JP4685768B2 - Dnaポリメラーゼ活性を有するポリペプチド - Google Patents
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Description
現在知られているDNAポリメラーゼはそのアミノ酸配列の共通性から大きく4つのファミリーに分類することができ、中でもファミリーA(ポルI型酵素)とファミリーB(α型酵素)が大多数を占めている。それぞれのファミリーに属するDNAポリメラーゼは概ね類似した生化学的特性を有しているが、詳細に比較すると個々の酵素によって基質特異性、基質アナログの取込み、プライマー伸長性の強さ及び速度、DNA合成の様式、エキソヌクレアーゼ活性の付随、温度、pHなどの至適反応条件、また阻害剤に対する感受性などについて異なる性質を有している。したがってこれまで実験操作に応じてそれぞれ現存する中で最も適した性質を有するDNAポリメラーゼが選ばれ利用されている。
例えば、Pyrococcus furiosus(Pfu)由来DNAポリメラーゼ(例えば、特許文献1〜5参照)は、最も耐熱性の高いDNAポリメラーゼのひとつであり、校正(Proofreading)活性として知られる3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を持ち、耐熱性酵素の中でも高いFidelityを示す。しかしながら当該酵素は、伸長速度が遅く、processivityが低いため、PCRに使用すると増幅に時間がかかり、また長鎖は増幅できないという問題を有している。
即ち、
本発明の第1の発明は、
(a)配列表の配列番号16に記載のアミノ酸配列、
(b)配列表の配列番号24に記載のアミノ酸配列、又は
(c)配列表の配列番号32に記載のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列中の1ないしは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、置換したアミノ酸配列を有し、かつDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドに関する。
本発明の第2の発明の核酸は、配列表の配列番号15、23又は31に記載の塩基配列あるいはその一部を有する核酸であってもよく、更には該核酸に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であり、かつDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸であってもよい。
(a)配列表の配列番号16に記載のアミノ酸配列、
(b)配列表の配列番号24に記載のアミノ酸配列、又は
(c)配列表の配列番号32に記載のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列中の1ないしは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、置換したアミノ酸配列を有し、かつDNAポリメラーゼ活性を有する。
(a)配列表の配列番号16に記載のアミノ酸配列、
(b)配列表の配列番号24に記載のアミノ酸配列、又は
(c)配列表の配列番号32に記載のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列中の1ないしは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、置換したアミノ酸配列を有し、かつDNAポリメラーゼ活性を有する。
(1)本発明のDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする遺伝子
本発明のDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、Pfu由来DNAポリメラーゼ、KOD由来DNAポリメラーゼと比較してプライマー伸長に適した、さらにDNA合成時の正確性に優れたポリペプチドである。また、本発明のDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、代表的な高Fidelity耐熱性DNAポリメラーゼであるPfu由来DNAポリメラーゼのPyrobest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)、KOD DNAポリメラーゼ、KOD dash DNAポリメラーゼ並びにKOD plus DNAポリメラーゼ(いずれも東洋紡社製)に比較し、PCR法において増幅できるDNAの鎖長やその反応のFidelityという観点において優れている。
(イ)分子量:SDS−PAGE法により約85−90キロダルトンである。
(ロ)至適温度:75℃〜85℃
(ハ)至適pH:5.5〜6.5(75℃)
さらに、同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子を人為的に作製することは種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。たとえば遺伝子工学的なポリペプチドの生産において、目的のポリペプチドをコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合にはポリペプチドの発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的ポリペプチドの高発現を図ることが行われている(例えば、特公平7−102146号公報)。このように特定のアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子は、人為的に作製可能なことは言うまでもなく、自然界においても生成されうるものである。従って本発明中に開示された塩基配列と同一の塩基配列を有する遺伝子ではなくても、それが本発明中に開示されたアミノ酸配列をコードする限り該遺伝子は本発明に包含されるものである。
本発明のDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、例えば、Tks、Tsi、またはTceの菌株培養物から、あるいは当該ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した形質転換体から大量生産することが可能である。
このようにして得られた本発明のDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、SDS−PAGE上で約85−90ダルトンを示す。
本発明のDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドはFidelityが高く、プライマー伸長に適しているという特徴を有し、当該ポリペプチドを用いることにより、標的核酸の正確な増幅、解析、同定を行う方法、該方法のための組成物ならびにキットが提供される。
本実施例のDNAポリメラーゼの活性測定に使用する活性化DNAは以下の方法で調製した。
すなわち、サケ精子DNA(シグマ社製)あるいは仔牛胸腺DNA(ワージントン社製)をDNaseI処理によって活性化した。当該方法は、ハーバー アンド ロー社発行、D.R.Davis編集のDNA polymerase from Escherichia coli 第263−276頁(C.C.リチャードソン著)に記載の方法に基づくものである。
すなわち、活性測定しようとする試料を活性測定用反応液(20mM トリス−塩酸緩衝液 pH8.3、10mM 塩化カリウム、6mM 硫酸アンモニウム、2mM 塩化マグネシウム、0.1%トライトンX−100、0.001%牛血清アルブミン、各200μM dATP、dGTP、dCTP、100μM dTTP、0.238μM 「3H」−Methyl TTP、0.4mg/ml活性型サケ精子DNA)50μl中、74℃、5分間反応させた。
反応終了後、2%Nappi(ナカライ社製)を含む20%トリクロロ酢酸(TCA)を500μl、sheared DNAを500μl添加し、氷上で15分以上放置した後、グラスフィルター(ワットマン社製)に捕集した。次に5mlの2%Nappiを含む5%TCAで7回洗浄した後、エタノールで洗浄し、グラスフィルターを乾燥し、放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。上記の酵素活性測定方法によって30分間に10nmolの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を酵素1Uとした。
サーモコッカス(Thermococcus) sp.KS−1株(JCM11816)、サーモコッカス セラー(Thermococcus celer、JCM8558)、サーモコッカス シクリ(Thermococcus siculi、DSMZ12349)について以下の方法でゲノムDNAを調製した。
すなわち、購入した培養液10mlを、8000rpm、10分間遠心分離した。得られた上清および上清と沈殿の界面にある黒層をさらに15000rpm、10分間遠心後、得られた沈殿に0.8mlの20%ショ糖、50mM トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)に懸濁し、0.16mlの500mM EDTA(pH8.0)、0.08mlの10mg/ml塩化リゾチーム(ナカライテスク社製)水溶液を加えて、室温で2時間反応させた。
反応終了後、この反応液に6.4mlの150mM NaCl、1mM EDTA、20mM トリス−HCl緩衝液(pH8.0)、0.08mlの20mg/mlプロテイナーゼK(タカラバイオ社製)及び0.4mlの10%ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、37℃で1時間保温した。次いでこれに等量の100mM トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)飽和フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール混合液(25:24:1、v/v)を加えて10分間緩やかに混合した後、更に10分間遠心(10000×g)を2回行った。遠心終了後、得られた上清をエタノール沈殿後、0.1mlのTE緩衝液に溶解してゲノムDNA溶液を得た。
(1)DNAポリメラーゼ遺伝子中央部のクローニング
様々な耐熱性DNAポリメラーゼのアミノ酸配列の間で保存されている部分をもとにして配列表の配列番号1〜4記載のオリゴヌクレオチドTPPolBF4、TPPolBF5、TTPolBR1並びにTTPolBR4をDNA合成機で合成した。
次に上記実施例2で調製したサーモコッカス sp.KS−1由来ゲノムDNA250ngを鋳型にして、50pmolのTPPolBF4と50pmolのTTPolBR1、50pmolのTPPolBF4と50pmolのTTPolBR4、50pmolのTPPolBF5と50pmolのTTPolBR1のプライマーの組み合わせで、100μlの容量でPCRを行った。PCRにおいてDNAポリメラーゼはタカラExTaq(タカラバイオ社製)を添付のプロトコールに従って用い、PCRは94℃、3分間反応後、94℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 2分を1サイクルとする、40サイクル反応を行った。
反応終了後、それぞれの反応液をフェノール処理した後、マイクロコン−100(タカラバイオ社製)で、プライマーを除去すると同時に増幅DNA断片の濃縮を行った。
上記実施例3−(1)で得られた塩基配列をもとに上流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドTks01(配列表の配列番号5)を合成した。さらに、下記表1に示す32種類のプライマーを合成した。表1中のタグ配列を配列表の配列番号6に示す。
上記実施例3−(1)で得た塩基配列をもとに上流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドTks02(配列表の配列番号8)を合成した。次に実施例2で調製したサーモコッカス sp.KS−1由来ゲノムDNA1ngを鋳型にして、10pmolのTks02と各10pmolの表1記載32種類のプライマーとの組み合わせでPCRを行った。PCR条件は前記条件と同様にして行った。得られたPCR産物の一部をアガロースゲル電気泳動し、その中のTks022Dの約2500bp DNA断片を回収し、T4 DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用いて末端を平滑化した後、HincII(タカラバイオ社製)で消化したpUC118(タカラバイオ社製)にT4 DNAリガーゼ(タカラバイオ社製)を用いて連結し、該プラスミドを用いて大腸菌JM109を形質転換した。さらに形質転換体を培養し、約2500bpのDNA断片が挿入されたプラスミドpTks022Dを得、挿入されたDNA断片の塩基配列を決定した。
サーモコッカス sp.KS−1 DNAポリメラーゼが配列中に2箇所インテイン配列を含むことが明らかになった。
そこで、インテイン配列を除去したDNAポリメラーゼ遺伝子を構築した。
実施例3−(3)で得られた配列をもとに配列表の配列番号9〜14記載のオリゴヌクレオチド、TksNde、Tks1EndBg、Tks2StaBg、Tks2EndBal、Tks3StaBalおよびTksBgPsを合成した。
次に実施例2で調製したサーモコッカス sp.KS−1由来ゲノムDNA100ngを鋳型にして20pmolのTksNdeと20pmolのTks1EndBg(TksA)、20pmolのTks2StaBgと20pmolのTks2EndBal(TksB)、20pmolのTks3StaBalと20pmolのTksBgPs(TksC)のプライマー組み合わせで、100μlの容量でPCRを行った。PCRにおいてDNAポリメラーゼはPyrobest(タカラバイオ社製)を添付のプロトコールに従って用い、94℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 3分を1サイクルとする、40サイクル反応を行い、約1.3kbのTksA、約0.3kbのTksB、約0.9kbのTksC 各DNA増幅断片を得た。さらに、同様の方法で上記PCR反応液TksB 1μlとPCR反応液TksC 1μlを混ぜたものを鋳型にして、20pmolのTks2StaBgと20pmolのTksBgPs(TksD)プライマーを用いて、100μlの容量で上記条件でPCRを行い、約1.2kbのTksD DNA増幅断片を得た。
得られたTksA DNA断片は制限酵素NdeIとBglIIで、TksD DNA断片は制限酵素BglIIとPstIで消化した後、制限酵素NdeIとPstIで消化したpTV119Nd(pTV119NのNcoIサイトをNdeIサイトに変換したもの)と常法によりライゲーションし、プラスミドpTks59を構築した。当該プラスミドは、pTks59と命名、表示され、平成16年5月14日(原寄託日)より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6(郵便番号305−8566))にFERM BP−10312として寄託されている。
実施例3−(4)で得られたpTks59の挿入DNA断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、目的のDNAポリメラーゼをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号15に示す。また、該塩基配列から推定されるRNaseHIIのアミノ酸配列を配列表の配列番号16に示す
pTks59で形質転換された大腸菌JM109を100μg/mlのアンピシリンを含む5mlのLB(1%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム)培地に植菌し、37℃で6時間した培養液50μlを100μg/mlのアンピシリンおよび1mM IPTGを含む5mlのLB培地に植菌し、37℃で1晩振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を36μlのソニケーションバッファー(50mMトリス−塩酸pH8.0、2mM 2−メルカプトエタノール、10%グリセロール)に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を80℃、10分間の熱処理にかけた。その後、再度12000rpmで10分の遠心分離を行い、上清を集め、熱処理上清液を得た。
上記で得られた熱処理上清液について、実施例1に記載の方法により酵素活性を測定した結果、DNAポリメラーゼ活性が確認できた。
実施例3−(5)で得られたプラスミドpTks59で形質転換された大腸菌JM109を50μg/mlのアンピシリン、0.1%グルコースを含む400mlLB培地に植菌し、37℃で一晩振盪培養後、全量を50μg/mlのアンピシリンを含む20リットルLB培地に添加し、37℃でOD600が1.0になるまで培養した。OD600が1.0になったら、最終濃度0.2mMになるようにIPTGを添加し、さらに37℃で4時間培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を732mlのバッファーA〔50mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.5)、2mM EDTA、2mM ジチオスレイトール、1mM フェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を12000rpmで30分間の遠心分離を行った。得られた上清に最終濃度0.2Mになるように硫酸アンモニウム(硫安)を添加し、75℃、15分間の熱処理にかけた後、0℃ 30分間放置し、再度12000rpmで30分間の遠心分離を行った。さらに、上清をポリエチレンイミンによる除核酸処理、硫安沈殿を行った後、バッファーB〔50mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.5)、1mM EDTA、10%グリセロール、1mM ジチオスレイトール、1mM フェニルメタンスルフォニルフルオライド〕2リットルを外液として、2時間の透析を2回、一晩の透析を1回行なった。透析後の酵素液200mlをバッファーBで平衡化したホスホセルロースP−11カラム(ワットマン社製)に供し、FPLCシステム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)を用いて0〜500mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)直線濃度勾配により溶出した。
この画分をバッファーD〔20mMトリス−HCl(pH9.0)、0.1mM EDTA、10%グリセロール、0.2%ツイーン20、1mMジチオスレイトール〕1lを外液として、2時間の透析を2回、一晩の透析を1回行なった。透析後の酵素液50mlをバッファーDで平衡化したQ−セファロース(ファルマシア ファルマシア バイオテク社製)に供し、FPLCシステムを用いて0〜300mM NaCl直線濃度勾配により溶出した。
この画分を保存バッファー〔50mMトリス−HCl(pH8.2)、0.1mM EDTA、10mM塩化ナトリウム、0.1%ツイーン20、0.1%ノニデットP−40、1mMジチオスレイトール、50%グリセロール〕1リットルを外液として、2時間の透析を2回、一晩の透析を1回行なった。こうして得られたDNAポリメラーゼをTks DNAポリメラーゼ標品とした。
得られたTks DNAポリメラーゼ標品を用いて、実施例1で記載した方法で活性を測定したところ、DNAポリメラーゼ活性が確認できた。
(1)DNAポリメラーゼ遺伝子中央部のクローニング
様々な耐熱性DNAポリメラーゼのアミノ酸配列の間で保存されている部分をもとにして配列表の配列番号17、2、3、18記載のオリゴヌクレオチドTPPolBF1、TPPolBF5、TTPolBR1並びにTTPolBR5を合成した。
次に上記実施例2で調製したサーモコッカス セラー由来ゲノムDNA250ngを鋳型にして、50pmolのTPPolBF1と50pmolのTTPolBR1、50pmolのTPPolBF1と50pmolのTTPolBR5、50pmolのTPPolBF5と50pmolのTTPolBR1のプライマーの組み合わせで、100μlの容量でPCRを行った。PCR条件並びに精製操作は実施例3−(1)記載と同様にして行った。得られた約2kbのTPPolBF1−TTPolBR1、約1kbのTPPolBF1−TTPolBR5並びに約0.8kbのTPPolBF5−TTPolBR1の各増幅断片についてダイレクトシークエンシングを行い、塩基配列を決定した。
上記実施例4−(1)で得た塩基配列をもとに上流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドTce01(配列表の配列番号19)および下流をクローニングするためのオリゴヌクレオチドTce02(配列表の配列番号20)を合成した。
次に実施例2で調製したサーモコッカス セラー由来ゲノムDNA1ngを鋳型にして、10pmolのTce01またはTceo2と各10pmolの実施例3−(2)表1記載の32種類のプライマーとの組み合わせで、実施例3−(2)記載の方法と同様にPCRならびに精製操作を行った。得られた増幅産物についてダイレクトシークエンシングを行い、目的のDNAポリメラーゼの上流領域を含む断片をスクリーニングした。その結果、約650bpのPCR増幅断片Tce013CにDNAポリメラーゼ遺伝子の上流、約650bpのPCR増幅断片Tce022FにDNAポリメラーゼ遺伝子の下流が含まれていることがわかった。
実施例4−(2)で得られた配列をもとに配列表の配列番号21及び22記載のオリゴヌクレオチドTceNdeおよびTceBgPsを合成した。
実施例2で調製したサーモコッカス セラー由来ゲノムDNA100ngを鋳型にして20pmolのTceNdeと20pmolのTceBgPsをプライマーに用い、100μlの容量でPCRを行なった。PCRは、DNAポリメラーゼとしてパイロベスト(タカラバイオ社製)を添付のプロトコールに従って用い、94℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 2分を1サイクルとする、40サイクル反応を行った。得られた約2.3kbのDNA増幅断片を制限酵素NdeI及びBglII(ともにタカラバイオ社製)で消化し、得られたDNA断片をプラスミドベクターpTV119Nd(pTV119NのNcoIサイトをNdeIサイトに変換したもの)のNdeI及びBamHI間に組込み、プラスミドpTce19を作製した。当該プラスミドは、pTce19と命名、表示され、平成16年5月14日(原寄託日)より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6(郵便番号305−8566))にFERM BP−10311として寄託されている。
上記pTce19の挿入DNA断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、目的のDNAポリメラーゼをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号23に示す。また、該塩基配列から推定されるDNAポリメラーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号24に示す
pTce19で形質転換された大腸菌JM109を実施例3−(6)記載の方法で培養し、遠心分離によって集めた菌体を64μlのソニケーションバッファーに懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を80℃、10分間の熱処理にかけた。その後、再度12000rpmで10分の遠心分離を行い、上清を集め、熱処理上清液を得た。
上記得られた熱処理上清液について、実施例1に記載の方法により酵素活性を測定した結果、DNAポリメラーゼ活性が認められた。
上記pTce19で形質転換された大腸菌JM109を実施例3―(7)記載の方法で培養した。精製はヘパリン−セファロースCL−6B(ファルマシア バイオテク社製)を用いて0〜700mM KCl直線濃度勾配により溶出するまでは実施例3−(7)と同様にして行った。
溶出したDNAポリメラーゼ画分は、さらに0.3M 塩化ナトリウムを含むバッファーC 1リットルを外液として、2時間の透析を2回、一晩の透析を1回行なった。透析後の酵素液95mlを0.3M塩化ナトリウムを含むバッファーCで平衡化したSuperdexG200(ファルマシア バイオテク社製)に供し、0.3M塩化ナトリウムを含むバッファーCで溶出した。
溶出したDNAポリメラーゼ画分をバッファーD 1リットルを外液として、2時間の透析を2回、一晩の透析を1回行なった。透析後の酵素液45mlをバッファーDで平衡化したQ−セファロース(ファルマシア ファルマシア バイオテク社製)に供し、FPLCシステムを用いて0〜300mM NaCl直線濃度勾配により溶出した。
この画分を保存バッファー 1リットルを外液として、2時間の透析を2回、一晩の透析を1回行なった。こうして得られたDNAポリメラーゼをTce DNAポリメラーゼ標品とした。
上記で得られたTce DNAポリメラーゼ標品を用いて、実施例1に記載した方法により酵素活性を測定した結果、Tce DNAポリメラーゼ標品にDNAポリメラーゼ活性が確認できた。
(1)DNAポリメラーゼ遺伝子中央部のクローニング
様々な耐熱性DNAポリメラーゼのアミノ酸配列の間で保存されている部分をもとにして配列表の配列番号17、2、3、4、18記載のオリゴヌクレオチドTPPolBF1、TPPolBF5、TTPolBR1、TTPolBR4並びにTTPolBR5を合成した。
次に実施例2で調製したサーモコッカス スクリ由来ゲノムDNA250ngを鋳型にして、50pmolのTPPolBF1と50pmolのTTPolBR4、50pmolのTPPolBF1と50pmolのTTPolBR5、50pmolのTPPolBF5と50pmolのTTPolBR1のプライマーの組み合わせで、100μlの容量でPCRを行った。PCR条件並びに精製操作は、実施例3−(1)記載のものと同様にして行った。得られた約1.2kbのTPPolBF1−TTPolBR4、約1kbのTPPolBF1−TTPolBR5、約2kb TPPolBF5−TTPolBR1の各増幅断片についてダイレクトシークエンシングを行い、塩基配列を決定した。その結果、サーモコッカス スクリ DNAポリメラーゼがインテイン配列を含むことが明らかになった。
上記実施例5−(1)で得た塩基配列をもとに上流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドTsi01(配列表の配列番号25)および下流をクローニングするためのオリゴヌクレオチドTsi06(配列表の配列番号26)を合成した。
次に実施例2で調製したサーモコッカス スクリ由来ゲノムDNA1ngを鋳型にして、10pmolのTsi01またはTsi06と各10pmolの表1記載32種類のプライマーとの組み合わせでPCRを行った。PCR条件ならびに精製操作は実施例3−(2)と同様にして行った。得られた増幅断片は、ダイレクトシークエンシングを行い、DNAポリメラーゼの上流含む断片をスクリーニングした。その結果、約2900bpのTsi011A断片にDNAポリメラーゼ遺伝子の上流、約400bpのTsi065B断片にDNAポリメラーゼ遺伝子の下流が含まれていることがわかった。
サーモコッカス スクリ DNAポリメラーゼの配列中に1箇所インテイン配列を含むことが明らかになった。そこで、インテイン配列除去したDNAポリメラーゼ遺伝子を構築した。
すなわち、実施例5−(2)で得られた配列をもとに配列表の配列番号27〜30記載のオリゴヌクレオチドTsiNde、TsiA、TsiBおよびTsiBamPstを合成した。
実施例2で調製したサーモコッカス スクリ由来ゲノムDNA100ngを鋳型にして20pmolのTksNdeと20pmolのTsiB(TsiI)20pmolのTsiAと20pmolのTsiBamPst(TsiII)のプライマー組み合わせで、100μlの容量でPCRを行った。PCR条件は実施例5−(2)と同様にして行い、約1.5kbのTsiI、約0.9kbのTsiIIDNA断片を得た。さらに、同様の方法で上記PCR反応液TsiI 1μlとPCR反応液TsiII 1μlを混ぜたものを鋳型にして、20pmolのTsiNdeと20pmolのTsiBamPst)プライマーを用いて、100μlの容量でPCRを行い、約2.4kbのDNA断片を得た。
得られた約2.4kbのDNA断片は、制限酵素NdeIとBamHIで消化した後、NdeIとBamHIで消化したpTV119Nd(pTV119NのNcoIサイトをNdeIサイトに変換したもの)とライゲーションし、プラスミドpTsi16を構築した。当該プラスミドは、pTsi16と命名、表示され、平成16年5月14日(原寄託日)より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6(郵便番号305−8566))にFERM BP−10310として寄託されている。
実施例5−(3)で得られたpTsi16の挿入DNA断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。得られた塩基配列の結果を解析したところ、DNAポリメラーゼをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号31に示す。また、該塩基配列から推定されるDNAポリメラーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号32に示す。
プラスミドpTsi16で形質転換された大腸菌JM109を実施例3−(6)記載の方法で培養し、遠心分離によって集めた菌体を52μlのソニケーションバッファーに懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を80℃、10分間の熱処理にかけた。その後、再度12000rpmで10分の遠心分離を行い、上清を集め、熱処理上清液を得た。
上記で得られた熱処理上清液について、実施例1に記載の方法により酵素活性を測定した結果、DNAポリメラーゼ活性が認められた。
プラスミドpTsi16で形質転換された大腸菌JM109を実施例3−(7)記載の方法で培養した。精製は実施例3−(7)と同様にして行った。
こうして得られたDNAポリメラーゼをTsi DNAポリメラーゼ標品とした。得られたTsi DNAポリメラーゼ標品を用いて、実施例1に記載されている方法で活性を測定した結果、Tsi DNAポリメラーゼ標品にDNAポリメラーゼ活性が確認できた。
(1)各種DNAポリメラーゼの取込および伸長活性
Tks、Tce及びTsi DNAポリメラーゼの取込および伸長活性を測定した。対照として市販のKOD DNAポリメラーゼ(東洋紡社製)を用いた。
鋳型として、取込活性を測定する場合は1μg活性型仔牛胸腺DNAを用いた。また、伸長活性を測定する場合は1μgM13ファージの1本鎖DNAとこれに相補的な1pmolの、配列表の配列番号33記載のHTプライマーをアニーリングさせたもの(M13/HT Primer)を用いた。緩衝液は、1mM 塩化マグネシウムを含むKOD#1バッファーを用いた。DNAポリメラーゼの活性測定は、以下の方法で行った。
すなわち、活性を測定しようとする酵素試料、上記鋳型、40μM dNTP、0.238μM 「3H」methyl−TTP(アマシャム社製)、1mM 塩化マグネシウムを含むKOD#1バッファー(東洋紡社製)50μlで、75℃、5分間反応させた。反応液のうち40μlをDE81ペーパー(ワットマン社製)にスポットし、5%Na2PO4で4回洗浄を行った後にDE81ペーパー上に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。上記の酵素活性測定方法によって30分間に10nmolのdNMPを基質DNAに取り込む酵素量を酵素1Uとした。その結果を表2に示す。表2中、「取込」は鋳型となる核酸中のニック部位に対する取り込み能力を示し、「伸長」は鋳型となる核酸にアニーリングしたプライマーからの伸長のための取り込み能力を示す。
Tks、Tce及びTsi DNAポリメラーゼの取込およびM13の1本鎖DNAポリメラーゼに対する親和性を調べた。対照として、KOD DNAポリメラーゼを用いた。
鋳型として、様々な濃度のM13の1本鎖DNAを用いた。プライマーとしてこれに相補的な1pmolのHTプライマーを使用した。緩衝液は1mM塩化マグネシウムを含むKOD#1バッファーを用いた。DNAポリメラーゼ活性測定は、上記実施例6−(1)記載の方法で測定した。その結果を表3に示す。
Tks、Tsi DNAポリメラーゼのFidelityを調べた。対照として、KOD DNAポリメラーゼ、KOD plus DNAポリメラーゼ(いずれも東洋紡社製)及びPyrobest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用いた。
鋳型としてサーマス サーモフィラス HB8 ゲノムDNA(タカラバイオ社製)を使用した。また、配列表の配列番号34及び35記載のc280/RG34−F及びRプライマーを使用した。
Tks及びTce DNAポリメラーゼのFidelityを調べた。対照として、KOD DNAポリメラーゼ、KOD plus DNAポリメラーゼ(いずれも東洋紡社製)及びPyrobest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用いた。
鋳型としてサーマス サーモフィラス HB8 ゲノムDNA(タカラバイオ社製)を使用した。また、配列表の配列番号36及び37記載のc240/RA18−F及びRプライマーを使用した。
(1)各種DNAポリメラーゼの至適温度
Tks、Tce及びTsi DNAポリメラーゼの至適温度を測定した。鋳型としては20μg活性型仔牛胸腺DNAを用いた。また、緩衝液としてはPyrobest DNAポリメラーゼに添付のバッファーを用いた。DNAポリメラーゼの活性測定は、以下の方法で行った。
まず、活性を測定しようとする酵素試料5mU(実施例6−(1)に記載の取込活性の測定方法により算出)、上記鋳型、200μM dATP、200μM dGTP、200μM dCTP、100μM dTTP、0.204μM 「3H」methyl−TTP(アマシャム社製)、1×Pyrobest DNAポリメラーゼに添付のバッファー(タカラバイオ社製)を含む計50μlの反応液を調製した。次に、それぞれの酵素試料について、65℃〜85℃の所望の温度で5分間反応させた。反応液のうち40μlをDE81ペーパー(ワットマン社製)にスポットし、5%Na2PO4で4回洗浄を行った後にDE81ペーパー上に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。上記の活性測定方法で測定された活性と反応温度との関係を図1に示す。なお、図1では、85℃での反応における活性を100%としている。
Tks、Tce及びTsi DNAポリメラーゼの至適pHを測定した。鋳型としては10μg活性型仔牛胸腺DNAを用いた。また、緩衝液としては、75℃におけるpHがpH5.0〜pH8.0の所望の値に調整された120mM Tris−HClを用いた。DNAポリメラーゼの活性測定は、以下の方法で行った。
まず、活性を測定しようとする酵素試料0.05U(実施例6−(1)に記載の取込活性の測定方法により算出)、上記鋳型、上記緩衝液、10mM KCl、6mM (NH4)2SO4、0.1% TritonX−100、0.001% BSA、1mM MgCl2、40μM dNTP、0.204μM 「3H」methyl−TTP(アマシャム社製)を含む計50μlの反応液を調製した。次に、それぞれの酵素試料について、75℃で5分間反応させた。反応液のうち40μlをDE81ペーパー(ワットマン社製)にスポットし、5%Na2PO4で4回洗浄を行った後にDE81ペーパー上に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。上記の活性測定方法で測定された活性とpHとの関係を図2に示す。なお、図2ではpH6.0(75℃)における活性を100%としている。
本発明のDNAポリメラーゼのPCR反応における性能を、KOD DNAポリメラーゼと比較するために、λ−DNAを鋳型としたPCR反応を行った。Tks、Tce及びTsiのDNAポリメラーゼ用の反応液組成は1×KOD plus DNAポリメラーゼに添付の緩衝液、200μM dNTP、1mM (NH4)2SO4とし、KOD DNAポリメラーゼ用の反応液組成は1×KOD DNAポリメラーゼに添付の緩衝液、200μM dNTP、1mM MgCl2とし、1ng/50μl λ−DNA(宝酒造社製)10pmol/50μl プライマーlambda−1、10pmol/50μl プライマーlambda−9B、0.625U/50μlDNAポリメラーゼ を含む反応液50μlを調製した。
(1)マウスハイブリドーマ細胞系の作成
実施例2で調製したTks DNAポリメラーゼ標品210μg(100μl)、実施例4で調製したTce DNAポリメラーゼ標品210μg(100μl)実施例6で調製したTsi DNAポリメラーゼ標品200μg(100μl)のそれぞれにPBS 800μlを加え、フロイント・コンプリート・アジェバント(Difco Lab.社製)1mlと共にエマルジョン化させ、抗原調整物とした。これらの抗原調製物をそれぞれBalb/cマウス(10週齢のメス、日本クレア製)4匹ずつに等分して腹腔内投与した。この2週間後と5週間後に、前記と同量のDNAポリメラーゼ標品にPBS 900μl、リビ・アジュバント(RIBI社製)を加えた抗原調製物を調製し、各マウスに等分して腹腔内投与し追加免疫を行った。さらに、初回の抗原投与から6週間後に、前記と同量の各DNAポリメラーゼ標品にPBS 900μlを加えた抗原調整物を作製し、各群のマウスに等分して腹腔内投与し、最終免疫した。
実施例8−(1)で抗原に用いた各DNAポリメラーゼ標品の溶液(5μg/ml)を使用し、各DNAポリメラーゼでコートされた96ウェルプレートを作製した。上記の細胞融合で得られた細胞のうち、細胞の成育の見られたウェルより上清を採取し、前記のDNAポリメラーゼコートプレート上でELISA法を実施して培養上清中の抗DNAポリメラーゼ抗体の有無を検定した。各DNAポリメラーゼを抗原として得られた、900株以上の細胞株についてこの検定を実施した。この操作により抗体の産生があると判定された株(Tks DNAポリメラーゼ:95株、Tce DNAポリメラーゼ:103株、Tsi DNAポリメラーゼ:61株)を選択した。
SEQ ID No:2; Designed oligonucleotide primer TPPolBF5 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
SEQ ID No:3; Designed oligonucleotide primer TTPolBR1 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
SEQ ID No:4; Designed oligonucleotide primer TTPolBR4 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
SEQ ID No:5; Designed oligonucleotide primer Tks01 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1
SEQ ID No:6; Designed oligonucleotide Tag sequence region to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
SEQ ID No:7; Designed oligonucleotide primer Tks04 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1
SEQ ID No:8; Designed oligonucleotide primer Tks02 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1
SEQ ID No:9; Designed oligonucleotide primer TksNde to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1
SEQ ID No:10; Designed oligonucleotide primer Tks1EndBg to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1
SEQ ID No:11; Designed oligonucleotide primer Tks2StaBg to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1
SEQ ID No:12; Designed oligonucleotide primer Tks2EndBal to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1
SEQ ID No:13; Designed oligonucleotide primer Tks3StaBal to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1
SEQ ID No:14; Designed oligonucleotide primer TksBgPs to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1
SEQ ID No:17; Designed oligonucleotide primer TPPolBF1 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
SEQ ID No:18; Designed oligonucleotide primer TTPolBR5 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
SEQ ID No:19; Designed oligonucleotide primer Tce01 to amplify a genomic DNA of Thermococcus celer
SEQ ID No:20; Designed oligonucleotide primer Tce02 to amplify a genomic DNA of Thermococcus celer
SEQ ID No:21; Designed oligonucleotide primer TceNde to amplify a genomic DNA of Thermococcus celer
SEQ ID No:22; Designed oligonucleotide primer TceBgPs to amplify a genomic DNA of Thermococcus celer
SEQ ID No:25; Designed oligonucleotide primer Tsi01 to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi
SEQ ID No:26; Designed oligonucleotide primer Tsi06 to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi
SEQ ID No:27; Designed oligonucleotide primer TsiNde to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi
SEQ ID No:28; Designed oligonucleotide primer TsiA to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi
SEQ ID No:29; Designed oligonucleotide primer TsiB to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi
SEQ ID No:30; Designed oligonucleotide primer TsiBamPst to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi
SEQ ID No:33; Designed oligonucleotide primer HT to amplify a genomic DNA of M13SEQ ID No:34; Designed oligonucleotide primer c280/RG34-F to amplify a genomic DNA of Thermus thermophilus HB-8
SEQ ID No:35; Designed oligonucleotide primer c280/RG34-R to amplify a genomic DNA of Thermus thermophilus HB-8
SEQ ID No:36; Designed oligonucleotide primer c240/RA18-F to amplify a genomic DNA of Thermus thermophilus HB-8
SEQ ID No:37; Designed oligonucleotide primer c240/RA18-R to amplify a genomic DNA of Thermus thermophilus HB-8
SEQ ID No:38; Designed oligonucleotide primer lambda-1 to amplify a DNA of bacteriophage lambda
SEQ ID No:39; Designed oligonucleotide primer lambda-9B to amplify a DNA of bacteriophage lambda
SEQ ID No:40; Designed oligonucleotide primer lambda-10D to amplify a DNA of bacteriophage lambda
Claims (7)
- 以下の群より選択されるアミノ酸配列を有し、かつDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチド:
(a)配列表の配列番号16に記載のアミノ酸配列;
(b)配列表の配列番号24に記載のアミノ酸配列;又は
(c)配列表の配列番号32に記載のアミノ酸配列。 - 請求項1に記載のポリペプチドをコードする核酸。
- 配列表の配列番号15、23又は31に記載の塩基配列を有する請求項2記載の核酸。
- ポリペプチドを産生する能力を有する細胞を培養する工程、および培養物から該ポリペプチドを採取する工程を包含するポリペプチドの製造方法であって、該ポリペプチドは以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、かつDNAポリメラーゼ活性を有する:
(a)配列表の配列番号16に記載のアミノ酸配列;
(b)配列表の配列番号24に記載のアミノ酸配列;又は
(c)配列表の配列番号32に記載のアミノ酸配列。 - ポリペプチドを用いて核酸を増幅する工程を包含する、核酸の増幅方法であって、該ポリペプチドは以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、かつDNAポリメラーゼ活性を有する:
(a)配列表の配列番号16に記載のアミノ酸配列;
(b)配列表の配列番号24に記載のアミノ酸配列;又は
(c)配列表の配列番号32に記載のアミノ酸配列。 - 請求項1記載のポリペプチドを含有する核酸増幅用組成物。
- 請求項1記載のポリペプチドを含有するキット。
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