JP4363988B2 - Rna検出酵素 - Google Patents
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Description
本発明は、核酸、特にRNAの直接的検出、特徴付け、および定量のために設計された新規な酵素に関する。本発明は、標的RNA配列上で形成された特異的核酸切断構造を認識し、かつ部位特異的な様式で核酸切断構造を切断して、非標的切断産物を産生する酵素を提供する。本発明は、DNAおよびRNAの核酸の鎖を含む複合体のDNAメンバーを特異的に切断する改善された能力を有する酵素を提供する。
分子医薬において、直接的かつ定量的なRNA検出のための単純かつ費用効果の高い方法は、RNAウイルスの分析および特異的遺伝子発現の測定を非常に容易にする。これらの両方の事柄は、現在、この分野において急を要する問題である。この必要性にも関わらず、本当に直接的である技術はほとんど出現していない。PCRに基づく検出アッセイ法は、増幅の前に逆転写酵素によるRNAからDNAへの転換を必要とし、これは、正確な定量を損ない得る変異を導入する。さらに、PCRおよび指数関数的な増幅に基づく他の方法(例えば、NASBA)は、相互汚染を避けるための骨の折れる封じ込め測定を必要とし、かつ、量の小さな差異(例えば、2〜3倍)を区別する困難さを有する。RNAを直接的に検査する他の試験は、時間のかかるオートラジオグラフィーの工程(例えば、RNase保護アッセイ法)または一晩の反応時間(例えば、分枝DNAアッセイ法)を含む、種々の欠点に悩まされている。米国において毎年行われている150万を超えるウイルス負荷測定では、RNAの定量的測定のための高価でない、迅速な、高処理能力の系についての莫大な潜在性が明確に存在する。
本発明は、核酸、特にRNAの直接的検出、特徴付け、および定量のために設計された新規な酵素に関する。本発明は、標的RNA配列上で形成された特異的核酸切断構造を認識し、かつ部位特異的な様式で核酸切断構造を切断して、非標的切断産物を産生する酵素を提供する。本発明は、DNAおよびRNAの核酸の鎖を含む複合体のDNAメンバーを特異的に切断する改善された能力を有する酵素を提供する。
を含む群より選択されるアミノ酸配列を有する熱安定性5'ヌクレアーゼを提供する。別の態様において、この5'ヌクレアーゼは、配列番号:
を含む群より選択されるDNA配列によってコードされる。
を含む群より選択される。好ましい態様において、本発明は、構造特異的ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を有するDNAを含む組換えDNAベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、このヌクレオチドは、配列番号:
を含む群より選択される。本発明は、利用される宿主細胞の性質によって限定されない。当業者は、種々の原核宿主細胞および真核宿主細胞において発現され得る構造特異的ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の発現のために適切な発現ベクターを十分に認識している。好ましい態様において、宿主細胞は大腸菌細胞である。
を含む群より選択されるDNAによってコードされる。なお他の好ましい態様において、本発明のキットは、核酸切断産物を検出するための試薬をさらに含む。さらなる好ましい態様において、切断産物を検出するための試薬は、引き続く侵襲性切断反応における使用のためのオリゴヌクレオチドを含む(例えば、米国特許第5,994,069号を参照されたい)。特に好ましい態様において、引き続く侵襲性切断反応のための試薬は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)効果を産生する部分で標識されたプローブを含む。
本発明の理解を容易にするために、多くの用語および語句が以下に定義される。
(すなわち、配列番号:136(改変された塩基なし))を有し、かつプローブの切断が第2および第3の残基の間で起こり、このオリゴヌクレオチドの1つの可能な電荷が釣り合ったバージョンは、
である。この改変されたオリゴヌクレオチドは正味の負電荷を有する。切断後、以下のオリゴヌクレオチドが生成される:5'Cys3-アミノT-アミノ-T 3'および
(配列番号:136の3-22残基)。5'Cys3-アミノT-アミノ-T 3'は、検出可能な部分(正に荷電したCy3色素)および2つのアミノ修飾塩基を有する。アミノ修飾塩基およびCy3色素は、リン酸基によって寄与される負電荷を超える正電荷に寄与し、従って、5'Cy3-アミノT-アミノ-T 3' オリゴヌクレオチドは正味の正電荷を有する。他方のより長い切断断片は、インプットプローブのように、正味の負電荷を有する。5'Cys3-アミノT-アミノ-T 3'断片がインプットプローブからの電荷に基づいて分離可能であるので(電荷が釣り合ったオリゴヌクレオチド)、これは、電荷が釣り合っていないオリゴヌクレオチドといわれる。より長い切断産物は、インプットオリゴヌクレオチドからの電荷に基づいて分離されることができない。なぜなら、両方のオリゴヌクレオチドが正味の負電荷を有するからである;従って、より長い切断産物は電荷が釣り合っていないオリゴヌクレオチドではない。
INVADER技術(例えば、米国特許第5,846,717号、同第5,985,557号、同第5,994,069号、および同第6,001,567号、ならびにPCT国際公開公報第97/27214および同第98/42873号を参照されたい、これらはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)は、特定の核酸配列(mRNAの単一の点変異および類似の改変体を含む)の検出および定量に適用され得るシグナル増幅系を提供する。さらに、この技術は、対立遺伝子特異的なハイブリダイゼーションに独占的に依存するのではないので、同じ試料中で密接に関連するRNAを定量するために十分に適している。本発明は、核酸、特にRNA核酸のINVADERアッセイ法に基づく検出のために酵素を作製するための、改善された酵素および方法を提供する。本発明はまた、本発明の改善された酵素を使用するINVADERアッセイ法の実行のためのキットを提供する。
INVADER侵襲性切断反応は、RNA標的鎖の検出において有用であることが示されてきた(例えば、米国特許第6,001,567号を参照されたい。その全体が参照として本明細書に組み入れられる)。DNAの検出のためにINVADERアッセイ法を用いる場合(Lyamichevら、Nat. Biotechnol., 17: 292 [1999])、反応は、その反応において存在する標的RNAの各コピーについてプローブの多くのコピーの切断を許容する条件下で実行され得る。1つの態様において、反応は、切断されるプローブの融解温度(Tm)近くの温度で実行され得、その結果、切断されたプローブおよび切断されていないプローブが、温度のサイクル化なしで、標的鎖に対して容易に断続的にサイクル化する。全長プローブがINVADERオリゴヌクレオチドの存在下で標的に結合するたびに、これは5'ヌクレアーゼ酵素によって切断され得、切断産物の蓄積を生じる。この蓄積は、検出される配列について高度に特異的であり、反応の時間および標的濃度の両方に比例するように構成され得る。別の態様において、反応の温度はシフトされ得(すなわち、それはプローブの解離を引き起こす温度まで上昇され得る)、次いで、プローブの新規なコピーが標的にハイブリダイズし、酵素によって切断される温度に低下される。さらなる態様において、温度を上昇および低下させるプロセスは多くの回数反復されるか、またはPCRにおけるようにサイクル化される(MullisおよびFaloona, Methods in Enzymology, 155: 335 [1987], Saikiら、Science 230: 1350 [1985])。
PolAタイプDNAポリメラーゼ(テルムス種からのDNAポリメラーゼ酵素を含むがこれに限定されない)は、2つの別個のドメイン、5'ヌクレアーゼドメインおよびポリメラーゼドメインを含み、これは図6に図解的に示されている。ポリメラーゼドメインはタンパク質のC末端の3分の2に存在し、かつDNA依存性およびRNA依存性の両方のDNAポリメラーゼ活性の原因である。N末端の3分の1の部分は、5'ヌクレアーゼドメインを含む。テルムス属のPol Aポリメラーゼにおいて、パーム領域はおよそ300-500アミノ酸からなり、サム領域は500-600アミノ酸を含むのに対して、フィンガー領域は、残りの650-830アミノ酸によって形成される(図6)。
BstBI部位とBamHI部位との間のTthPolおよびTaqPolのアミノ酸配列の比較は、25のみの違いを示す(図13)。これらの間で、12の保存性変化および電荷の違いを生じる13の置換が存在する。キメラ酵素の分析は、いくつかの決定的なアミノ酸変化は、TthPolのBstBI-NdeI領域およびNdeI-BamHI領域の両方に位置することを示唆してきたので、部位特異的変異誘発が使用されて、それぞれ、TaqTth(D-B)キメラおよびTaqTth(N-D)キメラのBstBI-NdeI領域およびNdeI-BamHI領域にTthPol特異的アミノ酸を導入した。6つのTthPol特異的置換が、単一または二重のアミノ酸変異誘発によってTaqTth(D-B)のBstBI-NdeI領域において生成され、1つのみの二重の変異、W417L/G418Kが、IL-6標的を用いてTthPol活性を回復することができた(例えば、図14を参照されたい)。同様に、12のTthPol特異的アミノ酸がTaqTth(N-D)のNdeI-BamHI領域の相同位置に導入され、それらの内の1つのみ、E507Qが、TthPolのレベルまで切断速度を増加した(例えば、図14を参照されたい)。
Liら(Liら、Protein Sci., 7: 1116 [1998])によって決定されたプライマー/テンプレートDNAを伴うTaqPol(Klentaq1)の大きな断片の複合体の結晶構造におけるG418H変異およびE507Q変異の位置は、図17に示される。E507Q変異は、それぞれ、プライマー鎖およびテンプレート鎖のバックボーンリン酸から最も近い距離の3.8Åおよび18Åでサムサブドメインの先端に位置する。サムとDNAプライマー/テンプレートの小さな溝との間の相互作用は、以前にクレノウ断片DNAポリメラーゼ(Breeseら、Science 260: 352 [1993])およびTaqPol(Eomら、Nature 382: 278 [1996])の共結晶構造によって示唆された。TaqPolのアミノ酸494-518に対応するクレノウ断片におけるサムの先端の24アミノ酸部分の欠失は、DNA結合アフィニティーを100倍よりも多く減少させる(Minnickら、J. Biol. Chem. 271: 24954 [1996])。これらの観察は、E507残基を含むサム領域が上流の基質二重鎖との相互作用に関与するという仮説と一致する。
上記に記載されるように、物理的研究および分子モデリングが単独でまたは組み合わせて使用されて、酵素の領域を同定し得る。ここで、アミノ酸の変化は、切断機能の少なくとも1つの局面において観察可能な違いを引き起こす可能性がある。上記の節において、この情報の使用は、特定のアミノ酸またはアミノ酸の組み合わせを選択および変化させるために記載された。変化された機能を有する酵素を生成する別の方法は、変異をランダムに導入することである。このような変異は、当該分野で公知である多数の方法によって導入され得、この方法には以下が含まれるがこれらに限定されない:ヌクレオチドの誤取り込みをしやすい条件下でのPCR増幅(REF)、縮重領域(すなわち、反応において、異なり個別であるがさもなくば類似のオリゴヌクレオチドが異なる塩基を有し得る、塩基の位置)を有するプライマーを使用する増幅、および化学合成。ランダム変異誘発の多くの方法が当該分野において公知であり(Del Rioら、Biotechniques 17: 1132 [1994])、本発明の酵素の産生に組み入れられ得る。本明細書中に含まれる変異誘発の任意の特定の手段の議論は、例示の目的のみのために示され、限定を意図するものではない。ランダム変異誘発が、全体のタンパク質の特定の領域のみが変化するように実行される場合、これは「集中ランダム変異誘発」と記載され得る。実験的実施例において記載されるように、集中ランダム変異誘発アプローチは、HhHおよびサムドメインを変化させるために適用され、酵素改変体のいくつかが以前に作成された。これらのドメインは、このアプローチの例を提供するために選択された。ランダム変異誘発アプローチは、任意の特定のドメイン、または単一のドメインに限定されることは意図されない。これは、任意のドメイン、または任意の完全なタンパク質に適用され得る。このように改変されたタンパク質は、実施例1に記載されるスクリーニング反応において、図22および24に図示される試験基質を使用して、切断活性について試験され、その結果は表5および6に記載される。
本発明のいくつかの態様において、任意の適切な技術(例えば、上記に記載された技術の1つまたは複数を含むがこれらに限定されない)が使用されて、異種ドメインを有する改善された切断酵素(例えば、配列番号:221)を生成する。従って、いくつかの態様において、部位特異的変異誘発(例えば、市販のキット(例えば、Transformer Site Directed mutagenesisキット(Clontech))を使用するプライマー特異的変異誘発)が、本発明の切断酵素をコードする核酸を生成するために核酸配列の全体にわたって複数の変化を作製するように使用される。いくつかの態様において、複数のプライマー指向性変異誘発の工程は、本発明の切断酵素をコードする核酸を産生するためにタンデムで実行される。
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様および局面を例証する役目を果たし、かつその範囲を限定するものとして解釈されない。
5'ヌクレアーゼ活性についてのコロニーの迅速スクリーニング
未変性の5ヌクレアーゼおよび本発明の酵素を種々の機能について直接的に試験し得る。これらには、RNAまたはDNAの標的に対する5'ヌクレアーゼ活性、および標的検出反応において存在し得る構造を表す代替的な基質を使用するバックグラウンド特異性が含まれるがこれらに限定されない。適切な試験構造を有する核酸分子の例は、図18A-Dおよび図21-24に図解的に示される。以下に記載されるスクリーニング技術は、迅速かつ効率的に5'ヌクレアーゼを特徴付けするため、および新規な5'ヌクレアーゼが改善されたかまたは所望される活性を有するか否かを決定するために開発された。RNAまたはDNAの標的に対して改善されたサイクル化速度を示すか、または減少した標的非依存性切断を生じる酵素は、より徹底的な調査に値する。一般的に、ランダム変異誘発によって開発された改変タンパク質を、図18Aおよび18Bに示されるように基質上での迅速コロニースクリーニングによって試験した。次いで、迅速タンパク質抽出を行い、代替的構造上の活性の試験(例えば、図18C-Dに示されるように)をタンパク質抽出物を使用して実行した。最初のスクリーニングまたはさらなるスクリーニングのいずれか、および改善された活性のための酵素の特徴付けを、他の切断複合体(例えば、図21-24に図示されるようなもの)を使用して実行し得る。本発明の範囲は、このような試験切断構造を形成するために使用される特定の配列によって限定されることは意図されない。当業者は、迅速スクリーニングのための類似の構造を形成するために比較し得る核酸をいかにして設計および作製するかを理解する。
2×基質混液を調製した。これは、20mM MOPS、pH 7.5、10mM MgSO4、200mM KCl、2μM FRET-プローブオリゴ 配列番号:223
、1μM INVADERオリゴ 配列番号:224
、および4nM RNA標的 配列番号:225
を含む。5μlの2×基質混液を、96ウェルマイクロタイタープレート(Low Profile MULTIPLATE 96, M.J. Research, Inc.)の各試料ウェルに分散させた。
2×基質混液を調製した。これは、20mM MOPS、pH 7.5、10mM MgSO4、200mM KCl、2μM FRET-プローブオリゴ 配列番号:223
、1μM INVADERオリゴ 配列番号:224
、および1nM DNA標的 配列番号:226
を含む。5μlの2×基質混液を、96ウェルマイクロタイタープレート(MJ Low Profile)の各試料ウェルに分散させた。
RNAまたはDNAのいずれかのINVADERアッセイ法においてポジティブなまたは予期しない結果を与えた変異体を、X構造またはヘアピン構造(それぞれ、図18CおよびD)に対するバックグラウンド活性について、さらに詳細に分析した。迅速コロニースクリーニング形式を上記のように利用し得る。単に基質を変化させることによって、バックグラウンドまたは異常な酵素活性につての試験を行い得る。別のアプローチは、ポジティブクローンの少量の一晩培養物からの迅速タンパク質抽出を行い、さらなるタンパク質機能についてこの粗細胞溶解物を試験することである。1つの可能な迅速タンパク質抽出手順を以下に詳述する。2〜5mlのLB(プラスミド選択のための適切な抗生物質を含む;例えば、Maniatis, 第1、2、および3巻を参照されたい)に、残りの20μl容量の水-細胞懸濁物を接種し、37℃で一晩インキュベートした。約1.4mlの培養物を1.5mlの微量遠心管に移し、そして細胞をペレット化するために、室温で3-5分間、最高速度で微量遠心分離した(例えば、Eppendorf 5417卓上微量遠心分離機で14,000rpm)。上清を除去し、細胞ペレットを100μlのTESバッファーpH 7.5(Sigma)に懸濁させた。リゾチーム(Promega)を最終濃度0.5μg/μlで添加し、試料を室温で30分間インキュベートした。次いで、試料を70℃で10分間加熱してリゾチームを不活化させ、細胞細片を、最高速度で5分間での微量遠心分離によってペレット化した。上清を除去し、この粗細胞溶解物を以下の酵素活性アッセイ法において使用した。
反応を上記に詳述されるような条件下で実行した。1μlの粗細胞溶解物を9μlの反応成分に加えて、10μlの最終容量および以下の最終濃度とした:10mM MOPS、pH 7.5、5mM MgSO4、100mM KCl、1μM FRET-プローブオリゴ(配列番号:223)、0.5μM X構造INVADERオリゴ 配列番号:227
、および0.5nM DNA標的(配列番号:226)。ウェルを、10μlのClear CHILLOUT 14(M.J. Research, Inc.)液体ワックスで覆い、反応物を85℃で3分間加熱し、次いで59℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、以下のパラメーター:励起485/20、放射530/30、ゲイン40、ウェルあたりの読み取り10を使用してCytofluor蛍光プレートリーダーで読み取った。
反応を上記に詳述されるような条件下で実行した。1μlの粗細胞溶解物を9μlの反応成分に加えて、10μlの最終容量および以下の最終濃度とした:10mM MOPS、pH 7.5、5mM MgSO4、100mM KCl、1μM FRET-プローブオリゴヌクレオチド(配列番号:223)、および0.5nM DNA標的(配列番号:226)。ウェルを、10μlのClear CHILLOUT 14(M.J. Research, Inc.)液体ワックスで覆い、反応物を85℃で3分間加熱し、次いで59℃で1時間インキュベートした。1時間のインキュベーション後、プレートを、以下のパラメーター:励起485/20、放射530/30、ゲイン40、ウェルあたりの読み取り10を使用してCytofluorプレートリーダーで読み取った。
5'ヌクレアーゼ活性アッセイ法を、10mM MOPS、pH 7.5、0.05% Tween 20、0.05% Nonidet P-40、10μg/ml tRNA、100mM KCl、および5mM MgSO4を含む10μl反応溶液中で実行した。プローブ(配列番号:167)の濃度は2mMであった。実施例3におけるように調製した基質(IrT1(配列番号:228)またはIdT(配列番号:229)、それぞれ10または1nMの最終濃度)および約20ngの酵素を上記の反応バッファーと混合し、CHILLOUT(MJ Research)液体ワックスを重層した。反応を、反応温度57℃にし、MgSO4の添加により開始し、そして10分間インキュベートした。次いで、反応を、10mM EDTAおよび0.02%メチルバイオレット(Sigma)を含む95%ホルムアミド10μlの添加によって停止させた。試料を、電気泳動の直前に90℃で1分間加熱し、その後電気泳動を、7M尿素を有する20%変性アクリルアミドゲル(19:1架橋)を通して、および45mM Tris-ホウ酸、pH 8.3、1.4mM EDTAのバッファー中で行った。他に示さない限り、1μlの各停止反応溶液をレーン毎にロードした。次いで、ゲルをFMBIO-100蛍光ゲルスキャナー(Hitachi)で、505nmフィルターを使用してスキャンした。切断された産物の画分を、FMBIO分析ソフトウェア(バージョン6.0、Hitachi)を用いて、切断されていない基質および切断された基質に対応するバンドの強度から決定した。切断産物の画分は、測定値が切断の初速度を概算することを保証するために20%を超えなかった。代謝回転速度を、これらの反応条件下で、標的分子あたり1分間あたりに生成した切断されたシグナルプローブの数として規定した(1/分)。
5'ヌクレアーゼ活性アッセイ法を、10mM MOPS、pH 7.5、0.05% Tween 20、0.05% Nonidet P-40、10μg/ml tRNA、100mM KCl、および5mM MgSO4を含む10μl反応溶液中で実行した。ヘアピン構造アセンブリー(22A、配列番号:230および231)またはX構造アセンブリー(22B、配列番号:230-232)のいずれかの形成のための各オリゴを最終濃度1μMで添加し、そして実施例3に記載されるように調製した約20ngの試験酵素を上記の反応バッファーと混合し、CHILLOUT(MJ Research)液体ワックスを重層した。反応を、反応温度60℃にし、MgSO4の添加により開始し、そして10分間インキュベートした。次いで、反応を、10mM EDTAおよび0.02%メチルバイオレット(Sigma)を含む95%ホルムアミド10μlの添加によって停止させた。試料を、電気泳動の直前に90℃で1分間加熱し、その後電気泳動を、7M尿素を有する20%変性アクリルアミドゲル(19:1架橋)を通して、および45mM Tris-ホウ酸、pH 8.3、1.4mM EDTAのバッファー中で行った。他に示さない限り、1μlの各停止反応溶液をレーン毎にロードした。次いで、ゲルをFMBIO-100蛍光ゲルスキャナー(Hitachi)で、505nmフィルターを使用してスキャンした。切断された産物の画分を、FMBIO分析ソフトウェア(バージョン6.0、Hitachi)を用いて、切断されていない基質および切断された基質に対応するバンドの強度から決定した。切断産物の画分は、測定値が切断の初速度を概算することを保証するために20%を超えなかった。代謝回転速度を、これらの反応条件下で、標的分子あたり1分間あたりに生成した切断されたシグナルプローブの数として規定した(1/分)。
5'ヌクレアーゼ活性アッセイ法を、10mM MOPS、pH 7.5、0.05% Tween 20、0.05% Nonidet P-40、10μg/ml tRNA、100mM KCl、および5mM MgSO4を含む10μl反応溶液中で実行した。DNA IL-6基質を含む反応は、0.05nM IL-6 DNA標的(配列番号:163)および1μMの各プローブ(配列番号:162)およびINVADER(配列番号:161)オリゴヌクレオチドを含み、60℃で30分間実行した。IL-6 RNA標的(配列番号:160)を含む反応を、IL-6 RNA標的濃度が1nMであり、反応を57℃で60分間実行した以外は同じ条件下で実行した。各反応は、実施例3に記載されるように調製した、約20ngの試験酵素を含んだ。
合成r25mer標的(配列番号:233)を含む反応を、そのr25mer標的濃度が5nMであり、かつその反応を58℃で60分間実行した以外は同じ反応条件下(10mM MOPS、pH 7.5、0.05% Tween 20、0.05% Nonidet P-40、10μg/ml tRNA、100mM KCl、および5mM MgSO4)および1μMの各々のプローブ(配列番号:234)およびINVADER(配列番号:235)オリゴヌクレオチドで実行した。約20ngの各試験酵素を反応に加えた。酵素を実施例3に記載されるように調製した。
DNAポリメラーゼおよび変異体ポリメラーゼの5'ヌクレアーゼのクローニングおよび発現
A.テルムス アクアチクスおよびテルムス テルモフィルスのDNAポリメラーゼ
1. TaqPolおよびTthPolのクローニング
テルムス属の真正細菌からのA型DNAポリメラーゼは、広いタンパク質配列同一性(重合ドメインにおいて90%、DNAStar, WIからのDNA分析ソフトウェアにおけるLipman-Pearson法を使用)を共有し、重合アッセイ法およびヌクレアーゼアッセイ法の両方において同様にふるまう。それゆえに、テルムス アクアチクス(TaqPol)、テルムス テルモフィルス(TthPol)、およびテルムス スコトドクトゥスのDNAポリメラーゼについての遺伝子をこのクラスの代表として使用した。他の真正細菌(大腸菌、肺炎連鎖菌、マイコバクテリウム スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)、テルムス テルモフィルス、テルムスsp.、テルモトガ マリティマ(Thermotoga maritima)、テルモシホ アフリカヌス(Thermosipho africanus)、およびバチルス ステアロテルモフィルスを含むがこれらに限定されない)からのポリメラーゼ遺伝子は同等に適合可能である。
Taq DNAポリメラーゼ遺伝子を、テルムス アクアチクス、YT-1株からのゲノムDNA(Lawyerら、前出)から、配列番号:236および237に記載されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用してポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。得られるDNA断片は、コード配列の5'末端に制限エンドヌクレアーゼEcoRIについての認識配列、およびコード鎖の3'末端にBglII配列を有する。BglIIを用いる切断は、BamHIによって生成される末端と互換性のある5'突出すなわち「付着末端」を残す。PCR増幅したDNAをEcoRIおよびBamHIで消化した。ポリメラーゼ遺伝子についてのコード領域を含む2512bpの断片をゲル精製し、次いで誘導性プロモーターを含むプラスミドに連結した。
細菌種テルムス テルモフィルス(Tth)由来のDNAポリメラーゼ酵素を、発現ベクターにこのタンパク質についての遺伝子をクローニングすること、および大腸菌細胞においてそれを過剰発現させることによって産生した。ゲノムDNAを、ATCCからの乾燥させたテルムス テルモフィルス株HB-8の1バイアル(ATCC#27634)から調製した。DNAポリメラーゼ遺伝子を、以下のプライマー:
および
を使用してPCRによって増幅した。得られたPCR産物を、EcoRIおよびSalI制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、そしてEcoRI/SalI消化プラスミドベクターpTrc99G(実施例2C1に記載)に挿入して、プラスミドpTrcTth-1を作製した。このTthポリメラーゼ構築物は、1つのヌクレオチドを欠いており、これは、5'オリゴヌクレオチドから偶発的に除外されたものであり、フレームから外れたポリメラーゼ遺伝子を生じる。この誤りは、実施例4および5に記載されるように、以下のオリゴヌクレオチド:
を使用してpTrcTth-1の部位特異的変異誘発によって訂正され、プラスミドpTrcTtH-2を作製した。このタンパク質およびこのタンパク質をコードする核酸配列はTthPolと呼ばれ、それぞれ、配列番号:243および244として列挙される。
組換えタンパク質を、TaqDNAポリメラーゼ調製プロトコールに派生する以下の技術によって以下のように精製した(Engelkeら、Anal. Biochem., 191: 396 [1990])。pTrc99A、TaqPol、pTrc99GTthPolのいずれかを含む大腸菌細胞(JM109株)を100mg/mlアンピシリンを含む3mlのLBに接種し、37℃で16時間増殖させた。一晩培養物の全体を100mg/mlアンピシリンを含む200mlまたは350mlのLBに接種し、激しく振盪しながらA600が0.8になるまで37℃で増殖させた。IPTG(1Mストック溶液)を最終濃度1mMで添加し、増殖を37℃で16時間継続した。
(1. テルムス フィリフォルミスおよびテルムス スコトドクトゥスのクローニング)
DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellculturen, Braunschweig, Germany, strain #4687)から入手した凍結乾燥したテルムス フィリフォルミス(Tfi)の1バイアルを、1mlのCastenholz培地(DSMZ培地86)中で再水和させ、50℃まであらかじめ加熱した500mlのCastenholz培地に接種した。この培養物を激しく振盪しながら70℃で48時間インキュベートした。増殖後、細胞を8000×g、10分間の遠心分離によって収集し、細胞ペレットを10mlのTE(10mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA)に懸濁し、そして細胞を1mlアリコートにて-20℃で凍結させた。1つの1mlアリコートを融解し、リゾチームを1mg/mlで添加し、そして細胞を23℃で30分間インキュベートした。20% SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)の溶液を最終濃度0.5%で加え、続いて緩衝化フェノールで抽出した。水相をさらに1:1フェノール:クロロホルムで抽出し、最後はクロロホルムで抽出した。10分の1容量の3M酢酸ナトリウム、pH 5.0および2.5容量のエタノールを水相に加えて、混合した。DNAを、20,000×g、5分間の遠心分離によってペレット化した。このDNAペレットを70%エタノールで洗浄し、風乾し、そして200μlのTEに再懸濁し、増幅のために直接使用した。テルムス スコトドクトゥス(Tsc、ATCC #51532)を増殖させ、ゲノムDNAを、テルムス フィリフォルミスについて上記に記載されたのと同様に調製した。
を用いて増幅した。この反応からのPCR産物は、約1200塩基対の長さであった。これを制限酵素NotIおよびSalIで切断し、得られたDNAを、NotIおよびSalIで切断したpTrc99aに連結してpTrc99a-Tfi3'を作製した。この遺伝子の5'の半分を、以下の2つのプライマー:
を使用して上記と同様に増幅した。得られた1300塩基対の断片を、制限酵素EcoRIおよびNotIで切断し、NotIおよびEcoRIで切断したpTrc99a-Tfi3'に連結してpTrc99a-TfiPol、配列番号:249(対応するアミノ酸配列は配列番号:250に列挙される)を産生した。
を使用して増幅した。このPCR産物を制限酵素EcoRIおよびSalIで切断し、EcoRIおよびSalIで切断したpTrc99aに連結して、pTrc99a-TscPol、配列番号:253(対応するアミノ酸配列は配列番号:254に列挙される)を作製した。
プラスミドを、タンパク質発現のためにプロテアーゼ欠損大腸菌株BL21(Novagen)またはJM109株(Promega Corp., Madison, WI)に形質転換した。100μg/mlアンピシリンを含む200mlのLBを含むフラスコに、LBプレートからのシングルコロニーまたは適切な株の凍結ストックからのいずれかを接種した。激しく振盪しながらの37℃、数時間の増殖後、培養を200μlの1Mイソチオプロピル-ガラクトシド(IPTG)の添加によって誘導した。37℃での増殖を収集の前16時間継続した。細胞を8000×gで15分間の遠心分離によってペレット化し、続いて5mlのTEN(10mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA、100mM NaCl)中で細胞ペレットの懸濁を行った。100μlの50mg/mlリゾチームを加え、細胞を室温で15分間インキュベートした。デオキシコール酸(10%)を最終濃度0.2%で加えた。徹底的な混合後、細胞溶解物を氷上で2分間超音波処理して、混合物の粘度を低下させた。細胞細片を4℃、15分間、20,000×gでの遠心分離によってペレットにした。上清を取り除き、70℃で30分間インキュベートし、その後10%ポリエチレンイミン(PEI)を0.25%まで加えた。氷上での30分間のインキュベーション後、混合物を20,000×g、4℃、20分間遠心分離しした。この時点で、酵素を含有する上清を取り除き、タンパク質を、1.2gの硫酸アンモニウムの添加によって沈殿させ、4℃で1時間のインキュベーションを行った。タンパク質を、4℃で10分間、20,000×gでの遠心分離によってペレット化した。このペレットを、4mlHPLCのバッファーA(50mM TrisHCl、pH 8.0、1mM EDTA)に再懸濁した。このタンパク質を、Econo-Pacヘパリンカートリッジ(Bio-Rad)およびDionex DX 500 HPLC装置を使用するアフィニティークロマトグラフィーによってさらに精製した。手短に述べると、カートリッジをHPLCバッファーAで平衡化し、酵素抽出物をカラムにロードし、そして同じバッファー中のNaClのリニアグラジエント(0-2M)を用いて溶出した。純粋なタンパク質はNaCl 0.5Mから1Mの間で溶出する。酵素のピークを収集し、50%グリセロール、20mM Tris-HCl、pH 8、50mM KCl、0.5% Tween 20、0.5% Nonidet P-40、100mg/ml BSA中で透析した。
C節で生成したすべての変異体を、実施例2A1Cに記載されるように発現および精製した。
TaqDNと呼ばれるTaqDNAポリメラーゼの重合欠損変異体を構築した。TaqDNヌクレアーゼは、785位の野生型アスパラギン酸残基の代わりにアスパラギン残基を含む(D785N)。
Tth DN構築物を、上記に記載したTthPolを変異させることによって作製した。787位にアスパラギン酸をコードする配列を、上記のように部位特異的変異誘発によって、アスパラギンをコードする配列に変化させた。以下のオリゴヌクレオチド:
を用いるpTrcTth-2の変異誘発を実行して、プラスミドpTrcTthDNを作製した。変異タンパク質およびタンパク質をコードする核酸配列をTthDNと呼ぶ(それぞれ配列番号:261および262)。
6アミノ酸ヒスチジンタグ(his-タグ)をTaq DNおよびTth DNのカルボキシ末端に付加した。部位特異的変異誘発を、TRANSFORMER Site-Directed Mutagenesis Kit(Clontech)を使用して、製造業者の指示書に従って実行した。プラスミドpTaq DNおよびpTth DNで使用される変異誘発オリゴヌクレオチドは、配列117-067-03、
および配列136-037-05、
であった。選択プライマーTrans Oligo AlwNI/SpeI(Clontech、カタログ番号#6488-1)を両方の変異誘発反応のために使用した。得られた変異体遺伝子は、Taq DN HT(配列番号:265、核酸配列;配列番号:266、アミノ酸配列)およびTth DN HT(配列番号:267、核酸配列;配列番号:268、アミノ酸配列)と名付けられた。
Taq DN HTおよびTth DN HTの両方のタンパク質を大腸菌株JM109において実施例2B2において記載されるように発現させた。硫酸アンモニウム沈殿および遠心分離の後、タンパク質ペレットを0.5mlのQバッファー(50mM Tris-HCl、pH 8.0、0.1mM EDTAm、0.1% Tween 20)に懸濁した。このタンパク質を、His-Band ResinおよびBuffer Kit(Novagen)を使用して、製造業者の指示書に従ってアフィニティークロマトグラフィーによってさらに精製した。1mlのHis-Bind樹脂をカラムに移し、3カラム容量の滅菌水で洗浄し、5容量の1×充填バッファーを用いて充填し、そして3容量の1×Binding Bufferを用いて平衡化した。4mlの1×Binding Bufferをタンパク質試料に加え、試料溶液をカラムにロードした。3mlの1×Binding Bufferおよび3mlの1×Wash Bufferを用いる洗浄の後、結合したHis-Tagタンパク質を1mlの1×Elute Bufferで溶出した。次いで、純粋な酵素を50%グリセロール、20mM Tris-HCl、pH 8.0、50mM KCl、0.5% Tween 20、0.5% Nonidet P40、および100μg/ml BSA中で透析した。酵素濃度を279nmにおける吸収を測定することによって決定した。
TthPolのRNA依存性5'ヌクレアーゼ活性はDNAポリメラーゼドメインのN末端部分の移入によってTaqPol上に付与され得る
A. DNAまたはRNAのいずれかの標的鎖を有する基質構造の調製および精製
下流(配列番号:162)および上流(配列番号:161)のプローブならびにIL-6 DNA(配列番号:163)(図10)標的鎖を、PerSeptive Biosystems instrument上で、標準的なホスホルアミデート化学(Glen Research)を使用して合成した。5'末端でビオチン標識した合成RNA-DNAキメラIrT標的を(図20A)、2'-ACE RNA化学(Dharmacon Research)を利用して合成した。2'-保護基を、製造業者の指示書に従って酸触媒加水分解によって除去した。それらの5'末端を5'-フルオレセイン(Fl)または5'-テトラクロロ-フルオレセイン(TET)で標識した下流プローブを、Resource Qカラム(Amersham-Pharmacia Biotech)を使用して、逆相HPLCによって精製した。648ヌクレオチドのIL-6 RNA標的(配列番号:160)(図10)を、ヒトIL-6 cDNAのクローニングされた断片(Mayら、Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 8957 [1986]において公開された配列のヌクレオチド64-691)のT7 RNAポリメラーゼランオフ-転写によって、Magascript Kit(Ambion)を使用して合成した。すべてのヌクレオチドを、20%変性ポリアクリルアミドゲル上での分離、続いて切り出しおよび主要なバンドの溶出によって最終的に精製した。オリゴヌクレオチド濃度を、260nmにおける吸収を測定することによって決定した。ビオチン標識したIrT標的を、10mM MOPS、pH 7.5、0.05% Tween 20、0.05% P-40、および10μg/ml tRNAを含むバッファー中の5倍過剰のストレプトアビジン(Promega)とともに、室温で10分間インキュベートした。
キメラタンパク質の形成のために使用される制限部位を、以下に記載するように、便宜上選択した。以下の実施例における制限部位を、結晶構造および他の分析によって機能性ドメインであると示された領域を取り囲むように戦略的に配置した(図6、7、および19を参照されたい)。天然に存在するか、または特異的性変異誘発を介して作製されたかのいずれかの異なる部位を、関連する生物からの他のA型ポリメラーゼ遺伝子を有する類似の構築物を作製するために使用し得る。変異がすべてタンパク質機能に関してサイレントであることが所望される。核酸配列およびタンパク質のアミノ酸配列を研究することによって、対応するアミノ酸配列に効果を有さない核酸配列の変化を導入し得る。必要とされる核酸の変化がアミノ酸に影響を与える場合、新規なアミノ酸が、置き換えられたアミノ酸と同じかまたは類似の特徴を有するように変化を作製し得る。これらの選択肢がいずれも可能でない場合、核酸の変化がタンパク質の活性、特異性、または機能に変化を引き起こしたかどうかを決定するための、機能についての変異体酵素を試験し得る。本発明は、本発明の改善された酵素の作製のために選択または導入された特定の制限部位によって限定されることは意図されない。
変異誘発を実行して、Taq DN HTおよびTth DN HTの両方の酵素のポリメラーゼドメインに3つのさらなる独特な制限部位を導入した。部位特異的変異誘発を、製造業者の指示書に従ってTransformer Site-Directed Mutagenesis Kit(Clonetech)を使用して実行した。2つの異なる選択プライマー、Trans Oligo AlwNI/SpeIまたはSwicth Oligo SpeI/AlwNI(Clontech, Palo Alto CA, カタログ番号#6488-1またはカタログ番号#6373-1)のうちの1つを、記載されたすべての変異誘発反応のために使用した。所定の反応において使用される選択オリゴは、ベクター中に存在する選択制限部位に依存する。すべての変異誘発プライマーを標準的な合成化学によって合成した。生じるコロニーを大腸菌株JM109において発現させた。
および
を使用して作製した。BstI部位(アミノ酸382位)およびNdeI部位(アミノ酸443位)をセンス鎖変異誘発プライマー
および
を使用して両方の遺伝子に導入した。変異体プラスミドを過剰発現させ、Qiagen QiaPrep Spin Mini Prep Kit(カタログ番号#27106)を使用して精製した。このベクターをDNA配列決定および制限酵素地図作製によって制限部位の存在について調べた。これらの構築物を、Tth DN RX HT(DNA配列 配列番号:273、アミノ酸配列 配列番号:274)およびTaq DN RX HT(DNA配列 配列番号:275、アミノ酸配列 配列番号:276)と名付けた。
図19に示されるキメラ構築物を、両方の遺伝子にとって共通である制限エンドヌクレアーゼ部位EcoRI(E)およびBamHI(B)、クローニングベクター部位SalI(S)、ならびに、部位特異的変異誘発によって両方の遺伝子の相同位置で作製された新規な部位、NotI(N)、BstBI(Bs)、NdeI(D)によって規定される異種DNA断片を交換することによって作製した。これらのキメラ酵素を生成する際に、2つの異なるDNAの部分を一緒に連結して最終構築物を産生した。プラスミドベクターならびにTaqまたはTthの部分(または両方の部分)の配列を含む、より大きなDNAの部分は「ベクター」と呼ばれる。TaqまたはTthのいずれか(または両方の部分)のポリメラーゼの配列を含む、より小さなDNAの部分は、「挿入物」と呼ばれる。
実行された第1の交換は2つの酵素のポリメラーゼドメインを含んだ。ヌクレアーゼドメイン(タンパク質のN末端)のポリメラーゼドメイン(タンパク質のC末端側部分)からの分離を、制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびNotIを用いて両方の遺伝子を切断することによって達成した。Tth DN RX HT遺伝子からのおよそ900塩基対の断片をTaq DN RX HT遺伝子の相同部位にクローニングし、そしてTaq DN RX HT遺伝子からのおよそ900塩基対の断片をTth DN RX HT遺伝子の相同部位にクローニングし、2種のキメラ、TaqTth(N)(DNA配列 配列番号:69;アミノ酸配列 配列番号:2)(これは、Taq DN RX HTの5'ヌクレアーゼドメインおよびTth DN RX HTのポリメラーゼドメインを有する)、およびTthTaq(N)(DNA配列 配列番号:70;アミノ酸配列 配列番号:3)(これは、Tth DN RX HTの5'ヌクレアーゼドメインおよびTaq DN RX HTのポリメラーゼドメインから構成される)を産生した。
Taq DN RX HT構築物を酵素NdeIおよびBamHIを用いて切断し、より大きなベクター断片を上記に詳述されるようにゲルによって単離した。Tth DN RX HT構築物もまた、NdeIおよびBamHIを用いて切断し、より小さな(約795塩基対)Tth断片をゲルにより単離および精製した。Tth NdeI-BamHI挿入物を、上記に詳述されるようにTaq NdeI-BamHIベクターに連結し、TaqTth(N-B)(DNA配列 配列番号:71;アミノ酸配列 配列番号:4)を生成した。
Taq DN RX HT構築物を酵素BamHIおよびSalIを用いて切断し、より大きなベクター断片を上記に詳述されるようにゲルによって単離した。Tth DN RX HT構築物もまた、BamHIおよびSalIを用いて切断し、より小さな(約741塩基対)Tth断片をゲルにより単離および精製した。Tth BamHI-SalI挿入物を、上記に詳述されるようにTaq BamHI-SalIベクターに連結し、TaqTth(B-S)(DNA配列 配列番号:72;アミノ酸配列 配列番号:5)を生成した。
Taq DN RX HT構築物を酵素NotIおよびNdeIを用いて切断し、より大きなベクター断片を上記に詳述されるように単離した。Tth DN RX HT構築物もまた、NotIおよびNdeIを用いて切断し、より小さな(約345塩基対)Tth断片をゲルにより単離および精製した。Tth NotI-NdeI挿入物を、上記に詳述されるようにTaq NotI-NdeIベクターに連結し、TaqTth(N-D)(DNA配列 配列番号:73;アミノ酸配列 配列番号:6)を生成した。
Taq DN RX HT構築物を酵素NdeIおよびBamHIを用いて切断し、より大きなベクター断片を上記に詳述されるように単離した。Tth DN RX HT構築物もまた、NdeIおよびBamHIを用いて切断し、より小さな(約450塩基対)Tth断片をゲルにより単離および精製した。Tth NdeI-BamHI挿入物を、上記に詳述されるようにTaq NdeI-BamHIベクターに連結し、TaqTth(D-B)(DNA配列 配列番号:74;アミノ酸配列 配列番号:7)を生成した。
Taq DN RX HT構築物を酵素BstBIおよびBamHIを用いて切断し、より大きなベクター断片を上記に詳述されるように単離した。Tth DN RX HT構築物もまた、BstBIおよびBamHIを用いて切断し、より小さな(約633塩基対)Tth断片をゲルにより単離および精製した。Tth NdeI-BamHI挿入物を、上記に詳述されるようにTaq NdeI-BamHIベクターに連結し、TaqTth(Bs-B)(DNA配列 配列番号:75;アミノ酸配列 配列番号:8)を生成した。
Taq DN RX HT構築物を酵素NotIおよびBstBIを用いて切断し、より大きなベクター断片を上記に詳述されるように単離した。Tth DN RX HT構築物もまた、NotIおよびBstBIを用いて切断し、より小さな(約162塩基対)Tth断片をゲルにより単離および精製した。Tth NotI-BstBI挿入物を、上記に詳述されるようにTaq NotI-BstBIベクターに連結し、TaqTth(N-Bs)(DNA配列 配列番号:76;アミノ酸配列 配列番号:9)を生成した。
Tth DN RX HT構築物を酵素BamHIおよびSalIを用いて切断し、より大きなベクター断片を上記に詳述されるように単離した。Taq DN RX HT構築物もまた、BamHIおよびSalIを用いて切断し、より小さな(約741塩基対)Tth断片をゲルにより単離および精製した。Taq BamHI-SalI挿入物を、上記に詳述されるようにTth BamHI-SalIベクターに連結し、TthTaq(B-S)(DNA配列 配列番号:77;アミノ酸配列 配列番号:10)を生成した。
Tth DN RX HT構築物を酵素NotIおよびBamHIを用いて切断し、より大きなベクター断片を上記に詳述されるように単離した。Taq DN RX HT構築物もまた、NotIおよびBamHIを用いて切断し、より小さな(約795塩基対)Tth断片をゲルにより単離および精製した。Taq NotI-BamHI挿入物を、上記に詳述されるようにTth NotI-BamHIベクターに連結し、TthTaq(N-B)(DNA配列 配列番号:78;アミノ酸配列 配列番号:11)を生成した。
RNA依存性5'ヌクレアーゼ活性に影響を与える変化は、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性に必ずしも影響を与えない
TthPolは、TaqPolよりも活性なRNAテンプレート依存性DNAポリメラーゼを有することが知られている(MyersおよびGelfand、Biochemistry 30: 7661 [1991])。テルムス DNA Pol I酵素のRNAテンプレート依存性5'ヌクレアーゼ活性がそれらのRNA依存性ポリメラーゼ活性と関連するか否かを決定するために、TaqPolおよびTthPolのポリメラーゼ欠損バージョンを作製するために使用したD785NおよびD787Nの変異を、それぞれ逆にした。ポリメラーゼ活性は、TaqTth(N)(DNA配列 配列番号:79;アミノ酸配列 配列番号:12)キメラタンパク質、TaqTth(N-B)(DNA配列 配列番号:80;アミノ酸配列 配列番号:13)キメラタンパク質、TaqTth(B-S)(DNA配列 配列番号:81;アミノ酸配列 配列番号:14)キメラタンパク質、およびTaqPol(W417L/G418K/E507Q)(DNA配列 配列番号:82;アミノ酸配列 配列番号:15)変異タンパク質に同様に回復された。
Taq DN RX HTにおける特異的点変異はキメラ研究からの情報から発展した
キメラ研究(実施例3、上記)は、高いRNA依存性5'ヌクレアーゼ活性を決定するTthPol配列の部分がおよそアミノ酸382とアミノ酸593との間に位置するBstBI-BamHI領域を含むことを示唆する。Tth DN RX HTおよびTaq DN RX HT(それぞれ配列番号:165および164)のBstBIとBamHIとの間のアミノ酸配列の領域の比較は、25のみの違いを示した(図13)。これらの間で、12のアミノ酸の変化が保存性であるのに対して、13の違いは電荷の違いを生じた。キメラ酵素の分析は、決定的な変異がTth DN RX HTのBstBI-NdeIおよびNdeI-BamHIの両方の領域に位置していることを示唆したので、部位特異的変異誘発を使用して、それぞれ、Taq Tth(D-B)およびTaq Tth(N-D)のBstBI-NdeIおよびNdeI-BamHIの領域にTth DN RX HT特異的アミノ酸を導入した。
部位特異的変異誘発を、E404H変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-01
を使用してpTrc99A TaqTth(D-B)DNAに対して実行した。
部位特異的変異誘発を、F413H変異およびA414R変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-02
を使用してpTrc99A TaqTth(D-B)DNAに対して実行した。
部位特異的変異誘発を、W417L変異およびG418K変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-03
を使用してpTrc99A TaqTth(D-B)DNAに対して実行した。
部位特異的変異誘発を、A439R変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-04
を使用してpTrc99A TaqTth(ND-B)DNAに対して実行した。
部位特異的変異誘発を、L415変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-05
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)DNAに対して実行した。
部位特異的変異誘発を、L415Q変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-06
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)DNAに対して実行した。
部位特異的変異誘発を、V463L変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-07
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)DNAに対して実行した。
部位特異的変異誘発を、A468R変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-08
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)DNAに対して実行した。
部位特異的変異誘発を、A472E変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-09
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)DNAに対して実行した。
部位特異的変異誘発を、G499R変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-10
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)DNAに対して実行した。
部位特異的変異誘発を、E507Q変異を導入するために変異誘発プライマー276-046-04
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)DNAに対して実行した。
部位特異的変異誘発を、Y535H変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-11
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)DNAに対して実行した。
部位特異的変異誘発を、S543N変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-12
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)DNAに対して実行した。
部位特異的変異誘発を、I546V変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-13
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)DNAに対して実行した。
部位特異的変異誘発を、D551S変異およびI553V変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-14
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)DNAに対して実行した。
TaqDN RX HT W417L/G418K/E507Q三重変異体を、TaqTth(D-B)W417L/G418KをTaqTth(N-D)E507Qと合わせることによって作製した。TaqTth(D-B)W417L/G418Kを制限酵素NdeIおよびBamHIで切断し、より大きなベクター断片を実施例3に詳述するように単離した。TaqTth(N-D)E507Qを構築物をまたNdeIおよびBamHIで切断し、より小さな断片(約795塩基対)を、実施例3に詳述されうようにゲルによって単離および精製した。NdeI-BamHI挿入物を、実施例3に詳述されるようにゲル精製したベクターに連結した。
上記のTaqDN RX HT W417L/G418K/E507Qを出発物質とし、変異誘発プライマー337-01-02:
を部位特異的変異誘発反応において使用して、アミノ酸418位のKを野生型アミノ酸Gに戻すように変化させた。部位特異的変異誘発を、製造業者の指示書に従って、および実験的実施例4に記載されるように、Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit(Clonetech)を使用して行った。
上記のTaqDN RX HT W417L/G418K/E507Qを出発物質とし、変異誘発プライマー337-01-01:
を部位特異的変異誘発反応において使用して、アミノ酸417位のLを野生型アミノ酸Wに戻すように変化させた。部位特異的変異誘発を、製造業者の指示書に従って、および実験的実施例4に記載されるように、Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit(Clonetech)を使用して行った。
Taq DN RX HT G418K/E507Q 5'ヌクレアーゼ活性のRNA依存性5'ヌクレアーゼ特性の、最適な塩および温度に関したTth DN RX HTへの類似
RNA標的との切断速度の増加に加えて、G418K/E507Q変異がTaq DN RX HT変異体の特性において顕著な変化を引き起こしたか否かを決定するために、Taq DN RX HT G418K/E507Q(配列番号:33)酵素、Taq DN RX HT(配列番号:276)酵素、およびTth DN RX HT(配列番号:274)酵素を、温度ならびに塩および二価イオンの濃度を変化させた条件下でRNAテンプレート依存性5'ヌクレアーゼアッセイ法において比較した。本研究において使用された基質の上流DNA鎖およびテンプレートRNA鎖は、図20Aに示されるように、単一のIrT分子(配列番号:166)に連結され、そして標識された下流プローブ(配列番号:167)は大過剰で存在した。標的RNA鎖の5'末端は、反応の間の酵素によるいかなる非特異的分解も妨害するために、ビオチン-ストレプトアビジン複合体でブロックされた(Lyamichevら、Science 260: 778 [1993], Johnsonら、Science 269: 238 [1995])。Taq DN RX HT G418K/E507Q、Taq DN RX HT、およびTth DN RX HTについての切断速度を、図20Bにおいて温度の関数としてプロットする。黒丸は酵素Taq DN RX HTを表し、白丸は酵素Tth DN RX HTを表し、および×は酵素Taq DN RX HT G418K/E507Qを表す。IrT基質を用いてのTth酵素およびTaq DN RX HT酵素の活性の違いは、実施例1に記載された切断アッセイ法において試験された場合のIL-6 RNA基質を用いて見い出された違いよりもさらに大きい。G418K/E507Q変異は、Taq酵素の活性を10倍より多く増加させ、Tth酵素と比較して25%増加させる。3つすべての酵素は、侵襲性シグナル増幅反応の典型的な温度プロフィールを示し、同じ最適温度を有する。Taq DN RX HTのDNA依存性5'ヌクレアーゼ活性に対するG418K/E507Q変異の有意な効果は、IrT(配列番号:168)と類似のすべてのDNA基質を用いて、同じ条件下では見い出されなかった。
RNA依存性5'ヌクレアーゼ活性をさらに改善するための分子モデリングの使用
A. 点変異体
変化した機能を有する酵素を開発するために、あらかじめ決定された位置における部位特異的変異誘発またはランダム変異誘発によって配列の変化を導入した。部位特異的変異誘発のための位置は、キメラ研究、関連する公開された文献、および分子モデリングからの証拠に基づいて選択された。7つのさらなる変異体酵素をTth DN RX HT酵素から開発し、12個の7つのさらなる変異体酵素をTaq DN RX HT酵素から開発した。両方を以前に議論した。変異体酵素のいくつかは、複数の変異誘発反応の結果であり、すなわち、1つより多くの変化が最終産物を得るために導入された。変異反応を、他に言及しない限り、実施例2C2に記載されたTth DN RX HT構築物(配列番号:273)または実施例2C1に記載されたTaq DN RX HT構築物(配列番号:275)を使用して行った。プラスミドDNAを、すべての変異誘発反応についての十分な出発物質を得るために、製造業者のプロトコールに従ってQIAGEN Plasmid Maxi Kit(QIAGEN, Chatsworth, CA)を使用して、200mlのJM109の一晩培養物から精製した。すべての部位特異的変異を、製造業者のプロトコールに従ってTransformer Site Directed mutagenesis Kit(Clontech)を使用して導入した。2つの異なる選択プライマー、Trans Oligo AlwNI/SpeIまたはSwicth Oligo SpeI/AlwNI(Clontech, Palo Alto CA, カタログ番号#6488-1またはカタログ番号#6373-1)のうちの1つを、記載されたすべての変異誘発反応のために使用した。所定の反応において使用される選択オリゴは、ベクター中に存在する制限部位に依存する。部位特異的変異誘発およびランダム変異誘発の両方のためのすべての変異誘発プライマーを標準的な合成化学によって合成した。両方のタイプの反応について生じるコロニーは大腸菌株JM109であった。ランダム変異誘発方法は以下に記載される。
部位特異的変異誘発を、H641A変異(DNA配列 配列番号:101;アミノ酸配列 配列番号:34)を導入するために、変異誘発プライマー583-001-02:
を使用して、またはH748A変異体(DNA配列 配列番号:102;アミノ酸配列 配列番号:35)を生成するために、変異誘発プライマー583-001-03:
を使用して、またはH786A変異体酵素(DNA配列 配列番号:103;アミノ酸配列 配列番号:36)を生成するために、変異誘発プライマー583-001-04:
を使用して、pTrc99A Tth DN RX HT DNAに対して実行した。
上記に生成された変異体Tth DN RX HT H786Aを出発物質として、部位特異的変異誘発を、「TthAKK」と名付けられたこの改変体(DNA配列 配列番号:104;アミノ酸配列 配列番号:37)を生成するために、変異誘発プライマー604-022-02:
を使用して行った。
変異誘発オリゴヌクレオチド158-029-02:
を部位特異的変異誘発反応において使用してH784A変異を導入し、「Taq4M」と名付けられたこの構築物(DNA配列 配列番号:105;アミノ酸配列 配列番号:38)を生成した。
部位特異的変異誘発を、Taq4M H639A変異体(DNA配列 配列番号:106;アミノ酸配列 配列番号:39)を生成するためのプライマー473-010-11:
Taq4M R587A(DNA配列 配列番号:107;アミノ酸配列 配列番号:40)を生成するためのプライマー473-010-10:
Taq4M G504K(DNA配列 配列番号:108;アミノ酸配列 配列番号:41)を生成するためのプライマー300-081-06:
およびTaq4M G80E変異体(DNA配列 配列番号:109;アミノ酸配列 配列番号:42)を生成するためのプライマー330-088-04:
を使用して、Taq4M変異体に対して行った。
上記のTaq 4Mを出発物質として、部位特異的変異誘発を、P88E/P90E変異(DNA配列 配列番号:110;アミノ酸配列 配列番号:43)を生成するためのプライマー473-087-03:
またはL109F/A110T変異(DNA配列 配列番号:111;アミノ酸配列 配列番号:44)を生成するためのプライマー473-087-05:
を使用して行った。
2つのPCR反応を、最初に構築物Taq4M(Taq W417L/G418K/G504K/E507Q/H784A)をテンプレートとして使用して実行した。プライマー158-84-01
およびプライマー535-33-02
を使用して、620塩基対PCR断片を生成した。別の510塩基対PCR産物を、プライマー535-33-01
およびプライマー330-06-03
を使用して生成した。これら2つのPCR産物は、最終組換えPCR増幅が外側のプライマー158-84-01および330-06-03を使用して行われ、1182塩基対の生成物が得られるように重複している。この組換えPCR産物を製造業者の指示書に従って制限酵素NotIおよびBamHIで消化し、793塩基対断片を得た。親のプラスミドTaq4Mもまた同じ酵素で消化し、ライゲーションのためのベクターとして使用した。すべてのDNA断片をライゲーションの前にTAEアガロースゲルで精製した。この断片をベクターに連結し、JM109細胞に形質転換し、このようにして、変異G499R、A502K、I503L、およびE507K、ならびに制限エンドヌクレアーゼ部位AgeIを組み込んだ。この構築物を「Taq 8M」(DNA配列 配列番号:112;アミノ酸配列 配列番号:45)と名付ける。
変化した機能を有する多数の酵素をランダム変異誘発を介して生成させた。ランダム変異誘発のための標的とされたタンパク質の領域を分子モデリングのデータおよび文献中の情報に基づいて選択した。異なる変異誘発プライマーを使用して、タンパク質の異なる領域に変異を導入した。他に言及されない限り、ランダム変異誘発を上記のTaq改変体であるTaq 4M G504K(Taq DN RX HT W417L/G418K/G504K/E507Q/H784A/)(配列番号:108)で実行し、変異誘発反応において生成された変異体PCR断片をTaq8M(配列番号:112)中の相同領域と交換した。
第1の変異誘発オリゴヌクレオチド535-054-01:
を、158-84-01:
とともに使用して、Taqポリメラーゼ改変体Taq DN RX HT W417L/G418K/G504K/E507Q/H784A(配列番号:108)のアミノ酸500〜507位からのランダムな残基を導入した。これを、括弧内の塩基の91%のみが変化していないのに対して、残りの塩基の9%が他の3ヌクレオチドの等価な混合物であるように、プライマー535-054-01を合成することによって達成した。このオリゴの、最初の、変化していない配列は、G499R、A502K、およびQ507Kの変化を含んだ。
を、330-06-03:
とともに使用して、アミノ酸513-520からのランダムな残基を導入した。プライマー535-054-02の括弧内の塩基もまた、91%野生型でありかつ3%が他の3種のオリゴヌクレオチドの各々である。
Taq DN RX HT W417L/G418K/G499R/A502K/K504N/E507K/H784A(M1-13)(DNA配列 配列番号:113;アミノ酸配列 配列番号:46)。
Taq DN RX HT W417L/G418K/G499R/L500I/A502K/G504K/Q507H/H784A(M1-36)(DNA配列 配列番号:114;アミノ酸配列 配列番号:47)。
Taq DN RX HT W417L/G418K/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/T514S/H784A(M2-24)(DNA配列 配列番号:115;アミノ酸配列 配列番号:48)。
Taq DN RX HT W417L/G418K/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/V518L/H784A(M2-06)(DNA配列 配列番号:116;アミノ酸配列 配列番号:49)。
TthDN RX HT H786A(配列番号:36)酵素のヘリックス-ヘアピン-ヘリックス領域における変異体を生成するために、2つの異なるPCR反応を、H786A(配列番号:103)をテンプレートとして使用して実行した。2つのPCR産物は、組換えPCR反応が実行し得るように重複している(Higuchi, PCR Technology, H. A. Erlich偏、Stockton Press, New York, 61-70頁 [1989])。次いで、PCR産物を、断片の末端およびTthDN H786A配列中に位置する制限酵素部位を使用することによってTthDN H786A変異体の相同領域と交換した。
およびプライマー390-76-08:
を使用して、620塩基対のPCR断片を生成した。PCR反応を、製造業者の指示書に従ってAdvantage cDNA PCR kit(Clontech)を使用して実行した。このPCR産物はアミノ酸1-194を含む。この反応を通しては変異は導入されなかったが、しかし、制限酵素部位EcoRIは5'末端に存在する。
およびプライマー209-74-02:
を使用して、787塩基対のPCR断片を生成した。PCR反応を上記のように行った。この断片は、変異誘発プライマー、604-08-05の存在に起因するランダム変異を含んでいる。このプライマーの括弧内の塩基を、配列の91%が野生型であるのに対して、さらなる9%が残りの3塩基の間で均等に分けられるように合成した。
TthDN RX HT H786A/P197R/K200R(DNA配列 配列番号:117;アミノ酸配列 配列番号:50)。
TthDN RX HT H786A/K205Y(DNA配列 配列番号:118;アミノ酸配列 配列番号:51)。
TthDN RX HT H786A/G203R(DNA配列 配列番号:119;アミノ酸配列 配列番号:52)。
上記のTaq DN RX HT W417L/G418K/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/T514S/H784A(配列番号:115)変異体を出発物質として、プライマー473-087-05:
を、L109F変異およびA110T変異を組み入れるための部位特異的変異誘発反応において適切な選択プライマーとともに使用して、「TaqSS」(DNA配列 配列番号:120;アミノ酸配列 配列番号:53)と名付けられたこの酵素を生成した。
上記のTaq DN RX HT W417L/G418K/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/T514S/H784A(配列番号:115)変異体を出発物質として、プライマー473-087-03:
を、P88E変異およびP90E変異を組み入れるための部位特異的変異誘発反応において適切な選択プライマーとともに使用して、この酵素(DNA配列 配列番号:121;アミノ酸配列 配列番号:54)を生成した。
ランダム変異誘発をTaqSS変異体(配列番号:120)のヘリックス-ヘアピン-ヘリックスドメインにさらなる変化を導入するために使用した。変異誘発を上記の実施例9に記載されるように行った。第1の工程において、異なるが重複する2種のPCR産物を生成した。オリゴ390-76-08(配列番号:314)および604-08-04:
を用いて生成したPCR産物の1つは、EcoRI部位を断片に組み入れているが、いかなる変異も組み入れていない。第2のPCR産物は、変異誘発プライマー604-08-03:
およびプライマー209-74-02(配列番号:316)を利用する。この断片はランダム点変異を含み、そして第1の断片を用いた組換えPCRを介して合わせられた場合には、制限酵素EcoRIおよびNotIで切断され得、TaqSS(これもまたEcoRIおよびNotIで切断されている)に連結され得る。次いで、連結された構築物をJM109に形質転換した。コロニーを以下に記載するようにスクリーニングした。この変異誘発から開発された酵素には以下が含まれる:
TaqSS K198N(DNA配列 配列番号:112;アミノ酸配列 配列番号:55)。
TaqSS A205Q(DNA配列 配列番号:123;アミノ酸配列 配列番号:56)。
TaqSS I200M/A205Q(DNA配列 配列番号:124;アミノ酸配列 配列番号:57)。
TaqSS K203N(DNA配列 配列番号:125;アミノ酸配列 配列番号:58)。
TaqSS T204P(DNA配列 配列番号:126;アミノ酸配列 配列番号:59)。
アーチ領域およびポリメラーゼ領域の両方における配列の変化を有する酵素を産生するために、さらなる点変異をTaqSSにおいて生成した。部位特異的変異誘発を、上記のようにオリゴ473-060-10:
を使用して実行して、TaqSS R677A変異体(DNA配列 配列番号:127;アミノ酸配列 配列番号:60)を産生した。
キメラ変異体TaqTthAKKおよびTthTaq5Mを、Tth DN RX HT(H786A/G506K/Q509K)(配列番号:104;ここではTthAKKと略す)または Taq 4M G504(配列番号:108;ここではTaq 5Mと略す)を制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびNotIを用いて切断することによって生成した。より小さな挿入物断片ならびにより大きなベクター断片を実施例3Dに詳述するようにゲル精製し、挿入物断片を実施例3Dに記載されるように2つの変異体間で交換し、連結した。スクリーニングおよび構築物配列の確認もまた、実施例3Dに記載のように行った。
他のポリメラーゼにおけるRNA依存性5'ヌクレアーゼ活性の改善
TaqPol/TthPol組換え、変異誘発、およびモデリングから得られた情報を使用して、さらなるDNAポリメラーゼにおける比較し得る変異を作製し、これらの酵素の切断活性に対する効果を試験した。テルムス フィリフォルムス(TfiPol)およびテルムス スコトドクトゥス(TscPol)を実施例2に記載されるようにクローニングおよび精製した。これら2つのタンパク質の変異誘発は以下に記載される。
pTrc99a-TfiPol(配列番号:249)の変異誘発を、製造業者の指示書に従ってQuikChange site-directed mutagenesis kit(Stratagene)を用いて行った。P420K変異を以下のオリゴヌクレオチド:
を用いて作製した。E507Q変異を以下のオリゴヌクレオチド:
を用いて作製した。D785N変異を以下のオリゴヌクレオチド:
を用いて作製した。3つすべての変異を含むプラスミドを、pTrc99a-TfiPolDN2M(DNA配列 配列番号:130;アミノ酸配列 配列番号:63)と呼ぶ。
pTrc99a-TscPol(配列番号:253)の変異誘発を、製造業者の指示書に従ってQuikChange site-directed mutagenesis kit(Stratagene)を用いて行った。E416K変異を以下のオリゴヌクレオチド:
を用いて作製した。E505Q変異を以下のオリゴヌクレオチド:
を用いて作製した。D783N変異を以下のオリゴヌクレオチド:
を用いて作製した。3つすべての変異を含むプラスミドを、pTrc99a-TscPolDN2M(DNA配列 配列番号:131;アミノ酸配列 配列番号:64)と呼ぶ。
1. TfiTth AKK(DNA配列 配列番号:132;アミノ酸配列 配列番号:65)、TscTth AKK(DNA配列 配列番号:133;アミノ酸配列 配列番号:66)、TfiTaq5M(DNA配列 配列番号:134;アミノ酸配列 配列番号:67)、およびTscTaq5M(DNA配列 配列番号:135;アミノ酸配列 配列番号:68)
Tth DN RX HT(H86A/G506K/Q509K)(ここではTthAKK、配列番号:104と略す)またはTaq 4M G504(ここではTaq 5M、配列番号:108と略す)とTfi DN 2M(配列番号:130)またはTsc DN 2M(配列番号:131)との間のキメラ酵素を生成するために、さらなる制限エンドヌクレアーゼ部位を、部位特異的変異誘発によってTfiおよびTscと名付けられた変異体に導入した。変異誘発プライマー700-011-01
および700-011-02
を使用して、Tfi DN 2Mのアミノ酸1位にEcoRI部位、およびアミノ酸331位にNotI部位を導入した。変異誘発プライマー700-011-03
および700-011-04
を使用して、Tsc DN 2Mのアミノ酸1位にEcoRI部位、およびアミノ酸327位にNotI部位を導入した。PCR反応を、製造業者の指示書に従ってAdvance cDNA PCR kit(Clonetech)を使用して、およびTfi DN 2MまたはTsc DN 2Mのいずれかを標的として、それらに対応するプライマーとともに使用して行った。1017塩基対のPCR産物をEcoRIおよびNotIの両方で切断して993塩基対の挿入物断片を得、これを実施例3Dに記載されるようにゲル精製した。変異体Taq4M G504K(配列番号:108)およびTth DN RX HT(H786A/G506K/Q509K)(配列番号:104)もまたEcoRIおよびNotIで切断し、より大きなベクター断片を上記のようにゲル精製した。ライゲーションを実施例3Dにおいて詳述されるように実行し、同様に新規な構築物のスクリーニングおよび確認を行った。
改善されたRNA依存性5'ヌクレアーゼ活性を有するさらなる酵素
Tfi DN 2M(ΔN)の生成
後のクローニング工程を容易にするために、内因性制限酵素部位(NotI)をTfiPolDN2M遺伝子(配列番号:130、実施例8Aに記載される)のポリメラーゼ領域から除去し、独特のNotI部位をより有利な位置に挿入した。
を用いて使用した。新規な構築物をTfi DN 2M(ΔN)(DNA配列 配列番号:340;アミノ酸配列 配列番号:341)と名付けた。
Tfi DN 2M(ΔN)(配列番号:340)中に独特なNotI部位(アミノ酸328位)を導入するために、プライマー886-088-07
およびプライマー700-010-03
をPCR反応において、Tfi DN 2M(ΔN)(配列番号:340)をテンプレートとして用いて使用した。得られるPCR断片を精製し、制限酵素NotIおよびSalIを用いて切断した。次いで、切断断片を、TfiTthAKK(配列番号:132、実施例8Cに記載)構築物(これもまたNotIおよびSalIで消化された)に連結した。新規な構築物をTfi DN 2M(N)(DNA配列 配列番号:345;アミノ酸配列 配列番号:346)と名付けた。
および700-010-03
を用いて、TscPolDN2M(配列番号:131)をテンプレートとして使用して実行した。次いで、PCR産物のNotI-SalI消化産物を、NotIおよびSalI消化したTscTthAKKベクター(配列番号:133)にサブクローニングした。得られる構築物を、Tsc DN 2M(N)(DNA配列 配列番号:347;アミノ酸配列 配列番号:348)と名付けた。
変異の「AKK」セット(G504K/E507K/H784A/D785N)を生成するために、部位特異的変異誘発をTfi DN 2M(N)変異体(DNA配列 配列番号:345)で、プライマー959-022-01から-04:
を使用して行い、Tfi DN 2M(N)AKK変異体(DNA配列 配列番号:358;アミノ酸配列 配列番号:359)を生成した。この構築物を「TfiAKK」と名付けた。
を使用してTsc2M(N)AKK(DNA配列 配列番号:364;アミノ酸配列 配列番号:365)を生成した。この構築物を「Tsc AKK」と名付けた。
TthAKK構築物のヌクレアーゼドメインのアミノ酸195位に変異(P195AまたはP195Kのいずれか)を導入するために、変異誘発プライマー785-073-01(P195A)
または785-073-02(P195K)
および209-074-02:
をPCR反応において使用して、787塩基対断片を生成する。別のPCR断片を、プライマー:390-076-08
および785-073-03
を反応において、同じテンプレートとともに使用した。
同じアプローチを使用してTthAKK(N417K/L418K)を構築した。2つの重複するPCR断片を、変異誘発プライマー785-73-07
および700-10-03
ならびにプライマー158-084-01
および785-73-08
によって生成した。2つの生成物を合わせて、外側のプライマー700-10-03および158-084-01で増幅した。組換えPCR産物を制限酵素NotIおよびBamHIで切断し、NotI/BamHIであらかじめ切断したTthAKK構築物に連結した。この変異体をTthAKK(N417/L418K)(DNA配列 配列番号:379;アミノ酸配列 配列番号:380)と名付けた。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー886-049-05および886-049-06:
を使用して、TthAKK構築物に対して実行してTthAKK(P255L)(DNA配列 配列番号:383;アミノ酸配列 配列番号:384)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー886-049-09および886-049-10:
を使用して、TthAKK構築物に対して実行してTthAKK(F311Y)(DNA配列 配列番号:387;アミノ酸配列 配列番号:388)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー886-049-01および886-049-02:
を使用して、TthAKK構築物に対して実行してTthAKK(N221H/R224Q)(DNA配列 配列番号:391;アミノ酸配列 配列番号:392)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー886-049-03および886-049-04:
を使用して、TthAKK構築物に対して実行してTthAKK(R251H)(DNA配列 配列番号:395;アミノ酸配列 配列番号:396)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー886-088-01および886-088-02:
を使用して、TthAKK構築物(P255L)に対して実行してTthAKK(P255L/R251H)(DNA配列 配列番号:399;アミノ酸配列 配列番号:400)を生成した。
パーム領域のランダム化変異誘発を、変異誘発プライマー680-79-02
および逆方向プライマー680-79-04
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してパーム領域にランダム変異を導入した。括弧は91%の示される塩基および3%の他のすべての塩基の合成を示す。
パーム領域のランダム化変異誘発を、変異誘発プライマー680-79-02
および逆方向プライマー680-79-04
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してパーム領域にランダム変異を導入した。括弧は91%の示される塩基および3%の他のすべての塩基の合成を示す。
パーム領域のランダム化変異誘発を、変異誘発プライマー680-79-02
および逆方向プライマー680-79-04
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してパーム領域にランダム変異を導入した。括弧は91%の示される塩基および3%の他のすべての塩基の合成を示す。
パーム領域のランダム化変異誘発を、変異誘発プライマー680-79-02
および逆方向プライマー680-79-04
を使用して、Tth AKK DNAに対して実行してパーム領域にランダム変異を導入した。括弧は91%の示される塩基および3%の他のすべての塩基の合成を示す。
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-03
および逆方向プライマー680-80-06
を使用して、TthAKK構築物に対して実行してA504アミノ酸にランダム変異を導入した。
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-03
および逆方向プライマー680-80-06
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してA504アミノ酸にランダム変異を導入した。
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-03
および逆方向プライマー680-80-06
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してA504アミノ酸にランダム変異を導入した。
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-07
および逆方向プライマー680-80-10
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してS517アミノ酸にランダム変異を導入した。
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-07
および逆方向プライマー680-80-10
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してA518アミノ酸にランダム変異を導入した。
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-07
および逆方向プライマー680-80-10
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してA518アミノ酸にランダム変異を導入した。
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-05
を使用して、Taq 5M構築物に対して実行してTaq 5M酵素にL451R変異を導入した。
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー680-69-04
および逆方向プライマー680-69-05
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してTth AKK酵素にA504K変異を導入した。
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー680-69-08
および逆方向プライマー583-01-02
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してTth AKK酵素にH641A変異を導入した。
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー680-70-01
および逆方向プライマー680-70-02
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してTth AKK酵素にT508P変異を導入した。
Tth Akk酵素とαペプチド間との融合
TthAKK-lacZ-α-ペプチドキメラ融合物を、コロニーの青色-白色スクリーニングに基づく全長融合タンパク質の発現を不可能性にする変異(フレームシフト、欠失、挿入などを含む)の検出を可能にするために構築した(Wuら、Nucleic Acids Research, 24: 1710 [1996])。
および959-041-04
を使用してTthAKK DNAに対して実行して、lacZαペプチドの挿入のためにTth AKKのC末端に6×Hisタグに続いてSalI部位を有するpTthAKK-Lを生成した。αペプチド(201アミノ酸)を、プライマー959-041-01
および959-093-01
を用いて最初にpCRII-TOPOベクター(Invitrogen)からPCR増幅した。次いで、PCR産物を制限酵素SalIで消化し、これもまた同じ酵素で切断したpTthAKK-Lベクターに連結して、キメラ構築物TthAKK-αペプチド(DNA配列 配列番号:481;アミノ酸配列 配列番号:482)を生成した。挿入物の向きを配列決定によって確認した。
TthAKK構築物を酵素EcoRIおよびNotIで切断し、より小さな挿入物断片をゲル精製した。TscAKKまたはTfiAKK構築物をまたEcoRIおよびNotIで切断し、より大きな断片をゲル単離および精製した。Tth挿入物(ヌクレアーゼドメイン)をTscAKKベクターおよびTfiAKKベクター(ポリメラーゼドメイン)に連結し、TthTscAKK(DNA配列 配列番号:447;アミノ酸配列 配列番号:448)キメラ構築物およびTthTfiAKK(DNA配列 配列番号:449;アミノ酸配列 配列番号:450)キメラ構築物を生成した。
Taq(FT)TthAKKの構築
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー473-087-05
を使用して、TaqTthAKK5M構築物に対して実行してL107F/A108T変異を導入し、Taq(FT)TthAKK(DNA配列 配列番号:484;アミノ酸配列 配列番号:485)を導入した。
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー785-096-01:
および785-096-02:
を使用して、TfiTthAKK5M構築物に対して実行してL107F/V108T変異を導入し、Tfi(FT)TthAKK(DNA配列 配列番号:349;アミノ酸配列 配列番号:488)を導入した。
L107F/V108T変異を、Tfi DN 2M(N)変異体(DNA配列 配列番号:345)のNotI断片およびSalI断片を単離すること、およびあらかじめNotI-SalI消化したTfi(FT)TthAKK(DNA配列 配列番号:349;アミノ酸配列 配列番号:488)にそれを挿入し、Tfi(FT)DN 2M(N)変異体(DNA配列 配列番号:350;アミノ酸配列 配列番号:351)を産生した。L107FまたはE108T変異をこのTscに基づく構築物に加えるために、同じ手順を行った。Tsc DN 2M(N)変異体のNotIおよびSalI切断した断片(DNA配列 配列番号:348)を、あらかじめNotI-SalI消化したTsc(FT)TthAKK(DNA配列 配列番号:491)ベクターにそれを挿入し、Tsc(FT)DN 2M(N)変異体(DNA配列 配列番号:352;アミノ酸配列 配列番号:353)を産生した。
以前に記載したTfi(FT)DN 2M(N)構築物(DNA配列 配列番号:350)を出発物質として、プライマー959-022-01から-04:
を、部位特異的変異誘発によって「AKK」セットの変異(H784A、G504K、およびE507K)を導入するために使用した。得られる変異体構築物を、Tfi(FT)AKK(DNA配列 配列番号:366;アミノ酸配列 配列番号:367)と名付けた。
を、部位特異的変異誘発において、Tsc(FT)DN 2M(N)構築物(DNA配列 配列番号:352)をテンプレートとして用いて、Tsc(FT)AKK(DNA配列 配列番号:368;アミノ酸配列 配列番号:369)を生成するために使用した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー785-008-03
および逆方向プライマー680-21-03
を使用して、TscTthAKKに対して実行して、L107F/E108T変異を導入およびTsc(FT)TthAKK(DNA配列 配列番号:454;アミノ酸配列 配列番号:491)を生成した。
Taq(FT)TthAKK構築物を酵素EcoRIおよびNotIで切断し、より小さな挿入物断片をゲル単離した。TscAKK構築物またはTfiAKK構築物をまた酵素EcoRIおよびNotIで切断し、より大きな断片をゲル単離および精製した。Taq(FT)挿入物(ヌクレアーゼドメイン)をTscAKKベクターおよびTfiAKKベクター(ポリメラーゼドメイン)に連結してTaq(FT)TscAKK(DNA配列 配列番号:443;アミノ酸配列 配列番号:444)キメラ構築物およびTaq(FT)TfiAKK(DNA配列 配列番号:445;アミノ酸配列 配列番号:446)キメラ構築物を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー436-013-08
および436-013-09
を使用して、Taq(FT)-TthAKK DNA(配列番号:484)に対して実行して、K70E変異を導入した。
TaqEFT-Tth(AKK)-A/M1(DNA配列 配列番号:505;アミノ酸配列 配列番号:506)の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-01
および1044-038-02
を使用して、Taq(EFT)-Tth(AKK)DNA(配列番号:501)に対して実行して、G4EA変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-03
および1044-038-04
(それぞれ配列番号:511および512)を使用して、Taq(EFT)-Tth(AKK)DNA(配列番号:501)に対して実行して、H29F変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-05
および1044-038-06
(それぞれ配列番号:515および516)を使用して、Taq(EFT)-Tth(AKK)DNA(配列番号:501)に対して実行して、K57R変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-09
および1044-038-10
(それぞれ配列番号:519および520)を使用して、Taq(EFT)-Tth(AKK)DNA(配列番号:501)に対して実行して、S125T変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-11
および1044-038-12
(それぞれ配列番号:523および524)を使用して、Taq(EFT)-Tth(AKK)DNA(配列番号:501)に対して実行して、R206L変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-13
および1044-038-14
(それぞれ配列番号:527および528)を使用して、Taq(EFT)-Tth(AKK)DNA(配列番号:501)に対して実行して、R269G変異およびR271K変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-15
および1044-038-16
(それぞれ配列番号:531および532)を使用して、Taq(EFT)-Tth(AKK)DNA(配列番号:501)に対して実行して、E290G、S291G、P292E、A294P、およびL295Rの変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-17
および1044-038-18
(それぞれ配列番号:535および536)を使用して、Taq(EFT)-Tth(AKK)DNA(配列番号:501)に対して実行して、A328C変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1080-015-01
および1080-015-02
を使用して、Taq(EFT)-Tth(AKK)DNA(配列番号:501)に対して実行して、E210K変異を導入した。
7つの独立したPCR反応を、構築物TaqEFT(AKK)(配列番号:501)をテンプレートとして、以下の変異誘発プライマー対を用いて実行した:PCR反応1;1044-038-01
および1044-038-04
(これにより108塩基対断片を産生した)、PCR反応2;1044-038-03
および1044-038-06
(これにより117塩基対断片を産生した)、PCR反応3;1044-038-05
および1044-038-10
(これにより237塩基対断片を産生した)、PCR反応4;1044-038-09
および1044-038-12
(これにより276塩基対断片を産生した)、PCR反応5;1044-038-11
および1044-038-14
(これにより228塩基対断片を産生した)、PCR反応6;1044-038-13
および1044-038-16
(これにより113塩基対断片を産生した)、PCR反応7;1044-038-15
および1044-038-18
(これにより157塩基対断片を産生した)。7種のPCR産物は、プライマーの非存在下でのPCR増幅が適切な1005塩基対産物を産生してK70E、G4EA、H29F、K57R、S125T、R206L、R269G、R271K、E290G、S291G、P292E、A294P、L295R、およびA328Cの変異を導入するように重複している。この産物を、外側のプライマー:1044-038-01(配列番号:507)および1044-038-18(配列番号:536)を使用してさらに増幅し、pPCR-Script-Ampにクローニングした。この構築物からヌクレアーゼドメインを、プライマー:1044-038-01(配列番号:507)および1044-038-18(配列番号:536)を使用して再度増幅し、EcoRIおよびNotIで消化した。消化されたPCR産物を、EcoRIおよびNotIで消化されたTaqEFT-Tth(AAK)構築物に連結し、タンパク質発現およびスクリーニングのためにJM109に形質転換した。
7つの独立したPCR反応を、構築物TaqEFT(AKK)(配列番号:501)をテンプレートとして、以下の変異誘発プライマー対を用いて実行した:PCR反応1;1044-038-01
および1044-038-04
(これにより108塩基対断片を産生した)、PCR反応2;1044-038-03
および1044-038-06
(これにより117塩基対断片を産生した)、PCR反応3;1044-038-05
および1044-038-10
(これにより237塩基対断片を産生した)、PCR反応4;1044-038-09
および1080-42-02
(これにより299塩基対断片を産生した)、PCR反応5;1080-42-01
および1044-038-14
(これにより228塩基対断片を産生した)、PCR反応6;1044-038-13
および1044-038-16
(これにより113塩基対断片を産生した)、PCR反応7;1044-038-15
および1044-038-18
(これにより157塩基対断片を産生した)。7種のPCR産物は、プライマーの非存在下でのPCR増幅が適切な1005塩基対産物を産生してK70E、G4EA、H29F、K57R、S125T、R206L、E210K、R269G、R271K、E290G、S291G、P292E、A294P、L295R、およびA328Cの変異を導入するように重複している。この産物を、外側のプライマー:1044-038-01(配列番号:507)および1044-038-18(配列番号:536)を使用してさらに増幅し、pPCR-Script-Ampにクローニングした。この構築物からヌクレアーゼドメインを、プライマー:1044-038-01(配列番号:507)および1044-038-18(配列番号:536)を使用して再度増幅し、EcoRIおよびNotIで消化した。消化されたPCR産物を、EcoRIおよびNotIで消化されたTaqEFT-Tth(AAK)構築物に連結し、酵素の発現およびスクリーニングのためにJM109に形質転換した。
Tth(K69E)AKK、Taq(K69E)TthAKK、Tfi(K69E)TthAKK、およびTsc(K69E)TthAKKならびに変異体の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー
を使用して、TthAKK、TaqTthAKK、TfiTthAKK、およびTscTthAKKのDNAに対して実行して、K69E変異を導入し、Tth(K69E)AKK(DNA配列 配列番号:452;アミノ酸配列 配列番号:494)、Taq(K69E)TthAKK(DNA配列 配列番号:495;アミノ酸配列 配列番号:496)、Tfi(K69E)TthAKK(DNA配列 配列番号:497;アミノ酸配列 配列番号:498)、およびTsc(K69E)TthAKK(DNA配列 配列番号:499;アミノ酸配列 配列番号:500)の変異体酵素を生成した。
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08:
および1044-041-01
によって、テンプレートTth(K69E)AKK(DNA配列 配列番号:452)を用いて、ならびに、プライマー1044-041-02:
および209-074-02
によって、テンプレートTsc(K69E)TthAKK(DNA配列 配列番号:454)を用いて生成した。2つの産物を合わせて、外部のプライマー390-76-08および209-74-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcpRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製したベクターTthAKKに連結して、Tsc(167-33)TthAKK構築物(DNA配列 配列番号:455;アミノ酸配列 配列番号:456)を産生した。
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08:
および1044-041-03
によって、テンプレートTth(K69E)AKK(DNA配列 配列番号:452)を用いて、ならびに、プライマー1044-041-04:
および209-074-02
によって、テンプレートTsc(K69E)TthAKK(DNA配列 配列番号:454)を用いて生成した。2つの産物を合わせて、外部のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcpRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製したベクターTthAKKに連結して、Tsc(222-334)TthAKK構築物(DNA配列 配列番号:459;アミノ酸配列 配列番号:460)を産生した。
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08:
および1044-058-05
によって、テンプレートTth(K69E)AKK(DNA配列 配列番号:452)を用いて、ならびに、プライマー1044-058-06:
および209-074-02
によって、テンプレートTfi(K69E)TthAKK(DNA配列 配列番号:497)を用いて生成した。2つの産物を合わせて、外部のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcpRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製したベクターTthAKKに連結して、Tfi(222-334)TthAKK構築物(DNA配列 配列番号:463;アミノ酸配列 配列番号:464)を産生した。
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08:
および1044-058-07
によって、テンプレートTth(K69E)AKK(DNA配列 配列番号:452)を用いて、ならびに、プライマー1044-058-08:
および209-074-02
によって、テンプレートTfi(K69E)TthAKK(DNA配列 配列番号:498)を用いて生成した。2つの産物を合わせて、外部のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcpRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製したベクターTthAKKに連結して、Tfi(167-333)TthAKK構築物(DNA配列 配列番号:467;アミノ酸配列 配列番号:468)を産生した。
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08:
および1044-058-01
によって、テンプレートTth(K69E)AKK(DNA配列 配列番号:452)を用いて、ならびに、プライマー1044-058-02:
および209-074-02
によって、テンプレートTsc(K69E)TthAKK(DNA配列 配列番号:499)を用いて生成した。2つの産物を合わせて、外部のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcpRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製したベクターTthAKKに連結して、Tsc(167-333)TthAKK構築物(DNA配列 配列番号:471;アミノ酸配列 配列番号:472)を産生した。
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08:
および1044-058-03
によって、テンプレートTsc(K69E)TthAKK(DNA配列 配列番号:499)を用いて、ならびに、プライマー1044-058-04:
および209-074-02
によって、テンプレートTth(K69E)AKK(DNA配列 配列番号:452)を用いて生成した。2つの産物を合わせて、外部のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcpRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製したベクターTthAKKに連結して、Tsc(1-167)TthAKK構築物(DNA配列 配列番号:475;アミノ酸配列 配列番号:476)を産生した。
pAfuFENの構築
プラスミドpAfuFEN1を記載されたように(米国特許出願第09/684,938号、国際公開公報第98/23774号、各々その全体が参照として本明細書に組み入れられる)調製した。手短に述べると、ゲノムDNAを、DSMZからの生きているA.フルギドゥス細菌(DSMZ#4304)の1バイアル(約5ml培養物)から、製造業者の指示書に従ってDNA XTRAXキット(Gull Laboratories, Salt Lake City, UT)を用いて調製した。最終的なDNAペレットを、100μlのTE(10mM Tris HCl、pH 8.0、1mM EDTA)に懸濁した。1μlのDNA溶液を、ADVANTAGE cDNA PCRキット(Clontech)を使用してPCRに利用した;PCRを製造業者の推奨に従って行った。
である。得られる断片のクローニングは、プラスミドpTrc99-AFFEN1を作製するために、PfuFEN1遺伝子について、米国特許出願第5,994,069号(すべての目的のためにその全体が参照として本明細書に組み入れられる)に記載された。発現のために、pTrc99AfuHisプラスミドを、精製を容易にするためにヒスチジンテールを付加することによりpTrc99-AFFEN1を改変することによって構築した。このヒスチジンテールを付加するために、標準的PCRプライマー特異的変異誘発法を使用して、pTrc99-AFFEN1のコード領域の最後のアミノ酸コドンと停止コドンとの間に6つのヒスチジン残基についてのコード配列を挿入する。得られるプライマーをpTrcAfuHisと名付けた。次いで、タンパク質を記載されるように発現させ、Ni++アフィニティーカラムへの結合によって精製した。
2つの重複するPCR断片を、プライマー785-73-04:
および700-10-03
によって、ならびに、プライマー390-076-08:
および785-73-06
を用いて、テンプレートAfuFEN(DNA配列 配列番号:556)から生成した。2つの産物を合わせて、外部のプライマー700-10-03および390-076-08を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素NcoIおよびSalIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製したAfuFEN構築物に連結して、Afu(Y236A)構築物(DNA配列 配列番号:549;アミノ酸配列 配列番号:550)を産生した。
2つの重複するPCR断片を、プライマー785-73-05:
および700-10-03
を用いて、ならびに、プライマー390-076-08:
および785-73-06
を用いて、テンプレートAfuFENを使用して生成した。2つの産物を合わせて、外部のプライマー700-10-03および390-076-08を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素NcoIおよびSalIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製したAfuFEN構築物に連結して、Afu(Y236A)構築物(DNA配列 配列番号:552;アミノ酸配列 配列番号:553)を産生した。
以下の酵素構築物は、AfuFEN酵素ポリメラーゼドメインの部分およびテルムスポリメラーゼポリメラーゼドメインを合わせる。これらの組み合わせを、分子モデリングによって生成された情報に基づいて設計した。
2つの重複するPCR断片を生成した。第1の断片を、AfuFEN構築物(配列番号:556)をテンプレートとして使用して、プライマー390-076-08:
および390-065-05
を用いて作製した。第2の断片を、TthAKK(配列番号:558)をテンプレートとして使用して、ならびにプライマー700-049-01:
および390-076-09
を使用して作製した。2つの産物は配列重複の領域を含み、2つの産物を合わせて、外部のプライマー390-076-08および390-076-09を用いて組換えPCR反応において増幅した。組換えPCR産物を制限酵素BspEIおよびSalIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製したAfuFEN構築物に連結して、Afu336-Tth296(AKK)構築物(DNA配列 配列番号:559;アミノ酸配列 配列番号:560)を産生した。
2つの重複するPCR断片を生成した。第1の断片を、プライマー390-076-08:
および700-049-02
によって、AfuFEN構築物(配列番号:556)をテンプレートとして使用して作製した。第2の断片を、プライマー700-049-03:
および390-076-09
を使用して、TthAKK(配列番号:558)をテンプレートとして使用して、作製した。2つの産物は配列重複の領域を含み、2つの産物を合わせて、外部のプライマー390-076-08および390-076-09を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素BspEIおよびSalIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製したAfuFEN構築物に連結して、Afu336-Tth296(AKK)構築物(DNA配列 配列番号:563;アミノ酸配列 配列番号:564)を産生した。
Taq5M構築物(配列番号:41)をNotIおよびSalIで切断し、より小さな挿入物断片をゲル単離した。Afu336-Tth296(AKK)構築物(DNA配列 配列番号:559)をまた同じ制限酵素で切断し、より大きなベクター断片を精製した。次いで、挿入物(Taq5Mポリメラーゼドメイン)をベクターに連結し、Afu336-Taq5M構築物(DNA配列 配列番号:565;アミノ酸配列 配列番号:566)を生成した。
TaqDNHT構築物(配列番号:41)をNotIおよびSalIで切断し、より小さな挿入物断片をゲル単離した。Afu336-Tth296(AKK)構築物(DNA配列 配列番号:559)をまた同じ制限酵素で切断し、より大きなベクター断片を精製した。次いで、挿入物(TaqDNポリメラーゼドメイン)をベクターに連結し、Afu336-Taq5M構築物(DNA配列 配列番号:567;アミノ酸配列 配列番号:568)を生成した。
変化した機能を有する多数の酵素を、DNAシャッフリングの原理に基づくテルムスポリメラーゼのランダムキメラ作製を介して生成した(VolkovおよびArnold、Methods in Enzymology 328: 456 [2000])。以下の手順を使用して以下のキメラを開発した。
および209-74-02:
を用いてPCR増幅して、約1.4kbpテンプレートを生成した。約2μgのDNAテンプレートを等しい比率で混合し、次いで30μl反応溶液で、DNaseI(0.33U)で15℃で約1分間消化し、50-200bpのサイズの断片を生成した。DNA断片を4%アガロースで精製し、製造業者の指示書に従ってQIAEXIIゲル抽出キット(QIAGEN)によって抽出した。精製された断片(10μl)を、断片アセンブリー反応(PCRプログラム:3分間94℃、次に、30秒間94℃、1分間52℃、2分間+5秒間72℃の40サイクル、次に4分間72℃)のために、10μlの2×PCRプレミックス(5倍希釈、クローニングしたPfuバッファー、0.4mM 各dNTP、0.06U/μl クローニングしたPfu DNAポリメラーゼ、STRATAGENEカタログ番号#600153、付属するバッファーを伴う)に加えた。次いで、再アセンブルした産物(10倍希釈物の1μl)を一対のネスト化プライマー:072-090-01
および189-082-01
を用いて、製造業者の指示書に従ってCLONTECH GC melt cDNAキット(カタログ番号#K1907-Y)を使用して増幅した。精製したPCR産物を制限酵素EcoRIおよびNotIで消化し、次いで同じ酵素で切断することによって調製したTthAKKに連結した。ライゲーション混合物をJM109コンピテント細胞に形質転換し、コロニーを酵素活性についてスクリーニングした。
これらのキメラ酵素を開発するためのテンプレートはTthAKK、TaqTthAKK、TscTthAKK、およびTfiTthAKKの構築物からのヌクレアーゼドメインであった。2つのクローンが最初の活性スクリーニングに基づいて活性の改善を示すことが見い出された。次いで、ランダムキメラS26(DNA配列 配列番号:571;アミノ酸配列 配列番号:572)およびS36(DNA配列 配列番号:573;アミノ酸配列 配列番号:574)を配列決定および単離した。
S26(FT)の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー:785-008-03
および680-21-03
を使用してpS26 DNAに対して実行して、L107F/E108T変異を導入およびS26(FT)(DNA配列 配列番号:575;アミノ酸配列 配列番号:576)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー:785-096-01
および785-096-02
を使用してpS36 DNAに対して実行して、L107F/V110T変異を導入およびS36(FT)(DNA配列 配列番号:577;アミノ酸配列 配列番号:578)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー:
を使用してS26 DNAに対して実行して、K69E変異を導入およびS26(K69E)(DNA配列 配列番号:579;アミノ酸配列 配列番号:580)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー:
を使用してS26(FT)DNAに対して実行して、K69E変異を導入およびS26(FT/K69E)(DNA配列 配列番号:581;アミノ酸配列 配列番号:582)を生成した。
これらのキメラを生成するために使用されたテンプレートは、構築物Tth(K69E)AKK、Taq(K69E)TthAKK、Tsc(K69E)TthAKK、およびTfi(K69E)TthAKKのヌクレアーゼドメインであった。4つのクローンが、初回の活性スクリーニングに基づいて改善された活性を示した。次いで、ランダムキメラN3D7(DNA配列 配列番号:583;アミノ酸配列 配列番号:584)、N1A12(DNA配列 配列番号:585;アミノ酸配列 配列番号:586)、N1C4(DNA配列 配列番号:587;アミノ酸配列 配列番号:588)、およびN2C3(DNA配列 配列番号:589;アミノ酸配列 配列番号:590)をそれぞれ配列決定および単離した。
アミノ酸385におけるAspからGlyへの変化(D385G)およびアミノ酸455におけるArgからLeuへの変化(R455L)を有するTthポリメラーゼの改変体(アミノ酸配列 配列番号:2712;遺伝子配列 配列番号:2713)を使用して、誘導体酵素およびキメラ酵素を作製した。これらの2つのアミノ酸の変化を含む構築物を以下の「GL」の表記によって示す。1つのみの変化を含むキメラは「G」または「L」のいずれかとして示す。非重合改変体を作製するために、787位のアスパラギン酸をコードする配列を、上記のような部位特異的変異誘発によって、アスパラギンをコードする配列に変化させた。以下のヌクレオチド:
を有するpTrcTth GL-2の変異誘発を、プラスミドpTrcTthDN GLを作製するために実行した。変異体タンパク質およびコードする核酸配列を、それぞれTthDN GL、配列番号:2714および2715と呼ぶ。
6アミノ酸のヒスチジンタグ(his-タグ)を、Tth DNについて上記に記載されたようにTth DN HT GLのカルボキシ末端に付加した。得られた変異体遺伝子をTth DN HT GL(DNA配列 配列番号:2716;アミノ酸配列 配列番号:2717)と名付けた。このタンパク質を、上記のTth DN HTについて記載されるように発現させおよび精製した。
変異誘発を、3つのさらなる独特な制限部位をTth DN HT酵素のポリメラーゼドメインに導入するために実行した。部位特異的変異誘発を、製造業者の指示書に従ってTransformer Site-Directed Mutagenesis Kit(Clontech)を使用して実行した。2つの異なる選択プライマー、Trans Oligo AlwNI/SpeIまたはSwitch Oligo SpeI/AlwNI(Clontech, Palo Alto CA カタログ番号#6488-1またはカタログ番号#6373-1)のうちの1つを、記載されるすべての変異誘発反応のために使用した。所定の反応において使用される選択オリゴはベクターに存在する選択制限部位に依存する。すべての変異誘発プライマーを標準的な合成化学によって合成した。生成したコロニーを大腸菌株JM109において発現させた。
を使用して作製した。BstI部位(アミノ酸382位)およびNdeI部位(アミノ酸443位)を、センス鎖変異誘発プライマー
を使用して遺伝子に導入した。変異体プラスミドを過剰発現させ、Qiagen QiaPrep Spin Mini Prep Kit(カタログ番号#27106)を使用して精製した。ベクターを、DNA配列決定および制限酵素地図作製によって制限部位の存在について試験した。この構築物を、Tth DN RX HT GL(DNA配列 配列番号:2718;アミノ酸配列 配列番号:2719)と名付けた。キメラ構築物をTth DN RX HT GLを使用して作製した。
実行した最初の交換は2つの酵素のポリメラーゼドメインを含んだ。ヌクレアーゼドメイン(タンパク質のN末端ドメイン)のポリメラーゼドメイン(タンパク質のC末端ドメイン)からの分離には、制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびNotIを用いる両方の遺伝子の切断が伴った。Taq DN RX HT GL遺伝子からの約900塩基対断片を、Tth DN RX HT GL遺伝子の相同部位にクローニングし、キメラTaqTth(N)GL(DNA配列 配列番号:2675;アミノ酸配列 配列番号:2641)を産生し、これは、Taq DN RX HT GL 5'ヌクレアーゼドメインおよびTth DN RX HT GLポリメラーゼドメインを有する。
Taq DN RX HT構築物を酵素NdeIおよびBamHIで切断し、より大きなベクター断片を上記のようにゲル単離した。Tth DN RX HT GL構築物もまた酵素NdeIおよびBamHIで切断し、より小さな(約795塩基対)Tth断片をゲル単離および精製した。Tth GL NdeI-BamHI挿入物をTaq NdeI-BamHIベクターに上記のように連結し、TaqTth(N-B)GL(DNA配列 配列番号:2676;アミノ酸配列 配列番号:2642)を生成した。
Taq DN RX HT構築物を酵素NotIおよびNdeIで切断し、より大きなベクター断片を上記のように単離した。Tth DN RX HT GL構築物もまた酵素NotIおよびNdeIで切断し、より小さな(約345塩基対)Tth断片をゲル単離および精製した。Tth GL NotI-NdeI挿入物をTaq NotI-NdeIベクターに上記のように連結し、TaqTth(N-D)G(DNA配列 配列番号:2677;アミノ酸配列 配列番号:2643)を生成した。
Taq DN RX HT構築物を酵素NdeIおよびBamHIで切断し、より大きなベクター断片を上記のように単離した。Tth DN RX HT GL構築物もまた酵素NdeIおよびBamHIで切断し、より小さな(約450塩基対)Tth断片をゲル単離および精製した。Tth GL NdeI-BamHI挿入物をTaq NdeI-BamHIベクターに上記のように連結し、TaqTth(D-B)L(DNA配列 配列番号:2678;アミノ酸配列 配列番号:2644)を生成した。
Taq DN RX HT構築物を酵素BstBIおよびBamHIで切断し、より大きなベクター断片を上記のように単離した。Tth DN RX HT GL構築物もまた酵素BstBIおよびBamHIで切断し、より小さな(約633塩基対)Tth断片をゲル単離および精製した。Tth GL NdeI-BamHI挿入物をTaq NdeI-BamHIベクターに上記のように連結し、TaqTth(Bs-B)L(DNA配列 配列番号:2679;アミノ酸配列 配列番号:2645)を生成した。
Taq DN RX HT構築物を酵素NotIおよびBstBIで切断し、より大きなベクター断片を上記のように単離した。Tth DN RX HT GL構築物もまた酵素NotIおよびBstBIで切断し、より小さな(約162塩基対)Tth断片をゲル単離および精製した。Tth GL NotI-BstBI挿入物をTaq NotI-BstBIベクターに上記のように連結し、TaqTth(N-Bs)G(DNA配列 配列番号:2680;アミノ酸配列 配列番号:2646)を生成した。
Tth DN RX HT構築物を酵素BamHIおよびSalIで切断し、より大きなベクター断片を上記のように単離した。Taq DN RX HT構築物もまた酵素BamHIおよびSalIで切断し、より小さな(約741塩基対)Taq断片をゲル単離および精製した。Taq BamHI-SalI挿入物をTth GL BamHI-SalIベクターに上記のように連結し、TthTaq(B-S)GL(DNA配列 配列番号:2681;アミノ酸配列 配列番号:2647)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-01
を使用してpTrc99A TaqTth(D-B)L DNAに対して実行して、E404H変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-02
を使用してpTrc99A TaqTth(D-B)L DNAに対して実行して、F413H変異およびA414R変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-03
を使用してpTrc99A TaqTth(D-B)L DNAに対して実行して、W417L変異およびG418K変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-04
を使用してpTrc99A TaqTth(D-B)DNAに対して実行して、A439R変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-05
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)G DNAに対して実行して、L415変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-06
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)G DNAに対して実行して、L415Q変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-07
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)G DNAに対して実行して、V463L変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-08
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)G DNAに対して実行して、A468R変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-09
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)G DNAに対して実行して、A472E変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-10
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)G DNAに対して実行して、G499R変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー276-046-04
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)G DNAに対して実行して、E507Q変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-11
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)G DNAに対して実行して、Y535H変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-12
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)G DNAに対して実行して、S543N変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-13
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)G DNAに対して実行して、I546V変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-14
を使用してpTrc99A TaqTth(N-D)G DNAに対して実行して、D551S変異およびI553V変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、以下のプライマーを使用して、pTrc99A Tth DN RX HT GL DNAに対して実行した:H641A変異(DNA配列 配列番号:2699;アミノ酸配列 配列番号:2665)を導入するための変異誘発プライマー583-001-02
またはH748A変異体(DNA配列 配列番号:2700;アミノ酸配列 配列番号:2666)を生成するための変異誘発プライマー583-001-03
またはH786A変異体酵素(DNA配列 配列番号:2701;アミノ酸配列 配列番号:2667)を生成するための変異誘発プライマー583-001-04
。
上記に生成される変異体Tth DN RX HT GL H786Aを出発物質として、部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー604-022-02:
を使用して行い、「TthAKK GL」(DNA配列 配列番号:2702;アミノ酸配列 配列番号:2668)と名付けられたこの改変体を生成した。
TthDN RX HT H786A GL(配列番号:2667)酵素のヘリックス-ヘアピン-ヘリックス領域における変異体を生成するために、2つの異なるPCR反応を、H786A変異体(配列番号:2701)をテンプレートとして使用して実行した。上記に議論されたTthDN GL H786Aを出発物質として、プライマー604-08-06:
およびプライマー390-76-08:
を使用して、620塩基対PCR断片を生成した。PCR反応を、製造業者の指示書に従ってAdvantage cDNA PCRキット(Clontech)を使用して実行した。このPCR産物はアミノ酸1-194を含む。この反応を介しては変異は導入されなかったが、しかし、制限酵素部位EcoRIは5'末端に存在する。
およびプライマー209-74-02:
を使用して、787塩基対PCR断片を生成した。PCR反応を上記のように実行した。この断片は、変異誘発プライマー604-08-05の存在に起因するランダム変異を含む。このプライマーの括弧内の塩基は、その配列の91%が野生型であるのに対して、さらなる9%が残りの3種の塩基間で均等に分けられている。
TthDN RX HT GL H786A/P197R/K200R(DNA配列 配列番号:2703;アミノ酸配列 配列番号:2669)。
TthDN RX HT GL H786A/K205Y(DNA配列 配列番号:2704;アミノ酸配列 配列番号:2670)。
TthDN RX HT GL H786A/G203R(DNA配列 配列番号:2705;アミノ酸配列 配列番号:2671)。
キメラ変異体TaqTthAKK GLを、TthDN RX HT GL(H786A/G506K/Q509K)(配列番号:2702;ここではTthAKK GLと略す)およびTaq 4M G504(配列番号:108;ここではTaq 5Mと略す)を制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびNotIを用いて切断することによって生成した。Taq 5Mのより小さな挿入物断片およびTth AKK GLのより大きなベクター断片を、実施例3Dにおいて詳述するようにゲル精製し、そして挿入物断片を実施例3Dに記載されるように連結した。スクリーニングおよび構築物配列の確認もまた、実施例3Dと同様に行った。
TfiAKK GL(配列番号:2702)とTfiDN 2M(配列番号:130)、またはTsc DN 2M(配列番号:131)との間のキメラ酵素を生成するために、TthDN RX HT GL(H786A/G506K/Q509K)DNA(配列番号:2702)をEcoRIおよびNotIで切断し、より大きなベクター断片を上記のようにゲル単離した。TfiおよびTscの993塩基対のEcoRI-NotI断片を実施例8において記載されるように調製した。ライゲーションを実施例3Dにおいて記載されるように実行し、スクリーニングおよび構築物配列の確認もまた同様に行った。
TthAKK GL構築物のヌクレアーゼドメインにおけるアミノ酸195位に変異(P195AまたはP195K)を導入するために、変異誘発プライマー785-073-01(P195A)
または785-073-02(P195K)
およびプライマー209-074-02
をPCR反応において使用して、787塩基対断片を生成した。別のPCR断片を、プライマー390-076-08
および785-073-03
を反応において同じテンプレートとともに使用することによって得た。
同じアプローチを、TthAKK GL(N417K/L418K)を構築するために使用した。2つの重複するPCR断片を、変異誘発プライマー:785-73-07
および700-10-03
、ならびにプライマー158-084-01
および785-73-08
によって生成した。2つの産物を合わせ、外側のプライマー700-10-03および158-084-01を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素NotIおよびBamHIで切断し、NotI/BamHIであらかじめ切断したTthAKK GL構築物に連結した。この変異体をTthAKK GL(DNA配列 配列番号:2725;アミノ酸配列 配列番号:2726)と名付けた。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー886-049-05および886-049-06:
を使用してTthAKK GL構築物に対して実行して、TthAKK GL(P255L)(DNA配列 配列番号:2727;アミノ酸配列 配列番号:2728)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー886-049-09および886-049-10:
を使用してTthAKK GL構築物に対して実行して、TthAKK GL(F311Y)(DNA配列 配列番号:2729;アミノ酸配列 配列番号:2730)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー886-049-01および886-049-02:
を使用してTthAKK GL構築物に対して実行して、TthAKK GL(N221H/R224Q)(DNA配列 配列番号:2731;アミノ酸配列 配列番号:2732)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー886-049-03および886-049-04:
を使用してTthAKK GL構築物に対して実行して、TthAKK GL(R251H)(DNA配列 配列番号:2733;アミノ酸配列 配列番号:2734)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー886-088-01および886-088-02:
を使用してTthAKK GL(P255L)構築物に対して実行して、TthAKK GL(P255L/R251H)(DNA配列 配列番号:2735;アミノ酸配列 配列番号:2736)を生成した。
パーム領域ランダム化変異誘発を、変異誘発プライマー680-79-02
および逆方向プライマー680-79-04
を使用してTthAKK GL構築物に対して実行して、パーム領域にランダム変異を導入した。括弧は示される91%の塩基および3%の他のすべての塩基の合成を示す。
パーム領域ランダム化変異誘発を、変異誘発プライマー680-79-02
および逆方向プライマー680-79-04
を使用してTthAKK GL構築物に対して実行して、パーム領域にランダム変異を導入した。括弧は示される91%の塩基および3%の他のすべての塩基の合成を示す。
パーム領域ランダム化変異誘発を、変異誘発プライマー680-79-02
および逆方向プライマー680-79-04
を使用してTthAKK GL構築物に対して実行して、パーム領域にランダム変異を導入した。括弧は示される91%の塩基および3%の他のすべての塩基の合成を示す。
パーム領域ランダム化変異誘発を、変異誘発プライマー680-79-02
および逆方向プライマー680-79-04
を使用してTthAKK GL構築物に対して実行して、パーム領域にランダム変異を導入した。括弧は示される91%の塩基および3%の他のすべての塩基の合成を示す。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-03
および逆方向プライマー680-80-06
を使用してTth AKK GL構築物に対して実行して、A504アミノ酸にランダム変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-03
および逆方向プライマー680-80-06
を使用してTth AKK GL構築物に対して実行して、A504アミノ酸にランダム変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-03
および逆方向プライマー680-80-06
を使用してTth AKK GL構築物に対して実行して、A504アミノ酸にランダム変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-07
および逆方向プライマー680-80-10
を使用してTth AKK GL構築物に対して実行して、S517アミノ酸にランダム変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-07
および逆方向プライマー680-80-10
を使用してTth AKK GL構築物に対して実行して、A518アミノ酸にランダム変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-07
および逆方向プライマー680-80-10
を使用してTth AKK GL構築物に対して実行して、A518アミノ酸にランダム変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー680-69-04
および逆方向プライマー680-69-05
を使用してTth AKK GL構築物に対して実行して、Tth AKK GL酵素にA504K変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー680-69-08
および逆方向プライマー583-01-02
を使用してTth AKK GL構築物に対して実行して、Tth AKK GL酵素にH641A変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー680-70-01
および逆方向プライマー680-70-02
を使用してTthAKK GL構築物に対して実行して、Tth AKK GL酵素にT508P変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー473-087-05
を使用してTaqTthAKK GL構築物に対して実行して、L107F/A108T変異を導入し、Taq(FT)Tth AKK GL(DNA配列 配列番号:2779;アミノ酸配列 配列番号:2780)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー785-096-01
および785-096-02
を使用してTfiTthAKK GL構築物に対して実行して、L107F/V108T変異を導入し、Tfi(FT)Tth AKK GL(DNA配列 配列番号:2720;アミノ酸配列 配列番号:2781)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー785-008-03
および逆方向プライマー680-21-03
を使用してTscTthAKK GL構築物に対して実行して、L107F/E108T変異を導入し、Tsc(FT)TthAKK GL(DNA配列 配列番号:2764;アミノ酸配列 配列番号:2782)を生成した。
TthAKK GL-lacZ-ペプチドキメラ融合物を構築して、変異(フレームシフト、欠失、挿入など)の検出を可能にした。これは、コロニーの青色-白色スクリーニングに基づいて全長融合タンパク質の発現を不可能にする(Wuら、Nucleic Acids Research, 24: 1710 [1996])。
および959-041-04
を使用してTthAKK GL DNAに対して実行して、lacZαペプチドの挿入のためにTthAKK GLのC末端に6×Hisの後のSalI部位を有するpTthAKK GL-Lを生成した。αペプチド(201アミノ酸)を最初に、pCRII-TOPOベクター(Invitrogen)から、プライマー959-041-01
および959-093-01
を用いてPCR増幅した。次いで、PCR産物を制限酵素SalIで消化し、pTthAKK GL-Lベクター(これもまた同じ酵素で切断した)に連結して、キメラ構築物TthAKK GL-αペプチド(DNA配列 配列番号:2777;アミノ酸配列 配列番号:2778)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー436-013-08
および436-013-09
を使用してTaq(FT)-Tth(AKK)GL DNA構築物に対して実行して、K70E変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-01
および1044-038-02
を使用してTaq(EFT)-Tth(AKK)GL DNA(配列番号:2790)に対して実行して、G4EA変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-03
および1044-038-04
(それぞれ配列番号:511および512)を使用してTaq(EFT)-Tth(AKK)GL DNA(配列番号:2790)に対して実行して、H29F変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-05
および1044-038-06
(それぞれ配列番号:515および516)を使用してTaq(EFT)-Tth(AKK)GL DNA(配列番号:2790)に対して実行して、K57R変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-09
および1044-038-10
(それぞれ配列番号:519および520)を使用してTaq(EFT)-Tth(AKK)GL DNA(配列番号:2790)に対して実行して、S125T変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-11
および1044-038-12
(それぞれ配列番号:523および524)を使用してTaq(EFT)-Tth(AKK)GL DNA(配列番号:2790)に対して実行して、R206L変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-13
および1044-038-14
(それぞれ配列番号:527および528)を使用してTaq(EFT)-Tth(AKK)GL DNA(配列番号:2790)に対して実行して、R269G変異およびR271K変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-15
および1044-038-16
(それぞれ配列番号:531および532)を使用してTaq(EFT)-Tth(AKK)GL DNA(配列番号:2790)に対して実行して、変異E290G、S291G、P292E、A294P、およびL295Rを導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-17
および1044-038-18
(それぞれ配列番号:535および536)を使用してTaq(EFT)-Tth(AKK)GL DNA(配列番号:2790)に対して実行して、A328C変異を導入した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1080-015-01
および1080-015-02
を使用してTaq(EFT)-Tth(AKK)GL DNA(配列番号:2790)に対して実行して、E210K変異を導入した。
7つの独立したPCR反応を、構築物TaqEFT(AKK)GL(配列番号:2790)をテンプレートとして、以下の変異誘発プライマー対を用いて実行した:PCR反応1;1044-038-01
および1044-038-04
(これにより108塩基対断片を産生した)、PCR反応2;1044-038-03
および1044-038-06
(これにより117塩基対断片を産生した)、PCR反応3;1044-038-05
および1044-038-10
(これにより237塩基対断片を産生した)、PCR反応4;1044-038-09
および1044-038-12
(これにより276塩基対断片を産生した)、PCR反応5;1044-038-11
および1044-038-14
(これにより228塩基対断片を産生した)、PCR反応6;1044-038-13
および1044-038-16
(これにより113塩基対断片を産生した)、PCR反応7;1044-038-15
および1044-038-18
(これにより157塩基対断片を産生した)。7種のPCR産物は、プライマーの非存在下でのPCR増幅が適切な1005塩基対産物を産生してK70E、G4EA、H29F、K57R、S125T、R206L、R269G、R271K、E290G、S291G、P292E、A294P、L295R、およびA328Cの変異を導入するように重複している。この産物を、外側のプライマー:1044-038-01(配列番号:507)および1044-038-18(配列番号:536)を使用してさらに増幅し、pPCR-Script-Ampにクローニングした。この構築物からヌクレアーゼドメインを、プライマー:1044-038-01(配列番号:507)および1044-038-18(配列番号:536)を使用して再度増幅し、EcoRIおよびNotIで消化した。消化されたPCR産物を、EcoRIおよびNotIで消化されたTaqEFT-Tth(AAK)GL構築物に連結し、タンパク質発現およびスクリーニングのためにJM109に形質転換した。
7つの独立したPCR反応を、構築物TaqEFT(AKK)GL(配列番号:2790)をテンプレートとして、以下の変異誘発プライマー対を用いて実行した:PCR反応1;1044-038-01
および1044-038-04
(これにより108塩基対断片を産生した)、PCR反応2;1044-038-03
および1044-038-06
(これにより117塩基対断片を産生した)、PCR反応3;1044-038-05
および1044-038-10
(これにより237塩基対断片を産生した)、PCR反応4;1044-038-09
および1080-42-02
(これにより299塩基対断片を産生した)、PCR反応5;1080-42-01
および1044-038-14
(これにより228塩基対断片を産生した)、PCR反応6;1044-038-13
および1044-038-16
(これにより113塩基対断片を産生した)、PCR反応7;1044-038-15
および1044-038-18
(これにより157塩基対断片を産生した)。7種のPCR産物は、プライマーの非存在下でのPCR増幅が適切な1005塩基対産物を産生してK70E、G4EA、H29F、K57R、S125T、R206L、E210K、R269G、R271K、E290G、S291G、P292E、A294P、L295R、およびA328Cの変異を導入するように重複している。この産物を、外側のプライマー:1044-038-01(配列番号:507)および1044-038-18(配列番号:536)を使用してさらに増幅し、pPCR-Script-Ampにクローニングした。この構築物からヌクレアーゼドメインを、プライマー:1044-038-1(配列番号:507)および1044-038-18(配列番号:536)を使用して再度増幅し、EcoRIおよびNotIで消化した。消化されたPCR産物を、EcoRIおよびNotIで消化されたTaqEFT-Tth(AAK)GL構築物に連結し、酵素の発現およびスクリーニングのためにJM109に形質転換した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー
を使用してTthAKK GL、TaqTthAKK GL、TfiTthAKK GL、およびTscTthAKK GLのDNAに対して実行して、K69E変異を導入し、Tth(K69E)AKK GL(DNA配列 配列番号:2763;アミノ酸配列 配列番号:2783)、Taq(K69E)ThAKK GL(DNA配列 配列番号:2784;アミノ酸配列 配列番号:2785)、Tfi(K69E)TthAKK GL(DNA配列 配列番号:2786;アミノ酸配列 配列番号:2787)、およびTsc(K69E)TthAKK GL(DNA配列 配列番号:2788;アミノ酸配列 配列番号:2789)を生成した。
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08:
および1044-041-01:
によってテンプレートTth(K69E)AKK GL(DNA配列 配列番号:2763)を用いて、ならびに、プライマー1004-041-02:
および209-074-02:
によってテンプレートTsc(K69E)TthAKK GL(DNA配列 配列番号:2764)を用いて、生成した。2つの産物を合わせて、外側のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcoRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製されたベクターTthALL GLに連結し、Tsc(167-333)TthAKK GL構築物(DNA配列 配列番号:2765;アミノ酸配列 配列番号:2766)を産生した。
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08:
および1044-041-03:
によってテンプレートTth(K69E)AKK GL(DNA配列 配列番号:2763)を用いて、ならびに、プライマー1004-041-04:
および209-074-02:
によってテンプレートTsc(K69E)TthAKK GL(DNA配列 配列番号:2764)を用いて、生成した。2つの産物を合わせて、外側のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcoRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製されたベクターTthAKK GLに連結し、Tsc(222-334)TthAKK GL構築物(DNA配列 配列番号:2767;アミノ酸配列 配列番号:2768)を産生した。
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08:
および1044-058-05:
によってテンプレートTth(K69E)AKK GL(DNA配列 配列番号:2763)を用いて、ならびに、プライマー1004-058-06:
および209-074-02:
によってテンプレートTfi(K69E)TthAKK GL(DNA配列 配列番号:2786)を用いて、生成した。2つの産物を合わせて、外側のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcoRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製されたベクターTthAKK GLに連結し、Tfi(222-334)TthAKK GL構築物(DNA配列 配列番号:2769;アミノ酸配列 配列番号:2770)を産生した。
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08:
および1044-058-07:
によってテンプレートTth(K69E)AKK GL(DNA配列 配列番号:2763)を用いて、ならびに、プライマー1004-058-08:
および209-074-02:
によってテンプレートTfi(K69E)TthAKK GL(DNA配列 配列番号:2787)を用いて、生成した。2つの産物を合わせて、外側のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcoRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製されたベクターTthALL GLに連結し、Tfi(167-333)TthAKK GL構築物(DNA配列 配列番号:2771;アミノ酸配列 配列番号:2772)を産生した。
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08:
および1044-058-01:
によってテンプレートTth(K69E)AKK GL(DNA配列 配列番号:2763)を用いて、ならびに、プライマー1004-058-02:
および209-074-02:
によってテンプレートTsc(K69E)TthAKK GL(DNA配列 配列番号:2788)を用いて、生成した。2つの産物を合わせて、外側のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcoRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製されたベクターTthAKK GLに連結し、Tsc(167-333)TthAKK GL構築物(DNA配列 配列番号:2773;アミノ酸配列 配列番号:2774)を産生した。
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08:
および1044-058-03:
によってテンプレートTsc(K69E)TthAKK GL(DNA配列 配列番号:2788)を用いて、ならびに、プライマー1004-058-04:
および209-074-02:
によってテンプレートTth(K69E)AKK GL(DNA配列 配列番号:2763)を用いて、生成した。2つの産物を合わせて、外側のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcoRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製されたベクターTthAKK GLに連結し、Tsc(1-167)TthAKK GL構築物(DNA配列 配列番号:2775;アミノ酸配列 配列番号:2776)を産生した。
2つの重複するPCR断片を生成した。第1の断片を、AfuFEN構築物(配列番号:556)をテンプレートとして使用してプライマー390-76-08:
および390-065-05:
を用いて作製した。第2の断片を、TthAKK GL(配列番号:2702)をテンプレートとして使用してプライマー700-049-01:
および390-076-09:
を用いて作製した。2つの産物は配列の重複の領域を含み、この2つの産物を合わせて、外側のプライマー390-076-08および390-076-09を用いて組換えPCR反応において増幅した。組換えPCR産物を制限酵素BspEIおよびSalIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製されたベクターAfuFEN構築物に連結し、Afu336-Tth296(AKK)GL構築物(DNA配列 配列番号:2814;アミノ酸配列 配列番号:2815)を産生した。
2つの重複するPCR断片を生成した。第1の断片は、プライマー390-76-08:
および700-049-02:
によって、テンプレートAfuFEN(DNA配列 配列番号:556)を用いた。第2の断片は、プライマー700-049-03:
および390-076-09:
によって、テンプレートTthAKK GL(DNA配列 配列番号:2702)を用いた。この2つの産物を合わせて、外側のプライマー390-076-08および390-076-09を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素BspEIおよびSalIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製されたベクターpAfuFENに連結し、Afu336-Tth296(AKK)GL構築物(DNA配列 配列番号:2816;アミノ酸配列 配列番号:2817)を産生した。
これらのキメラ酵素を開発するために使用されるテンプレートは、構築物TthAKK GL、TscTthAKK GL、TscTthAKK GL、およびTfiTthAKK GLからのヌクレアーゼドメインであった。2つのクローンが、一次活性スクリーニングに基づいて活性の改善を示すことが見い出された。次いで、ランダムキメラS26 GL(DNA配列 配列番号:2818;アミノ酸配列 配列番号:2819)およびS36(DNA配列 配列番号:2820;アミノ酸配列 配列番号:2821)を配列決定および単離した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー:785-008-03
および680-21-03
を使用してpS26 GL DNAに対して実行して、L107F/E108T変異を導入およびS26(FT)GL(DNA配列 配列番号:2822;アミノ酸配列 配列番号:2823)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー:785-096-01:
および785-096-02
を使用してpS36 GL DNAに対して実行して、L109F/V110T変異を導入およびS36(FT)GL(DNA配列 配列番号:2824;アミノ酸配列 配列番号:2825)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー:
を使用してS26 GL DNAに対して実行して、K69E変異を導入およびS26(K69E)GL(DNA配列 配列番号:2826;アミノ酸配列 配列番号:2827)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー:
を使用してS26(FT)GL DNAに対して実行して、K69E変異を導入およびS26(FT/K69E)GL(DNA配列 配列番号:2828;アミノ酸配列 配列番号:2829)を生成した。
これらのキメラを生成するために使用されたテンプレートは、構築物Tth(K69E)AKK GL、Taq(K69E)TthAKK GL、Tsc(K69E)TthAKK GL、およびTfi(K69E)TthAKK GLのヌクレアーゼドメインであった。4つのクローンが、初回の活性スクリーニングに基づいて改善された活性を示した。次いで、ランダムキメラN3D7 GL(DNA配列 配列番号:2830;アミノ酸配列 配列番号:2831)、N1A12 GL(DNA配列 配列番号:2832;アミノ酸配列 配列番号:2833)、N1C4 GL(DNA配列 配列番号:2834;アミノ酸配列 配列番号:2835)、およびN2C3(DNA配列 配列番号:2836;アミノ酸配列 配列番号:2837)をそれぞれ配列決定および単離した。
アミノ酸385におけるGlyからAspへの変化(D385G)および/またはアミノ酸455におけるLeuからArgへの変化(L455R)を有する一連のTthAKK GLの改変体を、部位特異的変異誘発によって作製した。これらの2つのアミノ酸の変化を含む構築物を「DR」として示す。1つのみの変化を含むキメラは「DL」または「GR」のいずれかとして示す。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1144-60-01
および1144-60-02
を使用してpTrc99A TthAKK GL DNA(配列番号:2702)に対して実行して、G383D変異を導入およびTthAKK DL(DNA配列 配列番号:2838;アミノ酸配列 配列番号:2839)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1144-60-03
および1144-60-04
を使用してpTrc99A TthAKK GL DNA(配列番号:2702)に対して実行して、L453R変異を導入およびTthAKK GR(DNA配列 配列番号:2840;アミノ酸配列 配列番号:2841)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1144-60-01、1144-60-02、1144-60-03、および1144-60-04(それぞれ、配列番号:2858、2859、2860、および2861)を使用してpTrc99A TthAKK GL DNA(配列番号:2702)に対して実行して、G383D変異およびL453R変異を導入し、TthAKK DR変異体(DNA配列 配列番号:2842;アミノ酸配列 配列番号:2843)を産生した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1249-26-01
および1249-26-02
を使用してpTrc99A TthAKK GL DNA(配列番号:2702)に対して実行して、F29R変異を導入およびTthAKK(F29R)GL変異体(DNA配列 配列番号:2844;アミノ酸配列 配列番号:2845)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1249-26-03
および1249-26-04
を使用してpTrc99A TthAKK GL DNA(配列番号:2702)に対して実行して、F29R/F30H変異を導入およびTthAKK(F29R/F30H)GL変異体(DNA配列 配列番号:2846;アミノ酸配列 配列番号:2847)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1249-26-05
および1249-26-06
を使用してpTrc99A TthAKK GL DNA(配列番号:2702)に対して実行して、F29R/F30R変異を導入およびTthAKK(F29R/F30R)GL変異体(DNA配列 配列番号:2848;アミノ酸配列 配列番号:2849)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1249-26-01
および1249-26-02
を使用してpTrc99A TscTth(AKK)GL DNA(配列番号:2708)に対して実行して、F29R/F30R変異を導入およびTsc(F26R)TthAKK GL変異体(DNA配列 配列番号:2850;アミノ酸配列 配列番号:2851)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1249-26-03
および1249-26-04
を使用してpTrc99A TscTthAKK GL DNA(配列番号:2708)に対して実行して、F29R/F27H変異を導入およびTsc(F26R/F27H)TthAKK GL変異体(DNA配列 配列番号:2852;アミノ酸配列 配列番号:2853)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1249-26-05
および1249-26-06
を使用してpTrc99A TscTthAKK GL DNA(配列番号:2708)に対して実行して、F26R/F27R変異を導入およびTsc(F26R/F27R)TthAKK GL変異体(DNA配列 配列番号:2854;アミノ酸配列 配列番号:2855)を生成した。
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1249-26-03
および1249-26-04
を使用してpTrc99A-TaqTthAKK GL DNA(配列番号:2706)に対して実行して、F28R変異を導入およびTaq(F28R)TthAKK GL変異体(DNA配列 配列番号:2856;アミノ酸配列 配列番号:2857)を生成した。
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Claims (13)
- 配列番号:2857のアミノ酸配列を有する5’ヌクレアーゼを含む組成物。
- 請求項1に記載の5’ヌクレアーゼをコードする核酸を含む組成物であって、ここで該核酸は配列番号:2856のヌクレオチド配列を含む、組成物。
- 請求項2に記載の核酸を含む発現ベクターを含む、組成物。
- 請求項3に記載の発現ベクターを含む宿主細胞を含む、組成物。
- 請求項1に記載の組成物を含むキット。
- 少なくとも1種の核酸切断基質をさらに含む、請求項5に記載のキット。
- 核酸切断基質にハイブリダイズ可能な少なくとも1種のRNAをさらに含む、
請求項6に記載のキット。 - 標識されたオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項5に記載のキット。
- 侵襲性のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項5に記載のキット。
- 核酸を切断するための方法であって、
a) i)請求項1に記載の5’ヌクレアーゼを含む組成物;および
ii)基質核酸を含む試料
を提供する工程;ならびに
b)該基質核酸を該酵素に曝露する工程、
を包含する方法。 - 基質核酸の酵素への曝露工程が少なくとも1種の切断産物を産生する、
請求項10に記載の方法。 - c)切断産物を検出する工程をさらに包含する、請求項11に記載の方法。
- 基質核酸を含む試料が細胞溶解物を含む、請求項10に記載の方法。
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