CN1302104C

CN1302104C - Rna检测酶

Info

Publication number: CN1302104C
Application number: CNB038091593A
Authority: CN
Inventors: W·马; V·莱米柴夫; M·凯泽; N·E·莱米柴夫; H·T·阿拉韦; J·J·谢弗; B·N·奈里; A·A·鲁科瓦克
Original assignee: Third Wave Technologies Inc
Current assignee: Third Wave Technologies Inc
Priority date: 2002-02-26
Filing date: 2003-02-26
Publication date: 2007-02-28
Anticipated expiration: 2023-02-26
Also published as: EP2410049A1; ES2354874T3; EP1504093A2; AU2007254629A1; AU2007254629B2; WO2003073067A2; CN1653175A; WO2003073067A3; JP4363988B2; DE60334985D1; EP1504093A4; US7150982B2; AU2010235947A1; EP1504093B1; CA2477698A1; ATE488579T1; CA2477698C; US20030186238A1; HK1081593A1; AU2003216392A1

Abstract

本发明提供用于切割和修饰核酸的新型切割剂和聚合酶。例如，这些切割剂和聚合酶可用于检测和表征核酸序列和核酸序列的变异。在一些实施方案中，利用多种酶的5’核酸酶活性切割一种依赖靶标的切割结构，从而表明特定核酸序列或其特定变异的存在。

Description

RNA检测酶

本申请是美国专利申请号10/084,839的部分继续申请，后者是美国专利申请号09/864,636的部分继续申请，并且是专利申请号09/864,426的部分继续申请，它们都是美国专利申请号09/577,304和09/758,282的部分继续申请，并且是美国专利申请号09/350,309的部分继续申请，是系列号08/756,386(现在的美国专利号5,985,557)的分案申请，也是共同未决的申请系列号09/381,212的部分继续申请，后者是PCT申请号US 98/05809的国家进入，它要求对系列号08/823,516(现在的美国专利号5,994,069)、系列号08,759,038(现在的美国专利6,090,543)、系列号08/756,386(现在的美国专利5,985,557)、系列号08/682,853(现在的美国专利号6,001,567)、系列号08/599,491(现在的美国专利号5,846,717)和PCT申请号US 97/01072的优先权。

发明领域

本发明涉及用于直接检测、表征和定量核酸(特别是RNA)的新型酶。本发明提供这样的酶，它可识别在靶RNA序列上形成的特定核酸切割结构，并且以位点特异的方式切割该核酸切割结构，产生非靶切割产物。本发明提供这样的酶，其特异性切割包含DNA和RNA核酸链的复合物之DNA成员的能力提高。

发明背景

在分子医学中，一种简单、节省成本的直接、定量RNA检测方法可以极大地方便RNA病毒的分析和特定基因表达的测定。而这两个问题正是本领域当前面临的迫切问题。尽管有这种需要，但是极少有真正直接的技术。以PCR为基础的检测需要在扩增之前用逆转录酶将RNA转变为DNA，引入一个可能影响精确定量的变量。而且，PCR和以指数扩增为基础的其它方法(例如NASBA)需要艰苦的限制措施来避免交叉污染，并且很难区分量的微小差别(如2-3倍)。其它一些可以直接检测RNA的试验也有许多缺点，包括耗费时间的放射自显影步骤(例如RNase保护测定)或者过夜反应时间(例如分支的DNA测定)。在美国每年要进行超过150万个病毒载量测定，因此便宜、快速、高通量的RNA定量测定系统显然具有广阔的前景。

直接、定量检测mRNA的技术是监测大量不同基因表达的关键。具体而言，细胞因子(如白介素和淋巴因子)表达水平已经被用作多种疾病进展(Van Deuren等人，J.Int.Fed.Clin.Chem.，5：216[1993]，Van Deuren等人，J.Inf.Dis.，169：157[1994]，Perenboom等人，Eur.J.Clin.Invest.，26：159[1996]，Guidotti等人，Immunity 4：25[1996])以及监测移植接受者(Grant等人，Transplantation 62：910[1996])的免疫应答的临床量度。另外，病毒载量的监测和病毒基因型鉴定对于患有病毒感染(被如HIV和丙型肝炎病毒(HCV)的病原体感染)的个体具有重要的临床意义。病毒载量(即血流中病毒颗粒的绝对数)与AIDS发展时间之间有很高的相关性(Mellors等人，Nature medicine 2：625[1996])。为此，通过以核酸为基础的定量检测测定的病毒载量正在成为一种标准监测方法，用于评价治疗效果和HIV阳性患者的临床状况。认为在感染过程中尽可能早地减少病毒载量并且定期评价病毒水平是必要的。在HCV病例中，病毒基因型具有重要的临床意义，具有与肝病严重程度的相关性以及对干扰素治疗的应答性。而且，因为HCV不能培养生长，所以只有通过建立如病毒基因型的特征与临床结果的相关性，才能评价新的抗病毒治疗。

上述方法已经用于低通量研究用途或有限的临床用途，但是显然，适用于任何遗传系统的RNA大规模定量分析需要一种更具创新性的方法。一个理想的直接检测方法将结合直接检测的优点(例如容易定量，遭受污染的危险最小)与双寡核苷酸杂交试验具有的特异性。

上述许多方法单独依靠杂交来区分靶分子与其它核酸。虽然其中一些方法可能是高灵敏性的，但是它们往往不能精确定量及辨别密切相关的mRNA，特别是在同一样品中以不同水平表达的RNA。上述方法可用于某些用途，但是仍然需要一种能够特别轻易地区别特定RNA与密切相关的分子的技术。

发明概述

本发明提供结构特异的切割剂(例如核酸酶)，它们来自多种来源，包括嗜温、嗜冷、嗜热和嗜高温生物。优选的结构特异的酶是热稳定的。热稳定的结构特异的核酸酶被认为是特别有用的，因为它们允许在核酸杂交非常特异的温度下进行等位基因特异的检测(包括单碱基错配)。在一个实施方案中，热稳定的结构特异的核酸酶是热稳定的5’核酸酶，其包含改变的聚合酶，该聚合酶来源于栖热菌属(Thermus)的种的天然聚合酶，包括但不限于：水生栖热菌(Thermus aquaticus)、黄栖热菌(Thernius flavus)和嗜热栖热菌(Thermus themophilus)。然而，本发明不只限于热稳定的5’核酸酶的应用。来源于FEN-1、RAD2和XPG类核酸酶的热稳定的结构特异的核酸酶也是优选的。

本发明提供了一种检测靶序列(例如突变、多态性等)的方法，包括提供一种怀疑含有靶序列的样品；在靶序列存在下能够形成侵入切割结构的寡核苷酸；和用于检测存在侵入切割结构的一种试剂；使该样品暴露于寡核苷酸和该试剂。在一些实施方案中，该方法还包括(直接或间接)检测含有该试剂和侵入切割结构的复合物的步骤。在一些实施方案中，该试剂含有一种切割剂。在一些优选实施方案中，样品暴露于寡核苷酸和该试剂包括在如下条件下使样品暴露于寡核苷酸和试剂：如果样品中存在靶序列，则靶序列与寡核苷酸形成一种侵入切割结构，其中侵入切割结构被切割剂切割，形成一种切割产物。在一些实施方案中，该方法还包括检测切割产物的步骤。在一些实施方案中，靶序列包含第一区和第二区，第二区位于第一区下游并与之相邻，其中该寡核苷酸包含第一种和第二种寡核苷酸，其中第一种寡核苷酸的至少一部分与靶序列的第一部分完全互补，而第二种寡核苷酸包含3’部分和5’部分，其中5’部分与该靶核酸的第二部分完全互补。

本发明还提供检测这些靶序列的试剂盒，该试剂盒包含在靶序列存在下能够形成侵入切割结构的寡核苷酸。在一些实施方案中，该试剂盒还包含用于检测侵入切割结构(例如切割剂)的存在的试剂。在一些实施方案中，寡核苷酸包含第一种和第二种寡核苷酸，第一种寡核苷酸包含与靶核酸的第一区互补的5’部分，第二种寡核苷酸包含3’部分和5’部分，该5’部分与靶核酸的第二区互补，位于第一部分下游并与之相邻。在一些优选实施方案中，靶序列包含。

本发明还提供了通过检测非靶切割产物检测靶核酸分子的存在的方法，该方法包括提供：一种切割剂；靶核酸的来源，靶核酸包含第一区和第二区，第二区位于第一区下游并与之相邻；第一种寡核苷酸，其中第一种寡核苷酸的至少一部分与靶核酸的第一部分完全互补；第二种寡核苷酸，其包含3’部分和5’部分，其中5’部分与靶核酸的第二部分完全互补；在如下反应条件下混和切割剂、靶核酸、第一种寡核苷酸和第二种寡核苷酸，产生反应混合物，在该条件下，第一种寡核苷酸的至少一部分与靶核酸的第一区退火，第二种寡核苷酸的至少5’部分与靶核酸的第二区退火，从而产生一种切割结构，其中发生切割结构的切割，产生非靶切割产物；以及检测切割结构的切割。

切割结构的切割能够用任何方法检测。在一些实施方案中，切割结构之切割的检测包括检测非靶切割产物。在另一些实施方案中，切割结构之切割的检测包括荧光、质量或荧光能量转移检测。其它检测方案包括但不限于：放射性、发光、磷光、荧光极化和电荷。在一些实施方案中，用一种方法进行检测，该方法包括提供非靶切割产物；含有两种退火的单链核酸的组合物，以确定蛋白质结合区的单链部分；和一种蛋白质；在蛋白质可以与蛋白质结合区结合的条件下，使非靶切割产物暴露于蛋白质结合区的单链部分。在一些实施方案中，蛋白质包含一种产生核酸的蛋白质，其中这种产生核酸的蛋白质可以与蛋白质结合区结合，并产生核酸。在一些实施方案中，蛋白质结合区是模板依赖的RNA聚合酶结合区(例如T7RNA聚合酶结合区)。在其它实施方案中，利用一种方法进行检测，该方法包括提供非靶切割产物；一种连续单链核酸，其包含决定RNA聚合酶结合区的单链的序列；一种模板依赖的DNA聚合酶；和一种模板依赖的RNA聚合酶；在非靶切割产物可与RNA聚合酶结合区单链的一部分结合的条件下，使非靶切割产物暴露于RNA聚合酶结合区，产生结合的非靶切割产物；在可产生双链RNA聚合酶结合区的条件下，使结合的非靶切割产物暴露于模板依赖的DNA聚合酶；在可产生RNA转录物的条件下，使双链RNA聚合酶结合区暴露于模板依赖的RNA聚合酶。在一些实施方案中，该方法还包括检测RNA转录物的步骤。在一些实施方案中，模板依赖的RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。

本发明不受第二种寡核苷酸的3’部分的性质所限制。在一些优选实施方案中，第二种寡核苷酸的3’部分包含一个不与靶核酸互补的3’末端核苷酸。在一些实施方案中，第二种寡核苷酸的3’部分包含一个不与靶核酸互补的核苷酸。

该方法的任何组分可以与一个固体支持物相连接。例如，在一些实施方案中，第一种寡核苷酸与固体支持物连接。在其它实施方案中，第二种寡核苷酸与固体支持物连接。

切割剂可以是能够切割侵入切割结构的任何试剂。在一些优选实施方案中，切割剂包含结构特异的核酸酶。在一些特别优选的实施方案中，结构特异的核酸酶包含热稳定的结构特异的核酸酶(如热稳定的5’核酸酶)。热稳定的结构特异的核酸酶包括但不限于这样的酶：它们所含的氨基酸序列与来源于适热生物(例如水生栖热菌、黄栖热菌和嗜热栖热菌)的热稳定DNA聚合酶的一部分氨基酸同源。在其它实施方案中，热稳定的结构特异的核酸酶包括选自FEN-1、RAD-2、XPG类核酸酶的核酸酶，或者含有上述任何切割剂的一个或多个部分的嵌合结构。

该方法不受靶核酸的性质的限制。在一些实施方案中，靶核酸是单链或双链DNA或RNA。在一些实施方案中，双链核酸在形成切割结构之前被变成单链(例如通过加热)。在一些实施方案中，靶核酸的来源包括含有基因组DNA的样品。样品包括但不限于血液、唾液、脑脊液、胸水、乳液、淋巴、痰和精液。

在一些实施方案中，该方法的反应条件包括提供二价阳离子的来源。在一些优选实施方案中，二价阳离子选自Mn²⁺和Mg²⁺离子。在一些实施方案中，该方法的反应条件包括提供与靶核酸相比浓度过量的第一种和第二种寡核苷酸。

在一些实施方案中，该方法还包括提供第三种寡核苷酸，它与位于靶核酸第一部分上游的该靶核酸的第三部分互补，其中第三种寡核苷酸与反应混合物混和。

本发明还提供了一种通过检测非靶切割产物检测靶核酸分子的存在的方法，包括提供：一种切割剂；靶核酸的一种来源，该靶核酸包含第一区和第二区，第二区位于第一区下游并与之相邻；多个第一种寡核苷酸，其中第一种寡核苷酸的至少一部分与靶核酸的第一部分完全互补；第二种寡核苷酸，其包含3’部分和5’部分，其中5’部分与靶核酸的第二部分完全互补；在如下反应条件下混和切割剂、靶核酸、多个第一种寡核苷酸和第二种寡核苷酸，产生反应混合物，在该条件下第一种寡核苷酸的至少一部分与靶核酸的第一区退火，第二种寡核苷酸的至少5’部分与靶核酸的第二区退火，从而产生一种切割结构，其中发生切割结构的切割，产生非靶切割产物，其中该条件允许形成多个切割结构以及从靶核酸上切下；以及检测该切割结构的切割。在一些实施方案中，该条件包括允许多个第一种寡核苷酸与靶核酸解离的等温条件。尽管本发明受特定靶核酸上形成的切割结构的数量限制，在一些优选实施方案中，两个或更多的(3，4，5，...，10，...，10000...)多个第一种寡核苷酸与特定靶核酸形成切割结构，其中该切割结构被切割，产生非靶切割产物。

本发明还提供了这样的方法，其中在进一步的侵入切割反应中使用上述方法产生的切割产物。例如，本发明提供了一种方法，包含提供一种切割剂；第一种靶核酸，此第一种靶核酸包含第一区和第二区，第二区位于第一区下游并与之相邻；第一种寡核苷酸，其中第一种寡核苷酸的至少一部分与第一种靶核酸的第一部分完全互补；第二种寡核苷酸，其包含3’部分和5’部分，其中5’部分与第一种靶核酸的第二部分完全互补；第二种靶核酸，此第二种靶核酸包含第一区和第二区，第二区位于第一区下游并与之相邻；和第三种寡核苷酸，其中第三种寡核苷酸的至少一部分与第二种靶核酸的第一部分完全互补；产生第一种切割结构，其中第一种寡核苷酸的至少该部分与第一种靶核酸的第一区退火，第二种寡核苷酸的至少5’部分与第一种靶核酸的第二部分退火，其中通过切割剂发生第一种切割结构的切割，从而切割第一种寡核苷酸，产生第四种寡核苷酸，该第四寡核苷酸包含3’部分和5’部分，其中5’部分与第二种靶核酸的第二部分完全互补；在一定条件下产生第二种切割结构，其中第三种寡核苷酸的至少该部分与第二种靶核酸的第一区退火，第四种寡核苷酸的至少5’部分与第二种靶核酸的第二区退火，其中发生第二种切割结构的切割，产生一个切割片段；检测第二种切割结构的切割。在一些优选实施方案中，第四种寡核苷酸的3’部分包含不与第二种靶核酸互补的3’端核苷酸。在一些实施方案中，第三种寡核苷酸的3’部分与第二靶核酸共价连接。在一些实施方案中，第二种靶核酸还包含5’区，其中第二种靶核酸的5’区是第三种寡核苷酸。

本发明还提供试剂盒，其含有：一种切割剂；第一种寡核苷酸，其含有与靶核酸的第一区互补的5’部分；第二种寡核苷酸，其包含3’部分和5’部分，该5’部分与靶核酸的第二区互补，该第二区位于第一部分的下游并与之相邻。在一些实施方案中，第二种寡核苷酸的3’部分包含不与靶核酸互补的3’末端核苷酸。在一些优选实施方案中，第二种寡核苷酸的3’部分包含由不与靶核酸互补的单核苷酸组成的第二种寡核苷酸。在一些实施方案中，该试剂盒还包含一种固体支持物。例如，在一些实施方案中，第一种和/或第二种寡核苷酸与固体支持物连接。在一些实施方案中，该试剂盒还包含一种缓冲液。在一些优选实施方案中，缓冲液包含二价阳离子(如Mn²⁺和/或Mg²⁺离子)来源。在一些具体实施方案中，该试剂盒还包含与第一种靶核酸的第三部分互补的第三种寡核苷酸，第三部分位于第一种靶核酸的第一部分的上游。在其它实施方案中，该试剂盒还包含一种靶核酸。在一些实施方案中，该试剂盒还包含第二种靶核酸。在其它实施方案中，该试剂盒还包含第三种寡核苷酸，该核苷酸包含与第二种靶核酸的第一区互补的5’部分。在一些具体实施方案中，第三种寡核苷的3’部分与第二种靶核酸共价连接。在其它具体实施方案中，第二种靶核酸还包含5’部分，其中第二种靶核酸的5’部分是第三种寡核苷酸。在其它实施方案中，该试剂盒还包含一种ARRESTOR分子(例如ARRESTOR寡核苷酸)。

本发明进一步提供一种组合物，其含有一种切割结构，该切割结构包含：a)一种靶核酸，该靶核酸含有第一区、第二区、第三区和第四区，其中第一区与第二区相邻并位于其下游，第二区与第三区相邻并位于其下游，第三区与第四区相邻并位于其下游；b)第一种寡核苷酸，它与靶核酸的第四区互补；c)第二种寡核苷酸，其含有5’部分和3’部分，其中第二种寡核苷酸的5’部分含有与靶核酸的第二区互补的序列，其中第二种寡核苷酸的3’部分含有与靶核酸的第三区互补的序列；和d)第三种寡核苷酸，其含有5’部分和3’部分，其中第三种寡核苷酸的5’部分含有与靶核酸的第一区互补的序列，第三种寡核苷酸的3’部分含有与靶核酸的第二区互补的序列。

本发明不受靶核酸的四个区域的长度限制。在一个实施方案中，靶核酸的第一区长度为11-50个核苷酸。在另一个实施方案中，靶核酸的第二区长度为1-3个核苷酸。在另一个实施方案中，靶核酸的第三区长度为6-9个核苷酸。在其它实施方案中，靶核酸的第四区长度为6-50个核苷酸。

本发明并不受第一、第二、第三、第四种寡核苷酸的性质或组成的限制；这些寡核苷酸可能含有DNA、RNA、PNA及其组合，以及含有修饰的核苷酸、通用碱基、加合物等。此外，一种或多种第一、第二、第三、第四种寡核苷酸在3’末端也可含有双脱氧核苷酸。

在一个优选实施方案中，靶核酸不与第一、第二、第三、第四种寡核苷酸中的至少一种完全互补。在一个特别优先的实施方案中，靶核酸不与第二种寡核苷酸完全互补。

如前所述，本发明涉及结构特异性核酸酶在检测方法中的用途。在一个实施方案中，本发明提供了一种通过检测非靶切割产物检测靶核酸分子的存在的方法，包括：a)提供：i)一种切割工具，ii)靶核酸的来源，该靶核酸含有第一、第二、第三、第四区，其中第一区与第二区相邻并位于其下游，第二区与第三区相邻并位于其下游，第三区与第四区相邻并位于其下游；iii)第一种寡核苷酸，它与靶核酸的第四区互补；iv)第二种寡核苷酸，其含有5’部分和3’部分，其中第二种寡核苷酸的5’部分包含与靶核酸的第二区互补的序列，第二种寡核苷酸的3’部分包含与靶核酸的第三区互补的序列；iv)第三种寡核苷酸，其含有5’部分和3’部分，其中第三种寡核苷酸的5’部分含有与靶核酸的第一区互补的序列，第三种寡核苷酸的3’部分含有与靶核酸的第二区互补的序列；b)在一定反应条件下混和这些切割工具、靶核酸、第一种寡核苷酸、第二种寡核苷酸和第三种寡核苷酸，产生一种反应混合物，在该条件下第一种寡核苷酸与靶核酸的第四区退火，其中第二种寡核苷酸的至少3’部分与靶核酸退火，第三种寡核苷酸的至少5’部分与靶核酸退火，以便产生一种切割结构，其中发生切割结构的切割，产生非靶切割产物，每个非靶切割产物都含有一个3’羟基；c)检测该非靶切割产物。

本发明不受靶核酸性质的限制。在一个实施方案中，靶核酸含有单链DNA。在另一个实施方案中，靶核酸含有双链DNA，并且在步骤c)之前处理反应混合物，使双链DNA基本上成为单链。在另一个实施方案中，靶核酸含有RNA，第一种和第二种寡核苷酸含有DNA。

本发明不受切割工具性质的限制。在一个实施方案中，切割工具是一种结构特异的核酸酶；特别优选的结构特异的核酸酶是热稳定的结构特异的核酸酶。

在另一个优选实施方案中，热稳定的结构特异的核酸酶是一种嵌合核酸酶。

在一个备选优选实施方案中，非靶切割产物的检测包括反应产物的电泳分离，以及随后显示分离的非靶切割产物。

在另一个优选实施方案中，一种或多种第一、第二、第三种寡核苷酸在3’末端含有一个双脱氧核苷酸。当使用含有双脱氧核苷酸的寡核苷酸时，非靶切割产物的检测优选地包括：a)在一定条件下，非靶切割产物与不依赖模板的聚合酶和至少一种标记的核苷三磷酸温育，该条件使得至少一个标记的核苷酸加到非靶切割产物的3’羟基，产生标记的非靶切割产物；b)检测标记的非靶切割产物的存在。本发明不受使用的不依赖模板的聚合酶性质的限制；在一个实施方案中，不依赖模板的聚合酶选自末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和poly A聚合酶。当检测步骤使用TdT或poly A聚合酶时，第二种寡核苷酸可能含有5’端标记，该5’端标记是与标记的核苷三磷酸上存在的标记不同的标记。本发明不受5’端标记的性质的限制；本领域中公知多种适当的5’端标记，包括生物素、荧光素、四氯荧光素、六氯荧光素、Cy3 amidite、Cy5 amidite和洋地黄毒苷。

在另一个实施方案中，检测非靶切割产物包括：a)在一定条件下，非靶切割产物与不依赖模板的聚合酶和至少一种核苷三磷酸温育，该条件使得至少一个核苷酸加到非靶切割产物的3’羟基，产生加尾的非靶切割产物；b)检测加尾的非靶切割产物的存在。本发明不受使用的不依赖模板的聚合酶性质的限制，在一个实施方案中，不依赖模板的聚合酶选自末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和poly A聚合酶。当检测步骤使用TdT和poly A聚合酶时，第二种寡核苷酸可包含一个5’端标记。本发明不受5’端标记的性质的限制；本领域公知多种合适的5’端标记，包括生物素、荧光素、四氯荧光素、六氯荧光素、REDMONDRED染料、Cy3 amidite、Cy5 amidite和洋地黄毒苷。

在一个优选实施方案中，反应条件包括提供二价阳离子的来源；特别优选的二价阳离子是Mn²⁺和Mg²⁺离子。

本发明还提供一种通过检测非靶切割产物检测靶核酸分子的方法，包括：a)提供：i)一种切割工具，ii)靶核酸的来源，该靶核酸含有第一、第二和第三区，其中第一区与第二区相邻并位于其下游，第二区与第三区相邻并位于其下游；iii)第一种寡核苷酸，其含有5’部分和3’部分，其中第一种寡核苷酸的5’部分包含与靶核酸的第二区互补的序列，第一种寡核苷酸的3’部分包含与靶核酸的第三区互补的序列；iv)第二种寡核苷酸，其长度为7-15个核苷酸，还含有5’部分和3’部分，其中第二种寡核苷酸的5’部分含有与靶核酸的第一区互补的序列，第二种寡核苷酸的3’部分含有与靶核酸的第二区互补的序列；b)在一定反应条件下混和这些切割工具、靶核酸、第一种寡核苷酸和第二种寡核苷酸，产生一种反应混合物，在该条件下第一种寡核苷酸的至少3’部分与靶核酸退火，第二种寡核苷酸的至少5’部分与靶核酸退火，产生一种切割结构，其中发生切割结构的切割，产生非靶切割产物，每个非靶切割产物含有一个3’羟基；c)检测该非靶切割产物。在一个优选实施方案中，该切割工具是一种结构特异的核酸酶，优选地是热稳定的结构特异的核酸酶。

本发明不受靶核酸不同区的长度的限制。在一个优选实施方案中，靶核酸的第二区的长度为1-5个核酸。在另一个优选实施方案中，一种或多种第一种和第二种寡核苷酸在3’端含有一个双脱氧核苷酸。当使用含有双脱氧核苷酸的寡核苷酸时，非靶切割产物的检测优选地包括：a)在一定条件下，非靶切割产物与不依赖模板的聚合酶和至少一种标记的核苷三磷酸温育，该条件使得至少一个标记的核苷酸加到非靶切割产物的3’羟基，产生标记的非靶切割产物；b)检测标记的非靶切割产物的存在。本发明不受使用的不依赖模板的聚合酶性质的限制；在一个实施方案中，不依赖模板的聚合酶选自末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和poly A聚合酶。当检测步骤使用TdT或poly A聚合酶时，第二种寡核苷酸可能含有5’端标记，该5’端标记是与标记的核苷三磷酸上存在的标记不同的标记。本发明不受5’端标记的性质的限制；本领域中公知多种适当的5’端标记，包括生物素、荧光素、四氯荧光素、六氯荧光素、REDMOND RED染料、Cy3 amidite、Cy5 amidite和洋地黄毒苷。

本发明的新型检测方法可以用于检测靶DNA和RNA，包括但不限于包含野生型和突变等位基因的靶DNA和RNA，包括可能与疾病或癌症相关的人或其它动物的基因。另外，本发明的方法也可以用于检测或鉴定微生物菌株，包括细菌、真菌、原生动物、纤毛虫和病毒(特别是用于检测和鉴定RNA病毒，如HCV)。

本发明还提供了用于直接检测、表征和定量核酸(特别是RNA)的新型酶。本发明提供这样的酶：它可识别在靶RNA序列上形成的特定核酸切割结构，并且以位点特异的方式切割该核酸切割结构，产生非靶切割产物。本发明提供这样的酶：其特异性切割包含DNA和RNA核酸链的复合物的DNA成员的能力提高。

例如，本发明提供这样的DNA聚合酶：与天然DNA聚合酶相比其结构改变，使得它们在以切割含有核酸(例如RNA)的结构为基础的检测试验中显示改变(例如改善)的表现。具体而言，本发明的改变的聚合酶在以切割含有RNA靶链的切割结构(例如侵入切割结构)的DNA成员为基础的检测试验中显示改善的表现。

在检测试验中改善的表现可能是由于几个改进特征中的任何一个或组合。例如，在一个实施方案中，本发明的酶对特定靶结构的切割速度(k_cat)可能提高，使得在一定时间范围内可以产生较大量的切割产物。在另一个实施方案中，本发明的酶切割不适当或非特异结构的活性或速度降低。例如，在本发明的某些实施方案中，改善的一个方面是特定结构切割的可检测量与任何备选结构切割的可检测量之间的差异增大。同样，在本发明的范围内提供了一种酶，与天然酶的速度相比，它切割特定靶结构的速度降低，并且切割任何备选结构的速度进一步降低，使得特定结构切割的可检测量与任何备选结构切割的可检量之间的差异增大。然而，本方面不限于这些差别增大的酶。

在一个优选实施方案中，本发明的酶是一种DNA聚合酶，与作为酶来源的任何天然DNA聚合酶相比，其具有如上所述的改变的核酸酶活性，也具有改变的合成活性。特别优选地，DNA聚合酶改变，使得与天然DNA聚合酶相比，它显示降低的合成活性，以及提高的对RNA靶标的核酸酶活性。合成活性降低的酶和编码酶的基因已经描述(参见，例如Kaiser等人，J.Biol.Chem.，274：21387[1999]，Lyamichev等人，Prot.Natl.Acad.Sci.，96：6143[1999]，美国专利5,541,311、5,614,402、5,795,763和6,090,606，在此全文引用作为参考)。本发明涉及组合修饰，使得产生的5’核酸酶没有干扰合成活性，并且在RNA检测试验中具有改善的表现。

本发明涉及一种编码DNA聚合酶的DNA序列，与天然酶相比其序列发生改变，因此显示与天然DNA聚合酶相比改变的核酸酶活性。例如，在一个实施方案中，DNA序列编码一种酶，该酶切割特定靶结构的速度(K_cat)提高，从而可以在给定时间段内产生较大量的切割产物。在另一个实施方案中，DNA编码一种切割不适当或非特异结构的活性或速度降低的酶。在某些实施方案中，改善的一个方面是特定结构切割的可检测量与任何备选结构的切割的可检测量之间的差异增大。在本发明的范围内提供了编码一种酶的DNA，与天然酶的速度相比，该酶切割特定靶结构的速度降低，并且切割任何备选结构的速度进一步降低，使得特定结构切割的可检测量与任何备选结构切割的可检量之间的差异增大。然而，本方面不限于这些差别增大的聚合酶。

在一个优选实施方案中，该DNA序列编码一种DNA聚合酶，与作为改进的酶的来源的任何天然DNA聚合酶相比，该酶具有如上所述的改变的核酸酶活性，也具有改变的合成活性。特别优选地，编码的DNA聚合酶改变，使得与天然DNA聚合酶相比，它显示降低的合成活性，以及提高的对RNA靶标的核酸酶活性。

并非意在使本发明受引入改变的核酸酶活性所需的改变的性质所限制。也并非意在使本发明受改变或观察到的改善的程度所限制。如果聚合酶也被改变以致合成被修饰，并非意在使本发明受修饰或未修饰蛋白质的聚合酶活性所限制，或者使聚合酶合成修饰的改变的性质所限制。

本发明涉及来自多种来源的结构特异的核酸酶，包括但不限于嗜温、嗜冷、嗜热和嗜高温生物。优选的结构特异的酶是热稳定的。热稳定的结构特异的核酸酶被认为是特别有用的，因为它们允许在接近下游探针寡核苷酸的解链温度(T_m)的温度下操作INVADER试验(参见，例如，美国专利号5,846,717、5,985,557、5,994,069、6,001,567和6,090,543和PCT公开文本WO 97/27214和WO 98/42873，在此全文引用作为参考)，使得切割和未切割的探针在反应过程中可以开始或中止循环。在一个实施方案中，热稳定的结构特异的核酸酶是热稳定的5’核酸酶，其选自来源于栖热菌属的种的天然聚合酶的改变的聚合酶，这些种包括但不限于：水生栖热菌、黄栖热菌、嗜热栖热菌、丝状栖热菌(Thermus filiformus)和水管致黑栖热菌(Thermusscotoductus)。然而，本发明不只限于热稳定的5’核酸酶的应用。例如，本发明的某些实施方案使用短寡核苷探针，它们可以在低温下开始和中止循环，从而允许使用非热稳定的酶。

在一些优选实施方案中，本发明提供包含一种酶的一种组合物，其中该酶包含一个异源功能域，其中这种异源功能域在核酸切割试验中提供改变(例如改善)的功能性。本发明不受核酸切割试验的性质的限制。例如，核酸切割试验包括在酶的存在下直接或间接切割一种核酸的任何试验。在某些优选实施反案中，核酸切割试验是一种侵入切割试验。在特别优选的实施方案中，切割试验使用至少含有一种RNA成分的切割结构。在另外一个特别优选的实施方案中，切割试验使用至少含有一种RNA成分的切割结构，其中该切割结构的DNA被切割。

在一些优选实施方案中，该酶包含一个5’核酸酶或一个聚合酶。在某些优选实施方案中，5’核酸酶包含热稳定的5’核酸酶。在其它优选实施方案中，相对于天然存在的聚合酶序列，该聚合酶的序列改变，从而显示比天然存在的聚合酶降低的DNA合成活性。在某些优选实施方案中，该聚合酶包含热稳定的聚合酶(例如来源于栖热菌属的种的聚合酶，包括但不限于水生栖热菌、黄栖热菌、嗜热栖热菌、丝状栖热菌和水管致黑栖热菌)。

本发明不受异源功能域导致的改变的功能性所限制。改变的说明性例子包括但不限于异源功能域含有氨基酸序列(例如一个或多个氨基酸)的酶，它在核酸切割试验中具有提高的核酸酶活性，提高的底物结合活性和/或提高的背景特异性。

本发明不受异源功能域的性质的限制。例如，在一些实施方案中，异源功能域包含来自聚合酶的聚合酶域的两个或多个氨基酸(例如，通过插入嵌合功能域向酶中引入，或者通过突变产生)。在一些优选实施方案中，两个或多个氨基酸中的至少一个来源于聚合酶域的手掌或拇指区。本发明不受选择两个或多个氨基酸的聚合酶的身份所限制。在某些优选实施方案中，聚合酶包含嗜热栖热菌聚合酶。在特别优选的实施方案中，两个或多个氨基酸来自于SEQ ID NO：1的氨基酸300-650。

本发明的新型酶可用于检测靶DNA和RNA，包括但不限于含有野生型和突变等位基因的靶DNA和RNA，包括但不限于与或者可能与疾病或其它状况有关的来自人、其它动物或植物的基因。另外，本发明的酶也可用于检测和/或鉴定微生物株，包括细菌、真菌、原生动物、纤毛虫和病毒(特别是用于检测和鉴定含有RNA基因组的病毒，如丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒)。例如，本发明提供切割核酸的方法，包括提供：本发明的一种酶和一种底物核酸；使该底物核酸暴露于该酶(例如，产生可以检测到的切割产物)。

在一个实施方案中，本发明提供一种热稳定的5′核酸酶，它具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NOS：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、221、341、346、348、351、353、359、365、367、369、374、376、380、384、388、392、396、400、402、406、408、410、412、416、418、420、424、427、429、432、436、440、444、446、448、450、456、460、464、468、472、476、482、485、488、491、494、496、498、500、502、506、510、514、518、522、526、530、534、538、542、544、550、553、560、564、566、568、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、2641-2674、2710、2712、2714、2717、2719、2722、2724、2726、2728、2730、2732、2734、2736、2738、2740、2742、2744、2746、2748、2750、2752、2754、2756、2758、2760、2762、2766、2768、2770、2772、2774、2776、2778、2780、2781、2782、2783、2785、2787、2789、2791、2793、2795、2797、2799、2801、2803、2805、2807、2809、2811、2813、2815、2817、2819、2821、2823、2825、2827、2829、2831、2833、2835、2837、2839、2841、2843、2845、2847、2849、2851、2853、2855和2857。在另一个实施方案中，该5′核酸酶由选自下列的一种DNA序列编码：SEQ IDNOS：69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、222、340、345、347、350、352、358、364、366、368、373、375、379、383、387、391、395、399、401、405、407、409、411、415、417、419、423、426、428、431、435、439、443、445、447、449、452、454、455、459、463、467、471、475、481、484、495、497、499、501、505、509、513、517、521、525、529、533、537、541、543、549、552、559、563、565、567、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、2675-2709、2711、2713、2715、2716、2718、2720、2721、2723、2725、2727、2729、2731、2733、2735、2737、2739、2741、2743、2745、2747、2749、2751、2753、2755、2757、2759、2761、2763、2764、2765、2767、2769、2771、2773、2775、2777、2779、2784、2786、2788、2790、2792、2794、2796、2798、2800、2802、2804、2806、2808、2810、2812、2814、2816、2818、2820、2822、2824、2826、2828、2830、2832、2834、2836、2838、2840、2842、2844、2846、2848、2850、2852、2854和2856。

本发明也提供一种重组DNA载体，其中所含的DNA具有编码5’核酸酶的核苷酸序列，该核苷酸序列选自：SEQ ID NOS：69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、222、340、345、347、350、352、358、364、366、368、373、375、379、383、387、391、395、399、401、405、407、409、411、415、417、419、423、426、428、431、435、439、443、445、447、449、452、454、455、459、463、467、471、475、481、484、495、497、499、501、505、509、513、517、521、525、529、533、537、541、543、549、552、559、563、565、567、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、2675-2709、2711、2713、2715、2716、2718、2720、2721、2723、2725、2727、2729、2731、2733、2735、2737、2739、2741、2743、2745、2747、2749、2751、2753、2755、2757、2759、2761、2763、2764、2765、2767、2769、2771、2773、2775、2777、2779、2784、2786、2788、2790、2792、2794、2796、2798、2800、2802、2804、2806、2808、2810、2812、2814、2816、2818、2820、2822、2824、2826、2828、2830、2832、2834、2836、2838、2840、2842、2844、2846、2848、2850、2852、2854和2856。在一个优选实施方案中，本发明提供用一种重组DNA载体转化的宿主细胞，该载体所含的DNA具有编码结构特异的核酸酶的核苷酸序列，该核苷酸选自序列SEQ ID NOS：69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、222、340、345、347、350、352、358、364、366、368、373、375、379、383、387、391、395、399、401、405、407、409、411、415、417、419、423、426、428、431、435、439、443、445、447、449、452、454、455、459、463、467、471、475、481、484、495、497、499、501、505、509、513、517、521、525、529、533、537、541、543、549、552、559、563、565、567、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、2675-2709、2711、2713、2715、2716、2718、2720、2721、2723、2725、2727、2729、2731、2733、2735、2737、2739、2741、27432745、2747、2749、2751、2753、2755、2757、2759、2761、2763、2764、2765、2767、2769、2771、2773、2775、2777、2779、2784、2786、2788、2790、2792、2794、2796、2798、2800、2802、2804、2806、2808、2810、2812、2814、2816、2818、2820、2822、2824、2826、2828、2830、2832、2834、2836、2838、2840、2842、2844、2846、2848、2850、2852、2854和2856。本发明不受所使用的宿主细胞的性质所限制。本领域公知适于表达编码结构特异核酸酶的核苷酸序列的表达载体，它们能够在多种原核和真核宿主细胞中表达。在一个优选实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌细胞。

本发明提供一种方法，相对于天然5’核酸酶，其改变5′核酸酶，使它们在以切割包含RNA的结构为基础的检测试验中显示改善的表现。具体而言，本发明的方法产生的改变的5′核酸酶在以切割含有RNA靶链的切割结构(例如侵入切割结构)的DNA成员为基础的检测试验中显示改善的表现。本发明的方法产生的改进的5′核酸酶可能在此处所述的所有方面都有改进。提供了评价任何候选酶的改进方法的实例。

例如，本发明提供生产一种改变的酶的方法，该酶在核酸切割试验中具有改进的功能性，该方法包括：提供酶和核酸检测底物；向该酶内引入一个异源功能域，产生一种改变的酶；使该改变的酶接触该核酸检测底物，产生切割产物；检测该切割产物。在一些实施方案中，异源功能域的引入包括突变该酶的一个或多个氨基酸。在其它实施方案中，向酶中引入异源功能域包括向酶中添加一个来自蛋白质(例如另外一种酶)的功能域(例如在添加蛋白质的功能域之前，通过除去酶序列的一部分置换功能域)。在优选实施方案中，核酸检测底物含有一种切割结构。在特别优选的实施方案中，切割结构含有一种RNA靶核酸。在其它优选实施方案中，切割结构含有一种侵入切割结构。

本发明也提供核酸处理试剂盒。一个优选实施方案是含有一种组合物的试剂盒，该组合物含有至少一种改进的5′核酸酶。另外一个优选实施方案提供一种试剂盒，其含有：a)一种组合物，其含有至少一种改进的5′核酸酶；和b)一种INVADER寡核苷酸和一种信号探针寡核苷酸。在本发明的试剂盒的一些实施方案中，改进的5′核酸酶来源于真细菌种的DNA聚合酶。在其它实施方案中，真细菌种是一种嗜热生物。在其它实施方案中，该嗜热生物来自栖热菌属。在其它实施方案，该嗜热生物选自：水生栖热菌、黄栖热菌、嗜热栖热菌、丝状栖热菌和水管致黑栖热菌。在优选实施方案中，改进的5′核酸酶由选自下列的DNA编码：SEQ ID NOS：69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、222、340、345、347、350、352、358、364、366、368、373、375、379、383、387、391、395、399、401、405、407、409、411、415、417、419、423、426、428、431、435、439、443、445、447、449、452、454、455、459、463、467、471、475、481、484、495、497、499、501、505、509、513、517、521、525、529、533、537、541、543、549、552、559、563、565、567、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、2675-2709、2711、2713、2715、2716、2718、2720、2721、2723、2725、2727、2729、2731、2733、2735、2737、2739、2741、2743、2745、2747、2749、2751、2753、2755、2757、2759、2761、2763、2764、2765、2767、2769、2771、2773、2775、2777、2779、2784、2786、2788、2790、2792、2794、2796、2798、2800、2802、2804、2806、2808、2810、2812、2814、2816、2818、2820、2822、2824、2826、2828、2830、2832、2834和2836。在其它优选实施方案中，试剂盒还包含检测核酸切割产物的试剂。在其它优选实施方案中，检测切割产物的试剂含有在随后侵入切割反应中使用的寡核苷酸(参见，例如美国专利号5,994,069)。在特别优选的实施方案中，用于随后的侵入切割反应的试剂含有用可产生荧光共振能量转移(FRET)效应的部分标记的一种探针。

本发明也提供处理核酸的方法，包括：a)提供：在含有锰的溶液中由一种内切核酸酶组成的第一种结构特异的核酸酶；和一种核酸底物；b)用升高的温度处理核酸底物，使得底物基本上是单链；c)在使得单链底物形成一种或多种切割结构的条件下降低温度；d)切割工具与切割结构反应，产生一种或多种切割产物；和e)检测一种或多种切割产物。在这些方法的有些实施方案中，内切核酸酶包括但不限于：CLEAVASE BN酶、水生栖热菌DNA聚合酶、嗜热栖热菌DNA聚合酶、大肠杆菌Exo III和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Rad1/Rad10复合物。在其它优选实施方案中，该核酸酶是一种来自热稳定的DNA聚合酶的5′核酸酶，其氨基酸序列改变，因此显示比野生型DNA聚合酶降低的DNA合成活性，但是基本上保留与野生型DNA聚合酶相同的5′核酸酶活性。在其它实施方案中，该核酸选自RNA和DNA。在其它实施方案中，步骤(a)的核酸是双链。

本发明也提供核酸处理试剂盒，其含有：a)一种组合物，其含有至少一种纯化的FEN-1内切核酸酶；和b)一种含锰的溶液。在试剂盒的一些实施方案中，纯化的FEN-1内切核酸酶选自：沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)FEN-1内切核酸酶、激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)FEN-1内切核酸酶、詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)FEN-1内切核酸酶、热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)FEN-1内切核酸酶、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)FEN-1、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)、嗜气热棒菌(Pyrobaculurn aerophilum)、Thermococcuslitoralis、Archaeaglobus veneficus、深处古生球菌(Archaeaglobusprofundus)、布氏酸菌(Acidianus brierlyi)、Acidianus ambivalens、Desulfurococcus amylolyticus、运动硫还原球菌(Desulfurococcusmobilis)、布氏热网菌(Pyrodictium brockii)、Thermococcusgorgonarius、Thermococcus zilligii、坎氏甲烷嗜热菌(Methanopyruskandleri)、火源甲烷球菌(Methanococcus igneus)、Pyrococcushorikoshii、Aeropyrum pernix和嵌合FEN-1内切核酸酶。在其它实施方案中，试剂盒还包含至少一种第二种结构特异的核酸酶。在某些优选实施方案中，第二种核酸酶是一种来源于热稳定的DNA聚合酶的5’核酸酶，其氨基酸序列改变，因此显示比野生型DNA聚合酶降低的DNA合成活性，但是基本上保留与野生型DNA聚合酶相同的5′核酸酶活性。在试剂盒的其它实施方案中，第二种核酸酶的氨基酸序列部分与来源于栖热菌属的真细菌嗜热生物的热稳定DNA聚合酶的氨基酸序列部分同源。在其它实施方案中，嗜热生物选自水生栖热菌、黄栖热菌和嗜热栖热菌。在其它优选实施方案中，试剂盒还包含用于检测切割产物的试剂。

本发明还提供此处所述的任何组合物、混合物、方法和试剂盒，它们与含有下列的内切核酸酶一起使用：硫磺矿硫化叶菌、嗜气热棒菌、Thermococcus litoralis、Archaeaglobus veneficus、深处古生球菌、布氏酸菌、Acidianus ambivalens、Desulfurococcus amylolyticus、运动硫还原球菌、布氏热网菌、Thermococcus gorgonarius、Thermococcuszilligii、坎氏甲烷嗜热菌、火源甲烷球菌、Pyrococcus horikoshii和Aeropyrum pernix内切核酸酶。包括含有从生物中纯化的FEN-1内切核酸酶(包括此处提供的序列所述的特异内切核酸酶，以及变体和同源物)的组合物，含有这些组合物的试剂盒，含有嵌合内切核酸酶(含有来自这些生物的内切核酸酶的至少一部分)的组合物，含有这些组合物的试剂盒，含有编码来自这些生物(包括载体和宿主细胞)的内切核酸酶的核酸的组合物，含有这些组合物的试剂盒，抗内切核酸酶抗体，含有来自这些生物的内切核酸酶的混合物，在切割试验(例如侵入切割试验、CFLP等)中使用内切核酸酶的方法，以及含有可用于这些方法的成分的试剂盒。在此提供了描述这些内切核酸酶的生产、结构、用途和表征的实施例。

本发明也提供改进此处公开的方法和酶的方法。例如，本发明提供为了任何预期目的(例如，用于切割反应、扩增反应、结合反应或其它任何用途)改进酶的方法，包括下列步骤：提供此处公开的酶，修饰该酶(例如改变氨基酸序列，添加或删减序列，添加翻译后修饰，添加是或不是生物成分的其它任何成分，或其它任何修饰)。同样，本发明也提供改进此处公开的方法的方法，包括进行具有一个或多个改变(例如，该方法提供的组合物的改变，步骤的顺序改变，或者步骤的添加或删减)的方法步骤。

检测试验中改进的表现可能是由于几个改进的特征中的任何一个或其组合。例如，在一个实施方案中，本发明的酶切割特异靶结构的速度(kcat)可能提高，以在给定时间间隔内可以生产较大量的切割产物。在另一个实施方案中，本发明的酶切割不适当或非特异结构的活性或速度可能降低。在本发明的某些实施方案中，改进的一个方面是特定结构切割的可检测量与任何备选结构切割的可检测量之间的差异增大。同样，在本发明的范围内提供了一种酶，与天然酶的速度相比，它切割特定靶结构的速度降低，并且切割任何备选结构的速度进一步降低，使得特定结构切割的可检测量与任何备选结构切割的可检测量之间的差异增大。然而，本发明不限于这些差异增大的酶。

在一些优选实施方案中，本发明提供一种含有酶的组合物，其中该酶含有一个异源功能域，其中该异源功能域在核酸切割试验中提供改变的(例如提高的)功能性。本发明不受核酸切割试验的性质的限制。例如，核酸切割试验包括在酶存在下直接或间接切割一种核酸的任何试验。在某些优选实施方案中，核酸切割试验是一种侵入切割试验。在特别优选的实施方案中，切割试验使用含有至少一种RNA成分的切割结构。在另外一个特别优选的实施方案中，切割试验使用含有至少一种RNA成分的切割结构，其中该切割结构的DNA成员被切割。

本发明不受异源功能域提供的改变的功能性质所限制。改变的说明性实例包括但不限于异源功能域含有一种氨基酸序列(例如一个或多个氨基酸)的酶，该序列在核酸切割试验中提供提高的核酸酶活性、提高的底物结合活性和/或提高的背景特异性。

本发明不受异源功能域的性质的限制。例如，在一些实施方案中，异源功能域含有来自一种聚合酶的聚合酶域的两个或多个氨基酸(例如，通过插入化学功能域引入酶内，或者通过突变产生)。在某些优选实施方案中，两个或多个氨基酸中的至少一个来自聚合酶域的手掌区或拇指区。本发明不受从中选择两个或多个氨基酸的聚合酶的身份所限制。在某些优选实施方案中，聚合酶包括嗜热栖热菌聚合酶。在特别优选的实施方案中，两个或多个氨基酸来自SEQ ID NO：1的氨基酸300-650。

本发明的新型酶可用于检测靶DNA和RNA，包括但不限于含有野生型和突变等位基因的靶DNA和RNA，包括但不限于与或者可能与疾病或其它状况有关的来自人、其它动物或植物的基因。另外，本发明的酶也可用于检测和/或鉴定微生物株，包括细菌、真菌、原生动物、纤毛虫和病毒(特别是用于检测和鉴定含有RNA基因组的病毒，如丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒)。例如，本发明提供切割核酸的方法，包括提供：本发明的一种酶和一种底物核酸；使该底物核酸暴露于该酶(例如，产生可以检测到的切割产物)。在有些实施方案中，底物核酸位于细胞裂解物样品中。

定义

为了便于理解本发明，下面定义了大量术语和短语：

如此处所用的术语“互补的”或“互补性”用于通过碱基配对原则关联的多核苷酸(即核苷酸序列，如寡核苷酸或靶核酸)。例如，序列“5′-A-G-T-3′”与序列“3’-T-C-A-5′”互补。互补可以是“部分”的，其中只有一些核酸碱基根据碱基配对原则匹配。或者，核酸之间可以“完全”或“整体”互补。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度有显著影响。这在扩增反应以及依靠核酸之间结合的检测方法中特别重要。每个术语也可以用于多种核苷酸，特别是在多核苷酸范围内。例如，寡核苷酸内的一种具体核苷酸可能有以下特点：与该寡核苷酸的其余部分与核酸链之间的互补相反或相比，与另外一种核酸链内的核苷酸互补或缺乏互补。用来与另外一种核苷酸类似物(例如IsoC/IsoG碱基对)或与天然存在的核苷酸(如美国专利5,912,340所述，在此全文引用作为参考)形成非标准碱基对的核苷酸类似物也被认为与该定义含义内的碱基配对的配偶体互补。此外，当已知核苷酸与多种不同的碱基配对时，例如IsoG核苷酸与IsoC以及与T核苷酸配对的能力，能够与之形成氢键碱基对的每种碱基都属于如此处所用的“互补”的含义内。“通用”碱基，即能够与几种其它碱基形成碱基对的碱基，如“摆动”碱基肌苷，被认为与能够与之形成碱基对的碱基互补。

术语“同源性”和“同源的”是指同一性的程度。可以是部分同源或全部同源。部分同源序列是与另外一种序列不到100％相同的序列。

如此处所用的术语“杂交”用于互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即核酸之间的结合强度)受如下因素影响：核酸之间的互补程度，有关条件的严格性，和形成的杂合体的T_m。“杂交”方法包括一种核酸与另一种互补核酸(即含有互补核苷酸序列的核酸)退火。含有互补序列的两种核酸聚合物彼此发现并通过碱基配对相互作用退火的能力是一个公认的现象。Marmur和Lane，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 46：453(1960)和Doty等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 46：461(1960)最早发现“杂交”方法，之后该方法被改进为现代生物学的一个基本工具。

关于互补，它对于确定杂交是完全还是部分互补的某些诊断用途非常重要。例如，当只是希望检测病原体DNA(例如来源于病毒、细菌、真菌、支原体、原生动物)的存在与否时，杂交方法确保在存在相关序列时杂交才是重要的；能够选择部分互补探针和完全互补探针都将会杂交的条件。然而，其它诊断用途可能需要杂交方法能够区别部分和完全互补。检测遗传多态性可能是有意义的。例如，人血红蛋白部分由4条多肽链组成。其中两条链是相同的141个氨基酸的链(α链)，两条链是相同的146个氨基酸的链(β链)。已知编码β链的基因显示多态性。正常等位基因编码在第6个位点处为谷氨酸的β链。突变等位基因编码在第6个位点处为缬氨酸的β链。这种氨基酸差异具有深远的(当个体的突变等位基因纯合时最深远)生理影响，在临床上称为镰状细胞性贫血。众所周知，氨基酸改变的遗传基础包括正常等位基因DNA序列与突变等位基因DNA序列之间的单碱基差异。

如此处所用的核酸序列的互补序列是指一种寡核苷酸，当与该核酸序列排比使得一条序列的5’端与另一条序列的3’端配对时，其“反平行结合”。本发明的核酸中可能包含天然核酸中不常见的某些碱基，包括，例如肌苷和7-脱氮鸟嘌呤。互补不一定是完全互补；稳定的双链体可能含有错配碱基对或未配对的碱基。核酸技术领域的技术人员能够根据经验确定双链体的稳定性，这要考虑许多变量，包括，例如，寡核苷酸长度、碱基组成和寡核苷酸序列、离子强度和错配碱基对的发生率。

如此处所用的术语“T_m”是指“解链温度”。解链温度是一群双链核酸分子半解离为单链的温度。本领域公知用来计算核酸T_m的几个方程式。如标准参考文献所述，当核酸在1M NaCl水溶液中时，T_m值的简单估计可以用下列方程式计算：T_m＝81.5+0.41(％G+C)(参见，例如Anderson和Young，“定量滤膜杂交”，《核酸杂交》(Nucleic AcidHybridization)(1985))。其它参考文献(例如Allawi，H.T.和SantaLucia，J.，Jr.DNA中内部GT错配的热力学和NMR.Biochemistry36，10581-94(1997))包括更复杂的计算，T_m的计算考虑结构和环境以及序列特征。

如此处所用的术语“严格性”用于温度、离子强度和存在其它化合物的条件，在该条件下进行核酸杂交。在“高严格”条件下，核酸碱基配对只在具有高频率互补碱基序列的核酸片段之间发生。因此，当希望彼此不完全互补的核酸杂交或退火时，通常需要“弱”或“低”严格条件。

“高严格条件”当用于核酸杂交时，包括与下列条件相当的条件：当使用长度约为500个核苷酸的探针时，在42℃下，在包含5×SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH₂PO₄ H₂O和1.85g/l EDTA，pH用NaOH调节为7.4)，0.5％SDS，5×Denhardt′s试剂和100μg/ml变性鲑精DNA的溶液中结合或杂交，随后在42℃下用包含0.1×SSPE，1.0％SDS的溶液洗涤。

“中严格条件”当用于核酸杂交时，包括与下列条件相当的条件：当使用长度约为500个核苷酸的探针时，在42℃下，在包含5×SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH₂PO₄ H₂O和1.85g/l EDTA，pH用NaOH调节为7.4)，0.5％SDS，5×Denhardt′s试剂和100μg/ml变性鲑精DNA的溶液中结合或杂交，随后在42℃下用包含1.0×SSPE，1.0％SDS的溶液洗涤。

“低严格条件”当用于核酸杂交时，包括与下列条件相当的条件：当使用长度约为500个核苷酸的探针时，在42℃下，在包含5×SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH₂PO₄ H₂O和1.85g/l EDTA，pH用NaOH调节为7.4)，0.1％SDS，5×Denhardt′s试剂[50×Denhardt′s每500ml含有5g Ficoll(Type 400，Pharamcia)，5g BSA(组分V；Sigma)]和100μg/ml变性鲑精DNA的溶液中结合或杂交，随后在42℃下用包含5×SSPE，0.1％SDS的溶液洗涤。

术语“基因”是指一种DNA序列，其含有产生具有非编码功能的RNA(例如核糖体或转移RNA)、多肽或前体所必需的控制和编码序列。RNA或多肽能够由全长编码序列编码，或者由编码序列的任一部分编码，只要其保留希望的活性或功能。

术语“野生型”是指一种基因或基因产物，当从天然存在的来源中分离时，它具有基因或基因产物的特征。野生型基因是在群体中最常见的基因，因此被随意称为基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“修饰的”、“突变的”或“多态的”是指一种基因或基因产物，与野生型基因或基因产物相比，它显示序列和/或功能性质的修饰(即改变的特征)。应当指出，天然存在的突变体能够分离；它们的鉴定是根据与野生型基因或基因产物相比具有改变的特征这一事实。

如此处所用的术语“重组DNA载体”是指含有希望的异源序列的DNA序列。例如，尽管该术语不限于使用表达的序列或编码表达产物的序列，但是在有些实施方案中，异源序列是编码序列在宿主生物中复制或有效连接的编码序列在特定宿主生物中表达所需的一种编码序列和适当的DNA序列。在原核生物中表达所需的DNA序列包括启动子、任选地操纵基因序列、核糖体结合位点和可能的其它序列。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。

如此处所用的术语“LTR”是指在原病毒(即逆转录病毒的整合形式)的每一端发现的长末端重复序列。LTR含有大量调节信号，包括转录控制元件、聚腺苷酸化信号和病毒基因组复制和整合所需的序列。病毒LTR被分为三个区，称为U3、R和U5。

U3区含有增强子和启动子元件。U5区含有聚腺苷酸化信号。R(重复)区隔开U3和U5区，R区的转录序列在病毒RNA的5′和3′端都出现。

如此处所用的术语“寡核苷酸”被定义为一种分子，其含有两个或多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，优选地至少5个核苷酸，更优选地至少约10-15个核苷酸，更优选地至少约15-30个核苷酸。准确大小将取决于许多因素，这又取决于该寡核苷酸的最终功能和用途。该寡核苷酸可以用多种方法生产，包括化学合成、DNA复制、逆转录PCR或其组合。

因为单核苷酸反应生成寡核苷酸的方式为一个单核苷酸的戊糖环的5′磷酸与其邻居的3′氧通过磷酸二酯键以一个方向连接，如果其5′磷酸不与单核苷酸戊糖环的3′氧连接，则寡核苷酸的一端被称为“5′端”，如果其3′氧不与其后的单核苷酸戊糖环的5′磷酸连接，则被称为“3′端”。如此处所用的，一种核酸序列即使位于较大寡核苷酸的内部，也可以被认为具有5′和3′端。当以5’到3’方向沿核酸的一条链移动时，如果沿核酸链的第一个区的3’端位于第二个区的5’端之前，则第一个区被称为位于另一个区的上游。

当两个不同的非重叠寡核苷酸与同一线性互补核酸序列的不同区退火，且一个寡核苷酸的3’端指向另一个的5’端时，前者可以被称为“上游”寡核苷酸，后者被称为“下游”寡核苷酸。类似地，当两个重叠寡核苷酸与同一线性互补核酸序列杂交，第一个寡核苷酸的位置使其5′端位于第二个寡核苷酸的5′端上游，第一个寡核苷酸的3′端位于第二个寡核苷酸3′端上游时，第一个寡核苷酸可以被称为“上游”寡核苷酸，第二个寡核苷酸可以被称为“下游”寡核苷酸。

术语“引物”是指一种寡核苷酸，当置于启动引物延伸的条件下时，它能够作为合成的起点。寡核苷酸“引物”可以天然存在，作为纯化的限制酶切消化物，或者可以合成产生。

选择一种与模板特定序列的一条链“基本”互补的引物。为了与模板链杂交，发生引物延伸，引物必须充分互补。引物序列不需要反映模板的准确序列。例如，一条非互补核苷酸片段可以与引物的5′端连接，而引物序列的其余部分与该链基本互补。非互补碱基或较长的序列能够散布在引物内，假如引物序列与模板序列有足够的互补性，杂交并因此形成模板引物复合物，用于合成引物的延伸产物。

如此处所用的术语“标记”是指能够用来提供可检测(优选地可定量)效应并且能够与核酸或蛋白质连接的任何原子或分子。标记包括但不限于：染料；放射性标记，如³²P；结合部分，如生物素；半抗原，如洋地黄毒苷；发光、磷光或荧光部分；单独的或与通过荧光共振能量转移(FRET)能够抑制或转移发射光谱的部分相组合的荧光染料。标记可产生可通过荧光、放射性、比色法、比重法、X线衍射或吸收、磁学、酶活性等检测的信号。标记可以是一种带电荷的部分(正或负电荷)或者另外还可以带中性电荷。标记可能包含或由核酸或蛋白质序列组成，只要含有该标记的序列是可以检测的。

如此处所用的术语“信号”是指任何可检测的效应，如标记或测定反应引起或产生的。

如此处所用的术语“探测器”是指一种系统或系统的组件，例如一种仪器(例如照相机、荧光计、电荷耦合装置、闪烁计数器等)或一种反应介质(X射线或照相机胶片、pH指示剂等)，它们能够将信号或效应的存在传递给使用者或系统的另外一个组件(例如计算机或控制器)。探测器可以是：光度计或分光光度计系统，能够检测紫外线、可见光和红外线，包括荧光或化学发光；辐射检测系统；光谱系统，如核磁共振光谱、质谱或表面增强的拉曼光谱；如凝胶或毛细管电泳或凝胶排阻层析的系统；或本领域公知的其它检测系统，或其组合。

如此处所用的术语“切割结构”是指至少一种探针寡核苷酸与靶核酸相互作用形成的结构，形成含有一个双链体的结构，产生的结构可被一种切割剂(包括但不限于酶)切割。该切割结构是该切割工具的一种特异性切割底物，它不同于是试剂(如磷酸二酯酶)的非特异性切割底物的核酸分子，磷酸二酯酶切割核酸分子与二级结构无关(即不需要形成双链结构)。

如此处所用的术语“折叠的切割结构”是指含有二级结构的单链核酸底物的一个区域，该区域可被一种酶切工具切割。该切割结构是该切割工具的特异性切割底物，它不同于是试剂(如磷酸二酯酶)的非特异性切割底物的核酸分子，磷酸二酯酶切割核酸分子与二级结构无关(即不需要底物折叠)。

如此处所用的术语“折叠的靶标”是指含有二级结构的至少一个区(即至少一个双链区和核酸单链内的至少一个单链区)的核酸链。折叠的靶标除了二级结构区之外，还可能含有三级结构区。

如此处所用的术语“切割工具”或“切割剂”是指能够切割一种切割结构的任何工具，包括但不限于酶。切割工具可能包括具有5′核酸酶活性的天然DNAP(例如Taq DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I)，和更具体而言，具有5′核酸酶活性但缺乏合成活性的修饰的DNAP。“结构特异的核酸酶”或“结构特异的酶”是能够识别核酸分子的特异二级结构并切割这些结构的酶。本发明的切割工具响应切割结构的形成切割核酸分子；切割工具不一定在切割结构内的任一特定位置切割该切割结构。

切割工具不限于仅具有5′核酸酶活性的酶。切割工具可能包含来自多种来源的核酸酶活性，包括CLEAVASE酶、FEN-1内切核酸酶(包括RAD2和XPG蛋白)、Taq DNA聚合酶和大肠杆菌DNA聚合酶I。

术语“热稳定的”当用于一种酶，如5′核酸酶时，是指该酶在升高的温度(即约55℃或更高温度)下具有功能或活性(即能够进行催化)。

如此处所用的术语“切割产物”是指切割工具与切割结构反应(即用切割工具处理切割结构)产生的产物。

术语“靶核酸”是指一种核酸分子，它含有与至少一种探针寡核苷酸至少部分互补并且也可能与INVADER寡核苷酸至少部分互补的序列。靶核酸可能含有单链或双链DNA或RNA，可能含有核苷酸类似物、标记和其它修饰。

术语“探针寡核苷酸”是指一种寡核苷酸，在存在或不存在INVADER寡核苷酸的情况下，它可以与靶核酸相互作用形成切割结构。当与靶核酸退火时，探针寡核苷酸与靶标形成切割结构，切割在探针寡核苷酸内发生。

术语“非靶切割产物”是指并非来源于靶核酸的切割反应产物。如上所述，在本发明的方法中，切割结构的切割通常在探针寡核苷酸内发生。这种靶核酸依赖的切割产生的探针寡核苷酸的片段是“非靶切割产物”。

术语“INVADER寡核苷酸”是指一种寡核苷酸，它在靠近探针与靶核酸杂交区的位置处与靶核酸杂交，其中INVADER寡核苷酸含有与探针与靶标之间杂交区重叠的一部分(例如化学部分或核苷酸——与靶标互补或不互补)。在一些实施方案中，INVADER寡核苷酸在其3’端所含的序列与位于探针寡核苷酸5’端的序列基本相同。

术语“基本上单链的”当用于核苷酸底物时，是指该底物分子主要以单链核酸形式存在，它与双链底物不同，后者是以通过链间碱基配对相互作用结合在一起的核酸两条链的形式存在。

如此处所用的术语“序列变异”是指两种核酸之间核酸序列的差异。例如，野生型结构基因和该野生型结构基因的突变形式由于存在单碱基置换和/或一个或多个核苷酸的缺失或插入而在序列上可能不同。这两种结构基因的形式被认为彼此序列不同。可能存在第二种突变形式的结构基因。这第二种突变形式被认为与野生型基因和基因的第一种突变形式在序列上不同。

如此处所用的术语“释放”是指通过如5′核酸酶的作用，从较大核酸片段，如寡核苷酸上，释放核酸片段，使得释放的片段不再与寡核苷酸的其余部分共价连接。

如此处所用的术语“K_m”是指酶的米氏常数，被定义为一种酶在酶催化反应中达到其最大速度的一半时特异性底物的浓度。

如此处所用的术语“核苷酸”包括但不限于天然存在的和/或合成的核苷酸、核苷酸类似物和核苷酸衍生物。例如，该术语包括天然存在的DNA或RNA单体，骨架修饰的核苷酸，如肽核苷酸(PNA)(M.Egholm等人，Nature 365：566[1993])、硫代磷酸DNA、二硫代磷酸DNA、氨基磷酸DNA、酰胺连接的DNA、MMI连接的DNA、2′-O-甲基RNA、α-DNA和甲基膦酸DNA，糖修饰的核苷酸，如2′-O-甲基RNA、2′-氟RNA、2′-氨基RNA、2′-O-烷基DNA、2′-O-烯丙基DNA、2′-O-炔基DNA、己糖DNA、吡喃基RNA和无水己糖醇DNA，和碱基修饰的核苷酸，如C-5取代的嘧啶(取代基包括氟-、溴-、氯-、碘-、甲基-、乙基-、乙烯基-、甲酰-、乙炔基-、丙炔基-、炔基-、噻唑基-、咪唑基-、吡啶基-)，含有C-7取代基(包括氟-、溴-、氯-、碘-、甲基-、乙基-、乙烯基-、甲酰-、炔基-、链烯基-、噻唑基-、咪唑基-、吡啶基-)的7-脱氮嘌呤，肌苷和二氨基嘌呤。

如此处所用的术语“碱基类似物”是指修饰或非天然存在的碱基，如7-脱氮嘌呤(例如7-脱氮腺嘌呤和7-脱氮鸟嘌呤)；修饰的碱基，例如提供改变的相互作用，如非标准碱基配对，包括但不限于：IsoC、Iso G，和美国专利号5,432,272；6,001,983；6,037,120；6,140,496；5,912,340；6,127,121和6,143,877所述的其它修饰的碱基和核苷酸，均在此全文引用作为参考；以嘌呤或嘧啶环系统为基础的杂环碱基类似物，和其它杂环碱基。核苷酸类似物包括碱基类似物，包括脱氧核糖核苷酸以及核糖核苷酸的修饰形式。

术语“多态基因座”是在群体成员之间显示变异(例如最常见的等位基因的频率低于0.95)的一个群体中存在的一个基因座。相反，“单态基因座”是在群体成员之间不可见或可见极少变异的基因座(通常是指群体基因库中最常见的等位基因频率超过0.95的基因座)。

如此处所用的术语“微生物”是指太小以至不能用肉眼观察到的生物，包括但不限于细菌、病毒、原生动物、真菌和纤毛虫。

术语“微生物基因序列”是指来源于微生物的基因序列。

术语“细菌”是指任何细菌种，包括真细菌和古细菌种。

术语“病毒”是指不能自主复制(即复制需要使用宿主细胞的机制)的专性、超显微、细胞内寄生物。

术语“多药耐药”是指一种微生物对处理该微生物时使用的一种以上的抗生素或抗微生物剂具有抗性。

本申请书和权利要求书中使用的术语“样品”最广义地使用。一方面，包括标本或培养物(例如微生物培养物)。另一方面，包括生物和环境样品。样品可包括合成来源的标本。

生物样品可以是动物(包括人)的液体、固体(例如大便)或组织，以及液体和固体食物和饲料产品和成分，如乳制品、蔬菜、肉食和肉类副产品，和废物。生物样品可以获自所有不同的家畜以及野生动物，包括但不限于如有蹄类动物、熊、鱼、兔类、啮齿类等的动物。

环境样品包括环境物质，如表面物质、土壤、水和工业样品，以及获自食品和奶制品加工设备、装置、仪器、器皿、一次性和非一次性装置的样品。这些例子不应被视为限制适用于本发明的样品类型。

术语“靶核酸的来源”是指含有核酸(RNA或DNA)的任何样品。特别优选的靶核酸来源是生物样品，包括但不限于血液、唾液、脑脊液、胸水、乳液、淋巴、痰和精液。

如果一种寡核苷酸以高于另一种寡核苷酸(或靶核酸序列)的摩尔浓度存在，则称该寡核苷酸相对于另一种寡核苷酸(或靶核酸序列)“过量”存在。当一种寡核苷酸，如探针寡核苷酸，在切割反应中相对于互补靶核酸序列的浓度过量存在时，可以利用反应显示存在的靶核酸的量。一般而言，当过量存在时，探针寡核苷酸将至少100倍摩尔过量存在；当靶核酸序列以大约10fmol或更低浓度存在时，一般使用至少1pmole的每种探针寡核苷酸。

“怀疑含有”第一种和第二种靶核酸的样品可能含有任一种、两种或不含靶核酸分子。

术语“电荷平衡的”寡核苷酸是指一种修饰的寡核苷酸(反应中的输入寡核苷酸)，修饰的寡核苷酸带有电荷，以至在修饰的寡核苷酸被切割(即缩短)或延长时，获得的产物带有不同于输入寡核苷酸(“电荷不平衡的”寡核苷酸)的电荷，从而允许根据电荷分开输入和反应的寡核苷酸。术语“电荷平衡的”并不意味着修饰的或平衡的寡核苷酸具有净中性电荷(尽管这可能是事实)。电荷平衡是指一种寡核苷酸的设计和修饰，使得这种输入寡核苷酸产生的特异性反应产物根据电荷能够与输入寡核苷酸分开。

例如，在INVADER寡核苷酸引导的切割试验中，其中探针寡核苷酸含有序列：5′TTCTTTTCACCAGCGAGACGGG 3′(即SEQ IDNO：136，不含修饰的碱基)，探针的切割在第二个与第三个碱基之间发生，该寡核苷酸的一种可能的电荷平衡形式是：5′Cy3-氨基T-氨基-TCTTTTCACCAGCGAGAC GGG 3′。这种修饰的寡核苷酸带有净负电荷。切割后产生下列寡核苷酸：5′Cy3-氨基T-氨基-T 3′和5′CTTTTCACCAGCGAGACGGG 3′(SEQ ID NO：136的残基3-22)。5′Cy3-氨基T-氨基-T 3′含有一个可检测的部分(带正电荷的Cy3染料)和两个氨基修饰的碱基。氨基修饰的碱基和Cy3染料贡献的正电荷超过磷酸基贡献的负电荷，因此5′Cy3-氨基T-氨基-T 3′寡核苷酸带净正电荷。其它较长的切割片段，如输入探针，带有净负电荷。因为5′Cy3-氨基T-氨基-T 3′片段根据电荷能够与输入探针(电荷平衡的寡核苷酸)分开，因此它被称为电荷不平衡的寡核苷酸。较长的切割产物根据电荷无法与输入寡核苷酸分开，因为这两种寡核苷酸都带净负电荷；因此，较长的切割产物不是电荷不平衡的寡核苷酸。

术语“净中性电荷”当用于寡核苷酸，包括修饰的寡核苷酸时，是指在希望的反应或分离条件下，存在的电荷总和(即胸苷上的R-NH3+基，胞嘧啶的N3氮，磷酸基的存在与否，等等)基本为零。携带净中性电荷的寡核苷酸在电场中不迁移。

术语“净正电荷”当用于寡核苷酸，包括修饰的寡核苷酸时，是指在希望的反应条件下，存在的电荷总和(即胸苷上的R-NH3+基，胞嘧啶的N3氮，磷酸基的存在与否，等等)为+1或更高。携带净正电荷的寡核苷酸在电场中向阴极迁移。

术语“净负电荷”当用于寡核苷酸，包括修饰的寡核苷酸时，是指在希望的反应条件下，存在的电荷总和(即胸苷上的R-NH3+基，胞嘧啶的N3氮，磷酸基的存在与否，等等)为-1或更低。携带净负电荷的寡核苷酸在电场中向阳极迁移。

术语“聚合工具”或“聚合剂”是指能够有利于向寡核苷酸添加核苷三磷酸的任何试剂。优选的聚合工具包括DNA和RNA聚合酶。

术语“连接工具”或“连接剂”是指能够有利于连接(即在位于核酸两条链末端的3′-OH与5′P之间形成磷酸二酯键)的任何试剂。优选的连接工具包括DNA连接酶和RNA连接酶。

术语“反应物”在此最广义地使用。反应物可包括，例如，酶反应物、化学反应物或光(例如紫外线，特别是公知可断裂寡核苷酸链的短波长紫外线)。术语“反应物”包括能够与寡核苷酸反应从而缩短(即切割)或延长该寡核苷酸的任何试剂。

术语“加合物”在此最广义地使用，是指能添加到寡核苷酸上的任何化合物或元件。加合物可能是带电的(正电或负电)，或者可能带中性电荷。加合物可以通过共价或非共价键添加到寡核苷酸上。加合物的例子包括但不限于靛二炭花青染料亚酰胺、氨基取代的核苷酸、溴化乙锭、乙锭同型二聚体、(1，3-丙烷二氨基)丙锭、(二乙烯三氨基)丙锭、噻唑橙、(N-N′-四甲基-1，3-丙烷二氨基)丙基噻唑橙、(N-N′-四甲基-1，2-乙烷二氨基)丙基噻唑橙、噻唑橙-噻唑橙同型二聚体(TOTO)、噻唑橙-噻唑蓝杂二聚体(TOTAB)、噻唑橙-乙锭杂二聚体1(TOED1)、噻唑橙-乙锭杂二聚体2(TOED2)和荧光素-乙锭杂二聚体(FED)、补骨脂素、生物素、链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白等。

当第一种寡核苷酸与靶核酸的一个区互补，第二种寡核苷酸与同一区(或该区的一部分)互补时，则沿该靶核酸存在“序列重叠区”。重叠程度根据互补的性质而不同(参见，例如图29和67和所附讨论中的“X”区)。

如此处所用的术语“纯化的”或“纯化”是指从样品中除去污染物。例如，重组CLEAVASE核酸酶在细菌宿主细胞中表达，通过提取宿主细胞蛋白质纯化核酸酶；因此样品中这些重组核酸酶的百分比提高。

如此处所用的术语“重组DNA分子”是指包含利用分子生物学技术连接在一起的DNA片段的DNA分子。

如此处所用的术语“重组蛋白”或“重组多肽”是指由重组DNA分子表达的蛋白质分子。

如此处所用的术语“部分”当用于蛋白质时(“给定蛋白质的一部分”)，是指该蛋白质的片段。片段的大小可以是从4个氨基酸残基到整个氨基酸序列减一个氨基酸(例如4、5、6、...、n-1)。

如此处所用的术语“核酸序列”是指一种寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸，及其片段或部分，以及基因组或合成来源的DNA或RNA，它们可以是单链或双链，代表有义链或反义链。类似地，如此处所用的“氨基酸序列”是指肽或蛋白质序列。

如此处所用的术语“肽核酸”(“PNA”)是指一种分子，其含有碱基或碱基类似物，如天然核酸中发现的，但是与肽骨架连接而不是与核酸典型的糖-磷酸骨架连接。碱基与肽的连接使得碱基可以与核酸的互补碱基以类似于寡核苷酸的方式碱基配对。这些小分子，也被称为抗基因剂，通过与核酸互补链结合终止转录物的延伸(Nielsen等人Anticancer Drug Des.8：53 63[1993])。

如此处所用的术语“纯化的”或“基本纯化的”是指核酸或氨基酸序列分子，它们从其天然环境中提取，分离或分开，至少60％、优选地75％、最优选地90％不含它们天然结合的其它成分。因此，“分离的多核苷酸”或“分离的寡核苷酸”是一种基本纯化的多核苷酸。

如此处所用的术语“融合蛋白”是指一种嵌合蛋白，它含有与外源蛋白质片段(由非CLEAVASE BN/凝血酶核酸酶蛋白组成的融合配偶体)连接的目的蛋白质(例如CLEAVASE BN/凝血酶核酸酶及其部分或片段)。该融合配偶体可以提高重组嵌合蛋白(例如CLEAVASE BN/凝血酶核酸酶)在宿主细胞中表达时的溶解度，可提供亲和标签(例如his-尾)，从而允许在宿主细胞或培养上清液或此两者中纯化重组融合蛋白。如果希望，可以利用本领域公知的多种酶学或化学方法从目的蛋白质(例如CLEAVASEBN/凝血酶核酸酶或其片段)中分离融合蛋白。

如此处所用的术语“嵌合蛋白”是指一种蛋白质分子，它含有来源于两种或多种亲本蛋白质的氨基酸序列部分。这些亲本分子可能来自遗传上不同的来源的类似蛋白质、来自一种生物的不同蛋白质或来自不同生物的不同蛋白质。例如，但是并非限制，本发明的嵌合结构特异的核酸酶可含有氨基酸序列的混合物，它们来源于来自两种或多种含有这些基因的生物的FEN-1基因，组合形成非天然存在的核酸酶。如此处所用的术语“嵌合”并非意在转移天然存在的基因的任何具体比例的作用，也不是限制这些部分的组合方式。通过此处所述的检测方法测定，具有切割活性的任何嵌合结构特异的核酸酶构建体是本发明范围内的改进的切割剂。

如此处所用的术语“连续核酸链”是指一条核酸链，它含有连续、共价连接的骨架结构，不含切口或其它破坏。每个核苷酸，无论它是碱基配对的、单链的还是错配的，其碱基部分的分布不是连续链定义中的一个要素。连续链的骨架不限于在天然存在的未修饰核酸中发现的核糖-磷酸或脱氧核糖-磷酸组合物。本发明的核酸在骨架结构中可能含有修饰，包括但不限于硫代磷酸残基、膦酸残基、2’取代的核糖残基(例如2′-O-甲基核糖)和含有其它糖(例如阿拉伯糖)的残基。

如此处所用的术语“连续双链体”是指双链核酸的一个区，其中双链体内碱基对的进展没有破坏(即沿双链体的碱基对不会变形以适应连续双链体区范围内的缺口、凸起或错配)。如此处所用的术语仅指双链体内碱基对的排列，并非指核酸链骨架部分的连续性。含有不间断碱基配对，但是在一条或两条链中含有切口的双链核酸，在连续双链体的定义内。

术语“双链体”是指核酸状态，其中一条链上核苷酸的碱基部分通过氢键与第二条链上排列的它们的互补碱基结合。成为双链体形式的条件反映核酸碱基的状态。通过碱基配对，核酸链通常也假定为双螺旋的三级结构，含有一个大沟和一个小沟。形成双链的技术中包含了螺旋形式的假定。

术语“依赖双链体的蛋白质结合”是指依赖于双链或螺旋形式的核酸的蛋白质与核酸的结合。

如此处所用的术语“依赖于双链体的蛋白质结合位点或区”是指一种核酸内的不连续区或序列，它被依赖特定双链体的核酸结合蛋白以特定亲和力结合。这不同于非位点特异性蛋白质的依赖双链体的普遍结合，例如结合染色质几乎与特异序列或位点无关的组蛋白。

如此处所用的术语“蛋白质结合区”是指当与一种具体蛋白质或一类蛋白质结合时被一种序列或结构确定的核酸区。在该定义的范围内包括如下的区域，其含有足够的遗传信息，从而能够通过与已知序列比较鉴定该区，但是可能没有实际结合所必需的结构(例如依赖双链体的核酸结合蛋白质位点的单链)。如此处所用的“蛋白质结合区”不包括限制性内切核酸酶结合区。

如此处所用的术语“完整双链蛋白质结合区”是指使依赖双链体的蛋白质具有结合或其它活性所需的连续双链体的最小区域。该定义包括以下发现：有些依赖双链体的核酸结合蛋白能够以全活性与可能比标准蛋白质结合区更短的双链区相互作用，如在两条单链中的一条或另一条中所发现的。换句话说，该区域中的一个或多个核苷酸可能保持不配对，也不会抑制结合。如此处所用的术语“完整双链结合区”是指适应结合功能的最小序列。因为有些这样的区域能够在多个位置耐受非双链序列，尽管不一定同时，因此一个蛋白质结合区可能含有几个更短的亚区，当它们是双链时，将完全能够结合蛋白质。

术语“模板”是指一条核酸链，通过模板依赖的核酸聚合酶活性由核苷三磷酸在其上形成互补拷贝。按照惯例，在双链体内，模板链被描述为“底”链。类似地，非模板链通常被描述为“顶”链。

术语“模板依赖的RNA聚合酶”是指一种核酸聚合酶，其通过如上所述的模板链的拷贝能够产生新的RNA链，在没有模板时不能合成RNA。这不同于不依赖模板的核酸聚合酶的活性，后者合成或延伸核酸与模板无关，如末端脱氧核酸转移酶或Poly A聚合酶。

术语“ARRESTOR分子”是指向侵入切割反应中添加或其中包含的一种试剂，是为了终止一种或多种反应成分参与随后的作用或反应。这可以通过螯合或灭活某些反应成分(例如结合或碱基配对一种核酸成分，或与一种蛋白质成分结合)来实现。术语“ARRESTOR寡核苷酸”是指侵入切割反应中包含的一种寡核苷酸，是为了终止或阻止任一反应的一个或多个方面(例如第一个反应，和/或随后的任何反应或作用；ARRESTOR寡核苷酸并非限于任何具体反应或反应步骤)。可以通过螯合某些反应成分(例如与另外一种核酸碱基配对，或者与一种蛋白质成分结合)来实现。然而，该术语并非仅限于螯合反应成分的这些情况。

如此处所用的术语“试剂盒”是指用来递送物质的任何递送系统。在反应测定中，这类递送系统包括贮存、转运或将反应试剂(例如适当容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持物(例如缓冲液、进行测定的说明书等)从一个位置递送到另一个位置的系统。例如，试剂盒包含一个或多个外壳(例如盒子)，其中包含有关的反应试剂和/或支持物。如此处所用的术语“分区试剂盒”是指包含两个或多个不同容器的递送系统，每个容器中含有总试剂盒组分的亚部分。这些容器可以一起或分开递送到目标受体。例如，第一个容器可以含有一种在试验中使用的酶，而第二个容器含有寡核苷酸。术语“分区试剂盒”包括含有联邦食品、药品和化妆品法案第520(e)部分规定的分析纯试剂(ASR′s)的试剂盒，但是不限于此。实际上，术语“分区试剂盒”包括包含两个或多个分开容器的任何递送系统，每个容器含有总试剂盒组分的亚部分。相反，“组合试剂盒”是指在一个容器(例如一个盒子包含所有希望的组分)中含有反应试验的所有成分的递送系统。术语“试剂盒”包括分区和组合试剂盒。

如此处所用的术语“功能域”是指一种蛋白质(例如酶)的一个区、一个区的一部分，它使该蛋白质具有一种或多种功能特征。例如，酶的功能域可以直接或间接提供酶的一种或多种活性，包括但不限于底物结合能力和催化活性。功能域可以通过功能域内一个或多个氨基酸的突变来表征，其中氨基酸的突变改变了有关的功能性(在试验中根据经验确定)，从而表明功能域的存在。

如此处所用的术语“异源功能域”是指不是在其天然环境中的蛋白质功能域。例如，异源功能域包括从一种酶导入另外一种酶的功能域。异源功能域也包括对于以某些方法(例如突变、增加多个拷贝等)改变的蛋白质而言天然的功能域。异源功能域可能含有多个连续氨基酸，或者可能含有两个或多个远端氨基酸，是氨基酸片段(例如含有间插非异源序列的两个或多个氨基酸或片段)。异源功能域与内源功能域的区别在于异源氨基酸与氨基酸序列连接或含有该氨基酸序列，该序列发现不与天然氨基酸序列自然结合，或者与自然中未曾发现的蛋白质的一部分结合。

如此处所用的术语“在核酸切割试验中改变的功能性”是指一种酶不同于其天然状态的改变的(例如不同于自然中发现的)特征。改变包括但不限于异源功能域的添加(例如，通过突变或通过产生嵌合蛋白)。在有些实施方案中，酶的改变的特征可能在核酸切割试验中改善一种酶的表现。这种改善的类型包括但不限于提高的核酸酶活性(例如提高的反应速度)、提高的底物结合(例如某些核酸种[例如RNA或DNA]的提高或降低的结合，产生希望的结果[例如较高的特异性，提高的底物转换率等])和提高的背景特异性(例如产生较少不希望的产物)。本发明不限于用来检测提高的功能性的核酸切割试验。然而，在本发明的有些优选实施方案中，利用侵入切割试验作为核酸切割试验。在某些特别优选的实施方案中，使用RNA靶标的侵入切割试验被用作核酸切割试验。

如此处所用的术语“N端”和“C端”当用于多肽序列时，分别是指包括多肽的N端和C端区部分的多肽区。包含多肽N端区一部分的序列包含主要来自于多肽链N端一半的氨基酸，但不限于这些序列。例如，N端序列可以包含该多肽序列的内部部分，包括来自该多肽的N端和C端一半的碱基。同样适用于C端区。N端和C端区可以，但不是必须，分别包含限定多肽的最终N端和C端的氨基酸。

附图描述

图1显示连续侵入切割反应的示意图。在步骤A中，上游INVADER寡核苷酸和下游探针与靶核酸链结合，形成切割结构。在步骤B中，来自A的切割信号探针的一部分与第二条靶核酸链和标记的信号探针结合，形成第二种切割结构。在步骤C中，标记的第二种切割结构的切割产生一种可检测的信号。

图2显示含有RNA靶链(SEQ ID NO：141)的侵入切割结构的几个实例的示意图。图A显示一种INVADER寡核苷酸(SEQ ID NO：142)和探针(SEQ ID NO：143)。图B显示一种INVADER寡核苷酸(SEQ IDNO：144)和探针(SEQ ID NO：143)。图C显示一种INVADER寡核苷酸(SEQ ID NO：145)和探针(SEQ ID NO：145)。图D显示一种INVADER寡核苷酸(SEQ ID NO：145)和探针(SEQ ID NO：146)。

图3显示结构的两个实例的示意图，它们不是标记为SEQ IDNOs：147-152的侵入切割结构。

图4显示可用于检测靶序列变异的侵入切割构型的示意图。在A中，形成在两个探针之间具有重叠的侵入切割结构，箭头表明它可被本发明的酶切割。在B中，靶序列的变异除去了与下游探针互补的一个区，并且消除了重叠。图B中没有箭头说明与图A所示相比，该结构的切割速度降低。

图5显示在Li等人(Li等人，Protein Sci.，7：1116[1998])测定的聚合模式中，Klentaq1与引物/模板DNA的三重复合物的X射线结构图。并非旨在显示物理形态特征之间的精确界限，在文本中称为“手指”、“拇指”和“手掌”的部分分别用圆形、矩形和卵形粗略地表示。

图6显示来自水生栖热菌的DNA聚合酶基因的示意图。这些研究中使用的限制性酶切位点如上所述。编码该蛋白质的不同结构域或功能域的大致区域在下文中用双箭头表示。

图7显示含有TaqPol基因和TthPol基因部分的嵌合构建体的示意图。空心和阴影盒分别表示TaqPol和TthPol序列。数字对应于TaqPol的氨基酸序列。TaqPol的5′核酸酶和聚合酶域和聚合酶域的手掌、拇指和手指区均标明。用于重组的限制性酶切位点的缩写如下：E，EcoRI；N，NotI；Bs，BstBI；D，NdeI；B，BamHI；和S，SalI。

图8A-H显示从水生栖热菌(SEQ ID NO：153)、黄栖热菌(SEQ IDNO：154)和嗜热栖热菌(SEQ ID NO：155)中分离的聚合酶基因的核苷酸结构的比较；共有序列(SEQ ID NO：156)在每一行的上面显示。

图9A-C显示从水生栖热菌(SEQ ID NO：157)、黄栖热菌(SEQ IDNO：158)和嗜热栖热菌(SEQ ID NO：1)中分离的聚合酶的氨基酸序列的比较；共有序列(SEQ ID NO：159)在每一行的上面显示。

图10显示使用人IL-6RNA靶链(SEQ ID NO：160)和上游探针(SEQ ID NO：161)的侵入信号扩增反应中，底物的序列和建议的结构。下游探针(SEQ ID NO：162)的酶切位点用箭头表示。IL-6DNA靶链的序列(SEQ ID NO：163)在下面显示。

图11显示荧光成像仪产生的图像，显示使用所述酶的侵入切割试验的产物，和包含DNA靶链(A)或RNA靶链(B)的图10的IL-6底物。

图12比较Taq DN RX HT、Tth DN RX HT和Taq-Tth嵌合酶对含有RNA靶链的IL-6底物的循环切割活性。

图13显示TaqPol(SEQ ID NO：164)与TthPol(SEQ ID NO：165)的BstI-BamHI片段的氨基酸序列的比较。类似的氨基酸对用浅灰色作阴影。排比的具有电荷差异的氨基酸用深灰色作阴影。数字对应于TaqPol的氨基酸序列。TaqPol的氨基酸通过定点诱变改变为TthPol的相应氨基酸，用(+)表示。

图14比较Taq DN RX HT、Taq-Tth嵌合酶和含有所述其它氨基酸修饰的嵌合酶对含有RNA靶链的IL-6底物的循环切割活性。

图15比较Taq DN RX HT、Tth DN RX HT和含有所述氨基酸修饰的Taq DN RX HT对含有RNA靶链的IL-6底物的循环切割活性。

图16比较TaqPol、TthPol和Taq-Tth嵌合酶与含有所述氨基酸修饰的TaqPol的聚合活性。

图17显示在Li等人(Li等人，Protein Sci.，7：1116[1998])测定的聚合模式中，Klentaql与引物/模板DNA的三重复合物的X射线结构的图示。氨基酸G418和E507标出。

图18A-D显示可以用来测定酶的不同切割活性的底物实例的图示。例如，如上所述，底物可以用荧光染料和用于FRET检测的猝灭部分标记，以利于检测和测定。18A和18B的底物分别是含有RNA和DNA靶链的侵入切割结构。18C显示X结构的一个例子，18D显示发夹结构的一个例子，它们都可以用来评价酶对侵入切割反应中可能存在的其它结构的活性。

图19显示含有TaqPol基因和TthPol基因部分的嵌合构建体的示意图。空心和阴影盒分别表示TaqPol和TthPol序列。嵌合体也包含DN、RX和HT修饰。一张表比较了每种蛋白质对所述酶切底物的切割活性。

图20A显示含有RNA的侵入切割底物的示意图。靶分子(SEQ IDNO：166)的5’端如前所述用生物素修饰，并用链霉抗生物素蛋白封闭。也显示了含有酶切位点的下游探针(SEQ ID NO：167)。图B-D显示在不同反应温度、KCl浓度和MgSO₄浓度的条件下，在所示底物的切割中分析Taq DN RX HT G418K/E507Q突变体的性质。

图21显示用来检测酶的侵入切割活性的模型底物的图示。21A所示的分子提供一条DNA靶链(SEQ ID NO：168)，而21B中的模型提供一条含有RNA的靶链(SEQ DNA：167)。21A和B都显示下游探针SEQ ID NO：166。

图22显示用来检测酶对其它非侵入性结构的切割活性的模型底物的图示。

图23显示用来检测酶的侵入切割活性的模型底物的图示。

图24显示用来检测酶对RNA或DNA靶链的侵入切割活性的模型底物的图示。

图25比较Tth DN RX HT、Taq 2M、TfiPol、Tsc Pol和Tfi与Tsc-衍生的突变酶的循环切割活性。

发明概述

INVADER技术(参见美国专利号5,846,717、5,985,557、5,994,069和6,001,567和PCT公开文本WO 97/27214和WO98/42873，在此全文引用作为参考)提供一种信号扩增系统，能够用于检测和定量特定核酸序列，包括单点突变和类似的mRNA变体。另外，因为该技术不只是依赖于等位基因特异的杂交，因此适于定量同一样品中密切相关的RNA。本发明提供改进的酶和生产酶的方法，用于以INVADER试验为基础的核酸检测，特别是RNA核酸的检测。本发明也提供使用本发明的改进酶进行INVADER试验的试剂盒。

INVADER试验通过用结构特异的酶切割特定结构检测探针与靶标的杂交(参见，《INVADER试验》，Third WaveTechnologies；参见，例如美国专利号5,846,717；5,985,557；6,090,543；6,001,567；5,985,557；6,090,543；5,994,069；Lyamichev等人，Nat.Biotech.，17：292(1999)，Hall等人，PNAS，USA，97：8272(2000)，WO97/27214和WO98/42873，为了所有目的均在此全文引用作为参考)。除了用于特定核酸序列的定量测定之外，高特异性也提供了检测单碱基改变的能力。INVADER技术的基础是由于序列以外的结构导致的DNA和RNA分子在特定位置的切割。切割一般由5′核酸酶催化。5′核酸酶识别一种精确结构，该结构是在两种寡核苷酸探针(上游INVADER探针和下游信号探针)与核酸靶串联杂交产生底物复合物时形成的(图1A)。INVADER技术的特异性是由于序列特异的探针杂交与结构特异的酶切相结合。底物复合物具有一个对于精确酶识别而言至关重要的特征：杂交的核苷酸之间有重叠。为了形成侵入结构，上游INVADER寡核苷酸的3’端必须与杂交的信号探针区至少重叠一个碱基(Lyamichev等人，Nat.Biotechnol.，17：292[1999])。这种重叠可以如下生成：上游INVADER寡核苷酸的3’部分与下游探针寡核苷酸的靶标互补区的5’部分之间的序列复制。这样复制的序列区可以小到一个碱基。无论复制序列(即重叠)的长度如何，上游INVADER寡核苷酸的3’端碱基不必与靶链互补，可以是任何核苷酸。在有些实施方案中，可以将这个末端核苷酸替换为具有类似于核苷酸的化学特征的一个部分，如核苷酸类似物或有机环化合物(参见，例如美国专利号5,985,557)。在一个备选实施方案中，重叠不需要包括两种探针的靶标互补区之间序列的任何复制(Lyamichev等人，Nat.Biotechnol.，17：292[1999]和美国专利5,985,557)。在该实施方案中，INVADER和信号探针都含有与靶标的相邻区互补的区域，它们相邻并且不重叠。当没有共同的序列时，上游INVADER寡核苷酸的3’端包含至少一个不与靶链互补的其它核苷酸或核苷酸样类似物(Lyamichev等人，Nat.Biotechnol.，17：292[1999])。这与序列重叠不同，能够被称为物理重叠。任一种类型的重叠都将满足重叠的要求，这是INVADER试验的侵入切割的特点。图2显示了几个这样的实施方案。与上述重叠构型不同，如果探针含有与靶标相邻区互补的相邻且不重叠的区域，且上游寡核苷酸的3′端不含任何其它碱基或部分时，则不形成侵入结构(图3A)。甚至在不与靶链互补的下游寡核苷酸的5’端存在另外一个或多个碱基也不产生必需的重叠。如U.S.5,874,283所述，这后一种结构(图3B)不是“侵入切割”，尽管这些结构可用于本发明的某些实施方案。

有些5′核酸酶可能不需要上游寡核苷酸即可在切割反应中具有活性。尽管在不含上游寡核苷酸时切割可能较慢，但是仍然可以发生(Lyamichev等人，Science260：778[1993]，Kaiser等人，J.Biol.Chem.，274：21387[1999])。当DNA链是探针寡核苷酸可与之杂交的模板或靶链时，来源于DNA聚合酶和有些瓣(flap)内切核酸酶(FENs)的5′核酸酶，如来自詹氏甲烷球菌的酶，能够在不含引起重叠的上游寡核苷酸时，极好地切割(Lyamichev等人，Science 260：778[1993]，Kaiser等人，J.Biol.Chem.，274：21387[1999]，和美国专利号5,843,669，在此全文引用作为参考)。其它FENs，如来自闪烁古生球菌(Afu)和激烈火球菌(Pfu)的FEN，以比非重叠结构更高的速度切割DNA靶标上重叠的结构(即丢失了上游寡核苷酸或者含有非重叠的上游寡核苷酸)，它们能够被视为基本上绝对需要重叠(Lyamichev等人，Nat.Biotechnol.，17：292[1999]，Kaiser等人，J.Biol.Chem.，274：21387[1999])。当RNA靶标与DNA寡核苷酸探针杂交形成一种切割结构时，许多FENs较差地切割下游DNA探针，无论是否存在重叠。在这种含有RNA的结构上，来源于DNA聚合酶的5′核酸酶强烈需要重叠，没有时基本上无活性。

在严格需要重叠的条件下进行INVADER试验(例如使用AfuFEN进行DNA靶标检测，或者使用Tth DNA聚合酶的5′核酸酶进行RNA靶标检测)提供了检测单核苷酸或其它序列变异的一种出色的工具。在一个实施方案中，选择信号探针，使得疑有变化的靶碱基位于该探针的靶标互补区的5’端。安排上游INVADER寡核苷酸的位置以提供单碱基重叠。如果靶标和信号探针在所述碱基处互补，则形成重叠并且能够发生切割。该实施方案在图4A中显示。然而，如果在该位置靶标不与探针互补，探针的该碱基则成为非互补5’臂的一部分，探针之间不存在重叠，切割受到抑制。该实施方案在图4B中显示。在所有上述实施方案中，下游探针可以任选地包含一个不与靶标互补的区。在一个优选实施方案中，该非靶标互补区位于探针的5’端上，当信号探针与该靶标杂交时产生一个不配对的5′瓣。在被CLEAVASE酶切割后，释放的5′瓣能够加入随后的INVADER反应中，进一步扩增信号(参见，例如美国专利5,994,069和PCT公开文本WO 98/42873，在此全文引用作为参考)。可以使用的一种方法是作为一种INVADER寡核苷酸，它可以与提供的第二靶标和第二探针结合。在第一次侵入切割反应中CLEAVASE酶释放的5’瓣杂交后，形成第二种侵入结构复合物，因此它可以被CLEAVASE酶识别，第二种探针寡核苷酸可以被切割(Kwiatkowski等人，Molec.Diagn.，4：353[1999])，图1。

INVADER试验通常使用热稳定的CLEAVASE酶，使反应能够在接近下游探针寡核苷酸的解链温度(T_m)下进行，使得切割和未切割的探针在反应过程中可以开始及中止循环靶标。在一个优选实施方案中，较长的INVADER寡核苷酸可能不易于循环。在INVADER寡核苷酸存在下，全长探针每次与靶标结合，都能够被切割，导致切割产物的积累，这些产物对于检测的序列是高度特异性的，通常与时间和靶标浓度成比例。靶标通常是侵入切割的限制成分，因为INVADER和信号探针寡核苷酸通常摩尔过量。在第二次连接侵入切割中，第一次切割反应产生的成分(例如释放的5’瓣)是限制性的。当连续进行两个这样的切割反应时，组合反应产生的信号在靶核酸量方面线性积累，而反应顺序导致信号扩增极大地增强(Kwiatkowski等人，Molec.Diagn.，4：353[1999])。

真细菌Pol A DNA聚合酶的几个5′核酸酶域和结构上同源的DNA修复蛋白质，被称为瓣内切核酸酶(FENs)，能够切割INVADER与信号探针寡核苷酸之间形成的二级结构(Kaiser等人，J.Biol.Chem.，274：21387[1999]，Xu等人，J.Biol.Chem.，于2000年5月9日在www.jbc.org/pips/pips.2.shtml上在线发表为10.1074/jbc.M909135199)。这两类酶都含有一个推断的螺旋-发夹-螺旋(HhH)DNA结合基序，它对于DNA的不依赖于序列的、基于结构的识别至关重要(Doherty等人，Nucl.Acid.Res.，24：2488[1996])。这类DNA结合基序适于对DNA靶标进行测定，但是对于RNA靶标的测定可能会有问题，导致较低的测定敏感性。在识别RNA靶标上形成的侵入切割结构方面改进的新酶将大大提高INVADER试验在RNA靶标检测和定量方面的表现。

已经描述了与5′核酸酶和DNA聚合酶有关的大量酶改进。例如，已经描述了5′核酸酶活性改变或同时缺乏5′核酸酶活性的DNA聚合酶(美国专利5,466,591和5,795,762，均在此全文引用作为参考)。这些专利涉及热稳定的DNA聚合酶，它们显示与各自的天然聚合酶水平不同的5′-3′外切核酸酶活性。在有些实施方案中，热稳定的DNA聚合酶中特别保守的氨基酸域突变或缺失，从而改变了聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性。

已经描述了相对于天然聚合酶改变、因而显示改变的DNA合成活性的DNA聚合酶(Kaiser等人，J.Biol.Chem.，274：21387[1999]，Lyamichev等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，96：6143[1999]，美国专利5,541,311、5,614,402、5,795,763和美国专利申请系列号08/758,314，在此全文引用作为参考)。在优选实施方案中，这些DNA聚合酶改变，因此显示比天然DNA聚合酶降低的合成活性。在这方面，产生的酶主要是5′核酸酶，它们能够在没有干扰合成活性的情况下以结构特异的方式切割核酸。对于它们切割包含RNA的结构的作用，不选择这些聚合酶中形成的改变。

能够用RNA作为模板链的DNA聚合酶被称为逆转录酶，通常与RNase活性有关，RNase特异切割在异源双链体中与DNA链碱基配对的RNA。这种RNase活性通常被称为RNase H。已经描述了除去RNase H活性的改变的逆转录酶(参见，例如美国专利5,244,797，在此全文引用作为参考)。该专利涉及编码具有DNA聚合酶活性和极少或没有RNase H活性的逆转录酶的基因。发明也涉及利用逆转录酶由mRNA生产cDNA的一种方法。该专利没有描述切割含有DNA和RNA链的结构的DNA成员能力提高的酶，也不涉及在以切割含有RNA靶链的结构的DNA成员为基础的检测中表现提高的酶。

已经描述了热稳定的RNaseH酶(例如，美国专利号5,268,289、5,459,055和5,500,370，在此全文引用作为参考)。这些热稳定的酶切割含有DNA和RNA链的异源双链体的RNA成员。这些专利没有描述切割含有DNA和RNA链的结构的DNA成员能力提高的酶，也不涉及在以切割含有RNA靶链的结构的DNA成员为基础的检测中表现提高的酶。

仍然需要切割含有DNA和RNA链的结构的DNA成员能力提高的酶。具体而言，仍然需要在以切割含有RNA靶链的侵入复合物的DNA成员为基础的检测中表现提高的热稳定酶。

发明详述

已经证实INVADER侵入切割反应可用于RNA靶链的检测(参见，例如美国专利6,001,567，在此全文引用作为参考)。对于检测DNA的INVADER试验(Lyamichev等人，Nat.Biotechnol.，17：292[1999])，对于反应中存在的每个靶RNA拷贝，可以在允许多个探针拷贝切割的条件下进行反应。在一个实施方案中，可以在接近切割的探针的解链温度(T_m)的温度下进行反应，从而使切割的和未切割的探针不需要温度循环即可以容易地开始及中止循环靶标。在INVADER寡核苷酸存在下，全长探针每次与靶标结合，都被5′核酸酶切割，导致切割产物的积累。这种积累对于检测的序列高度特异，并且可能与反应的时间和靶浓度成比例。在另一个实施方案中，反应温度可以改变(即可以升高到使探针解离的温度)，然后降低到探针的新拷贝可与靶标杂交并且被该酶切割的温度。在另外一个实施方案中，升高及降低温度的过程重复多次，或者循环，如PCR一样(Mullis和Faloona，Methods inEnzymology，155：335[1987]，Saiki等人，Science 230：1350[1985])。

如上所述，含有RNA靶链的侵入切割结构优选Pol A型DNA聚合酶的5′核酸酶。本发明提供在以切割含有RNA的结构为基础的检测中表现提高的酶。具体而言，本发明的改变的聚合酶在以切割含有RNA靶链的侵入切割结构的DNA成员为基础的检测中显示提高的表现。

本发明的5′核酸酶可能来源于Pol A型DNA聚合酶。描述这类5′核酸酶中的改变时使用的术语与本领域公知的DNA聚合酶结构的描述有关。来自大肠杆菌的Pol A聚合酶的Klenow片段(C端三分之二，其具有DNA合成活性，但是缺乏5′核酸酶活性)已经描述为具有类似于右手的物理形态，含有一个被称为“手掌”的开放区，和一个容纳引物/模板双链体的裂隙，其在一侧定义为“手指”域，在另一个侧定义为“拇指”域(Joyce和Steitz，Trends in Biochemical Science 12：288[1987])。这在图5中显示。因为已经证实这种物理形态是所有Pol ADNA聚合酶和大量其它依赖模板的聚合酶(如逆转录酶)所共有的，因此手术语在本领域公知，这些酶的活性部位通常参照它们在手上的位置来描述。为了参照，而不是限制本发明，手掌由聚合酶域的大概前200个氨基酸形成，拇指由中间140个氨基酸形成，手指由下面160个氨基酸形成，裂隙的碱基由其余区域形成(图6)。尽管有些酶可能与这些结构描述不同，但是相当的结构域和对应于这些结构域的序列可以根据与已知酶序列的序列同源性、通过比较酶晶体结构和其它类似的方法来鉴定。

产生本发明的改进的酶采用几种方法，尽管本发明不只限于任何具体的方法。比较前两种DNA聚合酶Taq和Tth，它们对RNA靶标有不同的DNA链切割活性。为了鉴定与活性差异有关的结构域，产生一系列嵌合构建体，并测定活性。该方法鉴定了Tth聚合酶的两个区，如果转移到Taq聚合酶内，它能够使TaqPol具有相当于天然Tth蛋白质的RNA依赖的切割活性。在鉴定这些区域后，检查了与该活性有关的具体氨基酸。由于这两种蛋白质在总体氨基酸序列上大约87％相同，鉴定的区域只有少数氨基酸不同。通过单个和组合改变这些氨基酸，在TthPol中鉴定了一对氨基酸，如果引入TaqPol蛋白中，可提高切割速度，可达天然TthPol的水平。

这些数据证实了本发明的两个重要方面。第一，能够改变特定氨基酸，以使活性较低的聚合酶具有TthPol样依赖RNA的切割活性。然而更广泛地，这些结果提供了与含有RNA的切割结构识别有关的这些聚合酶的区域。这些重要区域的鉴定，以及本发明发展过程中发表的关于其它氨基酸与这些DNA聚合酶的不同功能的关系的信息以及计算机辅助分子模建，使得一种合理设计的方法能够产生其它改进的5′核酸酶。该信息也使与快速筛选法偶联的聚集随机诱变法能够快速产生并鉴定性质改进的酶。使用本发明的这些方法，产生了许多改进的聚合酶。

产生并选择本发明的改进的5′核酸酶中使用的方法在下文及实验实施例中详细描述。实验实施例中包括筛选及表征任何5′核酸酶的切割活性的一种常用方法。该方法的讨论分为下列部分：I)嵌合构建体的产生和筛选；II)以嵌合构建体的信息为基础的位点特异性诱变；III)以分子模建和发表的物理研究为基础的位点特异性诱变；和IV)聚焦随机诱变。

I)嵌合构建体的产生和筛选

PolA-型DNA聚合酶，包括但不限于来源于栖热菌种的DNA聚合酶，含有两个不同的结构域，5′核酸酶域和聚合酶域，如图6所示。聚合酶域位于蛋白质的C端三分之二，负责DNA依赖的和RNA依赖的DNA聚合酶活性。N端三分之一部分含有5′核酸酶域。在栖热菌Pol A聚合酶中，手掌区大概由氨基酸300-500组成，拇指区包含氨基酸500-650，而手指区由其余的氨基酸650-830组成(图6)。

修饰在本发明的许多实验中使用的以及此处描述的Taq和TthPol的衍生物Taq DN RX HT和Tth DN RX HT，以降低合成活性并促进嵌合体构建，但是具有与未修饰的TaqPol和TthPol基本相同的5′核酸酶活性。除非另外说明，下面讨论的TaqPol和TthPol酶是指DN RXHT衍生物。

TthPol对IL-6RNA模板的切割速度(图10所示)比TaqPol(图11和12所示)高4倍，但是Taq和TthPols在DNA靶结构切割方面显示相似性(图10)。因为TaqPol和TthPol的氨基酸序列(图8和9)有约87％的同一性和大于92％的相似性，酶之间的高度同源性允许产生一系列TthPol和TaqPol的嵌合酶。嵌合酶的活性用作鉴定影响RNA依赖的5′核酸酶活性的这些蛋白质区的参数。

图7和19中显示的TthPol和TaqPol基因的嵌合构建体通过交换由下列位点限定的DNA片段产生：两个基因共有的限制性内切核酸酶位点EcoRI和BamHI，克隆载体位点SalI，和通过定点诱变在两个基因的同源位置产生的新位点NotI、BstBI和NdeI。限制性内切酶缩写如下：EcoRI为E；NotI为N；BstBI为Bs；NdeI为D；BamHI为B；SalI为S。

使用IL-6 RNA靶标，利用侵入信号扩增试验评价每种嵌合酶的活性(图10)，图12所示的循环切割速度如实验实施例所述测定。通过在NotI位点处交换聚合酶域和5′核酸酶域(图7)产生前两种嵌合体TaqTth(N)和TthTaq(N)，它们的切割速度的比较表明，TaqTth(N)具有与TthPol相同的活性，而其对应物TthTaq(N)保留TaqPol的活性(图12)。此结果表明，TthPol的较高的切割速度与其聚合酶域有关，提示聚合酶域在5′核酸酶活性中的重要作用。

下一步是鉴定当置换TaqPol序列的相应区时，将产生TthPol样RNA依赖的5′核酸酶活性的TthPol聚合酶的最小区。为此，选择TaqTth(N)嵌合体，通过用TaqPol的同源区替换其TthPol序列，产生一系列新构建体。首先，用共同的BamHI位点作为断裂点，以TaqPol聚合酶域的N端和C端部分置换TaqTth(N)的相应区，分别产生TaqTth(N-B)和TaqTth(B-S)嵌合体(图7)。在氨基酸328与593之间含有TthPol序列的TaqTth(N-B)的活性比TaqTth(B-S)约高3倍，比TthPol约高40％(图12)。该结果表明，TthPol聚合酶域的NotI-BamHI部分决定了TthPol的优秀的RNA依赖的5′核酸酶活性。

根据这些数据确定，当TthPol的中心部分用来代替TaqPol的同源部分时(TaqTth(N-B)构建体)，能够使得RNA出色地识别主要由Taq蛋白组成的嵌合蛋白。实际上，该嵌合蛋白的循环率超过亲本TthPol。包含TthPol的活性提高区的亚部分的嵌合体在所有情况下均包含该区的约50％(参见TaqTth(N-D)和TaqTth(D-B)，图7和12)，它们的比较表明，与亲本TaqPol相比，RNA依赖的活性没有显著改进。该结果表明，该区域每一半的方面都是该活性所需的。只含有Tth插入部分(TaqTth(Bs-B))的较小部分的构建体显示接近于亲本TthPol蛋白，但是低于TaqTth(N-B)构建体的活性。

II)以嵌合构建体的信息为基础的位点特异性诱变

BstBI与BamHI位点之间TthPol和TaqPol氨基酸序列的比较只显示25％的差异(图13)。其中，有12个保守改变和13个置换导致电荷改变。由于嵌合酶的分析提示，某些关键氨基酸改变位于TthPol的BstBI-NdeI和NdeI-BamHI区，所以利用定点诱变将TthPol特异的氨基酸分别导入TaqTth(D-B)和TaqTth(N-D)嵌合体的BstBI-NdeI和NdeI-BamHI区。通过单或双氨基酸诱变在TaqTth(D-B)的BstBI-NdeI区中产生6个TthPol特异的置换，只有一个双突变W417L/G418K能够恢复TthPol对IL-6 RNA靶标的活性(参见如图14)。类似地，在TaqTth(N-D)的NdeI-BamHI区的同源位点引入12个TthPol特异的氨基酸，其中只有一个E507Q提高切割速度至TthPol的水平(参见例如图14)。

为了证实W417L、G418K和E507Q置换足以使TaqPol活性提高到TthPol的水平，产生含有这些突变的TaqPol变体，其对IL-6RNA底物的切割速度与TthPol进行比较。图15显示TaqPolW417L/G418K/E507Q和TaqPol G418K/E507Q突变体的活性比TthPol高1.4倍，比TaqPol高4倍，而TaqPol W417L/E507Q突变体具有与TthPol相同的活性，比TaqPol约高3倍。这些结果证实，在决定优于TaqPol的RNA依赖的5′核酸酶活性中，TthPol的K418和Q507是重要的氨基酸。

通过向另外两种生物丝状栖热菌和水管致黑栖热菌的聚合酶A基因内引入相应突变，检测这些氨基酸提高DNA聚合酶的RNA依赖的5′核酸酶活性的能力。当TaqPol被修饰含有W417L和E507Q突变，使其在这些残基处更类似于TthPol的相应残基(K418和Q507)时，它显示提高的RNA依赖的活性。修饰TfiPol，使其含有P420K和E507Q，产生TfiDN 2M，而修饰TscPol，使其含有E416K和E505Q，产生TscDN 2M。这些酶切割含有DNA和RNA的结构的活性如实施例1所述测定，其中使用图21和22所示的IdT2、IrT3、发夹和X结构，结果如图25和图7所示。这两种酶的RNA依赖的切割活性都大大低于TthPol或Taq 2M酶。然而，向这些聚合酶内引入上述突变，与未修饰的酶相比，使RNA依赖的切割活性提高2倍以上(图25)。这些结果证实，利用本发明的方法，可以将提高的RNA依赖的切割活性转移给许多聚合酶。

III)以分子模建和发表的物理研究为基础的位点特异性诱变

图17显示了Li等人(Li等人，Protein Sci.，7：1116[1998])测定的TaqPol(Klentaql)大片段与引物/模板DNA的复合物的晶体结构中G418H和E507Q突变的位置。E507Q突变位于拇指亚结构域的顶端，距引物和模板链的骨架磷酸的最近距离分别为3.8和18。以前根据Klenow片段DNA聚合酶I(Breese等人，Science 260：352[1993])和TaqPol(Eom等人，Nature 382：278[1996])的共结晶结构提示DNA引物/模板的拇指与小沟之间有相互作用。Klenow片段中拇指尖端的24个氨基酸部分的缺失，对应于TaqPol的氨基酸494-518，使DNA结合亲和力降低100倍以上(Minnick等人，J.Biol.Chem.，271：24954[1996])。这些发现符合以下假说：含有E507残基的拇指区与上游底物双链体的相互作用有关。

根据以聚合模式结合的TaqPol与双链DNA的共结晶结构，TaqPol手掌区中的W417L和G418K突变(图17)距模板和上游链的最近的磷酸约25(Li等人，Protein Sci.，7：1116[1998]，Eom等人，Nature 382：278[1996])。Klenow片段的类似W513和P514氨基酸与以编辑模式结合的DNA模板链之间观察到相同的距离(Breese等人，Science 260：352[1993])。因此，根据可以获得的该区域的共结晶研究，提示TaqPol与重叠底物之间没有相互作用。

尽管实施本发明不需要理解这些酶的作用机制，而且本发明也不只限于任何一种作用机制，但是提出只在该酶作为5′核酸酶时，TaqPol手掌区位点417和418的氨基酸才与上游底物双链体相互作用，但是当TaqPol转换为聚合模式时，不与这些氨基酸发生相互作用。该假说提出DNA聚合酶的一种新的底物结合模式，在此称为“5′核酸酶模式”。有几条证据支持这一假说。此处所述的嵌合酶的研究清楚地区分开与5′核酸酶和聚合酶活性有关的聚合酶结构域的区域。因此，W417L和G418K突变，与E507Q突变一起，影响TaqPol对含有RNA靶链的底物的5′核酸酶活性(图15)，但是对RNA-依赖的或DNA依赖的DNA聚合酶活性没有影响(图16)。另一方面，TaqPol活性部位的突变，如R573A、R587A、E615A、R746A、N750A和D785N，它们对应于大肠杆菌DNA Pol I的Klenow片段的置换，以聚合模式影响聚合酶活性和底物结合亲和力(Polesky等人，J.Biol.Chem.，265：14579[1990]，Polesky等人，J.Biol.Chem.，267：8417[1992]，Pandey等人，Eur.J.Biochem.，214：59[1993])，显示对5′核酸酶活性没有或几乎没有影响。使用程序DALI(Holm和Sander，J.Mol.Biol.，233：123[1993]，Holm和Sander，Science 273：595[1996])和Insight II(MolecularSimulation Inc.，Naperville，IL)，TaqPol(Eom等人，Nature 382：278[1996])、大肠杆菌Pol I和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)Pol I(Kiefer等人，Nature 391：304[1998])的聚合酶域的重叠显示，TaqPol的氨基酸402-451之间的手掌区，包括W417和G418，在这三种聚合酶中结构高度保守，尽管其余的手掌区亚结构域之间没有结构相似性。这一发现提示该区在真细菌DNA聚合酶中的重要作用。

如果连接酶不适当地连接末端，5′核酸酶和聚合酶活性应当精确同步，以产生带有切口的结构，而不是在Okazaki片段加工或DNA修复过程中能够导致缺失或插入的缺口或突出。根据以前提出的模型(Kaiser等人，J.Biol.Chem.，274：21387[1999])，上游链的3′端核苷酸被5′核酸酶螯合，阻止其片段，从而中止合成。与3’核苷酸的相互作用显然激活了5′核酸酶，该酶内切核苷酸切除置换的下游链的5′臂。通过在3’核苷酸确定的位点处精确切开发生这种切割，从而产生切口。该模型需要底物-酶复合物基本上重排，可能包括复合物向5′核酸酶模式的易位，从而使引物/模板与聚合酶活性部位分开。

模板与引入链之间形成的双链体与手指和拇指亚结构域形成的裂隙之间的相互作用，能够诱导底物远离聚合酶活性部位的再定位。这种相互作用能够使拇指区构象改变，从而使模板/引物双链体紧密接触W417和G418氨基酸。以前报道了拇指区的显著柔性，这可以解释这种改变(Beese等人，Science 260：352[1993]，Eom等人，Nature 382：278[1996]，Ollis等人，Nature 313：762[1985]，Kim等人，Nature 376：612[1995]，Korolev等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，92：9264[1995]，Li等人，EMBO J.，17：7514[1998])。可能有助于打开裂隙的手指域的其它构象改变，如Li等人(Li等人，EMBO J.，17：7514[1998])所述的从“封闭”向“开放”结构的转变，符合这种模型。在任何发表的DNA Pol I的共结晶结构中没有观察到5′核酸酶结合模式，因为只是用模板/引物底物，而不是用重叠的5′核酸酶底物，解析了聚合酶域的大多数结构。

已经测定TaqPol、TthPol和TaqPol G418K/E507Q对含有RNA的底物的K_m值为200-300nM。这些值大大高于用全DNA重叠底物估计的TthPol的＜1nM的K_m值，提示RNA模板不利地影响底物结合。酶与底物与RNA靶标采用的A形式双链体之间，或与RNA链的核糖2’羟基之间的不利的相互作用，能够解释这种低亲和力。在这两个因素中，后者似乎更加可能，因为真细菌DNA聚合酶的5′核酸酶能够用RNA下游探针有效地切割底物(Lyamichev等人，Science260：778[1993])，该探针可能具有A形式。此外，共结晶研究提示，模板/引物双链体在与DNA聚合酶的复合物中部分采用类似于A形式的构象(Eom等人，Nature 382：278[1996]，Kiefer等人，Nature391：304[1998]，Li等人，EMBO J.，17：7514[1998])。G418K/E507Q突变使TaqPol的k_cat提高2倍以上，但是对K_m几乎没有影响。如果突变使底物位置更适于切割的方向，而不只是提高结合常数，则这种作用是希望的。

除了上述突变分析以外，研究酶的特异区、酶结构-功能关系和酶-底物相互作用的另外一种方法是研究分子的实际物理结构。

随着结晶学、NMR和计算机及软件技术的发展，分子结构的研究已经成为那些对生物分子的构型、组织和动力学感兴趣的人的有效工具。分子模建加深了对蛋白质结构的相互作用性质以及蛋白质如何与底物功能相互作用的理解。描述不同聚合酶或聚合酶蛋白质部分、HIV逆转录酶和其它核酸结合蛋白的结构的大量公开文本提供了对蛋白质构象、构象改变和功能必需的分子相互作用的机械了解。

一个例子是，Doublie等人(Doublie等人，Nature 391：251[1998])的报道公开了T7DNA聚合酶的晶体结构，并且提供了关于氨基酸区可能影响底物结合的信息，这是接触聚合底物以及氨基酸结合辅因子(如金属离子)所必需的。在该文章及其它文献中指出，许多聚合酶不仅具有序列相似性，而且具有结构同源性。当不同聚合酶的某些结构域(例如，T7聚合酶、Klenow片段编码复合物、未配体结合的TaqDNA聚合酶和Taq聚合酶-DNA复合物)重叠时，保守基序可以清楚地辨别。

具体而言，将来自所有这些不同结构来源和参考文献的信息汇合起来，能够形成蛋白质与DNA、RNA或异源双链体相互作用的一个模型。然后检查该模型，鉴定可能与底物识别或底物接触有关的氨基酸。根据这些发现能够进行氨基酸的改变，利用筛选方法，如实验实施例所述的本发明的方法，评价对5′核酸酶蛋白的不同活性的影响。

以前所述的结构域交换分析证实，对于RNA-依赖的5′核酸酶活性而言重要的TthDN序列位于该蛋白质的聚合酶域中。因此，关于核酸识别的聚合酶域结构数据的研究提供了一种定位氨基酸的方法，当这些氨基酸改变时，可改变在5′核酸酶反应中的RNA识别。例如，在本发明的发展过程中进行的分析检查了发表的涉及大肠杆菌Pol 1聚合酶域、Klenow片段结合引物/模板的分析。表1显示测定的Klenow片段的动力学常数的采样，并且显示大量突变对这些测定的影响。TaqPol中相应的或类似定位的氨基酸在右手列中显示。如K_d改变和相对DNA亲和力值所示，假定对Klenow片段与DNA模板或引物/模板双链体的相互作用有显著影响的突变，在TaqPol和有关嵌合或突变衍生物的相应位点突变时，也可能具有影响。在TaqPol中产生并检查一种选择的突变，当该突变引入Klenow片段中时，产生较高K_d值或较低相对DNA亲和力值。这些Taq衍生物包括但不限于表1右手列中星号所示。

对于某些Klenow变体，如R682突变体，试验的选择不是根据DNA亲和力检测，而是因为分子模建提示模板/引物双链体的某些方面与该氨基酸之间的相互作用。类似地，根据结构数据和分子模建获得的信息，针对Taq聚合酶(或Taq衍生物)的其它区进行诱变。根据模建，推定拇指区接触RNA模板。因此，寻找在改变时可以改变这种接触的拇指区的氨基酸。例如，图6和17显示，氨基酸502、504和507位于拇指的顶部。可以认为改变这些氨基酸可能对酶-底物相互作用有影响。利用实施例1所述的活性筛选方法，鉴定产生有利作用的突变。该方法用来产生大量改进的酶。例如，TaqPol位点H784，对应于Klenow氨基酸H881，是手指区中的一个氨基酸，因此可能参与引物/模板底物结合。当Klenow酶中的H881氨基酸被替换为丙氨酸时，此改变使酶对DNA的亲和力降低到只有野生型水平的30-40％。在TaqPol衍生的酶中检测到一个类似的置换。以Taq衍生物W417L/G418K/E507Q开始，氨基酸784从组氨酸(H)改变为丙氨酸(A)，产生W417L/G418K/E507Q/H784A突变体，被命名为Taq 4M。该变体显示对RNA IrTl(图24)检测底物的5′核酸酶活性提高(表2的数据)。氨基酸R587位于拇指区，在计算机模型中与引物/模板双链体紧密接近，因此选择它进行突变。当向Taq 4M变体内加入R587A突变时，对IrTl检测底物的活性进一步提高。另外，相对于4M变体，图22所示X结构的切割的减少也是该酶功能的另外一个改进。

不是所有在聚合作用中降低DNA结合的氨基酸改变都影响5′核酸酶活性。例如，突变E615A、R677A，它们分别也影响位于拇指和手指域中的氨基酸，但是使用图21和22的检测底物测定，与缺乏这些改变的亲本变体相比，它们对5′核酸酶活性分别有不利的影响或没有影响。向TaqSS变体内加入R677A突变，并与该变体相比较，并向Taq 4M变体内加入E615A突变，并与该变体相比较。此处所述的检测方法提供了一种方便的方法，用于分析任何变体在侵入和非侵入底物(含有DNA和RNA的结构)的酶切活性上的改变。因此，本发明提供鉴定所有适当的改进酶的方法。

也检测可以提高酶对核酸靶标亲和力的改变。选择上述多个突变，因为它们使Klenow片段酶的DNA亲和力降低，目的在于产生更易接受含有非DNA链的结构的酶。与对DNA/DNA双链体的亲和力相比，天然DNA聚合酶对RNA/DNA双链体通常显示较低的亲和力。在本发明的发展过程中，一直试图在不恢复或提高对含有DNA而不是RNA靶链的结构的任何偏好的情况下，提高本发明的蛋白质对核酸底物的普通亲和力。检查具有不同电荷的氨基酸的置换，作为改变蛋白质与核酸底物之间相互作用的一种工具。例如，认为加入带正电的氨基酸残基，如赖氨酸(K)，可以提高蛋白质对带负电的核酸的亲和力。

如上所述，拇指区的改变能够影响蛋白质与核酸底物的相互作用。在一个实施例中，在Taq4M中引入突变G504K(拇指顶端)，使得对RNA靶标的核酸酶活性提高15％。与亲本Taq4M酶相比，其它带正电的突变(A502K和E507K)使RNA靶标依赖的活性进一步提高50％。

使用来自发表的研究和分子模建的数据，与本发明发展过程中获得的结果相组合，能够鉴定其中氨基酸的改变可能使切割功能的至少一个方面具有可见差异的蛋白质区。当区域能够这样靶向时，发现不同氨基酸的改变，即使在该蛋白质中靠近或紧邻，也可能具有不同的效果。例如，A502K置换使Taq 4M的RNA依赖的切割活性显著提高，而氨基酸499从G改变为K，距离502只有3个氨基酸，却只有最小的提高。如实验实施例所见，本发明的方法用来单独或组合地改变候选区中的几个氨基酸，然后利用实施例1提供的筛选方法快速评价这些改变的效果。这样，合理设计方法易适用于蛋白质工程任务。

除了在这些蛋白质的聚合酶域中发现的拇指、手掌和手区以外，也检查了对5′核酸酶和核酸酶域特异的区域。对多种5′核酸酶的比较研究显示，尽管氨基酸序列在酶与酶之间显著不同，但是大多数具有共同的结构特征。这些特征中的两个是螺旋-发夹-螺旋基序(H-h-H)和弓或环结构。H-h-H基序被认为介导非序列特异的DNA结合。已经在至少14个蛋白质家族中发现，包括核酸酶、N-糖基化酶、连接酶、解旋酶、拓扑异构酶和聚合酶(Doherty等人，Nucl.Acid.Res.，24：2488[1996])。与DNA模板-引物结合的大鼠DNA聚合酶pol的结晶学结构显示，在pol HhH基序的骨架氮与DNA双链体的引物的磷酸氧之间有非特异性的氢键(Pelletier等人，Science 264：1891[1994])。因为Taq和Tth聚合酶的5′核酸酶域的HhH域可能以类似的方式起作用，所以预计该酶的HhH区将改变活性。可以引入突变来改变基序的形状和结构，或者改变基序的电荷，使其对底物的亲和力提高或降低。

与来自不同来源(如真核生物、真细菌、古细菌和噬菌体)的5′核酸酶共有的另外一种结构是弓或环结构域。噬菌体T5的5′外切核酸酶的晶体结构显示由两个螺旋形成的一个明显的弓形，一个带正电，一个含有疏水残基(Ceska等人，Nature 382：90[1996])。令人感兴趣的是，T5与Taq之间保守的三个残基，Lys83、Arg 86、和Tyr 82，都位于弓形中。它们对应于Taq DNA聚合酶中的氨基酸Lys 83、Arg 86和Tyr 82。也检测了Taq(5′核酸酶)的晶体结构(Kim等人，Nature376：612[1995])。

来自詹氏甲烷球菌的瓣内切核酸酶-1的晶体结构也显示这种环基序(Hwang等人，Nat.Struct.Biol.，5：707[1998])。Mja FEN-1分子的骨架晶体结构可能在T5外切核酸酶、Taq 5′-外切核酸酶和T4RNaseH之上重叠。所有这些酶的一个令人感兴趣的共同特征是长环。FEN-1的环由大量带正电的芳香族残基组成，形成一个洞，其尺寸大到足以容纳单链DNA分子。T5外切核酸酶的相应区由三个螺旋组成，形成一个螺旋弓。T5外切核酸酶中螺旋弓形成的洞的大小不到Mj FEN-1中L1环形成的一半。在T4 RNase H或Taq 5′外切核酸酶中，该区域混乱。这种弓形的某些区结合金属，而该弓形的其它区接触核酸底物。排比来自pol I家族的DNA聚合酶的6个5′核酸酶结构域的氨基酸序列，显示有6个高度保守的序列基序，它们含有10个保守的酸性残基(Kim等人，Nature 376[1995])。

检测弓形区中改变的作用。在Taq聚合酶中，该弓形区由氨基酸80-95和96-109构成。对该弓形区进行定点诱变。FEN与聚合酶5′核酸酶的氨基酸序列的排比建议设计3个氨基酸置换：P88E、P90E和G80E。对Taq4M聚合酶突变体作为亲本酶进行这些置换。结果表明，尽管图22所示的对HP和X底物的背景活性在所有突变体中被显著抑制，但是对适当底物(IdT和IrT，图24)的希望的5′核酸酶活性也降低。尽管Taq与Tth聚合酶之间存在序列同源性，但是它们对HP和X底物有非常不同的活性。Taq与Tth聚合酶弓形区的排比也证实了具有广泛序列同源性以及较小差异的区域。这些差异导致利用Taq4M设计突变体Taq 4M A502K/G504K/E507K/T514S，产生Taq4M L109F/A110T/A502K/G504K/E507K/T514S突变体。这两种突变使Taq4M酶彻底变得在背景底物特异性上更类似于Tth酶，而对DNA和RNA底物的5′核酸酶活性几乎未变。

IV)聚焦随机诱变

如上所述，物理研究和分子模建可以单独使用或组合使用，用来鉴定其中氨基酸的改变可能使切割功能的至少一个方面具有可见差异的酶的区域。在以上的章节中，描述了使用该信息选择并改变特定氨基酸或氨基酸组合。产生功能改变的酶的另外一种方法是随机引入突变。这些突变能够用本领域公知的许多方法引入，包括但不限于在有利于核苷酸错误掺入的条件下PCR扩增(REF)、使用含有简并区的引物扩增(即一个反应中不同的但是其它类似的寡核苷酸可能含有不同碱基的碱基位置)和化学合成。本领域公知多种随机诱变方法(Del Rio等人，Biotechniques 17：1132[1994])，可以用于生产本发明的酶。此处所含的任何具体诱变方法的讨论只是通过实施例提出，并非作为限制。当进行随机诱变使得整个蛋白质只有一个具体区域不同时，能够描述为“聚焦的随机诱变”。如实验实施例所述，聚焦随机诱变法用来改变以前产生的酶变体的HhH和拇指域。选择这些结构域产生该方法的实施例，不是将随机诱变方法限于任何具体的结构域，或者一个结构域。它可以用于任何结构域，或任何完整蛋白质。在实施例1所述的筛选反应中，使用图22和24所示的检测底物，检测这样修饰的蛋白质的切割活性，结果如表5和6所示。

对亲本TaqSS或TthDNH785A突变体的HhH区进行随机诱变。产生的8种突变中没有一个显示活性比亲本酶提高(表5)。实际上，残基198-205之间区域的突变使得对DNA和RNA底物的活性大约降低2-5倍，提示该区是底物识别所必需的。拇指区的诱变产生新的突变，这些突变可使对DNA靶标的5′核酸酶活性提高20-100％，对RNA靶标的活性提高约10％(表6)。

每个不同亚结构域中的许多氨基酸在底物接触中起作用。它们的诱变可以通过改变底物结合改变底物特异性。而且，在不直接接触底物的氨基酸中引入突变也可通过较长范围或总构象改变作用改变底物特异性。这些突变可以用本领域公知的所有方法引入，包括但不限于随机诱变、定点诱变和嵌合蛋白质的产生。

如上所述，许多随机诱变方法在本领域公知。此处所述的聚焦随机诱变使用的方法可以用于整个基因。预期利用分子培育可以产生其它有用的嵌合构建体(参见，例如美国专利号5,837,458和PCT公开文本WO 00/18906、WO 99/65927、WO 98/31837和WO 98/27230，在此全文引用作为参考)。无论选择的诱变方法如何，此处所述的快速筛选方法均提供快速、有效的鉴定大量重组分子内有益改变的工具。这使得随机诱变方法成为一种易控制的实用工具，可用于产生具有有益改进的大量改变的5′核酸酶。作为实施例的用于酶的克隆和诱变策略适用于其它热稳定的和非热稳定的A型聚合酶，因为这些酶之间的DNA序列相似性极高。本领域技术人员应当理解，序列差异需要克隆策略的差异，例如，产生嵌合体可能需要使用不同的限制性内切核酸酶。现有备选位点的选择，或者通过备选位点诱变引入，是已经建立的方法，为本领域技术人员所周知。

酶的表达和纯化能够用多种分子生物学方法完成。以下所述的实施例描述了一种这样的方法，但是应当理解，本发明不限于这种克隆、蛋白质表达或纯化方法。本发明涉及能够在适当宿主中表达的核酸构建体。有大量方法可以用来将不同启动子和3’序列与基因结构相连接，实现高效表达。

V)位点特异性诱变

在本发明的某些实施方案中，应用任何适当的技术(例如包括但不限于上述一种或多种技术)产生含有异源域的改进的切割酶(例如SEQID NO：221)。因此，在一些实施方案中，利用位点特异性诱变(例如，使用商品试剂盒，如Transformer定点诱变试剂盒(Clontech)，进行的引物指导的诱变)在整个核酸序列中进行多处改变，产生编码本发明的切割酶的核酸。在有些实施方案中，串联进行多个引物指导的诱变步骤，产生编码本发明的切割酶的核酸。

在有些实施方案中，多个引物指导的诱变步骤是针对选择的核酸序列的一部分，在本发明的切割酶的选择部分中产生改变。在其它实施方案中，在选择的一部分中含有改变的核酸与在选择的不同部分中含有突变的核酸重组(例如通过克隆、分子培育或本领域公知的其它任何重组方法)，从而产生在选择的多个部分中含有突变并且编码本发明的一种切割酶的核酸。选择的每个部分中的突变可以用上述任何方法或者所述方法的任意组合引入，包括但不限于随机诱变方法和定点诱变。

例如，在本发明的一个说明性实施方案中，通过对SEQ ID NO：104的核酸序列(SEQ ID NO：104的构建见实施例7)进行多个引物指导的突变，产生SEQ ID NO：222的核酸序列(编码SEQ ID NO：221的切割酶的核酸序列)。在一些实施方案中，利用分开的诱变反应引入每个突变。连续进行反应，使得获得的核酸(SEQ ID NO：222)含有所有突变。在本发明的另外一个说明性实施方案中，如上所述，通过在SEQ IDNO：111的核酸酶部分(如图6所示)中进行多个引物指导的突变，产生SEQ ID NO：222的核酸序列。然后使用实施例4所述的重组方法，将突变核酸酶部分与SEQ ID NO：104的“聚合酶”部分在Not I位点处重组，从而产生含有SEQ ID NO：222并且编码SEQ ID NO：221的切割酶的一种核酸。在诱变后，产生改变的多肽，利用任何适当的试验(例如，包括但不限于实施例1和6所述)检测其切割活性。在一些实施方案中，编码SEQ ID NO：221的切割酶的核酸序列(例如SEQ ID NO：222)用任何适当的方法进一步修饰。

实施例

下列实施例用来说明本发明的某些优选实施方案和方面，不应视为限制其范围。

在以下公开内容中，使用下列缩写：Afu(闪烁古生球菌)；Mth(热自养甲烷杆菌)；Mja(詹氏甲烷球菌)；Pfu(激烈火球菌)；Pwo(沃氏火球菌)；Taq(水生栖热菌)；Taq DNAP，DNAPTaq和Taq Pol I(水生栖热菌DNA聚合酶I)；DNAPStf(DNAPTaq的Stoffel片段)；DNAPEcl(大肠杆菌DNA聚合酶I)；Tth(嗜热栖热菌)；Ex.(实施例)；Fig.(Figure)；℃(摄氏度)；g(引力场)；hr(小时)；min(分钟)；olio(寡核苷酸)；rxn(反应)；vol(体积)；w/v(重量比体积)；v/v(体积比体积)；BSA(牛血清白蛋白)；CTAB(十六烷基三甲铵溴化物)；HPLC(高压液相色谱)；DNA(脱氧核糖核酸)；p(质粒)；μl(微升)；ml(毫升)；μg(微克)；mg(毫克)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；pmoles(皮摩尔)；amoles(渺摩尔)；zmoles(zepto摩尔)；nm(纳米)；kdal(千道尔顿)；OD(光密度)；EDTA(乙二胺四乙酸)；FITC(异硫氰酸荧光素)；SDS(十二烷基硫酸钠)；NaPO₄(磷酸钠)；NP-40(Nonidet P-40)；Tris(三(羟甲基)-氨基甲烷)；PMSF(苯甲磺酰氟)；TBE(Tris-硼酸-EDTA，即用硼酸而不是HCl滴定且含有EDTA的Tris缓冲液)；PBS(磷酸缓冲液)；PPBS(含有1mM PMSF的磷酸缓冲液)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；Tween(聚氧乙烯-山梨聚糖)；ATCC(美国模式培养物保藏中心，Rockville，MD)；Coriell(Coriell Cell Repositories，Camden，NJ)；DSMZ(德意志微生物保藏中心，Braunschweig，德国)；Ambion(Ambion，Inc.，Austin，TX)；Boehringer(BoehringerMannheim Biochemical，Indianapolis，IN)；MJ Research(MJResearch，Watertown，MA；Sigma(Sigma Chemical Company，St.LoHis，MO)；Dynal(Dynal A.S.，Oslo，Norway)；Gull(GullLaboratories，Salt Lake City，UT)；Epicentre(Epicentre Technologies，Madison，WI)；Lampire(Biological Labs.，Inc.，Coopersberg，PA)；MJ Research(MJ Research，Watertown，MA)；National Biosciences(National Biosciences，Plymouth，MN)；NEB(New England Biolabs，Beverly，MA)；Novagen(Novagen，Inc.，Madison，WI)；；Promega(Promega，Corp.，Madison，WI)；Stratagene(Stratagene CloningSystems，La Jolla，CA)；Clonetech(Clonetech，Palo Alto，CA)Pharmacia(Pharmacia，Piscataway，NJ)；Milton Roy(Milton Roy，Rochester，NY)；Amersham(Amersham International，Chicago，IL)；和USB(U.S.Biochemical，Cleveland，OH)。Glen Research(GlenResearch，Sterling，VA)；Coriell(Coriell Cell Repositories，Camden，NJ)；Gentra(Gentra，Minneapolis，MN)；Third Wave Technologies(Third Wave Technologies，Madison，WI)；PerSeptive Biosystems(PerSeptive Biosystems，Framington，MA)；Microsoft(Microsoft，Redmond，WA)；Qiagen(Qiagen，Valencia，CA)；Molecular Probes(Molecular Probes，Eugene，OR)；VWR(VWR Scientific，)；AdvancedBiotechnologies(Advanced Biotechnologies，INC.，Columbia，MD)；和Perkin Elmer(也称为PE Biosytems和Applied Biosystems，FosterCity，CA).

实施例1

根据5′核酸酶活性对菌落的快速筛选

天然5′核酸酶和本发明的酶能够被直接检测多种功能。包括但不限于对RNA或DNA靶标的5′核酸酶活性，和使用代表靶检测反应中可能存在的结构的备选底物的背景特异性。具有适当的检测结构的核酸分子的实例在图18A-D和图21-24中显示。发展下文描述的筛选技术，用来快速、有效地表征5′核酸酶，确定新的5′核酸酶是否含有任何改进的或希望的活性。对RNA或DNA靶标的循环率提高或导致不依赖于靶标的切割减少的酶值得进行更全面的研究。通常通过对图18A和18B所示的底物进行快速菌落筛选，检测通过随机诱变开发的修饰蛋白质。然后进行快速蛋白质提取，并利用蛋白质提取物检测对备选结构的活性(例如图18C-D所示)。对活性提高的酶的最初筛选，或者进一步的筛选和表征，可以用其它切割复合物进行，如图21-24所示。本发明的范围不受用来形成这些检测切割结构的具体序列所限制。本领域技术人员应当知道如何设计产生可形成类似结构的类似核酸，用于快速筛选。

可以选择这种检测顺序来减少全部试验的数量，节约时间和试剂。酶功能的检测顺序并非旨在限制本发明。对RNA或DNA靶标显示合理循环速度的突变体然后可以培养过夜，进行快速蛋白质提取。此外，也可以同时进行切割试验的任何部分或全部。

为了方便起见，可以在不同微孔板上进行每种类型的快速筛选。例如，一块平板可以用来检测RNA INVADER活性，一块平板用来检测DNA INVADER活性。在一块平板上可以筛选多达90种不同的菌落。筛选的菌落能够来自多个来源，如未改变的(天然)5′核酸酶克隆，来自一个诱变反应(例如来自一块平板的多个菌落)，或者来自多个反应(选自多块平板的菌落)。

理想地，应当使用相同的试剂制剂，在与突变体相同的平板上设置阳性和阴性对照。较好的阳性对照的一个例子是一种菌落，其含有未修饰的酶，或以前修饰的活性与新突变体相当的酶。例如，如果对Taq DN RX HT构建体(下文描述)进行诱变反应，则应当选择未修饰的Taq DN RX HT构建体作为标准比较诱变对酶活性的影响。在快速筛选试验中也可以加入其它对照酶。例如，与Taq DN RX HT一起，也可包含Tth DN RX HT(下文描述；除非另外说明，以下所述的TaqPol和TthPol酶是指DN RX HT衍生物)作为酶活性的标准。这允许比较任何改变的酶与两种具有不同活性的已知的酶。也应当包含一个阴性对照来检测背景反应的水平(即除了所比较的核酸酶之外，由来源引起的切割或探针降解)。一种较好的阴性对照菌落是只含有在克隆和诱变中使用的载体的菌落，例如，只含有pTrc99A载体的菌落。

可能影响从特定诱变反应中选择的、用于最初快速筛选的菌落数量的两个因素是：1)诱变反应获得的菌落总数，2)诱变反应是位点特异的还是随机分布于整个基因或基因的一个区域。例如，如果平板上只存在5-10个菌落，则能够容易地检测所有菌落。如果存在上百个菌落，则可以分析其中的一部分。位点特异性诱变反应通常检测10-20个菌落，而一次随机诱变反应通常检测80-100个或更多的菌落。

说明时，这些实验实施例中描述的改变的5′核酸酶如下所述检测。

A.快速筛选：对RNA靶标的INVADER活性(图18A)

制备2×底物混合物，其中含有20mM MOPS，pH 7.5，10mMMgSO₄，200mM KCl，2μM FRET-探针oligo SEQ ID NO：223(5′-F1-CGCT-cy3-TCTCGCTCGC-3′)，1μM INVADER oligo SEQ IDNO：224(5′-ACGGAACGAGCGTCTTTG-3′)和4nM RNA靶标SEQID NO：225(5′-GCG AGC GAGA CAG CGA AAG ACG CUC GUUCCG U-3′)。将5μl 2×底物混合物分别加到96孔微孔板(Low ProfileMULTIPLATE 96，M.J.Research，Inc.)的每个样品孔中。

挑取单菌落(突变体、阳性对照和阴性对照菌落)，将每个菌落悬浮于20μl水中，由此制备细胞悬液。这能够以96孔板的形式方便地进行，每个菌落用一个孔。

向适当的检测孔中加入5μl细胞悬液，使得终反应条件是10mMMOPS，pH 7.5，5mM MgSO₄，100mM KCl，1μM FRET-探针oligo，0.5μM INVADER oligo和2nM RNA靶标。所有孔均覆盖10μl ClearCHILLOUT 14(M，J.Research，Inc.)液体石蜡，样品在85℃下加热3分钟，然后在59℃下温育1小时。温育后，用Cytofluor荧光读板器读板，使用下列参数：激发485/20，发射530/30。

B.快速筛选：对DNA靶标的INVADER活性(图18B)

制备2×底物混合物，其中含有20mM MOPS，pH 7.5，10mMMgSO₄，200mM KCl，2μM FRET-探针oligo SEQ ID NO：223(5′-F1-CGCT-cy3-TCTCGCTCGC-3′)，1μM INVADER oligo SEQ IDNO：224(5′-ACGGAACGAGCGTCTTTG-3′)，1nM RNA靶标SEQID NO：226(5′-GCG AGC GAGA CAG CGA AAG ACG CTC GTTCCG T-3′)。将5μl 2×底物混合物分别加到96孔微孔板(MJ LowProfile)的每个样品孔中。

挑取单菌落(突变体、阳性对照和阴性对照菌落)，将其悬浮于20μl水中，由此制备细胞悬液，通常使用96孔板的形式。

向适当的检测孔中加入5μl细胞悬液，使得终反应条件是10mMMOPS，pH 7.5，5mM MgSO₄，100mM KCl，1μM FRET-探针oligo，0.5μM INVADER oligo和0.5nM DNA靶标。所有孔均覆盖10μlClear CHILLOUT 14(M，J.Research，Inc.)液体石蜡，反应体系在85℃下加热3分钟，然后在59℃下温育1小时。1小时温育后，用Cytofluor荧光读板器读板，使用下列参数：激发485/20，发射530/30，放大40，每孔读数10。

C.快速蛋白质提取(粗细胞裂解物)

进一步分析那些在RNA或DNA INVADER试验中获得阳性或意外结果的突变体，具体分析对X结构或发夹底物的背景活性(分别见图18C和D)。能够使用快速筛选形式，如上所述。只是改变底物，即能进行对背景或异常酶活性的检测。另外一种方法是从阳性克隆的小量过夜培养物中快速提取蛋白质，然后检测这种粗细胞裂解物的其它蛋白质功能。下文详述了一种可能的快速蛋白质提取方法。2-5ml LB(为了质粒选择含有适当的抗生素；参见，例如Maniatis，书1、2、3)接种20μl水-细胞悬液的剩余体积，在37℃下温育过夜。将约1.4ml培养液转移到一个1.5ml微量离心管中，以最高速度(例如Eppendorf5417台式微量离心机为14,000rpm)微量离心，室温3-5分钟，沉淀细胞。弃去上清液，将细胞沉淀悬浮于100μl TES缓冲液pH 7.5(Sigma)中。加入溶菌酶(Promega)至终浓度为0.5μg/μl，样品在室温下温育30分钟。然后将样品在70℃下加热10分钟灭活溶菌酶，以最高速度微量离心5分钟沉淀细胞碎片。吸出上清液，在下列酶活性测定中使用这种粗细胞裂解物。

D.快速筛选：对X结构底物的背景特异性(图18C)

反应在如上详述的条件下进行。将1μl粗细胞裂解液加入9μl反应组分中，至终体积为10μl，终浓度为10mM MOPS，pH 7.5，5mMMgSO₄，100mM KCl，1μM FRET-探针oligo(SEQ ID NO：223)，0.5μM X-结构INVADER oligo SEQ ID NO：227(5′-ACGGAACGAGCGTCTTTCATCTGTCAATC-3′)和0.5nM DNA靶标(SEQ ID NO：226)。所有孔均覆盖10μl Clear CHILLOUT 14(M，J.Research，Inc.)液体石蜡，反应体系在85℃下加热3分钟，然后在59℃下温育1小时。温育后，用Cytofluor荧光读板器读板，使用下列参数：激发485/20，发射530/30，放大40，每孔读数10。

E.快速筛选：对发夹底物的背景特异性(图18D)

反应在如上详述的条件下进行。将1μl粗细胞裂解液加入9μl反应组分中，至终体积为10μl，终浓度为10mM MOPS，pH 7.5，5mMMgSO₄，100mM KCl，1μM FRET-探针oligo(SEQ ID NO：223)和0.5nM DNA靶标(SEQ ID NO：226)。所有孔均覆盖10μl ClearCHILLOUT 14(M，J.Research，Inc.)液体石蜡，反应体系在85℃下加热3分钟，然后在59℃下温育1小时。1小时温育后，用Cytofluor荧光读板器读板，使用下列参数：激发485/20，发射530/30，放大40，每孔读数10。

F.使用IrTl和IdT靶标的活性测定(图24)

5′核酸酶活性测定在10μl反应体系中进行，其中含有10mMMOPS，pH 7.5，0.05％Tween 20，0.05％Nonidet P-40，10μg/ml tRNA，100mM KCl和5mM MgSO₄。探针浓度(SEQ ID NO：167)为2mM。底物(IrTl(SEQ ID NO：228)或IdT(SEQ ID NO：229)，终浓度分别为10或1nM)和如实施例3所述制备的大约20ng酶，与上述反应缓冲液混合，覆盖CHILLOUT(MJ Research)液体石蜡。反应体系的反应温度为57℃，通过加入MgSO₄开始，温育10分钟。然后加入10μl含有10mM EDTA和0.02％甲基紫(Sigma)的95％甲酰胺终止反应。样品在90℃下加热1分钟，立即在45mM Tris-硼酸，pH 8.3，1.4mMEDTA缓冲液中利用含有7M尿素的20％变性丙烯酰胺凝胶(19∶1交联)电泳。除非另外说明，每道加1μl终止的反应液。然后使用505nm滤光片，用FMBIO-100荧光凝胶扫描仪(Hitachi)扫描凝胶。利用FMBIO分析软件(版本6.0，Hitachi)，根据对应于未酶切和酶切的底物的带强度测定切割产物的分数。切割产物的分数不超过20％，以确保测定接近最初的切割速度。转换率定义为在这些反应条件下每个靶分子每分钟产生的切割信号探针的数量(l/min)。

G.使用X结构(X)和发夹(HP)靶标的活性测定(图22)

5′核酸酶活性测定在10μl反应体系中进行，其中含有10mMMOPS，pH 7.5，0.05％Tween 20，0.05％Nonidet P-40，10μg/ml tRNA，100mM KCl和5mM MgSO₄。加入用于形成发夹结构装配体(22A，SEQ ID NOS：230和231)或X结构装配体(22B，SEQ ID NOS：230-232)的每种oligo，至终浓度为1μM，如实施例3所述制备的约20ng检测酶与上述反应缓冲液混合，覆盖CHILLOUT(MJ Research)液体石蜡。反应体系置于60℃下，加入MgSO₄开始，温育10分钟。然后加入10μl含有10mM EDTA和0.02％甲基紫(Sigma)的95％甲酰胺终止反应。样品在90℃下加热1分钟，之后立即在45mM Tris-硼酸，pH8.3，1.4mM EDTA的缓冲液中，用含有7M尿素的20％变性丙烯酰胺凝胶(19∶1交联)电泳。除非另外说明，每道加样1μl终止反应液。然后使用505nm滤光片，用FMBIO-100荧光凝胶扫描仪(Hitachi)扫描凝胶。使用FMBIO分析软件(版本6.0，Hitachi)，根据对应于未切割的和切割的底物的带强度测定切割产物的分数。切割产物的分数不超过20％，以确保测定接近开始时的切割速度。转换率被定义为在这些反应条件下每个靶分子每分钟产生的切割的信号探针的数量(l/min)。

H.使用人IL-6靶标的活性测定(图10)

5′核酸酶活性测定在10μl反应体系中进行，其中含有10mMMOPS，pH 7.5，0.05％Tween 20，0.05％Nonidet P-40，10μg/ml TRNA，100mM KCl和5mM MgSO₄。含有DNA IL-6底物的反应包含0.05nM IL-6DNA靶标(SEQ ID NO：163)和各1μM探针(SEQ ID NO：162)和INVADER(SEQ ID NO：161)寡核苷酸，在60℃下进行30分钟。含有IL-6 RNA靶标(SEQ ID NO：160)的反应在相同条件下进行，不同之处在于IL-6RNA靶标浓度为1nM，反应在57℃下进行60分钟。每个反应含有约20ng如实施例3所述制备的检测酶。

I.使用合成r25mer靶标的活性测定(Figure 23)

含有合成r25mer靶标(SEQ ID NO：233)的反应在相同条件下(10mM MOPS，pH 7.5，0.05％Tween 20，0.05％Nonidet P-40，10μg/mltRNA，100mM KCl和5mM MgSO₄)使用各1μM探针(SEQ IDNO：234)和INVADER(SEQ ID NO：235)寡核苷酸进行，不同之处在于r25mer靶标的浓度为5nM，反应在58℃下进行60分钟。向反应体系中加入约20ng每种检测酶。这些酶如实施例3所述制备。

能够修饰上述任何试验，以获得酶活性的最佳条件。例如，能够进行酶的滴定，以确定最大切割活性的最佳酶浓度，和最低的背景信号。例如，但并非限制，许多突变酶以10、20、40ng的量检测。类似地，试验中也能引入温度滴定。由于修饰蛋白质结构能够改变其温度需要，所以能够检测温度范围来确定最适于所述突变体的条件。

表3-8和图12、14、15、19、25显示了这些筛选(使用约20ng突变酶)的结果的例子。

实施例2

DNA聚合酶和突变聚合酶的5′核酸酶的克隆和表达

A.水生栖热菌和嗜热栖热菌的DNA聚合酶

1.TaqPol和TthPol的克隆

来自栖热菌属的真细菌的A型DNA聚合酶具有广泛的蛋白质序列同一性(聚合域有90％，使用DNAStar，WI的DNA分析软件中的Lipman-Pearson法)，在聚合和核酸酶测定中行为相似。因此，水生栖热菌(TaqPol)、嗜热栖热菌(TthPol)和水管致黑栖热菌的DNA聚合酶基因是这一类别的代表。来自其它真细菌生物的聚合酶，包括但不限于来自大肠杆菌、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、耻垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis)、嗜热栖热菌、栖热菌属的种、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、非洲栖热腔菌(Thermosiphoafricanus)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的，同样是适合的。

a.最初的TaqPol分离：突变TaqA/G

使用SEQ ID NOS：236和237所示的寡核苷酸作为引物，通过聚合酶链反应由水生栖热菌YT-1株的基因组DNA扩增Taq DNA聚合酶基因(Lawyer等人，同上)。获得的DNA片段在编码序列的5’端含有限制性内切核酸酶EcoRI的识别序列，在编码链的3’端含有BglII序列。用BglII酶切产生一个5′突出或“粘端”，它们与BamHI产生的末端相容。PCR扩增的DNA用EcoRI和BamHI消化。凝胶纯化含有聚合酶基因编码区的2512bp片段，然后连接到含有诱导型启动子的质粒内。

在本发明的一个实施方案中，使用pTTQ18载体，其含有杂合trp-lac(tac)启动子(M.J.R.Stark，Gene 5：255[1987])。tac启动子位于大肠杆菌lac阻抑蛋白控制下。阻抑使基因产物的合成受到抑制，直到细菌生长达到希望的水平，此时加入特定诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)解除抑制。该系统允许外源蛋白质的控制表达，可以减缓或阻止转化子的生长。

特别强的细菌启动子，如合成Ptac，当在多拷贝质粒中存在时可能不被完全抑制。如果一种高毒性蛋白质位于这种启动子控制下，甚至在不含诱导剂的情况下，少量的表达渗透都可能对细菌有害。在本发明的另一个实施方案中，涉及抑制克隆基因产物合成的另外一种选择。在质粒载体系列pET-3中发现的来自噬菌体T7的一种非细菌启动子，被用来表达克隆的突变Taq聚合酶基因(Studier和Moffatt，J.Mol.Biol.，189：113[1986])。该启动子仅被T7RNA聚合酶启动转录。在一种适当的株中，如BL21(DE3)pLYS，噬菌体T7RNA聚合酶基因位于细菌基因组中，在lac操纵基因控制下。这种排列具有(质粒上)多拷贝基因的表达完全依赖于T7RNA聚合酶的表达的优点，因为它存在于一个拷贝中，所以容易被抑制。

这里正好有两个含有适当诱导型启动子的载体的例子。本领域技术人员公知其它载体，本发明的改进的核酸酶不受表达系统限制选择的限制。

为了连接到pTTQ18载体内，含有Taq聚合酶编码区的PCR产物DNA(由于下述原因被称为mutTaq，SEQ ID NO：238)用EcoRI和BglII消化，该片段在标准“粘端”条件下连接(Sambrook等人，《分子克隆》，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，pp.1.63-1.69[1989])到质粒载体pTTQ 18的EcoRI和BamHI位点内。该构建体的表达产生一种翻译融合产物，其中天然蛋白质的前两个残基(Met-Arg)被替换为来自该载体的三个残基(Met-Asn-Ser)，但是PCR产物的蛋白质序列的其余部分不变(SEQ ID NO：239)。用该构建体转化大肠杆菌JM109株，转化子在不完全抑制的条件下平板接种，该条件不允许表达天然蛋白质的细菌生长。这些平板接种条件允许分离含有预先存在的突变的基因，如扩增过程中由Taq聚合酶的失真(infidelity)产生的突变。

使用这种扩增/筛选方案，分离含有突变Taq聚合酶基因(mutTaq)的克隆。首先检测该突变体的表型，其在粗细胞提取物中的温度稳定的5′核酸酶活性正常，但是聚合活性几乎没有(大约不到野生型Taq聚合酶活性的1％)。聚合酶活性通过引物延伸反应测定。反应在10μl缓冲液中进行，其中含有10mM MOPS，pH7.5，5mM MgSO₄，100mM KCl。在每个反应中，在10μM poly(A)₂₈₆或1μM poly(dA)₂₇₃模板、45μM dTTP和5μM Fl-dUTP存在下，利用40ng酶延伸10μM(dT)_25-30引物，60℃30分钟。用10μl终止溶液(95％甲酰胺，10mMEDTA，0.02％甲基紫染料)终止反应。样品(3μl)在15％变性丙烯酰胺凝胶(19∶1交联)上分级分离，用配备505nm发射滤光片的FMBIO-100荧光凝胶扫描仪(Hitachi)定量掺入的Fl-dUTP的级分。

重组基因的DNA序列分析表明，在聚合酶域中具有改变，导致两个氨基酸置换：核苷酸位点1394处A到G的改变，它使氨基酸位点465处Glu改变为Gly(根据天然核酸和氨基酸序列编号，SEQ IDNO：153和157)，另外一个在核苷酸位点2260处A到G的改变，它使氨基酸位点754处的Gln改变为Arg。因为Gln到Gly的突变位于非保守位点，并且因Glu到Arg的突变改变了实际上在所有已知A型聚合酶中保守的氨基酸，后一种突变最可能导致降低该蛋白质的合成活性。该构建体的核苷酸序列在SEQ ID NO：39中列出。该序列编码的酶被称为Taq A/G。

b.最初的TthPol分离

来自细菌种嗜热栖热菌(Tth)的DNA聚合酶如下生产：将该蛋白质的基因克隆到一种表达载体中，并在大肠杆菌细胞中过量产生。基因组DNA用1瓶干燥的来自ATCC的嗜热栖热菌HB-8株(ATCC#27634)制备。DNA聚合酶基因通过PCR扩增，使用下列引物：5′-CACGAATTCCGAGGCGATGCTTCCGCTC-3′(SEQ ID NO：240)和5′-TCGACGTCGACTAACCCTTGGCGGAAAGCC-3′(SEQ IDNO：241)。获得的PCR产物用EcoRI和SalI限制性内切核酸酶消化，插入EcoRI/SalI消化的质粒载体pTrc99G内(实施例2C1描述)，产生质粒pTrcTth-1。这种Tth聚合酶构建体丢失一个单核苷酸，该核苷酸被从5′寡核苷酸中非故意地去除，产生框外的聚合酶基因。使用下列寡核苷酸：5′-GCATCGCCTCGG ATTCATGGTC-3′(SEQ IDNO：242)，通过如实施例4和5所述的pTrcTth-1的位点特异性诱变更正这种错误，产生质粒pTrcTth-2。该蛋白质和编码该蛋白质的核酸序列被称为TthPol，分别作为SEQ ID NOS：243和244列出。

c.重组蛋白的大规模制备

重组蛋白用来源于Taq DNA聚合酶制备方案(Engelke等人，Anal.Biochem.，191：396[1990])的下列技术纯化，如下所述。含有pTrc99ATaqPol、pTrc99GTthPol的大肠杆菌细胞(JM109株)接种3ml含有100mg/ml氨苄青霉素的LB，在37℃下培养16小时。用整个过夜培养液接种200ml或350ml含有100mg/ml氨苄青霉素的LB，在37℃下剧烈振荡培养至A₆₀₀＝0.8。加入IPTG(1M贮存溶液)至终浓度为1mM，在37℃下继续培养16小时。

沉淀诱导的细胞，称重细胞沉淀。加入等体积的2×DG缓冲液(100mM Tris-HCL，pH7.6，0.1mM EDTA)，通过搅拌悬浮沉淀。加入15mg/ml溶菌酶(Sigma)至1mg/ml的终浓度，细胞在室温下温育15分钟。在振荡下逐滴加入脱氧胆酸(10％溶液)至终浓度为0.2％。加入1倍体积的H₂O和1倍体积的2×DG缓冲液，得到的混合物在冰上超声处理2分钟，以降低混合物的粘度。超声处理后，加入3M(NH₄)₂SO₄至终浓度为0.2M，裂解液在4℃下以14000×g离心20分钟。吸出上清液，在70℃下温育60分钟，此时加入10％聚亚乙基亚胺(PEI)至0.25％。在冰上温育30分钟后，混合物在4℃下以14,000×g离心20分钟。此时，吸出上清液，如下加入(NH₄)₂SO₄沉淀蛋白质。

加入2倍体积的3M(NH₄)₂SO₄沉淀蛋白质。混合物在室温下温育过夜，16小时，在4℃下以14000×g离心20分钟。将蛋白质沉淀悬浮于0.5ml Q缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，0.1mM EDTA，0.1％Tween 20)中。为了制备Mja FEN-1，加入固体(NH₄)₂SO₄至终浓度为3M(～75％饱和)，该混合物在冰上温育30分钟，蛋白质如上所述离心并悬浮。

通过测量A279，定量悬浮的蛋白质制品，透析并贮存于含有100μg/ml BSA的0.5％甘油，20mM Tris HCl，pH8.0，50mM KCl，0.5％Tween 20，0.5％Nonidet P-40中。

B.丝状栖热菌和水管致黑栖热菌的DNA聚合酶

1.丝状栖热菌和水管致黑栖热菌的克隆

一瓶从DSMZ(德意志微生物保藏中心，Braunschweig，德国，菌株#4687)获得的冻干的丝状栖热菌(Tfi)在1ml Castenholz培养基(DSMZ培养基86)中再水合，接种预温到50℃的500ml Castenholz培养基。该培养物在70℃和剧烈振荡下温育48小时。生长后，以8000×g离心10分钟收获细胞，细胞沉淀悬浮于10ml TE(10mM TrisHCL，pH 8.0，1mM EDTA)中，细胞以1ml等份冻存于-20℃。融化一份1ml等份，加入溶菌酶至1mg/ml，细胞在23℃下温育30分钟。加入20％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液至终浓度为0.5％，随后用缓冲的酚抽提。水相进一步用1∶1的酚∶氯仿抽提，最后一次用氯仿抽提。向水相中加入十分之一体积的3M乙酸钠，pH 5.0和2.5倍体积的乙醇，混合。以20,000×g离心5分钟沉淀DNA。DNA沉淀用70％乙醇洗涤，风干，重悬浮于200μl TE中，直接用于扩增。培养水管致黑栖热菌(Tsc，ATCC#51532)，如上对于丝状栖热菌所述制备基因组DNA。

来自Tfi(GenBank保藏号AF030320)的DNA聚合酶I基因不能扩增为单片段。因此，以2个不同片段克隆到表达载体pTrc99a内。这2个片段重叠，共有一个Not I位点，该位点是通过在PCR寡核苷酸中的Tfi DNA聚合酶开放阅读框(ORF)的位点1308处引入一个沉默突变而产生的。该基因的3′一半用Advantage cDNA PCR试剂盒(Clonetech)扩增，使用下列寡核苷酸：5′-ATAGCCATGGTGGAGCGGCCGCTCTCCCGG(SEQ IDNO：245)和5′-AAGCGTCGACTCAATCCTGCTTCGCCTCCAGCC(SEQ ID NO：246)。该反应的PCR产物长度约为1200个碱基对。用限制性内切酶Not I和Sal I酶切，将产生的DNA连接到用NotI和SalI酶切的pTrc99a内，产生pTrc99a-Tfi3′。该基因的5′一半如上所述扩增，使用下列两种引物：5′AATCGAATTCACCCCACTTTTTGACCTGGAGG(SEQ IDNO：247)和5′-CCGGGAGAGCGGCCGCTCCAC(SEQ ID NO：248)。获得的1300碱基对片段用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，并连接到用NotI和EcoRI酶切的pTrc99a-Tfi3′内，产生pTrc99a-TfiPol，SEQID NO：249(相应的氨基酸序列在SEQ ID NO：250中列出)。

来自水管致黑栖热菌的DNA聚合酶I基因用Advantage cDNAPCR试剂盒(Clonetech)扩增，使用下列两种引物：5′-ACTGGAATTCCTGCCCCTCTTTGAGCCCAAG(SEQ IDNO：251)和5′-AACAGTCGACCTAGGCCTTGGCGGAAAGCC(SEQ ID NO：252)。PCR产物用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切，连接到EcoRI/SalI酶切的pTrc99a内，产生pTrc99a-TscPol SEQ ID NO253(相应的氨基酸序列在SEQ ID NO：254中列出)。

2.丝状栖热菌和水管致黑栖热菌的表达和纯化

为了蛋白质表达，用质粒转化蛋白酶缺陷的大肠杆菌BL21株(Novagen)或JM109株(Promega Corp.，Madison，WI)。用来自LB平板或来自适当菌株冷冻原种的单菌落接种含有200ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB的摇瓶。在37℃和剧烈振荡下培养数小时后，加入200μl 1M异硫丙基半乳糖苷(IPTG)诱导培养物。在37℃下继续培养16小时后收获。以8000×g离心15分钟沉淀细胞，随后将细胞沉淀悬浮于5ml TEN(10mM TrisHCl，pH 8.0，1mM EDTA，100mM NaCl)中。加入100μl 50mg/ml溶菌酶，细胞在室温下温育15分钟。加入脱氧胆酸(10％)至终浓度为0.2％。在充分混合后，细胞裂解物在冰上超声处理2分钟，以降低混合物的粘度。在4℃下以20,000×g离心15分钟沉淀细胞碎片。吸出上清液，在70℃下温育30分钟，之后加入10％聚亚乙基亚胺(PEI)至0.25％。在冰上温育30分钟后，混合物在4℃下以20,000×g离心20分钟。此时，吸出含有酶的上清液，加入1.2g硫酸铵，在4℃下温育1小时，沉淀蛋白质。在4℃下以20000×g离心10分钟沉淀蛋白质。将沉淀重悬浮于4ml HPLC缓冲液A(50mMTrisHCl，pH 8.0，0.1mM EDTA)中。利用Econo-Pac肝素柱(Bio-Rad)和Dionex DX 500HPLC设备通过亲和层析进一步纯化该蛋白质。简言之，柱体用HPLC缓冲液A平衡，将酶提取物加到柱上，用NaCl在相同缓冲液中的线性梯度(0-2M)洗脱。纯蛋白质在0.5-1M NaCl之间洗脱。收集酶峰，在50％甘油，20mM Tris HCl，pH 8，50mM KCl，0.5％Tween 20，0.5％Nonidet P40，100mg/ml BSA中透析。

C.聚合酶活性降低但是5′核酸酶活性不变的聚合酶突变体的产生

部分C中产生的所有突变体都如实施例2A1C所述表达并纯化。

1.修饰的TaqPol基因：TaqDN

构建一种被称为TaqDN的聚合缺陷的Taq DNA聚合酶突变体。TaqDN核酸酶在位点785处含有一个天冬酰胺残基代替野生型的天冬氨酸残基(D785N)。

在两轮定点诱变中，由编码Taq A/G的基因构建编码TaqDN核酸酶的DNA。首先，Taq A/G基因(SEQ ID NO：238)的位点1397处的G和位点2264处的G均被改变为A，产生野生型TaqPol基因。在第二轮诱变中，通过将位点2356处的G改变为A，使野生型TaqPol基因转变为Taq DN基因。这些操作如下所述进行。

利用一种两步方法，将编码Taq A/G核酸酶的DNA从pTTQ18质粒中再克隆到pTrc99A质粒(Pharmacia)内。首先，通过除去pTrc99A图谱的位点270处的G修饰pTrc99A载体，产生pTrc99G克隆载体。为此，pTrc99A质粒DNA用NcoI酶切，并在所有4种dNTPs存在下用大肠杆菌聚合酶I Klenow片段补平隐性3′端，37℃15分钟。通过65℃温育10分钟灭活Klenow片段后，质粒DNA用EcoRI酶切，再次在所有4种dNTPs存在下用Klenow片段补平末端，37℃15分钟。然后通过65℃温育10分钟灭活Klenow片段。乙醇沉淀质粒DNA，通过连接再环化，用来转化大肠杆菌JM109细胞(Promega)。自单菌落中分离质粒DNA，通过DNA测序证实pTrc99A图谱的位点270处G的缺失。

第二步，使用EcoRI和SalI从pTTQ18质粒上切下编码Taq A/G核酸酶的DNA，含有Taq A/G核酸酶基因的DNA片段在1％琼脂糖凝胶上分离，并用Geneclean II试剂盒(Bio 101，Vista，CA)分离。将纯化的片段连接到已经用EcoRI和SalI酶切的pTrc99G载体内。用连接混合物转化感受态大肠杆菌JM109细胞(Promega)。从单菌落中分离质粒DNA，使用EcoRI和SalI的限制酶切分析证实了Taq A/G核酸酶基因的插入。

使用QIAGEN Plasmid Maxi试剂盒(QIAGEN，Chatsworth，CA)，按照厂商方案，从200ml JM109过夜培养物中纯化克隆到pTrc99A载体内的含有Taq A/G核酸酶基因的质粒DNA pTrcAG。使用两种诱变引物E465(SEQ ID NO：255)(Integrated DNA Technologies，Iowa)和R754Q(SEQ ID NO：256)(Integrated DNA Technologies)和选择引物反式寡核苷酸AlwNI/SpeI(Clontech，Palo Alto，CA，目录#6488-1)，按照TRANSFORMER定点诱变试剂盒方案(Clontech，Palo Alto，CA)，诱变pTrcAG质粒DNA，产生一种恢复的野生型TaqPol基因(pTrcWT)。

使用QIAGEN Plasmid Maxi试剂盒(QIAGEN，Chatsworth，CA)，按照厂商方案，从200ml JM109过夜培养物中纯化克隆到pTrc99A载体内的含有野生型TaqPol基因的pTrcWT质粒DNA。然后使用诱变引物D785N(SEQ ID NO：257)(Integrated DNATechnologies)和选择引物转换寡核苷酸SpeI/AlwNI(Clontech，PaloAlto，CA，目录#6373-1)，按照TRANSFORMER定点诱变试剂盒方案(Clontech，Palo Alto，CA)，诱变pTrcWT，产生一种含有编码Taq DN核酸酶的DNA的质粒。编码Taq DN核酸酶的DNA序列在SEQ IDNO：258中给出；Taq DN核酸酶的氨基酸序列在SEQ ID NO：259中给出。

2.修饰的TthPol基因：Tth DN

Tth DN构建体通过突变上述TthPol产生。通过如上所述的位点特异性诱变将编码位点787处天冬氨酸的序列改变为编码天冬酰胺的序列。用下列寡核苷酸诱变pTrcTth-2：5′-CAGGAGGAGCTCGTTGTGGACCTGGA-3′(SEQ ID NO：260)，产生质粒pTrcTthDN。突变蛋白质和蛋白质编码核酸序列分别被称为TthDN SEQ ID NOS：261和262。

3.Taq DN HT和Tth DN HT

向Taq DN和Tth DN的羧基端添加六氨基酸的组氨酸尾(his-尾)。定点诱变使用TRANSFORMER定点诱变试剂盒(Clontech)按照厂商说明进行。用于质粒pTaq DN和pTth DN的诱变寡核苷酸是序列117-067-03，5′-TCTAGAGGATCTATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCCTTGGCGGAGAGC-3′(SEQ ID NO：263)和5′-TGCCTGCAGGTCGACGCTAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGACCCTTGGCGGAAAGCC-3′(SEQ ID NO：264)，序列136-037-05。两个诱变反应都使用选择引物反式Oligo AlwNI/SpeI(Clontech，目录#6488-1)。获得的突变基因被称为Taq DN HT(SEQ ID NO：265，核酸序列；SEQ ID NO：266，氨基酸序列)和Tth DN HT(SEQ ID NO：267，核酸序列；SEQ IDNO：268，氨基酸序列)。

4.Taq DN HT和Tth DN HT的纯化

Taq DN HT和Tth DN HT蛋白质如实施例2B2所述在大肠杆菌JM109株中表达。在硫酸铵沉淀和离心后，将蛋白质沉淀悬浮于0.5mlQ缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，0.1mM EDTA，0.1％Tween 20)中。使用His-Bind树脂和缓冲液试剂盒(Novagen)，按照厂商说明，通过亲和层析进一步纯化蛋白质。将1ml His-结合树脂转移到柱上，用3倍柱体积的无菌水洗涤，加5倍体积的1×加载缓冲液，用3倍体积的1×结合缓冲液平衡。向蛋白质样品中加入4ml 1×结合缓冲液，将样品溶液加到柱上。用3ml 1×结合缓冲液和3ml 1×洗涤缓冲液洗涤后，用1ml 1×洗脱缓冲液洗脱结合的His-尾蛋白质。纯酶然后在50％甘油，20mM TrisHCl，pH8.0，50mM KCl，0.5％Tween 20，0.5％Nonidet P40和100μg/ml BSA中透析。通过测量279nm的吸光度测定酶的浓度。

实施例3

通过转移DNA聚合酶域的N端部分，能够使TaqPol具有TthPol的RNA依赖的5′核酸酶活性

A.含有DNA或RNA靶链的底物结构的制备和纯化

使用标准亚磷酰胺化学法(Glen Research)，用PerSeptiveBiosystems仪器合成下游(SEQ ID NO：162)和上游探针(SEQ IDNO：161)和IL-6DNA(SEQ ID NO：163)(图10)靶链。5’端用生物素标记的合成RNA-DNA嵌合IrT靶标(图20A)利用2′-ACE RNA化学法(Dharmacon Research)合成。按照厂商说明，通过酸催化的水解去除2′-保护基。使用Resource Q柱(Amersham-Pharmacia Biotech)，通过反相HPLC纯化5’端用5′-荧光素(Fl)或5′-四氯荧光素(TET)标记的下游探针。使用Megascript试剂盒(Ambion)，通过人IL-6 cDNA克隆片段(May等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，83：8957[1986]发表的序列的核苷酸64-691)的T7RNA聚合酶失控转录，合成648个核苷酸的IL-6RNA靶标(SEQ ID NO：160)(图10)。最后通过在20％变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，随后切下并洗脱主要的带，纯化所有寡核苷酸。通过测量260nm的吸光度测定寡核苷酸的浓度。生物素标记的IrT靶标与5倍过量的链霉抗生物素蛋白(Promega)在含有10mM MOPS，pH 7.5，0.05％Tween 20，0.05％NP-40和10μg/ml tRNA的缓冲液中温育，室温下10分钟。

B.为了制备嵌合体，限制酶切位点的引入

为方便起见选择下文描述的用于形成嵌合蛋白质的限制酶切位点。下列实施例中的限制酶切位点已经被策略地置于通过晶体结构和其它分析显示为功能域的环绕区中(见图6、7、19)。天然存在的或者通过定点诱变产生的不同位点能够用来制备与来自有关生物的其它A型聚合酶基因类似的构建体。希望所有突变在蛋白质功能方面都是沉默的。通过研究核酸序列和蛋白质氨的基酸序列，人们能够在核酸序列中引入对相应氨基酸序列没有影响的改变。如果需要的核酸改变影响氨基酸，人们能够进行改变，使得新的氨基酸具有与所替换的氨基酸相同或相似的特征。如果这些选择都不可能，人们能够检测突变酶的功能，来确定核酸改变是否导致蛋白质活性、特异性或功能改变。本发明不受为了产生本发明的改进酶而选择的或引入的特定限制酶切位点所限制。

C.Tth DN RX HT和Taq DN RX HT的产生

进行诱变，向Taq DN HT和Tth DN HT酶的聚合酶域引入另外3个独特的限制酶切位点。使用来自Clonetech的Transformer定点诱变试剂盒，按照使用说明进行位点特异性诱变。上述所有诱变反应都使用两种不同的选择引物之一，反式Oligo AlwNI/SpeI或切换OligoSpeI/AlwNI(Clontech，Palo Alto CA目录#6488-1或目录#6373-1)。给定反应中使用的选择oligo取决于载体中存在的选择限制酶切位点。所有诱变引物都用标准合成化学法合成。获得的菌落在大肠杆菌JM109株中表达。

使用下列诱变引物产生Not I位点(氨基酸位点328)：5′-gccgccaggggcggccgcgtccaccgggcc(SEQ ID NO：269)和5′-gcctgcaggggcggccgcgtgcaccggggca(SEQ ID NO：270)，分别对应于Taq DN HT和Tth DN HT基因的有义链。使用有义链诱变引物5′-ctcctggacccttcgaacaccacccc(SEQ ID NO：271)和5′-gtcctggcccatatggaggccac(SEQ ID NO：272)向两个基因内引入BstI(氨基酸位点382)和NdeI(氨基酸位点443)位点。使用Qiagen QiaPrepSpin Mini Prep试剂盒(目录号27106)过量表达并纯化突变质粒。通过DNA测序和限制酶切作图检测载体是否存在限制酶切位点。这些构建体被称为Tth DN RX HT(DNA序列SEQ ID NO：273；氨基酸序列SEQ ID NO：274)和Taq DN RX HT(DNA序列SEQ ID NO：275；氨基酸序列SEQ ID NO：276)。

D.嵌合体

图19所示的嵌合构建体通过交换由下列位点限定的同源DNA片段产生：两种基因共同的限制性内切核酸酶位点EcoRI(E)和BamHI(B)，克隆载体位点SalI(S)，和通过定点诱变在两种基因的同源位点处产生的新位点NotI(N)、BstBI(Bs)、NdeI(D)。在产生这些嵌合酶时，两种不同的DNA片段连接在一起，产生最终的构建体。含有质粒载体以及Taq或Tth(或两者的部分)序列部分的较大DNA片段被称为“载体”。含有Taq或Tth(或两者的部分)聚合酶的序列的较小DNA片段被称为“插入片段”。

所有限制性内切酶都获自New England Biolabs或Promega，按照使用说明在使用附带缓冲液的反应中使用。在特定酶的最佳温度下，在20μl体积中进行反应，每个反应使用约500ng DNA。如果这些酶在反应缓冲液条件和反应温度方面相容，则在一个反应中使用一种以上的酶(双消化)。如果所述的酶在缓冲液条件方面不相容，则首先使用需要最低盐条件的酶。在反应完成后，再将缓冲液条件改变为适于第二种酶的最佳或更好的条件，进行第二个反应。这是基础分子生物学领域公知的常用限制性内切酶消化策略(Maniatis，同上)。

为了最佳连接效率，凝胶分离消化的限制酶切片段。向20μl反应体系中加入2μl 10×加样染料(50％甘油，1×TAE，0.5％溴酚蓝)。加样整个体积，在每100ml琼脂糖凝胶溶液含有1μl 1％溴化乙锭溶液的1％1×TAE琼脂糖凝胶上电泳。消化的片段在紫外线下显示，从凝胶上切下适当的片段(根据大小决定)。然后用Qiagen凝胶提取试剂盒(cat#28706)按照使用说明纯化这些片段。

在10μl体积中进行连接，每个反应使用400单位来自NewEngland Biolabs的T4 DNA连接酶(目录#202L)的，使用附带的反应缓冲液。连接反应在室温下进行1小时，使用各1μl Qiagen-纯化的片段(约20-50ng每种DNA，取决于凝胶分离的回收率)。然后用连接产物转化大肠杆菌JM109株，平板接种于适当的生长和选择培养基上，如含有100μg/ml氨苄青霉素的LB，用来筛选转化子。

对于每个连接反应，为了检测是否存在希望的构建体，检测6个转化子。使用QiaPrep Spin Mini Prep试剂盒按照使用说明纯化并分离质粒DNA。构建体通过DNA测序和限制酶切作图证实。

嵌合酶的表达和纯化如下进行。用质粒转化大肠杆菌JM109株(Promega)。JM109的对数期培养物(200ml)用0.5mM IPTG(Promega)诱导，在收获前再培养16小时。含有可溶性蛋白质的粗提取物如下制备：在室温温育15分钟的过程中，在5ml 10mM Tris-HCl，pH 8.3，1mM EDTA，0.5mg/ml溶菌酶中裂解沉淀的细胞。裂解物与5ml 10mMTris-HCl pH 7.8，50mM KCl，1mM EDTA，0.5％Tween 20，0.5％Nonidet P-40混合，在72℃下加热30分钟，以12,000×g离心5分钟除去细胞碎片。使用Econo-Pac肝素柱(Bio-Rad)和Dionex DX 500HPLC设备，通过亲和层析进行最后的蛋白质纯化。简言之，柱体用50mM Tris-HCl pH 8，1mM EDTA平衡，对相同缓冲液透析的酶提取物上柱，用NaCl在相同缓冲液中的线性梯度(0-2M)洗脱。透析HPLC纯化的蛋白质，贮存于50％(vol/vol)甘油，20mM Tris-HCl pH 8.0，50mM KCl，0.5％Tween 20，0.5％Nonidet P-40和100μg/m BSA中。这些酶纯化为根据SDS-PAGE同质，通过测量279nm的吸光度测定酶的浓度。

1.TaqTth(N)和TthTaq(N)的构建

进行的第一次交换涉及两种酶的聚合酶域。核酸酶域(蛋白质的N端)与聚合酶域(蛋白质的C端)的分离通过用限制性内切核酸酶EcoRI和NotI酶切这两种基因实现。将来自Tth DN RX HT基因的大约900个碱基对的片段克隆到Taq DN RX HT基因的同源位点内，将来自Taq DN RX HT基因的大约900个碱基对的片段克隆到Tth DN RXHT基因的同源位点内，产生两种嵌合体，TaqTth(N)(DNA序列SEQID NO：69；氨基酸序列SEQ ID NO：2)，其含有Taq DN RX HT 5′核酸酶域和Tth DN RX HT聚合酶域，以及TthTaq(N)(DNA序列SEQID NO：70；氨基酸序列SEQ ID NO：3)，它由Tth DN RX HT 5′核酸酶域和Taq DN RX HT聚合酶域组成。

2.TaqTth(N-B)的构建

Taq DN RX HT构建体用酶NdeI和BamHI酶切，较大的载体片段如上所述凝胶纯化。Tth DN RX HT构建体也用NdeI和BamHI酶切，凝胶分离并纯化较小的(约795个碱基对)Tth片段。如上所述将TthNdeI-BamHI插入片段连接到TaqNdeI-BamHI载体内，产生TaqTth(N-B)(DNA序列SEQ ID NO：71；氨基酸序列SEQ ID NO：4)。

3.TaqTth(B-S)的构建

Taq DN RX HT构建体用酶BamHI和SalI酶切，如上所述凝胶分离较大的载体片段。Tth DN RX HT构建体也用BamHI和SalI酶切，凝胶分离并纯化较小的(约741个碱基对)Tth片段。如上所述将Tth BamHI-SaII插入片段连接到Taq BamHI-SaII载体内，产生TaqTth(B-S)(DNA序列SEQ ID NO：72；氨基酸序列SEQ ID NO：5)。

4.TaqTth(N-D)的构建

Taq DN RX HT构建体用酶NotI和NdeI酶切，如上所述凝胶分离较大的载体片段。Tth DN RX HT构建体也用NotI和NdeI酶切，凝胶分离并纯化较小的(约345个碱基对)Tth片段。如上所述将TthNotI-NdeI插入片段连接到Taq NotI-NdeI载体内，产生TaqTth(N-D)(DNA序列SEQ ID NO：73；氨基酸序列SEQ ID NO：6)。

5.TaqTth(D-B)的构建

Taq DN RX HT构建体用酶NdeI和BamHI酶切，如上所述凝胶分离较大的载体片段。Tth DN RX HT构建体也用NdeI和BamHI酶切，凝胶分离并纯化较小的(约450个碱基对)Tth片段。如上所述将Tth NdeI-BamHI插入片段连接到Taq NdeI-BamHI载体内，产生TaqTth(D-B)(DNA序列SEQ ID NO：74；氨基酸序列SEQ ID NO：7)。

6.TaqTth(Bs-B)的构建

Taq DN RX HT构建体用酶BstBI和BamHI酶切，如上所述凝胶分离较大的载体片段。Tth DN RX HT构建体也用BstBI和BamHI酶切，凝胶分离并纯化较小的(约633个碱基对)Tth片段。如上所述将Tth NdeI-BamHI插入片段连接到Taq NdeI-BamHI载体内，产生TaqTth(Bs-B)(DNA序列SEQ ID NO：75；氨基酸序列SEQ ID NO：8)。

7.TaqTth(N-Bs)的构建

Taq DN RX HT构建体用酶NotI和BstBI酶切，如上所述凝胶分离较大的载体片段。Tth DN RX HT构建体也用NotI和BstBI酶切，凝胶分离并纯化较小的(约162个碱基对)Tth片段。如上所述将TthNotI-BstBI插入片段连接到Taq NotI-BstBI载体内，产生TaqTth(N-Bs)(DNA序列SEQ ID NO：76；氨基酸序列SEQ ID NO：9)。

8.TthTaq(B-S)的构建

Tth DN RX HT构建体用酶BamHI和SalI酶切，如上所述凝胶分离较大的载体片段。Tth DN RX HT构建体也用BamHI和SalI酶切，凝胶分离并纯化较小的(约741个碱基对)Tth片段。如上所述将Taq BamHI-SaII插入片段连接到Tth BamHI-SaII载体内，产生TthTaq(B-S)(DNA序列SEQ ID NO：77；氨基酸序列SEQ ID NO：10)。

9.TthTaq(N-B)的构建

Tth DN RX HT构建体用酶NotI和BamHI酶切，如上所述凝胶分离较大的载体片段。Taq DN RX HT构建体也用NotI和BamHI酶切，凝胶分离并纯化较小的(约795个碱基对)Tth片段。如上所述将Taq NotI-BamHI插入片段连接到Tth NotI-BamHI载体内，产生TthTaq(N-B)(DNA序列SEQ ID NO：78；氨基酸序列SEQ IDNO：11)。

这些嵌合蛋白质的切割活性如实施例1部分A所述表征，对RNA靶标的切割循环率的比较在图12中显示。如发明描述进一步描述的，这些数据表明在TthPol蛋白中心三分之一中发现的组件对于使含有TaqPol部分的嵌合蛋白质具有TthPol样RNA依赖的切割活性非常重要。

实施例4

影响RNA依赖的5′核酸酶活性的改变不一定影响RNA依赖的DNA聚合酶活性

已知TthPol含有比TaqPol活性更高的RNA模板依赖的DNA聚合酶(Myers和Gelfand，Biochemistry 30：7661[1991])。为了确定栖热菌DNA PolI酶的RNA模板依赖的5′核酸酶活性是否与它们的RNA依赖的聚合酶活性有关，回复分别用来产生TaqPol和TthPol的聚合酶缺陷形式的D785N和D787N突变。类似地将聚合酶活性恢复为TaqTth(N)(DNA序列SEQ ID NO：79；氨基酸序列SEQ ID NO：12)、TaqTth(N-B)(DNA序列SEQ ID NO：80；氨基酸序列SEQ ID NO：13)、Taq Tth(B-S)(DNA序列SEQ ID NO：81；氨基酸序列SEQ ID NO：14)嵌合体和TaqPol(W417L/G418K/E507Q)(DNA序列SEQ ID NO：82；氨基酸序列SEQ ID NO：15)突变蛋白质。

通过向选择的嵌合或突变酶内插入天然非DN序列的BamHI-SalI片段，所有上述酶突变体恢复了聚合酶功能。例如，突变构建体TaqTth(N-B)用限制性内切酶BamHI(接近氨基酸位点593)和限制性内切酶SalI(接近氨基酸位点840)酶切。较大的载体片段如实施例3D所述凝胶纯化。天然TaqPol构建体也用限制性内切核酸酶BamHI和SalI酶切，含有天然氨基酸序列的较小插入片段也凝胶纯化。然后如实验实施例3D所述将插入片段连接到载体内。

通过在poly(dA)或poly(A)模板存在下，用荧光素标记的dUTP延伸dT_25-35-寡核苷酸引物，评价这些蛋白质的聚合酶活性。引物延伸反应在10μl含有10mM MOPS，pH7.5，5mM MgSO₄，100mM KCl的缓冲液中进行。在10μM poly(A)₂₈₆或1μM poly(dA)₂₇₃模板、45μMdTTP和5μM Fl-dUTP存在下，用40ng酶延伸10μM(dT)_25-30引物，60℃30min。用10μl终止溶液(95％甲酰胺，10mM EDTA，0.02％甲基紫染料)终止反应。样品(3μl)在15％变性丙烯酰胺凝胶上分级分离，如上所述，用装备了滤光片的FMBIO-100荧光凝胶扫描仪(Hitachi)定量掺入的Fl-dUTP的分数。

如图16所示，该实验中使用的所有构建体的DNA依赖的聚合酶活性非常相似，而TthPol、TaqTth(N)和TaqTth(B-S)的RNA依赖的聚合酶活性比TaqPol、TaqTth(N-B)和TaqPol W417L/G418K/E507Q突变体的活性至少高6倍。根据这些结果的分析，能够推断出TthPol的高RNA依赖的DNA聚合酶活性取决于聚合酶域的C端一半(大约是氨基酸593-830)，RNA依赖的5′核酸酶和聚合酶活性彼此无关，受不同区域控制。

实施例5

由嵌合研究获得的信息开发的Taq DN RX HT中的特异点突变

嵌合研究(实施例3，见上)提示，TthPol序列中决定高RNA依赖的5′核酸酶活性的部分含有大约位于氨基酸382与593之间的BstBI-BamHI区。Tth DN RX HT与Taq DN RX HT(分别为SEQ IDNOS：165和164)的BstBI与BamHI区之间氨基酸序列的比较显示只有25个不同(图13)。其中，12个氨基酸改变保守，而13个差异导致电荷改变。由于嵌合酶的分析提示关键突变位于Tth DN RX HT的BstBI-NdeI和NdeI-BamHI区内，所以利用位点特异性诱变分别向TaqTth(D-B)和TaqTth(N-D)的BstBI-NdeI和NdeI-BamHI区内内引入Tth DN RX HT特异的氨基酸。

通过单氨基酸或双氨基酸诱变，在TaqTth(D-B)的BstBI-NdeI区内产生6个Tth DN RX HT特异的置换。类似地，在TaqTth(N-D)的NdeI-BamHI区的同源位点处引入12个Tth DN RX HT特异的氨基酸改变。

使用QIAGEN Plasmid Maxi试剂盒(QIAGEN，Chatsworth，CA)，按照厂商方案从200ml JM 109过夜培养物中纯化质粒DNA，获得足够用于所有诱变反应的原料。所有位点特异性突变都用Transformer定点诱变试剂盒(Clontech)按照厂商方案引入；关于每个位点使用的诱变引物的具体序列信息在下文中提供。所述的所有诱变反应使用两种不同的选择引物中的一种，反式Oligo AlwNI/SpeI或转换OligoSpeI/AlwNI(Clontech，Palo Alto CA目录#6488-1或目录#6373-1)。给定反应中使用的选择oligo取决于载体中存在的限制性酶切位点。所有诱变引物都用标准合成化学法合成。产生的菌落是大肠杆菌JM109株。

1.TaqTth(D-B)E404H(DNA序列SEQ ID NO：83；氨基酸序列SEQ ID NO：16)的构建

使用诱变引物240-60-015′-gag gag gcg ggg cac cgg gcc gcc ctt-3′(SEQ ID NO：277)对pTrc99A TaqTth(D-B)DNA进行位点特异性诱变，引入E404H突变。

2.TaqTth(D-B)F413H/A414R(DNA序列SEQ ID NO：84；氨基酸序列SEQ ID NO：17)的构建

使用诱变引物240-60-025′-ctttcc gag agg ctc cat egg aac ctg tggggg agg-3′(SEQ ID NO：278)对pTrc99A TaqTth(D-B)DNA进行位点特异性诱变，引入F413H和A414R突变。

3.TaqTth(D-B)W417L/G418K(DNA序列SEQ ID NO：85；氨基酸序列SEQ ID NO：18)的构建

使用诱变引物240-60-035′-ctc ttc gcc aac ctg ctt aag agg ctt gagggg gag-3′(SEQ ID NO：279)对pTrc99A TaqTth(D-B)DNA进行位点特异性诱变，引入W417L和G418K突变。

4.TaqTth(D-B)A439R(DNA序列SEQ ID NO：86；氨基酸序列SEQ ID NO：19)的构建

使用诱变引物240-60-045′-agg ccc ctt tec cgg gtc ctg gcc cat-3′(SEQ ID NO：280)对pTrc99A TaqTth(ND-B)DNA进行位点特异性诱变，引入A439R突变。

5.TaqTth(N-D)L451R(DNA序列SEQ ID NO：87；氨基酸序列SEQ ID NO：20)的构建

使用诱变引物240-60-055′-acg ggg gtg cgc cgg gac gtg gcc tat-3′(SEQ ID NO：281)对pTrc99A TaqTth(N-D)DNA进行位点特异性诱变，引入L415突变。

6.TaqTth(N-D)R457Q(DNA序列SEQ ID NO：88；氨基酸序列SEQ ID NO：21)的构建

使用诱变引物240-60-065′-gtg gcc tat ctc cag gcc ttg tcc ctg-3′(SEQ ID NO：282)对pTrc99A TaqTth(N-D)DNA进行位点特异性诱变，引入L415Q突变。

7.TaqTth(N-D)V463L(DNA序列SEQ ID NO：89；氨基酸序列SEQ ID NO：22)的构建

使用诱变引物240-60-075′-ttg tcc ctg gag ctt gcc gag gag atc-3′(SEQ ID NO：283)对pTrc99A TaqTth(N-D)DNA进行位点特异性诱变，引入V463L突变。

8.TaqTth(N-D)A468R(DNA序列SEQ ID NO：90；氨基酸序列SEQ ID NO：23)的构建

使用诱变引物240-60-085′-gcc gag gag atc cgc cgc ctc gag gcc-3′(SEQ ID NO：284)对pTrc99A TaqTth(N-D)DNA进行位点特异性诱变，引入A468R突变。

9.TaqTth(N-D)A472E(DNA序列SEQ ID NO：91；氨基酸序列SEQ ID NO：24)的构建

使用诱变引物240-60-095′-gcc cgc etc gag gag gag gtc ttc cgc-3′(SEQ ID NO：285)对pTrc99A TaqTth(N-D)DNA进行位点特异性诱变，引入A472E突变。

10.TaqTth(N-D)G499R(DNA序列SEQ ID NO：92；氨基酸序列SEQ ID NO：25)的构建

使用诱变引物240-60-105′-ttt gac gag cta agg ctt ccc gcc atc-3′(SEQ ID NO：286)对pTrc99A TaqTth(N-D)DNA进行位点特异性诱变，引入G499R突变。

11.TaqTth(N-D)E507Q(DNA序列SEQ ID NO：93；氨基酸序列SEQ ID NO：26)的构建

使用诱变引物276-046-045′-atc gcc aag acg caa aag acc ggcaag-3′(SEQ ID NO：287)对pTrc99A TaqTth(N-D)DNA进行位点特异性诱变，引入E507Q突变。

12.TaqTth(N-D)Y535H(DNA序列SEQ ID NO：94；氨基酸序列SEQ ID NO：27)的构建

使用诱变引物240-60-115′-aag atc ctg cag cac egg gag ctc acc-3′(SEQ ID NO：288)对pTrc99A TaqTth(N-D)DNA进行位点特异性诱变，引入Y535H突变。

13.TaqTth(N-D)S543N(DNA序列SEQ ID NO：95；氨基酸序列SEQ ID NO：28)的构建

使用诱变引物240-60-125′-acc aag ctg aag aac acc tac att gac-3′(SEQ ID NO：289)对pTrc99A TaqTth(N-D)DNA进行位点特异性诱变，引入S543N突变。

14.TaqTth(N-D)I546V(DNA序列SEQ ID NO：96；氨基酸序列SEQ ID NO：29)的构建

使用诱变引物240-60-135′-aag agc acc tac gtg gac ccc ttg ccg-3′(SEQ ID NO：290)对pTrc99A TaqTth(N-D)DNA进行位点特异性诱变，引入I546V突变。

15.TaqTth(N-D)D551S/I553V(DNA序列SEQ ID NO：97；氨基酸序列SEQ ID NO：30)的构建

使用诱变引物240-60-145′-att gac ccc ttg ccg agc ctc gtc cac cccagg acg ggc-3′(SEQ ID NO：291)对pTrc99A TaqTth(N-D)DNA进行位点特异性诱变，引入D551S和I553V突变。

16.TaqDN RX HT W417L/G418K/E507Q(DNA序列SEQ IDNO：98；氨基酸序列SEQ ID NO：31)的构建

TaqDN RX HTW417L/G418K/E507Q三突变体通过TaqTth(D-B)W417L/G418K与TaqTth(N-D)E507Q组合制成。TaqTth(D-B)W417L/G418K用限制性内切酶NdeI和BamHI酶切，较大的载体片段如实施例3所述分离。TaqTth(N-D)E507Q构建体也用NdeI和BamHI酶切，较小的(约795个碱基对)片段如实施例3所述凝胶分离并纯化。如实施例3所述将NdeI-BamHI插入片段连接到凝胶纯化的载体内。

17.TaqDN RXHT W417L/E507Q(DNA序列SEQID NO：99；氨基酸序列SEQ ID NO：32)的构建

以上述TaqDN RX HTW417L/G418K/E507Q开始，在位点特异性诱变反应中使用诱变引物337-01-02：5′-TTC GCC AAC CTG CTTGGG AGG CTT GAG GGG GAG-3′(SEQ ID NO：292)将氨基酸位点418处的K变回野生型氨基酸G。用Transformer定点诱变试剂盒(Clonetech)按照厂商说明书并如实验实施例4所述进行位点特异性诱变。

18.TaqDN RX HT G418K/E507Q(DNA序列SEQ ID NO：100；氨基酸序列SEQ ID NO：33)的构建

以上述TaqDN RX HTW417L/G418K/E507Q开始，在位点特异性诱变反应中使用诱变引物337-01-01：5′-CTC TTC GCC AAC CTGTGG AAG AGG CTT GAG GGG-3′(SEQ ID NO：293)将氨基酸位点417处的L变回野生型氨基酸W。用Transformer定点诱变试剂盒(Clonetech)按照厂商说明书并如实验实施例4所述进行位点特异性诱变。

突变蛋白质的表达和纯化如实施例3所述进行，这些蛋白质的切割活性如实施例1部分A所述表征。图14显示选择的这些突变蛋白质对RNA靶标的切割循环率的比较。如发明描述进一步讨论的，这些数据表明417/418区中的氨基酸和氨基酸507在使含有TaqPol部分和TthPol部分(即Tth的D-B和N-D部分)的嵌合蛋白质具有TthPol-样RNA依赖的切割活性方面至关重要，单独的这些部分不能提供提高的RNA依赖的活性。如发明描述所述，产生只含有W417L、G418K和E507Q置换的Taq DN RX HT变体。如实施例1所述，通过比较它们与Tth DN RX HT对IL-6 RNA底物的切割速度，确定这些突变足以使Taq DN RX HT活性提高到Tth DN RX HT的水平。图15显示Taq DN RX HTW417L/G418K/E507Q和Taq DN RX HTG418K/E507Q突变体的活性比Tth DN RX HT高1.4倍，比Taq DNRX HT高4倍以上，而Taq DN RX HT W417L/E507Q突变体具有与该酶相同的活性，比Taq DN RX HT大约高3倍。这些结果证实，TthPol的K418和Q507在提供比TaqPol提高的RNA依赖的5′核酸酶活性方面是特别重要的氨基酸。

实施例6

Taq DN RX HTG418K/E507Q 5′核酸酶的RNA依赖的5′核酸酶性质在最佳盐和温度方面类似于Tth DN RX HT

为了确定除了对RNA靶标的切割速度提高外，G418K/E507Q突变是否导致Taq DN RX HT突变体性质的任何显著改变，在RNA模板依赖的5′核酸酶测定中，在温度和盐及二价离子的浓度变化的条件下，比较Taq DN RX HT G418K/E507Q(SEQ ID NO：33)、Taq DN RXHT(SEQ ID NO276)和Tth DN RX HT(SEQ ID NO：274)酶。将该研究中使用的上游DNA和底物的模板RNA链连接到如图20A所示的单IrT分子(SEQ ID NO：166)内，标记的下游探针(SEQ ID NO：167)过量存在。靶RNA链的5′端用生物素-链霉抗生物素蛋白复合物封闭，以防止反应过程中任何非特异性的酶降解(Lyamichev等人，Science260：778[1993]，Johnson等人，Science2，69：238[1995])。在图20B中，Taq DN RX HT G418K/E507Q、Taq DN RX HT和Tth DN RX HT的切割速度对温度作图。闭环代表酶Taq DN RX HT，开环代表酶TthDN RX HT，Xs代表酶Taq DN RX HTG418K/E507Q。当在如实施例1所述的切割试验中检测时，Tth与Taq DN RX HT酶对IrT底物的活性的差异甚至高于使用IL-6 RNA底物时发现的差异。G418K/E507Q突变使Taq酶的活性提高10倍以上，与Tth酶相比提高25％。所有这三种酶都显示侵入信号扩增反应的典型温度谱，具有相同的最佳温度。在相同条件下使用类似于IrT(SEQ ID NO：168)的全DNA底物，没有发现G418K/E507Q突变对Taq DN RX HT的DNA依赖的5′核酸酶活性的显著影响。

使用IrT底物，KCl和MgSO₄浓度对Taq DN RXHTG418K/E507Q、Taq DN RX HT和Tth DN RX HT的5′核酸酶活性的影响在图20C和D中显示。所有酶的活性都具有相似的盐依赖性，Taq DN RX HTG418K/E507Q和Tth DN RX HT的最佳KCl浓度为100mM，Taq DN RX HT为50mM。所有酶的最佳MgSO₄浓度均约为8mM。图20所示数据的分析提示，Taq DN RX HT G418K/E507Q的性质更接近于Tth DN RX HT而不是Taq DN RX HT，这证实了G418K/E507Q突变在含有RNA靶标的底物识别方面的关键作用。

为了理解在RNA存在下比在DNA靶标存在下5′核酸酶活性降低的机制，使用过量的IrT底物(SEQ ID NO：166)和下游探针(SEQ IDNO：167)和有限的酶浓度，测定所有三种酶的米氏常数(K_m)和最大催化速度(k_cat)。对于这些测定，建立10μl反应体系，其中含有10mMMOPS，pH 7.5，0.05％Tween 20，0.05％Nonidet P-40，10μg/ml tRNA，4mM MCl₂，1 nM酶(Taq DN RX HT、Tth DN RX HT或Taq DN RXHT G418K/E507Q)和IrT靶标与下游探针的不同浓度(0.125、0.25、0.5或1μM)的等摩尔混合物。在46℃下测定每种酶的切割动力学和每种底物的浓度。加入10μl含有10mM EDTA和0.02％甲基紫(Sigma)的95％甲酰胺终止反应。各1μl终止的反应消化物在45mM Tris-硼酸缓冲液，pH 8.3，1.4mM EDTA中，在含7M尿素的20％变性丙烯酰胺凝胶(19∶1交联)上分级分离。用使用585nm滤光片的FMBIO-100荧光凝胶扫描仪(Hitachi)扫描凝胶。切割产物的分数(使用FMBIO分析软件，版本6.0，Hitachi，根据对应于未切割的和切割的底物的带的强度测定)对反应时间作图。最初的切割速度取决于切割动力学线性部分的斜率，定义为切割产物的浓度除以酶浓度和反应时间(分钟)。根据最初的切割速度对底物浓度所作的图确定每种酶对于IrT底物的米氏常数K_m和最大催化速度k_cat。

已经发现，所有三种酶都具有相似的K_m值(约200-300nM)，TaqDN RX HT和Tth DN RX HT的k_cat值约为4min^-1，Taq DN RX HTG418K/E507Q为9min^-1。G418K/E507Q突变使Taq DN RX HT的k_cat提高2倍以上，但是对K_m几乎没有影响，提示突变使底物为更适于切割的方向，而不是只提高结合常数。

实施例7

分子模建进一步提高RNA-依赖的5′核酸酶活性的用途

A.点突变体

为了开发功能改变的酶，通过位点特异性诱变在预先确定的位置中引入或者通过随机诱变引入序列改变。根据嵌合研究的证据、发表的有关文献和分子模建选择位点特异性诱变的位置。另外7种突变酶来源于Tth DN RX HT酶，其它20种突变酶来源于Taq DN RX HT酶，这两种酶均在以上讨论。某些突变酶是多个诱变反应的结果，即引入一个以上的改变，获得终产物。除非另外说明，使用实施例2C2所述的Tth DN RX HT构建体(SEQ ID NO：273)或实施例2C1所述的Taq DN RX HT构建体(SEQ ID NO：275)进行突变反应。使用QIAGENPlasmid Maxi试剂盒(QIAGEN，Chatsworth，CA)，按照厂商方案从200ml JM 109过夜培养物中纯化质粒DNA，获得足够用于所有诱变反应的原料。所有位点特异性突变都用Transformer定点诱变试剂盒(Clontech)按照厂商方案引入。所述的所有诱变反应使用两种不同的选择引物中的一种，反式Oligo AlwNI/SpeI或转换Oligo SpeI/AlwNI(Clontech，Palo Alto CA目录#6488-1或目录#6373-1)。给定反应中使用的选择oligo取决于载体中存在的限制性酶切位点。所有诱变引物都用标准合成化学法合成。两种类型的反应获得的克隆在大肠杆菌JM109株中表达。随机诱变方法如下所述。

突变体通过实施例1所述的快速筛选方案检测。然后，如果希望进行更详细的分析，或者如果需要较大量的蛋白质制备，则如实施例3所述进行突变蛋白质的表达和纯化。

1.Tth DN RX HT H641A、Tth DN RX HT H748A、Tth DN RXHT H786A的构建

对pTrc99A Tth DN RX HT DNA进行位点特异性诱变，其中使用诱变引物583-001-02：5′-gct tgc ggt ctg ggt ggc gat gtc ctt ccc ctc-3′(SEQ ID NO：294)引入H641A突变(DNA序列SEQ ID NO：101；氨基酸序列SEQ ID NO：34)，或者使用诱变引物583-001-03：5′cat gtt gaaggc cat ggc ctc cgc ggc ctccct-3′(SEQ ID NO：295)产生H748A突变体(DNA序列SEQ ID NO：102；氨基酸序列SEQ ID NO：35)，或者使用诱变引物583-001-04：5′-cag gag gag ctc gtt ggc gac ctg gag gag-3′(SEQ ID NO：296)产生H786A突变酶(DNA序列SEQ ID NO：103；氨基酸序列SEQ ID NO：36)。

2.Tth DN RX HT(H786A/G506K/Q509K)的构建

以如上产生的突变体Tth DN RX HT H786A开始，使用诱变引物604-022-02：5′-gga gcg ctt gcc tgt ctt ctt cgt ctt ctt caa ggc ggg aggcct-3′(SEQ ID NO：297)进行位点特异性诱变，产生被称为“TthAKK”的变体(DNA序列SEQ ID NO：104；氨基酸序列SEQ ID NO：37)。

3.Taq DN RX HT(W417L/G418K/E507Q/H784A)的构建

在位点特异性诱变反应中使用诱变寡核苷酸158-029-02：5′-gaggac cag ctc gtt ggc gac ctg aag gag cat-3′(SEQ ID NO：298)引入H784A突变，产生被称为“Taq4M”的构建体(DNA序列SEQ ID NO：105；氨基酸序列SEQ ID NO：38)。

4.Taq4M H639A、Taq4M R587A、Taq4M G504K和Taq4MG80E的构建

对Taq4M突变体进行位点特异性诱变，使用引物473-010-11：5′-gaggggcgggacatcgccacggagaccgccagc-3′(SEQ ID NO：299)产生Taq4M H639A突变体(DNA序列SEQ ID NO：106；氨基酸序列SEQ IDNO：39)，使用引物473-010-10：5′-cag aac atc ccc gtc gcc acc ccg ctt gggcag-3′(SEQ ID NO：300)产生Taq 4M R587A(DNA序列SEQ IDNO：107；氨基酸序列SEQ ID NO：40)，使用引物300-081-06：5′-ggg cttccc gcc atc aag aag acg gag aag acc-3′(SEQ ID NO：301)产生Taq 4MG504K(DNA序列SEQ ID NO：108；氨基酸序列SEQ ID NO：41)，使用引物330-088-04：5′-cta ggg ctt ccc gcc atc aag aag acg caa aag accggc-3′(SEQ ID NO：302)产生Taq 4M G80E突变体(DNA序列SEQ IDNO：109；氨基酸序列SEQ ID NO：42)。

5.Taq 4M P88E/P90E和Taq 4M L109F/A110T的构建

以上述Taq 4M开始，进行位点特异性诱变，使用引物473-087-03：5′-ccg ggg aaa gtc ctc ctc cgt ctc ggc ccg gcc cgc ctt-3′(SEQ IDNO：303)产生P88E/P90E突变(DNA序列SEQ ID NO：110；氨基酸序列SEQ ID NO：43)，或者使用引物473-087-05：5′-cgg gac ctc gag gcgcgt gaa ccc cag gag gtccac-3′(SEQ ID NO：304)产生L109F/A110T突变(DNA序列SEQ ID NO：111；氨基酸序列SEQ ID NO：44)。

6 . Taq DN RX HT(W417L/G418K/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/H784A)的构建

进行两个PCR反应，第一个使用构建体Taq4M(TaqW417L/G418K/G504K/E507Q/H784A)作为模板。使用引物158-84-015′-CTCCTCCACGAGTTCGGC-3′(SEQ ID NO：305)和535-33-025′-ACC GGT CTT CTT CGT CTT CTT CAA CTT GGG AAG CCTGAG CTC GTC AAA-3′(SEQ ID NO：306)，产生620个碱基对的PCR片段。另一种510个碱基对的PCR产物利用下列引物产生：535-33-015′-AAG ACG AAG AAG ACC GGT AAG CGC TCC ACC AGC-3′(SEQ ID NO：307)和330-06-035′-GTC GAC TCT AGA TCA GTGGTG GTG GTG GTG GTG CTT GGC CGC CCG GCG CAT C-3′(SEQ ID NO：308)。两种PCR产物重叠，因此使用外部引物158-84-01和330-06-03进行最终的重组PCR扩增，产生1182个碱基对的产物。重组PCR产物用限制性内切酶NotI和BamHI按照厂商说明书消化，产生793个碱基对的片段。亲本质粒Taq4M也用相同的酶消化，用作连接载体。所有DNA片段都在连接前都进行TAE琼脂凝胶纯化。将该片段连接到载体内，转化JM109细胞，从而引入突变G499R、A502K、I503L和E507K以及限制性内切核酸酶位点AgeI。该构建体被命名为“Taq8M”(DNA序列SEQ ID NO：112；氨基酸序列SEQ IDNO：45)。

B.随机诱变

多种功能改变的酶通过随机诱变产生。根据分子模建数据和文献信息选择用于随机诱变的蛋白质区。使用不同诱变引物向蛋白质的不同区域内引入突变。除非另外说明，对上述Taq变体Taq4M G504K(Taq DN RX HTW417L/G418K/G504K/E507Q/H784A/)(SEQ IDNO：108)进行随机诱变，用诱变反应中产生的突变PCR片段交换Taq8M(SEQ ID NO：112)中的同源区。

也对上述Tth DN RX HT H786A(SEQ ID NO：103)进行随机诱变。用Tth DN RX HT H786A模板产生的突变PCR片段交换未改变的Tth DNRX HT H786A中的同源区。

1.氨基酸残基500-507或513-520中的随机突变

第一种诱变寡核苷酸535-054-01：5′-gga gcg ctt acc ggt ctt(ttg cgtctt ctt gat ctt ggg aag)cct tag ctc gtc aaa gag-3′(SEQ ID NO：309)与158-84-01：5′-CTC CTC CAC GAG TTC GGC-3′(SEQ ID NO：310)一起用来安装Taq聚合酶变体Taq DN RX HTW417L/G418K/G504K/E507Q/H784A(SEQ ID NO：108)的氨基酸位点500-507的随机残基。实现方法是合成引物535-054-01，使得括号内的碱基只有91％不改变，而其余9％的碱基是其它3种核苷酸的等量混合物。这种oligo的最初的未改变的序列包括G499R、A502K和Q507K改变。

为了在500-507区内产生突变，使用Advantage cDNA PCR试剂盒(Clonetech)，以上述Taq变体作为靶标，使用引物535-054-01和引物158-84-01进行PCR反应。该PCR片段然后在1％TAE琼脂糖凝胶上电泳，切下，用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia CA，目录#28706)纯化。纯化的片段用NotI和AgeI酶切，连接到用NotI和AgeI线性化的pTaq8M内。用这种连接产物转化JM109大肠杆菌细胞(Promega)。克隆如下所述检测。

第二种诱变寡核苷酸(在不同的反应中使用)535-054-02：5′-caaaag acc ggt aag cgc(tec acc age gcc gcc gtc ctg gag)gcc etc cgc gag gcccac-3′(SEQ ID NO：311)与330-06-03：5′-GTC GAC TCT AGA TCAGTG GTG GTG GTG GTG GTG CTT GGC CGC CCG GCG CATC-3′(SEQ ID NO：312)一起用来安装氨基酸513-520的随机残基。引物535-054-02的括号内的碱基也是91％为野生型，3％为其它3种核苷酸。

为了在513-520区内产生突变，如上所述，以Taq DN RX HTW417L/G418K/G504K/E507Q/H784A(SEQ ID NO：108)为模板，使用引物535-054-02和引物535-054-02进行PCR反应。获得的PCR片段如上所述纯化，用限制性内切酶AgeI和BamHI酶切。然后将酶切片段连接到也用AgeI和BamHI线性化的Taq8M构建体内。用该连接产物转化JM109大肠杆菌细胞。克隆如实施例1所述检测。由它们产生的突变体包括：

Taq DN RX HT

W417L/G418K/G499R/A502K/K504N/E507K/H784A(M1-13)(DNA序列SEQ ID NO：113；氨基酸序列SEQ ID NO：46)。

Taq DN RX HT

W417L/G418K/G499R/L500I/A502K/G504K/Q507H/H784A(Ml-36)(DNA序列SEQ ID NO：114；氨基酸序列SEQ ID NO：47)。

Taq DN RX HT

W417L/G418K/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/T514S/H784A(M2-24)(DNA序列SEQ ID NO：115；氨基酸序列SEQ ID NO：48)。

Taq DN RX HT

W417L/G418K/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/V518L/H784A(M2-06)(DNA序列SEQ ID NO：116；氨基酸序列SEQ ID NO：49)。

2.TthDN RX HT H786A随机诱变

为了在TthDN RX HT H786A(SEQ ID NO：36)酶的螺旋-发夹-螺旋区内产生突变，用H786A(SEQ ID NO：103)突变体作为模板进行两个不同的PCR反应。两种PCR产物重叠，因此能够进行重组PCR反应(Higuchi，《PCR技术》，H.A.Erlich编著，Stockton Press，New York.pp61-70[1989])。然后利用位于该片段末端和TthDNH786A序列内的限制性内切酶位点，以TthDN H786A突变体的同源区交换这种终PCR产物。

以上述TthDN H786A开始，使用引物604-08-06：5′-gtc gga ggggtc ccc cac gag-3′(SEQ ID NO：313)和引物390-76-08：5′-tgt gga att gtgagc gg(SEQ ID NO：314)，产生620个碱基对的PCR片段。使用Advantage cDNA PCR试剂盒(Clontech)按照厂商说明书进行PCR反应。该PCR产物包含氨基酸1-194。通过这种反应不引入突变，然而，5’端存在限制性内切酶位点EcoRI。

以上述TthDN RX HT H786A开始，使用诱变引物604-08-05：5′-ctc gtg ggg gac ccctcc gac aac ctc(ccc ggg gtc aag ggc atc ggg gagaag acc gcc)ctc aag ctt ctc aag-3′(SEQ ID NO：315)和引物209-74-02：5′-gtg gcctcc ata tgg gcc agg ac-3′(SEQ ID NO：316)，产生787个碱基对的PCR片段。PCR反应如上所述进行。由于存在诱变引物604-08-05，该片段含有随机突变。合成该引物括号内的碱基，使得91％的序列是野生型的，而其余9％平均分配其余3种碱基。

两个PCR片段重叠，在重组PCR反应中组合。加入引物390-76-08和209-74-02，再次按照厂商说明书所述使用Advantage cDNA PCR试剂盒(Clontech)。该反应产生1380个碱基对的产物。

按照厂商说明，重组PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，产生986个碱基对的片段。TthDN RX HT H786A通过用相同的酶酶切制备。然后将该片段连接到载体内，转化JM109细胞。这组反应产生的新突变体包括：

TthDN RX HT H786A/P197R/K200R(DNA序列SEQ IDNO：117；氨基酸序列SEQ ID NO：50)。

TthDN RX HT H786A/K205Y(DNA序列SEQ ID NO：118；氨基酸序列SEQ ID NO：51)。

TthDN RX HT H786A/G203R(DNA序列SEQ ID NO：119；氨基酸序列SEQ ID NO：52)。

3.Taq DN RX HT W417L/G418K/H784AL109F/A110T/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/T514S(Taq SS)的构建

以上述Taq DN RX HT W417L/G418K/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/T514S/H784A(SEQ ID NO：115)突变体开始，在位点特异性诱变反应中，使用引物473-087-05：5′-cgg gac ctc gag gcg cgt gaaccc cag gag gtc cac-3′(SEQ ID NO：317)以及适当的选择引物引入L109F和A110T突变，产生被命名为“TaqSS”的酶(DNA序列SEQ IDNO：120；氨基酸序列SEQ ID NO：53)。

4.Taq DN RX HTW417L/G418L/H784AP88E/P90E/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/T514S的构建

以上述Taq DN RX HT W417L/G418K/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/T514S/H784A(SEQ ID NO：115)突变体开始，在位点特异性诱变反应中，利用引物473-087-03：5′-ccg ggg aaa gtc ctc ctc cgtctc ggc ccg gcc cgcctt-3′(SEQ ID NO：318)以及适当的选择引物引入P88E和P90E突变，产生该酶(DNA序列SEQ ID NO：121；氨基酸序列SEQ IDNO：54)。

5.TaqSS随机诱变

利用随机诱变向TaqSS突变体(SEQ ID NO：120)的螺旋-发夹-螺旋域内引入其它改变。诱变如实施例9所述进行。第一步，产生两种不同的但是重叠的PCR产物。用oligos 390-76-08(SEQ ID NO：314)和604-08-04：5′-gtc gga ctc gtc acc ggt cag ggc-3′(SEQ ID NO：319)产生的一种PCR产物向片段内引入EcoRI位点，但是没有引入任何突变。第二种PCR产物使用诱变引物604-08-03：5′-ctg acc ggt gac gagtccgac aac ctt(ccc ggg gtc aag ggc atc ggg gag aag acg gcg)agg aag ctt ctggag-3′(SEQ ID NO：320)和引物209-74-02(SEQ ID NO：316)。该片段含有随机点突变，当通过重组PCR与第一种片段组合时，能够用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，并且连接到也用EcoRI和NotI酶切的TaqSS构建体内。连接的构建体然后转化JM109。如下所述筛选菌落。这种诱变产生的酶包括：

TaqSS K198N(DNA序列SEQ ID NO：112；氨基酸序列SEQ IDNO：55)。

TaqSS A205Q(DNA序列SEQ ID NO：123；氨基酸序列SEQ IDNO：56)。

TaqSS I200M/A205G(DNA序列SEQ ID NO：124；氨基酸序列SEQ ID NO：57)。

TaqSS K203N(DNA序列SEQ ID NO：125；氨基酸序列SEQ IDNO：58)。

TaqSS T204P(DNA序列SEQ ID NO：126；氨基酸序列SEQ IDNO：59)。

6.TaqSS R677A的构建

为了产生在弓形区和聚合酶区均序列改变的酶，在TaqSS中产生其它特异点突变。使用oligo 473-060-10：5′-tag ctc ctg gga gag ggc gtgggc cga cat gcc-3′(SEQ ID NO：321)，如上所述进行位点特异性诱变，产生TaqSS R677A突变体(DNA序列SEQ ID NO：127；氨基酸序列SEQ ID NO：60)。

7.TaqTthAKK(DNA序列SEQ ID NO：128；氨基酸序列SEQ IDNO：61)和TthTaq5M(DNA序列SEQ ID NO：129；氨基酸序列SEQ IDNO：62)的构建

通过用限制性内切核酸酶EcoRI和NotI酶切Tth DN RX HT(H786A/G506K/Q509K)(SEQ ID NO：104；在此缩写为TthAKK)或Taq 4M G504(SEQ ID NO：108；在此缩写为Taq5M)，产生嵌合突变体TaqTthAKK和TthTaq5M。较小插入片段以及较大载体片段如实施例3D所述凝胶纯化，这些插入片段在两种突变体之间交换，如实施例3D所述连接。构建体序列的筛选和证实也如实施例3D所述进行。

实施例8

其它聚合酶中RNA-依赖的5′核酸酶活性的提高

利用TaqPol/TthPol重组、诱变和模建获得的信息在其它DNA聚合酶中产生类似的突变，并检查对这些酶的切割活性的影响。丝状栖热菌(TfiPol)和水管致黑栖热菌(TscPol)的DNA聚合酶如实施例2所述克隆并纯化。这两种蛋白质的诱变在下文中描述。

A.TfiPolDN2M的构建

pTrc99a-TfiPol(SEQ ID NO：249)的诱变用QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene)按照厂商方案进行。P420K突变用下列两种寡核苷酸产生：5′-CTTCCAGAACCTCTTTAAACGGCTTTCCGAGAAG(SEQ ID NO：322)和5′-CTTCTCGGAAAGCCGTTTAAAGAGGTTCTGGAAG(SEQ ID NO：323)。E507Q突变用下列两种寡核苷酸产生：5′-CCGGTGGGCCGGACGCAGAAGACGGGCAAGC(SEQ IDNO：324)和5′-GCTTGCCCGTCTTCTGCGTCCGGCCCACCGG(SEQ ID NO：325)。D785N突变用下列两种寡核苷酸产生：5′-CTCCTCCAAGTGCACAACGAGCTGGTCCTGG(SEQ IDNO：326)和5′-CCAGGACCAGCTCGTTGTGCACTTGGAGGAG(SEQ ID NO：327)。含有所有这三种突变的质粒被称为Trc99a-TfiPolDN2M(DNA序列SEQ ID NO：130；氨基酸序列SEQ IDNO：63)。

B.TscPolDN2M的构建

pTrc99a-TscPol(SEQ ID NO：253)的诱变用QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene)按照厂商方案进行。E416K突变用下列两种寡核苷酸产生：5′-GCCGCCCTCCTGAAGCGGCTTAAGGG(SEQ IDNO：328)和5′-CCCTTAAGCCGCTTCAGGAGGGCGGC(SEQ IDNO：329)。E505Q突变用下列两种寡核苷酸产生：5′-ATCGGCAAGACGCAGAAGACGGGCAAGC(SEQ ID NO：330)和5′-GCTTGCCCGTCTTCTGCGTCTTGCCGAT(SEQ IDNO：331)。D783N突变用下列两种寡核苷酸产生：5′-TTGCAGGTGCACAACGAACTGGTCCTC(SEQ ID NO：332)和5′-GAGGACCAGTTCGTTGTGCACCTGCAA(SEQ ID NO：333)。含有所有这三种突变的质粒被称为Trc99a-TscPolDN2M(DNA序列SEQ ID NO：131；氨基酸序列SEQ ID NO：64)。

C.Tsc、Tfi、Tth和Taq突变体的嵌合

1.TfiTth AKK(DNA序列SEQ ID NO：132；氨基酸序列SEQ IDNO：65)、TscTthAKK(DNA序列SEQ ID NO：133；氨基酸序列SEQ IDNO：66)、TfiTaq5M(DNA序列SEQ ID NO：134；氨基酸序列SEQ IDNO：67)和TscTaq5M(DNA序列SEQ ID NO：135；氨基酸序列SEQ IDNO：68)的构建

为了产生Tth DN RX HT(H86A/G506K/Q509K)(在此缩写为TthAKK，SEQ ID NO：104)或Taq 4M G504(在此缩写为Taq5M，SEQID NO：108)与Tfi DN 2M(SEQ ID NO：130)或Tsc DN 2M(SEQ IDNO：131)的嵌合酶，通过位点特异性诱变向被命名为Tfi和Tsc的突变体内引入其它限制性内切核酸酶位点。利用诱变引物700-011-015′-cag acc atg aattcc acc cca ctt ttt gac ctg gag-3′(SEQ ID NO：334)和700-011-025′-gtg gac gcg gcc gcc cga ggc cgc cgc cag ggc cag-3′(SEQID NO：335)在Tfi DN 2M的氨基酸位点1处引入一个EcoRI位点，在氨基酸位点331处引入一个NotI位点。利用诱变引物700-011-035′-cagacc atg aattcc ctg ccc etcttt gag ccc aag-3′(SEQ ID NO：336)和700-011-045′-gta aac cgc gcc gcc cca ggc ggc ggc caa ggc gtt-3′(SEQID NO：337)在Tsc DN 2M的氨基酸位点1处引入一个EcoRI位点，在氨基酸位点327处引入一个NotI位点。以Tfi DN 2M或Tsc DN 2M作为靶标，使用相应的引物，使用AdvancecDNA PCR试剂盒(Clonetech)按照厂商说明书进行PCR反应。1017个碱基对的PCR产物用EcoRI和NotI酶切，产生993个碱基对的插入片段，如实施例3D所述凝胶纯化。突变体Taq4M G504K(SEQ ID NO：108)和Tth DNRX HT(H786A/G506K/Q509K)(SEQ ID NO：104)也用EcoRI和NotI酶切，较大的载体片段如上所述凝胶分离。如实施例3D所述进行连接，以及新构建体的筛选和证实。

实施例9

RNA依赖的5′核酸酶活性提高的其它酶

Tfi DN 2M(ΔN)的产生

为了利于以后的克隆步骤，从TfiPolDN2M基因(实施例8A所述的SEQ ID NO：130)的聚合酶区中除去一个内源限制性酶切位点(NotI)，并在更有利的位点插入一个独特的Not I位点。

内源Not I位点如下去除。根据厂商使用说明书使用来自Stratagene的QUIKCHANGE定点诱变试剂盒，使用诱变引物5′-gag-gtg-gag-cgg-ccc-ctc-tcc-cgg-gtc-ttg(SEQ ID NO：338)和5′-caa-gac-ccg-gga-gag-ggg-ccg-ctc-cac-ctc(SEQ ID NO：339)。新构建体被命名为Tfi DN 2M(ΔN)(DNA序列SEQ ID NO：340；氨基酸序列SEQ ID NO：341)。

Tfi DN 2M(N)、Tsc DN 2M(N)的产生

为了在Tfi DN 2M(ΔN)(SEQ ID NO：340)中插入独特NotI位点(在氨基酸位点328)，在PCR反应中使用引物886-088-07(SEQ IDNO：342)5′-tgg-cgg-cgg-cct-cgg-gcg-gcc-gcg-tcc-acc-ggg-caa-ca-3′和700-010-035′-ctt-ctc-tca-tcc-gcc-aaa-aca-gcc(SEQ ID NO：343)，以TfiDN 2M(ΔN)(SEQ ID NO：340)为模板。纯化并用限制性内切酶NotI和SalI酶切获得的PCR片段。然后将酶切片段连接到也用NotI和SalI消化的TfiTthAKK(SEQ ID NO：132，如实施例8C所述)构建体内。新构建体被命名为Tfi DN 2M(N)(DNA序列SEQ ID NO：345；氨基酸序列SEQ ID NO：346)。

为了将一个Not I限制性内切核酸酶位点引入突变体TscPol DN2M内(以上实施例8B中描述)，以TscPolDN2M(SEQ ID NO：131)作为模板，使用引物886-088-05(SEQ ID NO：344)5′-tgg-ccg-ccg-cct-ggg-gcg-gcc-gcg-ttt-acc-ggg-cgg-ag-3′和700-010-03(SEQ ID NO：343)5′-ctt-ctc-tca-tcc-gcc-aaa-aca-gcc-3′进行PCR。然后将PCR产物的NotI-SalI消化片段亚克隆到NotI和SalI消化的TscTthAKK载体(SEQ ID NO：133)内。获得的构建体被命名为Tsc DN2M(N)(DNA序列SEQ ID NO：347；氨基酸序列SEQ ID NO：348)。

Tfi DN 2M(N)AKK和Tsc DN2M(N)AKK的产生

为了产生“AKK”组突变(G504K/E507K/H784A/D785N)，对TfiDN 2M(N)突变体(DNA序列SEQ ID NO：345)进行位点特异性诱变，其中使用引物959-022-01到04：5′-ggc-ctc-acc-ccg-gtg-aag-cgg-acg-aag-aag-acg-ggc-aag-cgc-3′，5′-gcg-ctt-gcc-cgt-ctt-ctt-cgt-ccg-ctt-cac-cgg-ggt-gag-gcc-3′，5′-ctc-ctc-ctc-caa-gtg-gcc-aac-gag-ctg-gtc-ctg-3′，5′-cag-gac-cag-ctc-gtt-ggc-cac-ttg-gag-gag-gag-3′(SEQ IDNO：354-357)，产生Tfi 2M(N)AKK突变体(DNA序列SEQ ID NO：358；氨基酸序列SEQ ID NO：359)。该构建体被命名为“TfiAKK”。

为了将“AKK”组突变(G502K/E505K/H782A/D783N)引入TscDN2M(N)构建体(DNA序列SEQ ID NO：347)内，使用959-022-05到08：5′-ggg-ctt-ccc-gcc-atc-aag-aag-acg-aag-aag-acg-ggc-aag-cgc-3′，5′-gcg-ctt-gcc-cgt-ctt-ctt-cgt-ctt-ctt-gat-ggc-ggg-aag-ccc-3′，5′-atg-ctt-ttg-cag-gtg-gcc-aac-gaactg-gtc-ctc-3′，5′-gag-gac-cag-ttc-gtt-ggc-cac-ctg-caa-aag-cat-3′(SEQ IDNO：360-363)，产生Tsc2M(N)AKK(DNA序列SEQ ID NO：364；氨基酸序列SEQ ID NO：365)。该构建体被命名为“TscAKK”。

通过重组PCR，点突变体的构建

TthAKK(P195A)和TthAKK(P195K)的构建

为了在TthAKK构建体的核酸酶域的氨基酸位点195处引入突变(P195A或P195K)，在PCR反应中使用诱变引物785-073-01(P195A)5′-ccc-tcc-gac-aac-ctc-gcc-ggg-gtc-aag-ggc-atc-3′(SEQ ID NO：370)或785-073-02(P195K)5′-ccc-tcc-gac-aac-ctc-aag-ggg-gtc-aag-ggc-atc-3′(SEQ ID NO：371)和引物209-074-02：5′-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3′(SEQ ID NO：316)，产生一个787碱基对的片段。在使用相同模板的反应中，利用引物390-076-085′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQ ID NO：314)和785-073-035′-gag-gtt-gtc-gga-ggg-gtc-3′(SEQ ID NO：372)获得另外一条PCR片段。

两条PCR片段重叠，并且在重组PCR反应中组合。加入外部引物390-076-08和209-074-02，按照厂商使用说明书使用AdvantagecDNA PCR试剂盒(Clontech)。该反应产生1380个碱基对的产物。

重组PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，产生一条986个碱基对的片段。通过用相同酶酶切制备TthAKK构建体。然后将该片段连接到载体内，转化JM109细胞。由这组反应获得的新突变体包括：TthAKK(P195A)(DNA序列SEQ ID NO：373；氨基酸序列SEQ IDNO：374)和TthAKK(P195K)(DNA序列SEQ ID NO：375；氨基酸序列SEQ ID NO：376)。

TthAKK(N417K/L418K)的构建

利用相同的方法构建TthAKK(N417K/L418K)。使用诱变引物785-73-075′-gag-agg-ctc-cat-cgg-aag-aag-ctt-aag-cgc-ctc-gag-3′(SEQID NO：377)和700-10-035′-ctt-ctc-tca-tcc-gcc-aaa-aca-gcc-3′(SEQ IDNO：343)，和引物158-084-015′-ctc-ctc-cac-gag-ttc-ggc-3′(SEQ IDNO：310)和785-73-085′-ccg-atg-gag-cct-ctc-cga-3′(SEQ ID NO：378)，产生两条重叠的PCR片段。组合这两种产物，用外部引物700-10-03和158-084-01扩增。重组PCR产物用限制性内切酶NotI和BamHI酶切，连接到预先用NotI/BamHI酶切的TthAKK构建体内。该突变体被命名为TthAKK(N417K/L418K)(DNA序列SEQ ID NO：379；氨基酸序列SEQ ID NO：380)。

通过定点诱变，其它TthAKK点突变体的构建

TthAKK(P255L)的产生

使用诱变引物886-049-05和886-049-06：5′-gtg-cgc-acc-gac-ctc-ctc-ctg-gag-gtg-gac-ctc-3′(SEQ ID NO：381)，5′-gag-gtc-cac-ctc-cag-gag-gag-gtc-ggt-gcg-cac-3′(SEQ ID NO：382)，对TthAKK构建体进行位点特异性诱变，产生TthAKK(P255L)(DNA序列SEQ ID NO：383；氨基酸序列SEQ ID NO：384)。

TthAKK(F311Y)的构建

使用诱变引物886-049-09和886-049-10：5′-ggg-gcc-ttc-gtg-ggc-tac-gtc-ctc-tcc-cgc-ccc-3′(SEQ ID NO：P385)，5′-ggg-gcg-gga-gag-gac-gta-gcc-cac-gaa-ggc-ccc-3′(SEQ ID NO：386)，对TthAKK构建体进行位点特异性诱变，产生TthAKK(F311Y)(DNA序列SEQ ID NO：387；氨基酸序列SEQ ID NO：388)。

TthAKK(N221H/R224Q)的构建

使用诱变引物886-049-01和886-049-02：5′-gaa-aac-ctc-ctc-aag-cac-ctg-gac-cag-gta-aag-cca-gaa-aac-3′(SEQID NO：389)，5′-gtt-ttc-tgg-ctt-tac-ctg-gtc-cag-gtg-ctt-gag-gag-gtt-ttc-3′(SEQ ID NO：390)，对TthAKK构建体进行位点特异性诱变，产生TthAKK(N221H/R224Q)(DNA序列SEQ ID NO：391；氨基酸序列SEQ ID NO：392)。

TthAKK(R251H)的构建

使用诱变引物886-049-03和886-049-04：5′-gag-ctc-tcc-cgg-gtg-cac-acc-gac-ctc-ccc-ctg-3′(SEQ ID NO：393)，5′-cag-ggg-gag-gtc-ggt-gtg-cac-ccg-gga-gag-ctc-3′(SEQ ID NO：394)，对TthAKK构建体进行位点特异性诱变，产生TthAKK(R251H)(DNA序列SEQ ID NO：395；氨基酸序列SEQ ID NO：396)。

TthAKK(P255L/R251H)的构建

使用诱变引物886-088-01和886-088-02：5′-gag-ctc-tcc-cgg-gtg-cac-acc-gac-ctc-ctc-ctg-3′(SEQ ID NO：397)，5′-cag-gag-gag-gtc-ggt-gtg-cac-ccg-gga-gag-ctc-3′(SEQ ID NO：398)，对TthAKK(P255L)构建体进行位点特异性诱变，产生TthAKK(P255L/R251H)(DNA序列SEQ ID NO：399；氨基酸序列SEQID NO：400)。

Tth AKK L429V(DNA序列SEQ ID NO：401；氨基酸序列SEQ IDNO：402)的构建

使用诱变引物680-79-025′-ctc cat egg aac etc ctt[aag cgc ctc gagggg gag gag aag etc ctt tgg]ctc tac cac gag gtg-3′(SEQ ID NO：403)和反向引物680-79-045′-AAG GAG GTT CCG ATG GAG-3′(SEQ IDNO：404)，对Tth AKK构建体进行手掌区随机化诱变，在手掌区中引入随机突变。括号表示所示91％的碱基和3％的其它所有碱基的合成。

Tth AKK E425V(DNA序列SEQ ID NO：405；氨基酸序列SEQ IDNO：406)的构建

使用诱变引物680-79-025′-ctc cat egg aac ctc ctt[aag cgc ctc gagggg gag gag aag etc ctt tgg]ctc tac cac gag gtg-3′(SEQ ID NO：403)和反向引物680-79-045′-AAG GAG GTT CCG ATG GAG-3′(SEQ IDNO：404)，对Tth AKK构建体进行手掌区随机化诱变，在手掌区中引入随机突变。括号表示所示91％的碱基和3％的其它所有碱基的合成。

Tth AKK L422N/E425K(DNA序列SEQ ID NO：407；氨基酸序列SEQ ID NO：408)的构建

使用诱变引物680-79-025′-ctc cat cgg aac ctc ctt[aag cgc ctc gagggg gag gag aag ctc ctt tgg]ctc tac cac gag gtg-3′(SEQ ID NO：403)和反向引物680-79-045′-AAG GAG GTT CCG ATG GAG-3′(SEQ IDNO：404)，对Tth AKK构建体进行手掌区随机化诱变，在手掌区中引入随机突变。括号表示所示91％的碱基和3％的其它所有碱基的合成。

Tth AKK L422F/W430C(DNA序列SEQ ID NO：409；氨基酸序列SEQ ID NO：410)的构建

Tth AKK A504F(DNA序列SEQ ID NO：411；氨基酸序列SEQ IDNO：412)的构建

使用诱变引物680-80-035′-cag gag ctt agg ctt ccc nnn ttg aag aagacg aag aag aca-3′(SEQ ID NO：413)和反向引物680-80-065′-cct aagctc gtc aaa gag-3′(SEQ ID NO：414)，对Tth AKK构建体进行位点饱和诱变，在A504氨基酸中引入随机突变。

Tth AKK A504V(DNA序列SEQ ID NO：415；氨基酸序列SEQ IDNO：416)的构建

Tth AKK A504S(DNA序列SEQ ID NO：417；氨基酸序列SEQ IDNO：418)的构建

Tth AKK S517G(DNA序列SEQ ID NO：419；氨基酸序列SEQ IDNO：420)的构建

使用诱变引物680-80-075′-GGC AAG CGC TCC ACC NNNGCC GCG GTG CTG GAG GCC CTA CGG-3′(SEQ ID NO：421)和反向引物680-80-105′GGT GGA GCG CTT GCC-3′(SEQ IDNO：422)，对Tth AKK构建体进行位点饱和诱变，在S517氨基酸中引入随机突变。

Tth AKK A518L(DNA序列SEQ ID NO：423；氨基酸序列SEQ IDNO：424)的构建

使用诱变引物680-80-075′-GGC AAG CGC TCC ACC AGCNNN GCG GTG CTG GAG GCC CTA CGG-3′(SEQ ID NO：425)和反向引物680-80-105′GGT GGA GCG CTT GCC-3′(SEQ IDNO：422)，对Tth AKK构建体进行位点饱和诱变，在A518氨基酸中引入随机突变。

Tth AKK A518R(DNA序列SEQ ID NO：426；氨基酸序列SEQ IDNO：427)的构建

使用诱变引物680-80-075′-GGC AAG CGC TCC ACC AGCNNN GCG GTG CTG GAG GCC CTA CGG-3′(SEQ ID NO：425)和反向引物680-80-105′-ggt gga gcg ctt gcc-3′(SEQ ID NO：422)，对TthAKK构建体进行位点饱和诱变，在A518氨基酸中引入随机突变。

Taq5M L451R(DNA序列SEQ ID NO：428；氨基酸序列SEQ IDNO：429)的构建

使用诱变引物240-60-055′-acg-ggg-gtg-cgc-cgg-gac-gtg-gcc-tat 3′(SEQ ID NO：430)对Taq 5M构建体进行定点诱变，向Taq5M酶中引入L451R突变。

Tth AKK A504K(DNA序列SEQ ID NO：431；氨基酸序列SEQID NO：432)的构建

使用诱变引物680-69-045′-ctt agg ctt ccc aag ttg aag aag acg aagaag aca-3′(SEQ ID NO：433)和反向引物680-69-055′-tgt ctt ctt cgt cttctt caa ctt ggg aag cct aag-3′(SEQ ID NO：434)，对Tth AKK构建体进行定点诱变，在Tth AKK酶中引入A504K突变。

Tth AKK H641A(DNA序列SEQ ID NO：435；氨基酸序列SEQID NO：436)的构建

使用诱变引物680-69-085′-gag ggg aag gac atc gcc acc cag accgca agc-3′(SEQ ID NO：437)和反向引物583-01-025′-gct tgc ggt ctgggt ggc gat gtc ctt cccctc-3′(SEQ ID NO：438)，对Tth AKK构建体进行定点诱变，在Tth AKK酶中引入H641A突变。

Tth AKK T508P(DNA序列SEQ ID NO：439；氨基酸序列SEQ IDNO：440)的构建

使用诱变引物680-70-015′-ccc-gcc ttg aag aag ccg aag aag acaggc aag-3′(SEQ ID NO：441)和反向引物680-70-025′-ctt gcc tgt ctt cttegg ctt ctt caa ggc ggg-3′(SEQ ID NO：442)，对Tth AKK构建体进行定点诱变，在Tth AKK酶中引入T508P突变。

嵌合体和嵌合体中的突变

TthAKK酶与α-肽的融合

构建一种TthAKK-lacZ-α-肽嵌合融合体，以便能够根据菌落蓝白筛选检测使全长融合蛋白不能表达的突变(包括移码、缺失、插入等)(Wu等人，Nucleic Acids Research，24：1710[1996])。

使用诱变引物959-041-03，5′-cac-cac-cac-cac-cac-cac-gtc-gac-tag-tgc-tag-cgt-cga-cta-gct-gca-ggc-atg-caa-gct-tgg-c-3′(SEQ ID NO：477)和959-041-04，5′-gcc-aag-ctt-gca-tgc-ctg-cag-cta-gtc-gac-gct-agc-act-agt-cga-cgt-ggt-ggt-ggt-ggt-ggt-g-3′(SEQ ID NO：478)，对TthAKK DNA进行位点特异性诱变，产生pTthAKK-L，该产物为了插入lacZα肽，在TthAKK的C端6×His尾之后含有SalI位点。首先使用引物959-041-01，5′-cag-gaa-gcg-gcc-gcg-tcg-aca-tga-cca-tga-tta-cgc-caa-gc-3′(SEQ IDNO：479)和959-093-01，5′-ggg-ccc-gcc-agg-gtc-gac-tca-ggg-cga-tgg-ccc-act-acg-tga-3′(SEQ IDNO：480)，由pCRII-TOPO载体(Invitrogen)扩增(201个氨基酸的)α肽。然后用限制性内切酶SalI消化PCR产物，将其连接到也用相同酶酶切的pTthAKK-L载体内，产生嵌合构建体TthAKK-α肽(DNA序列SEQ ID NO：481；氨基酸序列SEQ ID NO：482)。插入方向通过测序证实。

TthTscAKK和TthTfiAKK酶的构建

TthAKK构建体用酶EcoRI和NotI酶切，凝胶分离较小的插入片段。TscAKK或TfiAKK构建体也用EcoRI和NotI酶切，凝胶分离并纯化较大的片段。将Tth插入片段(核酸酶域)连接到TscAKK和TfiAKK载体(聚合酶域)内，产生TthTscAKK(DNA序列SEQ IDNO：447；氨基酸序列SEQ ID NO：448)和TthTfiAKK(DNA序列SEQID NO：449；氨基酸序列SEQ ID NO：450)嵌合构建体。

提高底物特异性的Tth聚合酶的FT突变

Taq(FT)TthAKK的构建

使用诱变引物473-087-05：5′-cgg-gac-ctc-gag-gcg-cgt-gaa-ccc-cag-gag-gtc-cac-3′(SEQ IDNO：483)，对TaqTthAKK构建体进行位点特异性诱变，引入L107F/A108T突变，产生Taq(FT)TthAKK(DNA序列SEQ IDNO：484；氨基酸序列SEQ ID NO：485)。

Tfi(FT)TthAKK的构建

使用诱变引物785-096-01：5′-gtg-gac-ctt-ctg-ggc-ttt-acc-cgc-ctc-gag-gcc-ccg-3′(SEQ ID NO：486)和785-096-02：5′-cgg-ggc-ctc-gag-gcg-ggt-aaa-gcc-cag-aag-gtc-cac-3′(SEQ ID NO：487)，对TfiTthAKK构建体进行位点特异性诱变，引入L107F/V108T突变，产生Tfi(FT)TthAKK(DNA序列SEQ ID NO：349；氨基酸序列SEQ ID NO：488)。

Tfi(FT)DN 2M(N)和Tsc(FT)DN 2M(N)突变体

如下引入L107F/V108T突变：分离Tfi DN 2M(N)突变体(DNA序列SEQ ID NO：345)的NotI和SalI片段，将其插入预先用NotI-SalI消化的Tfi(FT)TthAKK(DNA序列SEQ ID NO：349；氨基酸序列SEQID NO：488)内，产生Tfi(FT)DN 2M(N)突变体(DNA序列SEQ IDNO：350；氨基酸序列SEQ ID NO：351)。为了向这种基于Tsc的构建体内添加L107F或E108T突变，进行相同的程序。将Tsc DN 2M(N)突变体(DNA序列SEQ ID NO：348)的NotI和SalI酶切片段插入NotI-SalI预消化的Tsc(FT)TthAKK(DNA序列SEQ ID NO：491)载体内，产生Tsc(FT)DN 2M(N)突变体(DNA序列SEQ ID NO：352，氨基酸序列SEQ ID NO：353)。

Tfi(FT)AKK和Tsc(FT)AKK的构建

以上述Tfi(FT)DN2M(N)构建体(DNA序列SEQ ID NO：350)开始，使用引物(959-022-01到04：5′-ggc-ctc-acc-ccg-gtg-aag-cgg-acg-aag-aag-acg-ggc-aag-cgc-3′，5′-gcg-ctt-gcc-cgt-ctt-ctt-cgt-ccg-ctt-cac-cgg-ggt-gag-gcc-3′，5′-ctc-ctc-ctc-caa-gtg-gcc-aac-gag-ctg-gtc-ctg-3′，5′-cag-gac-cag-ctc-gtt-ggc-cac-ttg-gag-gag-gag-3′(SEQ ID NO：354-357)，通过位点特异性诱变引入“AKK”组突变(H784A、G504K和E507K)。获得的突变构建体被命名为Tfi(FT)AKK(DNA序列SEQ ID NO：366，氨基酸序列SEQID NO：367)。

同样，在位点特异性诱变反应中以Tsc(FT)DN2M(N)突变体(DNA序列SEQ ID NO：352)为模板，使用引物959-022-05到08：5′-ggg-ctt-ccc-gcc-atc-aag-aag-acg-aag-aag-acg-ggc-aag-cgc-3′，5′-gcg-ctt-gcc-cgt-ctt-ctt-cgt-ctt-ctt-gat-ggc-ggg-aag-ccc-3′，5′-atg-ctt-ttg-cag-gtg-gcc-aac-gaa-ctg-gtc-ctc-3′，5′-gag-gac-cag-ttc-gtt-ggc-cac-ctg-caa-aag-cat-3′(SEQ IDNO：360-363)，产生Tsc(FT)AKK突变体(DNA序列SEQ ID NO：368；氨基酸序列SEQ ID NO：369)。

Tsc(FT)TthAKK的构建

使用诱变引物785-008-035′-ttt-acc-cgc-ctc-gag-gtg-ccg-ggc-3′(SEQ ID NO：489)和反向引物680-21-035′-cgg cac ctc gag gcg ggt aaagcc caa aag gtc cac-3′(SEQ ID NO：490)，对TscTthAKK构建体进行位点特异性诱变，引入L107F/E108T突变，产生Tsc(FT)TthAKK(DNA序列SEQ ID NO：454；氨基酸序列SEQ ID NO：491)。

Taq(FT)TscAKK和Taq(FT)TfiAKK酶的构建

Taq(FT)TthAKK构建体用酶EcoRI和NotI酶切，凝胶分离较小的插入片段。TscAKK或TfiAKK构建体也用EcoRI和NotI酶切，凝胶分离并纯化较大的片段。将Taq(FT)插入片段(核酸酶域)连接到TscAKK和TfiAKK载体(聚合酶域)内，产生Taq(FT)TscAKK(DNA序列SEQ ID NO：443；氨基酸序列SEQ ID NO：444)和Taq(FT)TfiAKK(DNA序列SEQ ID NO：445；氨基酸序列SEQ IDNO：446)嵌合构建体。

TaqEFT-Tth(AKK)(DNA序列SEQ ID NO：501；氨基酸序列SEQID NO：502)的构建

使用诱变引物436-013-085′-atc-gtg-gtc-ttt-gac-gcc-gag-gcc-ccc-tcc-ttc-c-3′(SEQ ID NO：503)和436-013-095′-gga-agg-agg-ggg-cct-cgg-cgt-caa-aga-cca-cga-t-3′(SEQID NO：504)，对Taq(FT)-Tth(AKK)DNA(SEQ ID NO：484)进行位点特异性诱变，引入K70E突变。

提高Taq(EFT)TthAKK酶活性的其它突变

TaqEFT-Tth(AKK)-A/M1(DNA序列SEQ ID NO：505；氨基酸序列SEQ ID NO：506)的构建

使用诱变引物1044-038-01：5′-cag-acc-atg-aat-tcg-gag-gcg-atg-ctg-ccc-ctc-ttt-3′(SEQ ID NO：507)和1044-038-02：(SEQ ID NO：508)5′-aaa-gag-ggg-cag-cat-cgc-ctc-cga-att-cat-ggt-ctg-3′，对Taq(EFT)-Tth(AKK)DNA(SEQ ID NO：501)进行位点特异性诱变，引入G4EA突变。

TaqEFT-Tth(AKK)-B/M2(DNA序列SEQ ID NO：509；氨基酸序列SEQ ID NO：510)的构建

使用诱变引物1044-038-03：5′-gcc-tac-cgc-acc-ttc-ttt-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-3和1044-038-04：5′-gag-gcc-ctt-cag-ggc-aaa-gaa-ggt-gcg-gta-ggc-3′(分别是SEQ IDNO：511和512)，对Taq(EFT)-Tth(AKK)DNA(SEQ ID NO：501)进行位点特异性诱变，引入H29F突变。

TaqEFT-Tth(AKK)-C/M3(DNA序列SEQ ID NO：513；氨基酸序列SEQ ID NO：514)的构建

使用诱变引物1044-038-05：5′-ctc-ctc-aag-gcc-ctc-aga-gag-gac-ggg-gac-gcg-3′和1044-038-06：5′-cgc-gtc-ccc-gtc-ctc-tct-gag-ggc-ctt-gag-gag-3′(分别为SEQ IDNO：515和516)，对Taq(EFT)-Tth(AKK)DNA(SEQ ID NO：501)进行位点特异性诱变，引入K57R突变。

TaqEFT-Tth(AKK)-D/M5(DNA序列SEQ ID NO：517；氨基酸序列SEQ ID NO：518)的构建

使用诱变引物1044-038-09：5′-gac-gac-gtc-ctg-gcc-acc-ctg-gcc-aag-aag-gcg-3′和1044-038-10：5′-cgc-ctt-ctt-ggc-cag-ggt-ggc-cag-gac-gtc-gtc-3′(分别为SEQ IDNO：519和520)，对Taq(EFT)-Tth(AKK)DNA(SEQ ID NO：501)进行位点特异性诱变，引入S125T突变。

TaqEFT-Tth(AKK)-E/M6(DNA序列SEQ ID NO：521；氨基酸序列SEQ ID NO：522)的构建

使用诱变引物1044-038-11：5′-ggg-gag-aag-acg-gcg-ctc-aag-ctt-ctg-gag-gag-3′和1044-038-12：5′-ctc-ctc-cag-aag-ctt-gag-cgc-cgt-ctt-ctc-ccc-3′(分别为SEQ IDNO：523和524)，对Taq(EFT)-Tth(AKK)DNA(SEQ ID NO：501)进行位点特异性诱变，引入R206L突变。

TaqEFT-Tth(AKK)-F/M7(DNA序列SEQ ID NO：525；氨基酸序列SEQ ID NO：526)的构建

使用诱变引物1044-038-13：5′-gag-ccc-gac-cgg-gag-ggg-ctt-aag-gcc-ttt-ctg-gag-agg-3′和1044-038-14：5′-cct-ctc-cag-aaa-ggc-ctt-aag-ccc-ctc-ccg-gtc-ggg-ctc-3(分别为SEQ ID NO：527和528)，对Taq(EFT)-Tth(AKK)DNA(SEQID NO：501)进行位点特异性诱变，引入R269G和R271K突变。

TaqEFT-Tth(AKK)-G/M8(DNA序列SEQ ID NO：529；氨基酸序列SEQ ID NO：530)的构建

使用诱变引物1044-038-15：5′-cac-gag-ttc-ggc-ctt-ctg-gga-ggg-gag-aag-ccc-cgg-gag-gag-gcc-ccc-tgg-ccc-3′和1044-038-16：5′-ggg-cca-ggg-ggc-ctc-ctc-ccg-ggg-ctt-ctc-ccc-tcc-cag-aag-gcc-gaa-ctc-gtg-3′(分别为SEQ ID NO：531和532)，对Taq(EFT)-Tth(AKK)DNA(SEQ ID NO：501)进行位点特异性诱变，引入E290G、S291G、P292E、A294P和L295R突变。

TaqEFT-Tth(AKK)-H/M9(DNA序列SEQ ID NO：533；氨基酸序列SEQ ID NO：534)的构建

使用诱变引物1044-038-17：5′-ctg-gcc-ctg-gcc-gcc-tgc-agg-ggc-ggc-cgc-gtg-3′和1044-038-18：5′-cac-gcg-gcc-gcc-cct-gca-ggc-ggc-cag-ggc-cag-3′(分别为SEQ IDNO：535和536)，对Taq(EFT)-Tth(AKK)DNA(SEQ ID NO：501)进行位点特异性诱变，引入A328C突变。

TaqEFT-Tth(AKK)-I/M10(DNA序列SEQ ID NO：537；氨基酸序列SEQ ID NO：538)的构建

使用诱变引物1080-015-01(SEQ ID NO：539)5′-ggg gag aag acggcg agg aag ctt ctg aag gag tgg ggg agc-3′和1080-015-02(SEQ IDNO：540)5′-gct ccc cca etc ctt cag aag ctt cct cgc cgt ctt etcccc-3′，对Taq(EFT)-Tth(AKK)DNA(SEQ ID NO：501)进行位点特异性诱变，引入E210K突变。

TaqEFT-Tth(AKK)-M1-9(DNA序列SEQ ID NO：541；氨基酸序列SEQ ID NO：542)的构建

用构建体TaqEFT-Tth(AKK)(SEQ ID：501)作为模板，进行7个独立的PCR反应，其中使用下列诱变引物对：PCR反应1；1044-038-015′-cag-acc-atg-aat-tcg-gag-gcg-atg-ctg-ccc-ctc-ttt-3′(SEQ ID NO：507)和1044-038-045′-gag-gcc-ctt-cag-ggc-aaa-gaa-ggt-gcg-gta-ggc-3′(SEQ ID NO：512)，产生108个碱基对的片段，PCR反应2；1044-038-035′-gcc-tac-cgc-acc-ttc-ttt-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-3′(SEQ ID NO：511)和1044-038-065′-cgc-gtc-ccc-gtc-ctc-tct-gag-ggc-ctt-gag-gag-3′(SEQ IDNO：516)，产生117个碱基对的片段，PCR反应3；1044-038-055′-ctc-ctc-aag-gcc-ctc-aga-gag-gac-ggg-gac-gcg-3′(SEQ ID NO：515)和1044-038-105′-cgc-ctt-ctt-ggc-cag-ggt-ggc-cag-gac-gtc-gtc-3′(SEQ IDNO：520)，产生237个碱基对的片段，PCR反应4；1044-038-095′-gac-gac-gtc-ctg-gcc-acc-ctg-gcc-aag-aag-gcg-3′(SEQ ID NO：519)和1044-038-125′-ctc-ctc-cag-aag-ctt-gag-cgc-cgt-ctt-ctc-ccc-3′(SEQ IDNO：524)，产生276个碱基对的片段，PCR反应5；1044-038-115′-ggg-gag-aag-acg-gcg-ctc-aag-ctt-ctg-gag-gag-3′(SEQ ID NO：523)和1044-038-145′-cct-ctc-cag-aaa-ggc-ctt-aag-ccc-ctc-ccg-gtc-ggg-ctc-3′(SEQ ID NO：528)，产生228个碱基对的片段，PCR反应6；1044-038-135′-gag-ccc-gac-cgg-gag-ggg-ctt-aag-gcc-ttt-ctg-gag-agg-3′(SEQ IDNO：527)和1044-038-165′-ggg-cca-ggg-ggc-ctc-ctc-ccg-ggg-ctt-ctc-ccc-tcc-cag-aag-gcc-gaa-ctc-gtg-3′(SEQ ID NO：532)，产生113个碱基对的片段，PCR反应7；1044-038-155′-cac-gag-ttc-ggc-ctt-ctg-gga-ggg-gag-aag-ccc-cgg-gag-gag-gcc-ccc-tgg-ccc-3′(SEQ IDNO：531)和1044-038-185′-cac-gcg-gcc-gcc-cct-gca-ggc-ggc-cag-ggc-cag-3′(SEQ ID NO：536)，产生157个碱基对的片段。这7种PCR产物重叠，因此在不使用引物时，PCR扩增产生适当的1005个碱基对的产物，引入K70E、G4EA、H29F、K57R、S125T、R206L、R269G、R271K、E290G、S291G、P292E、A294P、L295R和A328C突变。该产物用下列外部引物进一步扩增：1044-038-1(SEQ ID NO：507)和1044-038-18(SEQ ID NO：536)，克隆到pPCR-Script-Amp内。使用下列引物由该构建体再次扩增核酸酶域：1044-038-1(SEQ ID NO：507)和1044-038-18(SEQ ID NO：536)，并用EcoRI和NotI消化。将消化的PCR产物连接到EcoRI和NotI消化的TaqEFT-Tth(AKK)构建体内，转化JM109进行蛋白质表达和筛选。

TaqEFT-Tth(AKK)-M1-10(DNA序列SEQ ID NO：543；氨基酸序列SEQ ID NO：544)的构建

用构建体TaqEFT-Tth(AKK)(SEQ ID：501)作为模板进行7个独立的PCR反应，其中使用下列引物对：PCR反应1；1044-038-015′-cag-acc-atg-aat-tcg-gag-gcg-atg-ctg-ccc-ctc-ttt-3′(SEQ ID NO：507)和1044-038-045′-gag-gcc-ctt-cag-ggc-aaa-gaa-ggt-gcg-gta-ggc-3′(SEQ ID NO：512)，产生108个碱基对的片段，PCR反应2；1044-038-035′-gcc-tac-cgc-acc-ttc-ttt-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-3″(SEQ ID NO：511)和1044-038-065′-cgc-gtc-ccc-gtc-ctc-tct-gag-ggc-ctt-gag-gag-3′(SEQ IDNO：516)，产生117个碱基对的片段，PCR反应3；1044-038-055′-ctc-ctc-aag-gcc-ctc-aga-gag-gac-ggg-gac-gcg-3′(SEQ ID NO：515)和1044-038-105′-cgc-ctt-ctt-ggc-cag-ggt-ggc-cag-gac-gtc-gtc-3′(SEQ IDNO：520)，产生237个碱基对的片段，PCR反应4；1044-038-095′-gac-gac-gtc-ctg-gcc-acc-ctg-gcc-aag-aag-gcg-3′(SEQ ID NO：519)和1080-42-025′-gc ttc cag got ccc cca ctc ctt cag aag ctt gag cgc cgt cttctc ccc-3′(SEQ ID NO：546)，产生299个碱基对的片段，PCR反应5；1080-42-015′-ggg gag aag acg gcg ctc agg ctt ctg aag gag tgg ggg agcctg gaa gc-3′(SEQ ID NO：545)和1044-038-145′-cct-ctc-cag-aaa-ggc-ctt-aag-ccc-ctc-ccg-gtc-ggg-ctc-3′(SEQ IDNO：528)，产生228个碱基对的片段，PCR反应6；1044-038-135′-gag-ccc-gac-cgg-gag-ggg-ctt-aag-gcc-ttt-ctg-gag-agg-3′(SEQ IDNO：527)和1044-038-165′-ggg-cca-ggg-ggc-ctc-ctc-ccg-ggg-ctt-ctc-ccc-tcc-cag-aag-gcc-gaa-ctc-gtg-3′(SEQ ID NO：532)，产生113个碱基对的片段，PCR反应7；1044-038-155′-cac-gag-ttc-ggc-ctt-ctg-gga-ggg-gag-aag-ccc-cgg-gag-gag-gcc-ccc-tgg-ccc-3′(SEQ ID NO：531)和1044-038-185′-cac-gcg-gcc-gcc-cct-gca-ggc-ggc-cag-ggc-cag-3′(SEQID NO：536)，产生157个碱基对的片段。7种PCR产物重叠，因此在不使用引物时，PCR扩增产生适当的1005个碱基对的产物，引入K70E、G4EA、H29F、K57R、S125T、R206L、R269G、R271K、E290G、S291G、P292E、A294P、L295R和A328C突变。该产物用下列外部引物进一步扩增：1044-038-1(SEQ ID NO：507)和1044-038-18(SEQ ID NO：536)，克隆到pPCR-Script-Amp内。使用下列引物由该构建体再次扩增核酸酶域：1044-038-1(SEQ ID NO：507)和1044-038-18(SEQ ID NO：536)，并用EcoRI和NotI消化。将消化的PCR产物连接到EcoRI和NotI消化的TaqEFT-Tth(AKK)构建体内，转化JM109进行蛋白质表达和筛选。

进一步提高底物特异性的FEN酶的K69E突变

Tth(K69E)AKK、Taq(K69E)TthAKK、Tfi(K69E)TthAKK和Tsc(K69E)TthAKK和突变体的构建

使用诱变引物5′-atc-gtg-gtc-ttt-gac-gcc-gag-gcc-ccc-tcc-ttc-c-3′(SEQ ID NO：492)和5′-gga-agg-agg-ggg-cct-cgg-cgt-caa-aga-cca-cga-t-3′(SEQ ID NO：493)，对TthAKK、Taq TthAKK、TfiTthAKK和TscTthAKK DNA进行位点特异性诱变，引入K69E突变，产生Tth(K69E)AKK(DNA序列SEQ ID NO：452；氨基酸序列SEQ IDNO：494)、Taq(K69E)ThAKK(DNA序列SEQ ID NO：495；氨基酸序列SEQ ID NO：496)、Tfi(K69E)TthAKK(DNA序列SEQ ID NO：497；氨基酸序列SEQ ID NO：498)和Tsc(K69E)TthAKK(DNA序列SEQID NO：499；氨基酸序列SEQ ID NO：500)突变酶。

Tsc(167-334)TthAKK的构建

使用引物390-76-08：5′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQ ID NO：314)和1044-041-01：5′-ctt-ctc-tca-tcc-gcc-aaa-aca-gcc-3′(SEQ IDNO：451)，以及模板Tth(K69E)AKK(DNA序列SEQ ID NO：452)，使用引物1044-041-02：5′-ctc-ctc-cac-gag-ttc-ggc-3′(SEQ ID NO：453)和209-074-02：5′-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3′(SEQ ID NO：316)，以及模板Tsc(K69E)TthAKK(DNA序列SEQ ID NO：454)，产生两条重叠的PCR片段。组合这两种产物，用外部引物390-76-08和209-074-02扩增。重组PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，连接到用相同酶酶切制备的载体TthAKK内，产生Tsc(167-333)TthAKK构建体(DNA序列SEQ ID NO：455；氨基酸序列SEQ ID NO：456)。

Tsc(222-334)TthAKK的构建

使用引物390-76-08：5′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQ ID NO：314)和1044-041-03：5′-ttc-cag-gtg-ctt-gag-gag-gtt-ttc-cag-3′(SEQ IDNO：457)，以及模板Tth(K69E)AKK(DNA序列SEQ ID NO：452)，使用引物1044-041-04：5′-ctc-ctc-aag-cac-ctg-gaa-cag-gtg-aaa-3′(SEQ IDNO：458)和209-074-02：5′-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3′(SEQ IDNO：316)，以及模板Tsc(K69E)TthAKK(DNA序列SEQ ID NO：454)，产生两条重叠的PCR片段。组合这两种产物，用外部引物390-76-08和209-074-02扩增。重组PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，连接到用相同酶酶切制备的载体TthAKK内，产生Tsc(222-334)TthAKK构建体(DNA序列SEQ ID NO：459；氨基酸序列SEQ ID NO：460)。

Tfi(222-334)TthAKK的构建

使用引物390-76-08：5′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQ ID NO：314)和1044-058-05：5′-gtc-cag-gtt-ctt-gag-gag-gtt-ttc-cag-3′(SEQ IDNO：461)，以及模板Tth(K69E)AKK(DNA序列SEQ ID NO：452)，使用引物1044-058-06：5′-ctc-ctc-aag-aac-ctg-gac-cgg-gta-aag-3′(SEQ IDNO：462)和209-074-02：5′-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3′(SEQ IDNO：316)，以及模板Tfi(K69E)TthAKK(DNA序列SEQ ID NO：497)，产生两条重叠的PCR片段。组合这两种产物，用外部引物390-76-08和209-074-02扩增。重组PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，连接到用相同酶酶切制备的载体TthAKK内，产生Tfi(222-334)TthAKK构建体(DNA序列SEQ ID NO：463；氨基酸序列SEQ ID NO：464)。

Tfi(167-334)TthAKK的构建

使用引物390-76-085′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQ ID NO：314)和1044-058-075′-gac-gtc-ctt-cgg-ggt-gat-gag-gtg-gcc-3′(SEQ IDNO：465)，以及模板Tth(K69E)AKK(DNA序列SEQ ID NO：452)，以及使用引物044-058-085′-atc-acc-ccg-aag-gac-gtc-cag-gag-aag-3′(SEQ ID NO：466)和209-074-02 5′-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3′(SEQ ID NO：316)，以及模板Tfi(K69E)TthAKK(DNA序列SEQ IDNO：498)，两条重叠的PCR片段。组合这两种产物，用外部引物390-76-08和209-074-02扩增。重组PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，连接到用相同酶酶切制备的载体TthAKK内，产生Tfi(167-333)TthAKK构建体(DNA序列SEQ ID NO：467；氨基酸序列SEQ ID NO：468)。

Tsc(111-334)TthAKK的构建

使用引物390-76-085′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQ ID NO：314)和1044-058-015′-ctc-gag-gcg-ggt-aaa-ccc-cag-gag-gtc-3′(SEQ IDNO：469)，以及模板Tth(K69E)AKK(DNA序列SEQ ID NO：452)，使用引物1044-058-02 5′-ggg-ttt-acc-cgc-ctc-gag-gtg-ccc-ggc-3′(SEQ IDNO：470)和209-074-025′-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3′(SEQ IDNO：316)，以及模板Tsc(K69E)TthAKK(DNA序列SEQ ID NO：499)，产生两条重叠的PCR片段。组合这两种产物，用外部引物390-76-08和209-074-02扩增。重组PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，连接到用相同酶酶切制备的载体TthAKK内，产生Tsc(167-333)TthAKK构建体(DNA序列SEQ ID NO：471；氨基酸序列SEQ ID NO：472)。

Tsc(1-167)TthAKK的构建

使用引物390-76-085′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQ ID NO：314)和1044-058-035′-aag-cca-ctc-cgg-ggt-gat-cag-gta-acc-3′(SEQ IDNO：473)，以及模板Tth(K69E)TthAKK(DNA序列SEQ ID NO：499)，使用引物1044-058-045′-atc-acc-ccg-gag-tgg-ctt-tgg-gag-aag-3′(SEQID NO：474)和209-074-025′-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3′(SEQ IDNO：316)，以及模板Tth(K69E)AKK(DNA序列SEQ ID NO：452)，产生两条重叠的PCR片段。组合这两种产物，用外部引物390-76-08和209-074-02扩增。重组PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，连接到用相同酶酶切制备的载体TthAKK内，产生Tsc(1-167)TthAKK构建体(DNA序列SEQ ID NO：475；氨基酸序列SEQ ID NO：476)。

AfuFEN酶的修饰

pAfuFEN的构建

质粒pAfuFEN1如述制备[美国专利申请系列号09/684,938，WO98/23774，均在此全文引用作为参考]。简言之，使用DNA XTRAX试剂盒(Gull Laboratories，Salt Lake City，UT)，按照厂商方案，由一瓶(约5ml培养物)来自DSMZ的活闪烁古生球菌细菌(DSMZ#4304)制备基因组DNA。将终DNA沉淀重悬浮于100μl TE(10mM TrisHCl，pH 8.0，1mM EDTA)中。PCR使用1微升DNA溶液，使用ADVANTAGE cDNA PCR试剂盒(Clonetech)；按照厂商推荐进行PCR。

5’端引物与Afu FEN-1基因的5’端互补，不同之处在于它含有一个碱基对的置换，生成一个Nco I位点。3′端引物与FEN-1 ORF下游的Afu FEN-1基因的3’端互补，不同之处在于它含有2个碱基的置换，生成一个SalI位点。5′端和3’端引物的序列分别是5′-CCGTCAACATTTACCATGGGTGCGGA-3′(SEQ ID NO：617)和5′-CCGCCACCTCGTAGTCGACATCCTTTTCGTG(SEQ IDNO：618)。获得的片段的克隆如美国专利申请系列号5,994,069(为了所有目的在此全文引用)关于PfuFEN1基因所述进行，产生质粒pTrc99-AFFEN1。为了表达，通过修饰pTrc99-AFFEN1构建pTrcAfuHis质粒，这种修饰是添加一个组氨酸尾以利于纯化。为了添加这个组氨酸尾，利用标准PCR引物指导的诱变方法在pTrc99-AFFENl编码区的最后一个氨基酸密码子与终止密码子之间插入6个组氨酸残基的编码序列。获得的质粒被命名为pTrcAfuHis。然后如述表达这些蛋白质，通过与Ni⁺⁺亲和柱结合进行纯化。

Afu(Y236A)，A46-5的构建

由模板AfuFEN(SEQ ID NO：556)产生两种重叠PCR片段，其中使用引物：785-73-045′-ctg-gtc-ggg-acg-gac-gcc-aat-gag-ggt-gtg-aag-3′(SEQ ID NO：547)和700-10-03 5′-ctt-ctc-tca-tcc-gcc-aaa-aca-gcc-3′(SEQ ID NO：343)，和引物：390-076-08 5′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQ ID NO：314)和785-73-06 5′-gtc-cgt-ccc-gac-cag-aat-3′(SEQ IDNO：548)。组合这两种产物，用外部引物700-10-03和390-076-08扩增。重组PCR产物用限制性内切酶NotI和SalI酶切，连接到用相同酶酶切制备的载体AfuFEN内，产生Afu(Y236A)构建体(DNA序列SEQ IDNO：549；氨基酸序列SEQ ID NO：550)。

Afu(Y236R)，A56-9的构建

由模板AfuFEN产生两种重叠PCR片段，其中使用引物：785-73-05 5′-ctg-gtc-ggg-acg-gac-agg-aat-gag-ggt-gtg-aag-3′(SEQ IDNO：551)和700-10-03 5′-ctt-ctc-tca-tcc-gcc-aaa-aca-gcc-3′(SEQ IDNO：343)，和引物：390-076-08 5′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQ IDNO：314)和785-73-06 5′-gtc-cgt-ccc-gac-cag-aat-3′(SEQ ID NO：548)。组合这两种产物，用外部引物700-10-03和390-076-08扩增。重组PCR产物用限制性内切酶NotI和SalI酶切，连接到用相同酶酶切制备的载体AfuFEN内，产生Afu(Y236R)构建体(DNA序列SEQ ID NO：552；氨基酸序列SEQ ID NO：553)。

2.FEN酶与栖热菌聚合酶衍生物的嵌合体

下列酶构建体将AfuFEN酶的聚合酶域部分与栖热菌聚合酶的聚合酶域相组合。这些组合根据分子模建获得的信息设计。

Afu336-Tth296(AKK)，ATI-1的构建

产生两种重叠的PCR片段。第一种片段的制备以AfuFEN构建体(SEQ ID NO：556)为模板，使用引物：390-076-085′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQ ID NO：314)和390-065-055′-gaa-cca-cct-ctc-aag-cgt-gg-3′(SEQ ID NO：554)。第二种片段的制备以TthAKK(SEQ ID NO：558)为模板，使用引物：700-049-015′-acg-ctt-gag-agg-tggttc-ctg-gag-gag-gcc-ccc-tgg-3′(SEQ ID NO：555)和390-076-09 5′-taa-tct-gta-tca-ggc-tg-3′(SEQ ID NO：557)。两种产物含有一个序列重叠区，组合并在重组PCR反应中使用外部引物390-076-08和390-076-09扩增。重组PCR产物用限制性内切酶BspEI和SalI酶切，连接到用相同酶酶切制备的AfuFEN构建体内，产生Afu336-Tth296(AKK)构建体(DNA序列SEQ ID NO：559；氨基酸序列SEQ ID NO：560)。

Afu328-Tth296(AKK)，AT2-3的构建

产生两种重叠的PCR片段，第一个使用引物390-076-085′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQ ID NO：314)和700-049-025′-ggt-tga-ctt-cag-agc-ttt-gag-3′(SEQ ID NO：561)，以及模板AfuFEN(DNA序列SEQ ID NO：556)，第二个使用引物700-049-035′-aaa-gct-ctg-aag-tca-acc-ctg-gag-gag-gcc-ccc-tgg-3′(SEQ ID NO：562)和390-076-095′-taa-tct-gta-tca-ggc-tg-3′(SEQ ID NO：557)，以及模板TthAKK(DNA序列SEQ ID NO：558)。组合这两种产物，用外部引物390-076-08和390-076-09扩增。重组PCR产物用限制性内切酶BspEI和SalI酶切，连接到用相同酶酶切制备的载体AfuFEN内，产生Afu336-Tth296(AKK)构建体(DNA序列SEQ ID NO：563；氨基酸序列SEQ ID NO：564)。

Afu336-Taq5M的构建

Taq5M构建体(SEQ ID NO：41)用酶NotI和SalI酶切，凝胶分离较小的插入片段。Afu336-Tth296(AKK)构建体(DNA序列SEQ IDNO：559)也用相同的限制性内切酶酶切，纯化较大的载体片段。然后将插入片段(Taq5M聚合酶域)连接到载体内，产生Afu336-Taq5M构建体(DNA序列SEQ ID NO：565；氨基酸序列SEQ ID NO：566)。

Afu336-TaqDN的构建

TaqDNHT构建体用酶NotI和SalI酶切，凝胶分离较小的插入片段。Afu336-Tth296(AKK)构建体(DNA序列SEQ ID NO：559)也用相同的限制性内切酶酶切，纯化较大的载体片段。然后将插入片段(TaqDN聚合酶域)连接到载体内，产生Afu336-Taq5M构建体(DNA序列SEQ ID NO：567；氨基酸序列SEQ ID NO：568)。

栖热菌聚合酶的随机嵌合

根据DNA改组原理，通过栖热菌聚合酶的随机嵌合，产生许多功能改变的酶(Volkov和Arnold，Methods in Erazymology 328 456[2000])。利用下列方法发展下列嵌合体。

使用引物390-076-085′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQ IDNO：314)和209-074-02：5′-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3′(SEQ IDNO：316)，PCR扩增用于随机嵌合的目的基因，产生约1.4kbp的模板。约2μg DNA模板等比例混合，然后用DNaseI(0.33U)在30μl反应体系中消化，15℃约1分钟，产生大小为50-200bp的片段。在4％琼脂糖凝胶中纯化DNA片段，用QIAEXII凝胶提取试剂盒(QIAGEN)按照厂商说明书提取。将纯化的片段(10μl)加到10μl2×PCR预混合物中(5倍稀释，克隆Pfu缓冲液，各0.4mM dNTP，0.06U/μl克隆Pfu DNA聚合酶，STRATAGENE目录#600153，含有伴随缓冲液)，进行片段重装配反应(PCR程序：94℃3min，随后94℃30sec，52℃1min，72℃2min+5s/循环共40个循环，随后72℃4min)。然后使用CLONTECH GC melt cDNA PCR试剂盒(cat.#K1907-Y)，按照厂商说明，用一对巢式引物扩增重装配的产物(1μl 10倍稀释液)：072-090-01 5′-gag-cgg-ata-aca-att-tca-cac-agg-3′(SEQ IDNO：569)和189-082-01 5′-tgc-ccg-gtg-cac-gcg-gcc-gcc-cct-gca-ggc-3′(SEQ ID NO：570)。纯化的PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI消化，然后连接到用相同酶酶切制备的TthAKK构建体内。连接混合物转化JM109感受态细胞，根据酶活性筛选菌落。

1.随机嵌合体S26和S36的产生

用来制备这些嵌合酶的模板是来自TthAKK、TaqTthAKK、TscTthAKK和TfiTthAKK构建体的核酸酶域。根据初次活性筛选发现两个克隆显示活性提高。然后测序并分离随机嵌合体S26(DNA序列SEQ ID NO：571；氨基酸序列SEQ ID NO：572)和S36(DNA序列SEQ ID NO：573；氨基酸序列SEQ ID NO：574)。

2.为了提高底物特异性，向S26和S36中引入L107F/E108T、L109F/V110T和K69E突变

S26(FT)的构建

使用诱变引物785-008-03 5′-ttt-acc-cgc-ctc-gag-gtg-ccg-ggc-3′(SEQ ID NO：489)和680-21-035′-cgg-cac-ctc-gag-gcg-ggt-aaa-gcc-caa-aag-gtc-cac-3′(SEQ IDNO：490)，对pS26DNA进行位点特异性诱变，引入L107F/E108T突变，产生S26(FT)(DNA序列SEQ ID NO：575；氨基酸序列SEQ IDNO：576)。

S36(FT)的构建

使用诱变引物785-096-01：5′-gtg-gac-ctt-ctg-ggc-ttt-acc-cgc-ctc-gag-gcc-ccg-3′(SEQ ID NO：486)和785-096-02：5′-cgg-ggc-ctc-gag-gcg-ggt-aaa-gcc-cag-aag-gtc-cac-3′(SEQ ID NO：487)，对pS36DNA进行位点特异性诱变，引入L109F/V110T突变，产生S36(FT)(DNA序列SEQ ID NO：577；氨基酸序列SEQ ID NO：578)。

S26(K69E)的构建

使用诱变引物5′-atc-gtg-gtc-ttt-gac-gcc-gag-gcc-ccc-tcc-ttc-c-3′(SEQ ID NO：492)和5′-gga-agg-agg-ggg-cct-cgg-cgt-caa-aga-cca-cga-t-3′(SEQ ID NO：493)，对S26DNA进行位点特异性诱变，引入K69E突变，产生S26(K69E)(DNA序列SEQ ID NO：579；氨基酸序列SEQ ID NO：580)。

S26(FT/K69E)的构建

使用诱变引物5′-atc-gtg-gtc-ttt-gac-gcc-gag-gcc-ccc-tcc-ttc-c-3′(SEQ ID NO：492)和5′-gga-agg-agg-ggg-cct-cgg-cgt-caa-aga-cca-cga-t-3′(SEQ ID NO：493)，对S26(FT)DNA进行位点特异性诱变，引入K69E突变，产生S26(FT/K69E)(DNA序列SEQ ID NO：581；氨基酸序列SEQ ID NO：582)。

3.更多随机嵌合体：N3D7、N1A12、N1C4和N2C3

用来产生这些嵌合体的模板是Tth(K69E)AKK、Taq(K69E)TthAKK、Tsc(K69E)TthAKK和Tfi(K69E)TthAKK构建体的核酸酶域。根据初次活性筛选，有4个克隆显示活性提高。分别测序并分离随机嵌合体N3D7(DNA序列SEQ ID NO：583；氨基酸序列SEQ ID NO：584)、N1A12(DNA序列SEQ ID NO：585；氨基酸序列SEQ ID NO：586)、N1C4(DNA序列SEQ ID NO：587；氨基酸序列SEQID NO：588)和N2C3(DNA序列SEQ ID NO：589；氨基酸序列SEQ IDNO：590)。

G、L和GL变体的产生

在氨基酸385处Asp改变为Gly(D385G)并且在氨基酸455处Arg改变为Leu(R455L)的一种Tth聚合酶变体(氨基酸SEQ ID NO：2712；基因序列SEQ ID NO：2713)，用来产生衍生物和嵌合酶。含有这两个氨基酸变异的构建体在下文中用“GL”名称表示。只含有一个变异的嵌合体被表示为“G”或“L”。为了产生非聚合的变体，如上所述通过位点特异性诱变将在位点787处编码天冬氨酸的序列改变为编码天冬酰胺的序列。使用下列寡核苷酸诱变pTrcTth GL-2：5′-CAGGAGGAGCTCGTTGTGGACCTGGA-3′(SEQ ID NO：260)，产生质粒pTrcTthDN GL。突变蛋白质和编码核酸序列分别被称为TthDN GL，SEQ ID NOS：2714和2715。

A.Tth DN HT GL

如上对于Tth DN所述，向Tth DN GL的羧基端添加6个氨基酸的组氨酸尾(his-尾)。获得的突变基因被命名为Tth DN HT GL(SEQID NO：2716，核酸序列；SEQ ID NO：2717，氨基酸序列)。如以上对于TthDN HT所述表达并纯化该蛋白质。

B.Tth DN RX HT GL的产生

进行诱变，向Tth DN HT酶的聚合酶域内引入另外3个独特的限制酶切位点。使用Clonetech的Transformer定点诱变试剂盒，按照厂商说明进行位点特异性诱变。所述所有诱变反应使用两种不同的选择引物之一，反式Oligo AlwNI/SpeI或转换Oligo SpeI/AlwNI(Clontech，Palo Alto CA目录#6488-1或目录#6373-1)。给定反应中使用的选择oligo取决于载体中存在的选择限制酶切位点。所有诱变引物都用标准合成化学法合成。获得的克隆在大肠杆菌JM109株中表达。

使用对应于Tth DN HT GL基因有义链的诱变引物5′-gccgccaggggcggccgcgtccaccgggcc(SEQ ID NO：269)和5′-gcctgcaggggcggccgcgtgcaccggggca(SEQ ID NO：270)产生Not I位点(氨基酸位点328)。使用有义链诱变引物5′-ctcctggacccttcgaacaccacccc(SEQ ID NO：271)和5′-gtcctggcccatatggaggccac(SEQ ID NO：272)向基因内引入BstI(氨基酸位点382)和NdeI(氨基酸位点443)位点。利用Qiagen QiaPrep Spin Mini Prep试剂盒(cat.#27106)过量表达并纯化突变质粒。通过DNA测序和限制酶切作图检测该载体是否存在限制酶切位点。该构建体被命名为Tth DN RX HT GL(DNA序列SEQ IDNO：2718；氨基酸SEQ ID NO：2719)。利用Tth DN RX HT GL产生嵌合构建体。

1.TaqTth(N)GL的构建

进行的第一次交换涉及两种酶的聚合酶域。核酸酶域(蛋白质的N端)与聚合酶域(蛋白质的C端部分)的分离通过用限制性内切核酸酶EcoRI和NotI酶切两种基因完成。将来自Taq DN RX HT基因的约900个碱基对的片段克隆到Tth DNRX HT GL基因的同源位点，产生嵌合体TaqTth(N)GL(DNA序列SEQ ID NO：2675；氨基酸序列SEQID NO：2641)，其含有Taq DN RX HT 5′核酸酶域和Tth DN RX HTGL聚合酶域。

2.TaqTth(N-B)GL的构建

Taq DN RX HT构建体用酶NdeI和BamHI酶切，如上所述凝胶分离较大的载体片段。Tth DN RX HT GL构建体也用NdeI和BamHI酶切，凝胶分离并纯化较小的(约795个碱基对)的Tth片段。如上所述将Tth GL NdeI-BamHI插入片段连接到Taq NdeI-BamHI载体内，产生TaqTth(N-B)GL(DNA序列SEQ ID NO：2676；氨基酸序列SEQID NO：2642)。

3.TaqTth(N-D)G的构建

Taq DN RX HT构建体用酶NotI和NdeI酶切，如上所述分离较大的载体片段。Tth DN RX HT GL构建体也用NotI和NdeI酶切，凝胶分离并纯化较小的(约345个碱基对)Tth片段。如上所述将TthGL NotI-NdeI插入片段连接到Taq Notl-NdeI载体内，产生TaqTth(N-D)G(DNA序列SEQ ID NO：2677；氨基酸序列SEQ IDNO：2643)。

4.TaqTth(D-B)L的构建

Taq DN RX HT构建体用酶NdeI和BamHI酶切，如上所述分离较大的载体片段。Tth DN RX HT GL构建体也用NdeI和BamHI酶切，凝胶分离并纯化较小的(约450个碱基对)Tth片段。如上所述将Tth GL NdeI-BamHI插入片段连接到Taq NdeI-BamHI载体内，产生TaqTth(D-B)L(DNA序列SEQ ID NO：2678；氨基酸序列SEQ IDNO：2644)。

5.TaqTth(Bs-B)L的构建

Taq DN RX HT构建体用酶BstBI和BamHI酶切，如上所述分离较大的载体片段。Tth DN RX HT GL构建体也用BstBI和BamHI酶切，凝胶分离并纯化较小的(约633个碱基对)Tth片段。如上所述将Tth GL NdeI-BamHI插入片段连接到Taq NdeI-BamHI载体内，产生TaqTth(Bs-B)L(DNA序列SEQ ID NO：2679；氨基酸序列SEQID NO：2645)

6.TaqTth(N-Bs)G的构建

Taq DN RX HT构建体用酶NotI和BstBI酶切，如上所述分离较大的载体片段。Tth DN RX HT GL构建体也用NotI和BstBI酶切，凝胶分离并纯化较小的(约162个碱基对)Tth片段。如上所述将TthGL NotI-BstBI插入片段连接到Taq NotI-BstBI载体内，产生TaqTth(N-Bs)G(DNA序列SEQ ID NO：2680；氨基酸序列SEQ IDNO：2646).

7.TthTaq(B-S)GL的构建

Tth DN RX HT构建体用酶BamHI和SaII酶切，如上所述分离较大的载体片段。Taq DN RX HT GL构建体也用BamHI和SalI酶切，凝胶分离并纯化较小的(约741个碱基对)Taq片段。如上所述将TaqBamHI-SalI插入片段连接到Tth GL BamHI-SalI载体内，产生TthTaq(B-S)GL(DNA序列SEQ ID NO：2681；氨基酸序列SEQ IDNO：2647)。

8.TaqTth(D-B)L E404H(DNA序列SEQ IDNO-2684；氨基酸序列SEQ ID NO：2650)的构建

使用诱变引物240-60-01 5′-gag gag gcg ggg cac cgg gcc gcc ctt-3′(SEQ ID NO：277)对pTrc99A TaqTth(D-B)L DNA进行位点特异性诱变，引入E404H突变。

9.TaqTth(D-B)L F413H/A414R(DNA序列SEQ ID NO：2685；氨基酸序列SEQ ID NO：2651)的构建

使用诱变引物240-60-02 5′-ctt tec gag agg ctc cat cgg aac ctg tggggg agg-3′(SEQ ID NO：278)对pTrc99A TaqTth(D-B)L DNA进行位点特异性诱变，引入F413H和A414R突变。

10.TaqTth(D-B)L W417L/G418K(DNA序列SEQ ID NO：2686；氨基酸序列SEQ ID NO：2652)的构建

使用诱变引物240-60-03 5′-ctc ttc gcc aac ctg ctt aag agg ctt gagggg gag-3′(SEQ ID NO：279)对pTrc99A TaqTth(D-B)L DNA进行位点特异性诱变，引入W417L和G418K突变。

11.TaqTth(D-B)L A439R(DNA序列SEQ ID NO：2687；氨基酸序列SEQ ID NO：2653)的构建

使用诱变引物240-60-04 5′-agg ccc ctttoc cgg gtc ctg gcc cat-3′(SEQ ID NO：280)对pTrc99A TaqTth(D-B)DNA进行位点特异性诱变，引入A439R突变。

12.TaqTth(N-D)G L451R(DNA序列SEQ ID NO：2688；氨基酸序列SEQ ID NO：2654)的构建

使用诱变引物240-60-05 5′-acg ggg gtg cgc egg gac gtg gcc tat-3′(SEQ ID NO：281)对pTrc99A TaqTth(N-D)G DNA进行位点特异性诱变，引入L415突变。

13.TaqTth(N-D)G R457Q(DNA序列SEQ ID NO：2689；氨基酸序列SEQ ID NO：2655)的构建

使用诱变引物240-60-06 5′-gtg gcc tat ctc cag gcc ttg tcc ctg-3′(SEQ ID NO：282)对pTrc99A TaqTth(N-D)G DNA进行位点特异性诱变，引入L415Q突变。

14.TaqTth(N-D)G V463L(DNA序列SEQ ID NO：2690；氨基酸序列SEQ ID NO：2656)的构建

使用诱变引物240-60-07 5′-ttgtcc ctg gag ctt gcc gag gag atc-3′(SEQ ID NO：283)对pTrc99A TaqTth(N-D)G DNA进行位点特异性诱变，引入V463L突变。

15.TaqTth(N-D)G A468R(DNA序列SEQ ID NO：2691；氨基酸序列SEQw NO：2657)的构建

使用诱变引物240-60-08 5′-gcc gag gag atc cgc cgc ctc gag gcc-3′(SEQ ID NO：284)对pTrc99A TaqTth(N-D)G DNA进行位点特异性诱变，引入A468R突变。

16.TaqTth(N-D)G A472E(DNA序列SEQ ID NO：2692；氨基酸序列SEQ ID NO：2658)的构建

使用诱变引物240-60-095′-gcc cgc ctc gag gag gag gtc ttc cgc-3′(SEQ ID NO：285)对pTrc99A TaqTth(N-D)G DNA进行位点特异性诱变，引入A472E突变。

17.TaqTth(N-D)G G499R(DNA序列SEQ ID NO：2693；氨基酸序列SEQ ID NO：2659)的构建

使用诱变引物240-60-10 5′-ttt gac gag cta agg ctt ccc gcc atc-3′(SEQ ID NO：286)对pTrc99A TaqTth(N-D)G DNA进行位点特异性诱变，引入G499R突变。

18.TaqTth(N-D)G E507Q(DNA序列SEQ ID NO：2694；氨基酸序列SEQ ID NO：2660)的构建

使用诱变引物276-046-04 5′-atc gcc aag acg caa aag acc ggc aag-3′(SEQ ID NO：287)对pTrc99A TaqTth(N-D)G DNA进行位点特异性诱变，引入E507Q突变。

19.TaqTth(N-D)G Y535H(DNA序列SEQ ID NO：2695；氨基酸序列SEQ ID NO：2661)的构建

使用诱变引物240-60-11 5′-aag ate ctg cag cac egg gag ctc acc-3′(SEQ ID NO：288)对pTrc99A TaqTth(N-D)G DNA进行位点特异性诱变，引入Y535H突变。

20.TaqTth(N-D)G S543N(DNA序列SEQ ID NO：2696；氨基酸序列SEQ ID NO：2662)的构建

使用诱变引物240-60-12 5′-ac，c aag ctg aag aac acc tac att gac-3′(SEQ ID NO：289)对pTrc99A TaqTth(N-D)G DNA进行位点特异性诱变，引入S543N突变。

21.TaqTth(N-D)G I546V(DNA序列SEQ ID NO：2697；氨基酸序列SEQ ID NO：2663)的构建

使用诱变引物240-60-13 5′-aag age acc tac gtg gac ccc ttg ccg-3′(SEQ ID NO：290)对pTrc99A TaqTth(N-D)G DNA进行位点特异性诱变，引入I546V突变。

22.TaqTth(N-D)G D551S/I553V(DNA序列SEQ ID NO：2698；氨基酸序列SEQ ID NO：2664)的构建

使用诱变引物240-60-14 5′-att gac ccc ttg ccg age ctc gtc cac cccagg acgggc-3′(SEQ ID NO：291)对pTrc99A TaqTth(N-D)G DNA进行位点特异性诱变，引入D551S和I553V突变。

23.Tth DN RX HT GL H641A、Tth DN RX HT GL H748A、TthDN RX HT GL H786A的构建

对pTrc99A Tth DN RX HT GL DNA进行位点特异性诱变，使用诱变引物583-001-02：5′-gct tgc ggt ctg ggt ggc gat gtc ctt ccc ctc-3′(SEQ ID NO：294)引入H641A突变(DNA序列SEQ ID NO：2699；氨基酸序列SEQ ID NO：2665)，或者诱变引物583-001-03：5′cat gtt gaa ggccat ggc ctc cgc ggc etc cct-3′(SEQ ID NO：295)产生H748A突变体(DNA序列SEQ ID NO：2700；氨基酸序列SEQ ID NO：2666)，或者诱变引物583-001-04：5′-cag gag gag ctc gtt ggc gac ctg gag gag-3′(SEQID NO：296)，产生H786A突变酶(DNA序列SEQ ID NO：2701；氨基酸序列SEQ ID NO：2667)。

24.Tth DN RX HT GL(H786A/G506K/Q509K)的构建

以如上产生的突变体Tth DN RX HT GL H786A开始，使用诱变引物604-022-02：5′-gga gcg ctt gcc tgt ctt ctt cgt ctt ctt caa ggc gggaggcct-3′(SEQ ID NO：297)进行位点特异性诱变，产生这种被命名为“TthAKK GL”的变体(DNA序列SEQ ID NO：2702；氨基酸序列SEQID NO：2668)。

25.TthDN RX HT H786A随机诱变

为了产生TthDN RX HT H786A GL(SEQ ID NO：2667)酶的螺旋-发夹-螺旋区的突变体，用H786A(SEQ ID NO：2701)作为模板进行两个不同的PCR反应。由上述TthDN GL H786A开始，使用引物604-08-06：5′-gtc gga ggg gtc ccc cac gag-3′(SEQ ID NO：313)和引物390-76-08：5′-tgt gga att gtg agc gg(SEQ ID NO：314)，产生620个碱基对的PCR片段。使用Advantage cDNA PCR试剂盒(Clontech)，按照厂商说明进行PCR反应。该PCR产物包含氨基酸1-194。通过该反应不引入突变，然而，在5’端存在限制酶切位点EcoRI。

以上述TthDN RX HT GL H786A开始，使用诱变引物604-08-05：5′-ctc gtg ggg gac ccctcc gac aac ctc(ccc ggg gtc aag ggc atc ggg gagaag acc gcc)ctc aag ctt ctc aag-3′(SEQ ID NO：315)和引物209-74-02：5′-gtg gcctcc ata tgg gcc agg ac-3′(SEQ ID NO：316)，产生787个碱基对的PCR片段。PCR反应如上所述进行。由于存在诱变引物604-08-05，该片段含有随机突变。合成该引物括号内的碱基，使得91％的序列是野生型的，而其余9％平均分为其余3种碱基。

两种PCR片段重叠，在重组PCR反应中组合。加入引物390-76-08和209-74-02，再次按照厂商说明使用Advantage cDNA PCR试剂盒(Clontech)。该反应产生1390个碱基对的产物。

按照厂商说明，重组PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，产生986个碱基对的片段。TthDN RX HT GL H786A通过用相同的酶酶切制备。然后将该片段连接到载体内，转化JM109细胞。这组反应产生的新突变体包括：

TthDN RX HT GL H786A/P197R/K200R(DNA序列SEQ IDNO：2703；氨基酸序列SEQ ID NO：2669)。

TthDN RX HT GL H786A/K205Y(DNA序列SEQ ID NO：2704；氨基酸序列SEQ ID NO：2670)。

TthDN RX HT GL H786A/G203R(DNA序列SEQ ID NO：2705；氨基酸序列SEQ ID NO：2671)。

26.TaqTthAKK GL(DNA序列SEQ ID NO：2706；氨基酸序列SEQ ID NO：2672)的构建

通过用限制性内切核酸酶EcoRI和NotI酶切Tth DN RX HT GL(H786A/G506K/Q509K)(SEQ ID NO：2702；在此缩写为TthAKK GL)和Taq 4M G504(SEQ ID NO：108；在此缩写为Taq5M)，产生嵌合突变体TaqTthAKK GL。Taq 5M的较小插入片段和Tth AKK GL的较大载体片段如实施例3D所述凝胶纯化，这些插入片段如实施例3D所述连接。构建体序列的筛选和证实也如实施例3D所述进行。

27.TfiTth AKK GL(DNA序列SEQ ID NO：2707；氨基酸序列SEQ ID NO：2673)、TscTthAKK GL(DNA序列SEQ ID NO：2708；氨基酸序列SEQ ID NO：2674)的构建

为了产生TthAKK GL(SEQ ID NO：2702)与Tfi DN 2M(SEQ IDNO：130)或Tsc DN 2M(SEQ ID NO：131)的嵌合酶，Tth DN RX HTGL(H786A/G506K/Q509K)DNA(SEQ ID NO：2702)用EcoRI和NotI酶切，较大的载体片段如上所述凝胶分离。Tfi和Tsc的993个碱基对的EcoRI-NotI片段如实施例8所述制备。如实施例3D所述进行连接，以及新构建体的筛选和证实。

28.TthAKK GL(P195A)和TthAKK GL(P195K)的构建

为了在TthAKK GL构建体的核酸酶域的氨基酸位点195处引入突变(P195A或P195K)，在PCR反应中使用诱变引物785-073-01(P195A)5′-ccc-tcc-gac-aac-ctc-gcc-ggg-gtc-aag-ggc-atc-3′(SEQ IDNO：370)或785-073-02(P195K)5′-ccc-tcc-gac-aac-ctc-aag-ggg-gtc-aag-ggc-atc-3′(SEQ ID NO：371)和引物209-074-02：5′-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3′(SEQ IDNO：316)，产生787个碱基对的片段。另外一种PCR片段在使用相同模板的反应中用引物390-076-08 5′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQ IDNO：314)和785-073-035′-gag-gtt-gtc-gga-ggg-gtc-3′(SEQ ID NO：372)获得。

两种PCR片段重叠，在重组PCR反应中组合。加入外部引物390-076-08和209-074-02，按照厂商说明使用Advantage cDNA PCR试剂盒(Clontech)。该反应产生1380个碱基对的产物。

重组PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，产生986个碱基对的片段。TthAKK GL构建体通过用相同的酶酶切制备。然后将该片段连接到载体中，转化JM109细胞。这组反应产生的新突变体包括：TthAKK GL(P195A)(DNA序列SEQ ID NO：2721；氨基酸序列SEQ ID NO：2722)和TthAKK GL(P195K)(DNA序列SEQ IDNO：723；氨基酸序列SEQ ID NO：2724)。

29.TthAKK GL(N417K/L418K)的构建

利用相同的方法构建TthAKK GL(N417K/L418K)。用下列诱变引物产生两种重叠的PCR片段：785-73-075′-gag-agg-ctc-cat-cgg-aag-aag-ctt-aag-cgc-ctc-gag-3′(SEQ IDNO：377)和700-10-035′-ctt-ctc-tca-tcc-gcc-aaa-aca-gcc-3′(SEQ IDNO：343)，以及引物158-084-015′-ctc-ctc-cac-gag-ttc-ggc-3′(SEQ IDNO：310)和785-73-085′-ccg-atg-gag-cct-ctc-cga-3′(SEQ ID NO：378)。组合这两种产物，用外部引物700-10-03和158-084-01扩增。重组PCR产物用限制性内切酶NotI和BamHI酶切，连接到预先用NotI/BamHI酶切的TthAKK GL构建体内。该突变体被命名为TthAKK GL(N417K/L418K)(DNA序列SEQ ID NO：2725；氨基酸序列SEQ IDNO：2726)。

30.TthAKK GL(P255L)的构建

使用诱变引物886-049-05和886-049-06：5′-gtg-cgc-acc-gac-ctc-ctc-ctg-gag-gtg-gac-ctc-3′(SEQ ID NO：381)、5′-gag-gtc-cac-ctc-cag-gag-gag-gtc-ggt-gcg-cac-3′(SEQ ID NO：382)对TthAKK GL构建体进行位点特异性诱变，产生TthAKK GL(P255L)(DNA序列SEQ ID NO：2727；氨基酸序列SEQ ID NO：2728)。

31.TthAKK GL(F311Y)的构建

使用诱变引物886-049-09和886-049-10：5′-ggg-gcc-ttc-gtg-ggc-tac-gtc-ctc-tcc-cgc-ccc-3′(SEQ ID NO：P385)、5′-ggg-gog-gga-gag-gac-gta-gcc-cac-gaa-ggc-ccc-3′(SEQ ID NO：386)对TthAKK GL构建体进行位点特异性诱变，产生TthAKK GL(F311Y)(DNA序列SEQ ID NO：2729；氨基酸序列SEQ ID NO：2730)。

32.TthAKK GL(N221H/R224Q)的构建

使用诱变引物886-049-01和886-049-02：5′-gaa-aac-ctc-ctc-aag-cac-ctg-gac-cag-gta-aag-cca-gaa-aac-3′(SEQ IDNO：389)、5′-gtt-ttc-tgg-ctt-tac-ctg-gtc-cag-gtg-ctt-gag-gag-gtt-ttc-3′(SEQ ID NO：390)对TthAKK GL构建体进行位点特异性诱变，产生TthAKK GL(N221H/R224Q)(DNA序列SEQ ID NO：2731；氨基酸序列SEQ ID NO：2732)。

33.TthAKK GL(R251H)的构建

使用诱变引物886-049-03和886-049-04：5′-gag-ctc-tcc-cgg-gtg-cac-acc-gac-ctc-ccc-ctg-3′(SEQ IDNO：393)，5′-cag-ggg-gag-gtc-ggt-gtg-cac-ccg-gga-gag-ctc-3′(SEQ IDNO：394)对TthAKK GL构建体进行位点特异性诱变，产生TthAKKGL(R251H)(DNA序列SEQ ID NO：2733；氨基酸序列SEQ IDNO：2734)。

34.TthAKK GL(P255L/R251H)的构建

使用诱变引物886-088-01和886-088-02：5′-gag-ctc-tcc-cgg-gtg-cac-acc-gac-ctc-ctc-ctg-3′(SEQ ID NO：397)，5′-cag-gag-gag-gtc-ggt-gtg-cac-ccg-gga-gag-ctc-3′(SEQ ID NO：398)对TthAKK GL(P255L)构建体进行位点特异性诱变，产生TthAKK GL(P255L/R251H)(DNA序列SEQ ID NO：2735；氨基酸序列SEQ IDNO：2736)。

35.Tth AKK GL L429V(DNA序列SEQ ID NO：2737；氨基酸序列SEQ ID NO：2738)的构建

使用诱变引物680-79-025′-ctc cat cgg aac etc ctt [aag cgc etc gagggg gag gag aag ctc ctt tgg]ctc tac cac gag gtg-3′(SEQ ID NO：403)和反向引物680-79-045′-AAG GAG GTT CCG ATG GAG-3′(SEQ IDNO：404)对TthAKK GL构建体进行手掌区随机诱变，在手掌区中引入随机突变。括号表示91％的所示碱基和3％的其它全部碱基的合成。

36.Tth AKK GL E425V(DNA序列SEQ ID NO：2739；氨基酸序列SEQ ID NO：2740)的构建

使用诱变引物680-79-025′-ctc cat egg aac ctc ctt[aag cgc ctc gagggg gag gag aag ctc ctt tgg]ctc tac cac gag gtg-3′(SEQ ID NO：403)和反向引物680-79-045′-AAG GAG GTT CCG ATG GAG-3′(SEQ IDNO：404)对TthAKK GL构建体进行手掌区随机诱变，在手掌区中引入随机突变。括号表示91％的所示碱基和3％的其它全部碱基的合成。

37.Tth AKK GL L422N/E425K(DNA序列SEQ ID NO：2741；氨基酸序列SEQ ID NO：2742)的构建

38.Tth AKK GL L422F/W430C(DNA序列SEQ ID NO：2743；氨基酸序列SEQ ID NO：2744)的构建

使用诱变引物680-79-025′-ctc cat egg aac ctc ctt [aag cgc ctc gagggg gag gag aag etc ctt tgg]ctc tac cac gaggtg-3′(SEQ ID NO：403)和反向引物680-79-045′-AAG GAG GTT CCG ATG GAG-3′(SEQ IDNO：404)对TthAKK GL构建体进行手掌区随机诱变，在手掌区中引入随机突变。括号表示91％的所示碱基和3％的其它全部碱基的合成。

39.Tth AKK GL A504F(DNA序列SEQ ID NO：2745；氨基酸序列SEQ ID NO：2746)的构建

使用诱变引物680-80-03 5′-cag gag ctt agg ctt ccc nnn ttg aag aagacg aag aag aca-3′(SEQ ID NO：413)和反向引物680-80-06 5′-cct aagctc gtc aaa gag-3′(SEQ ID NO：414)对TthAKK GL构建体进行位点饱和诱变，向A504氨基酸中引入随机突变。

40.Tth AKK GL A504V(DNA序列SEQ ID NO：2747；氨基酸序列SEQ ID NO：2748)的构建

41.Tth AKK GL A504S(DNA序列SEQ ID NO：2749；氨基酸序列SEQ ID NO：2750)的构建

42.Tth AKK GL S517G(DNA序列SEQ ID NO：2751；氨基酸序列SEQ ID NO：2752)的构建

使用诱变引物680-80-07 5′-GGC AAG CGC TCC ACC NNNGCC GCG GTG CTG GAG GCC CTA CGG-3′(SEQ ID NO：421)和反向引物680-80-10 5′-GGT GGA GCG CTT GCC-3′(SEQ IDNO：422)对TthAKK GL构建体进行位点饱和诱变，向A504氨基酸中引入随机突变。

43.Tth AKK GL A518L(DNA序列SEQ ID NO：2753；氨基酸序列SEQ ID NO：2754)的构建

使用诱变引物680-80-07 5′-GGC AAG CGC TCC ACC AGCNNN GCG GTG CTG GAG GCC CTA CGG-3′(SEQ ID NO：425)和反向引物680-80-10 5′-GGT GGA GCG CTT GCC-3′(SEQ IDNO：422)对TthAKK GL构建体进行位点饱和诱变，向A518氨基酸中引入随机突变。

44.Tth AKK GL A518R(DNA序列SEQ ID NO：2755；氨基酸序列SEQ ID NO：2756)的构建

使用诱变引物68Q-80-07 5′-GGC AAG CGC TCC ACC AGCNNN GCG GTG CTG GAG GCC CTA CGG-3′(SEQ ID NO：425)和反向引物680-80-105′-ggt gga gcg ctt gcc-3′(SEQ ID NO：422)对TthAKK GL构建体进行位点饱和诱变，向A518氨基酸中引入随机突变。

45.Tth AKK GL A504K(DNA序列SEQ ID NO：2757；氨基酸序列SEQ ID NO：2758)的构建

使用诱变引物680-69-045′-ctt agg ctt ccc aag ttg aag aag acg aagaag aca-3′(SEQ IDNO：433)和反向引物680-69-05 5′-tgt ctt ctt cgt cttctt caa ctt ggg aag cct aag-3′(SEQ ID NO：434)对Tth AKK GL构建体进行定点诱变，向Tth AKK GL酶中引入A504K突变。

46.Tth AKK GL H641A(DNA序列SEQ ID NO：2759；氨基酸序列SEQ ID NO：2760)的构建

使用诱变引物680-69-08 5′-gag ggg aag gac atc gcc acc cag accgca agc-3′(SEQ ID NO：437)和反向引物583-01-02 5′-gct tgc ggt ctgggt ggc gat gtc ctt ccc ctc-3′(SEQ ID NO：438)对Tth AKK GL构建体进行定点诱变，向Tth AKK GL酶中引入H641A突变。

47.Tth AKK GL T508P(DNA序列SEQ ID NO：2761；氨基酸序列SEQ ID NO：2762)的构建

使用诱变引物680-70-01 5′-ccc-gcc ttg aag aag ccg aag aag acaggc aag-3′(SEQ ID NO：441)和反向引物680-70-025′-ctt gcc tgt ctt cttcgg ctt ctt caa ggc ggg-3′(SEQ ID NO：442)对TthAKK GL构建体进行定点诱变，向Tth AKK GL酶中引入T508P突变。

48.Taq(FT)TthAKK GL的构建

使用诱变引物473-087-05：5′-cgg-gac-ctc-gag-gcg-cgt-gaa-ccc-cag-gag-gtc-cac-3′(SEQ ID NO：483)对TaqTthAKK GL构建体进行位点特异性诱变，引入L107F/A108T突变，产生Taq(FT)TthAKKGL(DNA序列SEQ ID NO：2779；氨基酸序列SEQ ID NO：2780)。

49.Tfi(FT)TthAKK GL的构建

使用诱变引物785-096-01：5′-gtg-gac-ctt-ctg-ggc-ttt-acc-cgc-ctc-gag-gcc-ccg-3′(SEQ ID NO：486)和785-096-02：5′-cgg-ggc-ctc-gag-gcg-ggt-aaa-gcc-cag-aag-gtc-cac-3′(SEQ ID NO：487)对TfiTthAKKGL构建体进行位点特异性诱变，引入L107F/V108T突变，产生Tfi(FT)TthAKK GL(DNA序列SEQ ID NO：2720；氨基酸序列SEQ IDNO：2781)。

50.Tsc(FT)TthAKK GL的构建

使用诱变引物785-008-035′-ttt-acc-cgc-ctc-gag-gtg-ccg-ggc-3′(SEQ ID NO：489)和反向引物680-21-035′-cgg cac ctc gag gcg ggt aaagcc caa aag gtc cac-3′(SEQ ID NO：490)对TscTthAKK GL构建体进行位点特异性诱变，引入L107F/E108T突变，产生Tsc(FT)TthAKKGL(DNA序列SEQ ID NO：2764；氨基酸序列SEQ ID NO：2782)。

51.TthAKK GL酶与α肽的融合

构建TthAKKGL-lacZ-α肽嵌合融合体，以便能够根据菌落蓝白筛选检测使全长融合蛋白不能表达的突变(包括移码、缺失、插入等)(Wu等人，Nucleic Acids Research，24：1710[1996])。

使用诱变引物959-041-03，5′-cac-cac-cac-cac-cac-cac-gtc-gac-tag-tgc-tag-cgt-cga-cta-gct-gca-ggc-atg-caa-gct-tgg-c-3′(SEQ IDNO：477)和959-041-04，5′-gcc-aag-ctt-gca-tgc-ctg-cag-cta-gtc-gac-gct-agc-act-agt-cga-cgt-ggt-ggt-ggt-ggt-ggt-g-3′(SEQ IDNO：478)，对TthAKK DNA进行位点特异性诱变，产生pTthAKKGL-L，该产物为了插入lacZα肽，在TthAKK GL的C端6×His尾之后含有SalI位点。首先使用引物959-041-01，5′-cag-gaa-gcg-gcc-gcg-tcg-aca-tga-cca-tga-tta-cgc-caa-gc-3′(SEQ IDNO：479)和959-093-01，5′-ggg-ccc-gcc-agg-gtc-gac-tca-ggg-cga-tgg-ccc-act-acg-tga-3′(SEQ ID NO：480)，由pCRII-TOPO载体(Invitrogen)扩增(201个氨基酸的)α肽。然后用限制性内切酶SalI消化PCR产物，连接到也用相同酶酶切的pTthAKK GL-L载体内，产生嵌合构建体TthAKK GL-α肽(DNA序列SEQ ID NO：2777；氨基酸序列SEQ ID NO：2778)。插入方向通过测序证实。

52.TaqEFT-Tth(AKK)GL(DNA序列SEQ ID NO：2790；氨基酸序列SEQ ID NO：2791)的构建

使用诱变引物436-013-08：5′-atc-gtg-gtc-ttt-gac-gcc-gag-gcc-ccc-tcc-ttc-c-3′(SEQ ID NO：503)和436-013-09 5′-gga-agg-agg-ggg-cct-cgg-cgt-caa-aga-cca-cga-t-3′(SEQ ID NO：504)对Taq(FT)-Tth(AKK)GL DNA(SEQ ID NO：2779)进行位点特异性诱变，引入K70E突变。

53.TaqEFT-Tth(AKK)GL-A/M1(DNA序列SEQ ID NO：2792；氨基酸序列SEQ ID NO：2793)的构建

使用诱变引物1044-038-01：5′-cag-acc-atg-aat-tcg-gag-gcg-atg-ctg-ccc-ctc-ttt-3′(SEQ ID NO：507)和1044-038-02：(SEQ ID NO：508)

5′-aaa-gag-ggg-cag-cat-cgc-ctc-cga-att-cat-ggt-ctg-3′对Taq(EFT)-Tth(AKK)GL DNA(SEQ ID NO：2790)进行位点特异性诱变，引入G4EA突变。

54.TaqEFT-Tth(AKK)GL-B/M2(DNA序列SEQ ID NO：2794；氨基酸序列SEQ ID NO：2795)的构建

使用诱变引物1044-038-03：5′-gcc-tac-cgc-acc-ttc-ttt-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-3’和1044-038-04：5′-gag-gcc-ctt-cag-ggc-aaa-gaa-ggt-gcg-gta-ggc-3′(分别为SEQ ID NO：511和512)对Taq(EFT)-Tth(AKK)GL DNA(SEQ ID NO：2790)进行位点特异性诱变，引入H29F突变。

55.TaqEFT-Tth(AKK)GL-C/M3(DNA序列SEQ ID NO：2796；氨基酸序列SEQ ID NO：2797)的构建

使用诱变引物1044-038-05：5′-ctc-ctc-aag-gcc-ctc-aga-gag-gac-ggg-gac-gcg-3′和1044-038-06：5′-cgc-gtc-ccc-gtc-ctc-tct-gag-ggc-ctt-gag-gag-3′(分别为SEQ ID NO：515和516)对Taq(EFT)-Tth(AKK)GL DNA(SEQ ID NO：2790)进行位点特异性诱变，引入K57R突变。

56.TaqEFT-Tth(AKK)GL-D/M5(DNA序列SEQ ID NO：2798；氨基酸序列SEQ ID NO：2799)的构建

使用诱变引物1044-038-09：5′-gac-gac-gtc-ctg-gcc-acc-ctg-gcc-aag-aag-gcg-3′和1044-038-10：5′-cgc-ctt-ctt-ggc-cag-ggt-ggc-cag-gac-gtc-gtc-3′(分别为SEQ ID NO：519和520)对Taq(EFT)-Tth(AKK)GL DNA(SEQ ID NO：2790)进行位点特异性诱变，引入S125T突变。

57.TaqEFT-Tth(AKK)GL-E/M6(DNA序列SEQ ID NO：2800；氨基酸序列SEQ ID NO：2801)的构建

使用诱变引物1044-038-11：5′-ggg-gag-aag-acg-gcg-ctc-aag-ctt-ctg-gag-gag-3′和1044-038-12：5′-ctc-ctc-cag-aag-ctt-gag-cgc-cgt-ctt-ctc-ccc-3′(分别为SEQ ID NO：523和524)对Taq(EFT)-Tth(AKK)GL DNA(SEQ ID NO：2790)进行位点特异性诱变，引入R206L突变。

58.TaqEFT-Tth(AKK)GL-F/M7(DNA序列SEQ ID NO：2802；氨基酸序列SEQ ID NO：2803)的构建

使用诱变引物1044-038-13：5′-gag-ccc-gac-cgg-gag-ggg-ctt-aag-gcc-ttt-ctg-gag-agg-3′和1044-038-14：5′-cct-ctc-cag-aaa-ggc-ctt-aag-ccc-ctc-ccg-gtc-ggg-ctc-3(分别为SEQ ID NO：527和528)对Taq(EFT)-Tth(AKK)GL DNA(SEQ ID NO：2790)进行位点特异性诱变，引入R269G和R271K突变。

59.TaqEFT-Tth(AKK)GL-G/M8(DNA序列SEQ ID NO：2804；氨基酸序列SEQ ID NO：2805)的构建

使用诱变引物1044-038-15：5′-cac-gag-ttc-ggc-ctt-ctg-gga-ggg-gag-aag-ccc-cgg-gag-gag-gcc-ccc-tgg-ccc-3′和1044-038-16：5′-ggg-cca-ggg-ggc-ctc-ctc-ccg-ggg-ctt-ctc-ccc-tcc-cag-aag-gcc-gaa-ctc-gtg-3′(分别为SEQ ID NO：531和532)对Taq(EFT)-Tth(AKK)GLDNA(SEQ ID NO：2790)进行位点特异性诱变，引入E290G、S291G、P292E、A294P和L295R突变。

60.TaqEFT-Tth(AKK)GL-H/M9(DNA序列SEQ IDNO-2806；氨基酸序列SEQ ID NO：2807)的构建

使用诱变引物1044-038-17：5′-ctg-gcc-ctg-goc-goc-tgc-agg-ggc-ggc-cgc-gtg-3′和1044-038-18：5′-cac-gcg-gcc-gcc-cct-gca-ggc-ggc-cag-ggc-cag-3′(分别为SEQ ID NO：535和536)对Taq(EFT)-Tth(AKK)GL DNA(SEQ ID NO：2790)进行位点特异性诱变，引入A328C突变。

61.TaqEFT-Tth(AKK)GL-I/M10(DNA序列SEQ ID NO：2808；氨基酸序列SEQ ID NO：2809)的构建

使用诱变引物1080-015-01(SEQ ID NO：539)5′-ggg gag aag acggcg agg aag ctt ctg aag gag tgg ggg agc-3′和1080-015-02(SEQ IDNO：540)5′-gct ccc cca ctc ctt cag aag ctt cct cgc cgt ctt ctc ccc-3′对Taq(EFT)-Tth(AKK)GL DNA(SEQ ID NO：2790)进行位点特异性诱变，引入E210K突变。

62.TaqEFT-Tth(AKK)GL-M1-9(DNA序列SEQ ID NO：2810；氨基酸序列SEQ ID NO：2811)的构建

使用构建体TaqEFT-Tth(AKK)GL(SEQ ID：2790)作为模板进行7个独立的PCR反应，其中使用下列诱变引物对：PCR反应1；1044-038-015′-cag-acc-atg-aat-tcg-gag-gcg-atg-ctg-ccc-ctc-ttt-3′(SEQID NO：507)和1044-038-045′-gag-gcc-ctt-cag-ggc-aaa-gaa-ggt-gcg-gta-ggc-3′(SEQ ID NO：512)，产生108个碱基对的片段，PCR反应2；1044-038-035′-gcc-tac-cgc-acc-ttc-ttt-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-3′(SEQ ID NO：511)和1044-038-065′-cgc-gtc-ccc-gtc-ctc-tct-gag-ggc-ctt-gag-gag-3′(SEQ ID NO：516)，产生117个碱基对的片段，PCR反应3；1044-038-055′-ctc-ctc-aag-gcc-ctc-aga-gag-gac-ggg-gac-gcg-3′(SEQ ID NO：515)和1044-038-105′-cgc-ctt-ctt-ggc-cag-ggt-ggc-cag-gac-gtc-gtc-3′(SEQ ID NO：520)，产生237个碱基对的片段，PCR反应4；1044-038-095′-gac-gac-gtc-ctg-gcc-acc-ctg-gcc-aag-aag-gcg-3′(SEQ ID NO：519)和1044-038-125′-ctc-ctc-cag-aag-ctt-gag-cgc-cgt-ctt-ctc-ccc-3′(SEQ ID NO：524)，产生276个碱基对的片段，PCR反应5；1044-038-115′-ggg-gag-aag-acg-gcg-ctc-aag-ctt-ctg-gag-gag-3′(SEQ ID NO：523)和1044-038-145′-cct-ctc-cag-aaa-ggc-ctt-aag-ccc-ctc-ccg-gtc-ggg-ctc-3′(SEQ ID NO：528)，产生228个碱基对的片段，PCR反应6；1044-038-135′-gag-ccc-gac-cgg-gag-ggg-ctt-aag-gcc-ttt-ctg-gag-agg-3′(SEQ ID NO：527)和1044-038-16 5′-ggg-cca-ggg-ggc-ctc-ctc-ccg-ggg-ctt-ctc-ccc-tcc-cag-aag-gcc-gaa-ctc-gtg-3′(SEQ IDNO：532)，产生113个碱基对的片段，PCR反应7；1044-038-155′-cac-gag-ttc-ggc-ctt-ctg-gga-ggg-gag-aag-ccc-cgg-gag-gag-gcc-ccc-tgg-ccc-3′(SEQ ID NO：531)和1044-038-185′-cac-gcg-gcc-gcc-cct-gca-ggc-ggc-cag-ggc-cag-3′(SEQ ID NO：536)，产生157个碱基对的片段。这7种PCR产物重叠，因此在不使用引物时，PCR扩增产生适当的1005个碱基对的产物，引入K70E、G4EA、H29F、K57R、S125T、R206L、R269G、R271K、E290G、S291G、P292E、A294P、L295R和A328C突变。该产物用下列外部引物进一步扩增：1044-038-1(SEQ ID NO：507)和1044-038-18(SEQ IDNO：536)，克隆到pPCR-Script-Amp内。使用下列引物由该构建体再次扩增核酸酶域：1044-038-1(SEQ ID NO：507)和1044-038-18(SEQID NO：536)，并用EcoRI和NotI消化。将消化的PCR产物连接到EcoRI和NotI消化的TaqEFT-Tth(AKK)构建体内，转化JM109进行蛋白质表达和筛选。

63.TaqEFT-Tth(AKK)GL-M1-10(DNA序列SEQ ID NO：2812；氨基酸序列SEQ ID NO：2813)的构建

用构建体TaqEFT-Tth(AKK)GL(SEQ ID：501)作为模板进行7个独立的PCR反应，其中使用下列诱变引物对：PCR反应1；1044-038-01 5′-cag-acc-atg-aat-tcg-gag-gcg-atg-ctg-ccc-ctc-ttt-3′(SEQID NO：507)和1044-038-04 5′-gag-gcc-ctt-cag-ggc-aaa-gaa-ggt-gcg-gta-ggc-3′(SEQ ID NO：512)，产生108个碱基对的片段，PCR反应2；1044-038-03 5′-gcc-tac-cgc-acc-ttc-ttt-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-3″(SEQ ID NO：511)和1044-038-06 5′-cgc-gtc-ccc-gtc-ctc-tct-gag-ggc-ctt-gag-gag-3′(SEQ ID NO：516)，产生117个碱基对的片段，PCR反应3；1044-038-05 5′-ctc-ctc-aag-gcc-ctc-aga-gag-gac-ggg-gac-gcg-3′(SEQ ID NO：515)和1044-038-10 5′-cgc-ctt-ctt-ggc-cag-ggt-ggc-cag-gac-gtc-gtc-3′(SEQ ID NO：520)，产生237个碱基对的片段，PCR反应4；1044-038-09 5′-gac-gac-gtc-ctg-gcc-acc-ctg-gcc-aag-aag-gcg-3′(SEQ ID NO：519)和1080-42-02 5′-gc ttc cag gotccc cca ctc ctt cag aag ctt gag cgc cgt ctt ctc ccc-3′(SEQ ID NO：546)，产生299个碱基对的片段，PCR反应5；1080-42-01 5′-ggg gag aag acggcg ctc agg ctt ctg aag gag tgg ggg agc ctg gaa gc-3′(SEQ ID NO：545)和1044-038-14 5′-cct-ctc-cag-aaa-ggc-ctt-aag-ccc-ctc-ccg-gtc-ggg-ctc-3′(SEQ ID NO：528)，产生228个碱基对的片段，PCR反应6；1044-038-13 5′-gag-ccc-gac-cgg-gag-ggg-ctt-aag-gcc-ttt-ctg-gag-agg-3′(SEQ ID NO：527)和1044-038-16 5′-ggg-cca-ggg-ggc-ctc-ctc-ccg-ggg-ctt-ctc-ccc-tcc-cag-aag-gcc-gaa-ctc-gtg-3′(SEQ ID NO：532)，产生113个碱基对的片段，PCR反应7；1044-038-155′-cac-gag-ttc-ggc-ctt-ctg-gga-ggg-gag-aag-ccc-cgg-gag-gag-gcc-ccc-tgg-ccc-3′(SEQ IDNO：531)和1044-038-185′-cac-gcg-gcc-gcc-cct-gca-ggc-ggc-cag-ggc-cag-3′(SEQ ID NO：536)，产生157个碱基对的片段。7种PCR产物重叠，因此在不使用引物时，PCR扩增产生适当的1005个碱基对的产物，引入K70E、G4EA、H29F、K57R、S125T、R206L、R269G、R271K、E290G、S291G、P292E、A294P、L295R和A328C突变。该产物用下列外部引物进一步扩增：1044-038-1(SEQ ID NO：507)和1044-038-18(SEQ ID NO：536)，克隆到pPCR-Script-Amp内。使用下列引物由该构建体再次扩增核酸酶域：1044-038-1(SEQ ID NO：507)和1044-038-18(SEQ ID NO：536)，并用EcoRI和NotI消化。将消化的PCR产物连接到EcoRI和NotI消化的TaqEFT-Tth(AKK)GL构建体内，转化JM109进行蛋白质表达和筛选。

64.Tth(K69E)AKK、Taq(K69E)TthAKK、Tfi(K69E)TthAKK和Tsc(K69E)TthAKK和突变体的构建

使用诱变引物5′-atc-gtg-gtc-ttt-gac-gcc-gag-gcc-ccc-tcc-ttc-c-3′(SEQ ID NO：492)和5′-gga-agg-agg-ggg-cct-cgg-cgt-caa-aga-cca-cga-t-3′(SEQ ID NO：493)对TthAKK GL、TaqTthAKK GL、TfiTthAKKGL和TscTthAKK GL DNA进行位点特异性诱变，引入K69E突变，产生Tth(K69E)AKK GL(DNA序列SEQ ID NO：2763；氨基酸序列SEQ ID NO：2783)、Taq(K69E)ThAKK GL(DNA序列SEQ IDNO：2784；氨基酸序列SEQ ID NO：2785)、Tfi(K69E)TthAKK GL(DNA序列SEQ ID NO：2786；氨基酸序列SEQ ID NO：2787)和Tsc(K69E)TthAKK GL(DNA序列SEQ ID NO：2788；氨基酸序列SEQID NO：2789)突变酶。

65.Tsc(167-334)TthAKK GL的构建

使用引物390-76-08：5′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQ ID NO：314)和1044-041-01：5′-ctt-ctc-tca-tcc-gcc-aaa-aca-gcc-3′(SEQ ID NO：451)以及模板(K69E)AKK GL(DNA序列SEQ ID NO：2763)，引物1044-041-02：5′-ctc-ctc-cac-gag-ttc-ggc-3′(SEQ ID NO：453)和209-074-02：5′-gtg-gcc-tqc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3′(SEQ ID NO：316)以及模板Tsc(K69E)TthAKK GL(DNA序列SEQ ID NO：2764)，产生两种重叠的PCR片段。组合这两种产物，用外部引物390-76-08和209-074-02扩增。重组PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，连接到用相同酶酶切制备的载体TthAKK GL内，产生Tsc(167-333)TthAKK GL构建体(DNA序列SEQ ID NO：2765；氨基酸序列SEQ ID NO：2766)。

66.Tsc(222-334)TthAKK GL的构建

使用引物390-76-08：5′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQ ID NO：314)和1044-041-03：5′-ttc-cag-gtg-ctt-gag-gag-gtt-ttc-cag-3′(SEQ IDNO：457)以及模板Tth(K69E)AKK GL(DNA序列SEQ ID NO：2763)，和引物1044-041-04：5′-ctc-ctc-aag-cac-ctg-gaa-cag-gtg-aaa-3′(SEQ IDNO：458)和209-074-02：5′-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3′(SEQ IDNO：316)以及模板Tsc(K69E)TthAKK GL(DNA序列SEQ IDNO：2764)，产生两种重叠的PCR片段。组合这两种产物，用外部引物390-76-08和209-074-02扩增。重组PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，连接到用相同酶酶切制备的载体TthAKK GL内，产生Tsc(222-334)TthAKK GL构建体(DNA序列SEQ ID NO：2767；氨基酸序列SEQ ID NO：2768)。

67.Tfi(222-334)TthAKK GL的构建

使用引物390-76-08：5′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQ ID NO：314)和1044-041-05：5′-gtc-cag-gtt-ctt-gag-gag-gtt-ttc-cag-3′(SEQ IDNO：461)以及模板Tth(K69E)AKK GL(DNA序列SEQ ID NO：2763)，引物1044-058-06：5′-ctc-ctc-aag-aac-ctg-gac-cgg-gta-aag-3′(SEQ IDNO：462)和209-074-02：5′-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3′(SEQ IDNO：316)以及模板Tfi(K69E)TthAKK GL(DNA序列SEQ IDNO：2786)，产生两种重叠的PCR片段。组合这两种产物，用外部引物390-76-08和209-074-02扩增。重组PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，连接到用相同酶酶切制备的载体TthAKK GL内，产生Tfi(222-334)TthAKK GL构建体(DNA序列SEQ ID NO：2769；氨基酸序列SEQ ID NO：2770)。

68.Tfi(167-334)TthAKK GL的构建

使用引物390-76-08：5′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQID NO：314)和1044-041-07：5′-gac-gtc-ctt-cgg-ggt-gat-gag-gtg-gcc-3′(SEQ IDNO：465)以及模板Tth(K69E)AKK GL(DNA序列SEQ ID NO：2763)，引物1044-058-085′-atc-acc-ccg-aag-gac-gtc-cag-gag-aag-3′(SEQ IDNO：466)和209-074-02 5′-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3′(SEQ IDNO：316)以及模板Tfi(K69E)TthAKK GL(DNA序列SEQ IDNO：2787)，产生两种重叠的PCR片段。组合这两种产物，用外部引物390-76-08和209-074-02扩增。重组PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，连接到用相同酶酶切制备的载体TthAKK GL内，产生Tfi(167-333)TthAKK GL构建体(DNA序列SEQ ID NO：2771；氨基酸序列SEQ ID NO：2772)。

69.Tsc(111-334)TthAKK GL的构建

使用引物390-76-08 5′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQ ID NO：314)和1044-058-01 5′-ctc-gag-gcg-ggt-aaa-ccc-cag-gag-gtc-3′(SEQ IDNO：469)以及模板Tth(K69E)AKK GL(DNA序列SEQ ID NO：2763)，和引物1044-058-02 5′-ggg-ttt-acc-cgc-ctc-gag-gtg-ccc-ggc-3′(SEQ IDNO：470)和209-074-02 5′-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3′(SEQ IDNO：316)以及模板Tsc(K69E)TthAKK GL(DNA序列SEQ IDNO：2788)，产生两种重叠的PCR片段。组合这两种产物，用外部引物390-76-08和209-074-02扩增。重组PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，连接到用相同酶酶切制备的载体TthAKK GL内，产生Tsc(167-333)TthAKK GL构建体(DNA序列SEQ ID NO：2773；氨基酸序列SEQ ID NO：2774)。

70.Tsc(1-167)TthAKK GL的构建

使用引物390-76-085′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQ ID NO：314)和1044-041-03 5′-aag-cca-ctc-cgg-ggt-gat-cag-gta-acc-3′(SEQ IDNO：473)以及模板Tsc(K69E)TthAKK GL(DNA序列SEQ IDNO：2788)，和引物1044-058-045′-atc-acc-ccg-gag-tgg-ctt-tgg-gag-aag-3′(SEQ ID NO：474)和209-074-025′-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3′(SEQ ID NO：316)以及模板Tth(K69E)AKK GL(DNA序列SEQ ID NO：2763)，产生两种重叠的PCR片段。组合这两种产物，用外部引物390-76-08和209-074-02扩增。重组PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，连接到用相同酶酶切制备的载体TthAKK GL内，产生Tsc(1-167)TthAKK GL构建体(DNA序列SEQ ID NO：2775；氨基酸序列SEQ ID NO：2776)。

71.Afu336-Tth296(AKK)GL，AT1-1的构建

产生两种重叠的PCR片段。第一种片段的制备以AfuFEN构建体(SEQ ID NO：556)为模板，使用引物：390-076-085′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQ ID NO：314)和390-065-055′-gaa-cca-cct-ctc-aag-cgt-gg-3′(SEQ ID NO：554)。第二种片段的制备以TthAKK GL(SEQ ID NO：2702)为模板，使用引物：700-049-015′-acg-ctt-gag-agg-tggttc-ctg-gag-gag-gcc-ccc-tgg-3′(SEQ ID NO：555)和390-076-095′-taa-tct-gta-tca-ggc-tg-3′(SEQ ID NO：557)。这两种产物含有一个序列重叠区，组合并在重组PCR反应中使用外部引物390-076-08和390-076-09扩增。重组PCR产物用限制性内切酶BspEI和SalI酶切，连接到用相同酶酶切制备的AfuFEN构建体内，产生Afu336-Tth296(AKK)GL构建体(DNA序列SEQ ID NO：2814；氨基酸序列SEQ ID NO：2815)。

72.Afu328-Tth296(AKK)GL，AT2-3的构建

产生两种重叠的PCR片段，第一种使用引物390-076-085′-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3′(SEQ ID NO：314)和700-049-025′-ggt-tga-ctt-cag-agc-ttt-gag-3′(SEQ ID NO：561)，以及模板AfuFEN(DNA序列SEQ ID NO：556)，第二种使用引物700-049-035′-aaa-gct-ctg-aag-tca-acc-ctg-gag-gag-gcc-ccc-tgg-3′(SEQ ID NO：562)和390-076-095′-taa-tct-gta-tca-ggc-tg1-3′(SEQ ID NO：557)，以及模板TthAKK GL(DNA序列SEQ ID NO：2702)。组合这两种产物，用外部引物390-076-08和390-076-09扩增。重组PCR产物用限制性内切酶BspEI和SalI酶切，连接到用相同酶酶切制备的载体AfuFEN内，产生Afu336-Tth296(AKK)GL构建体(DNA序列SEQ ID NO：2816；氨基酸序列SEQ ID NO：2817)。

73.随机嵌合体S26和S36的产生

用来制备这些嵌合酶的模板是来自TthAKK GL、TaqTthAKKGL、TscTthAKK GL和TfiTthAKK GL构建体的核酸酶域。根据初次活性筛选发现有两个克隆显示活性提高。然后测序并分离随机嵌合体S26GL(DNA序列SEQ ID NO：2818；氨基酸序列SEQ ID NO：2819)和S36(DNA序列SEQ ID NO：2820；氨基酸序列SEQ ID NO：2821)。

74.S26(FT)GL的构建

使用诱变引物785-008-035′-ttt-acc-cgc-ctc-gag-gtg-ccg-ggc-3′(SEQ ID NO：489)和680-21-035′-cgg-cac-ctc-gag-gcg-ggt-aaa-gcc-caa-aag-gtc-cac-3′(SEQ ID NO：490)，对pS26GL DNA进行位点特异性诱变，引入L107F/E108T突变，产生S26(FT)GL(DNA序列SEQ IDNO：2822；氨基酸序列SEQ ID NO：2823)。

75.S36(FT)GL的构建

使用诱变引物785-096-01：5′-gtg-gac-ctt-ctg-ggc-ttt-acc-cgc-ctc-gag-gcc-ccg-3′(SEQ ID NO：486)和785-096-02：5′-cgg-ggc-ctc-gag-gcg-ggt-aaa-gcc-cag-aag-gtc-cac-3′(SEQ ID NO：487)，对pS36 GLDNA进行位点特异性诱变，引入L109F/V110T突变，产生S36(FT)GL(DNA序列SEQ ID NO：2824；氨基酸序列SEQ ID NO：2825)。

76.S26(K69E)GL的构建

使用诱变引物5′-atc-gtg-gtc-ttt-gac-gcc-gag-gcc-ccc-tcc-ttc-c-3′(SEQ ID NO：492)和5′-gga-agg-agg-ggg-cct-cgg-cgt-caa-aga-cca-cga-t-3′(SEQ ID NO：493)，对S26 GL DNA进行位点特异性诱变，引入K69E突变，产生S26(K69E)GL(DNA序列SEQ IDNO：2826；氨基酸序列SEQ ID NO：2827)。

77.S26(FT/K69E)GL的构建

使用诱变引物5′-atc-gtg-gtc-ttt-gac-gcc-gag-gcc-ccc-tcc-ttc-c-3′(SEQ ID NO：492)和5′-gga-agg-agg-ggg-cct-cgg-cgt-caa-aga-cca-cga-t-3′(SEQ ID NO：493)，对S26(FT)GL DNA进行位点特异性诱变，引入K69E突变，产生S26(FT/K69E)GL(DNA序列SEQ IDNO：2828；氨基酸序列SEQ ID NO：2829)。

78.更多随机嵌合体：N3D7、N1A12、N1C4和N2C3

用来产生这些嵌合体的模板是Tth(K69E)AKK GL、Taq(K69E)TthAKK GL、Tsc(K69E)TthAKKGL和Tfi(K69E)TthAKKGL构建体的核酸酶域。根据初次活性筛选，有4个克隆显示活性提高。分别测序并分离随机嵌合体N3D7GL(DNA序列SEQ IDNO：2830；氨基酸序列SEQ ID NO：2831)、N1A12GL(DNA序列SEQID NO：2832；氨基酸序列SEQ ID NO：2833)、N1C4GL(DNA序列SEQID NO：2834；氨基酸序列SEQ ID NO：2835)和N2C3GL(DNA序列SEQ ID NO：2836；氨基酸序列SEQ ID NO：2837)。

TthAKK GL酶的DL、GR和DR变体的产生

在氨基酸385处Gly改变为Asp(G385D)和/或在氨基酸455处Leu改变为Arg(L455R)的一系列TthAKK GL变体通过定点诱变产生。含有这两个氨基酸变异的构建体被表示为“DR”。只含有一种变异的嵌合体被表示为“DL”或“GR”。

1.TthAKK DL突变体的构建

使用诱变引物1144-60-01，5′-cgc-cta-cct-cct-gga-ccc-ttc-gaa-cac-cac-c-3′(SEQ ID NO：2858)和1144-60-02，5′-ggt-ggt-gtt-cga-agg-gtc-cag-gag-gta-ggc-g-3′(SEQ ID NO：2859)，对pTrc99A TthAKK GLDNA(SEQ ID NO：2702)进行位点特异性诱变，引入G383D突变，产生TthAKK DL(DNA序列SEQ ID NO：2838；氨基酸序列SEQ IDNO：2839)。

2.TthAKK GR突变体的构建

使用诱变引物1144-60-03，5′-ggt-acg-gcg-gga-cgt-ggc-cta-cct-tca-g-3′(SEQ ID NO：2860)和1144-60-04，5′-ctg-aag-gta-ggc-cac-gtc-ccg-ccg-tac-c-3′(SEQ ID NO：2861)对pTrc99A TthAKK GL DNA(SEQ ID NO：2702)进行位点特异性诱变，引入L453R突变，产生TthAKK GR(DNA序列SEQ ID NO：2840；氨基酸序列SEQ IDNO：2841)。

3.TthAKK DR突变体的构建

使用诱变引物1144-60-01、1144-60-02、1144-60-03和1144-60-04(分别为SEQ ID NOS：2858、2859、2860和2861)对pTrc99A TthAKKGL DNA(SEQ ID NO：2702)进行位点特异性诱变，引入G383D和L453R突变，产生TthAKK DR突变体(DNA序列SEQ ID NO：2842；氨基酸序列SEQ ID NO：2843)。

4.TthAKK(F29R)GL的构建

使用诱变引物1249-26-01，5′-cac-ctg-gcc-tac-cgc-acc-cgc-ttc-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-3′(SEQ ID NO：2862)和1249-26-02，5′-gag-gcc-ctt-cag-ggc-gaa-gcg-ggt-gcg-gta-ggc-cag-gtg-3′(SEQ IDNO：2863)，对pTrc99A TthAKK GL DNA(SEQ ID NO：2702)进行位点特异性诱变，引入F29R突变，产生TthAKK(F29R)GL突变体(DNA序列SEQ ID NO：2844；氨基酸序列SEQ ID NO：2845)。

5.TthAKK(F29R/F30H)GL的构建

使用诱变引物1249-26-03，5′-cac-ctg-gcc-tac-cgc-acc-cgc-cac-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-acc-3′(SEQ ID NO：2864)和1249-26-04，5′-ggt-gag-gcc-ctt-cag-ggc-gtg-gcg-ggt-gcg-gta-ggc-cag-gtg-3′(SEQ IDNO：2865)，对pTrc99A TthAKK GL DNA(SEQ ID NO：2702)进行位点特异性诱变，引入F29R/F30H突变，产生TthAKK(F29R/F30H)GL突变体(DNA序列SEQ ID NO：2846；氨基酸序列SEQ ID NO：2847)。

6.TthAKK(F29R/F30R)GL的构建

使用诱变引物1249-26-05，5′-cac-ctg-gcc-tac-cgc-acc-cgc-cgc-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-acc-3′(SEQ ID NO：2866)和1249-26-06，5′-ggt-gag-gcc-ctt-cag-ggc-gcg-gcg-ggt-gcg-gta-ggc-cag-gtg-3′(SEQ IDNO：2867)，对pTrc99A TthAKK GL DNA(SEQ ID NO：2702)进行位点特异性诱变，引入F29R/F30R突变，产生TthAKK(F29R/F30R)GL突变体(DNA序列SEQ ID NO：2848；氨基酸序列SEQ ID NO：2849)。

7.Tsc(F26R)TthAKK GL的构建

使用诱变引物1249-26-01，5′-cac-ctg-gcc-tac-cgc-acc-cgc-ttc-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-3′(SEQ ID NO：2862)和1249-26-02，5′-gag-gcc-ctt-cag-ggc-gaa-gcg-ggt-gcg-gta-ggc-cag-gtg-3′(SEQ IDNO：2863)，对pTrc99A TscTthAKK GL DNA(SEQ ID NO：2708)进行位点特异性诱变，引入F26R突变，产生Tsc(F26R)TthAKK GL突变体(DNA序列SEQ ID NO：2850；氨基酸序列SEQ ID NO：2851)。

8.Tsc(F26R/F27H)TthAKK GL的构建

使用诱变引物1249-26-03，5′-cac-ctg-gcc-tac-cgc-acc-cgc-cac-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-acc-3′(SEQ ID NO：2864)和1249-26-04，5′-ggt-gag-gcc-ctt-cag-ggc-gtg-gcg-ggt-gcg-gta-ggc-cag-gtg-3′(SEQ IDNO：2865)，对pTrc99A TscTthAKK GL DNA(SEQ ID NO：2708)进行位点特异性诱变，引入F26R/F27H突变，产生Tsc(F26R/F27H)TthAKK GL突变体(DNA序列SEQID NO：2852；氨基酸序列SEQ ID NO：2853)。

9.Tsc(F26R/F27R)TthAKK GL的构建

使用诱变引物1249-26-05，5′-cac-ctg-gcc-tac-cgc-acc-cgc-cgc-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-acc-3′(SEQ ID NO：2866)和1249-26-06，5′-ggt-gag-gcc-ctt-cag-ggc-gcg-gcg-ggt-gcg-gta-ggc-cag-gtg-3′(SEQ IDNO：2867)，对pTrc99A TscTthAKK GL DNA(SEQ ID NO：2708)进行位点特异性诱变，引入F26R/F27R突变，产生Tsc(F26R/F27R)TthAKK GL突变体(DNA序列SEQ ID NO：2854；氨基酸序列SEQ ID NO：2855)。

10.Taq(F28R)TthAKK GL的构建

使用诱变引物1249-26-03，5′-cac-ctg-gcc-tac-cgc-acc-cgc-cac-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-acc-3′(SEQ IDNO：2864)和1249-26-04，5′-ggt-gag-gcc-ctt-cag-ggc-gtg-gcg-ggt-gcg-gta-ggc-cag-gtg-3′(SEQ ID NO：2865)，对pTrc99A-TaqTthAKKGL DNA(SEQ ID NO：2706)进行位点特异性诱变，引入F28R突变，产生Taq(F28R)TthAKK GL突变体(DNA序列SEQ ID NO：2856；氨基酸序列SEQ ID NO：2857)。

表2

Klenow	Kcat(s-1)	Km(dNTP)(μM)	Kd(nM)	相对DNA亲和	参考文献	Taq Pol
Klenow	Kcat(s-1)	Km(dNTP)(μM)	Kd(nM)	相对DNA亲和	参考文献	Taq Pol	野生型S610AR668AN678AE710AE710DK758AK758RY766SR841AN845AN845QQ849AQ849EH881AD882ND882S	2.4n.d.0.006n.d.0.11.70.1312.00.80.31.00.030.020.0010.3＜0.00010.001	28-6.5-1.57.715.62.16.49.8231.73.8n.d.3.3n.d.7.5	8n.d.140，150n.d.250110--1340，538，580，55100，16090，9120，28300.9	1-0.06，0.05-0.030.070.631.1250.4，0.60.21.0，1.70.1，0.20.08，0.050.090.4，0.30.69	251，2522441，21，21，21，21，21，21，222	Wild-TypeS515R573^N583E615^E615^K663K663Y671R746^N750^N750^Q754Q754H784^*D785D785

参考文献：

1.JBC(1990)265：14579-14591

2.JBC(1992)267：8417-8428

3.Eur.J.Biochem (1993)214：59-65

4.JBC(1994)269：13259-13265

5.Nature(1996)382：278-281

表3：聚合酶区中的合理突变

A.DNA活性表

	IdT	％Tth	％Taq4M	HP	X
	IdT	％Tth	％Taq4M	HP	X	Tth DN RX HT	31.91	100％	83％	3.81	101.9
Tth DN RX HTH641A	23.61	74％	62％	5.32	221.24	Tth DN RX HT	31.91	100％	83％	3.81	101.9
Tth DN RX HTH641A	23.61	74％	62％	5.32	221.24	Tth DN RX HTR748A	22.1	69％	58％	4.39	88.17
Tth DN RX HTH786A	34.31	108％	90％	7.75	185.35	Tth DN RX HTR748A	22.1	69％	58％	4.39	88.17
Tth DN RX HTH786A	34.31	108％	90％	7.75	185.35	Tth DN RX HTH786A/G506K/Q509K(AKK)	32.1	101％	84％	5.7	332.8
Taq DN RX HTW417L/G418K/E507Q/H784A(Taq 4M)	38.23	120％	100％	68.21	1100.18	Tth DN RX HTH786A/G506K/Q509K(AKK)	32.1	101％	84％	5.7	332.8
Taq DN RX HTW417L/G418K/E507Q/H784A(Taq 4M)	38.23	120％	100％	68.21	1100.18	Taq 4M G504K	36.04	113％	94％	31.76	417.40
Taq 4M H639A	42.95	135％	112％	91.46	2249.67	Taq 4M G504K	36.04	113％	94％	31.76	417.40
Taq 4M H639A	42.95	135％	112％	91.46	2249.67	Taq 4M R587A	44.78	140％	117％	143.0	252.69
Taq DN RX HTW417L/G418K/G499R/A502K/I503L/K504N/E07K/H784A(Taq8M)	43.95	138％	115％	122.53	346.56	Taq 4M R587A	44.78	140％	117％	143.0	252.69
	43.95	138％	115％	122.53	346.56	TaqSS R677A	32.3	101％	84％	206.9	2450.0

B.RNA活性表

	IrT1	％Tth	％Taq4M
	IrT1	％Tth	％Taq4M	Tth DN RX HT	0.89	100％	34％
Tth DN RX HTH641A	1.18	133％	45％	Tth DN RX HT	0.89	100％	34％
Tth DN RX HTH641A	1.18	133％	45％	Tth DN RX HTR748A	1.34	151％	51％
Tth DN RX HTH786A	1.31	147％	49％	Tth DN RX HTR748A	1.34	151％	51％
Tth DN RX HTH786A	1.31	147％	49％	Tth DN RX HTH786A/G506K/Q509K(AKK)	1.59	179％	60％
Taq DN RX HTW417L/G418L/E507Q/H784A(Taq 4M)	2.65	298％	100％	Tth DN RX HTH786A/G506K/Q509K(AKK)	1.59	179％	60％
Taq DN RX HTW417L/G418L/E507Q/H784A(Taq 4M)	2.65	298％	100％	Taq 4M G504K	2.76	310％	114％
Taq 4M H639A	3.89	437％	147％	Taq 4M G504K	2.76	310％	114％
Taq 4M H639A	3.89	437％	147％	Taq 4M R587A	3.13	352％	118％
Taq DN RX HTW417L/G418K/G499R/A502K/I503L/K504N/E07K/H784A(Taq8M)	4.00	450％	151％	Taq 4M R587A	3.13	352％	118％
	4.00	450％	151％	TaqSS R677A	2.22	249％	84％

表4：合理的弓形突变

DNA活性表

	IdT	％Tth	％Taq4M	HP	X
	IdT	％Tth	％Taq4M	HP	X	Taq4MP88E/P90E	10.20	32％	27％	2.00	97.00
Taq4MG80E	26.30	82％	69％	103.6	2900	Taq4MP88E/P90E	10.20	32％	27％	2.00	97.00
Taq4MG80E	26.30	82％	69％	103.6	2900	Taq 4ML109F/A110T	36.45	114％	95％	19.71	749.69

RNA活性表

		IrT1	％Tth	％Taq4M
		IrT1	％Tth	％Taq4M	Taq 4MP88E/P90E	Taq 4MP88E/P90E	0.10	11％	4％
Taq 4MG80E	Taq 4MG80E	3.11	349％	117％	Taq 4MP88E/P90E	Taq 4MP88E/P90E	0.10	11％	4％
Taq 4MG80E	Taq 4MG80E	3.11	349％	117％	Taq 4ML109F/A110T	Taq 4ML109F/A110T	2.45	275％	92％

表5：弓形/拇指组合

DNA活性表

	IdT	％Tth	％Taq4M	HP	X
	IdT	％Tth	％Taq4M	HP	X	Taq W417L/G418K/E507K/H784A/L109F/A110T/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/T514S(Taq SS)	63.33	198％	166％	177.05	202.32
Taq P88E/P90E/W417L/G418K/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/T514S/H784A	36.48	114％	95％	9.44	70.35		63.33	198％	166％	177.05	202.32

RNA活性表

	IrT1	％Tth	％Taq4M
	IrT1	％Tth	％Taq4M	Taq W417L/G418K/E507K/H784A/L109F/A110T/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/T514S(Taq SS)	3.16	355％	119％
Taq P88E/P90E/W417L/G418K/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/T514S/H784A	0.22	25％	8％		3.16	355％	119％

表6：螺旋-发夹-螺旋随机诱变

DNA活性表

	IdT	％Tth	％Taq4M	HP	X
	IdT	％Tth	％Taq4M	HP	X	TaqSSK198N	23.4	73％	61％	25.7	1233.1
TaqSSA205Q	25.6	80％	67％	13.4	699.1	TaqSSK198N	23.4	73％	61％	25.7	1233.1
TaqSSA205Q	25.6	80％	67％	13.4	699.1	TaqSST204P	11.2	35％	29％	1.9	209.4
TaqSSI200M/A205G	16.8	53％	44％	7.8	597.2	TaqSST204P	11.2	35％	29％	1.9	209.4
TaqSSI200M/A205G	16.8	53％	44％	7.8	597.2	TaqSSK203N	25.9	81％	68％	36.6	1429.8
Tth DN RX HTH786A/P197R/K200R	10.7	33％	28％	3.2	66.3	TaqSSK203N	25.9	81％	68％	36.6	1429.8
Tth DN RX HTH786A/P197R/K200R	10.7	33％	28％	3.2	66.3	Tth DN RX HTH786A/K205Y	11.5	36％	30％	6.1	327.5
Tth DN RX HTH786A/G203R	18.3	57％	48％	2.1	98.8	Tth DN RX HTH786A/K205Y	11.5	36％	30％	6.1	327.5

RNA活性表

	IrT1	％Tth	％Taq4M
	IrT1	％Tth	％Taq4M	TaqSSK198N	1.22	137％	46％
TaqSSA205Q	0.62	70％	23％	TaqSSK198N	1.22	137％	46％
TaqSSA205Q	0.62	70％	23％	TaqSST204P	0.36	40％	14％
TaqSSI200M/A205G	0.77	87％	29％	TaqSST204P	0.36	40％	14％
TaqSSI200M/A205G	0.77	87％	29％	TaqSSK203N	2.09	235％	79％
Tth DN RX HTH786A/P197R/K200R	0.47	52％	18％	TaqSSK203N	2.09	235％	79％
Tth DN RX HTH786A/P197R/K200R	0.47	52％	18％	Tth DN RX HTH786A/K205Y	0.68	77％	26％
Tth DN RX HTH786A/G203R	1.61	180％	61％	Tth DN RX HTH786A/K205Y	0.68	77％	26％

表7随机拇指突变

DNA活性表

	IdT	％Tth	％Taq4M	HP	X
	IdT	％Tth	％Taq4M	HP	X	Taq DN RX HTW417L/G418K/	59.96	188％	157％	133.65	907.41
E507K/H784A/G499R/A502K/K504N/(M1-13)						Taq DN RX HTW417L/G418K/	59.96	188％	157％	133.65	907.41
E507K/H784A/G499R/A502K/K504N/(M1-13)						Taq DN RX HTW417L/G418K//H784A/L500I/Q507HA502K/G504K(M1-36)	46.74	146％	122％	123.11	822.61
Taq DN RX HTW417L/G418K/G499R/A502K/G504K/E507K/H784A/T514S(M2-24)	85.7	269％	224％	369.96	3752.12		46.74	146％	122％	123.11	822.61
	85.7	269％	224％	369.96	3752.12	Taq DN RX HTW417L/G418K/G499R/A502K/G504K/E507K/H784A/V518L(M2-06)	76.7	240％	201％	355.87	2038.19

RNA活性表

	IrT1	％Tth	％Taq4M
	IrT1	％Tth	％Taq4M	Taq DN RX HTW417L/G418K/E507K/784A/G499R/A502K/K504N/(M1-13)	2.55	287％	96％
Taq DN RX HTW417L/G418K//H784A/L500I/Q507HA502K/G504K(M1-36)	2.71	304％	102％		2.55	287％	96％
	2.71	304％	102％	Taq DN RX HTW417L/G418K/G499R/A502K/G504K/E507K/H784A/T514S(M2-24)	4.43	498％	167％
Taq DN RX HTW417L/G418K/G499R/A502K/G504K/E507K/H784A/V518L(M2-06)	3.56	400％	134％		4.43	498％	167％

表8：嵌合突变体

A.DNA活性表

	IdT2	％TthAKK	HP	X
	IdT2	％TthAKK	HP	X	TthAKK	34.18	100％	5	393
Taq 4M G504K	40.19	105％	28	1991	TthAKK	34.18	100％	5	393
Taq 4M G504K	40.19	105％	28	1991	Tfi DN 2M	36.60	106％	289	1326
Tsc DN 2M	25.49	75％	2S3	2573	Tfi DN 2M	36.60	106％	289	1326
Tsc DN 2M	25.49	75％	2S3	2573	TaqTthAKK	63.89	187％	32	1658
TthTaq 4M G504K	25.03	73％	8	627	TaqTthAKK	63.89	187％	32	1658
TthTaq 4M G504K	25.03	73％	8	627	TfiTthAKK	34.13	100％	15	459
TscTthAKK	35.23	103％	29	2703	TfiTthAKK	34.13	100％	15	459
TscTthAKK	35.23	103％	29	2703	TfiTaq 4M G504K	35.69	104％	37	872
TscTaq 4MG504K	30.04	88％	25	2008	TfiTaq 4M G504K	35.69	104％	37	872

B.RNA活性表

	IrT3	％TthAKK
	IrT3	％TthAKK	TthAKK	2.27	100％
Taq 4M G504K	2.31	102％	TthAKK	2.27	100％
Taq 4M G504K	2.31	102％	Tfi DN 2M	0.20	9％
Tsc DN 2M	0.29	13％	Tfi DN 2M	0.20	9％
Tsc DN 2M	0.29	13％	TaqTthAKK	6.81	300％
TthTaq4MG504K	1.09	48％	TaqTthAKK	6.81	300％
TthTaq4MG504K	1.09	48％	TfiTthAKK	1.24	55％
TscTthAKK	9.65	4.25％	TfiTthAKK	1.24	55％
TscTthAKK	9.65	4.25％	TfiTaq 4M G504K	1.05	46％
TscTaq 4MG504K	2.95	130％	TfiTaq 4M G504K	1.05	46％

以上说明书中提到的所有公开文本和专利均在此引用作为参考。在不背离本发明的范围和精神的情况下，所述本发明的方法和系统的多种修饰和变化，本领域技术人员应当清楚。尽管已经通过具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，申请专利的本发明不应过于限于这些具体实施方案。实际上，相关领域技术人员所知的用于实施本发明的模式的多种修饰也在下列权利要求书的范围内。

Claims

1.一种组合物，其含有一种酶，其中该酶包含一个异源功能域，其中该异源功能域在核酸切割试验中提供改变的功能性，其中所述酶含有衍生自嗜热栖热菌DNA聚合酶变体的至少一个部分，其中所述至少一个部分包含选自D385G和R455L的至少一个变化，其中该酶含有选自下列的一种氨基酸序列：SEQ ID NOs：2641-2674、2710、2712、2714、2717、2719、2722、2724、2726、2728、2730、2732、2734、2736、2738、2740、2742、2744、2746、2748、2750、2752、2754、2756、2758、2760、2762、2766、2768、2770、2772、2774、2776、2778、2780、2781、2782、2783、2785、2787、2789、2791、2793、2795、2797、2799、2801、2803、2805、2807、2809、2811、2813、2815、2817、2819、2821、2823、2825、2827、2829、2831、2833、2835、2837、2839、2841、2843、2845、2847、2849、2851、2853、2855和2857。

2.一种组合物，其含有编码权利要求1的酶的核酸，其中该核酸选自：SEQ ID NOs：2675-2709、2711、2713、2715、2716、2718、2720、2721、2723、2725、2727、2729、2731、2733、2735、2737、2739、2741、2743、2745、2747、2749、2751、2753、2755、2757、2759、2761、2763、2764、2765、2767、2769、2771、2773、2775、2777、2779、2784、2786、2788、2790、2792、2794、2796、2798、2800、2802、2804、2806、2808、2810、2812、2814、2816、2818、2820、2822、2824、2826、2828、2830、2832、2834、2836、2838、2840、2842、2844、2846、2848、2850、2852、2854和2856。

3.含有表达载体的组合物，该表达载体含有权利要求2的核酸。

4.一种组合物，其包含一含有权利要求3的表达载体的宿主细胞。

5.一种试剂盒，其含有权利要求1的组合物。

6.权利要求5的试剂盒，其进一步含有至少一种核酸切割底物。

7.权利要求6的试剂盒，其进一步含有至少一种能够与该核酸切割底物杂交的RNA。

8.权利要求5的试剂盒，其进一步含有标记的寡核苷酸。

9.权利要求5的试剂盒，其进一步含有侵入性寡核苷酸。

10.一种切割核酸的方法，包括：

a)提供：

i)权利要求1的酶；和

ii)一种含有底物核酸的样品；和

b)使该底物核酸暴露于该酶。

11.权利要求10的方法，其中所述底物核酸暴露于所述酶产生至少一种切割产物。

12.权利要求11的方法，其进一步包括c)检测所述切割产物的步骤。

13.权利要求10的方法，其中含有底物核酸的所述样品含有细胞裂解物。