熱活性DNAポリ
メラーゼ、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有
するキメラ熱安定性または熱活性DNAポリメラーゼ等を
提供することを目的とする。本発明におけるその他の課
題及び目的は、本明細書の記載により、理解されるであ
ろう。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明は、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活
性DNAポリメラーゼの驚くべく産生を説明する。弱化
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、かかる酵素を広
範囲の重合反応に用いることができる。

【００１６】一つの側面において、本発明は、弱化３’
−５’エキソヌクレアーゼ活性を呈する、単離された熱
安定性又は熱活性DNAポリメラーゼを提供する。一つの
態様において、熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼ
は、修飾された熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼで
ある。別の態様において、この修飾された熱安定性DNA
ポリメラーゼは、変異型熱安定性DNAポリメラーゼであ
る。別の態様において、この修飾された熱安定性又は熱
活性DNAポリメラーゼは、対応する非修飾熱安定性又は
非修飾熱活性DNAポリメラーゼの約O.1％から約65％の
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するものであ
り、ここで、エキソヌクレアーゼ活性は実施例3に記載
の標準アッセイを用いて測定される。別の態様におい
て、この修飾熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、
対応する非修飾熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼの
約1％から約30％の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性
を有する。別の態様において、この修飾熱安定性又は熱
活性DNAポリメラーゼは、対応する非修飾熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼの約3％から約20％の３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性を有する。別の態様において、
この修飾熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、対応
する非修飾熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼの約3％
から約10％の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有す
る。別の態様において、この修飾熱安定性又は修飾され
た熱活性DNAポリメラーゼは、対応する非修飾熱安定性
又は熱活性DNAポリメラーゼの約3％から約5％の間の
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。

【００１７】別の側面において、本発明は、下記実施例
3に記載の標準アッセイを用いて測定すると、6.5単位
(U)／pmol以下、しかし0U／pmolを超える３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性を有する、単離された熱安定性又
は熱活性DNAポリメラーゼを提供する。一つの態様にお
いて、修飾された熱安定性DNAポリメラーゼ又は修飾さ
れた熱活性DNAポリメラーゼは、約0.4から3.0U／pmolの
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。別の態様
において、修飾された熱安定性DNAポリメラーゼ又は修
飾された熱活性DNAポリメラーゼは、約0.4から1.6U／pm
olの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。

【００１８】別の側面において、本発明は、５’−３’
DNAポリメラーゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性を有し、エキソヌクレアーゼ活性に対するポリメ
ラーゼ活性の比率は1より高い、単離された熱安定性又
は熱活性DNAポリメラーゼを提供する。一つの態様にお
いて、熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼが有する、
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に対する５’−３’
DNAポリメラーゼ活性の比率は、約3.0から50である。別
の態様において、熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼ
の有する、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に対する
５’−３’DNAポリメラーゼ活性の比率は約6.0から25.0
である。

【００１９】別の側面において、熱安定性又は熱活性DN
Aポリメラーゼは、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ
活性を有する。一つの態様において、熱安定性又は熱活
性DNAポリメラーゼは、修飾された熱安定性DNAポリメラ
ーゼ又は修飾された熱活性DNAポリメラーゼである。別
の態様において、この修飾された熱安定性DNAポリメラ
ーゼは、変異型熱安定性DNAポリメラーゼである。

【００２０】他の側面において、本発明は、ssDNA又はd
sDNA３’−５’エキソヌクレアーゼ活性のいずれか一方
が選択的に弱化されている、修飾された熱安定性又は修
飾された熱活性DNAポリメラーゼを提供する。一つの態
様において、修飾された熱安定性DNAポリメラーゼは、
変異型熱安定性DNAポリメラーゼである。

【００２１】別の側面において、弱化３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活性DNAポリ
メラーゼは、サーモトガ属に属する好熱性真正細菌に由
来する。さらに別の側面において、好熱性真正細菌は、
サーモトガ・マリティマ(Tma)である。別の側面におい
て、好熱性真正細菌は、サーモトガ・ネアポリタナ(The
rmotoga neapolitana)である。

【００２２】一つの側面において、弱化３’−５’エキ
ソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活性DNAポ
リメラーゼは、サーモシフォ(Thermosipho)属に属する
好熱性真正細菌に由来する。一つの態様において、この
好熱性真正細菌はサーモシフォ・アフリカヌス(Thermos
ipho africanus)である

【００２３】別の側面において、弱化３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活性DNAポリ
メラーゼは、アクイフェックス(Aquifex)属に属する好
熱性真正細菌に由来する。一つの態様において、好熱性
真正細菌は、アクイフェックス・ピロフィルス(Aquifex
pyrophilus)である。別の態様において、好熱性真正細
菌は、アクイフェックス・アエオリエウス(Aquifex aeo
lieus)である。

【００２４】別の側面において、弱化３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活性DNAポリ
メラーゼは、サーモコッカス(Thermococcus)属に属する
好熱性古細菌に由来する。一つの態様において、好熱性
古細菌は、サーモコッカス・バロッシ(Thermococcus ba
rossi)である。別の態様において、好熱性古細菌は、サ
ーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)で
ある。別の態様において、好熱性古細菌は、サーモコッ
カス・ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)
（「Tgo」）である。

【００２５】別の側面において、弱化３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活性DNAポリ
メラーゼはパイロコッカス(Pyrococcus)属に属する好熱
性古細菌に由来する。一つの態様において、この好熱性
古細菌はパイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furi
osus)である。別の態様において、この好熱性古細菌は
パイロコッカス・スピーシーズGB-Dである。別の態様に
おいて、この好熱性古細菌はパイロコッカス・ヴェッセ
イ(Pyrococcus woesei)である。別の態様において、こ
の好熱性古細菌はパイロコッカス・アビッシ(Pyrococcu
s abyssi)である。

【００２６】別の側面において、弱化３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活性DNAポリ
メラーゼは、ピロディクティウム(Pyrodictium)属に属
する好熱性古細菌に由来する。一つの態様において、こ
の好熱性古細菌はピロディクティウム・アビッシ(Pyrod
ictium abyssi)である。別の態様において、好熱性古細
菌は、ピロディクティウム・オクルタム(Pyrodictium o
ccultum)である。

【００２７】別の側面において、本発明は、配列モチー
フ： (a)式DX₁EX₂X₃SX₄ （式中、Dはアスパラギン酸残基であり、X₁は任意のア
ミノ酸残基か又は残基なしであり、Eはグルタミン酸残
基であり、X₂は任意のアミノ酸残基であり、X₃は任意の
アミノ酸残基であり、Sはセリン残基であり、X₄は任意
のアミノ酸残基である）を有するEXO Iモチーフ、又は (b)式X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄（配列番号：1）（式中、X₅は任意のアミノ酸残基であり、X₆は任意のア
ミノ酸残基であり、X₇はシステイン残基若しくはロイシ
ン残基であり、X₈は任意のアミノ酸残基であり、X₉はフ
ェニルアラニン残基若しくはチロシン残基であり、X₁₀
は任意のアミノ酸残基であり、X₁₁は任意のアミノ酸残
基であり、X₁₂は任意のアミノ酸残基であり、X₁₃はイソ
ロイシン残基若しくはバリン残基であり、そしてX₁₄は
ロイシン残基若しくはフェニルアラニン残基である）を
有するEXO IIモチーフ、又は (c)式DX₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉YX₂₀X₂₁X₂₂X₂₃（配列番号：2）（式中、Dはアスパラギン酸残基であり、X₁₅はプロリン
残基、アラニン残基、ロイシン残基若しくはスレオニン
残基であり、X₁₆はロイシン残基若しくはメチオニン残
基であり、X₁₇はロイシン残基若しくはイソロイシン残
基であり、X₁₈は任意のアミノ酸残基であり、X_l9はアラ
ニン残基若しくはセリン残基であり、Yはチロシン残基
であり、X₂₀はロイシン残基、イソロイシン残基若しく
はバリン残基であり、X₂₁はロイシン残基若しくはトリ
プトファン残基であり、X₂₂はアスパラギン酸残基、ア
スパラギン残基、グルタミン酸残基若しくはグルタミン
残基であり、X₂₃はプロリン残基若しくはセリン残基で
ある）を有するEXO IIaモチーフ、又は (d)式X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅X₃₆（配列
番号：3）（式中、X₂₄はプロリン残基若しくはアラニン残基であ
り、X₂₅は任意のアミノ酸残基であり、X₂₆はグルタミン
酸残基、アスパラギン酸残基若しくはプロリン残基であ
り、X₂₇はリジン残基、アルギニン残基若しくはグルタ
ミン酸残基であり、X₂₈は任意のアミノ酸残基であり、X
₂₉は任意のアミノ酸残基であり、X₃₀はグルタミン酸残
基、アルギニン残基若しくはアスパラギン酸残基であ
り、X₃₁は任意のアミノ酸残基であり、X₃₂はセリン残
基、アラニン残基若しくはシステイン残基であり、X₃₃
は任意のアミノ酸残基であり、X₃₄はグルタミン酸残基
若しくはスレオニン残基であり、X₃₅は任意のアミノ酸
残基であり、X₃₆はアラニン残基である）を有するEXO I
IIモチーフ、を含有する３’−５’エキソヌクレアーゼ
ドメインを含有し、かつ実施例3の標準アッセイを用い
て測定すると、6.5単位／ピコモル以下であるが、0単位
／ピコモルより高い弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ
活性を呈示す、単離された熱安定性又は熱活性DNAポリ
メラーゼを提供する。

【００２８】別の側面において、本発明は、配列モチー
フ： (a)式DX₁EX₂X₃SX₄ （式中、Dはアスパラギン酸残基であり、X₁は任意のア
ミノ酸残基か又は残基なしであり、Eはグルタミン酸残
基であり、X₂は任意のアミノ酸残基であり、X₃は任意の
アミノ酸残基であり、Sはセリン残基であり、そしてX₄
は任意のアミノ酸残基である）を有するEXO Iモチー
フ、又は (b)式X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄（配列番号：1）（式中、X₅は任意のアミノ酸残基であり、X₆は任意のア
ミノ酸残基であり、X₇はシステイン残基若しくはロイシ
ン残基であり、X₈は任意のアミノ酸残基であり、X₉はフ
ェニルアラニン残基若しくはチロシン残基であり、X₁₀
は任意のアミノ酸残基であり、X₁₁は任意のアミノ酸残
基であり、X₁₂は任意のアミノ酸残基であり、X₁₃はイソ
ロイシン残基若しくはバリン残基であり、X₁₄はロイシ
ン残基若しくはフェニルアラニン残基である）を有する
EXO IIモチーフ、又は (c)式DX₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉YX₂₀X₂₁X₂₂X₂₃（配列番号：
2）：（式中、Dはアスパラギン酸残基であり、X₁₅はプロリン
残基、アラニン残基、ロイシン残基若しくはスレオニン
残基であり、X₁₆はロイシン残基若しくはメチオニン残
基であり、X₁₇はロイシン残基若しくはイソロイシン残
基であり、X₁₈は任意のアミノ酸残基であり、X_l9はアラ
ニン残基若しくはセリン残基であり、Yはチロシン残基
であり、X₂₀はロイシン残基、イソロイシン残基若しく
はバリン残基であり、X₂₁はロイシン残基若しくはトリ
プトファン残基であり、X₂₂はアスパラギン酸残基、ア
スパラギン残基、グルタミン酸残基若しくはグルタミン
残基であり、X₂₃はプロリン残基若しくはセリン残基で
ある）を有するEXO IIaモチーフ、又は (d)式X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅X₃₆（配列
番号：3）（式中、X₂₄はプロリン残基若しくはアラニン残基であ
り、X₂₅は任意のアミノ酸残基であり、X₂₆はグルタミン
酸残基、アスパラギン酸残基若しくはプロリン残基であ
り、X₂₇はリジン残基、アルギニン残基若しくはグルタ
ミン酸残基であり、X₂₈は任意のアミノ酸残基であり、X
₂₉は任意のアミノ酸残基であり、X₃₀はグルタミン酸残
基、アルギニン残基若しくはアスパラギン酸残基であ
り、X₃₁は任意のアミノ酸残基であり、X₃₂はセリン残
基、アラニン残基若しくはシステイン残基であり、X₃₃
は任意のアミノ酸残基であり、X₃₄はグルタミン酸残基
若しくはスレオニン残基であり、X₃₅は任意のアミノ酸
残基であり、X₃₆はアラニン残基である）の式を有するE
XO IIIモチーフ、を含有する３’−５’エキソヌクレア
ーゼドメインを含有し、かつ５’−３’ポリメラーゼ活
性と、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とを有
し、実施例3に記載の標準アッセイを用いて測定される
該３’−５’エキソヌクレアーゼ活性(U／pmol)に対し
て、実施例3に記載のポリメラーゼ評価法を用いて測定
される該５’−３’ポリメラーゼ活性(U／pmol)の比率
が、約1から100である、単離された熱安定性又は熱活性
DNAポリメラーゼを提供する。

【００２９】さらに別の側面において、本発明は、配列
モチーフ： (a)式DX₁EX₂X₃SX₄ （式中、Dはアスパラギン酸残基であり、X₁は任意のア
ミノ酸残基か又は残基なしであり、Eはグルタミン酸残
基であり、X₂は任意のアミノ酸残基であり、X₃は任意の
アミノ酸残基であり、Sはセリン残基であり、そしてX₄
は任意のアミノ酸残基である）を有するEXO Iモチー
フ、又は (b)式X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄（配列番号：1）（式中、X₅は任意のアミノ酸残基であり、X₆は任意のア
ミノ酸残基であり、X₇はシステイン残基若しくはロイシ
ン残基であり、X₈は任意のアミノ酸残基であり、X₉はフ
ェニルアラニン残基若しくはチロシン残基であり、X₁₀
は任意のアミノ酸残基であり、X₁₁は任意のアミノ酸残
基であり、X₁₂は任意のアミノ酸残基であり、X₁₃はイソ
ロイシン残基若しくはバリン残基であり、X₁₄はロイシ
ン残基若しくはフェニルアラニン残基である）を有する
EXO IIモチーフ、又は (c)式DX₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉YX₂₀X₂₁X₂₂X₂₃（配列番号：2）（式中、Dはアスパラギン酸残基であり、X₁₅はプロリン
残基、アラニン残基、ロイシン残基若しくはスレオニン
残基であり、X₁₆はロイシン残基若しくはメチオニン残
基であり、X₁₇はロイシン残基若しくはイソロイシン残
基であり、X₁₈は任意のアミノ酸残基であり、X_l9はアラ
ニン残基若しくはセリン残基であり、Yはチロシン残基
であり、X₂₀はロイシン残基、イソロイシン残基若しく
はバリン残基であり、X₂₁はロイシン残基若しくはトリ
プトファン残基であり、X₂₂はアスパラギン酸残基、ア
スパラギン残基、グルタミン酸残基若しくはグルタミン
残基であり、X₂₃はプロリン残基若しくはセリン残基で
ある）を有するEXO IIaモチーフ、又は (d)式X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅X₃₆（配列
番号：3）（式中、X₂₄はプロリン残基若しくはアラニン残基であ
り、X₂₅は任意のアミノ酸残基であり、X₂₆はグルタミン
酸残基、アスパラギン酸残基若しくはプロリン残基であ
り、X₂₇はリジン残基、アルギニン残基若しくはグルタ
ミン酸残基であり、X₂₈は任意のアミノ酸残基であり、X
₂₉は任意のアミノ酸残基であり、X₃₀はグルタミン酸残
基、アルギニン残基若しくはアスパラギン酸残基であ
り、X₃₁は任意のアミノ酸残基であり、X₃₂はセリン残
基、アラニン残基若しくはシステイン残基であり、X₃₃
は任意のアミノ酸残基であり、X₃₄はグルタミン酸残基
若しくはスレオニン残基であり、X₃₅は任意のアミノ酸
残基であり、そしてX₃₆はアラニン残基である）を有す
るEXO IIIモチーフ、を含有した３’−５’エキソヌク
レアーゼドメインを含有し、かつ修飾前の熱安定性DNA
ポリメラーゼの約0.1％から65％の３’−５’エキソヌ
クレアーゼ活性を有する、修飾された熱安定性又は熱活
性DNAポリメラーゼを提供する。

【００３０】一つの側面において、本発明の単離された
熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメインは、上記の式と一致する特定の
アミノ酸残基の任意の組み合わせを有するEXO I、EXO I
I、EXO IIa又はEXO IIIドメインを含有する。

【００３１】別の側面において、本発明の単離された熱
安定性又は熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソ
ヌクレアーゼドメインは、当該配列モチーフ(a)、(b)、
(c)及び(d)の少なくとも２つ、３つ又はそれぞれを、ア
ミノ末端からカルボキシ末端への順で含有する。

【００３２】別の側面において、本発明の修飾された熱
安定性又は修飾された熱活性DNAポリメラーゼは、図1A
（配列番号：85）中の下線が付与されている３’−５’
エキソヌクレアーゼドメインに対して、約80％より高い
が100％未満の配列同一性を有する３’−５’エキソヌ
クレアーゼドメインを含有し、下記実施例3の標準アッ
セイを用いて測定すると、約6.5U／pmol以下であるが、
0U／pmolより高い弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性を呈示すものである。

【００３３】別の側面において、本発明の修飾された熱
安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメインを含有し、下記実施例3の標準
アッセイを用いて測定すると、約6.5U／pmol以下である
が、0U／pmolより高い弱化３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性を示すものであり、図1Aの配列（配列番号：85）
に対して、約80％を超えるが100％には満たない配列同
一性を有する。

【００３４】別の側面において、本発明の修飾された熱
安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメインを含有し、下記実施例3の標準
アッセイを用いて測定すると、約6.5U／pmol以下である
が、0U／pmolより高い弱化３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性を示すものであり、非修飾Tne DNAポリメラーゼ
の３’−５’エキソヌクレアーゼドメインに対して、約
80％より高いが100％未満の配列同一性を有する。一つ
の態様において、非修飾Tne DNAポリメラーゼの３’−
５’エキソヌクレアーゼドメインは、図2に示される配
列（配列番号：88）を含有する。

【００３５】別の側面において、本発明の修飾された熱
安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメインを含有し、下記実施例3の標準
アッセイを用いて測定すると、約6.5U／pmol以下である
が0U／pmolより高い弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ
活性を示すものであり、非修飾Tne DNAポリメラーゼの
アミノ酸配列に対して、約80％より高いが100％未満で
ある配列同一性を有する。非修飾Tne DNAポリメラーゼ
のアミノ酸配列は、例えば、米国特許第5,948,614号で
提供されたTneポリメラーゼのアミノ酸配列を含有しう
る。

【００３６】別の側面において、本発明の修飾された熱
安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、非修飾Taf DNAポ
リメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメインに
対して、約80％より高いが100％未満の配列同一性を有
する３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含有し、
下記実施例3の標準アッセイを用いて測定すると、約6.5
U／pmol以下であるが0U／pmolより高い弱化３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性を示すものである。一つの態様
において、非修飾Taf DNAポリメラーゼの３’−５’エ
キソヌクレアーゼドメインは、図3に示される配列（配
列番号：89）を含有する。

【００３７】別の側面において、本発明の修飾された熱
安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメインを含有し、下記実施例3の標準
アッセイを用いて測定すると、約6.5U／pmol以下である
が0U／pmolより高い弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ
活性を示すものであり、非修飾Taf DNAポリメラーゼの
アミノ酸配列に対して、約80％を超えるが100％には満
たない配列同一性を有する。非修飾Taf DNAポリメラー
ゼのアミノ酸配列は、例えば、米国特許第5,968,799号
に提供されたTaf DNAポリメラーゼのアミノ酸配列を含
有することができる。

【００３８】別の側面において、本発明の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインは、EXO Iモチーフ：式DX₁EX₂X₃SX₄ （式中、Dはアスパラギン酸残基であり、X₁は任意のア
ミノ酸残基か又は残基なしであり、Eはグルタミン酸残
基であり、X₂はスレオニン残基であり、X₃は任意のアミ
ノ酸残基であり、Sはセリン残基であり、X₄は任意のア
ミノ酸残基である）（配列番号：4）、又は（式中、Dは
アスパラギン酸残基であり、X₁は任意のアミノ酸残基か
又は残基なしであり、Eはグルタミン酸残基であり、X₂
はスレオニン残基であり、X₃はスレオニン残基であり、
Sはセリン残基であり、X₄はロイシン残基である）（配
列番号：5）、又は、（式中、Dはアスパラギン酸残基で
あり、X₁は任意のアミノ酸残基か又は残基なしであり、
Eはグルタミン酸残基であり、X₂はスレオニン残基であ
り、X₃は任意のアミノ酸残基であり、Sはセリン残基で
あり、X₄はロイシン残基である）（配列番号：6）、又
は（式中、Dはアスパラギン酸残基であり、X₁は任意の
アミノ酸残基か又は残基なしであり、Eはグルタミン酸
残基であり、X₂は任意のアミノ酸残基であり、X₃は任意
のアミノ酸残基であり、Sはセリン残基であり、X₄はロ
イシン残基である）（配列番号：7）、又は（式中、Dは
アスパラギン酸残基であり、X₁は任意のアミノ酸残基か
又は残基なしであり、Eはグルタミン酸残基であり、X₂
は任意のアミノ酸残基であり、X₃はスレオニン残基であ
り、Sはセリン残基であり、X₄はロイシン残基である）
（配列番号：8）、又は（式中、Dはアスパラギン酸残基
であり、X₁はロイシン残基であり、Eはグルタミン酸残
基であり、X₂はスレオニン残基であり、X₃はセリン残基
であり、Sはセリン残基であり、X₄はロイシン残基であ
る）（配列番号：9）を含有する。

【００３９】別の側面において、本発明の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインは、EXO IIモチーフ：ここで、該モチーフ
中、X₅は任意のアミノ酸残基であり、X₆は任意のアミノ
酸残基であり、X₇はシステイン残基若しくはロイシン残
基であり、X₈は任意のアミノ酸残基であり、X₉はフェニ
ルアラニン残基若しくはチロシン残基であり、X₁₀は任
意のアミノ酸残基であり、X₁₁は任意のアミノ酸残基で
あり、X₁₂は任意のアミノ酸残基であり、X₁₃はイソロイ
シン残基若しくはバリン残基であり、X₁₄はロイシン若
しくはフェニルアラニンのアミノ酸残基である（配列
番号：10）、又はX₅は非荷電極性残基であり、X₆は任意
のアミノ酸残基であり、X₇はシステイン残基若しくはロ
イシン残基であり、X₈はリジン残基であり、X₉はフェニ
ルアラニン残基若しくはチロシン残基であり、X₁₀は任
意のアミノ酸残基であり、X₁₁は任意のアミノ酸残基で
あり、X₁₂は任意のアミノ酸残基であり、X₁₃はイソロイ
シン残基若しくはバリン残基であり、X₁₄はロイシン若
しくはフェニルアラニンのアミノ酸残基である（配列
番号：11）、又はX₅は非荷電極性残基であり、X₆は非荷
電極性残基であり、X₇はシステイン残基若しくはロイシ
ン残基であり、X₈はリジン残基であり、X₉はフェニルア
ラニン残基若しくはチロシン残基であり、X₁₀は任意の
アミノ酸残基であり、X₁₁は任意のアミノ酸残基であ
り、X₁₂は任意のアミノ酸残基であり、X₁₃はイソロイシ
ン残基若しくはバリン残基であり、X₁₄はロイシン若し
くはフェニルアラニンのアミノ酸残基である（配列番
号：12）、又はX₅は非荷電極性残基であり、X₆は非荷電
極性残基であり、X₇はシステイン残基若しくはロイシン
残基であり、X₈はリジン残基であり、X₉はフェニルアラ
ニン残基若しくはチロシン残基であり、X₁₀は酸性残基
であり、X₁₁は任意のアミノ酸残基であり、X₁₂は任意の
アミノ酸残基であり、X₁₃はイソロイシン残基若しくは
バリン残基であり、X₁₄はロイシン若しくはフェニルア
ラニンのアミノ酸残基である（配列番号：13）、又は
X₅は非荷電極性残基であり、X₆は非荷電極性残基であ
り、X₇はシステイン残基若しくはロイシン残基であり、
X₈はリジン残基であり、X₉はフェニルアラニン残基若し
くはチロシン残基であり、X₁₀は酸性残基であり、X₁₁は
任意のアミノ酸残基であり、X₁₂は任意のアミノ酸残基
であり、X₁₃はイソロイシン残基若しくはバリン残基で
あり、X₁₄はロイシン若しくはフェニルアラニンのアミ
ノ酸残基である（配列番号：14）、又はX₅はグルタミ
ン残基であり、X₆はアスパラギン残基であり、X₇はシス
テイン残基若しくはロイシン残基であり、X₈はリジン残
基であり、X₉はフェニルアラニン残基若しくはチロシン
残基であり、X₁₀はアスパラギン酸残基であり、X₁₁は任
意のアミノ酸残基であり、X₁₂は任意のアミノ酸残基で
あり、X₁₃はイソロイシン残基若しくはバリン残基であ
り、X₁₄はロイシン若しくはフェニルアラニンのアミノ
酸残基である（配列番号：15）、又はX₅はグルタミン
残基であり、X₆はアスパラギン残基であり、X₇はロイシ
ン残基であり、X₈はリジン残基であり、X₉はフェニルア
ラニン残基であり、X₁₀はアスパラギン酸残基であり、X
₁₁はチロシン残基であり、X₁₂はリジン残基であり、X₁₃
はバリン残基であり、X₁₄はロイシン残基である（配
列番号：16）、を含有する。

【００４０】別の側面において、本発明の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインは、EXO IIモチーフを含有し、該モチーフ
中、X₅は、アラニン残基などの非極性残基である。一つ
の態様において、本発明の熱安定性又は熱活性DNAポリ
メラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメインは、
EXO IIモチーフを含有し、該モチーフ中、X₈は、リジン
残基である。別の態様において、本発明の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインは、EXO IIモチーフを含有し、該モチーフ
中、X₅は、非極性残基であり、X₈はリジン残基である。

【００４１】別の側面において、本発明の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインは、EXO IIモチーフ：ここで、該モチーフ
中、X₅は非極性残基であり、X₆は非荷電極性残基であ
り、X₇はシステイン残基若しくはロイシン残基であり、
X₈はリジン残基であり、X₉はフェニルアラニン残基若し
くはチロシン残基であり、X₁₀は酸性残基であり、X₁₁は
任意のアミノ酸残基であり、X₁₂は任意のアミノ酸残基
であり、X₁₃はイソロイシン残基若しくはバリン残基で
あり、X₁₄はロイシン若しくはフェニルアラニンのアミ
ノ酸残基である（配列番号：17）、又はX₅はアラニン
残基であり、X₆は非荷電極性残基であり、X₇はシステイ
ン残基若しくはロイシン残基であり、X₈はリジン残基で
あり、X₉はフェニルアラニン残基若しくはチロシン残基
であり、X₁₀は酸性残基であり、X₁₁は任意のアミノ酸残
基であり、X₁₂は任意のアミノ酸残基であり、X₁₃はイソ
ロイシン残基若しくはバリン残基であり、X₁₄はロイシ
ン若しくはフェニルアラニンのアミノ酸残基である
（配列番号：18）、又はX₅はアラニン残基であり、X₆は
アスパラギン残基であり、X₇はシステイン残基若しくは
ロイシン残基であり、X₈はリジン残基であり、X₉はフェ
ニルアラニン残基若しくはチロシン残基であり、X₁₀は
アスパラギン酸残基であり、X₁₁は任意のアミノ酸残基
であり、X₁₂は任意のアミノ酸残基であり、X₁₃はイソロ
イシン残基若しくはバリン残基であり、X₁₄はロイシン
若しくはフェニルアラニンのアミノ酸残基である（配列
番号：19）を含有する。

【００４２】別の側面において、本発明の熱安定性又は
熱活性 DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインは、EXO IIモチーフ：ここで、該モチーフ
中、X₅はアラニン残基であり、X₆はアスパラギン残基で
あり、X₇はロイシン残基であり、X₈はリジン残基であ
り、X₉はフェニルアラニン残基であり、X₁₀はアスパラ
ギン酸残基であり、X₁₁はチロシン残基であり、X₁₂はリ
ジン残基であり、X₁₃はバリン残基であり、X₁₄はロイシ
ン残基である（配列番号：20）を含有する。

【００４３】一つの態様において、このような熱安定性
又は熱活性DNAポリメラーゼは、図4Aに示されるQ384A変
異によって修飾された３’−５’エキソヌクレアーゼド
メインのアミノ酸配列（配列番号：96）を含有する。別
の態様において、このような熱安定性又は熱活性DNAポ
リメラーゼは、Q384A変異によって修飾された図4Aのア
ミノ酸配列（配列番号：97）を含有する。

【００４４】別の側面において、本発明の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインは、EXO IIモチーフを含有し、ここで、該モ
チーフ中、X₆は非極性アミノ酸残基である。

【００４５】別の側面において、本発明の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインは、EXO IIモチーフ：ここで、該モチーフ
中、X₅は非荷電極性残基であり、X₆は非極性残基であ
り、X₇はシステイン残基若しくはロイシン残基であり、
X₈はリジン残基であり、X₉はフェニルアラニン残基若し
くはチロシン残基であり、X₁₀は酸性残基であり、X₁₁は
任意のアミノ酸残基であり、X₁₂は任意のアミノ酸残基
であり、X₁₃はイソロイシン残基若しくはバリン残基で
あり、X₁₄はロイシン若しくはフェニルアラニンのアミ
ノ酸残基である（配列番号：21）、又はX₅はグルタミ
ン残基であり、X₆はアラニン残基であり、X₇はシステイ
ン残基若しくはロイシン残基であり、X₈はリジン残基で
あり、X₉はフェニルアラニン残基若しくはチロシン残基
であり、X₁₀はアスパラギン酸残基であり、X₁₁は任意の
アミノ酸残基であり、X₁₂は任意のアミノ酸残基であ
り、X₁₃はイソロイシン残基若しくはバリン残基であ
り、X₁₄はロイシン残基若しくはフェニルアラニン残基
である（配列番号：22）を含有する。

【００４６】別の側面において、本発明の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインは、EXO IIモチーフ：ここで、該モチーフ中
X₅はグルタミン残基であり、X₆はアラニン残基であり、
X₇はロイシン残基であり、X₈はリジン残基であり、X₉は
フェニルアラニン残基であり、X₁₀はアスパラギン酸残
基であり、X₁₁はチロシン残基であり、X₁₂はリジン残基
であり、X₁₃はバリン残基であり、X₁₄はロイシン残基で
ある（配列番号：23）を含有する。

【００４７】一つの態様において、このような熱安定性
又は熱活性DNAポリメラーゼは、図4Aに示されるN385A変
異によって修飾された３’−５’エキソヌクレアーゼド
メインのアミノ酸配列（配列番号：98）を含有する。別
の態様において、このような熱安定性又は熱活性DNAポ
リメラーゼは、N385A変異によって修飾された図4Aのア
ミノ酸配列（配列番号：99）を含有する。

【００４８】別の側面において、本発明の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインは、EXO IIモチーフを含有し、ここで、該モ
チーフ中、X₁₀はグルタミン酸残基である。

【００４９】別の側面において、本発明の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインは、EXO IIモチーフ：ここで、該モチーフ
中、X₅は非荷電極性残基であり、X₆は非荷電極性残基で
あり、X₇はシステイン残基若しくはロイシン残基であ
り、X₈はリジン残基であり、X₉はフェニルアラニン残基
若しくはチロシン残基であり、X₁₀はグルタミン酸残基
であり、X₁₁は任意のアミノ酸残基であり、X₁₂は任意の
アミノ酸残基であり、X₁₃はイソロイシン残基若しくは
バリン残基であり、X₁₄はロイシン若しくはフェニルア
ラニンのアミノ酸残基である（配列番号：24）、又は
X₅はグルタミン残基であり、X₆はアスパラギン残基であ
り、X₇はシステイン残基若しくはロイシン残基であり、
X₈はリジン残基であり、X₉はフェニルアラニン残基若し
くはチロシン残基であり、X₁₀はグルタミン酸残基であ
り、X₁₁は任意のアミノ酸残基であり、X₁₂は任意のアミ
ノ酸残基であり、X₁₃はイソロイシン残基若しくはバリ
ン残基であり、X₁₄はロイシン残基若しくはフェニルア
ラニン残基である（配列番号：25）を含有する。

【００５０】別の側面において、本発明の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインはEXO IIモチーフを含み、ここで、X₅はグル
タミン残基であり、X₆はアスパラギン残基であり、X₇は
ロイシン残基であり、X₈はリジン残基であり、X₉はフェ
ニルアラニン残基であり、X₁₀はグルタミン酸残基であ
り、X₁₁はチロシン残基であり、X₁₂はリジン残基であ
り、X₁₃はバリン残基であり、そしてX₁₄はロイシン残基
である（配列番号：26）。

【００５１】一つの態様において、このような熱安定性
又は熱活性DNAポリメラーゼは、図4Aに示されるD389E変
異によって修飾された３’−５’エキソヌクレアーゼド
メインのアミノ酸配列（配列番号：159）を含有する。
別の態様において、このような熱安定性又は熱活性DNA
ポリメラーゼは、D389E変異によって修飾された図4Aの
アミノ酸配列（配列番号：175）を含有する。

【００５２】別の側面において、本発明の熱安定性又は
熱活性 DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインはEXO IIモチーフを含有し、ここで、該モチ
ーフ中、X₁₀はグルタミン酸残基である。

【００５３】別の側面において、本発明の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインは、EXO IIモチーフを含有し、ここで、該モ
チーフ中、X₅は非極性残基であり、X₆は非極性残基であ
る。

【００５４】別の側面において、本発明の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインは、EXO IIモチーフ：ここで、該モチーフ
中、X₅は非極性残基であり、X₆は非極性残基であり、X₇
はシステイン残基若しくはロイシン残基であり、X₈はリ
ジン残基であり、X₉はフェニルアラニン残基若しくはチ
ロシン残基であり、X₁₀は酸性残基であり、X₁₁は任意の
アミノ酸残基であり、X₁₂は任意のアミノ酸残基であ
り、X₁₃はイソロイシン残基若しくはバリン残基であ
り、X₁₄はロイシン若しくはフェニルアラニンのアミノ
酸残基である（配列番号：27）、又はX₅はアラニン残
基であり、X₆はアラニン残基であり、X₇はシステイン残
基若しくはロイシン残基であり、X₈はリジン残基であ
り、X₉はフェニルアラニン残基若しくはチロシン残基で
あり、X₁₀はアスパラギン酸残基であり、X₁₁は任意のア
ミノ酸残基であり、X₁₂は任意のアミノ酸残基であり、X
₁₃はイソロイシン残基若しくはバリン残基であり、X₁₄
はロイシン残基若しくはフェニルアラニン残基である
（配列番号：28）を含有する。

【００５５】別の側面において、本発明の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインはEXO IIモチーフ：ここで、該モチーフ中、
X₅はアラニン残基であり、X₆はアラニン残基であり、X₇
はロイシン残基であり、X₈はリジン残基であり、X₉はフ
ェニルアラニン残基であり、X₁₀はアスパラギン酸残基
であり、X₁₁はチロシン残基であり、X₁₂はリジン残基で
あり、X₁₃はバリン残基であり、X₁₄はロイシン残基であ
る（配列番号：29）を含有する。

【００５６】一つの態様において、このような熱安定性
又は熱活性DNAポリメラーゼは、図4Aに示されるQ384Aと
N385Aとの二重変異によって修飾された３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列（配列番号：10
0）を含有する。別の態様において、このような熱安定
性又は熱活性DNAポリメラーゼは、Q384AとN385Aとの二
重変異によって修飾された図4Aのアミノ酸配列（配列番
号：101）を含有する。

【００５７】別の側面において、本発明の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインはEXO IIAモチーフ：ここで、該モチーフ
中、Dはアスパラギン酸残基であり、X₁₅はスレオニン残
基であり、X₁₆はメチオニン残基であり、X₁₇はイソロイ
シン残基であり、X₁₈はアラニン残基であり、X_l9はアラ
ニン残基であり、Yはチロシン残基であり、X₂₀はロイシ
ン残基であり、X₂₁はロイシン残基であり、X₂₂はグルタ
ミン残基であり、X₂₃はプロリン残基である（配列番
号：30）を含有する。

【００５８】別の側面において、本発明の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインは上記のEXO IIIモチーフを含有し、ここ
で、該モチーフ中、X₃₅が酸性アミノ酸残基である。

【００５９】別の側面において、本発明の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインは、EXO IIIモチーフ：ここで、該モチーフ
中、X₂₄はプロリン残基であり、X₂₅はバリン残基、ロイ
シン残基若しくはイソロイシン残基であり、X₂₆はグル
タミン酸残基、アスパラギン酸残基若しくはプロリン残
基であり、X₂₇はリジン残基若しくはアルギニン残基で
あり、X₂₈はアラニン残基若しくはバリン残基であり、X
₂₉はアラニン残基若しくはバリン残基であり、X₃₀はグ
ルタミン酸残基若しくはアスパラギン残基であり、X₃₁
は非荷電極性のアミノ酸残基であり、X₃₂はセリン残基
若しくはシステイン残基であり、X₃₃はシステイン残基
若しくはグリシン残基であり、X₃₄はグルタミン酸残基
若しくはスレオニン残基であり、X₃₅はアスパラギン酸
残基であり、X₃₆はアラニン残基である（配列番号：3
1）、又は、X₂₄はプロリン残基であり、X₂₅はバリン残
基であり、X₂₆はグルタミン酸残基であり、X₂₇はリジン
残基であり、X₂₈はアラニン残基であり、X₂₉はアラニン
残基であり、X₃₀はアスパラギン残基であり、X₃₁はチロ
シン残基であり、X₃₂はセリン残基であり、X₃₃はシステ
イン残基であり、X₃₄はグルタミン酸残基であり、X₃₅は
アスパラギン酸残基であり、X₃₆はアラニン残基である
（配列番号：32）を含有する。

【００６０】別の側面において、本発明の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインは、EXO IIIモチーフを含有し、該モチーフ
中、X ₃₁が非極性残基である。一つの態様において、本
発明の熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼの３’−
５’エキソヌクレアーゼドメインは、EXO IIIモチーフ
を含有し、該モチーフ中、X₃₁が非極性残基であり、X₃₅
が酸性残基である。

【００６１】一つの側面において、本発明の熱安定性又
は熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレア
ーゼドメインはEXO IIIモチーフ：ここで、該モチーフ
中、X₂₄はプロリン残基であり、X₂₅はバリン残基、ロイ
シン残基若しくはイソロイシン残基であり、X₂₆はグル
タミン酸残基、アスパラギン酸残基若しくはプロリン残
基であり、X₂₇はリジン残基若しくはアルギニン残基で
あり、X₂₈はアラニン残基若しくはバリン残基であり、X
₂₉はアラニン残基若しくはバリン残基であり、X₃₀はグ
ルタミン酸残基若しくはアスパラギン残基であり、X₃₁
は非極性残基であり、X₃₂はセリン残基若しくはシステ
イン残基であり、X₃₃はシステイン残基若しくはグリシ
ン残基であり、X₃₄はグルタミン酸残基若しくはスレオ
ニン残基であり、X₃₅はアスパラギン酸残基であり、X₃₆
はアラニン残基である（配列番号：33）を含有する。

【００６２】一つの側面において、本発明の熱安定性又
は熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレア
ーゼドメインはEXO IIIモチーフ：ここで、該モチーフ
中、X₂₄はプロリン残基であり、X₂₅はバリン残基であ
り、X₂₆はグルタミン酸残基であり、X₂₇はリジン残基で
あり、X₂₈はアラニン残基であり、X₂₉はアラニン残基で
あり、X₃₀はアスパラギン残基であり、X₃₁はアラニン残
基であり、X₃₂はセリン残基であり、X₃₃はシステイン残
基であり、X₃₄はグルタミン酸残基であり、X₃₅はアスパ
ラギン酸残基であり、X₃₆はアラニン残基である（配列
番号：34）を含有する。

【００６３】別の側面において、本発明は、アミノ末端
部分とカルボキシ末端部分とを含有し、該アミノ末端部
分が、第一のDNAポリメラーゼのアミノ末端部分に由来
し、該カルボキシ末端部分が、第二のDNAポリメラーゼ
に由来する、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
有するキメラ熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼを提
供する。一つの態様において、弱化３’−５’エキソヌ
クレアーゼ活性を有するキメラDNAポリメラーゼは、第
一の熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼのアミノ末端
部分に由来するアミノ末端部分と、第二の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼに由来するカルボキシ末端部分
とを含有し、該第二のポリメラーゼは、好ましくは、
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示すものである。
別の態様において、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ
活性を有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、アミノ
末端部分及び／又はカルボキシ末端部分は、サーマス・
スピーシーズ由来のDNAポリメラーゼに由来する。別の
態様において、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性
を有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、アミノ末端
部分及び／又はカルボキシ末端部分は、サーモトガ・ス
ピーシーズ由来のDNAポリメラーゼに由来する。別の態
様において、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、アミノ末端部
分及び／又はカルボキシ末端部分又は別の部分は、サー
マス・スピーシーズ由来のDNAポリメラーゼに由来し、
他の末端部分又は別の部分は、サーモトガ・スピーシー
ズ由来のDNAポリメラーゼに由来する；例えば、一つの
態様において、該アミノ末端部分は、サーマス・スピー
シーズ由来のDNAポリメラーゼに由来し、該カルボキシ
末端部分は、サーモトガ・スピーシーズ由来のDNAポリ
メラーゼに由来する。別の態様において、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラDNAポリメ
ラーゼにおいて、アミノ末端部分は、サーマス・スピー
シーズに由来し、かつ５’−３’エキソヌクレアーゼド
メインを含有し、カルボキシ末端部分は、サーモトガ・
スピーシーズに由来し、かつ３’−５’エキソヌクレア
ーゼドメイン及びポリメラーゼドメインを含有する。別
の態様において、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性を有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、アミノ末
端部分は、サーマス・スピーシーズに由来し、５’−
３’エキソヌクレアーゼドメインを含有し、サーマス・
スピーシーズ由来のDNAポリメラーゼの対応するアミノ
末端部分に対して約80％より高い配列同一性を有し、カ
ルボキシ末端部分は、サーモトガ・スピーシーズ由来の
DNAポリメラーゼの対応するカルボキシ末端部分に対し
て、約80％より高いが100％未満の配列同一性を有す
る。別の態様において、サーマス・スピーシーズは、サ
ーマス・スピーシーズZ05であり、サーモトガ・スピー
シーズは、サーモトガ・マリティマである。別の態様に
おいて、キメラ熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼ
は、図中で示される一つ以上の変異によって修飾され
る、図4（配列番号：90）のアミノ酸配列を含有する。
別の態様において、キメラ熱安定性又は熱活性DNAポリ
メラーゼは、図中で示される一つ以上の変異によって修
飾される、図5（配列番号：107）のアミノ酸配列を含有
する。別の態様において、弱化３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性を有するキメラ熱安定性又は熱活性DNAポリ
メラーゼは、アミノ末端部分と、中央部分と、カルボキ
シ末端部分とを含有する。別の態様において、弱化３’
−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラDNAポリ
メラーゼにおいて、アミノ末端部分は、５’−３’エキ
ソヌクレアーゼドメインを含有する。別の態様におい
て、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキ
メラDNAポリメラーゼにおいて、中央部分は、３’−
５’エキソヌクレアーゼドメインを含有する。別の態様
において、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有
するキメラDNAポリメラーゼにおいて、カルボキシ末端
部分は、ポリメラーゼドメインを含有する。別の態様に
おいて、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有す
る当該キメラDNAポリメラーゼにおいて、カルボキシ末
端部分とアミノ末端部分とは、サーマス・スピーシーズ
由来のポリメラーゼに由来する。別の態様において、弱
化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラDN
Aポリメラーゼにおいて、アミノ末端部分及び／又はカ
ルボキシ末端部分は、サーマス・スピーシーズ由来のポ
リメラーゼの対応するアミノ末端部分及び／又はカルボ
キシ末端部分に対して、80％より高い配列同一性を有す
る。別の態様において、弱化３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性を有するキメラDNAポリメラーゼ中の中央部分
は、サーモトガ・スピーシーズ由来のポリメラーゼに由
来する。別の態様において、弱化３’−５’エキソヌク
レアーゼ活性を有するキメラDNAポリメラーゼ中の中央
部分は、サーモトガ・スピーシーズ由来の対応するポリ
メラーゼに対して、80％より高いが100％未満の配列同
一性を有する。別の態様において、弱化３’−５’エキ
ソヌクレアーゼ活性を有するキメラDNAポリメラーゼ中
のアミノ部分及びカルボキシ部分は、サーマス・スピー
シーズ由来のポリメラーゼに由来し、中央部分は、サー
モトガ・スピーシーズに由来する。別の態様において、
弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラ
DNAポリメラーゼにおいて、サーマス・スピーシーズ
は、サーマス・エスピーZ05であり、サーモトガ・スピ
ーシーズは、サーモトガ・マリティマである。別の態様
において、熱安定性キメラ又は熱活性キメラDNAポリメ
ラーゼは、図中で示される一つ以上の変異によって修飾
される、図6のアミノ酸配列（配列番号：130）を含有す
る。別の態様において、キメラ熱安定性又は熱活性DNA
ポリメラーゼは、図中で示される一つ以上の変異によっ
て修飾される図7（配列番号：148）のアミノ酸配列を含
有する。

【００６４】別の側面において、下記実施例3の標準ア
ッセイを用いて測定すると、約6.5U／pmol以下であるが
0U／pmolより高い弱化３’−５’活性を示す本発明の単
離された熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼは、非修
飾Tma DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインに対して、約80％より高いが100％未満の配
列同一性を有する。一つの態様において、下記実施例3
の標準アッセイを用いて測定すると、約6.5U／pmol以下
であるが0U／pmolより高い弱化３’−５’活性を示す本
発明の単離された熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼ
は、非修飾Tma DNAポリメラーゼに対して、約80％を超
えるが100％には満たない配列同一性を有する。非修飾T
ma DNAポリメラーゼのアミノ酸配列は、例えば、図1Aの
アミノ酸配列（配列番号：85）を含有しうる。

【００６５】別の側面において、下記実施例3の標準ア
ッセイを用いて測定すると、約6.5U／pmol以下であるが
0U／pmolより高い弱化３’−５’活性を示す本発明の単
離された熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、非修
飾Tne DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインに対して、約80％より高いが100％未満の配
列同一性を有する。一つの態様において、非修飾Tne DN
Aポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメイ
ンは、図2において示される配列（配列番号：88）を含
有する。別の態様において、下記実施例3の標準アッセ
イを用いて測定すると、約6.5U／pmol以下であるが0U／
pmolより高い弱化３’−５’活性を示す本発明の単離さ
れた熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、非修飾Tne
DNAポリメラーゼに対して、約80％より高いが100％未
満の配列同一性を有する。非修飾TneDNAポリメラーゼの
アミノ酸配列は、例えば、米国特許第5,948,614号に提
供されたTneポリメラーゼのアミノ酸配列を含有しう
る。

【００６６】別の側面において、下記実施例3の標準ア
ッセイを用いて測定すると、約6.5U／pmol以下であるが
0U／pmolより高い弱化３’−５’活性を示す本発明の単
離された熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼは、非修
飾Taf DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインに対して、約80％より高いが100％未満の配
列同一性を有する。一つの態様において、非修飾Taf DN
Aポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメイ
ンは、図3に示される配列（配列番号：89）を含有す
る。別の態様において、下記実施例3の標準アッセイを
用いて測定すると、約6.5U／pmol以下であるが0U／pmol
より高い弱化３’−５’活性を示す本発明の単離された
熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、非修飾Taf DNA
ポリメラーゼに対して、約80％より高いが100％未満の
配列同一性を有する。非修飾Taf DNAポリメラーゼのア
ミノ酸配列は、例えば、米国特許第5,968,799号に提供
されるTaf DNAポリメラーゼのアミノ酸配列を含有しう
る。

【００６７】別の側面において、本発明は、３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性 U／pmolに対する５’−３’
ポリメラーゼ活性 U／pmolの比率が、両方の酵素活性
を下記実施例3に記載のように測定すると、約1から100
であり、そして、この３’−５’エキソヌクレアーゼド
メインは、非修飾Tma DNAポリメラーゼの３’−５’エ
キソヌクレアーゼドメインに対して、約80％より高いが
100％未満の配列同一性を有する、弱化３’−５’活性
を示す３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを有す
る、単離された熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼを
提供する。一つの態様において、本発明は、３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性 U／pmolに対する５’−３’
ポリメラーゼ活性 U／pmolの比率が、両方の酵素活性
を、下記実施例3に記載にように測定すると、約1から10
0である、非修飾Tma DNAポリメラーゼに対して、約80％
より高いが100％未満の配列同一性を有する、単離され
た熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼを提供する。非
修飾Tma DNAポリメラーゼのアミノ酸配列は、例えば、
図1Aのアミノ酸配列（配列番号：85）を含有しうる。

【００６８】別の側面において、本発明の単離された熱
安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメインを有し、弱化３’−５’活性を
示すものであり、ここで、３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性 U／pmolに対する５’−３’ポリメラーゼ活性
U／pmolの比率が、両方の酵素活性を、下記実施例3に
記載のように測定すると、約1から100であり、該３’−
５’エキソヌクレアーゼドメインが、非修飾Tne DNAポ
リメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメインに
対して、約80％より高いが100％未満の配列同一性を有
するものである。一つの態様において、非修飾Tne DNA
ポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン
は、図2（配列番号：88）に示される配列を含有する。
別の態様において、本発明の単離された熱安定性又は熱
活性DNAポリメラーゼは弱化３’−５’活性を示すもの
であり、ここで、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性
U／pmolに対する５’−３’ポリメラーゼ活性 U／pmol
の比率は、実施例3に記載の評価法を用いて測定する
と、約1から100であり、該ポリメラーゼは、非修飾Tne
DNAポリメラーゼに対して、約80％より高いが100％未満
の配列同一性を有する。非修飾Tne DNAポリメラーゼの
アミノ酸配列は、例えば、米国特許第5,948,614号に提
供されたTneポリメラーゼのアミノ酸配列を含有しう
る。

【００６９】別の側面において、本発明の単離された熱
安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメインを有し、弱化３’−５’活性を
示すものであり、ここで、実施例3に記載の評価法を用
いて測定すると、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性
U／pmolに対する５’−３’ポリメラーゼ活性 U／pmol
の比率が、約1から100であり、該３’−５’エキソヌク
レアーゼドメインは、非修飾Taf DNAポリメラーゼの
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインに対して、約80
％より高いが100％未満の配列同一性を有する。一つの
態様において、非修飾Taf DNAポリメラーゼの３’−
５’エキソヌクレアーゼドメインは、図3に示される配
列（配列番号：89）を含有する。別の態様において、単
離された本発明の熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼ
は、弱化３’−５’活性を示すものであり、ここで、下
記実施例3で記載される評価法を用いて測定すると、
５’−３’ポリメラーゼ活性 U／pmolの３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性 U／pmolに対する比率は、1から
100であり、該ポリメラーゼは、米国特許第5,968,799号
に提供されるTaf DNAポリメラーゼのアミノ酸配列を含
有した非修飾Taf DNAポリメラーゼに対して、約80％よ
り高いが100％未満の配列同一性を有する。

【００７０】別の側面において、本発明は、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を示す本発明の熱安定性又
は熱活性DNAポリメラーゼを含有した熱安定性又は熱活
性 DNAポリメラーゼの混合物を提供する。一つの態様に
おいて、このような混合物は、下記実施例3に記載され
る標準アッセイを用いて測定すると、約6.5U／pmol以下
であるが0U／pmolより高い３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性を有する。別の態様において、下記実施例3に記
載される評価法を用いて測定すると、かかる混合物にお
ける３’−５’エキソヌクレアーゼ活性 U／pmolに対
する５’−３’ポリメラーゼ活性 U／pmolの比率が約1
から100である。

【００７１】別の側面において、本発明は、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活
性DNAポリメラーゼをコードする配列を含有した核酸を
提供する。一つの態様において、本発明は、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活
性DNAポリメラーゼをコードする配列を含有したプラス
ミドを提供する。別の態様において、前記プラスミド
は、発現ベクターである。別の態様において、前記発現
ベクターは、微生物中において、弱化３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活性DNAポリ
メラーゼを発現させうる。別の態様において、前記微生
物は、細菌である。別の態様において、前記細菌は、大
腸菌である。

【００７２】別の側面において、本発明は、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活
性DNAポリメラーゼをコードする配列を含有した核酸を
含む及び／又は発現するように操作された細胞を提供す
る。一つの態様において、前記細胞は、弱化３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活性DN
Aポリメラーゼをコードする配列を含有したプラスミド
を含有する。別の態様において、前記プラスミドは、前
記細胞中において、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ
活性を有する熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼを発
現させうる発現ベクターである。別の態様において、前
記細胞は、微生物である。別の態様において、前記微生
物は、大腸菌などの細菌である。

【００７３】別の側面において、本発明は、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱活性DNAポリメ
ラーゼの発現が可能な条件下、弱化３’−５’エキソヌ
クレアーゼ活性を有する熱活性 DNAポリメラーゼをコー
ドする核酸を発現する能力を有する細胞をインキュベー
トする工程、及び前記細胞から弱化３’−５’エキソヌ
クレアーゼ活性を有する熱活性DNAポリメラーゼを分離
する工程を含む、本発明の弱化３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性を有する熱安定性又は熱活性 DNAポリメラー
ゼの生産方法を提供する。一つの態様において、前記細
胞は、微生物である。別の態様において、前記微生物
は、細菌である。別の態様において、前記細菌は、大腸
菌である。別の態様において、前記細胞は、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱活性 DNAポリメ
ラーゼを含有した発現ベクターを含有する。

【００７４】別の側面において、本発明は、熱安定性又
は熱活性DNAポリメラーゼに、DNA分子を複製させうる条
件下、本発明の熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼと
ともに、DNA分子をインキュベートする工程を含む、DNA
分子の複製方法を提供する。前記DNA分子は、あらゆる
種類のDNA分子、例えば、cDNA分子、ゲノムDNA分子、一
本鎖DNA分子又は二本鎖DNAなどであってもよい。一つの
態様において、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性
を有する熱活性 DNAポリメラーゼを用いて、例えば、PC
Rを介してDNA分子を増幅する。別の態様において、特定
の適用条件、例えば、金属イオンのタイプ及び濃度、塩
のタイプ及び濃度、標的核酸の長さ及び／又は標的分子
が例えば一本鎖DNA、二本鎖DNA若しくはRNAであるかど
うかに適合するように、所望のレベルの３’−５’エキ
ソヌクレアーゼ活性を伴う熱安定性又は熱活性DNAポリ
メラーゼを選択する。

【００７５】別の側面において、本発明は、熱安定性又
は熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性を評価する工程、及び弱化３’−５’エキソヌ
クレアーゼ活性を有するポリメラーゼを選択する工程を
含む、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する
熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼの選択方法を提供
する。一つの態様において、熱安定性又は熱活性DNAポ
リメラーゼは、修飾された熱安定性DNAポリメラーゼ又
は修飾された熱活性DNAポリメラーゼである。別の態様
において、この修飾された熱安定性又は熱活性DNAポリ
メラーゼは、変異型熱安定性又は熱活性DNAポリメラー
ゼである。別の態様において、下記実施例3の標準アッ
セイを用いて測定し、熱安定性又は熱活性DNAポリメラ
ーゼが、参照のポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性のレベルの約0.1％から約65％のレベルの
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する場合、選択
される。別の態様において、熱安定性又は熱活性DNAポ
リメラーゼが、参照のポリメラーゼの３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性のレベルの約1.0％から約30％のレベ
ルの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する場合、
選択される。別の態様において、熱安定性又は熱活性DN
Aポリメラーゼが、参照のポリメラーゼの３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性のレベルの約3.0％から約20％の
レベルの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する場
合、選択される。別の態様において、熱安定性又は熱活
性DNAポリメラーゼが、参照のポリメラーゼの３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性のレベルの約3.0％から約1
0％のレベルの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有
する場合、選択される。別の態様において熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼが、参照のポリメラーゼの３’
−５’エキソヌクレアーゼ活性のレベルの約3.0％から
約5％のレベルの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
有する場合、選択される。別の態様において、熱安定性
又は熱活性 DNAポリメラーゼが、実施例3の標準アッセ
イで用いて測定して、6.5U／pmol以下であるが0U／pmol
より高いレベルの活性を有する場合、選択される。別の
態様において、酵素活性を下記実施例3に記載された評
価法を用いて測定して、前記変異型熱安定性又は熱活性
DNAポリメラーゼが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性に対する５’−３’DNAポリメラーゼ活性の比率が約1
から100の間の比率を有する場合、選択される。

【００７６】別の側面において、本発明は、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活
性DNAポリメラーゼの少なくとも一つを含有するキット
を提供する。一つの態様において、前記キットは、DNA
分子を複製するのに有用な試薬をさらに含有する。別の
態様において、前記試薬は、PCR増幅において、DNA分子
を複製するのに有用である。別の態様において、前記試
薬は、緩衝液である。別の態様において、この試薬はプ
ライマーである。別の態様において、この試薬はデオキ
シリボヌクレオチドである。別の態様において、前記試
薬は、ジデオキシリボヌクレオチドである。

【００７７】別の側面において、本発明は、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有する第一の熱安定性又
は熱活性 DNAポリメラーゼと、第二の熱安定性又は熱活
性 DNAポリメラーゼとを含有するDNAポリメラーゼの混
合物を提供する。一つの態様において、第二の熱安定性
又は熱活性DNAポリメラーゼは、第一の熱安定性又は熱
活性 DNAポリメラーゼよりもさらに弱い３’−５’エキ
ソヌクレアーゼ活性を有する。別の態様において、第二
の熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、本質的に
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有さない。別の態
様において、前記第二の熱安定性又は熱活性DNAポリメ
ラーゼは、第一の熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼ
よりも高い３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有す
る。別の態様において、この混合物は、下記実施例3の
標準アッセイを用いて測定すると、約6.5U／pmol以下で
あるが0U／pmolよりも高い３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性を有する。

【００７８】別の側面において、本発明は、DNAポリメ
ラーゼによるDNA分子の複製が可能となる条件下で、弱
化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する第一のポ
リメラーゼと、第二の熱安定性又は熱活性DNAポリメラ
ーゼと一緒にDNA分子をインキュベートする工程を含
む、熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼの混合物を用
いるDNA分子の複製方法を提供する。一つの態様におい
て、DNAは、PCR増幅においてポリメラーゼの混合物を用
いることにより複製される。

【００７９】本発明の組成物及び方法は、以前より利用
可能な組成物及び方法に、いくつかの利点を提供する。
本発明のポリメラーゼは、より高い忠実度での鋳型DNA
配列の複製及び増幅を可能にするため、本発明の熱安定
性又は熱活性DNAポリメラーゼは、３’−５’エキソヌ
クレアーゼ活性がない熱安定性又は熱活性DNAポリメラ
ーゼよりも優れている。本発明のポリメラーゼは、意図
とは逆の結果を招く「アイドリング」反応の発生を減少
させることによって、複製対象の鋳型のより少ない分
解、プライマーのより少ない変性及び／又はdNTP及び他
の反応成分のより有効な使用を可能にするため、本発明
の熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、強力な３’
−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱
活性DNAポリメラーゼよりも優れている。本発明のポリ
メラーゼは、取り扱いが容易で較正の必要がほとんどな
いので、より効率的にかつより低いコストで生産し使用
できるため、本発明の変異型熱安定性又は熱活性DNAポ
リメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をも
たない熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼの混合物よ
りも優れている。また、驚くべきことに、PCRでは、以
前より用いられていた酵素の混合物よりも本発明のポリ
メラーゼの方がより少量でPCRの要求を満たすというこ
とが見出された。本発明の混合物は、３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性に対する鋳型依存性５’−３’DNAポ
リメラーゼ活性の比率のよりよい制御を可能にし、一本
鎖DNAエキソヌクレアーゼ活性のレベルと二本鎖DNAエキ
ソヌクレアーゼ活性のレベルとが独立して調節される混
合物を生成することが可能となるため、本発明の熱安定
性又は熱活性酵素の混合物は、以前より利用可能な混合
物よりも優れている。

【００８０】

【発明の実施の形態】本発明の理解を容易にするため
に、多数の用語を以下に定義する。

【００８１】用語「細胞」、「セルライン」及び「細胞
培養」は、互いに交換して用いられることができ、この
ようなすべての表示は、子孫も含める。したがって、
「形質転換体」又は「形質転換細胞」の語は、伝達の数
に関わりなく、一次形質転換細胞及び該細胞に由来する
培養物を含む。意図的な又は偶発的な変異のせいで、す
べての子孫のDNA含量は、正確に同一ではなくてもよ
い。元の形質転換細胞において選別された同一の機能を
有する変異体の子孫は、形質転換体の定義中に含まれ
る。前記細胞は原核細胞でもよく、真核細胞でもよい。

【００８２】「制御配列」という用語は、特定の宿主生
物において、作動可能に連結されているコード配列が発
現するのに必要なDNA配列を指す。原核生物に適する制
御配列には、例えば、プロモーター、必要に応じてオペ
レーター配列、リボゾーム結合部位、陽性レトロ制御要
素（参照により本明細書に取り込まれる米国特許第4,66
6,848号を参照のこと）、及び他の可能な配列が含まれ
る。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化
シグナル及びエンハンサーを利用することが知られてい
る。

【００８３】「発現クローン」の語は、作動可能な連結
で、所望のコード配列と制御配列とを含み、これらの配
列で形質転換された宿主が、コードされたタンパク質を
生産する能力を有するものであるDNA配列をいう。「発
現系」という用語は、発現クローンで形質転換された宿
主を指す。形質転換を行なうために、発現クローンをベ
クター上に含めてもよい。しかしながら、関連するDNA
も宿主染色体内に取り込まれるかもしれない。

【００８４】「遺伝子」という用語は、タンパク質、ポ
リペプチド又は前駆体の生産に必要な制御配列とコード
配列とを含むDNA配列をいう。

【００８５】「作動可能に連結される(operably linke
d)」という用語は、制御配列が機能してコード配列によ
りコードされたタンパク質の発現を制御するようなコー
ド配列の配置を指す。従って、コード配列が制御配列に
「作動可能に連結される」とは、制御配列の方向にコー
ド配列が発現できるという配置を指す。

【００８６】本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレ
オチド」は、２以上のデオキシリボヌクレオチド又はリ
ボヌクレオチドを含有した分子として定義される。正確
なサイズは多くの因子に依存するであろうし、ついで、
オリゴヌクレオチドの最終的な機能又は使用に依存す
る。オリゴヌクレオチドは、あらゆる適切な方法、例え
ば、適切な配列のクローニング及び制限、並びにナラン
グ(Narang)らのホスホトリエステル法、1979, Meth. En
zymol. 68:90-99；ブラウン(Browm)らのホスホジエステ
ル法、1979, Meth. Enzymol. 68: 109-151；ビューケイ
ジ(Beaucage)らのジエチルホスホロアミダイト法、198
1, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862及び米国特許第4,
458,066号の固体担体法などの方法による直接化学合成
により調製されうる。なお、前記文献のそれぞれは参照
により本明細書に取り込まれる。合成法の総説は、グッ
ドチャイルド(Goodchild)、1990, Bioconjugate Chemis
try1(3): 165-187において提供され、参照により本明細
書に取り込まれる。

【００８７】本明細書で用いられる用語「プライマー」
は、プライマー伸長が開始される条件下に置かれた場
合、合成の開始点としてはたらくことができるオリゴヌ
クレオチドをいう。適切な緩衝液中の適切な温度にて、
必要な四つの異なるヌクレオシド三リン酸と、熱安定性
又は熱活性DNAポリメラーゼとの存在下で、核酸鎖に相
補的なプライマー伸長産物の合成を開始する。「緩衝
液」には、コファクター（二価の金属イオンなど）及び
（適切なイオン強度を提供するための）塩が含まれ、所
望のpHに調整される。

【００８８】遺伝子配列の（コード鎖のサブシークエン
スと同等である）非コード鎖とハイブリッド形成するプ
ライマーは、本明細書では「上流」又は「フォワード」
プライマーと称される。遺伝子配列のコード鎖とハイブ
リッド形成するプライマーは「下流」又は「リバース」
プライマーと称される。

【００８９】「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵
素」という用語は、特定のヌクレオチド配列の位置か又
は近傍で二本鎖DNAを切断する、通常は細菌起源の酵素
である。

【００９０】類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミ
リーは本明細書で定義される。これらのファミリーに
は、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、ア
ルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸
（例えば、アルパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極
性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルパラギン、グル
タミン、セリン、スレオニン、チロシン）、非極性側鎖
を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシ
ン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチ
オニン、トリプトファン、システイン、グリシン）、β
−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バ
リン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸
（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファ
ン、ヒスチジン）が含まれる。

【００９１】「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、
熱に安定で、熱に耐性を示し、二本鎖の核酸の変性に必
要な時間、温度を上昇させた後、続くプライマー伸長反
応を行なうのに十分な活性を保持する酵素を指す。核酸
の変性に必要な加熱条件は技術的に十分に知られてお
り、参照により本明細書に取り込まれる米国特許第4,96
5,188号及び米国特許第4,889,818号に例示されている。
本明細書で用いられるように、熱安定性ポリメラーゼは
PCRなどの温度サイクリング反応に用いる際に適する。

【００９２】「熱活性ポリメラーゼ」という用語は、特
異的プライミングとプライマー伸長とを確保するに必要
な高い温度（例えば、55〜80℃）で活性である酵素を指
す。

【００９３】「プルーフリーディング活性」という用語
は、５’−３’DNA重合活性をも有する分子が有する
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を指す。

【００９４】DNAポリメラーゼ活性について、「酵素活
性」とは、ヌクレオチドを適切な様式で組み合わせて、
鋳型核酸鎖と相補的なプライマー伸長産物を形成する触
媒作用を指す。DNAポリメラーゼ活性は、下記実施例3に
教示されるポリメラーゼアッセイを用いて測定して、単
位／ピコモルとして表される。ポリメラーゼ活性の一単
位は、下記実施例3で提供されるポリメラーゼアッセイ
の条件を用いて、30分間に合計で10nmolのdNMPがTCA沈
殿DNA産物に取り込まれるのに要する酵素活性の量とし
て定義される。

【００９５】３’−５’エキソヌクレアーゼ活性につい
て、「酵素活性」とは、核酸鎖、ポリヌクレオチド又は
オリゴマーの最も３’側のヌクレオチド残基を、ホスホ
ジエステル結合の加水分解の触媒により順次除去するこ
とを指す。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の一単位
は、下記実施例3で教示される標準アッセイの条件下
で、15分間に50pmolの一本鎖NJS40オリゴヌクレオチド
をより短い長さのオリゴヌクレオチドに変換することを
触媒する。

【００９６】５’−３’エキソヌクレアーゼ活性につい
て、「酵素活性」とは、核酸鎖、ポリヌクレオチド又は
オリゴヌクレオチドの最も５’側のヌクレオチド残基
を、ホスホジエステル結合の加水分解の触媒により順次
除去することを指す。５’−３’エキソヌクレアーゼ活
性の一単位は、米国特許第5,795,762号に定義されてお
り、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を測定するアッ
セイが提供されている。

【００９７】本明細書で用いられるように、アミノ酸配
列における「点変異」とは、1つのアミノ酸の置換、１
つのアミノ酸の挿入又は1つのアミノ酸の欠失のいずれ
かを指す。好ましい点変異は、コードするDNAにおける
適切なコドン変化により、アミノ酸配列が導入される。
配列中の個々のアミノ酸を、本明細書ではANで表し、こ
こで、Aは配列中のアミノ酸の標準的な一文字記号であ
り、Nは配列中の位置である。アミノ酸配列の変異を、
本明細書ではA₁NA₂として表し、ここで、A₁は、変異が
ないタンパク質配列中のアミノ酸の標準的な一文字記号
であり、A₂は、変異タンパク質配列中のアミノ酸の標準
的な一文字記号であり、Nはアミノ酸配列中の位置であ
る。例えば、G46D変異とは、46位のアミノ酸におけるグ
リシン残基のアスパラギン酸残基への変化を意味する。
タンパク質に由来するドメイン中の変異について言及す
る場合、変異を包含する領域の起源であるタンパク質の
全長配列に基づいて、アミノ酸配列の位置に番号が付与
される。それゆえに、本発明において、Tma DNAポリメ
ラーゼ配列の全長に基づいて、Tma DNAポリメラーゼに
由来する領域中の変異に番号が付与されるのに対して、
サーマス・スピーシーズのDNAポリメラーゼ配列の全長
により、サーマス・スピーシーズのDNAポリメラーゼに
由来するタンパク質の領域中の変異に番号が付与され
る。DNA配列中のヌクレオチド及びポイントミューテー
ションの説明は同様である。しかしながら、キメラタン
パク質又はキメラタンパク質をコードする核酸に言及す
る場合、アミノ酸残基又は核酸は次に続けて番号が付さ
れる。

【００９８】「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タ
ンパク質」という用語は、互いに交換可能に用いられ
る。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、
互いに交換可能に用いられる。別段の指示がない限り、
アミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシ末端に向け
て書かれる。別段の指示がない限り、一本鎖核酸配列
は、５’から３’に向けて書かれる。別段の指示がない
限り、二本鎖核酸配列の上側の鎖は、５’から３’に向
けて書かれ、下側の鎖は、３’から５’に向けて書かれ
る。

【００９９】本明細書で用いられるように、「キメラ」
タンパク質とは、アミノ酸配列が、少なくとも二つの別
個のタンパク質のアミノ酸配列のサブシークエンスの融
合産物を示すタンパク質を指す。好ましいキメラタンパ
ク質は、アミノ酸配列の直接的な操作によって生産され
るものではなく、キメラアミノ酸配列をコードする「キ
メラ」遺伝子から発現される。本発明の一つの態様にお
いて、サーマス・スピーシーズのDNAポリメラーゼに由
来するアミノ末端（N-末端）領域と、Tma DNAポリメラ
ーゼに由来するカルボキシ末端（C-末端）領域とからな
るキメラタンパク質が、提供される。N-末端領域とは、
N-末端（1位のアミノ酸）から内部アミノ酸まで広がる
領域を指す。同様に、C-末端領域とは、内部アミノ酸か
らC-末端まで広がる領域を指す。

【０１００】別段の明記されない限り、アミノ酸配列同
一性は、アルツール(Altschul)ら、J. Mol. Biol. 21
5、403-410、(1990)及びカーリン(Karlin)ら、PNAS USA
90:5873-5787 (1993)に記載されるBLASTアルゴリズム
を用いて決定される。特に有用なBLASTプログラムは、
アルツールら、Methods in Enzymology, 266:460-480
(1996)に記載されるWU-BLAST-2プログラムである。WU-B
LAST-2では、ほとんどがデフォルト値で設定されるいく
つかの検索パラメータが用いられる。調整可能なパラメ
ータは、次の値：オーバーラップスパン=1、オーバーラ
ップフラクション=0.125、ワードしきい値(T)=11で設定
される。HSP S及びHSP S2パラメータは、動的な値であ
り、特定の配列の組成及びどの対象配列が検索されるか
に対する特定のデータベースの組成に依存して、プログ
ラムそれ自体によって確立される；しかしながら、前記
値を調整して感度を高めてもよい。アミノ酸配列の同一
性のパーセントの値は、適合する同一の残基の数を、ア
ラインメントされた領域中の「より長い」配列の残基の
総数で割ることで決定される。「より長い」配列は、ア
ラインメントされた領域中の最も実際に存在する配列で
ある（アラインメントスコアを最大化するために、WU-B
last-2により導入されるギャップは無視される）。アミ
ノ酸配列の相同性のパーセントは、アミノ酸残基の総数
に対する相同的なアミノ酸残基の数に基づいて決定され
る。

【０１０１】核酸配列同一性のパーセント(％)は、配列
のヌクレオチド残基と同じである候補配列におけるヌク
レオチド残基のパーセントとして定義される。別段の明
記がない限り、核酸配列同一性のパーセントは、WU-BLA
ST-2セットのBLASTNモジュールを用いて、オーバーラッ
プスパンとオーバーラップフラクションを1及び0.125に
それぞれ設定した状態で、初期設定のパラメータで計算
される。アラインメントは、アラインメント対象の配列
中におけるギャップの導入を含んでもよい。核酸配列相
同性のパーセントは、ヌクレオシドの総数に対する相同
的なヌクレオシドの数に基づいて決定される。核酸配列
及びアミノ酸配列の両者についての「相同性％」及び
「配列相同性％」は、「類似性％」及び「配列類似性
％」と交換可能に用いられる。

【０１０２】本明細書で用いられるように、100％未満
であるが、下記実施例3に記載の標準アッセイを用い
て、いまだ測定可能である場合、活性は「弱化」されて
いる。完全に機能的な酵素の活性の０．１％未満の活性
である場合、活性は「失活」するか又は「本質的に失
活」する。

【０１０３】本発明の熱安定性及び熱活性DNAポリメラ
ーゼ本発明は、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有
する熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼからなる新規
組成物を提供する。本発明の熱安定性又は熱活性DNAポ
リメラーゼは、例えば、クローニングのためのDNAフラ
グメントのPCRに基づく増幅などのPCRに基づく増幅方法
における使用において、従来の熱安定性又は熱活性DNA
ポリメラーゼよりも適切であり、かつ望ましい。本発明
の改良されたPCR増幅方法には、これらの熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼの使用が包含される。プルーフ
リーディング活性を有する弱化熱安定性又は熱活性DNA
ポリメラーゼの製造方法、これらをコードするDNA配列
及びこれらを発現させるためのベクターも提供される。

【０１０４】１．弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性を有する熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼ一つの側面において、本発明は、減弱した３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活性DNA
ポリメラーゼを提供する。一つの態様において、前記ポ
リメラーゼは、好熱性真正細菌に由来する。別の態様に
おいて、前記好熱性真正細菌は、サーモトガ（Thermoto
ga）属の種である。別の態様において、前記好熱性真正
細菌は、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritim
a: Tma）である。別の態様において、前記好熱性真正細
菌は、サーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapoli
tana）である。別の態様において、前記好熱性真正細菌
は、サーモシフォ（Thermosipho）属の種である。別の
態様において、前記好熱性真正細菌は、サーモシフォ・
アフリカヌス（Thermosipho africanus）である。別の
態様において、前記好熱性真正細菌は、アクイフェクス
（Aquifex）属の種である。別の態様において、前記好
熱性真正細菌は、アクイフェクス・ピロフィラス（Aqui
fex pyrophilus）である。別の態様において、前記好熱
性真正細菌は、アクイフェクス・アエオリエウス（Aqui
fex aeolieus）である。

【０１０５】別の側面において、前記ポリメラーゼは、
好熱性古細菌に由来する。一つの態様において、前記好
熱性古細菌は、サーモコッカス（Thermococcus）属の種
である。別の態様において、前記好熱性古細菌は、サー
モコッカス・バロッシ（Thermococcus barossi）であ
る。別の態様において、前記好熱性古細菌は、サーモコ
ッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）であ
る。別の態様において、前記好熱性古細菌は、サーモコ
ッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）
である。さらに別の態様において、前記好熱性古細菌
は、パイロコッカス（Pyrococcus）属の種である。別の
態様において、前記好熱性古細菌は、パイロコッカス・
フリオサス（Pyrococcus furiosus）である。別の態様
において、前記好熱性古細菌は、パイロコッカス・スピ
ーシーズGB-D株（Pyrococcus sp. GB-D）である。別の
態様において、前記好熱性古細菌は、パイロコッカス・
ヴェッセイ（Pyrococcus woesei）である。別の態様に
おいて、前記好熱性古細菌は、パイロコッカス・アビッ
シ（Pyrococcus abyssi）である。別の態様において、
前記好熱性古細菌は、ピロディクティウム（Pyrodictiu
m）属の種である。別の態様において、前記好熱性古細
菌は、ピロディクティウム・アビッシ（Pyrodictium ab
yssi）である。別の態様において、前記好熱性古細菌
は、ピロディクティウム・オクルタム（Pyrodictium oc
cultum）である。

【０１０６】別の側面において、本発明は、３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性を低下させる一つ以上の点変異
（１個のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失変異）を有す
る熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼを提供する。一
つの態様において、変異型熱安定性又は熱活性DNAポリ
メラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、実施
例３記載の標準アッセイを用いて測定すると、野生型DN
Aポリメラーゼの約0.1％から約65％である。別の態様に
おいて、変異型熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼの
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、野生型DNAポリ
メラーゼの約1.0％から約30％である。別の態様におい
て、変異型ポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性は、野生型DNAポリメラーゼの約3.0％から約20％
である。別の態様において、変異型ポリメラーゼの３’
−５’エキソヌクレアーゼ活性は、野生型DNAポリメラ
ーゼの約3.0％から約10％である。別の態様において、
変異型ポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性は、野生型DNAポリメラーゼの約3.0％から約5.0％で
ある。

【０１０７】別の側面において、変異型ポリメラーゼの
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、実施例４に記載
した二本鎖DNA基質及び第一変形アッセイ（First Varia
nt Assay）を用いて測定すると、野生型DNAポリメラー
ゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の50％以下であ
るが、0％よりは高い。一つの態様において、変異型ポ
リメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、野
生型DNAポリメラーゼの約4％から約35％である。別の態
様において、変異型ポリメラーゼの３’−５’エキソヌ
クレアーゼ活性は、野生型DNAポリメラーゼの約4％から
約17％である。

【０１０８】別の側面において、変異型ポリメラーゼの
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、実施例４に記載
したミスマッチ含有二本鎖DNA基質及び第二変形アッセ
イ（Second Variant Assay）を用いて測定すると、野生
型DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性の約0.1％から約70％である。一つの態様において、
変異型ポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性は、野生型DNAポリメラーゼの約10％から約50％であ
る。別の態様において、変異型ポリメラーゼの３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性は、野生型DNAポリメラー
ゼの約10％から約30％である。

【０１０９】別の側面において、本発明は、実施例３記
載の標準アッセイを用いて測定すると、約6.5U/pmol以
下であるが0U/pmolよりは高い３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性を有する熱安定性又は熱活性DNAポリメラー
ゼを提供する。一つの態様において、熱安定性又は熱活
性DNAポリメラーゼは、約0.4から約3.0ユニット/pmolの
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。別の態様
において、熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、約
0.4から約1.6ユニット/pmolの３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性を有する。

【０１１０】別の側面において、本発明は、実施例４に
記載した二本鎖DNA基質及び第一変形アッセイ（First V
ariant Assay）を用いて測定すると、約5.5U/pmol以下
であるが、0U/pmolよりは高い３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性を有する熱安定性又は熱活性DNAポリメラー
ゼを提供する。一つの態様において、熱安定性又は熱活
性DNAポリメラーゼは、約0.5から約3.6ユニット/pmolの
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。別の態様
において、熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、約
0.5から約1.9ユニット/pmolの３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性を有する。

【０１１１】別の側面において、本発明は、実施例４に
記載したミスマッチ含有二本鎖DNA基質及び第二変形ア
ッセイ（Second Variant Assay）を用いて測定すると、
約0.01から12.0U/pmolの３’−５’エキソヌクレアーゼ
活性を有する熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼを提
供する。一つの態様において、熱安定性又は熱活性DNA
ポリメラーゼは、約1.0から約7.0ユニット/pmolの３’
−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。別の態様にお
いて、熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、約1.5か
ら約5.0ユニット/pmolの３’−５’エキソヌクレアーゼ
活性を有する。

【０１１２】別の側面において、本発明は、ポリメラー
ゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を実施例
３に記載した通りに測定すると、３’−５’エキソヌク
レアーゼ活性に対する５’−３’鋳型依存的DNAポリメ
ラーゼ活性の比率が約1から100である熱安定性又は熱活
性DNAポリメラーゼを提供する。一つの態様において、
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に対する５’−３’
鋳型依存的DNAポリメラーゼ活性の比率は約3.0から50で
ある。別の態様において、３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性に対する５’−３’鋳型依存的DNAポリメラーゼ
活性の比率は約6.0から25.0である。

【０１１３】別の側面において、本発明は、ポリメラー
ゼ活性を実施例３に記載した通りに測定し、３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性を実施例４に記載した二本鎖DN
A基質及び第一変形アッセイ（First Variant Assay）を
用いて測定すると、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性
に対する５’−３’鋳型依存的DNAポリメラーゼ活性の
比率が約1から100である熱安定性又は熱活性DNAポリメ
ラーゼを提供する。一つの態様において、３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性に対する５’−３’鋳型依存的DN
Aポリメラーゼ活性の比率は、約2.0から50である。一つ
の態様において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に
対する５’−３’鋳型依存的DNAポリメラーゼ活性の比
率は、約5.0から25.0である。

【０１１４】別の側面において、本発明は、ポリメラー
ゼ活性を実施例３に記載した通りに測定し、３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性を実施例４に記載したミスマッ
チ含有二本鎖DNA基質及び第二変形アッセイ（Second Va
riant Assay）を用いて測定すると、３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性に対する５’−３’鋳型依存的DNAポ
リメラーゼ活性の比率が約0.75から10である熱安定性又
は熱活性DNAポリメラーゼを提供する。一つの態様にお
いて、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に対する５’
−３’鋳型依存的DNAポリメラーゼ活性の比率は約1.2か
ら5.0である。別の態様において、３’−５’エキソヌ
クレアーゼ活性に対する５’−３’鋳型依存的DNAポリ
メラーゼ活性の比率は約2.0から4.5である。

【０１１５】本発明の別の側面において、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活
性DNAポリメラーゼは、Tma DNAポリメラーゼに由来す
る。本発明の一態様において、弱化３’−５’エキソヌ
クレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活性DNAポリメ
ラーゼは、Tmaの３’−５’エキソヌクレアーゼドメイ
ンを含む、サーマス（Thermus）／サーモトガ(Thermoto
ga)のキメラDNAポリメラーゼに由来する。Tma DNAポリ
メラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有す
る熱安定性で熱活性のDNAポリメラーゼである。米国特
許第5,624,833号及び第5,374,553号参照。図１に示した
Tma DNAポリメラーゼの約292番目から484番目までのア
ミノ酸残基が３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを
含む。別の態様において、本発明の熱安定性又は熱活性
DNAポリメラーゼは、Tma DNAポリメラーゼの３’−５’
エキソヌクレアーゼドメインに一個以上の変異を有す
る。別の態様において、変異型Tma DNAポリメラーゼ
は、L329に変異を有する。別の態様において、前記変異
は、L329Aである。別の態様において、変異型Tma DNAポ
リメラーゼはD389に変異を有する。別の態様において、
前記変異は、D389Eである。別の態様において、変異型T
ma DNAポリメラーゼは、Q384に変異を有する。別の態様
において、前記変異は、Q384Aである。別の態様におい
て、変異型Tma DNAポリメラーゼはN385に変異を有す
る。別の態様において、前記変異は、N385Aである。別
の態様において、変異型Tma DNAポリメラーゼは、Q384
及びN385に変異を有する。別の態様において、前記変異
は、Q384A N385Aである。

【０１１６】弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
もたらすこれらのアミノ酸位置又は別のアミノ酸位置に
おける他の変異も、本明細書に記載した常法及びエキソ
ヌクレアーゼ活性アッセイ法を用いて変異体を作出し、
試験することによって同定されうる。３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性が低下したTma DNAポリメラーゼを作
製する方法の一つは、アミノ酸残基を一個以上欠失させ
るか、又は、別の化学的性質を有するアミノ酸に変異さ
せることである。例えば、アスパラギン酸などの酸性側
鎖を有するアミノ酸残基を、塩基性側鎖、非荷電極性側
鎖、非極性側鎖、β分枝側鎖、又は芳香族性側鎖に変え
ることができる。例えば、アスパラギン酸残基をグルタ
ミン酸残基に変えるなど、アミノ酸の荷電性を保存する
置換変異も３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を弱化す
ることができる。

【０１１７】変異型熱安定性又は熱活性DNAポリメラー
ゼを作出する別の方法は、ポリメラーゼの３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性に影響することが分かっている
か、あるいは推定されている残基の近傍でポリメラーゼ
に変化を加えることである。例えば、ポリメラーゼの
３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン内の重要な残基
に隣接して、一個以上のアミノ酸残基を挿入、欠失、又
は置換することができる。又は、タンパク質の一次配列
では重要な残基に隣接していないが、ポリメラーゼの立
体構造では中心的な残基に隣接する一個以上の残基に挿
入、欠失、又は置換を行なうことができる。この方法
は、重要な残基自体の変異によって、ポリメラーゼの
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が必要以上に低下し
てしまう場合や、ポリメラーゼの誤った折り畳みなどの
問題を引き起こす場合に特に好都合である。

【０１１８】上記の部位特異的変異導入技術に代わるも
のとして、よりランダムな変異導入技術を用いて、本発
明の変異型熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼを作出
することができる。例えば、挿入、欠失、及び/又は置
換による変異を、上述した中心的な残基であるか、又
は、タンパク質のドメイン構造部であるかに関係なく、
いずれかの位置に導入することができる。一つの態様に
おいて、Tma DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌク
レアーゼドメイン全体にわたり、変異をランダムに導入
する。別の態様において、変異を、DNAポリメラーゼ分
子全体にランダムに導入する。ついで、実施例に記載し
たようにして、変異した各ポリメラーゼの３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性を測定することができ、次には、
所望のレベルの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有
する変異型ポリメラーゼを選択することができる。

【０１１９】また、本発明の変異型熱安定性又は熱活性
DNAポリメラーゼは、Tma DNAポリメラーゼに一つ以上の
変異を導入することによって作出することができる。例
えば、２個以上の変異のそれぞれが、それだけでは変異
型ポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
十分に低下させることはなくても、これらを一つのポリ
メラーゼの中で組み合わせることによって、３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性を所望の範囲内に低下させるこ
とができる。又は、ssDNA基質に対するTma DNAポリメラ
ーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を選択的に低
下させる一個以上の変異を、dsDNA基質に対するTma DNA
ポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を選
択的に低下させる変異を一個以上有するポリメラーゼ分
子の中に併合させることができる。

【０１２０】また、変異型DNAポリメラーゼが弱化３’
−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する場合には、隣接
する複数の残基を欠失、挿入、置換、又は再配列するこ
とによって、本発明の変異型熱安定性又は熱活性DNAポ
リメラーゼを作出することができる。

【０１２１】Tma DNAポリメラーゼのすべてのアミノ酸
における変異がすべて、所望のレベルの３’−５’エキ
ソヌクレアーゼ活性を有する変異型熱安定性又は熱活性
DNAポリメラーゼをもたらす訳ではない。変異の中に
は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を十分に低下さ
せないものもあれば、低下させすぎるものもあろう。例
えば、米国特許第6,015,668号、第5,939,301号、及び第
5,948,614号には、Tma DNAポリメラーゼ及びTne DNAポ
リメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメインの
金属結合アスパラギン酸をアラニン残基に変異させるこ
とが記載されている。これらの変異は、これらの酵素の
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を検出可能なレベル
よりも低いレベルに低下させるため、本発明には含まれ
ない。同様に、米国特許第5,882,904号には、サーモコ
ッカス・バロッシにおけるアスパラギン酸からアラニン
への類似変異が記載されており、また、米国特許第5,48
9,523号は、パイロコッカス・ヴェッセイのDNAポリメラ
ーゼのD141A E143A二重変異を開示す。これら2つの変異
型ポリメラーゼはいずれも、実際に検出可能な３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性をもたない。したがって、
当業者には、変異型熱安定性又は熱活性DNAポリメラー
ゼをアッセイして、その３’−５’エキソヌクレアーゼ
活性を測定する必要があることが分かるはずである。
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を測定する方法は後
述する。別の方法が、当該技術分野で周知である。例え
ば、Freemontら、1986、Proteins 1:66; Derbyshire
ら、1991, EMBO J. 16:17、及びDerbyshireら、1995、M
ethods in Enzymology 262:363-85を参照のこと。

【０１２２】別の側面において、本発明は、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、かつTma DNAポリ
メラーゼの一つ以上の性質に影響を与える一つ以上の変
異を含有した変異型Tma DNAポリメラーゼを提供する。
これらの性質の例としては、特に限定されないが、Tma
DNAポリメラーゼがdNTPとdNTPアナログ又は誘導体とを
区別できるという性質、例えば、米国特許第5,939,292
号及び第5,614,365号参照、３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性、例えば、米国特許第6,228,628号、第5,466,5
91号及び第5,420,029号参照、熱安定性、低温安定性、
例えば、米国特許第6,214,557号参照、製造の容易さ又
は費用、加工性、重合速度などが挙げられる。

【０１２３】アミノ酸配列の変異は、遺伝子をコードす
る配列の中に適切な変異を組み込むことによって達成さ
れる。DNA配列におけるかかる変異は、後に詳述するよ
うに、当該技術分野において周知の技術を用いて実施す
る。

【０１２４】別の側面において、本発明は、化学的に修
飾された、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有
する熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼを提供する。
例えば、米国特許第6,183,998号を参照のこと。一つの
態様において、化学的修飾は翻訳後修飾である。別の態
様において、修飾されたアミノ酸残基は、本明細書にお
いて、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性にとって重要
又は不可欠であると同定された残基である。翻訳後修飾
は、インビトロ又はインビボで行なうことができる。翻
訳後修飾の例としては、限定されないが、プロテアーゼ
によるプロセッシング、及びアミノ酸残基のリン酸化、
グリコシル化及びアシル化などが挙げられる。例えば、
Molecular Biology of the Cell、1994, (Albertsら
編)、第3版、ニューヨークにあるガーランドパブリシン
グ社（Garland Publishing, New York）を参照のこと。

【０１２５】Tma DNAポリメラーゼに関して上述した各
タイプの変異及び修飾を他の熱安定性又は熱活性DNAポ
リメラーゼに導入して、本発明の変異型熱安定性又は熱
活性DNAポリメラーゼを作出することができる。DNAポリ
メラーゼは、アミノ酸配列のアラインメントに基づい
て、大腸菌（E. coli）のDNAポリメラーゼI、II、及びI
IIとの相同性によってA、B、及びCと名付けられたファ
ミリーに分類されている。例えば、その全体が参照によ
り本明細書に取り込まれる、Itoら、Nucl. AcidsRes.,
19:4045-47参照。サーモトガ属及びサーマス属の種のDN
Aポリメラーゼは、ファミリーAのDNAポリメラーゼに属
し、このファミリーは、大腸菌DNAポリメラーゼIも含ん
でいる。ファミリーAのDNAポリメラーゼで保存されてい
るアミノ酸が同定されている。Tma DNAポリメラーゼの
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインの領域のアミノ
酸配列と他のファミリーAのDNAポリメラーゼのアミノ酸
配列とのアラインメントを図8（配列番号:172〜187）に
示す。ファミリーAのDNAポリメラーゼの間でアミノ酸が
保存されているため、大腸菌DNAポリメラーゼIやTma DN
Aポリメラーゼなど一つのDNAポリメラーゼにおける３’
−５’エキソヌクレアーゼ活性に影響を与えるアミノ酸
を同定し、本明細書が提供する開示内容と併せることに
よって、配列アラインメントに基づいて、３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性に影響を与えるアミノ酸を他のフ
ァミリーA DNAポリメラーゼで同定することが可能にな
る。保存されている配列モチーフ、Exo I、Exo II、Exo
IIa、及びExo IIIを図8に示す。したがって、一つの態
様において、本発明は、弱化３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性を有する変異型熱安定性又は熱活性ファミリー
AのDNAポリメラーゼを提供する。別の態様において、弱
化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性
又は熱活性DNAポリメラーゼは、Exo I、Exo II、Exo II
a、又はExo IIIに変異を有する。別の態様において、こ
の変異はExo I、Exo II、又はExo IIIに存する。

【０１２６】本発明に従って弱化することができる３’
−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラー
ゼを有する多数の好熱性生物種が同定されている。代表
的な真正細菌種として以下のものがある。サーモトガ・
マリティマ、サーモトガ・ネアポリティナ（Thermotoga
neapolitina）、例えば、米国特許第6,077,664号、第
6,015,668号、第6,001,645号、及び第5,912,155号参
照；サーモシフォ・アフリカヌス、例えば、米国特許第
5,968,799号参照；ホットスプリングファミリーA（Hot
Spring family A）。

【０１２７】これらのDNAポリメラーゼにおける対応ア
ミノ酸及び領域は、それらのアミノ酸配列をアラインメ
ントすることによって同定されうる。対応は、配列間で
同一の（保存されている）アミノ酸と、同一でないアミ
ノ酸の両方であって、全体的な配列類似性を最大にする
ようアラインメントされたアミノ酸を意味する。

【０１２８】当業者は、このようなアラインメントを用
いて、ファミリーAの熱安定性又は熱活性DNAポリメラー
ゼのどの残基が、上記Tma DNAポリメラーゼの３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性ドメイン又は重要な残基に
対応するかを判定することができる。このように、一つ
の態様において、本発明は、TmaのL329残基に対応する
残基における変異を含有する変異型熱安定性又は熱活性
DNAポリメラーゼを提供する。別の態様において、Tmaの
L329残基に対応する残基はアラニンに変異する。別の態
様において、本発明は、TmaのD389残基に対応する残基
における変異を含有する変異型熱安定性又は熱活性DNA
ポリメラーゼを提供する。別の態様において、TmaのD38
9残基に対応する残基はグルタミン酸に変異する。別の
態様において、本発明は、TmaのQ384残基に対応する残
基における変異を含有する変異型熱安定性又は熱活性DN
Aポリメラーゼを提供する。別の態様において、TmaのQ3
84残基に対応する残基はアラニンに変異する。別の態様
において、本発明は、TmaのN385残基に対応する残基に
おける変異を含有する変異型熱安定性又は熱活性DNAポ
リメラーゼを提供する。別の態様において、TmaのN385
残基に対応する残基はアラニンに変異する。別の態様に
おいて、本発明は、TmaのQ384及びN385残基に対応する
残基における変異を含有する変異型熱安定性又は熱活性
DNAポリメラーゼを提供する。別の態様において、Tmaの
Q384及びN385残基に対応する各残基はアラニンに変異す
る。

【０１２９】さらに別の好熱性真正細菌種が同定されて
おり、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Amer
ican Type Culture Collection (ATCC、バージニア州20
110-2209、マナッサス、ブールバード大学10801（10801
University Boulevard, Manassas, VA 20110-220
9）)、及びドイツ微生物コレクション（DSM、ドイツ、
ブラウンシュバイクD-38124、マヘロデルベクIb（Mache
roder Weg Ib, D-38124 Braunschveig, Germany））な
どの寄託機関から入手可能である。後述するように、DN
Aポリメラーゼ、及びそれらをコードする遺伝子は、寄
託されている菌株から回収可能であり、通常の方法で配
列決定することができる。例えば、GAPプログラム（ア
クセルリス社（Accelrys）、ウィスコンシン州マディソ
ン（Madison, WI））を用いて、好熱性真正細菌のファ
ミリーA DNAポリメラーゼのアミノ酸配列とTma DNAポリ
メラーゼのアミノ酸配列とを普通に配列アラインメント
すると、好熱性真正細菌のDNAポリメラーゼ配列を本発
明の変異型DNAポリメラーゼにおいて利用することが可
能になる。

【０１３０】本発明の別の側面において、３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活性DNA
ポリメラーゼで購入可能なものを用いて、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有する変異型熱安定性又
は熱活性DNAポリメラーゼを作製する。実質的な３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活
性DNAポリメラーゼで購入可能なものの例としては、登
録商標VENT_R及び登録商標DEEP VENT_R DNAポリメラーゼ
（マサチューセッツ州ビバリー（Beverly, MA）にある
ニューイングランド・バイオラボズ社（New England Bi
olabs））及びPfu DNAポリメラーゼ（カリフォルニア州
サンディエゴ（San Diego, CA））にあるストラタジー
ン社（Stratagene）)などがある。

【０１３１】別の側面において、本発明の変異型熱安定
性又は熱活性DNAポリメラーゼは、中温性生物に天然に
存するDNAポリメラーゼであって、熱安定性又は熱活性
酵素に変異又は作製されたDNAポリメラーゼに由来す
る。例えば、Sanchez-Ruizら、2001、Trends Biotechno
l. 19:132-35; Fontana, 1991, Curr. Opin. Biotechno
l. 2:551-60; Nosohら、1990、Trends Biotechnol. 8:1
6-20; Pace, 1990, Trends Biotechnol. 8:93-98、及び
Peters, 1998, Science 281:368-69を参照のこと。一つ
の態様において、このポリメラーゼはファミリーA DNA
ポリメラーゼである。別の態様において、中温性生物は
中温性真正細菌である。別の態様において、中温性真正
細菌は大腸菌である。Villbrandtら、2000, Protein En
g. 9:645-54参照。

【０１３２】２．本発明のキメラタンパク質別の側面において、本発明は、第一のDNAポリメラーゼ
のアミノ末端部分に由来するアミノ末端部分と第二のDN
Aポリメラーゼに由来するカルボキシ末端部分とを含有
した、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する
キメラ熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼを提供す
る。一つの態様において、弱化３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性を有するキメラDNAポリメラーゼは、第一の
熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼのアミノ末端部分
に由来するアミノ末端部分と第二の熱安定性又は熱活性
DNAポリメラーゼに由来するカルボキシ末端部分とを含
有し、該第二のポリメラーゼは、好ましくは、３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を示すものである。別の態
様では、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有す
るキメラDNAポリメラーゼにおいて、該アミノ末端及び/
又はカルボキシ末端部分がサーマス・スピーシーズ由来
のDNAポリメラーゼに由来する。別の態様では、弱化
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラDNA
ポリメラーゼにおいて、該アミノ末端及び/又はカルボ
キシ末端部分がサーモトガ・スピーシーズ由来のDNAポ
リメラーゼに由来する。別の態様では、弱化３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラDNAポリメラー
ゼにおいて、アミノ末端及び/又はカルボキシ末端部分
がサーマス・スピーシーズ由来のDNAポリメラーゼに由
来し、もう一方の末端部分がサーモトガ・スピーシーズ
由来のDNAポリメラーゼに由来する；例えば、一つの態
様において、アミノ末端部分がサーマス・スピーシーズ
由来のDNAポリメラーゼに由来し、カルボキシ末端部分
がサーモトガ・スピーシーズ由来のDNAポリメラーゼに
由来する。別の態様では、弱化３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性を有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、
アミノ末端部分が、サーマス・スピーシーズ由来で、
５’−３’エキソヌクレアーゼドメインを含有し、カル
ボキシ末端部分が、サーモトガ・スピーシーズ由来で、
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインとポリメラーゼ
ドメインとを含有する。別の態様では、弱化３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラDNAポリメラー
ゼにおいて、アミノ末端部分が、サーマス・スピーシー
ズ由来で５’−３’エキソヌクレアーゼドメインを含有
し、サーマス・スピーシーズ由来のDNAポリメラーゼの
対応するアミノ末端部分と約80％よりも高い配列同一性
を示し、カルボキシ末端部分が、サーモトガ・スピーシ
ーズ由来のDNAポリメラーゼの対応するカルボキシ末端
部分と約80％よりも高い配列同一性を示す。別の態様に
おいて、該サーマス・スピーシーズはサーマス・スピー
シーズZ05株（Thermus sp. Z05）であり、該サーモトガ
・スピーシーズはサーモトガ・マリティマである。別の
態様において、キメラ熱安定性又は熱活性DNAポリメラ
ーゼは、図に示した一個以上の変異によって改変された
図4のアミノ酸配列を含有する。別の態様において、キ
メラ熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、図に示し
た一個以上の変異によって改変された図5のアミノ酸配
列を含有する。別の態様において、弱化３’−５’エキ
ソヌクレアーゼ活性を有するキメラ熱安定性又は熱活性
DNAポリメラーゼは、アミノ末端部分、中央部分、及び
カルボキシ末端部分を含む。別の態様では、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラDNAポリメ
ラーゼにおいて、アミノ末端部分が５’−３’エキソヌ
クレアーゼドメインを含有する。別の態様では、弱化
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラDNA
ポリメラーゼにおいて、中央部分が３’−５’エキソヌ
クレアーゼドメインを含有する。別の態様では、弱化
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラDNA
ポリメラーゼにおいて、カルボキシ末端部分が３’−
５’エキソヌクレアーゼドメインを含有する。別の態様
では、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する
キメラDNAポリメラーゼにおいて、アミノ末端部分及び/
又はカルボキシ末端部分が、サーマス・スピーシーズ由
来のポリメラーゼの対応するアミノ末端部分及び/又は
カルボキシ末端部分に対し80％よりも高い配列同一性を
示す。別の態様では、弱化３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性を有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、中央
部分がサーモトガ・スピーシーズ由来のポリメラーゼに
由来する。別の態様では、弱化３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性を有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、
中央部分が、サーモトガ・スピーシーズ由来の対応する
ポリメラーゼに、80％よりも高いが100％未満の低い配
列一致率を示す。別の態様では、弱化３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性を有するキメラDNAポリメラーゼにお
いて、アミノ末端部分及びカルボキシ末端部分がサーマ
ス・スピーシーズ由来のDNAポリメラーゼに由来し、中
央部分がサーモトガ・スピーシーズに由来する。別の態
様では、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有す
るキメラDNAポリメラーゼにおいて、該サーマス・スピ
ーシーズがサーマス・スピーシーズZ05株であり、該サ
ーモトガ・スピーシーズがサーモトガ・マリティマであ
る。別の態様において、キメラ熱安定性又は熱活性DNA
ポリメラーゼが、図に示した一個以上の変異によって改
変された図6のアミノ酸配列を含有する。別の態様にお
いて、キメラ熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼが、
図に示した一個以上の変異によって改変された図7のア
ミノ酸配列を含有する。

【０１３３】別の側面において、弱化３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性を有するキメラDNAポリメラーゼは、2
種類以上の熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼに由来
する配列を含有する。一つの態様において、キメラポリ
メラーゼは、そのN-末端に、第一の種由来のDNAポリメ
ラーゼに由来する５’−３’エキソヌクレアーゼドメイ
ンを含有し、そのC-末端に、第二の種由来のDNAポリメ
ラーゼに由来する３’−５’エキソヌクレアーゼドメイ
ンを含有する。別の態様において、第一の種及び第二の
種は細菌種である。別の態様において、第一の種及び第
二の種は好熱性の種である。別の態様において、第一の
種はサーマス・スピーシーズである。別の態様におい
て、サーマス・スピーシーズはサーマス・アクアティク
ス（Thermus aquaticus; Taq）である。別の態様におい
て、サーマス・スピーシーズはサーマス・フラブス（Th
ermus flavus; Tfl）である。別の態様において、サー
マス・スピーシーズはサーマス・サーモフィルス（Ther
mus thermophilus; Tth）である。別の態様において、
サーマス・スピーシーズはサーマス・スピーシーズZ05
株（TZ05）である。別の態様において、サーマス・スピ
ーシーズはサーマス・スピーシーズl7株（Tspsl7）であ
る。別の態様において、サーマス・スピーシーズはサー
マス・カルドフィルス（Thermus caldofilus; Tca）で
ある。別の態様において、第二の種はサーモトガ・スピ
ーシーズである。別の態様において、サーモトガ・スピ
ーシーズはサーモトガ・マリティマ（Tma）である。別
の態様において、第一の種がTZ05であり、第二の種がTm
aである。

【０１３４】本発明の別の側面において、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラ熱安定性又
は熱活性DNAポリメラーゼは、熱安定性又は熱活性DNAポ
リメラーゼの配列と、キメラタンパク質に有利な性質を
付与する別のタンパク質の配列とを含有する。一つの態
様において、この有利な性質は、キメラタンパク質の発
現、精製、安定性、半減期、プロテアーゼ感受性、翻訳
後修飾、酵素活性、又は熱安定性に影響を与える。

【０１３５】サーマス属の種に由来するDNAポリメラー
ゼとTma DNAポリメラーゼとは、全体的な構造が似てい
る。これらのDNAポリメラーゼにおいて、酵素の５’-ヌ
クレアーゼ活性及びDNAポリメラーゼ活性は、タンパク
質の別々の領域（活性ドメイン）中に存在する。代表的
なサーマス・スピーシーズのDNAポリメラーゼ、Taq DNA
ポリメラーゼ、及びTma DNAポリメラーゼのおおよその
活性ドメインを表1に示す。さらに、米国特許第5,420,0
29号も参照のこと。Tma DNAポリメラーゼにおいて３’
−５’エキソヌクレアーゼ活性をコードする領域とTaq
DNAポリメラーゼの対応領域における長さの違いは、Taq
DNAポリメラーゼには３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性がないことに寄与するか、それと関連する。

【０１３６】

【表1】

【０１３７】サーマス・スピーシーズのDNAポリメラー
ゼとTma DNAポリメラーゼの間には有意なアミノ酸配列
類似性が存在する。例えば、GAPコンピュータプログラ
ム〔アクセルリス社（Accelrys）、Madison, WI〕を用
いて、代表的なサーマス・スピーシーズのDNAポリメラ
ーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、及びTma DNAポリメラーゼ
のアミノ酸配列の比較は、これらのアミノ酸配列全体に
わたり約44％一致し、66％類似することを示す。

【０１３８】Tma DNAポリメラーゼとサーマス・スピー
シーズのDNAポリメラーゼには全体的な構造及び配列に
おける類似性があるため、Tma DNAポリメラーゼに存在
する全体構造と活性ドメインとを保存するTma/サーマス
のキメラ酵素を構築することができる。一つの態様にお
いて、キメラ酵素は、Tma DNAポリメラーゼのC-末端領
域とサーマス・スピーシーズのDNAポリメラーゼのN-末
端領域を含む。別の態様において、本発明のキメラ酵素
は、５’−３’エキソヌクレアーゼドメインをサーマス
・スピーシーズのDNAポリメラーゼの対応するドメイン
で置換した変異型Tma DNAポリメラーゼに相当する。本
明細書において、「対応するドメイン」とは、米国特許
第6,228,628号により提供されているアミノ酸配列アラ
インメントによって定義される。

【０１３９】本発明の別の側面において、Tma DNAポリ
メラーゼに由来する領域の最初のアミノ酸は、サーマス
・スピーシーズのDNAポリメラーゼ配列の最後のアミノ
酸に対応するアミノ酸につづくアミノ酸から始まり、残
りのTma DNAポリメラーゼ配列（893番目のアミノ酸ま
で）を含有する。全長Tma DNAポリメラーゼのアミノ酸
配列を図1Aに示す（配列番号:85）。好ましくは、サー
マス・スピーシーズのDNAポリメラーゼに由来するアミ
ノ酸配列は、Tma DNAポリメラーゼに由来するアミノ酸
配列に、この二つのアミノ酸配列が一致又は類似するア
ミノ酸配列の位置で結合する。例えば、一つの態様は、
Taq DNAポリメラーゼの1〜190番目のアミノ酸、及びTma
DNAポリメラーゼの191〜893番目のアミノ酸からなる。
Tma DNAポリメラーゼの190番目のアミノ酸はTaq DNAポ
リメラーゼ190番目のアミノ酸に対応し、キメラ酵素のT
ma DNAポリメラーゼ部分は、次のアミノ酸である191番
目のアミノ酸から始まる。

【０１４０】二つのDNAポリメラーゼが一致する領域に
おいて、サーマス・スピーシーズのDNAポリメラーゼに
由来する最後のアミノ酸をその領域内で任意に同定する
ことができる。例えば、191番目と192番目のアミノ酸
は、Taq DNAポリメラーゼ及びTmaDNAポリメラーゼで同
じである（また、サーマス・スピーシーズのDNAポリメ
ラーゼで保存されている）ため、Taq DNAポリメラーゼ
の1〜190番目のアミノ酸を含むキメラタンパク質は、Ta
q DNAポリメラーゼの1〜191番目又は1〜192番目のアミ
ノ酸を含むキメラタンパク質と区別することができな
い。実施例に記載されている本発明の実施態様は、この
酵素の本来の由来に鑑みて、Taq DNAポリメラーゼの1〜
190番目のアミノ酸を含むものとして参照される。

【０１４１】本発明の一つの側面において、キメラDNA
ポリメラーゼは、全長Tma DNAポリメラーゼ遺伝子にお
ける133〜137番目のコドン付近に存在する選択的リボゾ
ーム結合部位を少なくとも介し、好ましくは、140番目
のメチオニン開始コドンを介するTma DNAポリメラーゼ
配列をコードする領域が、サーマス・スピーシーズのDN
Aポリメラーゼ由来の対応する領域をコードする遺伝子
配列に置換されているキメラ遺伝子によってコードされ
る。全長Tma DNAポリメラーゼ遺伝子におけるこの選択
的リボゾーム結合部位と開始コドンが存在する結果、14
0番目のアミノ酸から開始する切形型Tma DNAポリメラー
ゼが優先的に発現することになる。後述するように、Tm
a DNAポリメラーゼ遺伝子のこの領域を置換すると、全
長のキメラタンパク質を効率的に発現させるのに有用で
ある。このように、本発明のキメラDNAポリメラーゼの
一態様において、サーマス・スピーシーズのDNAポリメ
ラーゼに由来するN-末端領域は、少なくとも137番目の
アミノ酸を経由して含み、好ましくは、140番目のアミ
ノ酸を介して含むTma DNAポリメラーゼの領域に置換す
る。

【０１４２】Tma DNAポリメラーゼの1〜137番目のアミ
ノ酸に対応する、各サーマス・スピーシーズのDNAポリ
メラーゼの領域は、米国特許第6,228,628号に提供され
たアミノ酸配列アラインメントから得られる。例えば、
Tma DNAポリメラーゼの1〜137番目のアミノ酸に対応す
るTaq DNAポリメラーゼの領域は1〜142番目のアミノ酸
であり、Tma DNAポリメラーゼのM140に対するTaq DNAポ
リメラーゼのアミノ酸はL145である。したがって、N-末
端領域がTaq DNAポリメラーゼに由来する態様は、Taq D
NAポリメラーゼの少なくとも1〜142番目のアミノ酸、好
ましくは1〜145番目のアミノ酸を含有する。同様に、N-
末端領域が他のサーマス・スピーシーズのDNAポリメラ
ーゼに由来する態様としては、Tma DNAポリメラーゼの1
〜137番目、及び140番目のアミノ酸に対応するサーマス
・スピーシーズのDNAポリメラーゼの領域を、米国特許
第6,228,628号に提供されたアミノ酸配列アラインメン
トから得る。

【０１４３】当業者は、酵素の機能的性質を変化させな
い微小な変異、挿入、又は欠失をDNAポリメラーゼに導
入することができ、そのような変異型酵素は、どの点か
ら見ても、非変異型酵素と同等であると認めるはずであ
る。例えば、Taq DNAポリメラーゼにおいて、N-末端側
アミノ酸のいくつかを欠失させても、酵素の機能的性質
を変えないことが知られている。同様に、アミノ酸位置
の多くを置換変異しても、本質的には何の効果もないよ
うに見える。本発明の目的にとって、酵素の機能的性質
を変えない微小変異を含むDNAポリメラーゼは非変異型
酵素と同等であると考えられる。

【０１４４】３．熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼ
の混合物別の側面において、本発明は、少なくとも一つのポリメ
ラーゼが、上記したように、弱化３’−５’エキソヌク
レアーゼ活性を有する、複数種の熱安定性又は熱活性DN
Aポリメラーゼを含有した混合物を提供する。

【０１４５】一つの側面において、混合物は、下記の実
施例3に記載されている標準アッセイを用いて測定する
と約6.5ユニット/pmol以下で0ユニット/pmolよりも高い
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。一つの態
様において、前記混合物は、約0.4から3.0ユニット/pmo
lの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。別の
態様において、前記混合物は、約0.4〜1.6ユニット/pmo
lの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。

【０１４６】別の側面において、ポリメラーゼ活性を下
記の実施例3に記載されているポリメラーゼアッセイ法
を用いて測定し、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
下記の実施例3に記載されている標準アッセイを用いて
測定すると、前記混合物は、３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性に対する鋳型非依存的５’−３’DNAポリメラ
ーゼ活性の比率が約1から100である。一つの態様におい
て、この混合物で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に
対する鋳型非依存的５’−３’DNAポリメラーゼ活性の
比率が、約3.0から50である。別の態様において、混合
物は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に対する鋳型
非依存的５’−３’DNAポリメラーゼ活性の比率が、約
6.0から25.0である。

【０１４７】４．本発明のDNAポリメラーゼの長所本発明の変異型熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼ
は、文献に記載されている熱安定性又は熱活性DNAポリ
メラーゼに対して、顕著な向上を示す。特に、本発明の
DNAポリメラーゼは、以下の性質の組み合わせ：（1）野生型熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼと比較
してプライマーの分解が抑えられる；（2）野生型の熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼと比
較して、dNTPをより効率的に利用し、非生産的な「アイ
ドリング」反応を抑制する；（3）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもたない変
異型熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼと比較して、
複製の忠実度が向上する；（4）熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼの混合物と比
較して、手間と費用が低減する；（5）DNAポリメラーゼを組換発現系において容易かつ効
率的に高レベル発現させることができ、それにより、こ
の酵素の商業生産が容易になる；及び、（6）本発明のDNAポリメラーゼは、熱安定性古細菌由来
のプルーフリーディングDNAポリメラーゼとは対照的
に、ヌクレオシド三リン酸の類似化合物を簡単に取り込
む、を提供する。

【０１４８】本発明のDNAポリメラーゼが有する性質を
組み合わせることは、PCRにおいて特に有用であり、か
なり改善された結果が得られる。

【０１４９】（1）プライマー分解の低下強いssDNA ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する
熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼを用いるインビト
ロでの適用において、該ポリメラーゼはプライマーを分
解する。このことは、2つの様式で反応に影響する。第
一に、反応液中のプライマー濃度を低下させることであ
る。第二に、さまざまな長さの部分分解されたプライマ
ーを生成することである。プライマーの標的に対する特
異性は、プライマーの配列及び長さによって直接特定さ
れるため、短くなったプライマーでは、標的配列に対す
る特異性が低下する可能性がある。これは、所望の配列
の複製の減少と、偽又は目的外の配列の複製増加とを同
時煮引き起こしうる。加熱してDNA鎖を分離させ、二本
鎖を変性させる際に、ssDNA ３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性があると、後続の重合過程で鋳型として働く、
合成された鎖の末端の長さが短くなる可能性もある。プ
ライマーはこれらの末端に結合するため、それらの長さ
が短くなると、それらのプライマーに対する結合強度が
低下する。これによって、所望のPCR産物量の低下と、
偽のPCR産物量の増加とを引き起こしうる。これらの効
果は、増幅された偽配列に対する増幅された標的配列の
割合が増加すると、反応の特異性が低下し、それによっ
て標的検出の感度が低下する可能性があるため、PCRに
とって特に厄介である。

【０１５０】本発明の熱安定性又は熱活性DNAポリメラ
ーゼは、弱化レベルの３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性を有することにより、この問題を克服する。

【０１５１】（2）アイドリング反応の低下熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼのdsDNAエキソヌク
レアーゼ活性は、ポリメラーゼが直鎖状鋳型の末端に到
達したときに「アイドリング」する原因となることがあ
る。すなわち、重合の繰り返しサイクルにより、鋳型の
末端に至り、合成が完了した鎖の末端にある残基を加水
分解する。この重合と加水分解とのサイクルは、反応混
合物中のdNTP濃度を低下させ、ピロリン酸濃度を上昇さ
せるため、その後のサイクルの反応効率が低下する。そ
の結果、生成物の収率を低下させうる。

【０１５２】本発明の変異型熱安定性又は熱活性DNAポ
リメラーゼは、弱化dsDNA ３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性を有することにより、この問題を克服する。一
つの態様において、本発明の変異型ポリメラーゼは、一
本鎖DNA基質と実施例3記載の標準アッセイを用いて測定
すると、野生型酵素の活性の約0.1％から約65％の３’
−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。別の態様にお
いて、本発明の変異型ポリメラーゼは、野生型酵素の活
性の約1％から約30％の３’−５’エキソヌクレアーゼ
活性を有する。別の態様において、本発明の変異型ポリ
メラーゼは、野生型酵素の活性の約3％から約20％の
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。別の態様
において、本発明の変異型ポリメラーゼは、野生型酵素
の活性の約3％から約10％の３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性を有する。別の態様において、本発明の変異型
ポリメラーゼは、野生型酵素の活性の約3％から約5％の
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。

【０１５３】（3）高度の忠実性熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキ
ソヌクレアーゼ活性の有害作用を克服するための以前の
試みは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもたない
か、本質的にもたない変異型ポリメラーゼ又はこの活性
を本来もたないポリメラーゼを用いてきたが、この方法
にはそれ自体問題を生じる可能性がある。３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性をもたないポリメラーゼは、この
活性を有するポリメラーゼよりもエラー率が高い。PCR
のある応用例として、例えば、増幅した配列をクローン
化する場合、エラー率を低く保つことが重要である。さ
らに、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の存在は、ヌ
クレオチドの誤った取り込みが訂正されうるため、より
長い標的に対する増幅及び/又は逆転写酵素の効率を上
昇させる。従って、プルーフリーディング活性を全くも
たない熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、これら
の適用では、あまり適切でない場合がある。

【０１５４】本発明は、弱化３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性を有する熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼ
を提供することによって、この問題を克服する。目下、
弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性レベルが、誤っ
て挿入されたdNTPの効率的な除去によって長い鋳型のPC
R効率を向上させるには充分であり、長鎖PCR及びRT-PCR
を容易にすると判断されている。

【０１５５】（4）操作の軽減強い３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に伴う問題を克
服するために用いられている別のアプローチは、野生型
レベルのプルーフリーディング活性を有するポリメラー
ゼと、本質的にプルーフリーディング活性をもたないポ
リメラーゼとを混合することである。混合物中における
これら二種類のポリメラーゼの比率を操作することで、
ポリメラーゼ活性に対して、プルーフリーディング活性
を所望の比率にすることができる。かかるアプローチ
は、うまく使用されてきたが、その欠点もある。各酵素
の調製物毎に両酵素の３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性とポリメラーゼ活性とを正確に測定しなければなら
ず、また、各反応で、各酵素量を正確に加えなければな
らない。また、このアプローチでは、両酵素とも同じよ
うな保存安定性を有することは要求される。したがっ
て、酵素混合物を使用する反応はより多くの操作を必要
とするため、費用を増加させるとともに効率を低下させ
る。

【０１５６】本発明の熱安定性又は熱活性DNAポリメラ
ーゼは、一つの態様において、ポリメラーゼ活性に対し
て、プルーフリーディング活性を、所望の比率である単
一のポリメラーゼを提供することによって、これらの問
題を克服する。各反応には一種類の酵素を加えるだけで
ある。予想外にも、酵素混合物の代わりに本発明のポリ
メラーゼを用いる場合、より少ない全酵素量しか必要と
されないことも発見された。

【０１５７】（5）発現効率上記したとおり、一つの側面において、本発明は、５’
−ヌクレアーゼドメインがサーマス・スピーシーズのDN
Aポリメラーゼ由来の対応するドメインで置換されてい
る変異型Tma DNAポリメラーゼに相当するキメラ酵素を
提供する。前記酵素は、５’−ヌクレアーゼドメインを
コードする遺伝子の領域がサーマス・スピーシーズのDN
Aポリメラーゼ遺伝子の対応領で置換されている変異型T
ma DNAポリメラーゼ遺伝子に対応するキメラ遺伝子から
発現される。前記キメラ遺伝子の重要な長所は、組換発
現系において、Tma DNAポリメラーゼ遺伝子よりもずっ
と効率的に全長DNAポリメラーゼを発現させることがで
きることである。

【０１５８】全長天然型Tma DNAポリメラーゼ遺伝子を
含む組換発現系から全長DNAポリメラーゼの発現は、こ
のタンパク質の切形型が優先的に発現されるため問題と
なる。米国特許第5,420,029号を参照のこと。Met140 Tm
aという切形型タンパク質は、全長タンパク質のアミノ
酸番号140〜893からなり、翻訳が140位のメチオニンか
ら開始される翻訳に起因すると考えられる。さらに、コ
ドン133〜137に推定リボゾーム結合部位が存在すること
は、切形型タンパク質が内部メチオニンから開始される
翻訳に起因することを示唆する。Met140 Tma切形型タン
パク質の優先的発現は、全長Tma DNAポリメラーゼの発
現及び精製にかなりの困難が伴うことを示す。

【０１５９】本発明の一つの態様において、キメラDNA
ポリメラーゼ遺伝子は、全長Tma DNAポリメラーゼ遺伝
子における133〜137番目のコドン付近に存在する選択的
リボゾーム結合部位を少なくとも介し、好ましくは、14
0番目のメチオニン開始コドンを介して対応する領域に
サーマス・スピーシーズのDNAポリメラーゼ遺伝子の配
列を含む。したがって、リボゾーム結合部位と、好まし
くは、Met140 Tmaの翻訳に応答する開始コドンを含む領
域にわたる、Tma DNAポリメラーゼ遺伝子の配列が、サ
ーマス・スピーシーズのDNAポリメラーゼ遺伝子の対応
する領域で置換されている。サーマス・スピーシーズの
DNAポリメラーゼ遺伝子の対応する領域は、望ましくな
い内部開始による切形型タンパク質を生じさせない。そ
の結果、キメラDNAポリメラーゼを含む組換発現系は、
専ら全長キメラDNAポリメラーゼを発現させる。

【０１６０】（6）ヌクレオシド三リン酸アナログの取
り込み一つの側面において、本発明の熱安定性又は熱活性DNA
ポリメラーゼは、熱安定性古細菌のプルーフリーディン
グDNAポリメラーゼ（VENT^TM、DEEP VENT^TM、Pfu、Pwo、
Poc、Pab、Tgoなど）とは対照的に、dUTP、dITPなどの
ヌクレオシド三リン酸類似化合物を受け入れ簡単に取り
込むことができる。すなわち、これらのポリメラーゼ
は、dUTP若しくはdITPの存在又は鋳型鎖におけるdUMP若
しくはdIMPの存在によって阻害されない。これに対し
て、前記熱安定性古細菌の校正機能を有するDNAポリメ
ラーゼ、又は校正機能を有する古細菌DNAポリメラーゼ
を含むDNAポリメラーゼ混合物は、dUTP若しくはdITPの
存在又は、鋳型鎖におけるdUMP若しくはdIMPの存在によ
って阻害される。したがって、dTTPとともに、若しくは
dTTPの代わりに、dUTPを使用すること、又はdGTPととも
に、若しくはdGTPの代わりに、dITPを使用することの多
くの利点は、本発明の酵素では、実現されるであろう
が、古細菌の熱安定性DNAポリメラーゼでは、実現され
ないであろう。例えば、「PCR Applications: Protocol
s for Functional Genomics」、1999, Innisら（編）、
アカデミックプレス社(Academic Press), San Diegoの
第4、5、142及び143頁参照。このように、既報の古細菌
のDNAポリメラーゼ、又は古細菌のDNAポリメラーゼを含
む混合物は、dUTP又はdITPを用いて、プライマー伸長反
応又はPCR増幅を行なうことはできないが、一つの態様
において、本発明の熱安定性又は熱活性DNAポリメラー
ゼは、これらのアナログを使用することに適合する。

【０１６１】５．本発明のDNAポリメラーゼの調製 Tma DNAポリメラーゼをコードする遺伝子が米国特許第
5,420,029号及び第5,466,591号に記載されている。Tma
DNAポリメラーゼ遺伝子の塩基配列、及び、コードされ
る全アミノ酸配列もそれらに記載されている。’029号
特許の実施例5は、pTma01（1990年11月7日に寄託され、
1998年5月22日にATCC番号98764として再寄託されたATCC
番号68471）、及びpTma04（1990年11月7日に寄託され、
1998年5月22日にATCC番号98765として再寄託されたATCC
番号68472）から始めて、全長Tma DNAポリメラーゼ遺伝
子を含むプラスミドpTma12-1及びpTma13などの種々のプ
ラスミドを構築することを記載する。これら発現ベクタ
ーのいずれもTma DNAポリメラーゼ遺伝子の供給源とし
て適する。

【０１６２】本発明のポリメラーゼを作製するために変
異させることができる、３’−５’エキソヌクレアーゼ
活性を有する他の熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼ
としては、限定されないが、米国特許第6,077,664号、
米国特許第6,015,668号、米国特許第6,001,645号、及び
米国特許第5,912,155号（サーモトガ・ネアポリティ
ナ）、米国特許第6,066,483号、米国特許第5,874,282
号、米国特許第5,834,253号、米国特許第5,747,298号、
米国特許第6,013,451号、米国特許第5,830,714号、米国
特許第5,882,904号、及び米国特許第5,602,011号（サー
モコッカス・バロッシ）、米国特許第5,322,785号及び
米国特許第5,210,036号（サーモコッカス・リトラリ
ス）、米国特許第5,948,663号及び米国特許第5,866,395
号；Dabrowskiら、1998, Protein Expr. Purif. 14:131
-38（パイロコッカス・フリオサス）に記載されている
ものが挙げられる。例えば、米国特許第5,834,285号
（パイロコッカスGB-D株）、及びDabrowskiら（1998）
（パイロコッカス・ヴェッセイ）を参照。

【０１６３】一つの側面において、本発明のDNAポリメ
ラーゼは、サーマス・スピーシーズのDNAポリメラーゼ
に由来する部分と、Tma DNAポリメラーゼに由来する部
分を含むキメラ酵素である。一つの態様において、本発
明のDNAポリメラーゼは、サーマス・スピーシーズのDNA
ポリメラーゼに由来する部分と、Tma DNAポリメラーゼ
に由来する部分からなるキメラ酵素である。前記キメラ
酵素は、キメラ遺伝子、すなわち、キメラ酵素をコード
し、サーマス・スピーシーズのDNAポリメラーゼ遺伝子
に由来する部分、及びTma DNAポリメラーゼ遺伝子に由
来する部分からなるDNAから調製される。キメラ遺伝子
は、下記に詳述するように、分子生物学分野において周
知の標準的遺伝子操作技術を用いて、サーマス・スピー
シーズのDNAポリメラーゼ遺伝子とTma DNAポリメラーゼ
遺伝子とから作製される。

【０１６４】DNAポリメラーゼ遺伝子の塩基配列、及び
それにコードされるアミノ酸配列など、いくつかのサー
マス・スピーシーズに由来するDNAポリメラーゼをコー
ドする遺伝子が記載されている。これらの遺伝子のいく
つかは、公開されているプラスミドから得ることができ
る。さらに別のサーマス・スピーシーズに由来する遺伝
子は、参照により本明細書に取り込まれる米国特許第5,
079,352号、第5,618,711号、第5,455,170号、第5,405,7
74号、及び第5,466,591号に記載されている方法を用い
て、宿主生物から得ることができる。

【０１６５】Taq DNAポリメラーゼをコードする遺伝子
は、米国特許第5,079,352号及び第5,466,591号に記載さ
れている。Taq DNAポリメラーゼ遺伝子の塩基配列及び
コードされる全アミノ酸配列は、それらの文献に記載さ
れる。米国特許5,079,352号の実施例V〜VIIには、プラ
スミドpFC83（1987年5月29日に寄託され、1998年5月22
日にATCC番号98763として再寄託されたATCC番号6742
2）、及びpFC85（1987年5月29日に寄託され、1998年5月
22日にATCC番号98762として再寄託されたATCC番号6742
1）から始めて、プラスミドpLSG1、pLSG2、pSYC1578、p
LSG5、pLSG6など、全長Taq DNAポリメラーゼ遺伝子を含
むさまざまな発現プラスミドを構築することについて記
載している。これらの発現ベクターのいずれもTaq DNA
ポリメラーゼ遺伝子の供給源として適する。

【０１６６】Tth DNAポリメラーゼをコードする遺伝
子、該遺伝子を取得する方法、及び該遺伝子を含む発現
プラスミドは、米国特許第5,618,711号及び第5,466,591
号に記載される。

【０１６７】TZ05 DNAポリメラーゼをコードする遺伝
子、該遺伝子を取得する方法、及び該遺伝子を含む発現
プラスミドは、米国特許第5,455,170号及び米国特許第
5,466,591号に記載される。

【０１６８】Tspsl7 DNAポリメラーゼをコードする遺伝
子、この遺伝子を取得する方法、及びこの遺伝子を含む
発現プラスミドは、米国特許第5,405,774号及び第5,46
6,591号に記載されている。

【０１６９】Tfl DNAポリメラーゼ遺伝子は、Akhmetzja
novら、1992、Nucleic Acids Reserch 20:5839に記載さ
れており、その全体が参照により本明細書に取り込まれ
る。

【０１７０】Tfl DNAポリメラーゼ遺伝子は、参照され
た特許文献に記載された方法を用いて、ATCC 43280から
回収されうる。1984, FEMS Microbiol. Lett. 22:149-5
3も参照のこと。

【０１７１】Tca DNAポリメラーゼ遺伝子は、Kwon, 199
7, Mol. Cells 7:264-71に記載されており、塩基配列は
EMBL/GenBankアクセッション番号U62584として入手する
ことができる。

【０１７２】さらに別のサーマス・スピーシーズのDNA
ポリメラーゼ遺伝子を、上記引用特許文献に記載されて
いる技術を用いて、以下のATCC寄託物から回収すること
ができる。ATCC43814及びATCC43815、Alfredsson, 198
6, Appl. Environ. Microbiol. 52:1313-16；ATCC2797
8、Ramley, 1970, J. Bacteriol. 114:556-62；同上、1
03:527-528；ATCC31674、米国特許第4,442,214号及び米
国特許第4,480,036号；ATCC 35948号〔T．ルバー（T. r
uber）、Loginova, 1984, Int. J. Syst. Bacteriol. 3
4:498-99〕から回収することができる。すべての参考文
献は、参照により本明細書に取り込まれる。

【０１７３】さらに別のサーマス・スピーシーズのDNA
ポリメラーゼ遺伝子を、上記引用特許文献に記載されて
いる技術を用いて、以下のドイツ微生物コレクション
（DSM）寄託物から回収することができる。DSM: 1279
(NUM: 2244)、Loginovaら、1975、Izv. Akad. Nauk SSS
R Ser. Biol.: 304-07参照；DSM: 579; DSM: 625 (NUM:
2248)、Degryseら、1978、Arch. Microbiol. 189:196参
照；DSM: 1279 (NUM: 3844)、Loginova, 1984, Int. J.
Syst. Bacteriol. :498-99参照；及びDSM: 625(NUM: 1
002)、Brockら、1969, J. Bacteriol.: 289-97参照から
回収することができる。すべての参考文献は、その全体
が参照により本明細書に取り込まれる。

【０１７４】記載されているその他のサーマス・スピー
シーズには、T．オーシマイ（T. oshimai）、Williams
ら、1996、Int. J. Syst. Bacteriol. 46:403-08参照；
T．シルバヌス（T. silvanus）及びT.クリアロフィルス
（T. chliarophilus）、Tenreiroら、1995、Int. J. Sy
st. Bacteriol. 45:633-39参照；T．スコトダクタス
（T. scotoductus）、Tenreiroら、1995、Res. Microbi
ol. 146:315-24参照；及びT．ルバー、Shandrinaら、19
82、Mikrobiologiia 51:611-15；これらはすべて、その
全体が参照により本明細書に取り込まれる。

【０１７５】当業者は、本明細書に提示された手引きに
従い、周知技術のみを用いて、DNAポリメラーゼ遺伝子
から、多様な宿主系のいずれかで、本発明のキメラDNA
ポリメラーゼを発現するのに適したキメラ遺伝子を含む
多数の発現ベクターを調製することが可能である。

【０１７６】一つの側面において、本発明のキメラ酵素
は、随伴する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が低下
するよう適切に変異させた、Z05 DNAポリメラーゼに由
来する1〜291番目のアミノ酸とTma DNAポリメラーゼに
由来する292〜893番目のアミノ酸を含む。一つの態様に
おいて、本発明のキメラ酵素は、３’−５’エキソヌク
レアーゼ活性が低下するよう適切に変異させた、Z05 DN
Aポリメラーゼに由来するアミノ酸番号1〜291とTma DNA
ポリメラーゼに由来するアミノ酸番号292〜893からな
る。これらの態様は、上記の寄託されたプラスミドから
取得するか、又は宿主生物から回収されるZ05 DNAポリ
メラーゼ遺伝子とTma DNAポリメラーゼ遺伝子とから直
接構築することができる。

【０１７７】遺伝子コードに重複があるため、一般的に
は、多数のDNA配列が所定のアミノ酸配列をコードし、
この意味で、それらは同等である。後述するように、発
現ベクターが挿入されるであろう宿主細胞の選択的なコ
ドン使用頻度に基づいて、発現ベクターで用いる同等な
DNA配列のいずれかを選択することが望ましい。本発明
は、このキメラ酵素をコードするDNA配列のすべてを包
含することを意図する。従って、本発明のキメラ遺伝子
は、野生型サーマス・スピーシーズ及びTma DNAポリメ
ラーゼ遺伝子に由来する配列のみを含むものに限定され
るものではなく、本発明のキメラDNAポリメラーゼをコ
ードするDNA配列のいかなるものも含むことができる。

【０１７８】本発明の酵素の製造は、組換発現クローン
を用いて実施することができる。組換発現クローンの構
築、発現クローンによる宿主細胞の形質転換、及び、発
現を促進する条件下での形質転換細胞の培養を、当該技
術分野において十分に理解されている分子生物学的技術
を用いて、さまざまな方法で実施することができる。こ
れらのステップのそれぞれに対する方法について、以下
に、一般的に記載し、実施例に、具体的には記載する。

【０１７９】発現ベクターにおいて、適切な制御配列と
作動可能に結合するようコード配列を配置させることに
よって、作動可能な発現クローンを構築する。このベク
ターは、宿主細胞の中で自律複製するように、又は宿主
細胞の染色体DNAの中に組み込まれるように設計されう
る。得られたクローンを用いて適切な宿主を形質転換
し、形質転換された宿主をコード配列の発現に適した条
件下で培養する。発現したタンパク質を培地又は細胞か
ら単離するが、場合によっては、タンパク質の回収及び
精製は必要でない場合もある。

【０１８０】コード配列と適切な制御配列とを含む適切
なクローンの構築には、当該技術分野において十分に理
解されている標準的なライゲーション技術と制限酵素技
術を使用する。一般的には、単離されたプラスミド、DN
A配列、又は合成されたオリゴヌクレオチドを所望の形
態で切断、修飾、及び再連結する。適切な制限酵素部位
は、普通に利用できない場合、発現クローンの構築を容
易にするように、コード配列の末端に付加されうる。

【０１８１】当該技術分野において一般的に理解されて
おり、市販されている制限酵素の製造業者が特定する条
件下において、適切な制限酵素（又は複数の酵素）で処
理して、部位特異的DNA切断を行なう。例えば、アマー
シャム社（Amersham、Arlington Heights、IL）、ロシ
ュ・モレキュラーバイオケミカルズ社（Roche Molecula
r Biochemicals、Indianapolis、IN）、及びニューイン
グランド・バイオラボズ社（New England Biolabs、Bev
erly、MA）の製品カタログを参照のこと。通常、約1μg
のプラスミド又は他のDNAを、約20μlの緩衝液中、1ユ
ニットの酵素で切断する；下記の実施例においては、一
般的に、過剰量の制限酵素を用いて、確実にDNAが完全
消化されるようにする。それぞれの酵素に最適な温度で
約1時間から2時間のインキュベートするのが一般的であ
る。各インキュベーション後、フェノール及びクロロホ
ルムで抽出してタンパク質を除去する；この抽出の後、
エーテル抽出を行ない、エタノール沈殿によって水性画
分からDNAを回収することができる。所望であれば、標
準的技術を用いたポリアクリルアミドゲル又はアガロー
スゲル電気泳動によって、切断した断片のサイズ分離を
行なうことができる。例えば、Maxamら、1980、Methods
in Enzymology 65:499-560を参照のこと。

【０１８２】一本鎖「突出」末端を有する制限酵素切断
DNA断片は、50mM Tris, pH 7.6, 50mM NaCl, 10mM MgCl
₂, 10mM DTT, 及び5〜10μM dNTPsの中、20℃〜25℃で
約15〜25分間のインキュベーション時間で、4種類のデ
オキシヌクレオシド三リン酸（dNTP）存在下大腸菌DNA
ポリメラーゼIのラージフラグメント（クレノウ）で処
理することによって、一本鎖「突出」末端を有する制限
酵素切断DNA断片を平滑末端（二本鎖末端）化されう
る。クレノウフラグメントは５’突出末端を充填（フィ
ルイン）するが、たとえ4種類のdNTPが存在していて
も、突出した３’側一本鎖は削り取る。所望により、1
種類以上の選択したdNTPを補充することによって、突出
末端の性質による限度内で選択的な修復を行なうことが
できる。クレノウで処理した後、前記混合物をフェノー
ル/クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させる。適
切な条件下でS1ヌクレアーゼによる処理は、核酸の一本
鎖部分で加水分解をもたらすため、S1ヌクレアーゼを用
いても同様の結果を得ることができる。

【０１８３】15〜30μlの容量中、以下の標準的条件及
び温度： 20mM Tris-Cl, pH 7.5, 10mM MgCl₂, 10mM DT
T, 33μg/ml BSA, 10〜50mM NaCl、並びに40μM ATP及
び（相補的一本鎖末端を有する断片のライゲーションに
ついて）0.01〜0.02〔ワイス（Weiss）〕ユニットのT4
DNAリガーゼで0℃か、又は（「平滑末端」ライゲーショ
ンについて）1mM ATP及び0.3〜0.6ユニットのT4 DNAリ
ガーゼで14℃で、ライゲーションを行なう。。相補末端
を有する断片の分子間ライゲーションは、通常、33〜10
0μg/ml全DNA濃度（5〜100nM全末端濃度）で行なわれ
る。分子間での平滑末端のライゲーションは、（通常、
任意に20〜30倍の過剰なリンカーのモル濃度を用いて）
1μM全末端濃度で行なう。

【０１８４】ベクター構築において、一般的に、ベクタ
ー断片を細菌又は子牛小腸のアルカリホスファターゼ
（BAP又はCIAP）で処理して５’リン酸を除去し、ベク
ターの再連結と再構築を防止する。BAP及びCIAPによる
消化条件は、当該技術分野において周知であり、発表さ
れたプロトコールは、市販のBAP酵素及びCIAP酵素に通
常添付される。核酸断片を回収するためには、調製物を
フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿
させて、ホスファターゼを除去しDNAを精製する。又
は、適切な制限酵素部位を利用することができれば、ラ
イゲーション前又は後に、制限酵素消化することによっ
て不必要なベクター断片の再連結を防止できる。

【０１８５】当該技術分野において公知の適切な方法を
用いて、プラスミド構築物のライゲーションを確認する
ことができる。以下に示す構築法においては、プラスミ
ド構築物の正しいライゲーションは、まず、大腸菌DG10
1株（ATCC47043）や大腸菌DG116株（ATCC53606）など、
適切な宿主をライゲーション混合物で形質転換して確認
する。当該技術分野において理解されているように、プ
ラスミド構築の形態に応じて、成功した形質転換体をア
ンピシリン、テトラサイクリン、又は他の抗生物質耐性
又は感受性によって選択するか、あるいは別のマーカー
を用いて選択する。そして、Clewellら、1969、Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 62:1159の方法に従って、形質転
換体から得られたプラスミドを調製し、その後、任意に
クロラムフェニコール増幅を行なう。Clewell, 1972,
J. Bacteriol. 110:67参照。又は、ベセスダ・リサーチ
ラボラトリーズ（Bethesda Research Laboratories）の
刊行物であるFocus 5(2)の第11頁の「Base-Acid」抽出
法を用いてプラスミドDNAを調製することができ、プロ
トコールのステップ12から17までを、DNAのCsCl/エチジ
ウムブロミド超遠心分離で置換することによって、非常
に純粋なプラスミドDNAを得ることができる。もう一つ
の代替法として、市販のプラスミドDNA分離キット、例
えば、HISPEED^TM、QIAFILTER^TM、及び登録商標QIAGEN、
プラスミドDNA分離キット〔キアゲン社（Qiagen）、Val
encia, CA〕などを、製造供給業者から配布されるプロ
トコールに従って使用することができる。単離したDNA
は、制限酵素消化によって解析、及び/又は、Sanger
ら、1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463のジデ
オキシ法によって、さらにMessingら、1981, Nuc. Acid
s Res.9:309に記載されたようにして、若しくは、Maxam
ら、1980, Methods in Enzymology 65:499の方法によっ
て配列決定する。

【０１８６】制御配列、発現ベクター、及び形質転換法
は、遺伝子を発現させるために使用する宿主細胞の種類
によって決まる。一般的には、原核生物、酵母、昆虫、
又は哺乳動物の細胞が宿主として使用される。原核生物
宿主は、一般的に、最も効率的であり、組換タンパク質
の生産にとって都合がよいため、タンパク質を発現させ
るのに好適である。

【０１８７】組換タンパク質を発現させるために最もよ
く使用される原核生物は大腸菌である。しかし、例えば
枯草菌（Bacillus subtilis）などの桿菌、シュードモ
ナス（Pseudomonas）属及びサルモネラ（Salmonella）
属のさまざまな種、及びその他の細菌株など、大腸菌の
他の微生物系統も、タンパク質の組換発現に使用するこ
とができる。このような原核生物系において、宿主、又
は宿主と和合性のある種に由来する複製部位と制御配列
とを含むプラスミドベクターが一般的に使用される。

【０１８８】ほとんどの細菌のプロモーターによる制御
下で構築物を発現させるために、大腸菌遺伝子保存セン
ター(E.coli Gnenetic Stock Center)からGCSC 6135と
して入手できる大腸菌K12系統MM294株を宿主として用い
ることができる。P_LN_RBS又はP_LT7_RBSの制御配列を有す
る発現ベクターには、大腸菌K12系統MC1000株ラムダ溶
原菌、N₇N₅₃cI857SusP₈₀、ATCC 39531などを使用するこ
とができる。1987年4月7日にATCCに寄託された大腸菌DG
116（ATCC53606）、及び1985年3月29日にATCCに寄託さ
れた大腸菌KB2（ATCC53075）も有用な宿主細胞である。
M13ファージ組換体には、大腸菌K12系統DG98（ATCC3976
8）など、ファージ感染に感受性の大腸菌系統が使用さ
れる。DG98株は、1984年7月13日にATCCに寄託された。

【０１８９】例えば、大腸菌は、一般的には、Bolivar
ら、1977、Gene 2:95によって記載さているpBR322誘導
体を用いて形質転換する。プラスミドpBR322は、アンピ
シリン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含
む。これらの薬剤耐性マーカーは、所望のベクターを構
築するときに残されうるか、破壊されうるため、所望の
組換体の存在を検出するのに有用である。広く使用され
ている原核生物の制御配列、すなわち、リボゾーム結合
部位とともに、任意にオペレーターを有する転写開始用
プロモーターとしては、β-ラクタマーゼ（ペニシリナ
ーゼ）及びラクトース（lac）プロモーター系（Chang
ら、1977、Nature 198:1056参照）、トリプトファン（t
rp）プロモーター系（Goeddelら、1980, Nuc. Acids Re
s. 8:4057参照）、及びラムダ由来P_Lプロモーター（Shi
matakeら、1981, Nature 292:128参照）、並びに遺伝子
Nリボゾーム結合部位（N_RBS）などが挙げられる。1987
年12月8日に発行された米国特許第4,711,845号には、移
動可能な調節システムカセットが記載されている。この
カセットは、N_RBSに作動可能に結合したP_Lプロモーター
であって、さらに、N_RBS配列の３’側6塩基対の中で切
断可能な少なくとも一つの制限酵素部位を有する第三の
DNA配列の上流に位置するものを含有する。また、1986
年10月8日に発行された欧州特許公開第196,864号におい
てChangらによって記載されたホスファターゼA（phoA）
システムも有用である。しかしながら、原核生物に和合
する任意の利用可能なプロモーター系では、本発明の発
現ベクターを構築するために使用することができる。

【０１９０】細菌以外に、酵母などの真核微生物も組換
宿主細胞として使用することができる。パン酵母である
サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevi
siae）の研究用菌株が最もよく使用されるが、それ以外
の菌株のいくつかも広く利用可能である。2-ミクロン
（two micron）複製開始点を利用するベクターが一般的
である（Broach, 1983, Meth. Enz. 101:307）が、酵母
での発現に適した他のプラスミドベクターが知られてい
る。例えば、Stinchcombら、1979, Nature 282:39；Tsc
hempeら、1980、Gene 10:157；及びClarkeら、1983, Me
th. Enz. 101:300を参照のこと。酵母ベクター用の制御
配列には、解糖系酵素を合成するためのプロモーターが
含まれる。Hessら、1968, J. Adv. Enzyme Reg. 7:14
9；Hollandら、1978, Biotechnology 17:4900；及びHol
landら、1981, J. Biol. Chem. 256:1385を参照。当該
技術分野において既知のさらに別のプロモーターには、
3-ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター（Hitzem
anら、1980、J. Biol. Chem. 255:2073）、並びにグリ
セルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナ
ーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクト
キナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホス
ホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオ
ースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラー
ゼ、及びグルコキナーゼなどの解糖系酵素に対するプロ
モーターなどがある。増殖条件によって調節される転写
というさらなる長所を有する他のプロモーターは、アル
コールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロームC、酸ホス
ファターゼ、窒素代謝に関係する分解酵素、及び、マル
トース及びガラクトースの利用に関係する酵素に対する
プロモーター領域である（Holland、前掲）。

【０１９１】また、ターミネーター配列は、コード配列
の３’末端に配置した場合、発現を促進するために使用
されうる。このようなターミネーターは、酵母に由来す
る遺伝子のコード配列の後ろにある３’側非翻訳領域に
見られる。酵母和合性プロモーターと、複製開始点と、
他の制御配列とを含むベクターは、酵母発現ベクターの
構築に使用するのに適する。

【０１９２】コード配列は、多細胞生物に由来する真核
宿主細胞培養液中で発現されうる。例えば、Cell & Tis
sue Culture: Laboratory Procedures、Wiley, Doyleら
編（1993）を参照のこと。有用な宿主細胞系としては、
COS-7、COS-A2、CV-1、マウスミエローマN51及びVEROな
どのマウス細胞、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵
巣（CHO）細胞などがある。このような細胞での発現ベ
クターとしては、通常、例えば、広く使用されているサ
ルウイルス40（SV40）由来の早期プロモーター及び後期
プロモーター（Fiersら、1978、Nature 273:113参
照）、又は、他のウイルスプロモーター、ポリオーマウ
イルス、アデノウイルス2、ウシパピローマウイルス（B
PV）、又はトリ肉腫ウイルスに由来するプロモーターな
ど、又は、免疫グロブリンプロモーター及びヒートショ
ックプロモーターなど、真核生物細胞に適合するプロモ
ーター及び制御配列が挙げられる。BPVベクター系を用
いた、哺乳動物系でDNAを発現させるためのシステムが
米国特許第4,419,446号に開示されている。このシステ
ムの改変については米国特許第4,601,978号に記載され
ている。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の一般的側面に
ついては、米国特許第4,399,216号でAxelによって説明
されている。「エンハンサー」領域も、発現を最適化す
るのに重要である；これらは、一般的に、プロモーター
領域の上流に見られる配列である。必要ならば、複製開
始点もウイルス供給源から得ることができる。しかし、
染色体への組み込みは、真核生物におけるDNA複製に共
通のメカニズムである。

【０１９３】植物細胞も宿主として使用することがで
き、ノパリン合成酵素のプロモーターやポリアデニル化
シグナル配列など、植物細胞に和合する制御配列（Depi
ckerら、1982、J. Mol. Appl. Gen. 1:561）も利用する
ことができる。バキュロウイルスベクターによって提供
される制御系を利用する、昆虫細胞を用いた発現系も説
明されている。プレナムパブリッシング社（Prenum Pub
lishing）刊、Stelowら編、Genetic Engineering(1986)
の第8巻、第277〜97頁、Millerら参照。昆虫細胞を利用
する発現は、スポドプテラ・フルギペイダ（Spodoptera
frugipeida）において行なわれる。これらのシステム
も組換酵素を産生する上で好都合である。

【０１９４】使用する宿主細胞に応じて、その細胞に適
した標準的技術を用いて形質転換を行なう。Cohen, 197
2, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110に記載されて
いる、塩化カルシウムを用いたカルシウム処理法が、原
核生物細胞又は実質的な細胞壁バリアーを含む他の細胞
に用いられる。アクロバクテリウム・チュメファシエン
スによるインフェクション(Shaw et al., 1983, Gene,
23:315を参照のこと)は、特定の植物細胞に用いられ
る。哺乳動物細胞には、Grahamら、1978, Virology 52:
546のリン酸カルシウム沈殿法が好適である。酵母への
形質転換は、Van Solingenら、1977, J. Bact. 130:94
6、及びHsiaoら、1979, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 7
6:3829の方法に従って行なう。

【０１９５】本発明の酵素をコードするDNAの配列を改
変して、コードされているタンパク質のアミノ酸配列を
変更することなく、例えば、宿主細胞のコドン使用頻度
により適合した配列を提供することが望ましいであろ
う。最初の5〜6コドンに対するこのような改変は、発現
効率を向上させるであろう。発現効率を向上させるため
に改変されているが、同一のアミノ酸配列をコードする
DNA配列は同等であると考えられ、本発明に包含され
る。

【０１９６】部位特異的プライマーに特異的なさまざま
な変異導入法が利用可能であり、当該技術分野において
周知である。例えば、参照により本明細書に取り込まれ
るSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manu
al、Cold Spring Harbor、1989、第2版、第15.51章、
「Oligonucleotide-mediated mutagenesis」を参照。ポ
リメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、部位特異的変異
導入を行なうことができる。当該技術分野において、現
在標準的な別の技術では、所望の変異をコードする合成
オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、pBSM
13+誘導体など、変異を生じさせるプライマーの伸長産
物を構築するための鋳型として使用される一本鎖ベクタ
ーに含まれる相補的核酸配列の合成を行なう。変異した
DNAを宿主細菌に形質転換し、形質転換された細菌の培
養物をプレーティングして同定する。改変されたベクタ
ーの同定法は、選択した形質転換体のDNAをニトロセル
ロースフィルター又は別の膜に転写すること、及び、抽
出物のハイブリダイゼーションが改変された配列に適合
させるが、本来の非変異ストランドとのハイブリダイゼ
ーションを生じさせない温度で、リン酸化された合成変
異原プライマーとハイブリダイズする「リフト（lift
s）」を含むことがある。次に、プローブとハイブリダ
イズするDNAを含む形質転換体を培養し（このDNAの配列
は、通常、配列解析によって確認される）、改変DNAの
貯蔵庫として利用する。

【０１９７】組換宿主細胞でタンパク質が発現される
と、タンパク質を精製することが望ましいであろう。さ
まざまな精製手順を使用して、本発明の組換型熱安定性
又は熱活性DNAポリメラーゼを精製することができる。
例としては、米国特許第4,889,818号、第5,352,600号、
及び第5,079,352号に記載されたTaq DNAポリメラーゼ精
製法、米国特許第5,618,711号及び第5,310,652号に記載
されたサーマス・サーモフィルス（Tth）由来のDNAポリ
メラーゼの精製法、米国特許第5.374,553号及び第5,42
0,029号に記載されたTma DNAポリメラーゼの精製法など
が挙げられる。これらのDNAポリメラーゼを精製する方
法は、米国特許第5,466,591号にも記載されている。上
記の特許文献のすべては、参照により本明細書に取り込
まれる。

【０１９８】本発明の一側面では、中温性細菌宿主細胞
である大腸菌においてDNAポリメラーゼの発現を行な
う。ほとんどの大腸菌宿主タンパク質は熱感受性である
ため、熱でクルードライゼートを不活性化することによ
って、実質的に組換型の熱安定性又は熱活性DNAポリメ
ラーゼを集積させることができる。このステップを十分
な量の塩（一般的には、0.2〜0.4M硫酸アンモニウム）
存在下で行なって、DNAポリメラーゼと他の細胞ライゼ
ート中のタンパク質とのイオン性相互作用を低下させ
る。一つの態様において、下記実施例3に記載された方
法を用いて、精製されたDNAポリメラーゼの活性をアッ
セイする。

【０１９９】長期安定性のため、精製DNAポリメラーゼ
酵素を、1種類以上の非イオン性ポリマー性界面活性剤
を含む緩衝液の中で保存すべきである。このような界面
活性剤は、通常、約100〜250,000、好ましくは約4,000
〜200,000ダルトンの分子量をもち、約3.5〜約9.5、好
ましくは、約4〜8.5のpHで酵素を安定化させるものであ
る。このような界面活性剤の例としては、その全体が参
照により本明細書に取り込まれるMcCutcheon Division
of MC Publising Co., 175 Rock Road, Glen Rock,NJ(U
SA)によって出版されたMcCutcheon’s「Emulsifiers &
Detergents」、北米版（1983）の第295〜298頁に具体的
に記載されているものが挙げられる。一つの態様におい
て、界面活性剤は、エトキシル化された脂肪族アルコー
ルエーテル及びラウリルエーテル、エトキシル化アルキ
ルフェノール、オクチルフェノキシ・ポリエトキシエタ
ノール化合物、修飾オキシエチル化及び/又はオキシプ
ロピル化直鎖アルコール、ポリエチレングリコール・モ
ノオレイン酸化合物、ポリソルベート化合物、及びフェ
ノール性脂肪属アルコールエーテルを含む群から選択さ
れる。別の態様において、界面活性剤は、ICIアメリカ
ンズ社（ICI AmericansInc.）, Wilmington, DE）のポ
リオキシエチル化（20）ソルビタンモノラウリル酸であ
るTween 20^TM、及び、BASFワイアンドット社（BASF Wya
ndotte Corp.,Parsippany, NJ）から発売されているエ
トキシル化アルキルフェノール（nonyl）である登録商
標Iconol^TM NP-40を含む群から選択される。

【０２００】６．本発明の熱安定性又は熱活性DNAポリ
メラーゼの使用本発明の熱安定性又は熱活性酵素は、弱化３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活性DNA
ポリメラーゼを必要又は所望される目的のために使用す
ることができる。一つの態様において、前記酵素は、PC
Rに使用される。PCRを用いた応用の例としては、例え
ば、ゲノムDNA又はcDNAからの直接的クローニング、DNA
のインビトロでの変異導入及び改造、法医学試料の遺伝
子フィンガープリンティング、感染性病原体の測定、遺
伝子疾患の出生前診断、アレル配列バリエーションの解
析、RNA転写物の構造解析、ゲノムフットプリンティン
グ、並びにゲノムDNA及びcDNAの直接塩基配列決定など
が挙げられる。例えば、その全体が参照により本明細書
に取り込まれるCurrent Protocols in Molecular Biolo
gy、2001、Ausubelら（編）、ジョン・ワイリー・アン
ド・サンズ社（JohnWiley & Sons）の第15章、及びPCR
Strategies、1995、Innisら（編）、アカデミックプレ
ス社（Academic Press, Inc.）を参照のこと。

【０２０１】７．キット本発明の熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、キッ
トを作製するのに適する。本発明の変異型DNAポリメラ
ーゼを含有したキットは、キットの組成に応じて、周知
技術によるDNA分子の検出用標識、DNAシークエンス、又
はDNA分子の増幅に用いられるであろう。このようなキ
ットは、密閉して収納するように隔離されたバイアル、
試験管などの1個以上の容器に入れて渡すよう区分化さ
れている運搬手段を含有してもよい。このような容器の
それぞれは、DNAシークエンス、DNA標識、又はDNA増幅
を行なうのに必要な成分又は成分混合物を含む。

【０２０２】DNAシークエンス用キットは、いくつかの
容器を含有してもよい。第一の容器は、例えば、本発明
の熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼの実質的に精製
された試料を含んでもよい。第二の容器には、DNA鋳型
に相補的なDNA分子を合成するのに必要な1種類以上のヌ
クレオチドを含んでもよい。第三の容器は、1種類以上
の種々のタイプのジデオキシヌクレオチド三リン酸を含
んでもよい。上記の容器の他に、1種類以上のDNAプライ
マーを含むさらに別の容器がキットに含まれているかも
しれない。

【０２０３】DNA増幅に用いるキットは、例えば、実質
的に純粋な本発明の変異型DNAポリメラーゼを含む第一
の容器と、単一の種類のヌクレオチド、又はヌクレオチ
ドの混合物を含む別の一つ以上の容器とを含有してもよ
い。DNA増幅用キットには、種々のプライマーを含んで
もよく、含まなくてもよい。

【０２０４】所望であれば、本発明のキットは、DNA分
子を合成又はシークエンスする際、使用してもよい検出
可能に標識したヌクレオチドを含む容器を含んでもよ
い。このようなヌクレオチドを検出するために多数の標
識のうちの一つを用いることができる。例示的な標識と
しては、限定されないが、放射性同位元素、蛍光標識、
化学発光標識、生物発光標識、及び酵素標識など、又
は、直接的又は間接的にヌクレオチド若しくは核酸を標
識するための他の標識が挙げられる。

【０２０５】

【実施例】下記実施例は、本発明を限定するものではな
く、実施例中のパーセンテージは、特段の記載がない限
り、固体については重量により、液体であれば容量によ
る。

【０２０６】実施例1：pCS6及びpCS5の変異導入本実施例では、熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼの
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインの部位特異的変
異導入について説明する。

【０２０７】第１ラウンドの変異導入では、部位特異的
変異導入アプローチを用いて熱安定性DNAポリメラーゼ
内の残基であって、クレノウフラグメントのプルーフリ
ーディングドメインの活性部位に二価金属カチオンを配
位させるのに重要なことが知られている相同的残基か、
相同的残基の間にある残基を変更した。その全体が参照
により本明細書に取り込まれるDerbyshireら、1995、Me
thods in Enzymology262:363-85を参照のこと。変異型
キメラ熱安定性DNAポリメラーゼCS6をコードするプラス
ミドpCS6を用いた。図5参照。CS6は、キメラ熱安定性DN
AポリメラーゼCS5の変異型である。図４参照。CS5のN-
末端部分は、サーマス・スピーシーズZ05に由来するDNA
ポリメラーゼのN-末端側291個の残基であって、５’−
３’エキソヌクレアーゼ活性をコードする部分である。
米国特許第6,228,628号参照。CS5の残部は、Tma DNAポ
リメラーゼに由来するC-末端側602残基であり、その
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とそのDNAポリメラ
ーゼ活性とを含有する。CS6は、３’−５’エキソヌク
レアーゼドメインにおいて、D323A及びE325A変異（別段
の記載がない限り、野生型Tma酵素の残基番号を終始に
使用する）を有する以外はCS5と同一である。本明細書
に示すように、これらの変異によって、CS6は検出可能
な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持たなくなっ
た。

【０２０８】323位と325位の酸性残基と324位のロイシ
ン残基を標的とした。同一の基本的方法を用いて、各変
異（後に説明するように、D323E変異以外の変異）を作
出した。表2に示すように、縮重オリゴヌクレオチドペ
アを合成した。各ペアの縮重オリゴヌクレオチドの一つ
は11重合体であり、もう一方は17マーであった。縮重し
たヌクレオチド以外に、11マーの各オリゴヌクレオチド
ペアは、17マーのペアの11ヌクレオチドのサブシークエ
ンスに完全に相補的であった。D323E変異では、表2に示
すように、相補オリゴヌクレオチドの非縮重ペアを設計
した。それらの縮重位置で互いに完全に相補的なオリゴ
ヌクレオチドがアニールして、表2に示すように、一方
の末端で３’-TA突出部に隣接し、他方の末端で５’-CT
AG突出部に近接する11マーのdsDNA鎖を形成させるよう
に、各ペアの縮重オリゴヌクレオチドをアニーリング条
件下で混合した。これらの末端は、それぞれ制限酵素Sg
fI及びSpeIによって作出された末端と適合する。したが
って、各アニーリング反応は、表2に示すような完全に
相補的でアニールしたオリゴヌクレオチドペアの混合物
を生成した。

【０２０９】次に、5μgのpCS6を、15ユニットの制限酵
素SpeIと、50mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、10mM NaCl、pH
7.5とを含有した25μlの反応液中、37℃で2.5時間消化
した。75℃で10分間加熱してこの酵素を不活性化し、つ
いで、室温まで冷却した。そして、15ユニットの制限酵
素SgfIを加えて、さらに37℃で2時間インキュベーショ
ンを続けた。さらに、反応液を25℃に一晩置いた。これ
らのステップでpCS6を直鎖状にし、323位と325位との2
個の酸性残基（pCS6で変異する残基）と324位のロイシ
ンを除去した。また、アニールした縮重プライマーのペ
アの末端に適合する末端も残った。

【０２１０】別の反応において、各0.5pmolのアニール
したオリゴヌクレオチドペアの混合物を、供給された緩
衝液の中で0.1pmolの直鎖化pCS6、及び0.5ユニットのT4
DNAリガーゼ〔アマーシャム・ファルマシアバイオテッ
クAB社（Amersham PharmaciaBiotech AB）, Uppsala, S
weden）〕と混合し、4℃で一晩インキュベートした。

【０２１１】次に、各ライゲーション混合物1μl（20n
g）を用い、GENE PULSER^TM（ジーンパルサー）エレクト
ロポレーター〔バイオラッド社（Bio-Rad）, Hercules
CA〕を本質的に製造業者の指示どおりに用いて大腸菌DG
116株を形質転換した。電気穿孔された細胞を1mlのSOC
培地で希釈し、30℃で1時間攪拌させながらインキュベ
ートした。形質転換細胞を選抜するために、100μg/ml
のアンピシリンを添加したLBプレート上で、再懸濁した
細胞の50又は100μlの等量液を培養し、一晩インキュベ
ートした。

【０２１２】形質転換毎に、5個のコロニーを選んでPCR
増幅と制限解析とを行ない、もしあれば、それらが、ど
の変異型pCS6プラスミドを含むかを判定した。各コロニ
ーを、PCR緩衝液II〔PE-アプライドバイオシステムズ社
（PE-Applied BioSystems）,Redwood City, CA〕、40μ
MのdNTP混合物と各20pmolのプライマーCS4及びCS1Aとを
含む50μlのマスター混合物に懸濁した。

【０２１３】 CS1A: GTATGTAGTACGCTTCCTTTGGTTTGAA (配列番号：35) CS4: TGGCTTTGGGAGAAGTACGGCCT (配列番号：36)

【０２１４】各コロニーの増幅DNAが合成オリゴヌクレ
オチドを正確に取り込んでいるか、また、取り込んでい
るとすればどの変異配列を取り込んでいるかを判定する
ために、表3に示すように、判断のための一連の制限酵
素で各コロニーの増幅DNAを消化した。ついで、正しい
制限酵素部位のパターンを有するクローンについて、挿
入断片の領域をシークエンスして、さらに使用するため
に選択した各プラスミドが、所望の変異のみを取り込ん
でいることを確認した。

【０２１５】

【表２】

【０２１６】

【表３】

【０２１７】第二ラウンドの変異導入においては、PCR
を利用した部位特異的変異導入法を用いて、３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性の基質の結合に寄与することが
知られているか、寄与すると推定されている残基を標的
とした。表4に示すように、変異導入毎にプライマーの
ペアを設計した。各プライマーペアによって、pCS5のポ
リメラーゼをコードする遺伝子の部分の増幅が可能にな
った。一つのプライマーペアだけをL329A変異のために
使用した。前記変異では、前記ペアの一方のプライマー
がアンプリコンに変異を導入し、両方のプライマーも、
その末端に制限酵素部位を含み、同じ酵素で切断された
pCS5にサブクロニーングでき、L329A変異を有するZ05-T
maハイブリッドDNAポリメラーゼをコードする発現プラ
スミドが生成する。第二ラウンドの変異導入において、
残りの変異のそれぞれを、二組のプライマーペアを用い
て創出した。それぞれの変異について、各ペアの一つの
プライマーが所望の変異を含むが、他の点では、pCS5に
相補的あった。各ペアの他方のプライマーは、pCS5の部
分に完全に相補的であった。pCS5を鋳型として用いたPC
Rを各プライマーペア毎に別々に行なった。これらの反
応は、約35ヌクレオチドがオーバーラップするアンプリ
コンを生じた。このアンプリコンのオーバーラップ部分
は所望の変異を含んだ。次に、二種類の部分的に重複す
るアンプリコンを混合し、各ペアの隣接配列プライマー
（すなわち、変異配列を含有し、それぞれペアからの各
増幅プライマー）を使用して、もう一度PCR増幅を行な
った。この反応は、初期のPCRで生成した二種類の部分
的に重複するアンプリコンからなる一つの大きなアンプ
リコンを生じた。隣接配列プライマーは、クローニング
に有利な制限酵素部位を有するポリメラーゼをコードす
る遺伝子の部分に相補的であるよう設計された。つい
で、それらの制限酵素でアンプリコンとpCS5とを消化
し、混合し、ライゲーションして、所望の変異を含む発
現プラスミドを作製した。ライゲーション産物を用い
て、上記したようにして大腸菌を形質転換した。変異導
入が成功したことを、表5に列挙した制限酵素部位を上
記したように用いて確認した。

【０２１８】

【表４】

【０２１９】

【表５】

【０２２０】実施例２：変異型熱安定性DNAポリメラー
ゼの製造及び精製前記ライゲーション反応から得られたプラスミドは、λ
P_Lプロモーターの制御下にポリメラーゼ遺伝子を含む。
cI857（熱不安定性）λリプレッサーを含む宿主細胞（D
G116、ATCC53606）をプラスミドで形質転換した。野生
型又は変異させたポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミド
で形質転換されたDG116細胞を用いて、アンピシリン（1
00μg/ml）を含有した10mlの標準的フラスコ培地（SFM;
グルコース、ビタミンB₁、カザミノ酸、及び最少培地
を含む）に植菌し、30℃、250rpmで生育させた。一晩培
養した液のうち5mlを用いて450mlのSFM+アンピシリンに
植菌し、培養液のOD₆₀₀が0.6〜0.8になるまで30℃、250
rpmで振とうした。ついで、培養液を37℃に移して、250
rpmで一晩生育させて、温度誘導によるポリメラーゼ発
現を行なった。例えば、米国特許第5,079,352号、第5,4
20,029号、及び第5,618,711号を参照。一晩培養したも
のを3,000×gで15分間沈殿させた。

【０２２１】ペレットを、30mlの溶解用緩衝液（50mM T
ris-HCl, pH 7.5, 10mM EDTA, 1mMDTT, 1mM Pefabloc,
1μg/mlロイペプチン, 0.2mM TLCK）に再懸濁し、細胞
をフレンチプレスによって16,000 psiで溶解させた。こ
の溶解細胞懸濁液を0.2M (NH ₄)₂SO₄に入れ、75℃で15分
間加熱して、大腸菌の宿主タンパク質を不活性化し変性
させた。加熱した抽出物を0℃で15分間冷却し、0.6％ポ
リエチレンアミンになるよう調整して、宿主DNAを沈殿
させ、6,000×gで30分間遠心分離した。清澄になった抽
出物を、50mM Tris-HCl、pH7.5、10mM EDTA、1mM DTT、
0.2M (NH₄)₂SO₄、で事前に平衡させておいた2mlのフェ
ニル-セファロースカラムに負荷した。前記カラムを6ml
の平衡化用緩衝液で洗浄し、2mlの50mM Tris-HCl、pH7.
5、10mM EDTA、1mM DTTで洗浄し、最後に2mlの50mM Tri
s-HCl、pH7.5、10mM EDTA、1mM DTT、20％エチレングリ
コールで洗浄した。このタンパク質を50mM Tris-HCl、p
H7.5、10mM EDTA、1mM DTT、2.5M尿素で溶出した。溶出
液を100mM KClになるよう調整し、25mM Tris-HCl、pH7.
5、1mM EDTA、1mM DTT、100mM KClで事前に平衡化させ
ておいた2mlのヘパリン−セファロースカラムに負荷し
た。このカラムを6mlの平衡化用緩衝液で洗浄してか
ら、6mlの25mM Tris-HCl、pH 7.5、1mM EDTA、1mMDTT、
400mM KClで溶出させた。透析と希釈とによって最終溶
出物を20mM Tris-HCl、pH8.0、0.1mM EDTA、100mM KC
l、1mM DTT、0.2％ TWEEN 20、50％ v/vグリセロールに
なるように、調整し、−20℃で保存した。

【０２２２】実施例3：３’−５’エキソヌクレアーゼ
活性の標準アッセイ下記実施例は、熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼの
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を測定するための標
準アッセイと、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性のユ
ニットの定義を提供する。

【０２２３】CS5の変異型派生体の３’−５’エキソヌ
クレアーゼ活性を比較するために、カルボキシフルオレ
セイン（FAM）-標識した一本鎖オリゴヌクレオチド基質
NJS40の分解を測定した。

【０２２４】 NJS40: FAM GCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCAC (配列番号：80)

【０２２５】標準アッセイ（40μl）は、50mMトリシ
ン、pH8.3、25mM KOAc、5％ w/v DMSO、0.5mM Mn(OAc)₂
及び酵素保存緩衝液から5％ (v/v)の寄与(contribution
s)（反応液中：1mM Tris、pH8.0、5mM KCl、0.005mM ED
TA、0.025％ TWEEN-20、0.05mMDTT、2.5％グリセロー
ル）の中、4pmol（100nM）のFAM−標識一本鎖NJS40オリ
ゴヌクレオチドを含んだ。NJS40とMn(OAc)₂との添加に
より反応を開始させ、63℃で15分間インキュベートし
た。40μlの50mM EDTAを加えて反応を停止させた。酵素
濃度と反応時間を、線形性が達成されるよう調整した。
反応は、0.5〜10ミリユニットの酵素に対応して、最初
のオリゴヌクレオチドの短い産物への変換率が約1〜20
％にわたる範囲で直線状になる；酵素濃度は、基質濃度
よりも常に低くなった。停止反応溶液をホルムアミドで
0.1 nMオリゴヌクレオチドになるよう希釈し、キャピラ
リー電気泳動〔ABI 3100、アプライドバイオシステムズ
社（Applied Biosystems）、Foster City CA〕によって
解析した。GENESCAN^TM（ジーンスキャン）ソフトウエア
〔アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystem
s）、Foster City CA〕を用いて、出発サイズと分解さ
れたオリゴヌクレオチドのピークの高さを測定した。短
いオリゴヌクレオチド産物に変換されたオリゴヌクレオ
チドのpmol量は、｛1-（15分後に残っているP_nの相対量）｝×（反応開始
時におけるP_nのpmol）〔式中、P_nは、最初の長さnの基質オリゴヌクレオチド
（NJS40）である〕に等しい。15分後に残存するP_nの相
対量は、最初のサイズのオリゴヌクレオチドに対応する
ピークの高さを測定し、それを、すべてのピークの高さ
を合計したもので割ることにより決定した。そのため、
このアッセイは、オリゴヌクレオチドNJS40から３’末
端ヌクレオチドを解離させる速度を測定する。1ユニッ
トの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、標準アッセ
イ条件下で15分間に50pmolの一本鎖NJS40オリゴヌクレ
オチドを短い長さのオリゴヌクレオチドに変化するのを
触媒する。

【０２２６】上記したようにして作製された変異型ポリ
メラーゼの特徴について、標準アッセイを用いて調べ
た。これらのアッセイの結果を表6の「ssDNA」と表示さ
れた欄に示す。

【０２２７】米国特許第4,889,818号に記載されている
アッセイ法を用いて、各変異型酵素のポリメラーゼ活性
を測定した。すなわち、保存用緩衝液（20mM Tris, 100
mM KCl, 0.1mM EDTA, 0.5％ TWEEN-20,1mM DTT, 50％
グリセロール）での酵素保存液のある量を酵素希釈液
（25mM Tris-HCl, pH8.0, 50mM KCl, 1mM β-メルカプ
トエタノール、0.5％ TWEEN-20, 0.5％ NP40, 100μg/m
lゼラチン）で希釈して、各アッセイ当たり約0.02から
0.1ユニットのポリメラーゼ活性が得られた。5mlの希釈
した酵素液を45μlの反応緩衝液（25mM TAPS, pH 9,4,
50mM KCl, 2mM MgCl₂, 1mM β-メルカプトエタノール、
200μM d(GTA)TP, 100μM α-³³P-dCTP, 30μgの活性化
サケ精子DNA（「活性化」DNAとは、DNAの5％が酸可溶性
画分に移行するまでDNase Iで部分加水分解した後の天
然型DNA調製物である）に加えた。反応液を74℃で10分
間インキュベートし、ついで、10μlの60mM EDTAで停止
させた。50μg/mlのキャリアDNA（21ゲージの注射針に
通して剪断したサケ精子DNA）を含む2mM EDTA, pH8.0
1mlを含む試験管に、各停止反応液から50μlを添加し
た。1mlの20％トリクロロ酢酸（TCA）と2％ピロリン酸
ナトリウムとを添加し、ボルテックス攪拌器（vortex a
gitator）を用いて試験管をゆっくりと攪拌させた。前
記試験管を10〜20分間氷上でインキュベートし、DNAを
完全に沈殿させた。沈殿DNAを、真空濾過用マニホール
ド上のGF/Cフィルター上に集めた。このフィルターを、
5％ TCA, 1％ピロリン酸ナトリウムで、次に20％ TCA
で、最後に95％エタノールで3回洗浄した。機器のバッ
クグランドを測定するために2枚のブランクフィルター
を同じように処理した。登録商標OMNIFLUOR〔パッカー
ドバイオサイエンスB.V.社（Packard BioScience B.
V.）, Groningen, The Netherlands〕とLS6000IC^TMシン
チレーションカウンター（カリフォルニア州フラートン
（Fullerton CA）にあるベックマン・コールター社（Be
ckman Coulter））を用いて、沈殿したDNAに取り込まれ
た放射活性を定量した。1ユニットのポリメラーゼ活性
は、上記に示されたアッセイ条件を用いて、全部で10 n
moleのdNMPがTCA沈殿させたDNA産物に30分間で取り込ま
れるのに必要な酵素量と定義される。

【０２２８】実施例4：３’−５’エキソヌクレアーゼ
活性を測定するための変形アッセイ標準アッセイの2つの変法を用いても、上記した変異型
熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼの３’−５’エキ
ソヌクレアーゼ活性の特徴を調べた。これらの変形アッ
セイは、それぞれが異なった基質を使用する以外は、標
準アッセイと同一であった。標準アッセイの場合と同じ
ように、各変形アッセイにおいても、オリゴヌクレオチ
ドNJS40からの３’末端ヌクレオチドの解離速度を測定
した。しかしながら、変形アッセイでは、NJS40を相補
的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。第一変
形アッセイでは、完全に一致する二本鎖DNA基質:

【０２２９】

【０２３０】が用いられた。

【０２３１】第一変形アッセイを用いた上記変異型に関
する結果を表6の「dsDNA」と表示された欄に示す。

【０２３２】第二変形アッセイでは、ミスマッチを含む
二本鎖DNA基質：

【０２３３】

【０２３４】が用いられた。

【０２３５】第二変形アッセイを用いた上記変異型に関
する結果を表6の「ミスマッチを有するdsDNA」と表示さ
れた欄に示す。

【０２３６】

【表６】

【０２３７】実施例5：変異型熱安定性又は熱活性DNAポ
リメラーゼ及び変異型大腸菌DNAポリメラーゼの３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性の比較本実施例は、変異型熱安定性又は熱活性DNAポリメラー
ゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を類似したEco
DNA Pol I変異型ポリメラーゼの酵素的性質からは予測
できないことを示す。表7は、第二ラウンドのポリメラ
ーゼ変異体とそれに類似した大腸菌Pol変異体の３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性との比較を示す。

【０２３８】

【表７】

【０２３９】表7に示した結果は、Eco DNAポリメラーゼ
とCS5 DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインにおける類似変異が、野生型酵素活性に較べ
ると、しばしば酵素のプルーフリーディング活性に対し
て異なる影響を有することを示す。Eco Q419A変異体とC
S5 Q384A変異体との比較は、これら2種類の酵素におけ
る類似変異が、これらの３’−５’エキソヌクレアーゼ
活性に同じように影響することが分かる。しかし、いく
つかの類似変異体では、酵素活性に大きな違いが見られ
る。いくつかの変異体ペアにおいて、この違いは、単に
量的なものである。例えば、Eco Y497A変異体は、ssDNA
とdsDNAの両基質に対し,CS5 Y464A変異体よりも実質的
に高い残存酵素活性を有する。他の類似変異体は、さら
に質的な違いを示す。例えば、Eco L361A及びD424E変異
体はともに、dsDNA基質よりもssDNA基質に対して、より
強い活性を示す。しかし、類似CS5変異体（それぞれL32
9A及びD389E）は、ssDNA及びdsDNAの両基質に対して同
じような残存酵素活性を有する。

【０２４０】実施例6：弱化３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性を有する変異型熱安定性DNAポリメラーゼのPCR
への利用 HIV薬剤耐性アッセイを用いて、変異型酵素Y464A、D389
E、L329A、Q484A/N385A、Q384A、N385A、及びL324Qにつ
いて、逆転写酵素/PCR活性を調べた。120ユニットのCS6
（検出可能な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもた
ない）と5ユニットのCS5（野生型３’−５’エキソヌク
レアーゼ活性を有する）との混合物を対照として使用し
た。1.7 kb HIVアッセイ条件〔50mM Tricine, pH8.3, 4
5mM KOAc, pH7.5, 0.9mM Mn(OAc)₂，5％ DMSO, 0.2mM d
(AGC)TP, 0.3mM dUTP, 0.03mMdTTP, 0.2×SYBR Green
I, G46E CS5/CS6酵素混合物（5/125ユニット）、又は各
変異型酵素の60若しくは30ユニットのポリメラーゼ活
性、1ユニットのUNG、及び各々0.4M(-1)2’-アミノ修飾
プライマー（RN326とRN328）、及び動力学的サーモサイ
クリング、Myersら、2000、抗ウイルス治療（Antiviral
Therapy） 5: 要約49を参照）を用いて、特異的かつ感
度よくプロテアーゼ遺伝子とHIVの逆転写酵素遺伝子の
最初の400コドンとを増幅した。

【０２４１】 RN326: GAGGGGTATTGACAAACTCCCACTCAGGAATCXA (X=2'アミノdC) (配列番号：83) RN328: GGGAATTTTCTTCAGAGCAGACCAGAGCCAAXA (X=2'アミノdC) (配列番号：84)

【０２４２】GENEAMP^TM（ジーンアンプ）5700SDSサーモ
サイクラー〔PEバイオシステムズ社（PE Biosystem
s）、Foster City CA〕を下記サーモサイクリングプロ
トコール：50℃で2分間、60℃で60分間及び95℃で1分間
の後、95℃で20秒間と、58℃で15秒間と、65℃で1分45
秒間とを４サイクル、その後90℃で20秒間と、58℃で15
秒間と、65℃で1分45秒間とを３６サイクル、その後65
℃で10分間保温、で用いた。PCR増幅の増加曲線を図9に
示す。同じプロトコールを用イ、さまざまな量の酵素に
よる増幅を行ない、ゲル電気泳動を用いて解析した。PC
Rを行なった後、各100μlの反応液から5μlを1％アガロ
ースゲルに負荷し、本質的には、Sambrookら、Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbo
r、1989、第2版に記載されるように泳動した。エチジウ
ムブロマイドの1μg/ml溶液を用いてゲルを染色した。
得られたゲルを図10に示す。図10において、レーン20、
40、及び48=分子量マーカーであるBstII消化したラムダ
DNA〔ニューイングランド・バイオラボズ社（New Engla
nd Biolabs）、Beverly, MA〕；レーン36〜38及び58〜6
0=陰性対照（5 UのCS5, 125UのCS6、鋳型なし）；レー
ン33〜35及び55〜57=陽性対照（5 UのCS5, 125UのCS
6）；レーン1〜3=60 UのY464A CS5；レーン4〜6=30UのY
464A CS5；レーン7〜9=60 UのD389E CS5；レーン10〜12
=30 UのD389E CS5；レーン13〜15=60 UのL329A CS5；レ
ーン16〜18=30 UのL329A CS5；レーン21〜23=60 UのQ38
4A-N385A CS5；レーン24〜26=30 UのQ384A-N385A CS5；
レーン27〜29=60 UのQ384A CS5；レーン30〜32=30 UのQ
384A CS5；レーン41〜43=60 UのN385A CS5；レーン44〜
46=30 UのN385A CS5；レーン49〜51=60 UのL324Q CS5；
レーン52〜54=30 UのL329Q CS5（ここで、すべてのユニ
ット数はDNAポリメラーゼ活性を表す）。

【０２４３】変異型酵素を、それらのC_T値（図9）と、
それらの特異的及び非特異的増幅産物の収率とによって
判断し、増幅産物のゲル解析を用いて検出した（図1
0）。これらの結果は、（実施例3に記載した標準アッセ
イを用いて測定すると）野生型レベルの3％よりも高い
が20％未満のプルーフリーディング活性を有する変異体
が、1.7kbのHIV RNA鋳型の逆転写によるPCR増幅でうま
く機能することを実証する。また、これらの変異体は、
0.4〜1.6U/pmolの比活性をもち、また、実施例3に記載
されたようにして酵素活性を測定すると、３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性に対するポリメラーゼ活性の比率
が6.0U pol/U exoよりも大きいが、25.0Upol/U exoより
も低く、得られたPCRの結果は、CS5とCS6との混合物で
得られた結果に匹敵するものであった。Q384A CS5とN38
5A CS5も、それらの増幅産物をゲル解析したところうま
く機能したが、それらのC_T値によって判断した場合には
同じようではなかった。

【０２４４】実施例7：熱安定性又は熱活性ファミリーA
DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性
を弱化するための部位特異的変異導入を行なうための標
的残基の同定本実施例は、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
有する変異体を同定するために変異・試験することので
きる熱安定性又は熱活性ファミリーA DNAポリメラーゼ
における残基を同定する方法を提供する。

【０２４５】XSAEプログラム（Higginsら、1992，Cabio
s 8, 189-91参照）の「3D>配列接触（3D>sequence cont
acts）」特性を用いて、３’−５’エキソヌクレアーゼ
部分においてDNAと複合した大腸菌Pol IのX線構造（Bra
utiganら、1998、J. Mol. Biol. 277: 363-77参照）を
解析して、DNA基質（1kfs.pdb, B鎖）の5A内にある選択
したタンパク質（Pol I; 1kfs.pdb, A鎖）の残基すべて
を同定した。この方法を用いて、表8中の残基を大腸菌P
ol Iにおいて同定した。ポリメラーゼの配列アラインメ
ントを調べることによって（例えば、図8に示すように
して）、熱安定性又は熱活性ファミリーA DNAポリメラ
ーゼにおける類似残基を同定することができる。次に、
これらの候補残基を変異させてから、例えば、実施例3
に記載された標準アッセイを用いて、弱化３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性を調べることができる。

【０２４６】

【表８】

【０２４７】実施例8：弱化３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性を有するファミリーB DNAポリメラーゼの変異
体の同定本明細書に開示されているように、当業者は、本開示内
容に従って、例えば、本明細書に記載されているTma DN
Aポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメイ
ンの変異に対応する３’−５’エキソヌクレアーゼドメ
インにおける変異を作出することによって、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有するファミリーAのDNA
ポリメラーゼの変異体を容易に作製することができる。
Tma DNAポリメラーゼとファミリーBのDNAポリメラーゼ
の３’−５’エキソヌクレアーゼドメインの間に有意な
配列類似性のある唯一の領域は「DXE」金属結合モチー
フであるため、弱化プルーフリーディング活性を有する
ファミリーBのDNAポリメラーゼの変異体を設計するため
のかかる配列を利用したアプローチには限られた利用法
しかない。しかし、X線結晶研究によって、ファミリーA
ポリメラーゼ及びファミリーBポリメラーゼの３’−
５’エキソヌクレアーゼドメインが同じような三次元構
造を有することが示されている。Zhaoら、1999，Struct
ure Fold Des.7:1189-99, Karamら、2000，Prog, Nucle
ic Acid Res. Mol. Biol. 64:65-96, Hopfnerら、199
9、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3600-5, Wangら、1
997、Cell89:1087-99を参照。このため、弱化校正作用
を有するファミリーB DNAポリメラーゼを作出するため
に変異させることのできる残基を同定するための構造利
用法が開発された。

【０２４８】図11は、ファミリーB DNAポリメラーゼで
ある大腸菌のPol II DNAポリメラーゼを、多くの別のフ
ァミリーB DNAポリメラーゼとアラインメントした図で
ある。これらのタンパク質の全部又は殆ど全部で保存さ
れる残基を、それらの保存がプルーフリーディング機能
にとって重要であることを示すという仮定に基づいて単
純に同定するのではなく、むしろバクテリオファージRB
69（Shamooら、1999、Cell 99:155-66; 構造はプロテイ
ンデータバンク（Bermanら、2000、Nucleic Acids Res.
28:235-42; www.pdb.org/）からPDB識別番号1CLQとし
て利用可能である）から単離したファミリーB DNAポリ
メラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメインの三
次元構造を調べて、Tmaのプルーフリーディングドメイ
ンと比較した。これらのタンパク質のそれぞれにおい
て、プルーフリーディングドメインに結合した一本鎖DN
A配列の３’末端ヌクレオチドと接触すると推定された
残基のすべてを同定した。この情報と、図11の配列アラ
インメントとを用いて、下記の表9に示すように他のフ
ァミリーB DNAポリメラーゼにおける類似残基を同定し
た。これらのデータは、これら特定の位置における変異
が、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するDN
Aポリメラーゼ分子をもたらすことを示す。

【０２４９】

【表９】

【０２５０】前記実施例は、予測的なものも実際的なも
のも、例示のために提示されたものにすぎず、いかなる
点においても、本願発明の範囲を制限するものではな
い。

【０２５１】本明細書において、引用された全ての文献
は、それらの全体が参照により本明細書に取り込まれ
る。

【０２５２】

【発明の効果】本発明の弱化３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性を有する熱安定性または熱活性DNAポリメラー
ゼ、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する修
飾熱安定性または熱活性DNAポリメラーゼ、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラ熱安定性ま
たは熱活性DNAポリメラーゼ等によれば、ＰＣＲ等に用
いた場合、高い忠実度で、高い複製効率で、迅速かつ経
済的に核酸合成を行なうことができるというすぐれた効
果を奏する。

【０２５３】

【配列表】_{SEQUENCE LISTING} _{<110> Schoenbrunner, Nancy} _{Myers, Thomas} _{Gelfand, David} _{<120> THERMOSTABLE OR THERMOACTIVE DNA POLYMERASE MOLECULES} _{WITH ATTENUATED 3'-5' EXONUCLEASE ACTIVITY} _<130> _ROC-03-005 _{<150> US 60/369,815} _{<151> 2002-04-02} _{<160> 203} _{<170> PatentIn version 3.2} _{<210> 1} _{<211> 10} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of EXO II motif} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (1)..(2)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (3)..(3)} _{<223> Xaa is Cys or Leu} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (4)..(4)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(5)} _{<223> Xaa is Phe or Tyr} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (6)..(8)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (9)..(9)} _{<223> Xaa is Ile or Val} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (10)..(10)} _{<223> Xaa is Leu or Phe} _{<400> 1} _{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa} _{1 5 10} _{<210> 2} _{<211> 11} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease EXOIIa motif} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (2)..(2)} _{<223> Xaa is Pro, Ala, Leu, or Thr} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (3)..(3)} _{<223> Xaa is Leu or Met} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (4)..(4)} _{<223> Xaa is Leu or Ile} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(5)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (6)..(6)} _{<223> Xaa is Ala or Ser} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (8)..(8)} _{<223> Xaa is Leu, Ile, or Val} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (9)..(9)} _{<223> Xaa is Leu or Trp} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (10)..(10)} _{<223> Xaa is Asp, Asn, Glu, or Gln} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (11)..(11)} _{<223> Xaa is Pro, or Ser} _{<400> 2} _{Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa} _{1 5 10} _{<210> 3} _{<211> 13} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease EXO III motif} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (1)..(1)} _{<223> Xaa is Pro, or Ala} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (2)..(2)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (3)..(3)} _{<223> Xaa is Glu, Asp, or Pro} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (4)..(4)} _{<223> Xaa is Lys, Arg, or Glu} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(6)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (7)..(7)} _{<223> Xaa is Glu, Arg, or Asp} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (8)..(8)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (9)..(9)} _{<223> Xaa is Ser, Ala, or Cys} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (10)..(10)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (11)..(11)} _{<223> Xaa is Glu or Thr} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (12)..(12)} _{<223> Xaa is any amino acid} _{<400> 3} _{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala} _{1 5 10} _{<210> 4} _{<211> 7} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (2)..(2)} _{<223> Xaa is any amino acid or no amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(5)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (7)..(7)} _{<223> Xaa is any amino acid} _{<400> 4} _{Asp Xaa Glu Thr Xaa Ser Xaa} _{1 5} _{<210> 5} _{<211> 7} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (2)..(2)} _{<223> Xaa is any amino acid or no amino acid} _{<400> 5} _{Asp Xaa Glu Thr Thr Ser Leu} _{1 5} _{<210> 6} _{<211> 7} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (2)..(2)} _{<223> Xaa is any amino acid or no amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(5)} _{<223> Xaa is any amino acid} _{<400> 6} _{Asp Xaa Glu Thr Xaa Ser Leu} _{1 5} _{<210> 7} _{<211> 7} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (2)..(2)} _{<223> Xaa is any amino acid or no amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (4)..(5)} _{<223> Xaa is any amino acid} _{<400> 7} _{Asp Xaa Glu Xaa Xaa Ser Leu} _{1 5} _{<210> 8} _{<211> 7} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (2)..(2)} _{<223> Xaa is any amino acid or no amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (4)..(4)} _{<223> Xaa is any amino acid} _{<400> 8} _{Asp Xaa Glu Xaa Thr Ser Leu} _{1 5} _{<210> 9} _{<211> 7} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _{<400> 9} _{Asp Leu Glu Thr Ser Ser Leu} _{1 5} _{<210> 10} _{<211> 10} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (1)..(2)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (3)..(3)} _{<223> Xaa is Cys or Leu} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(5)} _{<223> Xaa is Phe or Tyr} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (6)..(8)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (9)..(9)} _{<223> Xaa is Ile or Val} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (10)..(10)} _{<223> Xaa is Leu or Phe} _{<400> 10} _{Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa} _{1 5 10} _{<210> 11} _{<211> 10} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (1)..(1)} _{<223> Xaa is any uncharged polar residue} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (2)..(2)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (3)..(3)} _{<223> Xaa is Cys or Leu} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(5)} _{<223> Xaa is Phe or Tyr} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (6)..(8)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (9)..(9)} _{<223> Xaa is Ile or Val} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (10)..(10)} _{<223> Xaa is Leu or Phe} _{<400> 11} _{Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa} _{1 5 10} _{<210> 12} _{<211> 10} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (1)..(2)} _{<223> Xaa is any uncharged polar residue} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (3)..(3)} _{<223> Xaa is Cys or Leu} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(5)} _{<223> Xaa is Phe or Tyr} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (6)..(8)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (9)..(9)} _{<223> Xaa is Ile or Val} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (10)..(10)} _{<223> Xaa is Leu or Phe} _{<400> 12} _{Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa} _{1 5 10} _{＜２１０＞１３} _{＜２１１＞１０} _{＜２１２＞ＰＲＴ} _{＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｓｅｑｕｅｎｃｅ} _{＜２２０＞} _{＜２２３＞３’−５’ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｄｏｍａｉｎｏｆｔ}
_{ｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ} _{＜２２０＞} _{＜２２１＞ＭＩＳＣ＿ＦＥＡＴＵＲＥ} _{＜２２２＞（１）．．（２）} _{＜２２３＞Ｘａａｉｓａｎｙｕｎｃｈａｒｇｅｄｐｏｌａｒｒｅ}
_{ｓｉｄｕｅ} _{＜２２０＞} _{＜２２１＞ＭＩＳＣ＿ＦＥＡＴＵＲＥ} _{＜２２２＞（３）．．（３）} _{＜２２３＞ＸａａｉｓＣｙｓｏｒＬｅｕ} _{＜２２０＞} _{＜２２１＞ＭＩＳＣ＿ＦＥＡＴＵＲＥ} _{＜２２２＞（５）．．（５）} _{＜２２３＞ＸａａｉｓＰｈｅｏｒＴｙｒ} _{＜２２０＞} _{＜２２１＞ＭＩＳＣ＿ＦＥＡＴＵＲＥ} _{＜２２２＞（６）．．（６）} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (7)..(8)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (9)..(9)} _{<223> Xaa is Ile or Val} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (10)..(10)} _{<223> Xaa is Leu or Phe} _{<400> 13} _{Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa} _{1 5 10} _{<210> 14} _{<211> 10} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (1)..(2)} _{<223> Xaa is any uncharged polar residue} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (3)..(3)} _{<223> Xaa is Cys or Leu} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(5)} _{<223> Xaa is Phe or Tyr} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (6)..(6)} _{<223> Xaa is any acidic residue} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (7)..(8)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (9)..(9)} _{<223> Xaa is Ile or Val} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (10)..(10)} _{<223> Xaa is Leu or Phe} _{<400> 14} _{Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa} _{1 5 10} _{<210> 15} _{<211> 10} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (3)..(3)} _{<223> Xaa is Cys or Leu} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(5)} _{<223> Xaa is Phe or Tyr} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (7)..(8)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (9)..(9)} _{<223> Xaa is Ile or Val} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (10)..(10)} _{<223> Xaa is Leu or Phe} _{<400> 15} _{Gln Asn Xaa Lys Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa} _{1 5 10} _{<210> 16} _{<211> 10} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _{<400> 16} _{Gln Asn Leu Lys Phe Asp Tyr Lys Val Leu} _{1 5 10} _{<210> 17} _{<211> 10} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (1)..(1)} _{<223> Xaa is any nonpolar residue} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (2)..(2)} _{<223> Xaa is any uncharged polar residue} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (3)..(3)} _{<223> Xaa is Cys or Leu} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(5)} _{<223> Xaa is Phe or Tyr} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (6)..(6)} _{<223> Xaa is any acidic residue} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (7)..(8)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (9)..(9)} _{<223> Xaa is Ile or Val} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (10)..(10)} _{<223> Xaa is Leu or Phe} _{<400> 17} _{Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa} _{1 5 10} _{<210> 18} _{<211> 10} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (2)..(2)} _{<223> Xaa is any uncharged polar residue} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (3)..(3)} _{<223> Xaa is Cys or Leu} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(5)} _{<223> Xaa is Phe or Tyr} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (6)..(6)} _{<223> Xaa is any acidic residue} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (7)..(8)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (9)..(9)} _{<223> Xaa is Ile or Val} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (10)..(10)} _{<223> Xaa is Leu or Phe} _{<400> 18} _{Ala Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa} _{1 5 10} _{<210> 19} _{<211> 10} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (3)..(3)} _{<223> Xaa is Cys or Leu} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(5)} _{<223> Xaa is Phe or Tyr} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (7)..(8)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (9)..(9)} _{<223> Xaa is Ile or Val} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (10)..(10)} _{<223> Xaa is Leu or Phe} _{<400> 19} _{Ala Asn Xaa Lys Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa} _{1 5 10} _{<210> 20} _{<211> 10} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _{<400> 20} _{Ala Asn Leu Lys Phe Asp Tyr Lys Val Leu} _{1 5 10} _{<210> 21} _{<211> 10} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (1)..(1)} _{<223> Xaa is any uncharged polar amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (2)..(2)} _{<223> Xaa is any nonpolar residue} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (3)..(3)} _{<223> Xaa is Cys or Leu} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(5)} _{<223> Xaa is Phe or Tyr} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (6)..(6)} _{<223> Xaa is any acidic residue} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (7)..(8)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (9)..(9)} _{<223> Xaa is Ile or Val} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (10)..(10)} _{<223> Xaa is Leu or Phe} _{<400> 21} _{Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa} _{1 5 10} _{<210> 22} _{<211> 10} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (3)..(3)} _{<223> Xaa is Cys or Leu} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(5)} _{<223> Xaa is Phe or Tyr} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (7)..(8)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (9)..(9)} _{<223> Xaa is Ile or Val} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (10)..(10)} _{<223> Xaa is Leu or Phe} _{<400> 22} _{Gln Ala Xaa Lys Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa} _{1 5 10} _{<210> 23} _{<211> 10} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _{<400> 23} _{Gln Ala Leu Lys Phe Asp Tyr Lys Val Leu} _{1 5 10} _{<210> 24} _{<211> 10} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (1)..(2)} _{<223> Xaa is any uncharged polar residue} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (3)..(3)} _{<223> Xaa is Cys or Leu} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(5)} _{<223> Xaa is Phe or Tyr} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (7)..(8)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (9)..(9)} _{<223> Xaa is Ile or Val} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (10)..(10)} _{<223> Xaa is Leu or Phe} _{<400> 24} _{Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa} _{1 5 10} _{<210> 25} _{<211> 10} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (3)..(3)} _{<223> Xaa is Cys or Leu} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(5)} _{<223> Xaa is Phe or Tyr} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (7)..(8)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (9)..(9)} _{<223> Xaa is Ile or Val} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (10)..(10)} _{<223> Xaa is Leu or Phe} _{<400> 25} _{Gln Asn Xaa Lys Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa} _{1 5 10} _{<210> 26} _{<211> 10} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _{<400> 26} _{Gln Asn Leu Lys Phe Glu Tyr Lys Val Leu} _{1 5 10} _{<210> 27} _{<211> 10} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (1)..(2)} _{<223> Xaa is any nonpolar residue} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (3)..(3)} _{<223> Xaa is Cys or Leu} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(5)} _{<223> Xaa is Phe or Tyr} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (6)..(6)} _{<223> Xaa is any acidic residue} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (7)..(8)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (9)..(9)} _{<223> Xaa is Ile or Val} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (10)..(10)} _{<223> Xaa is Leu or Phe} _{<400> 27} _{Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa} _{1 5 10} _{<210> 28} _{<211> 10} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (3)..(3)} _{<223> Xaa is Cys or Leu} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(5)} _{<223> Xaa is Phe or Tyr} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (7)..(8)} _{<223> Xaa is any amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (9)..(9)} _{<223> Xaa is Ile or Val} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (10)..(10)} _{<223> Xaa is Leu or Phe} _{<400> 28} _{Ala Ala Xaa Lys Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa} _{1 5 10} _{<210> 29} _{<211> 10} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _{<400> 29} _{Ala Ala Leu Lys Phe Asp Tyr Lys Val Leu} _{1 5 10} _{<210> 30} _{<211> 11} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _{<400> 30} _{Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro} _{1 5 10} _{<210> 31} _{<211> 13} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> EXO III motif of DNA polymerase of the invention} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (2)..(2)} _{<223> Xaa is Val Leu or Ile} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (3)..(3)} _{<223> Xaa is Glu Asp or Pro} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (4)..(4)} _{<223> Xaa is Lys or Arg} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(6)} _{<223> Xaa is Ala or Val} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (7)..(7)} _{<223> Xaa is Glu or Asp} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (8)..(8)} _{<223> Xaa is any uncharged polar amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (9)..(9)} _{<223> Xaa is Ser or Cys} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (10)..(10)} _{<223> Xaa is Cys or Gly} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (11)..(11)} _{<223> Xaa is Glu or Thr} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (12)..(12)} _{<223> Xaa is Glu or Thr} _{<400> 31} _{Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Ala} _{1 5 10} _{<210> 32} _{<211> 13} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _{<400> 32} _{Pro Val Glu Lys Ala Ala Asp Tyr Ser Cys Glu Asp Ala} _{1 5 10} _{<210> 33} _{<211> 13} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (2)..(2)} _{<223> Xaa is Val, Leu, or Ile} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (3)..(3)} _{<223> Xaa is Glu, Asp, or Pro} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (4)..(4)} _{<223> Xaa is Lys, or Arg} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (5)..(6)} _{<223> Xaa is Ala, or Val} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (7)..(7)} _{<223> Xaa is Glu or Asp} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (8)..(8)} _{<223> Xaa is any non polar amino acid} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (9)..(9)} _{<223> Xaa is Ser or Cys} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (10)..(10)} _{<223> Xaa is Cys or Gly} _<220> _{<221> MISC_FEATURE} _{<222> (11)..(11)} _{<223> Xaa is Glu or Thr} _{<400> 33} _{Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Ala} _{1 5 10} _{<210> 34} _{<211> 13} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> 3'-5' Exonuclease domain of thermostable DNA Polymerase} _{<400> 34} _{Pro Val Glu Lys Ala Ala Asn Ala Ser Cys Glu Asp Ala} _{1 5 10} _{<210> 35} _{<211> 28} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> Primer} _{<400> 35} _{Gly Thr Ala Thr Gly Thr Ala Gly Thr Ala Cys Gly Cys Thr Thr Cys} _{1 5 10 15} _{Cys Thr Thr Thr Gly Gly Thr Thr Thr Gly Ala Ala} _{20 25} _{<210> 36} _{<211> 23} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> Primer} _{<400> 36} _{Thr Gly Gly Cys Thr Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly Thr} _{1 5 10 15} _{Ala Cys Gly Gly Cys Cys Thr} ₂₀ _{<210> 37} _{<211> 11} _{<212> DNA} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> Primer} _<220> _{<221> misc_feature} _{<222> (7)..(7)} _{<223> n is degenerate position, either 'a' or 't'} _{<400> 37} _{cgacgangag a 11} _{<210> 38} _{<211> 17} _{<212> DNA} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> Primer} _<220> _{<221> misc_feature} _{<222> (9)..(9)} _{<223> n is degenerate position, either 'a' or 't'} _{<400> 38} _{tagctgctnc tctgatc 17} _{<210> 39} _{<211> 11} _{<212> DNA} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> Primer} _{<400> 39} _{cgacgaagag a 11} _{<210> 40} _{<211> 17} _{<212> DNA} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> Primer} _{<400> 40} _{tagctgcttc tctgatc 17} _{<210> 41} _{<211> 11} _{<212> DNA} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> Primer} _{<400> 41} _{cgacgatgag a 11} _{<210> 42} _{<211> 17} _{<212> DNA} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> Primer} _{<400> 42} _{tagctgctac tctgatc 17} _{<210> 43} _{<211> 11} _{<212> DNA} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> Primer} _{<400> 43} _{tgatmaggaa a 11} _{<210> 44} _{<211> 17} _{<212> DNA} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> Primer} _<220> _{<221> misc_feature} _{<222> (7)..(7)} _{<223> n is degenerate position, either 'g' or 't'} _{<400> 44} _{taactantcc tttgatc 17} _{<210> 45} _{<211> 11} _{<212> DNA} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> Primer} _{<400> 45} _{tgataaggaa a 11} _{<210> 46} _{<211> 17} _{<212> DNA} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> Primer} _{<400> 46} _{taactattcc tttgatc 17} _{<210> 47} _{<211> 11} _{<212> DNA} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> Primer} _{<400> 47} _{tgatcaggaa a 11} _{<210> 48} _{<211> 17} _{<212> DNA} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> Primer} _{<400> 48} _{taactagtcc tttgatc 17} _{<210> 49} _{<211> 11} _{<212> DNA} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> Primer} _{<400> 49} _{cgatmatgaa a 11} _{<210> 50} _{<211> 17} _{<212> DNA} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> Primer} _<220> _{<221> 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_{ＴｙｒＬｅｕＬｅｕＧｌｕＰｒｏＡｓｎＧｌｕ} _{１１５１２０}
_１２５ _{ＬｙｓＬｙｓＰｈｅＡｓｎＬｅｕＡｓｐＡｓｐＬｅｕＡｌａ}
_{ＬｅｕＬｙｓＰｈｅＬｅｕＧｌｙＴｙｒＬｙｓ} _{１３０１３５}
_１４０ _{ＭｅｔＴｈｒＳｅｒＴｙｒＧｌｎＧｌｕＬｅｕＭｅｔＳｅｒ}
_{ＰｈｅＳｅｒＰｈｅＰｒｏＬｅｕＰｈｅＧｌｙ} _{１４５１５０}
_{１５５１６０} _{ＰｈｅＳｅｒＰｈｅＡｌａＡｓｐＶａｌＰｒｏＶａｌＧｌｕ}
_{ＬｙｓＡｌａＡｌａＡｓｎＴｙｒＳｅｒＣｙｓ} _１６５
_{１７０１７５} _{ＧｌｕＡｓｐＡｌａＡｓｐＩｌｅＴｈｒＴｙｒＡｒｇＬｅｕ}
_{ＴｙｒＬｙｓＴｈｒＬｅｕＳｅｒＬｅｕＬｙｓ} _{１８０１８５}
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Xaa Glu Asn Cys Glu Ile Asn Ala} _{1130 1135 1140} _{Leu Ile Gly Asn Met Glu Asn Thr Ser Glu Thr Gly Thr Gly Cys} _{1145 1150 1155} _{Gly Leu Ala Ser Thr Ser Arg Ser Pro Ala Gly Glu} _{1160 1165 1170} _{<210> 200} _{<211> 774} _{<212> PRT} _{<213> Pyrococcus kodakaraensis} _{<400> 200} _{Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile} _{1 5 10 15} _{Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg} _{20 25 30} _{Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile} _{35 40 45} _{Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Val Val Thr} _{50 55 60} _{Val Lys Arg Val Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val} _{65 70 75 80} _{Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile} _{85 90 95} _{Arg Asp Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr} _{100 105 110} _{Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro} _{115 120 125} _{Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr} _{130 135 140} _{Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile} _{145 150 155 160} _{Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Asn Val} _{165 170 175} _{Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Arg Glu Met Ile Lys} _{180 185 190} _{Arg Phe Leu Arg Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr} _{195 200 205} _{Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu} _{210 215 220} _{Lys Leu Gly Ile Asn Phe Ala Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys} _{225 230 235 240} _{Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile} _{245 250 255} _{His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr} _{260 265 270} _{Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Gln Pro Lys Glu} _{275 280 285} _{Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Thr Thr Ala Trp Glu Thr Gly Glu Asn} _{290 295 300} _{Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr} _{305 310 315 320} _{Glu Leu Gly Lys Glu Phe Leu Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu} _{325 330 335} _{Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu} _{340 345 350} _{Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala} _{355 360 365} _{Pro Asn Lys Pro Asp Glu Lys Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gln Ser Tyr} _{370 375 380} _{Glu Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile} _{385 390 395 400} _{Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His} _{405 410 415} _{Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp} _{420 425 430} _{Val Ala Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe} _{435 440 445} _{Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys} _{450 455 460} _{Lys Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Arg Lys Leu Leu Asp} _{465 470 475 480} _{Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr} _{485 490 495} _{Tyr Gly Tyr Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser} _{500 505 510} _{Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Thr Met Thr Ile Lys Glu Ile} _{515 520 525} _{Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Ile Tyr Ser Asp Thr Asp Gly Phe} _{530 535 540} _{Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala} _{545 550 555 560} _{Met Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu} _{565 570 575} _{Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys} _{580 585 590} _{Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu} _{595 600 605} _{Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala} _{610 615 620} _{Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asp Val Glu Lys Ala Val} _{625 630 635 640} _{Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro} _{645 650 655} _{Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Lys Asp} _{660 665 670} _{Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala} _{675 680 685} _{Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu} _{690 695 700} _{Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe} _{705 710 715 720} _{Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln} _{725 730 735} _{Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys} _{740 745 750} _{Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Ser Ala Trp} _{755 760 765} _{Leu Lys Pro Lys Gly Thr} ₇₇₀ _{<210> 201} _{<211> 804} _{<212> PRT} _{<213> Pyrococcus abyssei} _<220> _{<221> misc_feature} _{<222> (804)..(804)} _{<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid} _{<400> 201} _{Met Pro Glu Ala Ile Glu Phe Val Leu Leu Asp Ser Ser Tyr Glu Ile} _{1 5 10 15} _{Val Gly Lys Glu Pro Val Ile Ile Leu Trp Gly Val Thr Leu Asp Gly} _{20 25 30} _{Lys Arg Ile Val Leu Leu Asp Arg Arg Phe Arg Pro Tyr Phe Tyr Ala} _{35 40 45} _{Leu Ile Ser Arg Asp Tyr Glu Gly Lys Ala Glu Glu Val Val Ala Ala} _{50 55 60} _{Ile Arg Arg Leu Ser Met Ala Lys Ser Pro Ile Ile Glu Ala Lys Val} _{65 70 75 80} _{Val Ser Lys Lys Tyr Phe Gly Arg Pro Arg Lys Ala Val Lys Val Thr} _{85 90 95} _{Thr Val Ile Pro Glu Ser Val Arg Glu Tyr Arg Glu Ala Val Lys Lys} _{100 105 110} _{Leu Glu Gly Val Glu Asp Ser Leu Glu Ala Asp Ile Arg Phe Ala Met} _{115 120 125} _{Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Ala Tyr Arg Val} _{130 135 140} _{Arg Ala Glu Asn Ala Gly Arg Ser Pro Gly Phe Arg Val Asp Ser Val} _{145 150 155 160} _{Tyr Thr Ile Val Glu Asp Pro Glu Pro Ile Ala Asp Ile Thr Ser Ile} _{165 170 175} _{Asp Ile Pro Glu Met Arg Val Leu Ala Phe Asp Ile Glu Val Tyr Ser} _{180 185 190} _{Lys Arg Gly Ser Pro Asn Pro Ser Arg Asp Pro Val Ile Ile Ile Ser} _{195 200 205} _{Ile Lys Asp Ser Lys Gly Asn Glu Lys Leu Leu Glu Ala Asn Asn Tyr} _{210 215 220} _{Asp Asp Arg Asn Val Leu Arg Glu Phe Ile Glu Tyr Ile Arg Ser Phe} _{225 230 235 240} _{Asp Pro Asp Ile Ile Val Gly Tyr Asn Ser Asn Asn Phe Asp Trp Pro} _{245 250 255} _{Tyr Leu Ile Glu Arg Ala His Arg Ile Gly Val Lys Leu Asp Val Thr} _{260 265 270} _{Arg Arg Val Gly Ala Glu Pro Ser Met Ser Val Tyr Gly His Val Ser} _{275 280 285} _{Val Gln Gly Arg Leu Asn Val Asp Leu Tyr Asn Tyr Val Glu Glu Met} _{290 295 300} _{His Glu Ile Lys Val Lys Thr Leu Glu Glu Val Ala Glu Tyr Leu Gly} _{305 310 315 320} _{Val Met Arg Lys Ser Glu Arg Val Leu Ile Glu Trp Trp Arg Ile Pro} _{325 330 335} _{Asp Tyr Trp Asp Asp Glu Lys Lys Arg Pro Leu Leu Lys Arg Tyr Ala} _{340 345 350} _{Leu Asp Asp Val Arg Ala Thr Tyr Gly Leu Ala Glu Lys Ile Leu Pro} _{355 360 365} _{Phe Ala Ile Gln Leu Ser Thr Val Thr Gly Val Pro Leu Asp Gln Val} _{370 375 380} _{Gly Ala Met Gly Val Gly Phe Arg Leu Glu Trp Tyr Leu Met Arg Ala} _{385 390 395 400} _{Ala His Asp Met Asn Glu Leu Val Pro Asn Arg Val Lys Arg Arg Glu} _{405 410 415} _{Glu Ser Tyr Lys Gly Ala Val Val Leu Lys Pro Leu Lys Gly Val His} _{420 425 430} _{Glu Asn Val Val Val Leu Asp Phe Ser Ser Met Tyr Pro Asn Ile Met} _{435 440 445} _{Ile Lys Tyr Asn Val Gly Pro Asp Thr Ile Ile Asp Asp Pro Ser Glu} _{450 455 460} _{Cys Glu Lys Tyr Ser Gly Cys Tyr Val Ala Pro Glu Val Gly His Met} _{465 470 475 480} _{Phe Arg Arg Ser Pro Ser Gly Phe Phe Lys Thr Val Leu Glu Asn Leu} _{485 490 495} _{Ile Ala Leu Arg Lys Gln Val Arg Glu Lys Met Lys Glu Phe Pro Pro} _{500 505 510} _{Asp Ser Pro Glu Tyr Arg Ile Tyr Asp Glu Arg Gln Lys Ala Leu Lys} _{515 520 525} _{Val Leu Ala Asn Ala Ser Tyr Gly Tyr Met Gly Trp Val His Ala Arg} _{530 535 540} _{Trp Tyr Cys Lys Arg Cys Ala Glu Ala Val Thr Ala Trp Gly Arg Asn} _{545 550 555 560} _{Leu Ile Leu Ser Ala Ile Glu Tyr Ala Arg Lys Leu Gly Leu Lys Val} _{565 570 575} _{Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Ser Leu Phe Val Thr Tyr Asp Ile Glu Lys} _{580 585 590} _{Val Lys Lys Leu Ile Glu Phe Val Glu Lys Gln Leu Gly Phe Glu Ile} _{595 600 605} _{Lys Ile Asp Lys Val Tyr Lys Arg Val Phe Phe Thr Glu Ala Lys Lys} _{610 615 620} _{Arg Tyr Val Gly Leu Leu Glu Asp Gly Arg Met Asp Ile Val Gly Phe} _{625 630 635 640} _{Glu Ala Val Arg Gly Asp Trp Cys Glu Leu Ala Lys Glu Val Gln Glu} _{645 650 655} _{Lys Val Ala Glu Ile Ile Leu Lys Thr Gly Asp Ile Asn Arg Ala Ile} _{660 665 670} _{Ser Tyr Ile Arg Glu Val Val Arg Lys Leu Arg Glu Gly Lys Ile Pro} _{675 680 685} _{Ile Thr Lys Leu Val Ile Trp Lys Thr Leu Thr Lys Arg Ile Glu Glu} _{690 695 700} _{Tyr Glu His Glu Ala Pro His Val Thr Ala Ala Arg Arg Met Lys Glu} _{705 710 715 720} _{Ala Gly Tyr Asp Val Ala Pro Gly Asp Lys Ile Gly Tyr Ile Ile Val} _{725 730 735} _{Lys Gly His Gly Ser Ile Ser Ser Arg Ala Tyr Pro Tyr Phe Met Val} _{740 745 750} _{Asp Ser Ser Lys Val Asp Thr Glu Tyr Tyr Ile Asp His Gln Ile Val} _{755 760 765} _{Pro Ala Ala Met Arg Ile Leu Ser Tyr Phe Gly Val Thr Glu Lys Gln} _{770 775 780} _{Leu Lys Ala Ala Ser Ser Gly His Arg Ser Leu Phe Asp Phe Phe Ala} _{785 790 795 800} _{Ala Lys Lys Xaa} _{<210> 202} _{<211> 804} _{<212> PRT} _{<213> Pyrococcus occultum} _<220> _{<221> misc_feature} _{<222> (804)..(804)} _{<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid} _{<400> 202} _{Met Thr Glu Thr Ile Glu Phe Val Leu Leu Asp Ser Ser Tyr Glu Ile} _{1 5 10 15} _{Leu Gly Lys Glu Pro Val Val Ile Leu Trp Gly Ile Thr Leu Asp Gly} _{20 25 30} _{Lys Arg Val Val Leu Leu Asp His Arg Phe Arg Pro Tyr Phe Tyr Ala} _{35 40 45} _{Leu Ile Ala Arg Gly Tyr Glu Asp Met Val Glu Glu Ile Ala Ala Ser} _{50 55 60} _{Ile Arg Arg Leu Ser Val Val Lys Ser Pro Ile Ile Asp Ala Lys Pro} _{65 70 75 80} _{Leu Asp Lys Arg Tyr Phe Gly Arg Pro Arg Lys Ala Val Lys Ile Thr} _{85 90 95} _{Thr Met Ile Pro Glu Ser Val Arg His Tyr Arg Glu Ala Val Lys Lys} _{100 105 110} _{Ile Glu Gly Val Glu Asp Ser Leu Glu Ala Asp Ile Arg Phe Ala Met} _{115 120 125} _{Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Arg Leu Tyr Pro Phe Thr Val Tyr Arg Ile} _{130 135 140} _{Pro Val Glu Asp Ala Gly Arg Asn Pro Gly Phe Arg Val Asp Arg Val} _{145 150 155 160} _{Tyr Lys Val Ala Gly Asp Pro Glu Pro Leu Ala Asp Ile Thr Arg Ile} _{165 170 175} _{Asp Leu Pro Pro Met Arg Leu Val Ala Phe Asp Ile Glu Val Tyr Ser} _{180 185 190} _{Arg Arg Gly Ser Pro Asn Pro Ala Arg Asp Pro Val Ile Ile Val Ser} _{195 200 205} _{Leu Arg Asp Ser Glu Gly Lys Glu Arg Leu Ile Glu Ala Glu Gly His} _{210 215 220} _{Asp Asp Arg Arg Val Leu Arg Glu Phe Val Glu Tyr Val Arg Ala Phe} _{225 230 235 240} _{Asp Pro Asp Ile Ile Val Gly Tyr Asn Ser Asn His Phe Asp Trp Pro} _{245 250 255} _{Tyr Leu Met Glu Arg Ala Arg Arg Leu Gly Ile Lys Leu Asp Val Thr} _{260 265 270} _{Arg Arg Val Gly Ala Glu Pro Thr Thr Ser Val Tyr Gly His Val Ser} _{275 280 285} _{Val Gln Gly Arg Leu Asn Val Asp Leu Tyr Asp Tyr Ala Glu Glu Met} _{290 295 300} _{Pro Glu Ile Lys Met Lys Thr Leu Glu Glu Val Ala Glu Tyr Leu Gly} _{305 310 315 320} _{Val Met Lys Lys Ser Glu Arg Val Ile Ile Glu Trp Trp Arg Ile Pro} _{325 330 335} _{Glu Tyr Trp Asp Asp Glu Lys Lys Arg Gln Leu Leu Glu Arg Tyr Ala} _{340 345 350} _{Leu Asp Asp Val Arg Ala Thr Tyr Gly Leu Ala Glu Lys Met Leu Pro} _{355 360 365} _{Phe Ala Ile Gln Leu Ser Thr Val Thr Gly Val Pro Leu Asp Gln Val} _{370 375 380} _{Gly Ala Met Gly Val Gly Phe Arg Leu Glu Trp Tyr Leu Met Arg Ala} _{385 390 395 400} _{Ala Tyr Asp Met Asn Glu Leu Val Pro Asn Arg Val Glu Arg Arg Gly} _{405 410 415} _{Glu Ser Tyr Lys Gly Ala Val Val Leu Lys Pro Leu Lys Gly Val His} _{420 425 430} _{Glu Asn Val Val Val Leu Asp Phe Ser Ser Met Tyr Pro Ser Ile Met} _{435 440 445} _{Ile Lys Tyr Asn Val Gly Pro Asp Thr Ile Val Asp Asp Pro Ser Glu} _{450 455 460} _{Cys Pro Lys Tyr Gly Gly Cys Tyr Val Ala Pro Glu Val Gly His Arg} _{465 470 475 480} _{Phe Arg Arg Ser Pro Pro Gly Phe Phe Lys Thr Val Leu Glu Asn Leu} _{485 490 495} _{Leu Lys Leu Arg Arg Gln Val Lys Glu Lys Met Lys Glu Phe Pro Pro} _{500 505 510} _{Asp Ser Pro Glu Tyr Arg Leu Tyr Asp Glu Arg Gln Lys Ala Leu Lys} _{515 520 525} _{Val Leu Ala Asn Ala Ser Tyr Gly Tyr Met Gly Trp Ser His Ala Arg} _{530 535 540} _{Trp Tyr Cys Lys Arg Cys Ala Glu Ala Val Thr Ala Trp Gly Arg Asn} _{545 550 555 560} _{Leu Ile Leu Thr Ala Ile Glu Tyr Ala Arg Lys Leu Gly Leu Lys Val} _{565 570 575} _{Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Ser Leu Phe Val Val Tyr Asp Lys Glu Lys} _{580 585 590} _{Val Glu Lys Leu Ile Glu Phe Val Glu Lys Glu Leu Gly Phe Glu Ile} _{595 600 605} _{Lys Ile Asp Lys Ile Tyr Lys Lys Val Phe Phe Thr Glu Ala Lys Lys} _{610 615 620} _{Arg Tyr Val Gly Leu Leu Glu Asp Gly Arg Ile Asp Ile Val Gly Phe} _{625 630 635 640} _{Glu Ala Val Arg Gly Asp Trp Cys Glu Leu Ala Lys Glu Val Gln Glu} _{645 650 655} _{Lys Ala Ala Glu Ile Val Leu Asn Thr Gly Asn Val Asp Lys Ala Ile} _{660 665 670} _{Ser Tyr Ile Arg Glu Val Ile Lys Gln Leu Arg Glu Gly Lys Val Pro} _{675 680 685} _{Ile Thr Lys Leu Ile Ile Trp Lys Thr Leu Ser Lys Arg Ile Glu Glu} _{690 695 700} _{Tyr Glu His Asp Ala Pro His Val Met Ala Ala Arg Arg Met Lys Glu} _{705 710 715 720} _{Ala Gly Tyr Glu Val Ser Pro Gly Asp Lys Val Gly Tyr Val Ile Val} _{725 730 735} _{Lys Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Arg Ala Tyr Pro Tyr Phe Met Val} _{740 745 750} _{Asp Pro Ser Thr Ile Asp Val Asn Tyr Tyr Ile Asp His Gln Ile Val} _{755 760 765} _{Pro Ala Ala Leu Arg Ile Leu Ser Tyr Phe Gly Val Thr Glu Lys Gln} _{770 775 780} _{Leu Lys Ala Ala Ala Thr Val Gln Arg Ser Leu Phe Asp Phe Phe Ala} _{785 790 795 800} _{Ser Lys Lys Xaa} _{<210> 203} _{<211> 7} _{<212> PRT} _{<213> Artificial sequence} _<220> _{<223> EXO I motif from Tma DNA polymerase} _{<400> 203} _{Asp Leu Glu Thr Ser Ser Leu} _{1 5}

【図面の簡単な説明】

【図１】図1Aは、サーモトガ・マリティマ(Tma) DNAポ
リメラーゼのアミノ酸配列(配列番号：85）を示す。
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインは、およそ292
から487番目のアミノ酸残基（配列番号：86）の範囲内
に位置し、これらの残基には下線が付与されている。図
1Bは、図1Aのアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列
番号：87）を示す。

【図２】図2は、サーモトガ・ネアポリタナ(Tne) DNAポ
リメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメインの
領域のアミノ酸配列（配列番号：88）を示す。

【図３】図3は、サーモシフォ・アフリカヌス(Taf) DNA
ポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン
の領域のアミノ酸配列（配列番号：89）を示す。

【図４】図4Aは、キメラ熱安定性DNAポリメラーゼCS5の
アミノ酸配列（配列番号：90）を示す。３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメインは、およそ292から487番目の残
基まで広がり、これらの残基には下線が付与されている
（配列番号：91）。1-291番目の残基（配列番号：92）
はZ05 DNAポリメラーゼに由来し、そして矢印で示され
る292-893番目の残基（配列番号：93）は、Tma DNAポリ
メラーゼに由来する。第二ラウンドの変異誘発の際に導
入されるアミノ酸残基の置換を、置換される残基の真上
に表しており、それらを太字で示す：L329A（３’−
５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番号：94；タン
パク質全体、配列番号：95）、Q384A（３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメイン、配列番号：96；タンパク質全
体、配列番号：97）、N385A（３’−５’エキソヌクレ
アーゼドメイン、配列番号：98；タンパク質全体、配列
番号：99）、Q384A N385A（３’−５’エキソヌクレア
ーゼドメイン、配列番号：100；タンパク質全体、配列
番号：101）、D389E（３’−５’エキソヌクレアーゼド
メイン、配列番号：102；タンパク質全体、配列番号：1
03）及びY464A（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイ
ン、配列番号：104；タンパク質全体、配列番号：10
5)。図4Bは、CS5をコードする核酸配列（配列番号：10
6）を示す。

【図５】図5Aは、キメラ熱安定性DNAポリメラーゼCS6の
アミノ酸配列（配列番号：107）を示す。３’−５’エ
キソヌクレアーゼドメインは、およそ292から487番目の
残基まで広がり、これらの残基には下線が付与されてい
る（配列番号：108）。1-291番目の残基（配列番号：10
9）はZ05 DNAポリメラーゼに由来し、323-325番目の残
基が既に配列ALAで置換されていることを除いて、矢印
で示される292-893番目の残基（配列番号：110）はTma
DNAポリメラーゼに由来する。一順目の突然変異誘発の
際に導入されるアミノ酸残基の置換を、置換される残基
の真上に表しており、それらを太字で示す：DEE（３’
−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番号：111；
タンパク質全体、配列番号：112）、DDE（３’−５’エ
キソヌクレアーゼドメイン、配列番号：113；タンパク
質全体、配列番号：114）、DKE（３’−５’エキソヌク
レアーゼドメイン、配列番号：115；タンパク質全体、
配列番号:116）、DNE（３’−５’エキソヌクレアーゼ
ドメイン、配列番号：117；タンパク質全体、配列番
号：118）、DQE（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイ
ン、配列番号：119；タンパク質全体、配列番号：12
0）、DHE（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配
列番号：121；タンパク質全体、配列番号：122）、DLD
（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番号：
123；タンパク質全体、配列番号：124）、ELD（３’−
５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番号：125；タ
ンパク質全体、配列番号：126）、ELE（３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメイン、配列番号：127；タンパク質
全体、配列番号：128）。図5Bは、CS6をコードする核酸
配列（配列番号：129）を示す。

【図６】図6Aは、キメラ熱安定性DNAポリメラーゼCS7の
アミノ酸配列（配列番号：130）を示す。３’−５’エ
キソヌクレアーゼドメインはおよそ残基292から残基487
程度まで広がり、これらの残基には下線が付与されてい
る（配列番号：131）。1-291番目の残基（配列番号：13
2）及び残基485-894（配列番号：133）はZ05 DNAポリメ
ラーゼに由来し、そして矢印で示されるように、292-48
4番目の残基（配列番号：134）はTma DNAポリメラーゼ
に由来する。第二ラウンドの突然変異誘発の際にCS5内
に導入される、これらと類似するアミノ酸残基の置換
を、置換される残基の上に直接現しており、それらを太
字で示す：L329A（３’−５’エキソヌクレアーゼドメ
イン、配列番号：135；タンパク質全体、配列番号：13
6）、Q384A（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、
配列番号：137；タンパク質全体、配列番号：138）、N3
85A（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番
号：139；タンパク質全体、配列番号：140）、Q384A N3
85A（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番
号：141；タンパク質全体、配列番号：142）、D389E
（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番号：
143；タンパク質全体、配列番号：144）及びY464A
（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番号：
145；タンパク質全体、配列番号：146）。図6Bは、CS7
をコードする核酸配列（配列番号：147）を示す。

【図７】図7Aは、キメラ熱安定性DNAポリメラーゼCS8の
アミノ酸配列（配列番号：148）を示す。３’−５’エ
キソヌクレアーゼドメインはおよそ292から487番目の残
基まで広がり、これらの残基には下線が付与されている
（配列番号：149）。残基1-291（配列番号：150）及び
残基485-894（配列番号：151）はZ05 DNAポリメラーゼ
に由来し、323-325番目の残基が既に配列ALAで置換され
ていたことを除いて、矢印で示されるように、292-484
番目の残基（配列番号：152）はTma DNAポリメラーゼに
由来する。第二ラウンドのCS5の変異誘発の際に導入さ
れる、これらと類似するアミノ酸残基の置換を、置換さ
れる残基の真上に表しており、それらを太字で示す：DE
E（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番
号：153；タンパク質全体、配列番号：154）、DDE
（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番号：
155；タンパク質全体、配列番号：156）、DKE（３’−
５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番号：157；タ
ンパク質全体、配列番号：158）、DNE（３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメイン、配列番号：159；タンパク質
全体、配列番号：160）、DQE（３’−５’エキソヌクレ
アーゼドメイン、配列番号：161；タンパク質全体、配
列番号：162）、DHE（３’−５’エキソヌクレアーゼド
メイン、配列番号：163；タンパク質全体、配列番号：1
64）、DLD（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、
配列番号：165；タンパク質全体、配列番号：166）、EL
D（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番
号：167；タンパク質全体、配列番号：168）、ELE
（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番号：
169；タンパク質全体、配列番号：170）。図7Bは、CS8
（配列番号：171）をコードする核酸配列を示す。

【図８】図8は、Eco DNAポリメラーゼの３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメインの領域のアミノ酸配列と、他の
ファミリーAのDNAポリメラーゼのそれとの配列比較を示
す：Tth （配列番号：172）、Tca（配列番号：173）、Z
05（配列番号：174）、Taq（配列番号：175）、Tfl（配
列番号：176）、Tfi（配列番号：177）、 Sps17（配列
番号：178）、Dra（配列番号：179）、HSP-B-7（配列番
号：180）、Bst（配列番号：181）、Bca（配列番号：18
2）、E. coli（配列番号：183）、Tma（配列番号：18
4）、Tne（配列番号：185）、Taf（配列番号：186）、H
SP-A（配列番号：187）。Exo I（配列番号：203）、Exo
II（配列番号：188）、Exo IIa（配列番号：189）及び
Exo III（配列番号：190）モチーフはTmaを配列中、太
字で示す。

【図９】図9A及び図9Bは、本発明の変異型DNAポリメラ
ーゼを用いた、逆転写酵素／1.7kbのHIVの鋳型のPCR増
幅の増加曲線を示す。

【図１０】図10は、図9のPCR増幅の逆転写酵素の増幅産
物の電気泳動解析の写真を示す。

【図１１】図11は、Eco Pol IIファミリーBのDNAポリメ
ラーゼと、他のファミリーBの多数のDNAポリメラーゼと
の配列アラインメントを示す（配列番号：191-202）。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１５年５月２日（２００３．５．２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３２】別の側面において、本発明の修飾された熱
安定性又は修飾された熱活性DNAポリメラーゼは、Figur
e 1A（配列番号：85）中の下線が付与されている３’−
５’エキソヌクレアーゼドメインに対して、約80％より
高いが100％未満の配列同一性を有する３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメインを含有し、下記実施例3の標準
アッセイを用いて測定すると、約6.5U／pmol以下である
が、0U／pmolより高い弱化３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性を呈示すものである。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３３】別の側面において、本発明の修飾された熱
安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメインを含有し、下記実施例3の標準
アッセイを用いて測定すると、約6.5U／pmol以下である
が、0U／pmolより高い弱化３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性を示すものであり、Figure 1Aの配列（配列番
号：85）に対して、約80％を超えるが100％には満たな
い配列同一性を有する。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３４】別の側面において、本発明の修飾された熱
安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメインを含有し、下記実施例3の標準
アッセイを用いて測定すると、約6.5U／pmol以下である
が、0U／pmolより高い弱化３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性を示すものであり、非修飾Tne DNAポリメラーゼ
の３’−５’エキソヌクレアーゼドメインに対して、約
80％より高いが100％未満の配列同一性を有する。一つ
の態様において、非修飾Tne DNAポリメラーゼの３’−
５’エキソヌクレアーゼドメインは、Figure 2に示され
る配列（配列番号：88）を含有する。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３６】別の側面において、本発明の修飾された熱
安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、非修飾Taf DNAポ
リメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメインに
対して、約80％より高いが100％未満の配列同一性を有
する３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含有し、
下記実施例3の標準アッセイを用いて測定すると、約6.5
U／pmol以下であるが0U／pmolより高い弱化３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性を示すものである。一つの態様
において、非修飾Taf DNAポリメラーゼの３’−５’エ
キソヌクレアーゼドメインは、Figure 3に示される配列
（配列番号：89）を含有する。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４３】一つの態様において、このような熱安定性
又は熱活性DNAポリメラーゼは、Figure 4Aに示されるQ3
84A変異によって修飾された３’−５’エキソヌクレア
ーゼドメインのアミノ酸配列（配列番号：96）を含有す
る。別の態様において、このような熱安定性又は熱活性
DNAポリメラーゼは、Q384A変異によって修飾されたFigu
re 4Aのアミノ酸配列（配列番号：97）を含有する。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４７】一つの態様において、このような熱安定性
又は熱活性DNAポリメラーゼは、Figure 4Aに示されるN3
85A変異によって修飾された３’−５’エキソヌクレア
ーゼドメインのアミノ酸配列（配列番号：98）を含有す
る。別の態様において、このような熱安定性又は熱活性
DNAポリメラーゼは、N385A変異によって修飾されたFigu
re 4Aのアミノ酸配列（配列番号：99）を含有する。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５１】一つの態様において、このような熱安定性
又は熱活性DNAポリメラーゼは、Figure 4Aに示されるD3
89E変異によって修飾された３’−５’エキソヌクレア
ーゼドメインのアミノ酸配列（配列番号：159）を含有
する。別の態様において、このような熱安定性又は熱活
性DNAポリメラーゼは、D389E変異によって修飾されたFi
gure 4Aのアミノ酸配列（配列番号：175）を含有する。

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５６】一つの態様において、このような熱安定性
又は熱活性DNAポリメラーゼは、Figure 4Aに示されるQ3
84AとN385Aとの二重変異によって修飾された３’−５’
エキソヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列（配列番
号：100）を含有する。別の態様において、このような
熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、Q384AとN385A
との二重変異によって修飾されたFigure 4Aのアミノ酸
配列（配列番号：101）を含有する。

【手続補正９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６３】別の側面において、本発明は、アミノ末端
部分とカルボキシ末端部分とを含有し、該アミノ末端部
分が、第一のDNAポリメラーゼのアミノ末端部分に由来
し、該カルボキシ末端部分が、第二のDNAポリメラーゼ
に由来する、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
有するキメラ熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼを提
供する。一つの態様において、弱化３’−５’エキソヌ
クレアーゼ活性を有するキメラDNAポリメラーゼは、第
一の熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼのアミノ末端
部分に由来するアミノ末端部分と、第二の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼに由来するカルボキシ末端部分
とを含有し、該第二のポリメラーゼは、好ましくは、
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示すものである。
別の態様において、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ
活性を有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、アミノ
末端部分及び／又はカルボキシ末端部分は、サーマス・
スピーシーズ由来のDNAポリメラーゼに由来する。別の
態様において、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性
を有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、アミノ末端
部分及び／又はカルボキシ末端部分は、サーモトガ・ス
ピーシーズ由来のDNAポリメラーゼに由来する。別の態
様において、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、アミノ末端部
分及び／又はカルボキシ末端部分又は別の部分は、サー
マス・スピーシーズ由来のDNAポリメラーゼに由来し、
他の末端部分又は別の部分は、サーモトガ・スピーシー
ズ由来のDNAポリメラーゼに由来する；例えば、一つの
態様において、該アミノ末端部分は、サーマス・スピー
シーズ由来のDNAポリメラーゼに由来し、該カルボキシ
末端部分は、サーモトガ・スピーシーズ由来のDNAポリ
メラーゼに由来する。別の態様において、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラDNAポリメ
ラーゼにおいて、アミノ末端部分は、サーマス・スピー
シーズに由来し、かつ５’−３’エキソヌクレアーゼド
メインを含有し、カルボキシ末端部分は、サーモトガ・
スピーシーズに由来し、かつ３’−５’エキソヌクレア
ーゼドメイン及びポリメラーゼドメインを含有する。別
の態様において、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性を有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、アミノ末
端部分は、サーマス・スピーシーズに由来し、５’−
３’エキソヌクレアーゼドメインを含有し、サーマス・
スピーシーズ由来のDNAポリメラーゼの対応するアミノ
末端部分に対して約80％より高い配列同一性を有し、カ
ルボキシ末端部分は、サーモトガ・スピーシーズ由来の
DNAポリメラーゼの対応するカルボキシ末端部分に対し
て、約80％より高いが100％未満の配列同一性を有す
る。別の態様において、サーマス・スピーシーズは、サ
ーマス・スピーシーズZ05であり、サーモトガ・スピー
シーズは、サーモトガ・マリティマである。別の態様に
おいて、キメラ熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼ
は、図中で示される一つ以上の変異によって修飾され
る、Figure 4（配列番号：90）のアミノ酸配列を含有す
る。別の態様において、キメラ熱安定性又は熱活性DNA
ポリメラーゼは、図中で示される一つ以上の変異によっ
て修飾される、Figure 5（配列番号：107）のアミノ酸
配列を含有する。別の態様において、弱化３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性を有するキメラ熱安定性又は熱活
性DNAポリメラーゼは、アミノ末端部分と、中央部分
と、カルボキシ末端部分とを含有する。別の態様におい
て、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキ
メラDNAポリメラーゼにおいて、アミノ末端部分は、
５’−３’エキソヌクレアーゼドメインを含有する。別
の態様において、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性を有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、中央部分
は、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含有す
る。別の態様において、弱化３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性を有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、カ
ルボキシ末端部分は、ポリメラーゼドメインを含有す
る。別の態様において、弱化３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性を有する当該キメラDNAポリメラーゼにおい
て、カルボキシ末端部分とアミノ末端部分とは、サーマ
ス・スピーシーズ由来のポリメラーゼに由来する。別の
態様において、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性
を有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、アミノ末端
部分及び／又はカルボキシ末端部分は、サーマス・スピ
ーシーズ由来のポリメラーゼの対応するアミノ末端部分
及び／又はカルボキシ末端部分に対して、80％より高い
配列同一性を有する。別の態様において、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラDNAポリメ
ラーゼ中の中央部分は、サーモトガ・スピーシーズ由来
のポリメラーゼに由来する。別の態様において、弱化
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラDNA
ポリメラーゼ中の中央部分は、サーモトガ・スピーシー
ズ由来の対応するポリメラーゼに対して、80％より高い
が100％未満の配列同一性を有する。別の態様におい
て、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキ
メラDNAポリメラーゼ中のアミノ部分及びカルボキシ部
分は、サーマス・スピーシーズ由来のポリメラーゼに由
来し、中央部分は、サーモトガ・スピーシーズに由来す
る。別の態様において、弱化３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性を有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、サ
ーマス・スピーシーズは、サーマス・エスピーZ05であ
り、サーモトガ・スピーシーズは、サーモトガ・マリテ
ィマである。別の態様において、熱安定性キメラ又は熱
活性キメラDNAポリメラーゼは、図中で示される一つ以
上の変異によって修飾される、Figure 6のアミノ酸配列
（配列番号：130）を含有する。別の態様において、キ
メラ熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、図中で示
される一つ以上の変異によって修飾されるFigure 7（配
列番号：148）のアミノ酸配列を含有する。

【手続補正１０】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６４】別の側面において、下記実施例3の標準ア
ッセイを用いて測定すると、約6.5U／pmol以下であるが
0U／pmolより高い弱化３’−５’活性を示す本発明の単
離された熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼは、非修
飾Tma DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインに対して、約80％より高いが100％未満の配
列同一性を有する。一つの態様において、下記実施例3
の標準アッセイを用いて測定すると、約6.5U／pmol以下
であるが0U／pmolより高い弱化３’−５’活性を示す本
発明の単離された熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼ
は、非修飾Tma DNAポリメラーゼに対して、約80％を超
えるが100％には満たない配列同一性を有する。非修飾T
ma DNAポリメラーゼのアミノ酸配列は、例えば、Figure
1Aのアミノ酸配列（配列番号：85）を含有しうる。

【手続補正１１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６５】別の側面において、下記実施例3の標準ア
ッセイを用いて測定すると、約6.5U／pmol以下であるが
0U／pmolより高い弱化３’−５’活性を示す本発明の単
離された熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、非修
飾Tne DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインに対して、約80％より高いが100％未満の配
列同一性を有する。一つの態様において、非修飾Tne DN
Aポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメイ
ンは、Figure 2において示される配列（配列番号：88）
を含有する。別の態様において、下記実施例3の標準ア
ッセイを用いて測定すると、約6.5U／pmol以下であるが
0U／pmolより高い弱化３’−５’活性を示す本発明の単
離された熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、非修
飾Tne DNAポリメラーゼに対して、約80％より高いが100
％未満の配列同一性を有する。非修飾Tne DNAポリメラ
ーゼのアミノ酸配列は、例えば、米国特許第5,948,614
号に提供されたTneポリメラーゼのアミノ酸配列を含有
しうる。

【手続補正１２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６６】別の側面において、下記実施例3の標準ア
ッセイを用いて測定すると、約6.5U／pmol以下であるが
0U／pmolより高い弱化３’−５’活性を示す本発明の単
離された熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼは、非修
飾Taf DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメインに対して、約80％より高いが100％未満の配
列同一性を有する。一つの態様において、非修飾Taf DN
Aポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメイ
ンは、Figure 3に示される配列（配列番号：89）を含有
する。別の態様において、下記実施例3の標準アッセイ
を用いて測定すると、約6.5U／pmol以下であるが0U／pm
olより高い弱化３’−５’活性を示す本発明の単離され
た熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、非修飾Taf D
NAポリメラーゼに対して、約80％より高いが100％未満
の配列同一性を有する。非修飾TafDNAポリメラーゼのア
ミノ酸配列は、例えば、米国特許第5,968,799号に提供
されるTaf DNAポリメラーゼのアミノ酸配列を含有しう
る。

【手続補正１３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６７】別の側面において、本発明は、３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性 U／pmolに対する５’−３’
ポリメラーゼ活性 U／pmolの比率が、両方の酵素活性
を下記実施例3に記載のように測定すると、約1から100
であり、そして、この３’−５’エキソヌクレアーゼド
メインは、非修飾Tma DNAポリメラーゼの３’−５’エ
キソヌクレアーゼドメインに対して、約80％より高いが
100％未満の配列同一性を有する、弱化３’−５’活性
を示す３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを有す
る、単離された熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼを
提供する。一つの態様において、本発明は、３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性 U／pmolに対する５’−３’
ポリメラーゼ活性 U／pmolの比率が、両方の酵素活性
を、下記実施例3に記載にように測定すると、約1から10
0である、非修飾Tma DNAポリメラーゼに対して、約80％
より高いが100％未満の配列同一性を有する、単離され
た熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼを提供する。非
修飾Tma DNAポリメラーゼのアミノ酸配列は、例えば、F
igure 1Aのアミノ酸配列（配列番号：85）を含有しう
る。

【手続補正１４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６８】別の側面において、本発明の単離された熱
安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメインを有し、弱化３’−５’活性を
示すものであり、ここで、３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性 U／pmolに対する５’−３’ポリメラーゼ活性
U／pmolの比率が、両方の酵素活性を、下記実施例3に
記載のように測定すると、約1から100であり、該３’−
５’エキソヌクレアーゼドメインが、非修飾T ne DNAポ
リメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメインに
対して、約80％より高いが100％未満の配列同一性を有
するものである。一つの態様において、非修飾Tne DNA
ポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン
は、Figure 2（配列番号：88）に示される配列を含有す
る。別の態様において、本発明の単離された熱安定性又
は熱活性DNAポリメラーゼは弱化３’−５’活性を示す
ものであり、ここで、３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性U／pmolに対する５’−３’ポリメラーゼ活性 U／pm
olの比率は、実施例3に記載の評価法を用いて測定する
と、約1から100であり、該ポリメラーゼは、非修飾Tne
DNAポリメラーゼに対して、約80％より高いが100％未満
の配列同一性を有する。非修飾Tne DNAポリメラーゼの
アミノ酸配列は、例えば、米国特許第5,948,614号に提
供されたTneポリメラーゼのアミノ酸配列を含有しう
る。

【手続補正１５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６９】別の側面において、本発明の単離された熱
安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメインを有し、弱化３’−５’活性を
示すものであり、ここで、実施例3に記載の評価法を用
いて測定すると、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性
U／pmolに対する５’−３’ポリメラーゼ活性 U／pmol
の比率が、約1から100であり、該３’−５’エキソヌク
レアーゼドメインは、非修飾Taf DNAポリメラーゼの
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインに対して、約80
％より高いが100％未満の配列同一性を有する。一つの
態様において、非修飾Taf DNAポリメラーゼの３’−
５’エキソヌクレアーゼドメインは、Figure3に示され
る配列（配列番号：89）を含有する。別の態様におい
て、単離された本発明の熱安定性又は熱活性 DNAポリメ
ラーゼは、弱化３’−５’活性を示すものであり、ここ
で、下記実施例3で記載される評価法を用いて測定する
と、５’−３’ポリメラーゼ活性 U／pmolの３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性 U／pmolに対する比率
は、1から100であり、該ポリメラーゼは、米国特許第5,
968,799号に提供されるTaf DNAポリメラーゼのアミノ酸
配列を含有した非修飾Taf DNAポリメラーゼに対して、
約80％より高いが100％未満の配列同一性を有する。

【手続補正１６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１５

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１１５】本発明の別の側面において、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活
性DNAポリメラーゼは、Tma DNAポリメラーゼに由来す
る。本発明の一態様において、弱化３’−５’エキソヌ
クレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活性DNAポリメ
ラーゼは、Tmaの３’−５’エキソヌクレアーゼドメイ
ンを含む、サーマス（Thermus）／サーモトガ(Thermoto
ga)のキメラDNAポリメラーゼに由来する。Tma DNAポリ
メラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有す
る熱安定性で熱活性のDNAポリメラーゼである。米国特
許第5,624,833号及び第5,374,553号参照。Figure １に
示したTma DNAポリメラーゼの約292番目から484番目ま
でのアミノ酸残基が３’−５’エキソヌクレアーゼドメ
インを含む。別の態様において、本発明の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼは、Tma DNAポリメラーゼの３’
−５’エキソヌクレアーゼドメインに一個以上の変異を
有する。別の態様において、変異型Tma DNAポリメラー
ゼは、L329に変異を有する。別の態様において、前記変
異は、L329Aである。別の態様において、変異型Tma DNA
ポリメラーゼはD389に変異を有する。別の態様におい
て、前記変異は、D38 9Eである。別の態様において、変
異型Tma DNAポリメラーゼは、Q384に変異を有する。別
の態様において、前記変異は、Q384Aである。別の態様
において、変異型Tma DNAポリメラーゼはN385に変異を
有する。別の態様において、前記変異は、N385Aであ
る。別の態様において、変異型Tma DNAポリメラーゼ
は、Q384及びN385に変異を有する。別の態様において、
前記変異は、Q384A N385Aである。

【手続補正１７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２５

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１２５】Tma DNAポリメラーゼに関して上述した各
タイプの変異及び修飾を他の熱安定性又は熱活性DNAポ
リメラーゼに導入して、本発明の変異型熱安定性又は熱
活性DNAポリメラーゼを作出することができる。DNAポリ
メラーゼは、アミノ酸配列のアラインメントに基づい
て、大腸菌（E. coli）のDNAポリメラーゼI、II、及びI
IIとの相同性によってA、B、及びCと名付けられたファ
ミリーに分類されている。例えば、その全体が参照によ
り本明細書に取り込まれる、Itoら、Nucl. AcidsRes.,
19:4045-47参照。サーモトガ属及びサーマス属の種のDN
Aポリメラーゼは、ファミリーAのDNAポリメラーゼに属
し、このファミリーは、大腸菌DNAポリメラーゼIも含ん
でいる。ファミリーAのDNAポリメラーゼで保存されてい
るアミノ酸が同定されている。Tma DNAポリメラーゼの
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインの領域のアミノ
酸配列と他のファミリーAのDNAポリメラーゼのアミノ酸
配列とのアラインメントをFigure 8（配列番号:172〜18
7）に示す。ファミリーAのDNAポリメラーゼの間でアミ
ノ酸が保存されているため、大腸菌DNAポリメラーゼIや
Tma DNAポリメラーゼなど一つのDNAポリメラーゼにおけ
る３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に影響を与えるア
ミノ酸を同定し、本明細書が提供する開示内容と併せる
ことによって、配列アラインメントに基づいて、３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性に影響を与えるアミノ酸を
他のファミリーA DNAポリメラーゼで同定することが可
能になる。保存されている配列モチーフ、Exo I、Exo I
I、ExoIIa、及びExo IIIをFigure 8に示す。したがっ
て、一つの態様において、本発明は、弱化３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性を有する変異型熱安定性又は熱活
性ファミリーAのDNAポリメラーゼを提供する。別の態様
において、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有
する熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、ExoI、Exo
II、Exo IIa、又はExo IIIに変異を有する。別の態様
において、この変異はExo I、Exo II、又はExo IIIに存
する。

【手続補正１８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３２

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１３２】２．本発明のキメラタンパク質別の側面に
おいて、本発明は、第一のDNAポリメラーゼのアミノ末
端部分に由来するアミノ末端部分と第二のDNAポリメラ
ーゼに由来するカルボキシ末端部分とを含有した、弱化
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラ熱安
定性又は熱活性DNAポリメラーゼを提供する。一つの態
様において、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
有するキメラDNAポリメラーゼは、第一の熱安定性又は
熱活性DNAポリメラーゼのアミノ末端部分に由来するア
ミノ末端部分と第二の熱安定性又は熱活性DNAポリメラ
ーゼに由来するカルボキシ末端部分とを含有し、該第二
のポリメラーゼは、好ましくは、３’−５’エキソヌク
レアーゼ活性を示すものである。別の態様では、弱化
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラDNA
ポリメラーゼにおいて、該アミノ末端及び/又はカルボ
キシ末端部分がサーマス・スピーシーズ由来のDNAポリ
メラーゼに由来する。別の態様では、弱化３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性を有するキメラDNAポリメラーゼ
において、該アミノ末端及び/又はカルボキシ末端部分
がサーモトガ・スピーシーズ由来のDNAポリメラーゼに
由来する。別の態様では、弱化３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性を有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、
アミノ末端及び/又はカルボキシ末端部分がサーマス・
スピーシーズ由来のDNAポリメラーゼに由来し、もう一
方の末端部分がサーモトガ・スピーシーズ由来のDNAポ
リメラーゼに由来する；例えば、一つの態様において、
アミノ末端部分がサーマス・スピーシーズ由来のDNAポ
リメラーゼに由来し、カルボキシ末端部分がサーモトガ
・スピーシーズ由来のDNAポリメラーゼに由来する。別
の態様では、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、アミノ末端部
分が、サーマス・スピーシーズ由来で、５’−３’エキ
ソヌクレアーゼドメインを含有し、カルボキシ末端部分
が、サーモトガ・スピーシーズ由来で、３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメインとポリメラーゼドメインとを含
有する。別の態様では、弱化３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性を有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、ア
ミノ末端部分が、サーマス・スピーシーズ由来で５’−
３’エキソヌクレアーゼドメインを含有し、サーマス・
スピーシーズ由来のDNAポリメラーゼの対応するアミノ
末端部分と約80％よりも高い配列同一性を示し、カルボ
キシ末端部分が、サーモトガ・スピーシーズ由来のDNA
ポリメラーゼの対応するカルボキシ末端部分と約80％よ
りも高い配列同一性を示す。別の態様において、該サー
マス・スピーシーズはサーマス・スピーシーズZ05株（T
hermus sp. Z05）であり、該サーモトガ・スピーシーズ
はサーモトガ・マリティマである。別の態様において、
キメラ熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼは、図に示
した一個以上の変異によって改変されたFigure 4のアミ
ノ酸配列を含有する。別の態様において、キメラ熱安定
性又は熱活性DNAポリメラーゼは、図に示した一個以上
の変異によって改変されたFigure 5のアミノ酸配列を含
有する。別の態様において、弱化３’−５’エキソヌク
レアーゼ活性を有するキメラ熱安定性又は熱活性DNAポ
リメラーゼは、アミノ末端部分、中央部分、及びカルボ
キシ末端部分を含む。別の態様では、弱化３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性を有するキメラDNAポリメラーゼ
において、アミノ末端部分が５’−３’エキソヌクレア
ーゼドメインを含有する。別の態様では、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラDNAポリメ
ラーゼにおいて、中央部分が３’−５’エキソヌクレア
ーゼドメインを含有する。別の態様では、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラDNAポリメ
ラーゼにおいて、カルボキシ末端部分が３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメインを含有する。別の態様では、弱
化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラDN
Aポリメラーゼにおいて、アミノ末端部分及び/又はカル
ボキシ末端部分が、サーマス・スピーシーズ由来のポリ
メラーゼの対応するアミノ末端部分及び/又はカルボキ
シ末端部分に対し80％よりも高い配列同一性を示す。別
の態様では、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、中央部分がサ
ーモトガ・スピーシーズ由来のポリメラーゼに由来す
る。別の態様では、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ
活性を有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、中央部
分が、サーモトガ・スピーシーズ由来の対応するポリメ
ラーゼに、80％よりも高いが100％未満の低い配列一致
率を示す。別の態様では、弱化３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性を有するキメラDNAポリメラーゼにおいて、
アミノ末端部分及びカルボキシ末端部分がサーマス・ス
ピーシーズ由来のDNAポリメラーゼに由来し、中央部分
がサーモトガ・スピーシーズに由来する。別の態様で
は、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するキ
メラDNAポリメラーゼにおいて、該サーマス・スピーシ
ーズがサーマス・スピーシーズZ05株であり、該サーモ
トガ・スピーシーズがサーモトガ・マリティマである。
別の態様において、キメラ熱安定性又は熱活性DNAポリ
メラーゼが、図に示した一個以上の変異によって改変さ
れたFigure 6のアミノ酸配列を含有する。別の態様にお
いて、キメラ熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼが、
図に示した一個以上の変異によって改変されたFigure 7
のアミノ酸配列を含有する。

【手続補正１９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３９

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１３９】本発明の別の側面において、Tma DNAポリ
メラーゼに由来する領域の最初のアミノ酸は、サーマス
・スピーシーズのDNAポリメラーゼ配列の最後のアミノ
酸に対応するアミノ酸につづくアミノ酸から始まり、残
りのTma DNAポリメラーゼ配列（893番目のアミノ酸ま
で）を含有する。全長Tma DNAポリメラーゼのアミノ酸
配列をFigure 1Aに示す（配列番号:85）。好ましくは、
サーマス・スピーシーズのDNAポリメラーゼに由来する
アミノ酸配列は、Tma DNAポリメラーゼに由来するアミ
ノ酸配列に、この二つのアミノ酸配列が一致又は類似す
るアミノ酸配列の位置で結合する。例えば、一つの態様
は、Taq DNAポリメラーゼの1〜190番目のアミノ酸、及
びTma DNAポリメラーゼの191〜893番目のアミノ酸から
なる。Tma DNAポリメラーゼの190番目のアミノ酸はTaq
DNAポリメラーゼ190番目のアミノ酸に対応し、キメラ酵
素のTma DNAポリメラーゼ部分は、次のアミノ酸である1
91番目のアミノ酸から始まる。

【手続補正２０】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２０７

【補正方法】変更

【補正内容】

【０２０７】第１ラウンドの変異導入では、部位特異的
変異導入アプローチを用いて熱安定性DNAポリメラーゼ
内の残基であって、クレノウフラグメントのプルーフリ
ーディングドメインの活性部位に二価金属カチオンを配
位させるのに重要なことが知られている相同的残基か、
相同的残基の間にある残基を変更した。その全体が参照
により本明細書に取り込まれるDerbyshireら、1995、Me
thods in Enzymology262:363-85を参照のこと。変異型
キメラ熱安定性DNAポリメラーゼCS6をコードするプラス
ミドpCS6を用いた。Figure 5参照。CS6は、キメラ熱安
定性DNAポリメラーゼCS5の変異型である。Figure ４参
照。CS5のN-末端部分は、サーマス・スピーシーズZ05に
由来するDNAポリメラーゼのN-末端側291個の残基であっ
て、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性をコードする部
分である。米国特許第6,228,628号参照。CS5の残部は、
Tma DNAポリメラーゼに由来するC-末端側602残基であ
り、その３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とそのDNA
ポリメラーゼ活性とを含有する。CS6は、３’−５’エ
キソヌクレアーゼドメインにおいて、D323A及びE325A変
異（別段の記載がない限り、野生型Tma酵素の残基番号
を終始に使用する）を有する以外はCS5と同一である。
本明細書に示すように、これらの変異によって、CS6は
検出可能な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持たな
くなった。

【手続補正２１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２４２

【補正方法】変更

【補正内容】

【０２４２】GENEAMP^TM（ジーンアンプ）5700SDSサーモ
サイクラー〔PEバイオシステムズ社（PE Biosystem
s）、Foster City CA〕を下記サーモサイクリングプロ
トコール：50℃で2分間、60℃で60分間及び95℃で1分間
の後、95℃で20秒間と、58℃で15秒間と、65℃で1分45
秒間とを４サイクル、その後90℃で20秒間と、58℃で15
秒間と、65℃で1分45秒間とを３６サイクル、その後65
℃で10分間保温、で用いた。PCR増幅の増加曲線をFigur
e 9に示す。同じプロトコールを用い、さまざまな量の
酵素による増幅を行ない、ゲル電気泳動を用いて解析し
た。PCRを行なった後、各100μlの反応液から5μlを1％
アガロースゲルに負荷し、本質的には、Sambrookら、Mo
lecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring
Harbor、1989、第2版に記載されるように泳動した。エ
チジウムブロマイドの1μg/ml溶液を用いてゲルを染色
した。得られたゲルをFigure 10に示す。Figure 10にお
いて、レーン20、40、及び48=分子量マーカーであるBst
II消化したラムダDNA〔ニューイングランド・バイオラ
ボズ社（New England Biolabs）、Beverly, MA〕；レー
ン36〜38及び58〜60=陰性対照（5 UのCS5, 125UのCS6、
鋳型なし）；レーン33〜35及び55〜57=陽性対照（5 Uの
CS5, 125UのCS6）；レーン1〜3=60 UのY464A CS5；レー
ン4〜6=30UのY464A CS5；レーン7〜9=60 UのD389E CS
5；レーン10〜12=30UのD389E CS5；レーン13〜15=60 U
のL329A CS5；レーン16〜18=30 UのL329A CS5；レーン2
1〜23=60 UのQ384A-N385A CS5；レーン24〜26=30 UのQ3
84A-N385A CS5；レーン27〜29=60 UのQ384A CS5；レー
ン30〜32=30 UのQ384A CS5；レーン41〜43=60 UのN385A
CS5；レーン44〜46=30 UのN385A CS5；レーン49〜51=6
0 UのL324Q CS5；レーン52〜54=30 UのL329Q CS5（ここ
で、すべてのユニット数はDNAポリメラーゼ活性を表
す）。

【手続補正２２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２４３

【補正方法】変更

【補正内容】

【０２４３】変異型酵素を、それらのC_T値（Figure 9）
と、それらの特異的及び非特異的増幅産物の収率とによ
って判断し、増幅産物のゲル解析を用いて検出した（Fi
gure10）。これらの結果は、（実施例3に記載した標準
アッセイを用いて測定すると）野生型レベルの3％より
も高いが20％未満のプルーフリーディング活性を有する
変異体が、1.7kbのHIV RNA鋳型の逆転写によるPCR増幅
でうまく機能することを実証する。また、これらの変異
体は、0.4〜1.6U/pmolの比活性をもち、また、実施例3
に記載されたようにして酵素活性を測定すると、３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性に対するポリメラーゼ活性
の比率が6.0U pol/U exoよりも大きいが、25.0U pol/U
exoよりも低く、得られたPCRの結果は、CS5とCS6との混
合物で得られた結果に匹敵するものであった。Q384A CS
5とN385A CS5も、それらの増幅産物をゲル解析したとこ
ろうまく機能したが、それらのC_T値によって判断した場
合には同じようではなかった。

【手続補正２３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２４５

【補正方法】変更

【補正内容】

【０２４５】XSAEプログラム（Higginsら、1992，Cabio
s 8, 189-91参照）の「3D>配列接触（3D>sequence cont
acts）」特性を用いて、３’−５’エキソヌクレアーゼ
部分においてDNAと複合した大腸菌Pol IのX線構造（Bra
utiganら、1998、J. Mol. Biol. 277: 363-77参照）を
解析して、DNA基質（1kfs.pdb, B鎖）の5A内にある選択
したタンパク質（Pol I; 1kfs.pdb, A鎖）の残基すべて
を同定した。この方法を用いて、表8中の残基を大腸菌P
ol Iにおいて同定した。ポリメラーゼの配列アラインメ
ントを調べることによって（例えば、Figure 8に示すよ
うにして）、熱安定性又は熱活性ファミリーA DNAポリ
メラーゼにおける類似残基を同定することができる。次
に、これらの候補残基を変異させてから、例えば、実施
例3に記載された標準アッセイを用いて、弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を調べることができる。

【手続補正２４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２４８

【補正方法】変更

【補正内容】

【０２４８】Figure 11は、ファミリーB DNAポリメラー
ゼである大腸菌のPol II DNAポリメラーゼを、多くの別
のファミリーB DNAポリメラーゼとアラインメントした
図である。これらのタンパク質の全部又は殆ど全部で保
存される残基を、それらの保存がプルーフリーディング
機能にとって重要であることを示すという仮定に基づい
て単純に同定するのではなく、むしろバクテリオファー
ジRB69（Shamooら、1999、Cell 99:155-66; 構造はプロ
テインデータバンク（Bermanら、2000、Nucleic Acids
Res. 28:235-42; www.pdb.org/）からPDB識別番号1CLQ
として利用可能である）から単離したファミリーB DNA
ポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン
の三次元構造を調べて、Tmaのプルーフリーディングド
メインと比較した。これらのタンパク質のそれぞれにお
いて、プルーフリーディングドメインに結合した一本鎖
DNA配列の３’末端ヌクレオチドと接触すると推定され
た残基のすべてを同定した。この情報と、Figure 11の
配列アラインメントとを用いて、下記の表9に示すよう
に他のファミリーB DNAポリメラーゼにおける類似残基
を同定した。これらのデータは、これら特定の位置にお
ける変異が、弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
有するDNAポリメラーゼ分子をもたらすことを示す。

【手続補正２５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】Figure 1Aは、サーモトガ・マリティマ(Tma) D
NAポリメラーゼのアミノ酸配列(配列番号：85）を示
す。３’−５’エキソヌクレアーゼドメインは、およそ
292から487番目のアミノ酸残基（配列番号：86）の範囲
内に位置し、これらの残基には下線が付与されている。

【図２】Figure 1Bは、Figure 1Aのアミノ酸配列をコー
ドする核酸配列（配列番号：87）を示す。

【図３】Figure 1Bは、Figure 1Aのアミノ酸配列をコー
ドする核酸配列（配列番号：87）を示す。

【図４】Figure 2は、サーモトガ・ネアポリタナ(Tne)
DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメ
インの領域のアミノ酸配列（配列番号：88）を示す。

【図５】Figure 3は、サーモシフォ・アフリカヌス(Ta
f) DNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼド
メインの領域のアミノ酸配列（配列番号：89）を示す。

【図６】Figure 4Aは、キメラ熱安定性DNAポリメラーゼ
CS5のアミノ酸配列（配列番号：90）を示す。３’−
５’エキソヌクレアーゼドメインは、およそ292から487
番目の残基まで広がり、これらの残基には下線が付与さ
れている（配列番号：91）。1-291番目の残基（配列番
号：92）はZ05 DNAポリメラーゼに由来し、そして矢印
で示される292-893番目の残基（配列番号：93）は、Tma
DNAポリメラーゼに由来する。第二ラウンドの変異誘発
の際に導入されるアミノ酸残基の置換を、置換される残
基の真上に表しており、それらを太字で示す：L329A
（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番号：
94；タンパク質全体、配列番号：95）、Q384A（３’−
５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番号：96；タン
パク質全体、配列番号：97）、N385A（３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメイン、配列番号：98；タンパク質全
体、配列番号：99）、Q384A N385A（３’−５’エキソ
ヌクレアーゼドメイン、配列番号：100；タンパク質全
体、配列番号：101）、D389E（３’−５’エキソヌクレ
アーゼドメイン、配列番号：102；タンパク質全体、配
列番号：103）及びY464A（３’−５’エキソヌクレアー
ゼドメイン、配列番号：104；タンパク質全体、配列番
号：105)。

【図７】Figure 4Bは、CS5をコードする核酸配列（配列
番号：106）を示す。

【図８】Figure 4Bは、CS5をコードする核酸配列（配列
番号：106）を示す。

【図９】Figure 5Aは、キメラ熱安定性DNAポリメラーゼ
CS6のアミノ酸配列（配列番号：107）を示す。３’−
５’エキソヌクレアーゼドメインは、およそ292から487
番目の残基まで広がり、これらの残基には下線が付与さ
れている（配列番号：108）。1-291番目の残基（配列番
号：109）はZ05 DNAポリメラーゼに由来し、323-325番
目の残基が既に配列ALAで置換されていることを除い
て、矢印で示される292-893番目の残基（配列番号：11
0）はTma DNAポリメラーゼに由来する。一順目の突然変
異誘発の際に導入されるアミノ酸残基の置換を、置換さ
れる残基の真上に表しており、それらを太字で示す：DE
E（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番
号：111；タンパク質全体、配列番号：112）、DDE
（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番号：
113；タンパク質全体、配列番号：114）、DKE（３’−
５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番号：115；タ
ンパク質全体、配列番号:116）、DNE（３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメイン、配列番号：117；タンパク質
全体、配列番号：118）、DQE（３’−５’エキソヌクレ
アーゼドメイン、配列番号：119；タンパク質全体、配
列番号：120）、DHE（３’−５’エキソヌクレアーゼド
メイン、配列番号：121；タンパク質全体、配列番号：1
22）、DLD（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、
配列番号：123；タンパク質全体、配列番号：124）、EL
D（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番
号：125；タンパク質全体、配列番号：126）、ELE
（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番号：
127；タンパク質全体、配列番号：128）。

【図１０】Figure 5Bは、CS6をコードする核酸配列（配
列番号：129）を示す。

【図１１】Figure 5Bは、CS6をコードする核酸配列（配
列番号：129）を示す。

【図１２】Figure 6Aは、キメラ熱安定性DNAポリメラー
ゼCS7のアミノ酸配列（配列番号：130）を示す。３’−
５’エキソヌクレアーゼドメインはおよそ残基292から
残基487程度まで広がり、これらの残基には下線が付与
されている（配列番号：131）。1-291番目の残基（配列
番号：132）及び残基485-894（配列番号：133）はZ05 D
NAポリメラーゼに由来し、そして矢印で示されるよう
に、292-484番目の残基（配列番号：134）はTma DNAポ
リメラーゼに由来する。第二ラウンドの突然変異誘発の
際にCS5内に導入される、これらと類似するアミノ酸残
基の置換を、置換される残基の上に直接現しており、そ
れらを太字で示す：L329A（３’−５’エキソヌクレア
ーゼドメイン、配列番号：135；タンパク質全体、配列
番号：136）、Q384A（３’−５’エキソヌクレアーゼド
メイン、配列番号：137；タンパク質全体、配列番号：1
38）、N385A（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイ
ン、配列番号：139；タンパク質全体、配列番号：14
0）、Q384A N385A（３’−５’エキソヌクレアーゼドメ
イン、配列番号：141；タンパク質全体、配列番号：14
2）、D389E（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、
配列番号：143；タンパク質全体、配列番号：144）及び
Y464A（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列
番号：145；タンパク質全体、配列番号：146）。

【図１３】Figure 6Bは、CS7をコードする核酸配列（配
列番号：147）を示す。

【図１４】Figure 6Bは、CS7をコードする核酸配列（配
列番号：147）を示す。

【図１５】Figure 7Aは、キメラ熱安定性DNAポリメラー
ゼCS8のアミノ酸配列（配列番号：148）を示す。３’−
５’エキソヌクレアーゼドメインはおよそ292から487番
目の残基まで広がり、これらの残基には下線が付与され
ている（配列番号：149 ）。残基1-291（配列番号：15
0）及び残基485-894（配列番号：151）はZ05 DNAポリメ
ラーゼに由来し、323-325番目の残基が既に配列ALAで置
換されていたことを除いて、矢印で示されるように、29
2-484番目の残基（配列番号：152）はTmaDNAポリメラー
ゼに由来する。第二ラウンドのCS5の変異誘発の際に導
入される、これらと類似するアミノ酸残基の置換を、置
換される残基の真上に表しており、それらを太字で示
す：DEE（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配
列番号：153；タンパク質全体、配列番号：154）、DDE
（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番号：
155；タンパク質全体、配列番号：156）、DKE（３’−
５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番号：157；タ
ンパク質全体、配列番号：158）、DNE（３’−５’エキ
ソヌクレアーゼドメイン、配列番号：159；タンパク質
全体、配列番号：160）、DQE（３’−５’エキソヌクレ
アーゼドメイン、配列番号：161；タンパク質全体、配
列番号：162）、DHE（３’−５’エキソヌクレアーゼド
メイン、配列番号：163；タンパク質全体、配列番号：1
64）、DLD（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、
配列番号：165；タンパク質全体、配列番号：166）、EL
D（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番
号：167；タンパク質全体、配列番号：168）、ELE
（３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番号：
169；タンパク質全体、配列番号：170）。

【図１６】Figure 7Bは、CS8（配列番号：171）をコー
ドする核酸配列を示す。

【図１７】Figure 7Bは、CS8（配列番号：171）をコー
ドする核酸配列を示す。

【図１８】Figure 8は、Eco DNAポリメラーゼの３’−
５’エキソヌクレアーゼドメインの領域のアミノ酸配列
と、他のファミリーAのDNAポリメラーゼのそれとの配列
比較を示す：Tth （配列番号：172）、Tca（配列番号：
173）、Z05（配列番号：174）、Taq（配列番号：17
5）、Tfl（配列番号：176）、Tfi（配列番号：177）、S
ps17（配列番号：178）、Dra（配列番号：179）、HSP-B
-7（配列番号：180）、Bst（配列番号：181）、Bca（配
列番号：182）、E. coli（配列番号：183）、Tma（配列
番号：184）、Tne（配列番号：185）、Taf（配列番号：
186）、HSP-A（配列番号：187）。Exo I（配列番号：20
3）、Exo II（配列番号：188）、Exo IIa（配列番号：1
89）及びExo III（配列番号：190）モチーフはTmaを配
列中、太字で示す。

【図１９】Figure 9Aは、本発明の変異型DNAポリメラー
ゼを用いた、逆転写酵素／1.7kbのHIVの鋳型のPCR増幅
の増加曲線を示す。

【図２０】Figure 9Bは、本発明の変異型DNAポリメラー
ゼを用いた、逆転写酵素／1.7kbのHIVの鋳型のPCR増幅
の増加曲線を示す。

【図２１】Figure 10は、Figure 9のPCR増幅の逆転写酵
素の増幅産物の電気泳動解析の写真を示す。

【図２２】Figure 11は、Eco Pol IIファミリーBのDNA
ポリメラーゼと、他のファミリーBの多数のDNAポリメラ
ーゼとの配列アラインメントを示す（配列番号：191-20
2）。

【図２３】Figure 11は、Eco Pol IIファミリーBのDNA
ポリメラーゼと、他のファミリーBの多数のDNAポリメラ
ーゼとの配列アラインメントを示す（配列番号：191-20
2）。

【図２４】Figure 11は、Eco Pol IIファミリーBのDNA
ポリメラーゼと、他のファミリーBの多数のDNAポリメラ
ーゼとの配列アラインメントを示す（配列番号：191-20
2）。

【図２５】Figure 11は、Eco Pol IIファミリーBのDNA
ポリメラーゼと、他のファミリーBの多数のDNAポリメラ
ーゼとの配列アラインメントを示す（配列番号：191-20
2）。

【図２６】Figure 11は、Eco Pol IIファミリーBのDNA
ポリメラーゼと、他のファミリーBの多数のDNAポリメラ
ーゼとの配列アラインメントを示す（配列番号：191-20
2）。

【図２７】Figure 11は、Eco Pol IIファミリーBのDNA
ポリメラーゼと、他のファミリーBの多数のDNAポリメラ
ーゼとの配列アラインメントを示す（配列番号：191-20
2）。

【図２８】Figure 11は、Eco Pol IIファミリーBのDNA
ポリメラーゼと、他のファミリーBの多数のDNAポリメラ
ーゼとの配列アラインメントを示す（配列番号：191-20
2）。

【図２９】Figure 11は、Eco Pol IIファミリーBのDNA
ポリメラーゼと、他のファミリーBの多数のDNAポリメラ
ーゼとの配列アラインメントを示す（配列番号：191-20
2）。

【図３０】Figure 11は、Eco Pol IIファミリーBのDNA
ポリメラーゼと、他のファミリーBの多数のDN Aポリメ
ラーゼとの配列アラインメントを示す（配列番号：191-
202）。

【手続補正２６】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図４】

【図３】

【図５】

【図６】

【図７】

【図１２】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図３０】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ナンシージェイ．シェーンブルンナーアメリカ合衆国カリフォルニア 94556 モラガ，クロスブルックドライブ 746 (72)発明者トーマスダブリュ．マイヤーズアメリカ合衆国カリフォルニア 94501 アラミダ，ファーンサイドブールバール 2910 (72)発明者デービッドエイチ．ゲルフランドアメリカ合衆国カリフォルニア 94611 オークランド，チェルトンドライブ 6208 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA10 CA02 DA06 EA04 HA01 4B050 CC05 DD02 FF09E FF14E LL10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記配列モチーフ： (a) 式DX₁EX₂X₃SX₄ （式中、Dは、アスパラギン酸残基であり、X₁は、任意
のアミノ酸残基であるか、残基なしであり、Eは、グル
タミン酸残基であり、X₂は、任意のアミノ酸残基であ
り、X₃は、任意のアミノ酸残基であり、Sは、セリン残
基であり、X₄は、任意のアミノ酸残基である）を有する
配列モチーフ、又は (b) 式X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (配列番号：1) （式中、X₅は、任意のアミノ酸残基であり、X₆は、任意
のアミノ酸残基であり、X₇は、システイン残基若しくは
ロイシン残基であり、X₈は、任意のアミノ酸残基であ
り、X₉は、フェニルアラニン残基若しくはチロシン残基
であり、X₁₀は、任意のアミノ酸残基であり、X₁₁は、任
意のアミノ酸残基であり、X₁₂は、任意のアミノ酸残基
であり、X₁₃は、イソロイシン残基若しくはバリン残基
であり、X₁₄は、ロイシン残基若しくはフェニルアラニ
ン残基である）を有する配列モチーフ、又は (c) 式DX₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉YX₂₀X₂₁X₂₂X₂₃ (配列番号：2) （式中、Dは、アスパラギン酸残基であり、X₁₅は、プロ
リン残基、アラニン残基、ロイシン残基若しくはスレオ
ニン残基であり、X₁₆は、ロイシン残基若しくはメチオ
ニン残基でありX₁₇は、ロイシン残基若しくはイソロイ
シン残基であり、X₁₈は、任意のアミノ酸残基であり、X
₁₉は、アラニン残基若しくはセリン残基であり、Yは、
チロシン残基であり、X₂₀は、ロイシン残基、イソロイ
シン残基若しくはバリン残基であり、X₂₁は、ロイシン
残基若しくはトリプトファン残基であり、X₂₂は、アス
パラギン酸残基、アスパラギン残基、グルタミン酸残基
若しくはグルタミン残基であり、X₂₃は、プロリン残基
若しくはセリン残基である）を有する配列モチーフ、又
は (d) 式X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅X₃₆ (配
列番号：3) （式中、X₂₄は、プロリン残基若しくはアラニン残基で
あり、X₂₅は、任意のアミノ酸残基であり、X₂₆は、グル
タミン酸残基、アスパラギン酸残基若しくはプロリン残
基であり、X₂₇は、リジン残基、アルギニン残基若しく
はグルタミン酸残基であり、X₂₈は、任意のアミノ酸残
基であり、X₂₉は、任意のアミノ酸残基であり、X₃₀は、
グルタミン酸残基、アルギニン残基若しくはアスパラギ
ン残基でありX₃₁は、任意のアミノ酸残基であり、X
₃₂は、セリン残基、アラニン残基若しくはシステイン残
基であり、X₃₃は、任意のアミノ酸残基であり、X₃₄は、
グルタミン酸残基若しくはスレオニン残基であり、X₃₅
は、任意のアミノ酸残基であり、X₃₆は、アラニン残基
である）を有する配列モチーフから選択された配列モチ
ーフを含有した３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン
を含有し、かつ標準アッセイを用いて測定した場合、約
6.5以下であるが0U/pmolより高い弱化３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性を呈する、単離された熱安定性又は熱
活性DNAポリメラーゼ。
【請求項２】下記配列モチーフ： (a) 式DX₁EX₂X₃SX₄ （式中、Dは、アスパラギン酸残基であり、X₁は、任意
のアミノ酸残基であるか、残基なしであり、Eは、グル
タミン酸残基であり、X₂は、任意のアミノ酸残基であ
り、X₃は、任意のアミノ酸残基であり、Sは、セリン残
基であり、X₄は、任意のアミノ酸残基である）を有する
配列モチーフ、又は (b) 式X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (配列番号：1) （式中、X₅は、任意のアミノ酸残基であり、X₆は、任意
のアミノ酸残基であり、X₇は、システイン残基若しくは
ロイシン残基であり、X₈は、任意のアミノ酸残基であ
り、X₉は、フェニルアラニン残基若しくはチロシン残基
であり、X₁₀は、任意のアミノ酸残基であり、X₁₁は、任
意のアミノ酸残基であり、X₁₂は、任意のアミノ酸残基
であり、X₁₃は、イソロイシン残基若しくはバリン残基
であり、X₁₄は、ロイシン残基若しくはフェニルアラニ
ン残基である）を有する配列モチーフ、又は (c) 式DX₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉YX₂₀X₂₁X₂₂X₂₃ (配列番号：2) （式中、Dは、アスパラギン酸残基であり、X₁₅は、プロ
リン残基、アラニン残基、ロイシン残基若しくはスレオ
ニン残基であり、X₁₆は、ロイシン残基若しくはメチオ
ニン残基であり、X₁₇は、ロイシン残基若しくはイソロ
イシン残基であり、X₁₈は、任意のアミノ酸残基であ
り、X₁₉は、アラニン残基若しくはセリン残基であり、Y
は、チロシン残基であり、X₂₀は、ロイシン残基、イソ
ロイシン残基若しくはバリン残基であり、X₂₁は、ロイ
シン残基若しくはトリプトファン残基であり、X₂₂は、
アスパラギン酸残基、アスパラギン残基、グルタミン酸
残基若しくはグルタミン残基であり、X₂₃は、プロリン
残基若しくはセリン残基である）を有する配列モチー
フ、又は (d) 式 X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅X₃₆
(配列番号：3) （式中、X₂₄は、プロリン残基若しくはアラニン残基で
あり、X₂₅は、任意のアミノ酸残基であり、X₂₆は、グル
タミン酸残基、アスパラギン酸残基若しくはプロリン残
基であり、X₂₇は、リジン残基、アルギニン残基若しく
はグルタミン酸残基であり、X₂₈は、任意のアミノ酸残
基であり、X₂₉は、任意のアミノ酸残基であり、X₃₀は、
グルタミン酸残基、アルギニン残基若しくはアスパラギ
ン残基であり、X₃₁は、任意のアミノ酸残基であり、X₃₂
は、セリン残基、アラニン残基若しくはシステイン残基
であり、X₃₃は、任意のアミノ酸残基であり、X₃₄は、グ
ルタミン酸残基若しくはスレオニン残基であり、X
₃₅は、任意のアミノ酸残基であり、X₃₆は、アラニン残
基である）を有する配列モチーフから選ばれた配列モチ
ーフを含有した３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン
を含有し、５’−３’ポリメラーゼ活性と弱化３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性とを有し、実施例３記載の
ように酵素活性を測定した場合、該３’−５’エキソヌ
クレアーゼ活性 U/pmolに対する該５’−３’ポリメラ
ーゼ活性 U/pmolの比率が、約100から1である、単離さ
れた熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼ。
【請求項３】下記配列モチーフ： (a) 式DX₁EX₂X₃SX₄, （式中、Dは、アスパラギン酸残基であり、X₁は、任意
のアミノ酸残基であるか、残基なしであり、Eは、グル
タミン酸残基であり、X₂は、任意のアミノ酸残基であ
り、X₃は、任意のアミノ酸残基であり、Sは、セリン残
基であり、X₄は、任意のアミノ酸残基である）を有する
配列モチーフ、又は (b) 式X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄ (配列番号：1) （式中、X₅は、任意のアミノ酸残基であり、X₆は、任意
のアミノ酸残基であり、X₇は、システイン残基若しくは
ロイシン残基であり、X₈は、任意のアミノ酸残基であ
り、X₉は、フェニルアラニン残基若しくはチロシン残基
であり、X₁₀は、任意のアミノ酸残基であり、X₁₁は、任
意のアミノ酸残基であり、X₁₂は、任意のアミノ酸残基
であり、X₁₃は、イソロイシン残基若しくはバリン残基
であり、X₁₄は、ロイシン残基若しくはフェニルアラニ
ン残基である）を有する配列モチーフ、又は (c) 式DX₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉YX₂₀X₂₁X₂₂X₂₃ (配列番号：2) （式中、Dは、アスパラギン酸残基であり、X₁₅は、プロ
リン残基、アラニン残基、ロイシン残基若しくはスレオ
ニン残基であり、X₁₆は、ロイシン残基若しくはメチオ
ニン残基であり、X₁₇は、ロイシン残基又はイソロイシ
ン残基であり、X₁₈は、任意のアミノ酸残基であり、X₁₉
は、アラニン残基若しくはセリン残基であり、Yは、チ
ロシン残基であり、X₂₀は、ロイシン残基、イソロイシ
ン残基若しくはバリン残基であり、X₂₁は、ロイシン残
基若しくはトリプトファン残基であり、X₂₂は、アスパ
ラギン酸残基であり、アスパラギン残基、グルタミン酸
残基若しくはグルタミン残基であり、X₂₃は、プロリン
残基若しくはセリン残基である）を有する配列モチー
フ、又は (d) 式X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅X₃₆ (配
列番号：3) （式中、X₂₄は、プロリン残基若しくはアラニン残基で
あり、X₂₅は、任意のアミノ酸残基であり、X₂₆は、グル
タミン酸残基、アスパラギン酸残基若しくはプロリン残
基であり、X₂₇は、リジン残基、アルギニン残基若しく
はグルタミン酸残基であり、X₂₈は、任意のアミノ酸残
基であり、X₂₉は、任意のアミノ酸残基であり、X₃₀は、
グルタミン酸残基、アルギニン残基若しくはアスパラギ
ン残基であり、X₃₁は、任意のアミノ酸残基であり、X₃₂
は、セリン残基、アラニン残基若しくはシステイン残基
であり、X₃₃は、任意のアミノ酸残基であり、X₃₄は、グ
ルタミン酸残基若しくはスレオニン残基であり、X
₃₅は、任意のアミノ酸残基であり、X₃₆は、アラニン残
基である）を有する配列モチーフから選ばれた配列モチ
ーフを含有した３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン
を含有し、標準アッセイを用いて測定した場合、修飾前
の熱安定性DNAポリメラーゼの約0.1から65%の３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有する、単離された修飾
熱安定性又は熱活性DNAポリメラーゼ。
【請求項４】非修飾Tma DNAポリメラーゼの３’−
５’エキソヌクレアーゼドメインに対し、約80%より高
いが100%未満の配列同一性を有した３’−５’エキソヌ
クレアーゼドメインを含有し、約6.5ユニット/pmol以下
であるが0ユニット/pmolより高い弱化３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性を呈する、単離された修飾熱安定性又
は熱活性DNAポリメラーゼ。