CN1993468A - 具有dna聚合酶活性的多肽 - Google Patents

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Abstract

一种具有高保真性DNA聚合酶活性并可用作基因工程试剂的多肽；编码该多肽的基因；生产该多肽的方法；以及通过使用该多肽扩增核酸的方法。

Description

具有DNA聚合酶活性的多肽
技术领域
本发明涉及用作基因工程的试剂的、具有高保真性DNA聚合酶活性的多肽、编码该多肽的基因、生产该多肽的方法，以及使用该多肽扩增核酸的方法。
背景技术
DNA聚合酶是可用于基因工程的试剂、并广泛用于DNA测序、标记、定点诱变等等的酶。由于聚合酶链反应(PCR)方法的发展，耐热的DNA聚合酶近来愈发受到关注。已经开发并上市了适于PCR方法的多种DNA聚合酶。
根据氨基酸序列相似性，通常可将当前已知的DNA聚合酶分成四个家族。其中，家族A(pol I型酶)和家族B(α型酶)占大多数。属于每个家族的DNA聚合酶通常具有相似的生化特性。然而，详细的比较已显示各自酶在底物特异性、底物类似物的掺入、引物延伸能力的强度和速度、DNA合成的模式、伴随的外切核酸酶活性、最适反应条件(温度、pH等)、对抑制剂的敏感性等方面相互之间有不同的性能。因此，已从目前的DNA聚合酶中选出并利用具有最适于实验方法的特性的DNA聚合酶。
例如，来自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的DNA聚合酶(Pfu)(参见例如，专利文件1-5)是最耐热的DNA聚合酶之一。其具有被称作校正活性的3′→5′外切核酸酶活性，并且其在耐热酶中显示相对地高保真性。然而，该酶也有尚待解决的问题，即如果用于PCR其需要长的扩增时间，并且因为其延伸速度和持续合成能力低，其不能用于长链的扩增。
最近，可商购的称作KOD DNA聚合酶的聚合酶，其具有比Pfu来源的DNA聚合酶更高的3′→5′外切核酸酶活性、更高的延伸速度和更高的持续合成能力(参见例如，专利文件6和7，非专利文件1)。可使用该酶在短时间内进行具有高准确度的PCR。然而，该酶有尚待解决的问题，即由于强的3′→5′外切核酸酶活性降解引物或扩增产物，所以相对难于确定反应条件，并且不适于长链的扩增。
此外，通过改良KOD DNA聚合酶已开发了两类酶。其中之一，KOD-Plus-DNA聚合酶，能热启动PCR而不需要通过向KOD DNA聚合酶添加两种单克隆抗体以抑制在正常温度下的聚合酶活性和3′→5′外切核酸酶活性的特殊步骤。与KOD DNA聚合酶相比，通过优化反应缓冲液组合物提高扩增效率和合成长链DNA的能力，同时保留高保真性(例如，专利文件8)。然而，仍存在有待解决的问题，该酶的延伸速度比KOD DNA聚合酶低得多，并且降到与Pfu来源的DNA聚合酶相等的水平。
KOD Dash DNA聚合酶是基于Barnes等方法制备的混合型DNA聚合酶(参见例如，专利文件9，非专利文件2)。通过以最佳比例将KOD DNA聚合酶和已使用基因工程技术从中除去3′→5′外切核酸酶活性的修饰型的KOD DNA聚合酶混合，提高扩增效率和延伸能力(参见例如，专利文件10)。其延伸速度象KOD DNA聚合酶一样高。然而，还是存在有待解决的问题，由于3′→5′外切核酸酶活性相对降低，所以与KOD DNA聚合酶相比，保真性显著降低。
专利文件1：美国专利No.5489523
专利文件2：美国专利No.5545552
专利文件3：美国专利No.5866395
专利文件4：美国专利No.6489150
专利文件5：美国专利No.5948663
转录文件6：美国专利No.6054301
专利文件7：美国专利No.6225065
专利文件8：美国专利公开No.2002/0076768
专利文件9：美国专利No.5436149
专利文件10：美国专利No.6008025
非专利文件1：Barnes W.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.91，No.6，p.2216-2220(1994)
非专利文件2：Takagi M.，等，Appl.Environ.Microbiol.，vol.63，No.11，p.4504-4510(1997)
发明的公开
本发明将要解决的问题
本发明的主要目的是提供可用于克隆、测序和核酸扩增的具有高保真性DNA聚合酶活性的多肽，以及编码该多肽的基因。本发明的另一个目的是提供一种生产具有DNA聚合酶活性的多肽的方法以及使用具有DNA聚合酶活性的多肽用于扩增核酸的方法。
解决问题的方法
通过深入的研究，本发明人从热球菌(Thermococcus)属的超嗜热古细菌中发现了一种具有DNA聚合酶活性的新的多肽，其具有优于任何其它常规DNA聚合酶的性能。此外，本发明人克隆了编码具有这种活性的多肽的基因，并且发现了生产该多肽的方法。因此，已经完成了本发明。
本发明的第一个方面涉及具有DNA聚合酶活性的多肽，其具有选自下列的氨基酸序列、或具有在所述氨基酸序列中缺失、插入、添加或取代一个或几个氨基酸的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：16的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：24的氨基酸序列；和
(c)SEQ ID NO：32的氨基酸序列。
本发明的第二个方面涉及一种编码第一方面的多肽的核酸。
第二个方面的核酸可以是具有SEQ ID NO：15、23或31的核苷酸序列，或者其一部分的核酸。其可以是编码具有DNA聚合酶活性的多肽的核酸，其在严格条件下和与上述核酸互补的核苷酸序列构成的核酸杂交。
本发明的第三个方面涉及一种生产多肽的方法，该方法包括：
培养能产生多肽的细胞，和
从培养物中收集所述多肽，
其中所述多肽具有DNA聚合酶活性，并且具有选自下列的氨基酸序列或具有在所述氨基酸序列中缺失、插入、添加或取代一个或几个氨基酸的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：16的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：24的氨基酸序列；和
(c)SEQ ID NO：32的氨基酸序列。
本发明的第四个方面涉及一种扩增核酸的方法，该方法包括：
使用多肽扩增核酸，
其中所述多肽具有DNA聚合酶活性，并且具有选自下列的氨基酸序列或具有在所述氨基酸序列中缺失、插入、添加或取代一个或几个氨基酸的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：16的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：24的氨基酸序列；和
(c)SEQ ID NO：32的氨基酸序列。
本发明的第五个方面涉及一种含有第一方面的多肽的组合物。
本发明的第六个方面涉及一种含有第一方面的多肽的试剂盒。
本发明的第七个方面涉及一种结合第一方面的多肽的抗体。
发明的效果
本发明提供一种可用于克隆、测序和核酸扩增的具有高保真性DNA聚合酶活性的多肽，编码该多肽的基因，以及用于生产具有所述DNA聚合酶活性的多肽的方法。使用具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽，即使将其用于包括许多循环的PCR也可获得具有较低错误率的扩增产物。因此，其可用于以低拷贝数量存在的靶核酸的分析或鉴定。
附图简述
图1说明DNA聚合酶活性和反应温度之间的关系。在图中，◇、△和○分别代表Tks DNA聚合酶、Tce DNA聚合酶和Tsi DNA聚合酶的结果。
图2说明DNA聚合酶活性和pH之间的关系。在图中，◇、△和○分别代表Tks DNA聚合酶、Tce DNA聚合酶和Tsi DNA聚合酶的结果。
完成本发明的最佳方式
如这里所使用的，具有DNA聚合酶活性的多肽指根据模板DNA的核苷酸序列掺入四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)并且催化与模板DNA互补的DNA链聚合的多肽。
如这里所使用的，引物延伸的适合性指擅长使用引物与单链模板DNA退火形成的复合物作为底物从引物合成DNA的能力。例如对单链DNA的高亲和力。预计具有对单链DNA高亲和力的DNA聚合酶使核酸扩增反应中的高灵敏度。因此，其可用于从以低拷贝数量存在的模板核酸扩增核酸的反应。DNA聚合酶对单链DNA亲和力的示例性的指标是对M13噬菌体单链DNA的Km值。该Km值优选地是2.5μg/ml或更小，更优选地2.0μg/ml或更小，更优选地1.5μg/ml或更小。
如这里所使用的，高保真性指在用DNA聚合酶的DNA合成反应中高度准确的核苷酸掺入。其测定方法的实例包括Kunkel法(J.Biol.Chem.1985May 10；260(9)：5787-96)、测序法以及Cline等的方法(Nucleic Acids Res.1996Sep 15；24(18)：3546-51)。在这些方法中，测序法是最可靠的。尽管不作为对本发明的限制，例如，但是可根据下列步骤估计保真性：使用嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB-8的基因组DNA作为模板以及DNA聚合酶进行PCR；将扩增产物克隆到载体pUC118中；测定多个克隆中约500-bp扩增片段的核苷酸序列；测定认为是错误的核苷酸的数量；以及测定总的所测核苷酸中错误核苷酸的百分率。
在下文中，将详细描述本发明。
(1)具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽以及编码该多肽的基因
具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽是比Pfu来源的DNA聚合酶和KOD来源的DNA聚合酶更适于引物延伸，并且在DNA合成上非常准确的多肽。具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽在可使用PCR法扩增的DNA链长度和反应的保真性上比Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio)(来自典型的高保真性耐热DNA聚合酶，Pfu来源的DNA聚合酶)、KOD DNA聚合酶、KOD dash DNA聚合酶以及KOD plusDNA聚合酶(所有都来自Toyobo)更优秀。
本发明的DNA聚合酶的理化特性如下：
(i)分子量：根据通过SDS-PAGE法测定，约85-90千道尔顿
(ii)最适温度：75-85℃
(iii)最适pH：5.5-6.5(75℃)
关于具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽没有特殊限制，只要其具有上述理化特征。例如，其可从热球菌属某种(Thermococcus sp.)KS-1(下文称作Tks)、Thermococcus siculi(下文称作Tsi)和速生热球菌(Thermococcus celer)(下文称作Tce)中获得。
具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽可由SEQ ID NO：16、24或32的氨基酸序列构成，或者其可以是具有基本上相同活性的功能等同物。可在天然存在的多肽中产生突变，如氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入、添加或取代。这种突变可能是由于编码多肽的基因的多态性或突变，或者由于多肽在体内或在合成后的纯化期间的修饰反应所产生的。已知这种突变的多肽可能仍然显示与无突变的多肽基本上相同的生理或生化活性即可。本发明也包括这种尽管在结构上有差别，但在功能或活性上没有发现显著差别的功能等同物。关于突变的氨基酸的数量没有特殊限制，只要多肽显示基本上相同的生理或生物活性。例如可以是1个或以上突变(缺失、插入、添加、取代等)，例如1到几个，更具体地1到10个核苷酸。这可用于将这种突变人为地引入到多肽的氨基酸序列中的实例。在这种情况中，可产生更多不同的突变体。
当使用基因工程技术生产多肽时，经常将其表达为融合多肽。例如，为了提高多肽的表达水平，可在目的多肽的N末端添加来自另一个多肽的N末端肽。在另一种情况中，可在目的多肽的N末端或C末端添加适当的肽链(例如，组氨酸标签、谷胱甘肽-S-转移酶)，然后表达多肽。由此，通过使用具有对肽链有亲和力的载体便于目的多肽的纯化。具有与本发明的DNA聚合酶部分不同的氨基酸序列的DNA聚合酶可作为“功能等同物”在本发明的范围内，只要其显示与本发明的DNA聚合酶基本等同的活性即可。
编码具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽的DNA包括含有编码SEQ ID NO：16、24或32的氨基酸序列，或其部分的核苷酸序列的DNA(例如，含有SEQ ID NO：15、23或31，或其部分的核苷酸序列的DNA)。也包括编码具有作为DNA聚合酶功能的多肽的DNA，其由在SEQ ID NO：16、24或32的氨基酸序列中缺失、插入、添加或取代1个或多个，例如1到几个，更具体地1到10个氨基酸的氨基酸序列构成。同样地，编码具有DNA聚合酶功能的多肽、能在严格条件下和与这种DNA互补的核苷酸序列构成的DNA杂交的核苷酸序列也包含在本发明的范围内。例如，“严格条件”指在68℃在含有0.5％SDS、5x Denhardt′s和100μg/ml变性的鲑精DNA的6x SSC(1x SSC：0.15MNaCl、0.015M柠檬酸钠，pH 7.0)中与探针孵育12-20小时的条件。例如，可在68℃在含有0.5％SDS的0.1x SSC中洗涤后检测与探针杂交的DNA。
本发明的基因可含有编码称作内含肽区的序列，其在翻译成多肽后从多肽中自动切除。本发明也包括含有这种序列的DNA，只要其编码具有DNA聚合酶活性的多肽即可。
尽管不作为对本发明的限制，但是例如，“具有DNA聚合酶活性的多肽”优选地是显示上述各种理化特性的具有DNA聚合酶活性的多肽。
下面解释如这里所使用的表述“含有编码氨基酸序列的核苷酸序列的DNA”。已知每个氨基酸有1-6个密码子(三个碱基的组合)，其中密码子定义基因中的氨基酸。因此，根据所编码的氨基酸序列，编码一个特定的氨基酸序列的DNA可以有多个。
此外，如果使用各种基因工程技术，那么人工产生编码同一氨基酸序列的各种基因不困难。例如，如果在编码目的多肽的原始基因中所使用的密码子在有待通过基因工程技术生产多肽的宿主中是使用率低的密码子，那么多肽的表达水平可能很低。在这种情况下，将密码子人为地转换成在宿主中经常使用的密码子，由此不改变所编码的氨基酸序列，旨在提高目的多肽的表达水平(例如，JP-B 7-102146)。如上所述，能人为地产生编码一种特定氨基酸序列的各种基因，当然，实际上可以产生。因此，本发明可包括编码这里所公开的氨基酸序列，但不具有与这里所公开的核苷酸序列相同的核苷酸序列的基因。
本发明的具有DNA聚合酶活性的多肽适于体外引物延伸。例如，当使用引物与单链DNA退火的底物(HT引物(SEQ ID NO：33)与M13单链DNA退火的底物；下文也称作M13/HT引物底物或引物延伸型底物)测定DNA聚合酶活性时，观察到核苷酸掺入的活性高于使用通常用作活性测定的活化的DNA(DNA酶I处理的小牛胸腺DNA)时所观察到的活性。
就使用M13/HT引物底物所测定的DNA聚合酶活性(下文也称作延伸活性)与使用活化的DNA作为底物所测定的DNA聚合酶活性(下文也称作掺入活性)的比值(延伸活性/掺入活性)而言，利用具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽所得的比值高于利用来自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu DNA聚合酶；Stratagene)、来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的Taq DNA聚合酶(TakaRa Taq，Takara Bio)或者来自Thermococcus kodakaraensis的KOD DNA聚合酶(KODDNA聚合酶，Toyobo)的已知DNA聚合酶所得的比值。
当向使用M13/HT引物底物的反应系统中添加作为竞争性底物的活化的DNA时，强烈抑制上述三种DNA聚合酶的引物延伸活性。在另一方面，仅轻微抑制具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽，证明该多肽具有对引物延伸型底物的高亲和力。
具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽的M13噬菌体单链DNA的Km值为2μg/ml或更低的事实也表明该多肽具有对引物延伸型底物的高亲和力。
(2)产生具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽的方法
例如，可从Tks、Tsi或Tce株的培养物中，或者从将编码多肽的基因转移到其中的转化体中大量生产具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽。
可使用生产本发明多肽的微生物的基因组DNA作为起始材料，获得编码本发明多肽的DNA。关于制备基因组DNA的方法没有特殊限制。在一个示例性的方法中，在85℃厌氧条件下培养热球(Thermococcus)属的古细菌、裂解培养的细胞以及提取DNA并纯化。可使用已知方法用于基因克隆的各种步骤，如用限制酶裂解所获得的DNA的方法。这些方法详细描述于J.Sambrook等，MolecularCloning，A Laboratory Manual，3rd ed.，2001，Cold Spring HarborLaboratory。
可在适当的培养条件下(例如，在大肠杆菌宿主的情况中，在LB培养基(10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、5g/l NaCl，pH 7.2))，通过培养用整合了编码具有DNA聚合酶活性的多肽的核酸(例如，非限定性的，具有SEQ ID NO：15、23或31的核苷酸序列的核酸)或其部分的重组质粒转化的转化体，在细胞中表达具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽。通过进行，例如，超声处理、加热，以及使用阳离子交换柱、亲和载体柱、凝胶过滤柱、阴离子交换柱等等的层析可从所培养的细胞中获得多肽。
如通过SDS-PAGE测定，这样获得的具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽的分子量是约85-90道尔顿。
具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽在75℃Tris缓冲液中所显示的最适pH为pH 5.5-6.5。当在各种温度测定DNA聚合酶的酶促活性时，其显示在75-85℃具有高度活性。具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽非常耐热。
具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽伴有3′→5′外切核酸酶活性。外切核酸酶活性相对于DNA聚合酶活性的程度超过Pfu DNA聚合酶的活性比，由于其高度外切核酸酶活性，已知导致在DNA合成上非常高的准确性。对于具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽，在所测定的DNA合成反应期间发生错误的频率低于来自Pfu的DNA聚合酶。上述各种特性显示本发明的DNA聚合酶作为基因工程(例如，对于PCR法)的试剂非常优秀。
(3)使用本发明的DNA聚合酶扩增核酸的方法，以及用于该方法的组合物和试剂盒
具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽的特征是，其具有高保真性并且适于引物延伸。由此，本发明提供使用该多肽用于准确扩增、分析或鉴定靶核酸的方法，以及用于该方法的组合物和试剂盒。
由于上述特点，具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽在PCR方法中显示非常优良的性能。例如，使用用于PCR方法的来自Thermococcus kodakaraensis(KOD DNA聚合酶，Toyobo)的DNA聚合酶很难扩增6k碱基对或更长的DNA片段。只有与其它DNA聚合酶联合使用才能扩增15k碱基对或更长的DNA片段。单独使用本发明的DNA聚合酶即可扩增15k碱基对的DNA片段，而不需要添加其它酶。
含有本发明多肽的组合物或试剂盒优于含有常规的DNA聚合酶或含有多个DNA聚合酶的组合物或试剂盒(例如，含有KOD DNA聚合酶的组合物或试剂盒；含有KOD dash DNA聚合酶的组合物或试剂盒；或者含有KOD plus DNA聚合酶的组合物或试剂盒)，可用于准确扩增、分析或鉴别靶核酸。
上述组合物或试剂盒，例如可以是含有具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽、优化多肽的缓冲液、四种dNTP以及二价阳离子的组合物或试剂盒。其可进一步含有用于扩增和/或检测靶核酸的一组引物。
本发明提供结合本发明的多肽的抗体。关于抗体没有特别限制，只要其能识别并特异性结合本发明的多肽即可。其可以是多克隆抗体或单克隆抗体。此外，本发明也包括具有与上述抗体相同的识别特征的抗体片段(例如，Fab片段)、单链抗体等等。
可根据已知方法，如在Current Protocols in Immunology，1992，John Wiley & Sons，Inc中所描述的方法，可利用作为抗原的本发明的多肽或其部分免疫小鼠或兔制备本发明的抗体。此外，可根据常规方法通过利用所免疫的动物中所收集的抗体生产细胞中产生杂交瘤，制备单克隆抗体。
可使用抗体用于本发明多肽进行检测或纯化。另外，其可用于抑制多肽的活性，如DNA聚合酶活性或3′→5′外切核酸酶活性。例如，能抑制DNA聚合酶活性的抗体可在PCR中用于在反应开始前抑制低温时从非特异性退火的引物开始的DNA延伸。此外，能抑制3′→5′外切核酸酶活性的抗体，例如可在PCR中用于抑制反应开始前的引物的降解。
实施例
下列实施例更详细地举例说明本发明，但是不应当被解释为限制其范围。
实施例1
根据下列方法制备用于测定实施例中DNA聚合酶活性的活化的DNA。
简要地，通过用DNA酶I处理以活化鲑精DNA(Sigma)或小牛胸腺DNA(Worthington)。该方法是基于C.C.Richardson在D.R.Davis(编辑)，“DNA polymerase from Escherichia coli”，pp.263-276，Harper& Row中所描述的方法。
根据下列方法测定DNA聚合酶的活性。
简要地，将进行活性测定的标本在74℃，在50μl用于活性测定的反应混合物(20mM Tris-盐酸缓冲液(pH 8.3)、10mM氯化钾、6mM硫酸铵、2mM氯化镁、0.1％Triton X-100、0.001％牛血清白蛋白、dATP、dGTP和dCTP各200μM、100μM dTTP、0.238μM [3H]-甲基TTP、0.4mg/ml活化的鲑精DNA)中反应5分钟。
反应后，向其中添加500μl含有2％Nappi(Nacalai Tesque)的20％三氯乙酸(TCA)和500μl剪切的DNA。在冰上放置15分钟或更长时间后，在玻璃滤器(Whatman)上收集混合物。将玻璃滤器用5ml含有2％Nappi的5％TCA洗涤七次，随后用乙醇洗涤并干燥，使用液体闪烁计数器测定放射性。根据上述酶活性测定方法，将在30分钟内将总共10nmol的核苷酸掺入到不溶于酸的沉淀中的酶活性定义为1U。
实施例2
根据下列方法从热球菌属(Thermococcus sp.)KS-1(JCM11816)、速生热球菌(Thermococcus celer)(JCM8558)和Thermococcus siculi(DSMZ12349)中制备基因组DNA。
简要地，将10ml所购买的培养物以8,000rpm离心10分钟。将所得的上清液以及在上清液和沉淀之间界面上的深色层进一步以15,000rpm离心10分钟。将所得的沉淀在0.8ml的20％蔗糖、50mMTris-盐酸缓冲液(pH 8.0)中悬浮。向其中添加0.16ml 500mM EDTA(pH 8.0)和0.08ml10mg/ml溶菌酶氯化物(Nacalai Tesque)水溶液。将混合物在室温下反应2小时。
反应后，向反应混合物中添加6.4ml含有150mM NaCl、1mMEDTA和20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)的溶液，0.08ml 20mg/ml蛋白酶K(Takara Bio)以及0.4ml10％月桂基硫酸钠水溶液。将所得的混合物在37℃孵育1小时。然后向其中添加等体积的100mM Tris-盐酸缓冲液(pH 8.0)饱和酚/氯仿/异戊醇混合物(25∶24∶1，v/v)。将混合物轻轻混合10分钟，然后以10,000xg离心10分钟两次。离心后，将这样获得的上清液进行乙醇沉淀，将沉淀溶于0.1ml TE缓冲液以获得基因组DNA溶液。
实施例3
(1)DNA聚合酶中间部分的克隆
根据各种耐热DNA聚合酶的氨基酸序列之间的保守部分，使用DNA合成仪合成寡核苷酸TPPolBF4、TPPolBF5、TTPolBR1和TTPolBR4(SEQ ID NOS：1-4)。
使用在实施例2中制备的250ng热球菌属(Thermococcus sp.)KS-1的基因组DNA作为模板，以及引物(每个50pmol)TPPolBF4和TTPolBR1、TPPolBF4和TTPolBR4，或者TPPolBF5和TTPolBR1的组合，在100μl的体积中进行PCR。根据所附的说明，使用TaKaRa ExTaq(Takara Bio)作为PCR的DNA聚合酶。进行如下的PCR反应：94℃，3分钟；以及40个94℃30秒钟，50℃30秒钟和72℃2分钟的循环。
反应后，将反应混合物用酚处理并用Microcon-100(Takara Bio)除去引物并浓缩所扩增的DNA片段。
通过直接测序测定浓缩的扩增片段TPPolBF4-TTPolBR1(3kb)、TPPolBF4-TTPolBR4(2kb)和TPPolBF5-TTPolBR1(0.7kb)的核苷酸序列，并且与各种耐热DNA聚合酶的氨基酸序列进行比较。结果，其显示热球菌属(Thermococcus sp.)KS-1DNA聚合酶含有内含肽序列。
(2)DNA聚合酶基因上游部分的克隆
根据在实施例3-(1)中所测定的核苷酸序列，合成用于克隆上游部分的特异性寡核苷酸Tks01(SEQ ID NO：5)。另外，合成如在表1中所示的32个引物。表1中的标签序列如SEQ ID NO：6所示。
                           表1
  5′-标签序列-NN-SSSSSSS-3′(N：G、A、T和C的混合物；S代表下面的核苷酸序列)
  No.   核苷酸序列   No.   核苷酸序列   No.   核苷酸序列
  123456789101112   gcccaaagctcatagtggcgagaaagccgaggtaggcttttggtatccgggacggtgcaaaacgatcatcgtgccgcgcgggcg   131415161718192021222324   gccgtatgggatttgtcaagcgcgttatgggcaaggatcatcgtagcgggcgtgctgcgttcagggcgaagtcttcagggtaaa   2526272829303132   gtggacagtcccaagctgctaggcgggcgccgtcggaaccgtgttccacggtgcag
在50μl反应混合物中进行PCR，每个反应混合物含有在实施例2中制备的1ng热球菌属(Thermococcus sp.)KS-1基因组DNA作为模板、10pmol Tks01和10pmol表1中所列32个引物之一的组合、20mMTris-乙酸缓冲液(pH 8.5)、50mM乙酸钾、3mM乙酸镁、0.01％BSA、dNTP各300μM以及1.25U TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶(TakaraBio)。进行如下PCR：在94℃孵育3分钟；以及40个98℃10秒钟，50℃10秒钟和72℃40秒钟的循环。将每个PCR产物的部分进行琼脂糖凝胶电泳。使用Microcon-100(Takara Bio)从所选的用于产生单一条带的反应混合物中除去引物并浓缩反应混合物。对浓缩物进行直接测序以筛选含有DNA聚合酶上游部分的片段。结果，显示约1300-bp PCR扩增的片段Tks012G含有目的DNA聚合酶基因的上游部分。此外，进一步证实该片段含有与实施例3-(1)不同的内含肽序列。
根据Tks012G的序列，合成用于克隆起始密码子附近更上游部分的特异性寡核苷酸Tks04(SEQ ID NO：7)。使用在实施例2中制备的1ng热球菌属(Thermococcus sp.)KS-1基因组DNA作为模板，以及10pmol Tks04和10pmol表1中所列32个引物之一的组合在50-μl反应混合物中进行PCR。PCR的条件和纯化方法如上所述。将扩增的片段进行直接测序以筛选含有DNA聚合酶上游部分的片段。结果，显示约1800-bp PCR扩增片段Tks041B含有目的DNA聚合酶基因的起始密码子附近的部分。
(3)DNA聚合酶下游部分的克隆
根据实施例3-(1)中测定的核苷酸序列，合成用于克隆上游部分的特异性寡核苷酸Tks02(SEQ ID NO：8)。使用在实施例2中制备的1ng热球菌属(Thermococcus sp.)KS-1基因组DNA作为模板，以及10pmolTks02和10pmol表1中所列32个引物之一的组合进行PCR。PCR的条件如上所述。将每个PCR产物的部分进行琼脂糖凝胶电泳。回收约2500-bp的Tks022D DNA片段，用T4DNA聚合酶(Takara Bio)平末端化并用T4DNA连接酶(Takara Bio)连接到已用HincII(Takara Bio)消化的pUC118(Takara Bio)上。使用该质粒转化大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109。培养转化体以获得具有插入约2500-bp DNA片段的质粒pTks022D，测定所插入的DNA片段的核苷酸序列。
(4)表达DNA聚合酶的质粒的构建
已证明在热球菌属(Thermococcus sp.)KS-1DNA聚合酶的序列中含有两个内含肽序列。
然后，构建除去了内含肽序列的DNA聚合酶基因。
根据实施例3-(3)中所测定的序列，合成寡核苷酸TksNde、Tks1EndBg、Tks2StaBg、Tks2EndBal、Tks3StaBal和TksBgPs(SEQ IDNOS：9-14)。
使用在实施例2中制备的100ng热球菌属(Thermococcus sp.)KS-1基因组DNA作为模板，以及引物(每种20pmol)TksNde和Tks1EndBg(TksA)、Tks2StaBg和Tks2EndBal(TksB)或者Tks3StaBal和TksBgPs(TksC)的组合，在100μl的体积中进行PCR。根据所附的说明，使用Pyrobest(Takara Bio)作为PCR的DNA聚合酶。进行如下反应：94℃30秒钟，50℃30秒钟以及72℃3分钟，如此40个循环。然后，获得下列扩增的DNA片段：约1.3-kb TksA；约0.3-kb TksB；以及约0.9-kb TksC。另外，在上述条件下以类似方式使用1μl PCR反应混合物TksB和1μlPCR反应混合物TksC的混合物作为模板，以及20pmol Tks2StaBg和20pmol TksBgPs(TksD)作为引物，在100μl体积中进行PCR。然后，获得约1.2-kb扩增的DNA片段TksD。
DNA片段TksA用限制酶NdeI和BglII消化。DNA片段TksD用限制酶BglII和PstI消化。根据常规方法将它们连接到已用限制酶NdeI和PstI消化的pTV119Nd(pTV119N中的NcoI位点转化成NdeI位点的质粒)中以构建质粒pTks59。将该质粒称作并表示为Tks59，并于2004年5月14日(原始保藏日期)保藏在国际专利生物保藏中心，国立高等工业科学和技术学院，AIST Tsukuba中心6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，日本，保藏号FERM BP-10312。
(5)含有DNA聚合酶基因的DNA片段的核苷酸序列的测定
根据双脱氧法测定实施例3-(4)中所获得的插入到pTks59中的DNA片段的核苷酸序列。
所测定的核苷酸序列的分析显示，存在可能编码目的DNA聚合酶的可读框。可读框的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。从核苷酸序列中推定的RNA酶HII的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
(6)热球菌属(Thermococcus sp.)KS-1DNA聚合酶基因的表达
将用pTks59转化的大肠杆菌(Escherichia coli)JM109接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的5ml LB培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠)中并在37℃培养6小时。将50μl培养物接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的5ml LB培养基中，在37℃震荡过夜培养。培养后，将通过离心收集的细胞悬于36μl超声处理缓冲液(50mM Tris-盐酸(pH 8.0)、2mM 2-巯基乙醇、10％甘油)中并进行超声处理。将超声处理的悬液通过在12,000rpm离心10分钟所获得的上清液在80℃加热10分钟，然后再次在12,000rpm离心10分钟以收集上清液作为加热过的上清液。
根据实施例1中所述的方法测定加热的上清的酶活性。结果，观察到有DNA聚合酶活性。
(7)纯化的DNA聚合酶制剂的制备
将用实施例3-(5)中所获得的质粒pTks59转化的大肠杆菌JM109接种到400ml含有50μg/ml氨苄青霉素和0.1％葡萄糖的LB培养基中，并在37℃震荡过夜培养。将整个培养物加到含有50μg/ml氨苄青霉素的20升LB培养基中并在37℃培养到OD660为1.0。当OD600达到1.0时，添加IPTG至终浓度为0.2mM，继续在37℃培养4小时。培养后，将通过离心收集的细胞在732ml缓冲液A(50mM Tris-盐酸缓冲液(pH 7.5)、2mM EDTA、2mM二硫苏糖醇、1mM苯甲基磺酰氟)中悬浮并进行超声处理。将超声处理过的悬液在12,000rpm离心30分钟。向所得的上清液中添加硫酸铵至终浓度为0.2M。将混合物在75℃加热15分钟并使其在0℃放置30分钟。将其再次在12,000rpm离心30分钟。使用聚乙烯亚胺和硫酸铵沉淀除去上清液中的核酸，并用2升缓冲液B(50mM Tris-盐酸缓冲液(pH 7.5)、1mM EDTA、10％甘油、1mM二硫苏糖醇、1mM苯甲基磺酰氟)透析2次，每次2小时并过夜透析一次。透析后，将200ml酶溶液加到用缓冲液B平衡的磷酸纤维素P-11柱(Whatman)上。使用FPLC系统(AmershamPharmacia Biotech)，用0-500mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)的线性梯度进行洗脱。
将洗脱的DNA聚合酶级分用1升缓冲液C(20mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.5)、0.1mM EDTA、10％甘油、0.2％Tween 20、1mM二硫苏糖醇)透析2次，每次2小时并过夜透析一次。透析后，将100ml的酶溶液加到用缓冲液B平衡的肝素-琼脂糖CL-6B(PharmaciaPharmacia Biotech)上。使用FPLC系统，用0-700mM KCl的线性梯度进行洗脱。
将级分用1升缓冲液D(20mM Tris-HCl(pH 9.0)、0.1mM EDTA、10％甘油、0.2％Tween 20、1mM二硫苏糖醇)透析2次，每次2小时并过夜透析一次。透析后，将50ml酶溶液加到上用缓冲液D平衡的Q-琼脂糖(Pharmacia Pharmacia Biotech)上。使用FPLC系统，用0-300mM NaCl的线性梯度进行洗脱。
将级分用1升贮藏缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8.2)、0.1mMEDTA、10mM氯化钠、0.1％Tween 20、0.1％Nonidet P-40、1mM二硫苏糖醇、50％甘油)透析2次，每次2小时并过夜透析一次。将这样获得的DNA聚合酶用作Tks DNA聚合酶制剂。
根据在实施例1中所描述的方法测定Tks DNA聚合酶制剂的活性。结果，观察到有DNA聚合酶活性。
实施例4
(1)DNA聚合酶基因中间部分的克隆
根据各种耐热DNA聚合酶的氨基酸序列之间的保守部分，合成寡核苷酸TPPolBF1、TPPolBF5、TTPolBR1和TTPolBR5(SEQ IDNOS：17、2、3、18)。
使用在实施例2中制备的250ng速生热球菌(Thermococcusceler)基因组DNA作为模板，以及引物(每种50pmol)TPPolBF1和TTPolBR1、TPPolBF1和TTPolBR5或者TPPolBF5和TTPolBR1的组合，在100μl体积中进行PCR。PCR的条件和纯化方法如实施例3-(1)中所述。通过直接测序确定扩增片段TPPolBF1-TTPolBR1(约2kb)、TPPolBF1-TTPolBR5(约1kb)以及TPPolBF5-TTPolBR1(约0.8kb)的核苷酸序列。
(2)DNA聚合酶基因的上游和下游部分的克隆
根据实施例4-(1)中所测定的核苷酸序列，合成用于克隆上游部分的特异性寡核苷酸Tce01(SEQ ID NO：19)和用于克隆下游部分的Tce02(SEQ ID NO：20)。
使用在实施例2中制备的1ng速生热球菌(Thermococcus celer)基因组DNA作为模板，以及10pmol Tce01或Tce02和10pmol实施例3-(2)表1中所列32个引物之一的组合进行PCR。PCR的条件和纯化方法如实施例3-(2)中所述。将扩增产物进行直接测序以筛选含有目的DNA聚合酶上游区的片段。结果，显示约650-bp PCR扩增片段Tce013C含有DNA聚合酶基因的上游部分，约650-bp PCR扩增片段Tce022F含有DNA聚合酶基因的下游部分。
(3)用于表达DNA聚合酶的质粒的构建
根据实施例4-(2)中所测定的序列合成寡核苷酸TceNde和TceBgPs(SEQ ID NOS：21和22)。
使用在实施例2中所制备的100ng速生热球菌(Thermococcusceler)基因组DNA作为模板，以及引物(每种20pmol)TceNde和TceBgPs的组合，在100μl体积中进行PCR。根据所附的说明，使用Pyrobest(Takara Bio)作为PCR的DNA聚合酶。进行如下的反应：94℃30秒钟，50℃30秒钟以及72℃2分钟，如此40个循环。用限制性酶NdeI和BglII(购自Takara Bio)消化约2.3-kb扩增的DNA片段。在质粒载体pTV119Nd(将pTV119N中的NcoI位点转变成NdeI位点的质粒)的NdeI和BamHI位点之间整合DNA片段以构建质粒pTce19。将该质粒称作并表示为pTce19，并在2004年5月14日(原始保藏日期)保藏在国际专利微生物保藏中心，国立高等工业科学和技术学院，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，日本，保藏号为FERM BP-10311。
(4)含有DNA聚合酶基因的DNA片段的核苷酸序列的测定
根据双脱氧法测定插入到pTce19中的DNA片段的核苷酸序列。
所测定的核苷酸序列的分析显示，存在可能编码目的DNA聚合酶的可读框。可读框的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示。从该核苷酸序列所推断的DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。
(5)速生热球菌(Thermococcus celer)DNA聚合酶基因的表达
根据如实施例3-(6)中所述的方法，培养用pTce19转化的大肠杆菌JM109。将通过离心所收集的细胞悬浮在64μl超声处理缓冲液中并进行超声处理。将超声处理的悬液通过在12,000rpm离心10分钟所获得的上清液在80℃加热10分钟，然后在12,000rpm再次离心10分钟以收获上清液作为加热的上清液。
根据如在实施例1中所描述的方法测定加热的上清液的酶活性。结果，观察到有DNA聚合酶活性。
(6)纯化的DNA聚合酶制剂的制备
根据实施例3-(7)中所描述的方法培养用pTce19转化的大肠杆菌JM109。根据如在实施例3-(7)中所描述的方法进行纯化直到用0-700mM KCl的线性梯度从肝素-琼脂糖CL-6B(Pharmacia Biotech)上洗脱的步骤。
将洗脱的DNA聚合酶级分用含有0.3M氯化钠的1升缓冲液C透析2次，每次2小时并过夜透析一次。透析后，将95ml酶溶液加到用含有0.3M氯化钠的缓冲液C平衡的Superdex G200(PharmaciaBiotech)上。用含有0.3M氯化钠的缓冲液C进行洗脱。
将洗脱的DNA聚合酶级分用1升缓冲液D透析2次，每次2小时并过夜透析一次。透析后，将45ml酶溶液加到用缓冲液D平衡的Q-琼脂糖(Pharmacia Pharmacia Biotech)上。使用FPLC系统，用0-300mM NaCl的线性梯度进行洗脱。
将级分用1升贮藏缓冲液透析2次，每次2小时并过夜透析一次。将这样所得的DNA聚合酶用作Tce DNA聚合酶制剂。
根据如实施例1中所描述的方法测定Tce DNA聚合酶制剂的酶活性。结果，观察到Tce DNA聚合酶制剂有DNA聚合酶活性。
实施例5
(1)DNA聚合酶基因的中间部分的克隆
根据各种耐热DNA聚合酶的氨基酸序列之间的保守部分，合成寡核苷酸TPPolBF1、TPPolBF5、TTPolBR1、TTPolBR4和TTPolBR5(SEQID NOS：17、2、3、4、18)。
使用在实施例2中制备的250ng Thermococcus siculi基因组DNA作为模板，以及引物(每种50pmol)TPPolBF1和TTPolBR4、TPPolBF1和TTPolBR5或者TPPolBF5和TTPolBR1的组合，在100μl体积中进行PCR。PCR的条件和纯化方法如在实施例3-(1)中所述。通过直接测序测定扩增片段TPPolBF1-TTPolBR4(约1.2kb)、TPPolBF1-TTPolBR5(约1kb)和TPPolBF5-TTPolBR1(约2kb)的核苷酸序列。结果，显示Thermococcus siculi DNA聚合酶含有内含肽序列。
(2)DNA聚合酶基因的上游和下游部分的克隆
根据在实施例5-(1)中所测定的核苷酸序列，合成用于克隆上游部分的特异性寡核苷酸Tsi01(SEQ ID NO：25)和用于克隆下游部分的Tsi06(SEQ ID NO：26)。
使用在实施例2中制备的1ng Thermococcus siculi基因组DNA作为模板，以及10pmol Tsi01或Tsi06和10pmol表1所列32个引物之一的组合进行PCR。PCR的条件和纯化方法如实施例3-(2)所述。将扩增产物进行直接测序以筛选含有目的DNA聚合酶的上游区的片段。结果，显示约2900-bp片段Tsi011A含有DNA聚合酶基因的上游部分，约400-bp片段Tsi065B含有DNA聚合酶基因的下游部分。
(3)用于表达DNA聚合酶的质粒的构建
证明在Thermococcus siculi DNA聚合酶的序列中含有一个内含肽序列。然后，构建除去内含肽了序列的DNA聚合酶基因。
根据在实施例5-(2)中所测定的序列，合成寡核苷酸TsiNde、TsiA、TsiB和TsiBamPst(SEQ ID NOS：27-30)。
使用在实施例2中制备的100ng的Thermococcus siculi基因组DNA作为模板，以及引物(各20pmol)TksNde和TsiB(TsiI)或者TsiA和TsiBamPst(TsiII)的组合，在100μl体积中进行PCR。如在实施例5-(2)中所述进行PCR以获得DNA片段TsiI(约1.5kb)和TsiII(约0.9kb)。另外，使用1μlPCR反应混合物TsiI和1μl PCR反应混合物TsiII的混合物作为模板，以及20pmol TsiNde和20pmol TsiBamPst作为引物，在100μl体积中以类似方式进行PCR。获得约2.4-kb DNA片段。
用限制性酶NdeI和BamHI消化所得的约2.4-kb DNA片段。将DNA片段连于已用NdeI和BamHI消化的pTV119Nd(将pTV119N中的NcoI位点转变成NdeI位点的质粒)以构建质粒pTsi16。将该质粒称作并表示为Tsi16，并且在2004年5月4日保藏在国际专利微生物保藏中心，国立高等工业科学和技术学院，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，日本，保藏号为FERM BP-10310。
(4)含有DNA聚合酶基因的DNA片段的核苷酸序列的测定
根据双脱氧法测定在实施例5-(3)中所获得的插入到pTsi16中的DNA片段的核苷酸序列。所测定的核苷酸序列的分析显示，存在可能编码目的DNA聚合酶的可读框。可读框的核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示。从该核苷酸序列推断的DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ IDNO：32所示。
(5)Thermococcus siculi DNA聚合酶基因的表达
根据如在实施例3-(6)中所述的方法培养用质粒pTsi16转化的大肠杆菌JM109。在52μl超声处理的缓冲液中悬浮通过离心所收集的细胞并进行超声处理。将超声处理的悬液通过在12,000rpm离心10分钟后所获得的上清液在80℃加热10分钟，然后在12,000rpm再次离心10分钟以收集上清液作为加热的上清液。
根据如在实施例1中所述的方法测定加热的上清液的酶活性。结果，观察到有DNA聚合酶活性。
(6)纯化的DNA聚合酶制剂的制备
根据如实施例3-(7)中所述的方法培养用质粒pTsi16转化的大肠杆菌JM109。根据如实施例3-(7)中所述的方法进行纯化。
这样获得的DNA聚合酶用作Tsi DNA聚合酶制剂。根据如在实施例1中所述的方法测定Tsi DNA聚合酶制剂的活性。结果，观察到TsiDNA聚合酶制剂有DNA聚合酶活性。
实施例6
(1)各DNA聚合酶的掺入和延伸活性
测定Tks、Tce和Tsi DNA聚合酶的掺入和延伸活性。使用可通过商业途径获得的产品KOD DNA聚合酶(Toyobo)作为对照。
当测定掺入活性时，使用1μg活化的小牛胸腺DNA作为模板。当测定延伸活性时，使用M13/HT引物，其中将1μg M13噬菌体单链DNA和与其互补的1pmol HT引物(SEQ ID NO：33)退火。使用含有1mM氯化镁的KOD#1缓冲液作为缓冲液。根据下列方法测定DNA聚合酶活性。
简要地说，将含有要进行活性测定的酶标本、上述模板、40μMdNTP、0.238μM[3H]甲基-TTP(Amersham)以及1mM氯化镁的50μlKOD#1缓冲液在75℃反应5分钟。将40μl反应混合物点在DE81纸(Whatman)上。用5％Na2PO4洗涤4次后，使用液体闪烁计数器测定DE81纸上残留的放射性。根据上述酶活性测定方法，将导致在30分钟内将10nmol dNMP掺入到底物DNA中的酶量定义为1U的酶。结果显示于表2。在表2中，“掺入”代表在作为模板的核酸的缺口位点处掺入的能力，“延伸”代表由于延伸从与作为模板的核酸退火的引物掺入的能力。
                        表2
  聚合酶活性(U/μl)   掺入   延伸   延伸/掺入
  Tks   9.38   11.46   1.22
  Tce   10.83   13.28   1.23
  Tsi   9.67   21.93   2.27
  KOD   6.80   6.69   0.98
如表2所示，进一步证实Tks、Tce和Tsi DNA聚合酶由引物延伸所显示出的掺入的活性高于KOD#1缓冲液中向模板DNA中掺入核酸到的活性。此外，进一步证实与用作对照的KOD DNA聚合酶相比，由于引物延伸的掺入活性非常高。基于上述结果，进一步证实本发明的DNA聚合酶非常适于引物延伸。
(2)对M13单链DNA的亲和力
检查Tks、Tce和Tsi DNA聚合酶的掺入和对M13单链DNA聚合酶的亲和力。使用KOD DNA聚合酶作为对照。
使用各种浓度的M13单链DNA作为模板。使用与其互补的1pmolHT引物作为引物。使用含有1mM氯化镁的KOD#1缓冲液作为缓冲液。根如实施例6-(1)中所述的方法测定DNA聚合酶活性。结果如表3所示。
        表3
  聚合酶   Km(μg/ml)
  Tks   1.04
  Tce   0.91
  Tsi   1.33
  KOD   2.65
如表3所示，进一步证实本发明的Tks、Tce和Tsi DNA聚合酶显示对M13单链DNA的亲和力高于KOD DNA聚合酶。根据上述结果，就PCR中的检测灵敏度而言，本发明的DNA聚合酶优于KOD DNA聚合酶。
(3)Tks和Tsi DNA聚合酶的保真性
检查Tks和Tsi DNA聚合酶的保真性。使用KOD DNA聚合酶和KOD plus DNA聚合酶(两者均来自Toyobo)以及Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio)作为对照。
使用嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB8基因组DNA(Takara Bio)作为模板。另外，使用引物c280/RG34-F和-R(SEQ IDNOS：34和35)。
根据下列方法测定保真性。简要地，在50μl体积中进行PCR，使用10ng嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB8基因组DNA(TakaraBio)作为模板，以及引物c280/RG34-F和-R的组合。由于用引物扩增区域的GC含量高(70％)，因此添加2％浓度的DMSO。当使用Tks、Tsi和KOD plus DNA聚合酶时，根据所附的说明使用KOD plus缓冲液。当使用KOD DNA聚合酶时，根据KOD DNA聚合酶所附的说明，使用KOD#1缓冲液。此外，根据所附的说明，在所附的缓冲液中使用Pyrobest DNA聚合酶。PCR的条件如下：在96℃孵育2分钟，随后98℃5秒钟；以及68℃30秒钟，如此30个循环。反应后，向其中添加等体积的100mM Tris-盐酸缓冲液(pH 8.O)饱和酚/氯仿/异戊醇混合物(25∶24∶1，v/v)。将混合物混合，然后在10,000xg离心10分钟，两次。离心后，将上清液与氯仿/异戊醇的混合物(24∶1，v/v)混合，然后在10,000xg离心10分钟。将这样获得的上清液进行乙醇沉淀，将沉淀溶于20μlH2O中以获得约0.5-bp DNA片段。根据TaKaRa BKL试剂盒(Takara Bio)的方案，对每8μl约0.5-bp DNA片段进行处理，使用每5μl所得的溶液转化大肠杆菌JM109。培养所得的转化体，测定12-24个插入约500-bp DNA片段的克隆的核苷酸序列，并且计算突变的核苷酸数与所阅读的总核苷酸数的比值以确定保真性。结果如表4所示。
                表4
  缓冲液   酶名称   突变频率
  KOD plus   Tks   0.000％
  Tsi   0.021％
  KOD plus   0.082％
  特殊缓冲液   Pyrobest   0.023％
  KOD#1   KOD   0.022％
如表4所示，进一步证实本发明的Tks和Tsi DNA聚合酶的突变频率低于KOD、KOD plus或Pyrobest DNA聚合酶。基于上述结果，证明它们作为用于克隆的酶比KOD、KOD plus或Pyrobest DNA聚合酶更优秀。
(4)Tks和Tce DNA聚合酶的保真性
检查Tks和Tce DNA聚合酶的保真性。使用KOD DNA聚合酶和KOD plus DNA聚合酶(来自Toyobo)以及Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio)作为对照。
使用嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB8基因组DNA(TakaraBio)作为模板。另外，使用引物c240/RA18-F和-R(SEQ ID NOS：36和37)。
为了测定保真性，使用10ng嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB-8基因组DNA作为模板，以及引物TEMP10-F和-R的组合，在50μl体积中进行PCR。由于引物所扩增的区域的GC含量高(70％)，因此添加2％浓度的DMSO。根据所附的说明，使用KOD#1缓冲液作为缓冲液。PCR的条件和计算保真性的方法如实施例6-(3)所述。结果显示于表5。
              表5
  缓冲液   酶名称   突变频率
  KOD#1   Tks   0.000％
  Tce   0.000％
  KOD   0.064％
如表5所示，进一步证明本发明的Tks和Tce DNA聚合酶的突变频率低于KOD。也根据上述结果，证明它们作为用于克隆的酶很优秀。
实施例7
(1)各自DNA聚合酶的最适温度
测定Tks、Tce和Tsi DNA聚合酶的最适温度。使用20μg活化的小牛胸腺DNA作为模板。使用Pyrobest DNA聚合酶所附的缓冲液作为缓冲液。根据下列方法测定DNA聚合酶活性。
首先，制备含有5mU(根据如实施例6-(1)所述掺入活性测定方法所计算的)将要进行活性测定的酶标本、上述模板、200μM dATP、200μM dGTP、200μM dCTP、100μM dTTP、0.204μM[3H]甲基-TTP(Amersham)和Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio)所附的1x缓冲液的50μl反应混合物。使用各自酶标本，在65℃-85℃范围的期望温度反应5分钟。将每种反应混合物40μl点到DE81纸(Whatman)上。用5％Na2PO4洗涤4次后，使用液体闪烁计数器测定DE81纸上残留的放射性。在图1图示根据上述活性测定方法所测定的活性和反应温度之间的关系。在图1中，将反应在85℃所观察到的活性定义为100％。
如图1所示，当使用活化的小牛胸腺DNA作为模板时，Tks、Tce和Tsi DNA聚合酶具有75℃-85℃范围的最适温度。
(2)各DNA聚合酶的最适pH
测定Tks、Tce和Tsi DNA聚合酶的最适pH。使用10μg活化的小牛胸腺DNA作为模板。使用已在75℃时将pH调至pH 5.0-pH 8.0的期望值的120mM Tris-HCl缓冲液作为缓冲液。根据下列方法测定DNA聚合酶活性。
首先，制备含有0.05U(根据如实施例6-(1)所述掺入活性测定方法所计算的)将要进行活性测定的酶标本、上述模板、上述缓冲液、10mM KCl、6mM(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100、0.001％BSA、1mMMgCl2、40μM dNTP和0.204μM[3H]甲基-TTP(Amersham)的50μl反应混合物。使用各自酶标本在75℃反应5分钟。将每个混合物的40μl溶液点在DE81纸(Whatman)上。用5％Na2PO4洗涤4次后，使用液体闪烁计数器测定DE81纸上残留的放射性。在图2图示根据上述活性测定方法所测定的活性与pH之间的关系。在图2中，将在pH 6.0(75℃)时所观察到的反应的活性定义为100％。
如图2所示，当使用活化的小牛胸腺DNA作为模板时，Tks、Tce和Tsi DNA聚合酶具有pH 5.5-pH 6.5(75℃)范围的最适pH。
实施例8
为了将本发明的DNA聚合酶在PCR反应中的性能与KOD DNA聚合酶进行比较，使用λ-DNA作为模板进行PCR反应。用KOD plusDNA聚合酶所附的1x缓冲液、200μM dNTP和1mM(NH4)2SO4(对于Tks、Tce或Tsi DNA聚合酶)；或者KOD DNA聚合酶所附的1x缓冲液、200μM dNTP和1mM MgCl2(对于KOD DNA聚合酶)的反应混合物组合物，制备含有1ng/50μlλ-DNA(Takara Shuzo)、10pmol/50μl引物λ-1、10pmol/50μlλ-9B和0.625U/50μl DNA聚合酶的50μl反应混合物。
在SEQ ID NOS：38和39中分别示出引物λ-1和λ-9B的核苷酸序列。将反应混合物进行如下反应：98℃10秒钟；以及68℃10分钟，如此30个循环。然后，将每个反应混合物的3μl溶液进行琼脂糖凝胶电泳，并且通过用溴化乙锭染色观察所扩增的DNA片段。结果，使用KOD DNA聚合酶没有观察到DNA片段的扩增。在另一个方面，使用Tks、Tce或Tsi DNA聚合酶观察到约12k碱基对的DNA片段的扩增。
其次，将引物改变成引物λ-1和引物λ-10D进行实验。在SEQ IDNO：40中引物λ10D的核苷酸序列。用与上述相同的反应混合物组合物制备50μl含有1ng/50μlλ-DNA(Takara Shuzo)、10pmol/50μl引物λ-1、10pmol/50μl引物λ-10d和0.625U/50μlDNA聚合酶的反应混合物。将反应混合物进行下列PCR反应：98℃10秒钟；以及68℃10分钟，如此30个循环。然后，将每个反应混合物的3μl溶液进行琼脂糖凝胶电泳，并通过用溴化乙锭染色观察所扩增的DNA片段。结果，使用KOD DNA聚合酶没有观察到DNA片段的扩增。在另一个方面，使用Tks、Tce或Tsi DNA聚合酶观察到约15k碱基对的DNA片段的扩增。
实施例8
(1)小鼠杂交瘤细胞系的生产
向在实施例2中所制备的210μg(100μl)Tks DNA聚合酶制剂、在实施例4中所制备的210μg(100μl)Tce DNA聚合酶制剂，或者在实施例6中所制备的200μg(100μl)Tsi DNA聚合酶制剂添加800μlPBS。将每个混合物用1ml完全弗氏佐剂(Difco Lab.)乳化以获得抗原制剂。将该抗原制剂分成相等的部分并通过腹膜内施用给4只Balb/c小鼠(10周龄，雌性，CREA日本)。在2和5周后进行下列强化免疫：通过向与上述等量的DNA聚合酶制剂中添加900μlPBS和RIBI佐剂(RIBI)制备抗原制剂，向各自小鼠腹膜内施用其相等的部分。此外，初次抗原施用后6周进行下列终免疫：通过向与上述等量的DNA聚合酶制剂中添加900μlPBS制备抗原制剂，并向各自组中的小鼠腹膜内施用其相等的部分。
终免疫后3天从所免疫动物中的两只中除去脾，并且在存在50％聚乙二醇时与P3-X63-Ag8-U1小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合。将细胞分配到10个96孔平板内并培养。
(2)杂交瘤细胞系的筛选
使用在实施例8-(1)中用作抗原的各DNA聚合酶制剂的溶液(5μg/ml)，制备用DNA聚合酶包被的96孔平板。对于在上述细胞融合中所获得的细胞，从观察到细胞生长的孔中收集上清液，在DNA聚合酶包被的平板上进行ELISA法以测定培养物上清液中是否存在抗DNA聚合酶抗体。对使用DNA聚合酶作为抗原所获得的900个或更多细胞系进行该试验。根据该方法选择鉴定为用于生产抗体的细胞系(TksDNA聚合酶：95个细胞系；Tce DNA聚合酶：103个细胞系；Tsi DNA聚合酶：61个细胞系)。
培养所选的细胞系作为原始细胞系，在42℃使用培养物上清液检查各自DNA聚合酶的聚合酶活性的抑制。根据下列方法测定抑制活性。将已与每个杂交瘤的培养物上清液中的IgG结合的抗小鼠IgG磁珠(Dynabeads M-280绵羊抗小鼠IgG，Dynal Biotech)和DNA聚合酶在室温下孵育10分钟。然后在42℃测定DNA聚合酶活性并与单独使用DNA聚合酶得到的DNA聚合酶活性测定的结果进行比较。结果，在下列系的培养物上清液中观察到DNA聚合酶活性的抑制：Tks DNA聚合酶：18个细胞系；Tce DNA聚合酶：28个细胞系；Tsi DNA聚合酶：11个细胞系。通过限制性稀释分析，对这些细胞系进行克隆。
在42℃检查每个克隆细胞的培养物上清液中DNA聚合酶的聚合酶活性的抑制。选择下列系作为抑制95％或更高的聚合酶活性的杂交瘤克隆系：Tks DNA聚合酶：1个细胞系；Tce DNA聚合酶：2个细胞系；Tsi DNA聚合酶：2个细胞系。检查由这些杂交瘤克隆系所产生的抗体的同种型。结果，Tks和Tce DNA聚合酶的抗体是IgG2b型，TsiDNA聚合酶的抗体是IgG1和G2b型。当将从杂交瘤的培养物上清液中所制备的抗体在94℃加热5分钟时，完全丧失抑制DNA聚合酶的活性。因此，证明这些抗体可以低温度特异性方式用于抑制耐热DNA聚合酶的活性。
工业应用性
本发明提供适于引物延伸的具有高保真性DNA聚合酶活性的多肽，其可用于克隆、测序和核酸扩增，编码该多肽的基因，以及用于生产具有DNA聚合酶活性的该多肽的方法。使用具有本发明的DNA聚合酶活性的多肽，可获得具有较低错误率的扩增产物，例如，即使其用于包括多个循环的PCR。因此，其可用于以低拷贝数量存在的靶核酸的分析或鉴别。
序列表自由文本
SEQ ID No：1；设计用于扩增热球菌属某种(Thermococcus sp.)基因组DNA的寡核苷酸引物TPPolBF4
SEQ ID No：2；设计用于扩增热球菌属某种(Thermococcus sp.)基因组DNA的寡核苷酸引物TPPolBF5
SEQ ID No：3；设计用于扩增热球菌属某种(Thermococcus sp.)基因组DNA的寡核苷酸引物TTPolBR1
SEQ ID No：4；设计用于扩增热球菌属某种(Thermococcus sp.)基因组DNA的寡核苷酸引物TTPolBR4
SEQ ID No：5；设计用于扩增热球菌属某种(Thermococcus sp.)KS-1基因组DNA的寡核苷酸引物Tks01
SEQ ID No：6；设计用于扩增热球菌属某种(Thermococcus sp.)基因组DNA的寡核苷酸标签序列区
SEQ ID No：7；设计用于扩增热球菌属某种(Thermococcus sp.)KS-1基因组DNA的寡核苷酸引物Tks04
SEQ ID No：8；设计用于扩增热球菌属某种(Thermococcus sp.)KS-1基因组DNA的寡核苷酸引物Tks02
SEQ ID No：9；设计用于扩增热球菌属某种(Thermococcus sp.)KS-1基因组DNA的寡核苷酸引物TksNde
SEQ ID No：10；设计用于扩增热球菌属某种(Thermococcus sp.)KS-1基因组DNA的寡核苷酸引物Tks1EndBg
SEQ ID No：11；设计用于扩增热球菌属某种(Thermococcus sp.)KS-1基因组DNA的寡核苷酸引物Tks2StaBg
SEQ ID No：12；设计用于扩增热球菌属某种(Thermococcus sp.)KS-1基因组DNA的寡核苷酸引物Tks2EndBal
SEQ ID No：13；设计用于扩增热球菌属某种(Thermococcus sp.)KS-1基因组DNA的寡核苷酸引物Tks3StaBal
SEQ ID No：14；设计用于扩增热球菌属某种(Thermococcus sp.)KS-1基因组DNA的寡核苷酸引物TksBgPs
SEQ ID No：17；设计用于扩增热球菌属某种(Thermococcus sp.)基因组DNA的寡核苷酸引物TPPolBF1
SEQ ID No：18；设计用于扩增热球菌属某种(Thermocoecus sp.)基因组DNA的寡核苷酸引物TTPoIBR5
SEQ ID No：19；设计用于扩增速生热球菌(Thermococcus celer)基因组DNA的寡核苷酸引物Tce01
SEQ ID No：20；设计用于扩增速生热球菌(Thermococcus celer)基因组DNA的寡核苷酸引物Tce02
SEQ ID No：21；设计用于扩增速生热球菌(Thermococcus celer)基因组DNA的寡核苷酸引物TceNde
SEQ ID No：22；设计用于扩增速生热球菌(Thermococcus celer)基因组DNA的寡核苷酸引物TceBgPs
SEQ ID No：25；设计用于扩增Thermococcus siculi基因组DNA的寡核苷酸引物Tsi01
SEQ ID No：26；设计用于扩增Thermococcus siculi基因组DNA的寡核苷酸引物Tsi06
SEQ ID No：27；设计用于扩增Thermococcus siculi基因组DNA的寡核苷酸引物TsiNde
SEQ ID No：28；设计用于扩增Thermocoecus siculi基因组DNA的寡核苷酸引物TsiA
SEQ ID No：29；设计用于扩增Thermococcus siculi基因组DNA的寡核苷酸引物TsiB
SEQ ID No：30；设计用于扩增Thermococcus siculi基因组DNA的寡核苷酸引物TsiBamPst
SEQ ID No：33；设计用于扩增M13基因组DNA的寡核苷酸引物HT SEQ ID No：34；设计用于扩增嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB-8基因组DNA的寡核苷酸引物c280/RG34-F
SEQ ID No：35；设计用于扩增嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)HB-8基因组DNA的寡核苷酸引物c280/RG34-R
SEQ ID No：36；设计用于扩增嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)HB-8基因组DNA的寡核苷酸引物c240/RA18-F
SEQ ID No：37；设计用于扩增嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)HB-8基因组DNA的寡核苷酸引物c240/RA18-R
SEQ ID No：38；设计用于扩增噬菌体λ的DNA的寡核苷酸引物λ-1
SEQ ID No：39；设计用于扩增噬菌体λ的DNA的寡核苷酸引物λ-9B
SEQ ID No：40；设计用于扩增噬菌体λ的DNA的寡核苷酸引物λ-10D。
            序列表
<110>TAKARA BIO INC.
<120>具有DNA聚合酶活性的多肽
<130>665234
<150>JP 2004-166541
<151>2004-06-04
<160>40
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增热球菌属(Thermococcus sp.)基因组DNA的寡核苷酸引物TPPolBF4
<220>
<221>特征
<222>(35)..(35)
<223>n代表任何碱基
<400>1
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<212>DNA
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<223>设计用于扩增热球菌属(Thermococcus sp.)基因组DNA的寡核苷酸引物TPPolBF5
<220>
<221>特征
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<221>特征
<222>(35)..(35)
<223>n代表任何碱基
<400>2
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<212>DNA
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<223>设计用于扩增热球菌属(Thermococcus sp.)基因组DNA的寡核苷酸引物TTPolBR4
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<220>
<223>设计用于扩增热球菌属(Thermococcus sp.)KS-1基因组DNA的寡核苷酸引物Tks3StaBal
<400>13
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增热球菌属(Thermococcus sp.)KS-1基因组DNA的寡核苷酸引物TksBgPs
<400>14
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<211>2325
<212>DNA
<213>热球菌属(Thermococcus sp.)KS-1
<400>15
atgatcctcg acactgacta cataactgag aatggaaaac ccgtcataag gattttcaag  60
aaggagaacg gcgagtttaa gattgagtac gataggactt ttgaacccta catttacgcc  120
ctcctgaagg acgattctgc cattgaggag gtcaagaaga taaccgccga gaggcacgga  180
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gagcttggga aggagttttt ccctatggag gcccagcttt ctcgcttaat cggccagtcc  1020
ctctgggacg tctcccgctc cagcactggc aacctcgttg agtggttcct cctcaggaag  1080
gcctacgaga ggaatgagct ggccccgaac aagcccgatg aaaaggagct ggccagaaga  1140
cgacagagct atgaaggagg ctatgtaaaa gagcccgaga gagggttgtg ggagaacata  1200
gtgtacctag attttagatc tctgtacccc tcaatcatca tcacccacaa cgtctcgccg  1260
gatactctca acagggaagg atgcaaggaa tatgacgttg ccccccaggt cggtcaccgc  1320
ttctgcaagg acttcccagg atttatcccg agcctgcttg gagacctcct agaggagagg  1380
cagaagataa agaagaagat gaaggccacg attgacccga tcgagaggaa gctcctcgat  1440
tacaggcaga gggccatcaa gatcctggcc aacagctact acggttacta cggctatgca  1500
agggcgcgct ggtactgcaa ggagtgtgca gagagcgtaa cggcctgggg aagggagtac  1560
ataacgatga ccatcagaga gatagaggaa aagtacggct ttaaggtaat ctacagcgac  1620
accgacggat tttttgccac aatacctgga gccgatgctg aaaccgtcaa aaagaaggcg  1680
atggagttcc tcaagtatat caacgccaaa ctcccgggcg cgcttgagct cgagtacgag  1740
ggcttctaca aacgcggctt cttcgtcacg aagaagaagt acgcggtgat agacgaggaa  1800
ggcaagataa caacgcgcgg acttgagatt gtgaggcgcg actggagcga gatagcgaaa  1860
gagacgcagg cgagggttct tgaagctttg ctaaaggacg gtgacgtcga gaaggccgtg  1920
aggatagtca aagaagttac cgaaaagctg agcaagtacg aggttccgcc ggagaagctg  1980
gtgatccacg agcagataac gagggattta aaggactaca aggcaaccgg tccccacgtt  2040
gccgttgcca agaggttggc cgcgagagga gtcaaaatac gccctggaac ggtgataagc  2100
tacatcgtgc tcaagggctc tgggaggata ggcgacaggg cgataccgtt cgacgagttc  2160
gacccgacga agcacaagta cgacgccgag tactacattg agaaccaggt tctcccagcc  2220
gttgagagaa ttctgagagc cttcggttac cgcaaggaag acctgcgcta ccagaagacg  2280
agacaggttg gtctgggagc ctggctgaag ccgaagggaa cttga                  2325
<210>16
<211>774
<212>PRT
<213>热球菌属(Thermococcus sp.)KS-1
<400>16
Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Lys Pro Val Ile
1               5                   10                  15
Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg
            20                  25                  30
Thr Phe Glu Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile
        35                  40                  45
Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Val Val Thr
    50                  55                  60
Val Lys Arg Ala Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val
65                  70                  75                  80
Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile
                85                  90                  95
Arg Asp Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr
            100                 105                 110
Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro
        115                 120                 125
Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr
    130                 135                 140
Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile
145                 150                 155                 160
Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Asn Ala
                165                 170                 175
Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Arg Glu Met Ile Lys
            180                 185                 190
Arg Phe Leu Lys Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr
        195                 200                 205
Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu
    210                 215                 220
Lys Leu Gly Ile Asn Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys
225                 230                 235                 240
Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile
                245                 250                 255
His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr
            260                 265                 270
Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Gln Pro Lys Glu
        275                 280                 285
Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Ala Thr Ala Trp Glu Ser Gly Glu Gly
    290                 295                 300
Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr
305                 310                 315                 320
Glu Leu Gly Lys Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu
                325                 330                 335
Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu
            340                 345                 350
Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala
        355                 360                 365
Pro Asn Lys Pro Asp Glu Lys Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gln Ser Tyr
    370                 375                 380
Glu Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile
385                 390                 395                 400
Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His
                405                 410                 415
Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp
            420                 425                 430
Val Ala Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe
        435                 440                 445
Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys
    450                 455                 460
Lys Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Arg Lys Leu Leu Asp
465                 470                 475                 480
Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr
                485                 490                 495
Tyr Gly Tyr Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser
            500                 505                 510
Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Thr Met Thr Ile Arg Glu Ile
        515                 520                 525
Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Ile Tyr Ser Asp Thr Asp Gly Phe
    530                 535                 540
Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala
545                 550                 555                 560
Met Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu
                565                 570                 575
Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys
            580                 585                 590
Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu
        595                 600                 605
Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala
    610                 615                 620
Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asp Val Glu Lys Ala Val
625                 630                 635                 640
Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro
                645                 650                 655
Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Lys Asp
            660                 665                 670
Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala
        675                 680                 685
Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu
    690                 695                 700
Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe
705                 710                 715                 720
Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln
                725                 730                 735
Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys
            740                 745                 750
Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp
        755                 760                 765
Leu Lys Pro Lys Gly Thr
    770
<210>17
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增热球菌属(Thermococcus sp.)基因组DNA的寡核苷酸引物TPPolBF1
<400>17
ttaatacgac tcactatagg cgctacctca tmgayaargg                        40
<210>18
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增热球菌属(Thermococcus sp.)基因组DNA的寡核苷酸引物TTPolBR5
<400>18
gctagttatt gctcagcggg tatctggyga gacrttrtg                         39
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增速生热球菌(Thermococcus celer)基因组DNA的寡核苷酸引物Tce01
<400>19
cgtggtaaga gggtctcgaa t                                            21
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增速生热球菌(Thermococcus celer)基因组DNA的寡核苷酸引物Tce02
<400>20
ctcaagggct ccggaaggat a                                            21
<210>21
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增速生热球菌(Thermococcus celer)基因组DNA的寡核苷酸引物TceNde
<400>21
aatccaacgg gtggtcatat gatcctcgac gctgac                            36
<210>22
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增速生热球菌(Thermococcus celer)基因组DNA的寡核苷酸引物TceBgPs
<400>22
cagagaggag catgcagatc ttcacccctt ccccgcgtt                         39
<210>23
<211>2325
<212>DNA
<213>速生热球菌(Thermococcus celer)
<400>23
atgatcctcg acgctgacta catcaccgaa gatgggaagc ccgtcgtgag gatattcagg  60
aaggagaagg gcgagttcag aatcgactac gacagggact tcgagcccta catctacgcc  120
ctcctgaagg acgattcggc catcgaggag gtgaagagga taaccgttga gcgccacggg  180
aaggccgtca gggttaagcg ggtggagaag gtcgaaaaga agttcctcaa caggccgata  240
gaggtctgga agctctactt caatcacccg caggacgttc cggcgataag ggacgagata  300
aggaagcatc cggccgtcgt tgatatctac gagtacgaca tccccttcgc caagcgctac  360
ctcatcgata aggggctcgt cccgatggag ggggaggagg agctcaaact gatggccttc  420
gacatcgaga ccctctacca cgagggagac gagttcgggg aggggccgat cctgatgata  480
agctacgccg acggggacgg ggcgagggtc ataacctgga agaagatcga cctcccctac  540
gtcgacgtcg tctcgaccga gaaggagatg ataaagcgct tcctccaggt ggtgaaggag  600
aaggacccgg acgtgctcgt aacttacaac ggcgacaact tcgacttcgc ctacctgaag  660
agacgctccg aggagcttgg attgaagttc atcctcggga gggacgggag cgagcccaag  720
atccagcgca tgggcgaccg cttcgccgtc gaggtgaagg ggaggataca cttcgacctc  780
tacccggtga taaggcgcac cgtgaacctg ccgacctaca cgctcgaggc ggtctacgag  840
gccatcttcg ggaggccaaa ggagaaggtc tacgccgggg agatagtgga ggcctgggaa  900
accggcgagg gtcttgagag ggttgcccgc tactccatgg aggacgcaaa ggttaccttc  960
gagctcggga gggagttctt cccgatggag gcccagctct cgaggctcat cggccagggt  1020
ctctgggacg tctcccgctc gagcaccggc aacctggtcg agtggttcct cctgaggaag  1080
gcctacgaga ggaacgaact ggccccgaac aagccgagcg gccgggaagt ggagatcagg  1140
aggcgtggct acgccggtgg ttacgttaag gagccggaga ggggtttatg ggagaacatc  1200
gtgtacctcg actttcgctc tctttacccc tccatcatca taacccacaa cgtctcgccc  1260
gataccctaa acagggaggg ctgtgagaac tacgacgtcg ccccccaggt ggggcataag  1320
ttctgcaaag attttccggg cttcatcccg agcctgctcg gaggcctgct tgaggagagg  1380
cagaagataa agcggaggat gaaggcctct gtggatcccg ttgagcggaa gctcctcgat  1440
tacaggcaga gggccatcaa gatactggcc aacagcttct acggatacta cggctacgcg  1500
agggcgaggt ggtactgcag ggagtgcgcg gagagcgtta ccgcctgggg cagggagtac  1560
atcgataggg tcatcaggga gctcgaggag aagttcggct tcaaggtgct ctacgcggac  1620
acggacggac tgcacgccac gatccccggg gcggacgccg ggaccgtcaa ggagagggcg  1680
agggggttcc tgagatacat caaccccaag ctccccggcc tcctggagct cgagtacgag  1740
gggttctacc tgaggggttt cttcgtgacg aagaagaagt acgcggtcat agacgaggag  1800
ggcaagataa ccacgcgcgg cctcgagata gtcaggcggg actggagcga ggtggccaag  1860
gagacgcagg cgagggtcct ggaggcgata ctgaggcacg gtgacgtcga ggaggccgtt  1920
agaatcgtca gggaggtaac cgaaaagctg agcaagtacg aggttccgcc ggagaaactg  1980
gtgatccacg agcagataac gagggatttg agggactaca aagccacggg accgcacgtg  2040
gcggtggcga agcgcctggc cgggaggggg gtaaggatac gccccgggac ggtgataagc  2100
tacatcgtcc tcaagggctc cggaaggata ggggacaggg cgattccctt cgacgagttc  2160
gacccgacta agcacaggta cgacgccgac tactacatcg agaaccaggt tctgccagcc  2220
gtcgagagga tcctgaaggc cttcggctac cgcaaggagg acctgaaata ccagaagacg  2280
aggcaggtgg gcctgggtgc gtggctcaac gcggggaagg ggtga                  2325
<210>24
<211>774
<212>PRT
<213>速生热球菌(Thermococcus celer)
<400>24
Met Ile Leu Asp Ala Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Val
1               5                   10                  15
Arg Ile Phe Arg Lys Glu Lys Gly Glu Phe Arg Ile Asp Tyr Asp Arg
            20                  25                  30
Asp Phe Glu Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile
        35                  40                  45
Glu Glu Val Lys Arg Ile Thr Val Glu Arg His Gly Lys Ala Val Arg
    50                  55                  60
Val Lys Arg Val Glu Lys Val Glu Lys Lys Phe Leu Asn Arg Pro Ile
65                  70                  75                  80
Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Asn His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile
                85                  90                  95
Arg Asp Glu Ile Arg Lys His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr
            100                 105                 110
Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro
        115                 120                 125
Met Glu Gly Glu Glu Glu Leu Lys Leu Met Ala Phe Asp Ile Glu Thr
    130                 135                 140
Leu Tyr His Glu Gly Asp Glu Phe Gly Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile
145                 150                 155                 160
Ser Tyr Ala Asp Gly Asp Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile
                165                 170                 175
Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys
            180                 185                 190
Arg Phe Leu Gln Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Val Thr
        195                 200                 205
Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Arg Arg Ser Glu
    210                 215                 220
Glu Leu Gly Leu Lys Phe Ile Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys
225                 230                 235                 240
Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile
                245                 250                 255
His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Val Asn Leu Pro Thr
            260                 265                 270
Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Arg Pro Lys Glu
        275                 280                 285
Lys Val Tyr Ala Gly Glu Ile Val Glu Ala Trp Glu Thr Gly Glu Gly
    290                 295                 300
Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Phe
305                 310                 315                 320
Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu
                325                 330                 335
Ile Gly Gln Gly Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu
            340                 345                 350
Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala
        355                 360                 365
Pro Asn Lys Pro Ser Gly Arg Glu Val Glu Ile Arg Arg Arg Gly Tyr
    370                 375                 380
Ala Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile
385                 390                 395                 400
Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His
                405                 410                 415
Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Glu Asn Tyr Asp
            420                 425                 430
Val Ala Pro Gln Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe
        435                 440                 445
Ile Pro Ser Leu Leu Gly Gly Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys
    450                 455                 460
Arg Arg Met Lys Ala Ser Val Asp Pro Val Glu Arg Lys Leu Leu Asp
465                 470                 475                 480
Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly Tyr
                485                 490                 495
Tyr Gly Tyr Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Arg Glu Cys Ala Glu Ser
            500                 505                 510
Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Asp Arg Val Ile Arg Glu Leu
        515                 520                 525
Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Leu
    530                 535                 540
His Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Gly Thr Val Lys Glu Arg Ala
545                 550                 555                 560
Arg Gly Phe Leu Arg Tyr Ile Asn Pro Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu
                565                 570                 575
Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Leu Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys
            580                 585                 590
Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu
        595                 600                 605
Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Val Ala Lys Glu Thr Gln Ala
    610                 615                 620
Arg Val Leu Glu Ala Ile Leu Arg His Gly Asp Val Glu Glu Ala Val
625                 630                 635                 640
Arg Ile Val Arg Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro
                645                 650                 655
Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Arg Asp
            660                 665                 670
Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Gly
        675                 680                 685
Arg Gly Val Arg Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu
    690                 695                 700
Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe
705                 710                 715                 720
Asp Pro Thr Lys His Arg Tyr Asp Ala Asp Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln
                725                 730                 735
Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Lys Ala Phe Gly Tyr Arg Lys
            740                 745                 750
Glu Asp Leu Lys Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp
        755                 760                 765
Leu Asn Ala Gly Lys Gly
    770
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增Thermococcus siculi基因组DNA的寡核苷酸引物Tsi01
<400>25
ctcatggtag agcgtctcaa t                                            21
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增Thermococcus siculi基因组DNA的寡核苷酸引物Tsi06
<400>26
catcagctac atcgtgctca a                                           21
<210>27
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增Thermococcus siculi基因组DNA的寡核苷酸引物TsiNde
<400>27
tacccggtgt cccatatgat cctcgacacg gactac                            36
<210>28
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增Thermococcus siculi基因组DNA的寡核苷酸引物TsiA
<400>28
ctttatgcgg acactgacgg cttcttcgcg acg                               33
<210>29
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增Thermococcus siculi基因组DNA的寡核苷酸引物TsiB
<400>29
gaagccgtca gtgtccgcat aaagtacttt aaagcc                            36
<210>30
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增Thermococcus siculi基因组DNA的寡核苷酸引物TsiBamPst
<400>30
gttcacttgc tgcagggatc ctcacccctt ccccttcgg                         39
<210>31
<211>2328
<212>DNA
<213>Thermococcus siculi
<400>31
atgatcctcg acacggacta catcacggaa gatgggaaac ccgtcataag gatattcaag  60
aaagagaacg gcgagttcaa gatcgagtac gacaggactt ttgaacccta catctacgcc  120
ctcctgaagg acgactccgc gattgaggat gttaaaaaga taaccgccga gaggcacgga  180
acggtggtga aggtcaagcg cgccgaaaag gtgcagaaga agttcctagg caggccggtt  240
gaagtctgga agctctactt cacccacccc caagatgtcc cggcgataag ggacaagatt  300
aggaagcatc cagctgtaat tgacatctac gagtacgaca taccattcgc caagcgctac  360
ctcatcgaca agggcctgat tccgatggag ggtgaagaag agcttaagat gctcgccttc  420
gacattgaga cgctctacca tgagggtgag gagttcgccg aggggcctat tctgatgata  480
agctacgccg acgagagcga ggcacgcgtc atcacctgga agaaaatcga cctcccctac  540
gttgacgtcg tctcaacgga gaaggagatg ataaagcgct tcctccgcgt tgtgaaggag  600
aaagatcccg atgtcctcat aacctacaac ggcgacaact tcgacttcgc ctacctgaag  660
aagcgctgtg aaaagcttgg aataaacttc ctccttggaa gggacgggag cgagccgaag  720
atccagagaa tgggtgaccg cttcgccgtt gaggtgaagg ggaggataca cttcgacctc  780
tatcctgtaa taaggcgcac gataaacctg ccgacctaca tgcttgaggc agtctacgag  840
gccatctttg ggaagccaaa ggagaaggtt tacgccgagg agatagccac cgcttgggaa  900
accggagagg gccttgagag ggtggctcgc tactctatgg aggacgcgaa ggtcacgttt  960
gagcttggaa aggagttctt cccgatggag gcccaacttt cgaggttggt cggccagagc  1020
ttctgggatg tcgcgcgctc aagcacgggc aatctggtcg agtggttcct cctcaggaag  1080
gcctacgaga ggaacgagct ggctccaaac aagccctctg gaagggaata tgacgagagg  1140
cgcggtggat acgccggcgg ctacgtcaag gaaccggaaa agggcctgtg ggagaacata  1200
gtctacctcg actataaatc tctctacccc tcaatcatca tcacccacaa cgtctcgccc  1260
gataccctca accgcgaggg ctgtaaggag tatgacgtag ctccacaggt cggccaccgc  1320
ttctgcaagg actttccagg cttcatcccg agcctgctcg gggatctcct ggaggagagg  1380
cagaagataa agaggaagat gaaggcaaca attgacccga tcgagagaaa gctccttgat  1440
tacaggcaac gggccatcaa gatccttcta aatagttttt acggctacta cggctacgca  1500
agggctcgct ggtactgcaa ggagtgtgcc gagagcgtta cggcatgggg aagggaatat  1560
atcaccatga caatcaggga aatagaagag aagtatggct ttaaagtact ttatgcggac  1620
actgacggct tcttcgcgac gattcccggg gaagatgccg agaccatcaa aaagagggcg  1680
atggagttcc tcaagtacat aaacgccaaa ctccccggtg cgctcgaact tgagtacgag  1740
gacttctaca ggcgcggctt cttcgtcacc aagaagaaat acgcggttat cgacgaggag  1800
ggcaagataa caacgcgcgg gctggagatc gtcaggcgcg actggagcga gatagccaag  1860
gagacgcagg cgcgggttct ggaggccctt ctgaaggacg gtgacgtcga agaggccgtg  1920
agcatagtca aagaagtgac cgagaagctg agcaagtacg aggttccgcc ggagaagctc  1980
gttatccacg agcagataac gcgcgagctg aaggactaca aggcaacggg accacacgtg  2040
gcgatagcga agaggttagc cgcgagaggc gtcaaaatcc gccccgggac agtcatcagc  2100
tacatcgtgc tcaagggctc cgggaggata ggcgacaggg cgattccctt cgacgagttc  2160
gaccccacga agcacaagta cgatgcagag tactacatcg agaaccaggt tctacctgcc  2220
gtcgagagga ttctgaaggc cttcggctat cgcggtgagg agctcagata ccagaagacg  2280
aggcaggttg gacttggggc gtggctgaag ccgaagggga aggggtga               2328
<210>32
<211>775
<212>PRT
<213>Thermococcus siculi
<400>32
Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile
1               5                   10                  15
Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg
            20                   25                  30
Thr Phe Glu Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile
        35                  40                  45
Glu Asp Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Val Val Lys
    50                  55                  60
Val Lys Arg Ala Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val
65                  70                  75                  80
Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile
                85                  90                  95
Arg Asp Lys Ile Arg Lys His Pro Ala Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr
            100                 105                 110
Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro
        115                 120                 125
Met Glu Gly Glu Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr
   130                 135                 140
Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile
145                 150                 155                 160
Ser Tyr Ala Asp Glu Ser Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile
                165                 170                 175
Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys
            180                 185                 190
Arg Phe Leu Arg Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr
        195                 200                 205
Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu
    210                 215                 220
Lys Leu Gly Ile Asn Phe Leu Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys
225                 230                 235                 240
Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile
                245                 250                 255
His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr
            260                 265                 270
Tyr Met Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Lys Pro Lys Glu
        275                 280                 285
Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Ala Thr Ala Trp Glu Thr Gly Glu Gly
    290                 295                 300
Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Phe
305                 310                 315                 320
Glu Leu Gly Lys Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu
                325                 330                 335
Val Gly Gln Ser Phe Trp Asp Val Ala Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu
            340                 345                 350
Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala
        355                 360                 365
Pro Asn Lys Pro Ser Gly Arg Glu Tyr Asp Glu Arg Arg Gly Gly Tyr
    370                 375                 380
Ala Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu Trp Glu Asn Ile
385                 390                 395                 400
Val Tyr Leu Asp Tyr Lys Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His
                405                 410                 415
Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp
            420                 425                 430
Val Ala Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe
       435                  440                 445
Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys
   450                  455                 460
Arg Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Arg Lys Leu Leu Asp
465                 470                 475                 480
Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Leu Asn Ser Phe Tyr Gly Tyr
                485                 490                 495
Tyr Gly Tyr Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser
            500                 505                 510
 Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Thr Met Thr Ile Arg Glu Ile
         515                 520                 525
Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Phe
    530                 535                 540
Phe Ala Thr Ile Pro Gly Glu Asp Ala Glu Thr Ile Lys Lys Arg Ala
545                 550                 555                 560
Met Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu
                565                 570                 575
Leu Glu Tyr Glu Asp Phe Tyr Arg Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys
            580                 585                 590
Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu
        595                 600                 605
Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala
    610                 615                 620
Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asp Val Glu Glu Ala Val
625                 630                 635                 640
Ser Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro
                645                 650                 655
Pro Glu Lys Leu Val lle His Glu Gln Ile Thr Arg Glu Leu Lys Asp
            660                 665                 670
Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Ile Ala Lys Arg Leu Ala Ala
        675                 680                 685
Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu
    690                 695                 700
Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe
705                 710                 715                 720
Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln
                725                 730                 735
Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Lys Ala Phe Gly Tyr Arg Gly
            740                 745                 750
Glu Glu Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp
        755                 760                 765
Leu Lys Pro Lys Gly Lys Gly
    770                 775
<210>33
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增M13基因组DNA的寡核苷酸引物HT
<400>33
ccggaaccgc ctccctcaga gccgccaccc tcagaaccgc caccc                  45
<210>34
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB-8基因组DNA的寡核苷酸引物c280/RG34-F
<400>34
atatcatatg aaagaggcct tcaaggaggc cctcgccc                           38
<210>35
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB-8基因组DNA的寡核苷酸引物c280/RG34-R
<400>35
atatagatct ttattacgat ggccatacca acctcctgta                        40
<210>36
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB-8基因组DNA的寡核苷酸引物c240/RA18-F
<400>36
atatcatatg aaagtagagg aagtggttct tcccggcg                          38
<210>37
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB-8基因组DNA的寡核苷酸引物c240/RA18-R
<400>37
atatagatct ttattagaag ctccccttca gggcctccac                        40
<210>38
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增λDNA的寡核苷酸引物λ-1B
<400>38
gatgagttcg tgtccgtaca actggcgtaa tcatg                             35
<210>39
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增λDNA的寡核苷酸引物λ-9B
<400>39
tgtccgtcag ctcataacgg tacttcacg                                    29
<210>40
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增λDNA的寡核苷酸引物λ-10D
<400>40
atatctggcg gtgcaatatc ggtactgt                                     28
21

Claims (9)

1、一种具有DNA聚合酶活性的多肽，其具有选自下列的氨基酸序列或具有在所述氨基酸序列中缺失、插入、添加或取代一个或几个氨基酸的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：16的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：24的氨基酸序列；和
(c)SEQ ID NO：32的氨基酸序列。
2、编码权利要求1所定义多肽的核酸。
3、根据权利要求2的核酸，其具有SEQ ID NO：15、23或31，或其部分的核苷酸序列。
4、一种编码具有DNA聚合酶活性的多肽的核酸，其在严格条件下与和权利要求3定义的核酸互补的核苷酸序列构成的核酸杂交。
5、一种生产多肽的方法，该方法包括：
培养能生产多肽的细胞，和
从培养物中收集所述的多肽，
其中所述多肽具有DNA聚合酶活性，并且具有选自下列的氨基酸序列或者具有在所述氨基酸序列中缺失、插入、添加或取代一个或几个氨基酸的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：16的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：24的氨基酸序列；和
(c)SEQ ID NO：32的氨基酸序列。
6、一种扩增核酸的方法，该方法包括：
使用多肽扩增核酸，
其中所述多肽具有DNA聚合酶活性，并且具有选自下列的氨基酸序列或者具有在所述氨基酸序列中缺失、插入、添加或取代一个或几个氨基酸的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：16的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：24的氨基酸序列；和
(c)SEQ ID NO：32的氨基酸序列。
7、用于扩增核酸的组合物，其含有权利要求1所定义的多肽。
8、含有权利要求1所定义的多肽的试剂盒。
9、结合权利要求1所定义的多肽的抗体。
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