ES2354874T3

ES2354874T3 - Enzimas de detección del arn.

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Publication number: ES2354874T3
Application number: ES03743221T
Authority: ES
Inventors: Wupo Ma; Victor Lyamichev; Michael Kaiser; Natalie E. Lyamicheva; Hatim Allawi; James J. Schaefer; Bruce N. Neri; Andrew A. Lukowiak; Brad T. Argue; Christian Tor Bartholomay; Luanne Chehak; Michelle L. Curtis; Peggy S. Eis; Jeff G. Hall; Hon S. Ip; Lin Ji; Jr. Robert W. Kwiatkowski; Sarah M. Olson; Marilyn C. Olson-Munoz; Zbigniev Skrzypczynski
Original assignee: Third Wave Technologies Inc
Current assignee: Third Wave Technologies Inc
Priority date: 2002-02-26
Filing date: 2003-02-26
Publication date: 2011-03-18
Anticipated expiration: 2023-02-26
Also published as: AU2007254629B2; CA2477698A1; EP1504093A4; US7150982B2; JP2005518223A; AU2003216392A1; DE60334985D1; ATE488579T1; WO2003073067A2; HK1081593A1; CN1302104C; JP4363988B2; CA2477698C; AU2007254629A1; EP1504093B1; CN1653175A; AU2010235947A1; US20030186238A1; EP2410049A1; WO2003073067A3

Abstract

- Una composición que comprende una enzima nucleasa 5' que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2857.

Description

Campo de la invención

La presente invención se refiere a enzimas novedosas diseñadas para dirigir la detección, caracterización y cuantificación de ácidos nucleicos, particularmente del ARN La presente invención proporciona enzimas que reconocen las estructuras de escisión específicas del ácido 5 nucleico formadas en una secuencia de ARN diana y que escinden la estructura de escisión del ácido nucleico de una manera específica del sitio para producir productos de escisión no diana. La presente invención proporciona enzimas que tienen una capacidad mejorada de escindir de manera específica un miembro del ADN de un complejo que comprende hebras de ácido nucleico ADN y ARN. 10

Antecedentes de la Invención

En medicina molecular, un procedimiento simple y económico para la detección directa y cuantificada del ARN podría facilitar en gran medida el análisis de los virus de ARN y la medida de la expresión específica del gen. Ambas cuestiones son actualmente problemas urgentes en la 15 práctica. A pesar de esta necesidad, han aparecido pocas técnicas que sean verdaderamente directas. Los ensayos de detección basados en la PCR requieren la conversión del ARN en ADN mediante la transcriptasa inversa antes de la amplificación, introduciendo una variable que puede comprometer una cuantificación fiable. Además, la PCR y otros procedimientos basados en la amplificación exponencial (por ejemplo, NASBA) requieren meticulosas medidas de contención 20 para evitar la contaminación cruzada, y tienen dificultades en distinguir pequeñas diferencias (por ejemplo, 2 a 3 veces) en la cantidad. Otros ensayos que examinan directamente el ARN adolecen de una variedad de inconvenientes, entre las que se incluyen etapas de autorradiografía que consumen tiempo (por ejemplo, ensayos de protección de la RNasa), o tiempos de reacción durante la noche (por ejemplo, ensayos de ADN ramificado). Puesto que se llevan a cabo 1,5 25 millones de medidas de carga vírica en los Estados Unidos cada año, existe de forma clara un enorme potencial para un sistema de alto rendimiento, rápido y barato para la medida cuantitativa del ARN.

Las técnicas para la detección directa y cuantificada del ARNm son vitales para vigilar la expresión de numerosos genes diferentes. En particular, se están aprovechando los niveles de 30 expresión de las citocinas (por ejemplo, interleucinas y linfocinas) como medidas clínicas de la respuesta inmune en la progresión de una amplia variedad de enfermedades (Van Deuren y col., J. Int. Fed. Clin. Chem., 5: 216 [1993], Van Deuren y col., J. Inf. Dis., 169: 157 [1994], Perenboom y col., Eur. J. Clin. Invest., 26: 159 [1996], Guidotti y col., Immunity 4: 25 [1996]), así como en la vigilancia de los receptores de trasplantes (Grant y col., Transplantation 62: 910 [1996]). 35 Adicionalmente, la vigilancia de la carga vírica y la identificación del genotipo vírico tienen gran significancia clínica para los individuos que padecen infecciones víricas por dichos patógenos como VIH o virus de la Hepatitis C (VHC). Existe una elevada correlación entre la carga vírica (es decir, el número absoluto de partículas víricas en el torrente sanguíneo) y el tiempo de progresión del SIDA (Mellors y col., Science 272: 1167 [1996], Saag y col., Nature Medicine 2: 625 [1996]). 5 Por esta razón, la carga vírica, tal como se mide mediante el ensayo cuantitativo basado en ácido nucleico, es un procedimiento de vigilancia normalizado apropiado para evaluar la eficacia del tratamiento y del estado clínico de los pacientes VIH positivos. Se cree que es esencial reducir la carga vírica tan pronto como sea posible en el curso de la infección y evaluar los niveles víricos de forma regular. En el caso del VHC, el genotipo vírico tiene una gran significancia clínica, con 10 correlaciones para la gravedad de la enfermedad hepática y sensibilidad a la terapia del interferón. Además, debido a que no se puede hacer crecer el VHC en un cultivo, es solo estableciendo correlaciones entre las probables características del genotipo vírico y el resultado clínico que se pueden evaluar los nuevos tratamientos antivíricos.

Aunque los procedimientos anteriormente mencionados han sido prácticos para 15 aplicaciones de investigación con bajo rendimiento, o para una aplicación clínica limitada, es evidente que el análisis cuantitativo del ARN a gran escala fácilmente adaptable a cualquier sistema genético requerirá un enfoque más innovador. Un procedimiento de detección directa ideal combinaría las ventajas de los ensayos de detección directa (por ejemplo, fácil cuantificación y mínimo riesgo de contaminación cruzada) con la especificidad proporcionada por un ensayo de 20 doble hibridación de oligonucleótidos.

Muchos de los procedimientos descritos anteriormente dependen solo de la hibridación para distinguir una molécula diana de otros ácidos nucleicos Aunque algunos de estos procedimientos pueden ser muy sensibles, no pueden a menudo cuantificar y distinguir de manera precisa los ARNm estrechamente relacionados, especialmente, los mencionados ARN expresados 25 a diferentes niveles en la misma muestra. Aunque los procedimientos anteriormente mencionados son prácticos para algunos objetivos, existe la necesidad de una tecnología que sea particularmente acertada para distinguir los ARN particulares de las moléculas estrechamente relacionadas.

UNIPROT, con Número de Acceso P52028, da a conocer la secuencia de aminoácidos de 30 la ADN polimerasa de Thermus termophilus.

El documento WO 0190337 A2 da a conocer otra ADN polimerasa como la SEQ ID NO: 104

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Resumen de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones y se refiere a enzimas novedosas diseñadas para dirigir la detección, caracterización y cuantificación de ácidos nucleicos, particularmente del ARN. La presente invención proporciona enzimas que reconocen estructuras de escisión específicas del ácido nucleico formado sobre una secuencia de ARN diana y que 5 escinden la estructura de escisión del ácido nucleico de una manera específica del sitio para producir productos de escisión no dianas. La presente invención proporciona enzimas que tienen una capacidad mejorada para escindir específicamente un miembro de ADN de un complejo que comprende cadenas de ácido nucleico de ADN y ARN.

La invención proporciona una composición que comprende una enzima nucleasa 5’ que 10 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2857. La invención proporciona un kit que comprende la composición de la reivindicación 1. La invención proporciona un procedimiento para escindir un ácido nucleico que comprende: a) proporcionar; i) la enzima de la reivindicación 1; y ii) una muestra que comprende ácido nucleico sustrato; y b) exponer dicho ácido nucleico sustrato a dicha enzima. 15

La presente invención se refiere a agentes de escisión específicos de estructura (por ejemplo, nucleasas) procedentes de una variedad de fuentes, entre las que se incluyen organismos mesófilos, psicrófilos, termófilos, e hipertermófilos. Las nucleasas específicas de estructura preferidas son termoestables. Las nucleasas termoestables específicas de estructura se contemplan como particularmente útiles ya que funcionan a una temperatura a la que la 20 hibridación del ácido nucleico es extremadamente específica, permitiendo la detección específica de alelo (que incluye emparejamientos incorrectos de bases únicas). Las nucleasas termoestables específicas de estructura relacionadas son nucleasas 5’ termoestables que comprenden polimerasas alteradas derivadas de polimerasas naturales de especies de Thermus, que incluyen, pero no se limitan a Thermus aquaticus, Thermus flavus, y Thermus termophilus. Sin embargo, la 25 invención no se limita al uso de nucleasas 5’ termoestables. Están también relacionadas las nucleasas específicas de estructura termoestable procedentes de las nucleasas de tipo FEN-1, RAD2 y XPG. La invención proporciona la nucleasa 5’ de las reivindicaciones 1 a 4.

La presente invención proporciona un procedimiento para detectar una secuencia diana (por ejemplo, una mutación, polimorfismo, etc), que comprende proporcionar una muestra 30 sospechosa de contener la secuencia diana; oligonucleótidos capaces de formar una estructura de escisión invasiva en presencia de la secuencia diana; y un agente para detectar la presencia de una estructura de escisión invasiva; y exponer la muestra a los oligonucleótidos y al agente. En formas de realización relacionadas, el procedimiento comprende además la etapa de detectar un complejo que comprende el agente y la estructura de escisión invasiva (directa o indirectamente). 35 En formas de realización relacionadas, el agente comprende un agente de escisión. En algunas formas de realización relacionadas, la exposición de la muestra a los oligonucleótidos y al agente comprende exponer la muestra a los oligonucleótidos y al agente en condiciones en las que se forma una estructura de escisión invasiva entre la secuencia diana y los oligonucleótidos si la secuencia diana está presente en la muestra, en el que la estructura de escisión invasiva se 5 escinde mediante el agente de escisión para formar un producto de escisión. En formas de realización relacionadas, el procedimiento comprende además la etapa de detectar el producto de escisión. En formas de realización relacionadas, la secuencia diana comprende una primera región y una segunda región, la segunda región en la dirección 3’ de y contigua a la primera región, y en la que los oligonucleótidos comprenden el primer y el segundo oligonucleótidos, en el 10 que al menos una porción del primer oligonucleótido es completamente complementaria a la primera porción de la secuencia diana y en la que el segundo oligonucleótido comprende una porción 3’ y una porción 5’, en la que la porción 5’ es completamente complementaria de la segunda porción de dicho ácido nucleico diana. La invención proporciona el procedimiento de las reivindicaciones 10 a 13. 15

La presente invención se refiere a un kit para detectar dichas secuencias diana, comprendiendo dicho kit oligonucleótidos capaces de formar una estructura de escisión invasiva en presencia de la secuencia diana. En formas de realización relacionadas, el kit comprende además un agente para detectar la presencia de una estructura de escisión invasiva (por ejemplo, un agente de escisión). En las formas de realización relacionadas, los oligonucleótidos 20 comprenden un primer y un segundo oligonucleótidos, comprendiendo dicho primer oligonucleótido una porción 5’ complementaria de una primera región del ácido nucleico diana y comprendiendo dicho segundo oligonucleótido unas porciones 3’ y una porción 5’, siendo dicha porción 5’ complementaria a la segunda región del ácido nucleico diana en la dirección 3’ de y contigua a la primera porción. La invención proporciona el kit de las reivindicaciones 5 a 9. 25

La presente invención se refiere a procedimientos para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico diana mediante la detección de productos de escisión no dianas que comprende proporcionar: un agente de escisión; una fuente de ácido nucleico diana, el ácido nucleico diana que comprende una primera región y una segunda región, la segunda región en la dirección 3’ de y contigua con la primera región; un primer oligonucleótido, en el que al menos una 30 porción del primer oligonucleótido es completamente complementaria de la primera porción del ácido nucleico diana; y un segundo oligonucleótido que comprende una porción 3’ y una porción 5’, en el que la porción 5’ es completamente complementaria de la segunda porción del ácido nucleico diana; mezclar el agente de escisión, el ácido nucleico diana, el primer oligonucleótido y el segundo oligonucleótido para crear una mezcla de reacción en condiciones de reacción de tal 35 manera que al menos la porción del primer oligonucleótido se hibrida con la primera región de dicho ácido nucleico diana y en la que al menos la porción 5’ del segundo oligonucleótido se hibrida con la segunda región del ácido nucleico diana con el fin de crear una estructura de escisión, y en el que la escisión, de la estructura de escisión, se produce para generar producto de escisión no diana; y detectar la escisión de la estructura de escisión. 5

La detección de la escisión de la estructura de escisión se puede llevar a cabo de cualquier manera. En formas de realización relacionadas, la detección de la escisión de la estructura de escisión comprende detectar el producto de escisión no diana. En formas de realización adicionalmente relacionadas, la detección de la escisión de la estructura de escisión comprende la detección de la transferencia de fluorescencia, masa, o energía de fluorescencia. 10 Otros procedimientos de detección incluyen, pero no se limitan a la detección de la radioactividad, luminiscencia, fosforescencia, polarización de la fluorescencia, y carga. En formas de realización relacionadas, la detección se lleva a cabo mediante un procedimiento que comprende proporcionar el producto de escisión no diana; una composición que comprende dos ácidos nucleicos monocatenarios hibridados de tal manera que definen una porción monocatenaria de 15 una región de unión a proteína; y una proteína; y exponer el producto de escisión no diana a la porción monocatenaria de la región de unión a proteína en condiciones tales que la proteína se une a la región de unión a proteína. En formas de realización relacionadas, la proteína comprende un ácido nucleico productor proteína, en el que el ácido nucleico productor de proteína se une a la región de unión a proteína y produce ácido nucleico. En formas de realización relacionadas, la 20 región de unión a proteína es una región de unión a la ARN polimerasa dependiente del molde (por ejemplo, una región de unión a la ARN polimerasa T7). En formas de realización relacionadas, la detección se lleva a cabo mediante un procedimiento que comprende proporcionar el producto de escisión no diana; una única cadena continua de ácido nucleico que comprende una secuencia que define una única cadena de una región de unión a la ARN 25 polimerasa; una ADN polimerasa dependiente del molde; y una ARN polimerasa dependiente del molde; exponer el producto de escisión no diana a la región de unión a la ARN polimerasa en condiciones tales que el producto de escisión no diana se una a una porción de la cadena única de la región de unión a la ARN polimerasa para producir un producto de escisión no diana unido; exponer el producto de escisión no diana unido a la ADN polimerasa dependiente del molde en 30 condiciones tales que se produzca una región de unión a la ARN polimerasa bicatenaria; y exponer la región de unión a la ARN polimerasa bicatenaria a la ARN polimerasa dependiente del molde en condiciones tales que se produzcan transcritos de ARN. En formas de realización relacionadas, el procedimiento comprende además la etapa de detectar los transcritos de ARN. En formas de realización relacionadas, la ARN polimerasa dependiente del molde es ARN polimerasa 35 T7.

La presente invención no está limitada por la naturaleza de la porción 3’ del segundo oligonucleótido En algunas formas de realización relacionadas, la porción 3’ del segundo oligonucleótido comprende un nucleótido en el extremo 3’ no complementario del ácido nucleico diana. En formas de realización relacionadas, la porción 3’ del segundo oligonucleótido consiste 5 en un único nucleótido no complementario del ácido nucleico diana.

Cualquiera de los componentes del procedimiento se puede ligar a un soporte sólido. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el primer oligonucleótido está ligado a un soporte sólido. En formas de realización relacionadas, el segundo oligonucleótido está ligado a un soporte sólido. 10

El agente de escisión puede ser cualquier agente que sea capaz de escindir estructuras de escisión invasivas. En formas de realización relacionadas, el agente de escisión comprende una nucleasa específica de estructura. En formas de realización relacionadas, la nucleasa específica de estructura comprende una nucleasa termoestable específica de estructura (por ejemplo, una nucleasa 5’ termoestable). Las nucleasa termoestables específicas de estructura incluyen, pero no 15 se limitan a, las que tienen una secuencia de aminoácidos homóloga con una porción de la secuencia de aminoácidos de una ADN polimerasa termoestable derivada de un organismo termófilo (por ejemplo, Thermus aquaticus, Thermus flavus, y Thermus termophilus). En formas de realización relacionadas, la nucleasa termoestable específica de estructura comprende una nucleasa de los tipos FEN-1, RAD2 o XPG de nucleasa, o estructuras quiméricas que contienen 20 una o más porciones de cualquiera de los agentes de escisión anteriores.

El procedimiento no está limitado por la naturaleza del ácido nucleico diana. En formas de realización relacionadas, el ácido nucleico diana es ADN o ARN monocatenario o bicatenario. En formas de realización relacionadas, el ácido nucleico bicatenario se convierte en monocatenario (por ejemplo, mediante calor) antes de la formación de la estructura de escisión. En una forma de 25 realización relacionada, la fuente del ácido nucleico diana comprende una muestra que contiene ADN genómico. La muestra incluye, pero no se limita a, sangre, saliva, fluido cerebroespinal, fluido pleural, leche, linfa, esputo y semen.

En formas de realización relacionadas, las condiciones de reacción del procedimiento comprenden proporcionar una fuente de cationes divalentes. En algunas formas de realización 30 relacionadas, el catión divalente se selecciona entre el grupo que comprende iones Mn2+ y Mg2+. En formas de realización relacionadas, las condiciones de reacción del procedimiento comprenden proporcionar el primer y el segundo oligonucleótidos en una concentración en exceso en comparación con el ácido nucleico diana.

En formas de realización relacionadas, el procedimiento comprende además proporcionar 35 un tercer oligonucleótido complementario de una tercera porción de dicho ácido nucleico diana en la dirección 5’ de la primera porción del ácido nucleico diana, en el que el tercer oligonucleótido se mezcla con la mezcla de reacción.

La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico diana que detecta los productos de escisión no dianas que comprende 5 proporcionar; un agente de escisión; una fuente de ácido nucleico diana, el ácido nucleico diana que comprende una primera región y una segunda región, la segunda región en la dirección 3’ respecto de y contigua con la primera región; una pluralidad de primeros oligonucleótidos, en los que al menos una porción de los primeros oligonucleótidos es completamente complementaria de la primera porción del ácido nucleico diana; un segundo oligonucleótido que comprende una 10 porción 3’ y una porción 5’, en la que dicha porción 5’ es completamente complementaria de la segunda porción del ácido nucleico diana; mezclar el agente de escisión, el ácido nucleico diana, la pluralidad de primeros oligonucleótidos y del segundo oligonucleótido para crear una mezcla de reacción en condiciones de reacción tales que al menos la porción de un primer oligonucleótido se hibrida con la primera región del ácido nucleico diana y en la que al menos la porción 5’ del 15 segundo oligonucleótido se hibrida con la segunda región del ácido nucleico diana con el fin de crear una estructura de escisión, y en la que la escisión de la estructura de escisión se produce para generar producto de escisión no diana, en el que las condiciones permiten formarse múltiples estructuras de escisión y escindirse del ácido nucleico diana, y detectar la escisión de dichas estructuras de escisión. En formas de realización relacionadas, las condiciones comprenden 20 condiciones isotérmicas que permiten disociar la pluralidad de primeros oligonucleótidos del ácido nucleico diana. Aunque la presente invención está limitada por el número de estructuras de escisión formadas en un ácido nucleico diana concreto, en algunas formas de realización preferidas, dos o más (3, 4, 5,…, 10,…, 10000,…) de la pluralidad de primeros oligonucleótidos forman estructuras de escisión con un ácido nucleico diana concreto, en el que las estructuras de 25 escisión se escinden para producir los productos de escisión no dianas.

La presente invención se refiere también a procedimientos en los que un producto de escisión procedente de los procedimientos anteriores se usa en una reacción de escisión más invasiva. Por ejemplo, la presente invención se refiere a un procedimiento que comprende proporcionar un agente de escisión; un primer ácido nucleico diana, comprendiendo el primer 30 ácido nucleico diana una primera región y una segunda región, la segunda región en la dirección 3’ y contigua con la primera región; un primer oligonucleótido, en el que al menos una porción del primer oligonucleótido es completamente complementaria de la primera porción del primer ácido nucleico diana; un segundo oligonucleótido que comprende una porción 3’ y una porción 5’, en el que la porción 5’ es completamente complementaria a la segunda porción del primer ácido 35 nucleico diana; un segundo ácido nucleico diana, comprendiendo dicho segundo ácido nucleico diana una primera región y una segunda región, la segunda región en la dirección 3’ y contigua a la primera región; y un tercer oligonucleótido, en el que al menos una porción del tercer oligonucleótido es completamente complementaria de la primera porción del segundo ácido nucleico diana; generando una primera estructura de escisión en la que al menos dicha porción 5 del primer oligonucleótido se hibrida con la primera región del primer ácido nucleico diana, en el que al menos la porción 5’ del segundo oligonucleótido se hibrida con la segunda región del primer ácido nucleico diana y en el que la escisión de la primera estructura de escisión se produce mediante el agente de escisión escindiendo por tanto el primer oligonucleótido para generar un cuarto oligonucleótido, comprendiendo dicho cuarto oligonucleótido una porción 3’ y una porción 5’ 10 en la que la porción 5’ es completamente complementaria de la segunda porción del segundo ácido nucleico diana; generar una segunda estructura de escisión en condiciones en las que al menos dicha porción del tercer oligonucleótido se hibrida con la primera región del segundo ácido nucleico diana y en el que al menos la porción 5’ del cuarto oligonucleótido se hibrida con la segunda región del segundo ácido nucleico diana y en el que la escisión de la segunda estructura 15 de escisión se produce para generar un fragmento de escisión; y detectar la escisión de la segunda estructura de escisión. En algunas formas de realización relacionadas, la porción 3’ del cuarto oligonucleótido comprende un nucleótido en el extremo 3’ no complementario de el segundo ácido nucleico diana. En las formas de realización relacionadas, la porción 3’ del tercer oligonucleótido se une covalentemente con el segundo ácido nucleico diana. En las formas de 20 realización relacionadas, el segundo ácido nucleico diana comprende además una región 5’, en la que la región 5’ del segundo ácido nucleico diana es el tercer oligonucleótido.

La presente invención se refiere además a kits que comprenden: un agente de escisión; un primer oligonucleótido que comprende una porción 5’ complementaria a una primera región de un ácido nucleico diana; y un segundo oligonucleótido que comprende una porción 3’ y una porción 25 5’, siendo dicha porción 5’ complementaria de una segunda región del ácido nucleico diana en la dirección 3’ de y contigua con la primera porción. En las formas de realización relacionadas, la porción 3’ del segundo oligonucleótido comprende un nucleótido en el extremo 3’ no complementario del ácido nucleico diana. En las formas de realización relacionadas, la porción 3’ del segundo oligonucleótido está compuesta por un único oligonucleótido no complementario del 30 ácido nucleico diana. En las formas de realización relacionadas, el kit comprende además un soporte sólido. Por ejemplo, en formas de realización relacionadas, el primer y/o el segundo oligonucleótido se une a dicho soporte sólido. En formas de realización relacionadas, el kit comprende además una solución tampón. En formas de realización relacionadas, la solución tampón comprende una fuente de cationes divalentes (por ejemplo, iones Mn2+ y/o Mg2+). En 35 algunas formas de realización relacionadas, el kit comprende además un tercer oligonucleótido complementario a una tercera porción del ácido nucleico diana en la dirección 5’ de la primera porción del primer ácido nucleico diana. En otras formas de realización adicionales relacionadas, el kit comprende además un ácido nucleico diana. En formas de realización relacionadas, el kit comprende además un segundo ácido nucleico diana. En otras formas de realización adicionales 5 relacionadas, el kit comprende además un tercer oligonucleótido que comprende una porción 5’ complementaria de la primera región del segundo ácido nucleico diana. En algunas formas de realización relacionadas, la porción 3’ del tercer oligonucleótido está unido covalentemente al segundo ácido nucleico diana. En otras realizaciones relacionadas, el segundo ácido nucleico diana comprende además una porción 5’, en la que la porción 5’ del segundo ácido nucleico diana 10 es el tercer oligonucleótido. En otras formas de realización más relacionadas, el kit comprende además una molécula ARRESTOR (por ejemplo, el oligonucleótido ARRESTOR).

La presente invención se refiere además a una composición que comprende una estructura de escisión, comprendiendo la estructura de escisión: a) un ácido nucleico diana, teniendo el ácido nucleico diana una primera región, una segunda región, una tercera región y una 15 cuarta región, en la que la primera región se localiza adyacente y en la dirección 3’ de la segunda región, la segunda región se localiza adyacente a y en la dirección 3’ de la tercera región y la tercera región se localiza adyacente a y en la dirección 3’ de la cuarta región; b) un primer oligonucleótido complementario de la cuarta región del ácido nucleico diana; c) un segundo oligonucleótido que tiene una porción 5’ y una porción 3’ en la que la porción 5’ del segundo 20 oligonucleótido contiene una secuencia complementaria de la segunda región del ácido nucleico diana y en la que la porción 3’ del segundo oligonucleótido contiene una secuencia complementaria de la tercera región del ácido nucleico diana; y d) un tercer oligonucleótido que tiene una porción 5’ y una porción 3’ en la que la porción 5’ del tercer oligonucleótido contiene una secuencia complementaria de la primera región del ácido nucleico diana y en la que la porción 3’ 25 del tercer oligonucleótido contiene una secuencia complementaria de la segunda región del ácido nucleico diana.

La presente invención no está limitada por la longitud de las cuatro regiones del ácido nucleico diana. En una forma de realización relacionada, la primera región del ácido nucleico diana tiene una longitud de 11 a 50 nucleótidos. En otra forma de realización relacionada, la segunda 30 región del ácido nucleico diana tiene una longitud de uno a tres nucleótidos. En otra forma de realización relacionada, la tercera región del ácido nucleico diana tiene una longitud de seis a nueve nucleótidos. En otra forma de realización adicionalmente relacionada, la cuarta región del ácido nucleico diana tiene una longitud de 6 a 50 nucleótidos.

La invención no está limitada por la naturaleza o la composición del primero, del segundo, 35 del tercero y del cuarto oligonucleótidos; estos oligonucleótidos pueden comprender ADN, ARN, PNA y sus combinaciones así como comprender nucleótidos modificados, bases universales, aductos, etc. Además, uno o más del primero, del segundo, del tercero y del cuarto oligonucleótidos pueden contener un didesoxinucleótido en el extremo 3’.

En una forma de realización relacionada, el ácido nucleico diana no es completamente 5 complementario de al menos uno del primero, del segundo, del tercero y del cuarto oligonucleótidos. En una forma de realización relacionada, el ácido nucleico diana no es completamente complementario del segundo oligonucleótido.

Tal como se ha señalado anteriormente, la presente invención está relacionada con el uso de nucleasas específicas de estructura en procedimientos de detección. La presente invención 10 está relacionada con un procedimiento para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico diana detectando productos de escisión no dianas que comprende: a) proporcionar: i) unos medios de escisión, ii) una fuente de ácido nucleico diana, teniendo el ácido nucleico diana una primera región, una segunda región, una tercera región y una cuarta región, en la que la primera región está localizada adyacente a y en la dirección 3’ de la segunda región, la segunda 15 región está localizada adyacente a y en la dirección 3’ de la tercera región y la tercera región está localizada adyacente a y en la dirección 3’ de la cuarta región; iii) un primer oligonucleótido complementario de la cuarta región del ácido nucleico diana; iv) un segundo oligonucleótido que tiene una porción 5’ y una porción 3’ en la que la porción 5’ del segundo oligonucleótido contiene una secuencia complementaria de la segunda región del ácido nucleico diana y en la que la 20 porción 3’ del segundo oligonucleótido contiene una secuencia complementaria de la tercera región del ácido nucleico diana; v) un tercer oligonucleótido que tiene una porción 5’ y una porción 3’ en la que la porción 5’ del tercer oligonucleótido contiene una secuencia complementaria de la primera región del ácido nucleico diana y en la que la porción 3’ del tercer oligonucleótido contiene una secuencia complementaria de la segunda región del ácido nucleico diana; b) mezclar los 25 medios de escisión, el ácido nucleico diana, el primer oligonucleótido, el segundo oligonucleótido y el tercer oligonucleótido para crear una mezcla de reacción en condiciones de reacción tales que el primer oligonucleótido se hibrida con la cuarta región del ácido nucleico diana y en el que al menos la porción 3’ del segundo oligonucleótido se hibrida con el ácido nucleico diana y en la que al menos la porción 5’ del tercer oligonucleótido se hibrida con el ácido nucleico diana con el fin de 30 crear una estructura de escisión y en la que la escisión de la estructura de escisión se produce para generar productos de escisión no dianas, teniendo cada producto de escisión no diana un grupo 3’-hidroxilo; y c) detectar los productos de escisión no dianas.

La invención no está limitada por la naturaleza del ácido nucleico diana. En una forma de realización relacionada, el ácido nucleico diana comprende ADN monocatenario. En otra forma de 35 realización relacionada, el ácido nucleico comprende ADN bicatenario y antes de la etapa c), la mezcla de reacción se trata de tal manera que el ADN bicatenario se convierte sustancialmente en monocatenario. En otra forma de realización relacionada, el ácido nucleico diana comprende ARN y el primero y el segundo oligonucleótidos comprenden ADN.

La invención no está limitada por la naturaleza de los medios de escisión. En una forma de 5 realización relacionada, los medios de escisión son una nucleasa específica de estructura; las nucleasas específicas de estructura particularmente preferidas son nucleasas termoestables específicas de estructura.

En otra forma de realización, la nucleasa termoestable específica de estructura es una nucleasa quimérica. 10

En una forma de realización relacionada alternativa, la detección de los productos de escisión no dianas comprende separación electroforética de los productos de la reacción seguida por visualización de los productos de escisión no dianas separados.

En otra forma de realización relacionada, uno o más del primero, segundo y tercer oligonucleótidos contiene un didesoxinucleótido en el extremo 3’. Cuando se emplean 15 oligonucleótidos que contienen didesoxinucleótidos, la detección de los productos de escisión no dianas comprende preferiblemente: a) incubar los productos de escisión no dianas con una polimerasa independiente de la plantilla y al menos un nucleósido trifosfato marcado en condiciones tales que se añade al menos un nucleótido marcado al grupo 3’-hidroxilo de los productos de escisión no marcados para generar productos de escisión no dianas marcados; y b) 20 detectar la presencia de los productos de escisión no dianas marcados. La invención no está limitada por la naturaleza de la polimerasa independiente de la plantilla empleada; en una forma de realización relacionada, la polimerasa independiente de la plantilla se selecciona entre el grupo compuesto por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y polimerasa poli A. Cuando se emplean TdT o polimerasa poli A en la etapa de detección, el segundo oligonucleótido puede 25 contener una marca en el extremo 5’, siendo la marca en el extremo 5’ una marca diferente que la marca presente en el nucleósido trifosfato marcado. La invención no está limitada por la naturaleza de la marca en el extremo 5’; se conocen en la técnica una amplia variedad de marcas en el extremo 5’ adecuadas e incluyen biotina, fluoresceína, tetraclorofluoresceína, hexaclorofluoresceína, Cy3 amidita, Cy5 amidita y digoxigenina. 30

En otra forma de realización relacionada, detectar los productos de escisión no diana comprende: a) incubar los productos de escisión no diana con una polimerasa independiente de la plantilla y al menos un nucleósido trifosfato en condiciones tales que al menos se añade un nucleótido al grupo 3’-hidroxilo de los productos de escisión no dianas para generar productos de escisión no diana hechos a medida; y b) detectar la presencia de los productos de escisión no 35 diana hechos a medida. La invención no está limitada por la naturaleza de la polimerasa independiente de la plantilla empleada; en una forma de realización, la polimerasa independiente de la plantilla se selecciona entre el grupo compuesto por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y polimerasa poli A. Cuando TdT o polimerasa poli A se emplean en la etapa de detección, el segundo oligonucleótido pueden contener una marca en el extremo 5’. La invención no está 5 limitada por la naturaleza de la marca en el extremo 5’; se conocen en la técnica una amplia variedad de marcas en el extremo 5’ adecuadas e incluyen biotina, fluoresceína, tetraclorofluoresceína, hexaclorofluoresceína, colorante REDMON RED, Cy3 amidita, Cy5 amidita y digoxigenina.

En una forma de realización relacionada, las condiciones de reacción comprenden 10 proporcionar una fuente de cationes divalentes; particularmente, los cationes divalentes preferidos son los iones Mn2+y Mg2+.

La presente invención se refiere además a un procedimiento para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico diana que detecta los productos de escisión no dianas que comprende: a) proporcionar: i) unos medios de escisión, ii) una fuente de ácido nucleico diana, el 15 ácido nucleico que tiene una primera región, una segunda región y una tercera región, en la que la primera región se localiza adyacente a y en la dirección 3’ de la segunda región y en la que la segunda región se localiza adyacente a y en la dirección 3’ de la tercera región; iii) un primer oligonucleótido que tiene una porción 5’ y una porción 3’ en la que la porción 5’ del primer oligonucleótido contiene una secuencia complementaria de la segunda región del ácido nucleico 20 diana y en la que la porción 3’ del primer oligonucleótido contiene una secuencia complementaria de la tercera región del ácido nucleico diana; iv) un segundo oligonucleótido que tiene una longitud de entre once a quince nucleótidos y que tiene además una porción 5’ y una porción 3’ en la que la porción 5’ del segundo oligonucleótido contiene una secuencia complementaria de la primera región del ácido nucleico diana y en la que la porción 3’ del segundo oligonucleótido contiene una 25 secuencia complementaria de la segunda región del ácido nucleico diana; b) mezclar los medios de escisión, el ácido nucleico diana, el primer oligonucleótido y el segundo oligonucleótido para crear una mezcla de reacción en condiciones de reacción tales que al menos la porción 3’ del primer oligonucleótido se hibrida con el ácido nucleico diana y en la que al menos la porción 5’ del segundo oligonucleótido se hibrida con el ácido nucleico diana con el fin de crear una estructura 30 de escisión y en la que la escisión de la estructura de escisión se produce para generar productos de escisión no diana, teniendo ca cada producto de escisión no diana un grupo 3’-hidroxilo, y c) detectar los productos de escisión no dianas. En una forma de realización relacionada, los medios de escisión son una nucleasa específica de estructura, preferiblemente una nucleasa termoestable específica de estructura. 35

La invención no está limitada por la longitud de las diversas regiones del ácido nucleico diana. En una forma de realización preferida, la segunda región del ácido nucleico diana tiene una longitud de entre uno a cinco nucleótidos. En otra forma de realización relacionada, uno o más del primero y del segundo oligonucleótidos contiene un didesoxinucleótido en el extremo 3’. Cuando se emplean oligonucleótidos que contienen didesoxinucleótidos, la detección de los productos de 5 escisión no dianas comprende preferiblemente: a) incubar los productos de escisión no dianas con una polimerasa independiente de la plantilla y al menos un nucleósido trifosfato marcado en condiciones tales que se añade al menos un nucleótido marcado en el grupo 3’-hidroxilo de los productos de escisión no dianas para generar productos de escisión no dianas marcados; y b) detectar la presencia de productos de escisión no dianas marcados para generar productos de 10 escisión no dianas marcados. La invención no está limitada por la naturaleza de la polimerasa independiente de la plantilla empleada; en una forma de realización, la polimerasa independiente de la plantilla se selecciona entre el grupo compuesto por desoxinucleotidil transferasa (TdT) y polimerasa poli A. Cuando se emplea TdT o polimerasa poli A en la etapa de detección, el segundo oligonucleótido puede contener una marca en el extremo 5’, siendo la marca en el 15 extremo 5’ una marca diferente que la de la marca presente en el nucleósido trifosfato marcado. La invención no está limitada por la naturaleza de la marca en el extremo 5’; se conocen en la técnica una amplia variedad de marcas en el extremo 5’ e incluyen biotina, fluoresceína, tetraclorofluoresceína, hexaclorofluoresceína, colorante REDMON RED, Cy3 amidita, Cy5 amidita y digoxigenina. 20

En otra forma de realización relacionada, detectar los productos de escisión no dianas comprende: a) incubar los productos de escisión no dianas con una polimerasa independiente de la plantilla y al menos un nucleósido trifosfato en condiciones tales que se añade al menos un nucleótido en el grupo 3’ hidroxilo de los productos de escisión no dianas para generar productos de escisión no dianas hechos a medida; y b) detectar la presencia de productos de escisión no 25 dianas hechos a medida. La invención no está limitada por la naturaleza de la polimerasa independiente de la plantilla empleada; en una forma de realización, la polimerasa independiente de la plantilla empleada se selecciona entre el grupo compuesto por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y polimerasa poli A. Cuando se emplean TdT o polimerasa poli A en la etapa de detección, el segundo oligonucleótido puede contener una marca en el extremo 5’. La invención 30 no está limitada por la naturaleza de la marca en el extremo 5’; se conocen en la técnica una amplia variedad de marcas en el extremo 5’ adecuadas e incluyen biotina, fluoresceína, tetraclorofluoresceína, hexaclorofluoresceína, colorante REDMON RED, Cy3 amidita, Cy5 amidita y digoxigenina.

Se pueden emplear los novedosos procedimientos de detección de la invención para la 35 detección de los ADN y los ARN dianas que incluyen, pero no se limitan a, ADN y ARN dianas que comprenden alelos de genes naturales y mutantes, que incluyen genes de seres humanos u otros animales que son o se pueden asociar con enfermedad o con cáncer. Adicionalmente, se pueden usar los procedimientos de la invención para la detección de y/o la identificación de cepas de microorganismos, incluyendo bacterias, hongos, protozoos, ciliados y virus (y en particular para la 5 detección e identificación de virus de ARN, tales como VHC).

La presente invención se refiere además a novedosos enzimas diseñados para dirigir la detección, caracterización y cuantificación de ácidos nucleico, particularmente ARN. La presente invención proporciona enzimas que reconocen estructuras de escisión específicas de ácidos nucleico formadas en una secuencia de un ARN diana y que escinden la estructura de escisión del 10 ácido nucleico de una manera específica de sitio para producir productos de escisión no dianas. La presente invención proporciona enzimas que tienen una capacidad mejorada para escindir específicamente un miembro de ADN de un complejo que comprende cadenas de ácido nucleico ADN y ARN.

Por ejemplo, la presente invención proporciona ADN polimerasas que presentan una 15 estructura alterada en relación con las ADN polimerasas naturales, de tal manera que presentan un rendimiento alterado (por ejemplo, mejorado) en los ensayos de detección basados en la escisión de un acido nucleico que comprende una estructura (por ejemplo, ARN). En particular, las polimerasas alteradas de la presente invención presentan comportamiento mejorado en los ensayos de detección basados en la escisión de un miembro de ADN de la estructura de escisión 20 (por ejemplo, una estructura de escisión invasiva) que comprende una cadena de ARN diana. La invención proporciona la enzima de las reivindicaciones 1 a 4.

El rendimiento mejorado en un ensayo de detección puede surgir de una cualquiera, o de una combinación de algunas características mejoradas. Por ejemplo, en una forma de realización relacionada, la enzima de la presente invención puede tener una velocidad de escisión mejorada 25 (Kcat) en una estructura dirigida específica, de tal manera que se puede producir una cantidad más grande de producto de escisión en un plazo de tiempo dado. En otra forma de realización relacionada, la enzima de la presente invención puede tener una actividad reducida o una velocidad en la escisión de estructuras inapropiadas o no específicas. Por ejemplo, en algunas formas de realización relacionadas de la presente invención, un aspecto de mejora es que el 30 diferencial entre la cantidad detectable de escisión de una estructura específica y la cantidad detectable de escisión de cualquier estructura alternativa está aumentado. Como tal, está dentro del alcance de la presente invención proporcionar una enzima que tenga una reducida velocidad de escisión de una estructura diana específica en comparación con la velocidad de la enzima natural, y que tenga además una reducida velocidad de escisión de cualquier estructura 35 alternativa, de tal manera que el diferencial entre la cantidad detectable de escisión de la estructura específica y la cantidad detectable de escisión de cualquier estructura alternativa esté aumentada. Sin embargo, la presente invención no está limitada a enzimas que tienen un diferencial mejorado.

En una forma de realización adicional, la enzima de la presente invención es ADN 5 polimerasa que tiene una actividad nucleasa alterada tal como se ha descrito anteriormente, y que tiene también una actividad sintética alterada, en comparación con la de cualquier ADN polimerasa natural de la que se haya derivado la enzima. Se prefiere especialmente que la ADN polimerasa esté alterada de tal manera que presente una actividad sintética reducida así como una actividad nucleasa mejorada en dianas de ARN, en comparación con la de la ADN polimerasa 10 natural. Se han descrito enzimas y genes que codifican enzimas que tienen actividad sintética reducida (Véanse por ejemplo, Kaiser y col., J. Biol. Chem., 274: 21387 [1999], Lyamichev y col., Prot. Natl. Acad. Sci., 96: 6143 [1999], Patentes de los Estados Unidos 5.541.311, 5.614.402, 5.795.763 y 6.090.606). La presente invención contempla modificaciones combinadas, tales como las de que las nucleasas 5’ resultantes están sin actividad sintética interferente, y tienen 15 rendimiento mejorado en los ensayos de detección del ARN.

La presente invención contempla una secuencia de ADN que codifica una ADN polimerasa alterada con respecto a la secuencia de la secuencia natural, de tal manera que presenta una actividad nucleasa alterada con respecto a la de la ADN polimerasa natural. Por ejemplo, en una forma de realización relacionada, la secuencia de ADN codifica una enzima que tiene una 20 velocidad mejorada de escisión (kcat) en una estructura dirigida específica, de tal manera que se puede producir una cantidad más grande de un producto de escisión en un plazo de tiempo dado. En otra forma de realización relacionada, el ADN codifica una enzima que tiene una actividad o velocidad reducida en la escisión de estructuras no específicas o inapropiadas. En algunas formas de realización relacionadas, un aspecto de mejora es que el diferencial entre la cantidad 25 detectable de escisión de una estructura diana específica y la cantidad detectable de escisión de cualquier estructura alternativa está aumentada. Está dentro del alcance de la presente invención proporcionar un ADN que codifica una enzima que tiene una reducida velocidad de escisión de una estructura diana específica en comparación con la velocidad de la enzima natural, y que tiene además una reducida velocidad de escisión de cualquier estructura alternativa, de tal manera que 30 el diferencial entre la cantidad detectable de escisión de la estructura específica y la cantidad detectable de escisión de cualquier estructura alternativa está aumentada. Sin embargo, la presente invención no está limitada a las polimerasas que tienen un diferencial mejorado.

En una forma de realización relacionada, la secuencia de ADN codifica una ADN polimerasa que tiene la actividad nucleasa alterada descrita anteriormente, y que tiene también 35 actividad sintética alterada, en comparación con la de cualquier ADN polimerasa natural de la cual se derive el enzima mejorado. Se prefiere especialmente que la ADN polimerasa codificada esté alterada de tal manera que presenta actividad sintética reducida así como actividad nucleasa mejorada en las dianas de ARN, en comparación con la de la ADN polimerasa natural.

No se pretende que la invención esté limitada por la naturaleza de la alteración requerida 5 para introducir la actividad nucleasa alterada. Ni se pretende que la invención esté limitada por la extensión tanto de la alteración, como de la mejora observada. Si la polimerasa está también alterada de tal manera que esté modificada la síntesis, no se pretende que la invención esté limitada por la actividad de la polimerasa o de la proteína modificada o no modificada, o por la naturaleza de la alteración para conseguir una modificación en la síntesis de la polimerasa. 10

La presente invención se refiere a nucleasas específicas de la estructura procedentes de una variedad de fuentes, entre las que se incluyen, pero no se limitan a, organismos mesófilos, psicrófilos, termófilos, e hipertermófilos. Las nucleasas específicas de estructura preferidas son termoestables. Las nucleasas termoestables específicas de estructura se contemplan como particularmente útiles por que permiten el ensayo INVADER (véase por ejemplo, patentes de los 15 Estados unidos Nos 5.846.717, 5.985.557, 5.994.069, 6.001.567, y 6.090.543 y las publicaciones PCT WO 97/27214 y WO 98/42873) que se va a realizar cerca de la temperatura de fusión (Tm) de manera que las sondas de oligonucleótidos en la dirección 3’, escindidas y sin escindir pueden ciclar y desciclar la diana durante el curso de la reacción. En una forma de realización relacionada, las enzimas termoestables específicas de estructura son nucleasas 5’ termoestables que se 20 seleccionar entre el grupo que comprende polimerasas activadas derivadas de las polimerasas naturales de especies de Thermus, que incluyen, pero no se limitan a, Thermus aquaticus, Thermus flavus, Thermus thermophilus, Thermus filiformus, y Thermus scotoductus. Sin embargo, la invención no se limita al uso de nucleasas 5’ termoestables. Por ejemplo, algunas formas de realización relacionadas de la presente invención utilizan sondas cortas de oligonucleótidos que 25 pueden ciclar y desciclar la diana a bajas temperaturas, permitiendo el uso de enzimas no termoestables.

En algunas formas de realización relacionadas, la presente invención proporciona una composición que comprende una enzima, en la que la enzima comprende un dominio funcional heterólogo, en el que el dominio funcional heterólogo proporciona funcionalidad alterada (por 30 ejemplo, mejorada) en un ensayo de escisión del ácido nucleico. La presente invención no está limitada por la naturaleza del ensayo de escisión del ácido nucleico. Por ejemplo, los ensayos de escisión del ácido nucleico incluyen cualquier ensayo en el que se escinde un ácido nucleico, directa o indirectamente, en presencia del enzima. En algunas formas de realización preferidas, el ensayo de escisión del ácido nucleico es un ensayo de escisión invasivo. En formas de realización 35 particularmente relacionadas, el ensayo de escisión utiliza una estructura de escisión que tiene al menos un componente de ARN. En otra forma de realización relacionada, el ensayo de escisión utiliza una estructura de escisión que tiene al menos un componente de ARN, en el que se escinde un miembro del ADN de la estructura de escisión.

En algunas formas de realización relacionadas, la enzima comprende una nucleasa 5’ o 5 una polimerasa. En algunas formas de realización relacionadas, la nucleasa 5’ comprende nucleasas 5’ termoestables. En otras formas de realización relacionadas, la polimerasa tiene la secuencia alterada con respecto a una secuencia de una polimerasa que se produce naturalmente de tal manera que presenta actividad sintética de ADN reducida con respecto a la de la polimerasa que se produce naturalmente. En algunas formas de realización relacionadas, la polimerasa 10 comprende una polimerasa termoestable (por ejemplo, una polimerasa procedente de especies de Thermus que incluyen pero no se limitan a, Thermus aquaticus, Thermus flavus, Thermus thermophilus, Thermus filiformus, y Thermus scotoductus).

La presente invención no está limitada por la naturaleza de la funcionalidad alterada proporcionada por el dominio funcional heterólogo. Ejemplos ilustrativos de alteraciones incluyen, 15 pero no se limitan a, enzimas donde el dominio funcional heterólogo comprende una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, uno o más aminoácidos) que proporciona una actividad nucleasa mejorada, una actividad de unión a sustrato y/o una especificidad de fondo mejorada en un ensayo de escisión del ácido nucleico.

La presente invención no está limitada por la naturaleza del dominio funcional heterólogo. 20 Por ejemplo, en algunas formas de realización relacionadas, el dominio funcional heterólogo comprende dos o más aminoácidos procedentes de un dominio de polimerasa de una polimerasa (por ejemplo, introducido en la enzima mediante la inserción de un dominio funcional quimérico o creado mediante mutación). En alguna forma de realización relacionada, al menos uno de los dos o más aminoácidos procede de una región de la palma o del pulgar del dominio de la polimerasa 25 En algunas formas de realización relacionadas, la polimerasa comprende polimerasa de Thermus thermophilus. En formas de realización relacionadas, los dos o más aminoácidos son de los aminoácidos 300-650 de la SEQ ID NO: 1.

Se pueden emplear las novedosas enzimas de la invención para la detección de ADN y ARN dianas incluyendo, pero sin limitarse a, ADN y ARN dianas que comprenden alelos de genes 30 naturales y mutantes, que incluyen, pero sin limitarse a, genes de seres humanos, otros animales, o plantas que son o se pueden asociar con enfermedades u otras dolencias. Adicionalmente, se pueden usar las enzimas de la invención para la detección de y/o la identificación de cepas de microorganismos, que incluyen bacterias, hongos, protozoos, ciliados y virus (y en particular, para la detección e identificación de virus que tienen genomas de ARN, tales como los virus de la 35 Hepatitis C y de la Inmunodeficiencia Humana). Por ejemplo, la presente invención proporciona procedimientos para escindir un ácido nucleico que comprenden proporcionar: una enzima de la presente invención y un ácido nucleico sustrato, y exponer el ácido nucleico sustrato a la enzima (por ejemplo, para producir un producto de escisión que se pueda detectar).

La presente invención proporciona una nucleasa 5’ termoestable que tiene la secuencia de 5 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2857. En otra forma de realización, la nucleasa 5’ está codificada por una secuencia de ADN que comprende la SEQ ID NO: 2856.

La presente invención proporciona también un vector de ADN recombinante que comprende ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una nucleasa 5’, comprendiendo la secuencia de nucleótidostermo la SEQ ID NO: 2856. En una forma de 10 realización preferida, la invención proporciona una célula huésped transformada con un vector de ADN recombinante que comprende ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una nucleasa específica de estructura, comprendiendo la secuencia de nucleótidos la secuencia SEQ ID NO: 2856. La invención no está limitada por la naturaleza de la célula huésped empleada. La técnica es muy consciente de los vectores de expresión adecuados para la expresión de las 15 secuencias de nucleótidos que codifican nucleasas específicas de estructura que se pueden expresar en una variedad de células hospedadoras procariotas y eucariotas. En una realización preferida, la célula huésped es una célula Escherichia coli.

La presente invención está relacionada con un procedimiento para alterar las enzimas nucleasa 5’ con respecto a las enzimas nucleasas 5’ naturales, de tal manera que presentan 20 rendimiento mejorado en los ensayos de detección basados en la escisión de un ARN que comprende una estructura. En particular, las nucleasas 5’ alteradas producidas mediante el procedimiento relacionado presentan rendimiento mejorado en los ensayos de detección basados en la escisión de un miembro de ADN de una estructura de escisión (por ejemplo, una estructura de escisión invasiva), que comprende una cadena de ARN diana. Las nucleasas 5’ mejoradas 25 resultantes de los procedimientos relacionados se pueden mejorar mediante cualquiera de las maneras descritas en el presente documento. Se proporcionan ejemplos de procedimientos para evaluar la mejora en cualquier enzima candidata.

Por ejemplo, la presente invención está relacionada con procedimientos para producir una enzima alterada con funcionalidad mejorada en un ensayo de escisión del ácido nucleico que 30 comprende: proporcionar una enzima y un sustrato de ensayo de ácido nucleico; introducir un dominio funcional heterólogo en la enzima para producir una enzima alterada; poner en contacto la enzima alterada con el sustrato de ensayo de ácido nucleico para producir productos de escisión; y detectar los productos de escisión. En algunas formas de realización, la introducción del dominio funcional heterólogo comprende mutar uno o más aminoácidos de la enzima. En otras 35 formas de realización relacionadas, la introducción del dominio funcional heterólogo en la enzima comprende añadir un dominio funcional procedente de una proteína (por ejemplo, otra enzima) en la enzima (por ejemplo, sustituyendo dominios funcionales mediante la eliminación de una porción de la secuencia de la enzima antes de añadir el dominio funcional de la proteína). En formas de realización relacionadas, el sustrato de ensayo de ácido nucleico comprende una estructura de 5 escisión. En una forma de realización relacionada, la estructura de escisión comprende un ácido nucleico ARN diana. En otras formas de realización adicionalmente relacionadas, la estructura de escisión comprende una estructura de escisión invasiva.

La presente invención también se refiere a kits de tratamiento de ácido nucleico. Una forma de realización relacionada es un kit que comprende una composición que comprende al 10 menos una nucleasa 5’ mejorada. Otra forma de realización relacionada proporciona un kit que comprende: a) una composición que comprende al menos una nucleasa 5’ mejorada; y b) un oligonucleótido INVADER y una sonda de oligonucleótido señal. En algunas formas de realización relacionadas de los kits de la presente invención, la nucleasa 5’ mejorada se deriva de una ADN polimerasa procedente de una especie eubacteriana. En formas de realización adicionales 15 relacionadas, la especie eubacteriana es termófila. En formas de realización más adicionales relacionadas, el termófilo es del género Thermus. En formas de realización más adicionales relacionadas, el termófilo se selecciona entre el grupo compuesto por Thermus aquaticus, Thermus flavus, Thermus thermophilus, Thermus filiformus, y Thermus scotoductus. En formas de realización relacionadas, la nucleasa 5’ mejorada está codificada por ADN seleccionado entre el 20 grupo que comprende las SEQ ID NOS: 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103,104, 105, 106, 107,108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129,130, 131, 132, 133, 134, 135, 222, 340, 345, 347, 350, 352, 358, 364, 366, 368, 373, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 401, 405, 407, 409, 411, 415, 417, 419, 423, 426, 25 428, 431, 435, 439, 443, 445, 447, 449, 452, 454, 455, 459, 463, 467, 471, 475, 481, 484, 495, 497, 499, 501, 505, 509, 513, 517, 521, 525, 529, 533, 537, 541, 543, 549, 552, 559, 563, 565, 567, 571, 573, 575, 577, 579, 581, 583, 585, 587, 589, 2675-2709, 2711, 2713, 2715, 2716, 2718, 2720, 2721, 2723, 2725, 2727, 2729, 2731, 2733, 2735, 2737, 2739, 2741, 2743 2745, 2747, 2749, 2751, 2753, 2755, 2757, 2759, 2761, 2763, 2764, 2765, 2767, 2769, 2771, 2773, 2775, 30 2777, 2779, 2784, 2786, 2788, 2790, 2792, 2794, 2796, 2798, 2800, 2802, 2804, 2806, 2808, 2810, 2812, 2814, 2816, 2818, 2820, 2822, 2824, 2826, 2828, 2830, 2832, 2834, y 2836. En otras formas de realización adicionalmente relacionadas, los kits comprenden además reactivos para detectar un producto de escisión de ácido nucleico. En formas de realización preferidas adicionales, los reactivos para detectar un producto de escisión comprenden oligonucleótidos para 35 uso en una reacción de escisión invasiva posterior (Véase por ejemplo, Patente de los Estados Unidos Nº 5.994.069). En otras formas de realización relacionadas, los reactivos para la posterior reacción de escisión invasiva comprenden una sonda marcada con restos que producen un efecto de transferencia de energía de resonancia con fluorescencia (FRET).

La presente invención se refiere también a procedimientos para tratar ácido nucleico, que 5 comprenden: a) proporcionar: una primera nucleasa específica de estructura constituida por una endonucleasa en una solución que contiene manganeso; y un sustrato de ácido nucleico; b) tratar el sustrato de ácido nucleico con temperatura creciente de tal manera que el sustrato sea sustancialmente monocatenario; c) reducir la temperatura en condiciones tales que el sustrato monocatenario forme una o más estructuras de escisión; d) hacer reaccionar los medios de 10 escisión con las estructuras de escisión de tal manera que se produzcan uno o más productos de escisión; y e) detectar el uno o más productos de escisión. En algunas formas de realización de los procedimientos, la endonucleasa incluye, pero no se limita a, enzima CLEAVASE BN, ADN polimerasa de Thermus aquaticus, ADN polimerasa de Thermus thermophilus, Exo III de Escherichia coli, y el complejo Rad1/Rad10 de Saccharomyces cerevisiae. En otras formas de 15 realización adicionalmente relacionadas, la nucleasa es una nucleasa 5’ derivada de una ADN polimerasa termoestable alterada en la secuencia de aminoácidos de tal manera que presenta actividad sintética de ADN reducida don respecto a la de la ADN polimerasa natural, pero retiene sustancialmente la misma actividad nucleasa 5’ de la ADN polimerasa natural. En otras formas de realización adicionalmente relacionadas, el ácido nucleico se selecciona entre el grupo compuesto 20 por ARN y ADN. En formas de realización adicionales relacionadas, el ácido nucleico de la etapa (a) en bicatenario.

La presente invención se refiere también a kits de tratamiento de ácido nucleico, que comprenden: a) una composición que comprende al menos una endonucleasa FEN-1 purificada; y b) una solución que contiene manganeso. En algunas formas de realización relacionadas de los 25 kits, la endonucleasa FEN-1 purificada se selecciona entre el grupo compuesto por endonucleasa FEN-1 de Pyrococcus woesei, endonucleasa FEN-1 de Pyrococcus furiosus, endonucleasa FEN-1 de Methanococcus jannaschii, endonucleasa FEN-1 de Methanobacterium thermoautotrophicum, endonucleasa FEN-1 de Archaeoglobus fulgidus, Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, 30 Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix, y endonucleasas FEN-1 quiméricas. En otras formas de realización relacionadas, los kits comprenden además al menos una segunda nucleasa específica de estructura. En algunas formas de realización relacionadas, la 35 segunda nucleasa es una nucleasa 5’ derivada de una ADN polimerasa termoestable alterada en la secuencia de aminoácidos de tal manera que presenta actividad sintética de ADN reducida con respecto a la de la ADN polimerasa natural, pero retiene sustancialmente la misma actividad nucleasa 5’ de la ADN polimerasa natural En otras formas de realización adicionalmente relacionadas de los kits, la porción de la secuencia de aminoácidos de la segunda nucleasa es 5 homóloga a una porción de la secuencia de aminoácidos de una ADN polimerasa termoestable derivada de un termófilo eubacteriano del género Thermus En formas de realización adicionales relacionadas, el termófilo se selecciona entre el grupo compuesto por Thermus aquaticus, Thermus flavus y Thermus thermophilus. En otras formas de realización adicionalmente relacionadas, los kits comprenden además reactivos para detectar los productos de escisión. 10

La presente invención está relacionada con cualquiera de las composiciones, mezclas, procedimientos, y kits descritos en el presente documento, usados junto con endonucleasas que comprenden endonucleasas de Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, 15 Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, y Aeropyrum pernix. Estas composiciones incluyen endonucleasas FEN-1 purificadas procedentes de los organismos (incluyendo endonucleasas específicas descritas por secuencias proporcionadas en el presente documento, así como variantes y homólogos), los kits que comprenden estas composiciones, las composiciones que comprenden endonucleasas 20 quiméricas que comprenden al menos una porción de las endonucleasas procedentes de estos organismos, los kits que comprenden dichas composiciones, las composiciones que comprenden ácidos nucleicos que codifican las endonucleasas procedentes de estos organismos (incluyendo vectores y células hospedadoras), los kits que comprenden dichas composiciones, los anticuerpos generados por las endonucleasas, las mezclas que comprenden procedentes de estos 25 organismos, los procedimientos de usar la endonucleasas en ensayos de escisión (por ejemplo, ensayos de escisión invasivos, CFLP, etc), y los kits que contienen componentes útiles para dichos procedimientos. Se proporcionan en el presente documento ejemplos que describen la generación, estructura, uso y caracterización de estas endonucleasas.

La presente invención se refiere a procedimientos para mejorar los procedimientos y 30 enzimas dados a conocer en el presente documento. Por ejemplo, la presente invención se refiere a procedimientos para mejorar enzimas para cualquier objetivo previsto (por ejemplo, uso en reacciones de escisión, reacciones de amplificación, reacciones de unión, o cualquier otro uso) que comprende la etapa de proporcionar una enzima dada a conocer en el presente documento y modificar la enzima (por ejemplo, alterando la secuencia de aminoácidos, añadiendo o 35 sustrayendo la secuencia, añadiendo modificaciones después de la traducción, añadiendo cualquier otro componente tanto biológico como no, o cualquier otra modificación). Igualmente, la presente invención se refiere a procedimientos para mejorar los procedimientos dados a conocer en el presente documento que comprenden, llevar a cabo las etapas del procedimiento con uno o más cambios (por ejemplo, cambio en una composición proporcionada en el procedimiento, 5 cambio en el orden de las etapas, o adición o sustracción de etapas).

El rendimiento mejorado en un ensayo de detección puede surgir de una cualquiera de, o de una combinación de diversas características mejoradas Por ejemplo, en una forma de realización relacionada, la enzima de la presente invención puede tener una velocidad de escisión (kcat) mejorada sobre una estructura dirigida específica, de tal manera que se puede producir una 10 cantidad más grande de un producto de escisión en un plazo de tiempo dado. En otra forma de realización relacionada, la enzima de la presente invención puede tener una actividad o velocidad reducidas en la escisión de estructuras inapropiadas o no específicas. Por ejemplo, en algunas formas de realización relacionadas de la presente invención, un aspecto de mejora es la del diferencial entre la cantidad detectable de escisión de una estructura específica y la cantidad 15 detectable de escisión de cualquier estructura alternativa está aumentada. Como tal, la presente invención está relacionada con una enzima que tiene una velocidad reducida de escisión de una estructura diana específica en comparación con la velocidad de la enzima natural, y que tiene una velocidad de escisión adicionalmente reducida de cualquier estructura alternativa, de tal manera que el diferencial entre la cantidad detectable de escisión de la estructura específica y la cantidad 20 detectable de escisión de cualquier estructura alternativa está aumentada. Sin embargo, la presente invención no está limitada a enzimas que tienen un diferencial mejorado.

En algunas formas de realización relacionadas, la presente invención proporciona una composición que comprende una enzima, en la que la enzima comprende un dominio funcional heterólogo, en el que el dominio funcional heterólogo proporciona funcionalidad alterada (por 25 ejemplo, mejorada) en el ensayo de escisión del ácido nucleico La presente invención no está limitada por la naturaleza del ensayo de escisión del ácido nucleico. Por ejemplo, los ensayos de escisión del ácido nucleico incluyen cualquier ensayo en el que se escinde un ácido nucleico, directa o indirectamente, en presencia de la enzima. En algunas formas de realización relacionadas, el ensayo de escisión del ácido nucleico es un ensayo de escisión invasivo. En 30 formas de realización particularmente preferidas, el ensayo de escisión utiliza una estructura de escisión que tiene al menos un componente de ARN. En otra forma de realización particularmente preferida, el ensayo de escisión utiliza una estructura de escisión que tiene al menos un componente de ARN, en el que se escinde un miembro del ADN de la estructura de escisión.

La presente invención no está limitada por la naturaleza de la funcionalidad alterada 35 proporcionada por el dominio funcional heterólogo. Ejemplos ilustrativos de alteraciones incluyen, pero no se limitan a, enzimas donde el dominio funcional heterólogo comprende una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, uno o más aminoácidos) que proporciona una actividad nucleasa mejorada, una actividad de unión a sustrato mejorada y/o una especificidad de fondo mejorada en un ensayo de escisión del ácido nucleico. 5

La presente invención no está limitada por la naturaleza del dominio funcional heterólogo. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el dominio funcional heterólogo comprende dos o más aminoácidos procedentes de un dominio de polimerasa de una polimerasa (por ejemplo, introducido en la enzima mediante la inserción de un dominio funcional quimérico o creado mediante mutación). En alguna forma de realización preferida, al menos uno de los dos o más 10 aminoácidos es de una región de la palma o del pulgar del dominio de la polimerasa. La presente invención no esta limitada por la identidad de la polimerasa a partir de la cual se seleccionan los dos o más aminoácidos. En algunas formas de realización preferidas, la polimerasa comprende polimerasa de Thermus thermophilus. En formas de realización particularmente preferidas, los dos o más aminoácidos son de los aminoácidos 300-650 de la SEQ ID NO: 1. 15

Se pueden emplear los novedosos enzimas de la invención para la detección de ADN y ARN dianas incluyendo, pero sin limitarse a, ADN y ARN dianas que comprenden alelo naturales y mutantes de genes, que incluyen, pero no se limitan a, genes de seres humanos, otros animales, o plantas que son o que se pueden asociar con enfermedades u otras dolencias. Adicionalmente, se pueden usar las enzimas de la invención para la detección y/o la identificación de cepas de 20 microorganismos, incluyendo bacterias, hongos, protozoos, ciliados y virus (y en particular para la detección e identificación de virus que tienen genomas de ARN, tales como los virus de la Hepatitis C y de la Inmunodeficiencia Humana). Por ejemplo, la presente invención está relacionada con procedimientos para escindir un ácido nucleico que comprenden proporcionar: una enzima de la presente invención y un ácido nucleico sustrato; y exponer el ácido nucleico 25 sustrato a la enzima (por ejemplo, para producir un producto de escisión que se pueda detectar). En algunas formas de realización, el ácido nucleico sustrato está en una muestra de lisado celular.

Definiciones

Para facilitar la comprensión de la presente invención, se definen a continuación varios 30 términos y expresiones:

Tal como se usa en el presente documento, los términos “complementario” y complementariedad” se usan en referencia a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos tal como un oligonucleótido o un ácido nucleico diana) relacionados por las reglas del emparejamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia “5’-A-G-T-3’” es complementaria de la 35 secuencia “3’-T-C-A-5’”. La complementariedad puede ser “parcial”, en que únicamente se emparejan algunas de las bases de los ácidos nucleicos de acuerdo con las reglas del emparejamiento de bases. O, puede ser una complementariedad “completa” o “total” entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre cadenas de ácidos nucleicos tiene significativos efectos sobre la eficacia y la fuerza de la hibridación entre cadenas de ácidos 5 nucleicos. Esto es de particular importancia en las reacciones de amplificación, así como en los procedimientos de detección que dependen de la unión entre ácidos nucleicos. Se puede usar también cualquier término en referencia a nucleótidos individuales, especialmente dentro del contexto de los polinucleótidos. Por ejemplo, se puede señalar un nucleótido particular dentro de un oligonucleótido por su complementariedad, o carecer de la misma, para un nucleótido particular 10 dentro de otra cadena de ácido nucleico, por el contrario o en comparación a la complementariedad entre el resto de oligonucleótidos y la cadena de ácido nucleico. Los nucleótidos análogos usados para formar parejas de bases no estándares, tanto con otro nucleótido análogo (por ejemplo un par de bases IsoC/IsoG), como con un nucleótido que se produce naturalmente (por ejemplo, tal como se describe en la Patente de los Estados Unidos 15 5.912.340, incorporada por referencia en su totalidad), se consideran también que son complementarios con un compañero de emparejamiento de bases comprendido dentro del significado de esta definición. Además, cuando se sabe que los nucleótidos forman parejas con múltiples bases diferentes, por ejemplo, la capacidad del nucleótido IsoG de emparejarse con Iso C y con nucleótidos T, cada una de las bases con la cual puede formar un par de bases unidas 20 por hidrógeno queda comprendida dentro del significado de “complementariedad”, tal como se usa en el presente documento. Bases “universales”, es decir, aquellas que pueden formar pares de bases con algunas otras bases, tales como la base inosina “tambaleante”, se consideran complementarias con aquellas bases con las que pueden formar parejas.

El término “homología” y “homólogo” se refiere al grado de identidad. Puede ser homología 25 parcial u homología completa. Una secuencia parcialmente homóloga es una que es menor de un 100% idéntica a otra secuencia.

Tal como se usa en el presente documento, el término “hibridación” se usa en referencia al emparejamiento de ácidos nucleicos complementarios, La hibridación y la fuerza de la hibridación (es decir, la fuerza de la asociación entre los ácidos nucleicos) está influenciada por dichos 30 factores como el grado de complementariedad entre los ácidos nucleicos, el rigor de las condiciones implicadas, y la Tm del híbrido formado. Los procedimientos de “hibridación” implican la hibridación de un ácido nucleico con otro, un ácido nucleico complementario, es decir, un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria. La capacidad de dos polímeros de ácido nucleico que contienen secuencias complementarias de localizarse entre sí e hibridarse 35 mediante la interacción del emparejamiento de bases es un fenómeno bien reconocido. Las observaciones iniciales del procedimiento de ·hibridación” de Marmur y Lane, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46: 453 (1960) y Doty y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46: 461 (1960) se han continuado por el refinamiento de este procedimiento en una herramienta esencial de la biología moderna. 5

Con respecto a la complementariedad, es importante en algunas aplicaciones diagnósticas para determinar si la hibridación representa complementariedad completa o parcial. Por ejemplo, cuando se desea detectar de manera sencilla la presencia o ausencia de ADN patógeno (tal como de un virus, bacteria, hongo, micoplasma, protozoo), es importante únicamente que el procedimiento asegure la hibridación cuando está presente la secuencia relevante; se pueden 10 seleccionar las condiciones en las que se hibridarán sondas parcialmente complementarias y sondas completamente complementarias. Otras aplicaciones diagnósticas, sin embargo, pueden requerir que el procedimiento de hibridación distinga entre complementariedad parcial y completa. Puede ser de interés detectar polimorfismos genéticos. Por ejemplo, la hemoglobina humana está compuesta, en parte, de cuatro cadenas de polipéptidos. Dos de estas cadenas son cadenas 15 idénticas de 141 aminoácidos (cadenas alfa) y dos de estas cadenas son cadenas idénticas de 146 aminoácidos (cadenas beta). Se conoce el gen que codifica la cadena beta por presentar polimorfismo. El alelo normal codifica una cadena beta que tiene ácido glutámico en la sexta posición. El alelo mutante codifica una cadena beta que tiene valina en la sexta posición. Esta diferencia en los aminoácidos tiene un profundo (más profundo cuando el individuo es 20 homocigótico para el alelo mutante) impacto fisiológico conocido clínicamente como anemia falciforme. Se sabe bien que la base genética de los cambios de aminoácidos implica diferencia en una única base entre el alelo normal de la secuencia de ADN y el alelo mutante de la secuencia de ADN.

El complemento de la secuencia de ácido nucleico tal como se usa en el presente 25 documento se refiere a un oligonucleótido que, cuando se alinea con la secuencia de ácido nucleico de tal manera que el extremo 5’ de una secuencia se empareja con el extremo 3’ de la otra, está en asociación “antiparalela”. Se pueden incluir algunas bases no encontradas comúnmente en los ácidos nucleicos naturales de la presente invención e incluyen, por ejemplo, inosina y 7-deazaguanina. La complementariedad no necesita ser perfecta; dúplex estables 30 pueden contener pares de bases incorrectamente emparejadas o bases no emparejadas. Las personas expertas en la técnica de la tecnología de ácidos nucleicos pueden determinar la estabilidad del dúplex de manera empírica considerando numerosas variables que incluyen, por ejemplo, la longitud del oligonucleótido, la composición de las bases y la secuencia del oligonucleótido, la fuerza iónica y la incidencia de pares de bases incorrectamente emparejadas. 35

Tal como se usa en el presente documento, el término “Tm” se usa en referencia a la “temperatura de fusión”. La temperatura de fusión es la temperatura a la cual una población de moléculas de ácido nucleico bicatenario llega a semidisociarse en cadenas individuales. Se conocen bien en la técnica algunas ecuaciones para calcular la Tm de los ácidos nucleicos. Tal como se indica por referencias normalizadas, se puede calcular una estimación sencilla del valor 5 de la Tm mediante la ecuación: Tm = 81,5 + 0,41 (% G + C), cuando un ácido nucleico está en una disolución acuosa a NaCl 1 M (véase por ejemplo, Anderson y Young, Quantitative Filter Hybridization, en Nucleic Acid Hybridization (1985). Otras referencias (por ejemplo, Allawi, H.T. & SantaLucia, J., Jr. Thermodynamics and NMR of internal G.T mismatches in DNA. Biochemistry 36, 10581-94 (1997) incluyen cálculo más sofisticados que consideran características 10 estructurales y ambientales, así como la secuencia a tener en cuenta para el cálculo de la Tm.

Tal como se usa en el presente documento, el término “rigurosidad” se usa en referencia a las condiciones de temperatura, fuerza iónica, y la presencia de otros compuestos, en las cuales se llevan a cabo las hibridaciones de ácidos nucleicos. En condiciones de “elevada rigurosidad”, se producirá el emparejamiento de bases de ácidos nucleicos únicamente entre fragmentos de 15 ácidos nucleicos que tienen una elevada frecuencia de secuencias de bases complementarias. De esta manera, se requieren a menudo condiciones de rigurosidad “débil” o “baja” cuando se desea que ácidos nucleicos que no son completamente complementarios entre sí se hibriden o fusiones conjuntamente.

Las “condiciones de elevada rigurosidad” cuando se usan en referencia a la hibridación de 20 ácidos nucleicos comprenden condiciones equivalentes a la unión o a la hibridación a 42ºC en una solución constituida por 5X SSPE (43,8 g/l de NaCl, 6,9 g/l de NaH2PO4 H2O y 1,85 g/ de EDTA, pH ajustado a 7,4 con NaOH), SDS al 0,5%, 5X reactivo de Denhardt y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado seguido por lavado en una solución que comprende 0,1X SSPE, SDS al 1,0% a 42ºC cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos 25 de longitud.

Las “condiciones medias de rigurosidad” cuando se usan en referencia a la hibridación de ácidos nucleicos comprenden condiciones equivalentes a la unión o a la hibridación a 42ºC en una solución constituida por 5X SSPE (43,8 g/l de NaCl, 6,9 g/l de NaH2PO4 H2O y 1,85 g/l de EDTA, pH ajustado a 7,4 con NaOH), SDS al 0,5%, 5X reactivo de Denhardt y 100 µg/ml de ADN de 30 esperma de salmón desnaturalizado seguido por lavado en una solución que comprende 1,0X SSPE, SDS al 1,0% a 42ºC cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos.

Las “condiciones de baja rigurosidad” comprenden condiciones equivalentes a la unión o a la hibridación a 42ºC en una solución constituida por 5X SSPE (43,8 g/l de NaCl, 6,9 g/l de NaH2PO4 H2O y 1,85 g/l de EDTA, pH ajustado a 7,4 con NaOH), SDS al 0,1%, 5X reactivo de 35 Denhardt [50X de reactivo de Denhardt contiene por 500 ml: 5 g de Ficoll (Tipo 400, Pharmacia), 5 g de BSA (Fracción V; Sigma)] y 100 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado seguido por lavado en una solución que comprende 5X SSPE, SDS al 0,1% a 42ºC cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.

El término “gen” se refiere a una secuencia de ADN que comprende las secuencias de 5 control y de codificación necesarias para la producción de un ARN que tiene una función no codificante (por ejemplo, un ARN ribosómico o de transferencia), un polipéptido o un precursor. El ARN o el polipéptido pueden estar codificados por una secuencia de codificación de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia de codificación con la condición de que se retenga la actividad o la función deseada. 10

El término “natural” se refiere a un gen o a un producto génico que tiene las características de este gen o del producto génico cuando se aísla de una fuente que se produce naturalmente. Un gen natural es el que se observa más frecuentemente en una población y de esta manera, se designa arbitrariamente la forma “normal” o “natural” del gen. Por el contrario el término “modificado”, “mutante” o polimórfico se refiere a un gen o a un producto génico que presenta 15 modificaciones en la secuencia y/o en las propiedades funcionales (es decir, características alteradas) cuando se compara con el gen o con el producto génico natural. Se señala que se pueden aislar mutantes que se producen naturalmente; estos se identifican por el hecho de que tienen características alteradas cuando se comparan con el gen o con el producto génico natural.

La expresión “vector de ADN recombinante” tal como se usa en el presente documento se 20 refiere a las secuencias de ADN que contienen una secuencia heteróloga deseada. Por ejemplo, aunque el término no está limitado al uso de secuencias expresadas o a secuencias que codifican un producto de expresión, en algunas formas de realización, la secuencia heteróloga es una secuencia de codificación y unas secuencias de ADN apropiadas, necesarias tanto para la replicación de la secuencia de codificación en un organismo hospedador, como para la expresión 25 de la secuencia de codificación unida de manera operable en un organismo hospedador particular. Las secuencias de ADN necesarias para la expresión en procariotas incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un sitio de unión a ribosoma y posiblemente otras secuencias. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores. 30

El término “LTR” tal como se usa en el presente documento se refiere a la repetición terminal larga que se encuentra en cada extremo de un provirus (es decir, la forma integrada de un retrovirus). La LTR contiene numerosas señales reguladoras que incluyen elementos de control de la transcripción, señales de poliadenilación y secuencias necesarias para la replicación y la integración del genoma vírico. La LTR vírica se divide en tres regiones denominadas U3, R y U5. 35

La región U3 contiene los elementos potenciadores y promotores. La región U5 contiene las señales de poliadenilación. La región R (repetición) separa las regiones U3 y U5 y las secuencias transcritas de la región R aparecen en los extremos 5’ y 3’ del ARN vírico.

El término “oligonucleótido tal como se usa en el presente documento se define como una molécula que comprende dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferiblemente al 5 menos 5 nucleótidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 10-15 nucleótidos y más preferiblemente al menos aproximadamente 15 a 30 nucleótidos. El tamaño exacto dependerá de muchos factores, que a la vez dependen de la función en último extremo o del uso del oligonucleótido. Se puede generar el oligonucleótido de cualquier manera, incluyendo la síntesis química, la replicación del ADN, la transcripción inversas, la PCR, o una de sus combinaciones. 10

Debido a que se hacen reaccionar mononucleótidos para preparar oligonucleótidos de una manera tal que el fosfato 5’ de un anillo pentosa de mononucleótido se une al oxígeno 3’ de su vecino en una dirección mediante un enlace fosfodiéster, un extremo de un oligonucleótido se denomina como el “extremo 5’” si su fosfato 5’ no está unido al oxígeno 3’ de un anillo pentosa de mononucleótido y como el “extremo 3’” si su oxígeno 3’ no está unido al fosfato 5’ de un anillo 15 pentosa de mononucleótido posterior. Tal como se usa en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico, incluso si el oligonucleótido interno de uno más grande, puede ser mencionado por tener extremos 5’ y 3’. Se dice que una primera región a lo largo de una cadena de ácido nucleico está en la dirección 5’ de otra región si el extremo 3’ de la primera región está antes del extremo 5’ de la segunda región cuando se mueve a lo largo de una cadena de ácido nucleico en 20 una dirección 5’ a 3’.

Cuando dos oligonucleótidos diferentes, no solapantes se hibridan en diferentes regiones de la misma secuencia de ácido nucleico complementaria lineal, y el extremo 3’ de un oligonucleótido apunta hacia el extremo 5’ del otro, el primero se puede denominar oligonucleótido “en la dirección 5’” y el último, oligonucleótido “en la dirección 3’” De manera similar, cuando se 25 hibridan dos oligonucleótidos solapantes en la misma secuencia de ácido nucleico complementaria lineal, situándose el primer oligonucleótido de manera que su extremo 5’ está en la dirección 5’ del extremo 5’ del segundo oligonucleótido, y el extremo 3’ del primer oligonucleótido está en la dirección 5’ del extremo 3’ del segundo oligonucleótido, se puede denominar el primer oligonucleótido, el oligonucleótido “en la dirección 5’“ y se puede denominar el 30 segundo oligonucleótido, el oligonucleótido “en la dirección 3’“.

El término “cebador” se refiere a un oligonucleótido que es capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis cuando se coloca en condiciones en la que se inicia la extensión del cebador. Un “cebador” de oligonucleótido se puede producir naturalmente, como en la digestión purificada mediante restricción o se puede producir sintéticamente. 35

Se selecciona un cebador para ser “sustancialmente” complementario de una cadena de secuencia específica de la plantilla. Un cebador debe ser suficientemente complementario para hibridarse con una cadena plantilla para que se produzca el alargamiento del cebador. Una secuencia de cebador necesita reflejar la secuencia exacta de la plantilla. Por ejemplo, un fragmento de nucleótido no complementario se puede unir al extremo 5’ del cebador, siendo el 5 resto de la secuencia del cebador sustancialmente complementaria. Se pueden intercalar bases no complementarias o secuencias más largas en el cebador, con la condición de que la secuencia del cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia de la plantilla a hibridar y forme por tanto un complejo del molde cebador para la síntesis del producto de extensión del cebador.

El término “marca” tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier átomo 10 o molécula que se puede usar para proporcionar un efecto detectable (preferiblemente cuantificable), y que se puede unir a un ácido nucleico o a una proteína. Las marcas incluyen, pero no se limitan a colorantes; radiomarcas tales como 32P; restos de unión tales como biotina; haptenos tales como digoxigenina; restos luminogénicos, fosforescentes o fluorógenos; y colorantes fluorescentes solos o en combinación con restos que pueden suprimir o modificar los 15 espectros de emisión mediante transferencia de energía de resonancia con fluorescencia (FRET). Las marcas pueden proporcionar señales detectables mediante fluorescencia, radioactividad, colorimetría, gravimetría, difracción o absorción mediante rayos X, magnetismo, actividad enzimática, y similares. Una marca puede ser un resto cargado (carga positiva o negativa) o alternativamente, puede ser una carga neutra. Las marcas pueden incluir o consistir en un ácido 20 nucleico o secuencia de proteína, siempre que la secuencia que comprende la marca sea detectable.

El término “señal” tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier efecto detectable, de tal manera que se podría producir o proporcionar por una marca o una reacción de ensayo. 25

Tal como se usa en el presente documento, el término “detector” se refiere a un sistema o componente de un sistema, por ejemplo, un instrumento (por ejemplo, una cámara, fluorímetro, dispositivo acoplado a carga, contador por centelleo, etc), o a un medio reactivo (película de rayos X o de cámara, indicador de pH, etc), que puede transportarse por un usuario o por otro componente de un sistema (por ejemplo, un ordenador o controlador) la presencia de una señal o 30 efecto. Un detector puede ser un sistema fotométrico o espectrofotométrico, que puede detectar la luz ultravioleta, visible o infrarroja, incluyendo fluorescencia o quimioluminiscencia; un sistema de detección de radiación; un sistema espectroscópico tal como espectroscopía de resonancia magnética nuclear, espectrometría de masas, o espectroscopía Raman de superficie potenciada; un sistema como la electroforesis en gel o capilar, o cromatografía de exclusión en gel; u otro 35 sistema de detección conocido en la técnica, o sus combinaciones.

El término “estructura de escisión”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una estructura que está formada por la interacción de al menos una sonda de oligonucleótidos y un ácido nucleico diana, que forma una estructura que comprende un dúplex, siendo la estructura resultante escindible por un agente de escisión, que incluye, pero no se limita a una enzima. La 5 estructura de escisión es un sustrato para la escisión específica por los medios de escisión por el contrario con una molécula de ácido nucleico que es un sustrato para la escisión no específica por agentes tales como fosfodiesterasas que escinden las moléculas de ácido nucleico con respecto a la estructura secundaria (es decir, no se requiere la formación de una estructura de dúplex).

La expresión “estructura de escisión plegada”, tal como usa en el presente documento, se 10 refiere a una región de un sustrato de ácido nucleico monocatenario que contiene una estructura secundaria, siendo la estructura resultante escindible por un agente de escisión, que incluye, pero no se limita a una enzima. La estructura de escisión es un sustrato para la escisión específica por los medios de escisión por el contrario con una molécula de ácido nucleico que es un sustrato para la escisión no específica por agentes tales como fosfodiesterasas que escinden las 15 moléculas de ácido nucleico con respecto a la estructura secundaria (es decir, no se requiere el plegado del sustrato).

Tal como se usa en el presente documento, el término “diana plegada” se refiere a una cadena de ácido nucleico que contiene al menos una región de estructura secundaria (es decir, al menos una región bicatenaria y al menos una región monocatenaria dentro de una única cadena 20 del ácido nucleico). Una diana plegada puede comprender regiones de estructura terciaria adicionalmente a regiones de estructura secundaria.

El término “medios de escisión” o “agente de escisión” tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier medio que es capaz de escindir una estructura de escisión, incluyendo, pero sin limitarse a enzimas los medios de escisión pueden incluir DNAP naturales 25 que tienen actividad nucleasa 5’ (por ejemplo, ADN polimerasa Taq, ADN polimerasa I de E. coli) y, más específicamente, DNAP modificados que tienen actividad nucleasa 5’ pero que careces de actividad sintética. “Nucleasas específicas de estructura” o “enzimas específicas de estructura” son enzimas que reconocen estructuras secundarias específicas en una molécula de ácido nucleico y escinden estas estructuras. Los medios de escisión de la invención escinden una 30 molécula de ácido nucleico en respuesta a la formación de estructuras de escisión; no es necesario que los medios de escisión escindan la estructura de escisión en alguna localización concreta dentro de la estructura de escisión.

Los medios de escisión no están restringidos a enzimas que tienen únicamente actividad nucleasa 5’. Los medios de escisión pueden incluir actividad nucleasa proporcionada a partir de 35 una variedad de fuentes que incluyen las enzimas CLEAVASE, las endonucleasas FEN-1 (que incluyen las proteínas RAD2 y XPG), la ADN polimerasa Taq y la ADN polimerasa I de E. coli.

El término “termoestable” cuando se usa en referencia a una enzima, tal como una nucleasa 5’, indica que la enzima es funcional o activa (es decir, puede llevar a cabo la catálisis) a una temperatura elevada, es decir, a aproximadamente 55ºC o más. 5

El término “productos de escisión” tal como se usa en el presente documento, se refiere a productos generados por la reacción de un medio de escisión con una estructura de escisión (es decir, el tratamiento de una estructura de escisión con unos medios de escisión).

El término “ácido nucleico diana” se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia que tiene al menos complementariedad parcial con al menos una sonda de 10 oligonucleótidos y puede tener también al menos complementariedad parcial con un oligonucleótido INVADER. El ácido nucleico diana puede comprender ADN o ARN monocatenario o bicatenario, y puede comprender nucleótidos análogos, marcas, y otras modificaciones.

El término “sonda de oligonucleótidos” se refiere a un oligonucleótido que interactúa con un ácido nucleico diana para formar una estructura de escisión en presencia o ausencia de un 15 oligonucleótido INVADER. Cuando se hibrida con el ácido nucleico diana, la sonda de oligonucleótidos y la diana forman una estructura de escisión y se produce la escisión dentro de la sonda de oligonucleótidos.

El término “producto de escisión no diana” se refiere a u producto de una reacción de escisión que no está derivado del ácido nucleico diana. Tal como se ha descrito anteriormente, en 20 el procedimiento de la invención, la escisión de la estructura de escisión se produce generalmente dentro de la sonda de oligonucleótidos. Los fragmentos de la sonda de oligonucleótidos generados por esta escisión dependiente del ácido nucleico diana son “productos de escisión no dianas”.

El término “oligonucleótido INVADER” se refiere a un oligonucleótido que se hibrida con un 25 ácido nucleico diana en una localización próxima a la región de hibridación entre una sonda y el ácido nucleico diana, en el que el oligonucleótido INVADER comprende una porción (por ejemplo, un resto químico, o un nucleótido tanto complementario de esta diana como no) que solapa con la región de hibridación entre la sonda y la diana. En algunas formas de realización, el oligonucleótido INVADER contiene secuencias en su extremo 3’ que son sustancialmente iguales 30 que las secuencias localizadas en el extremo 5’ de una sonda de oligonucleótidos.

La expresión “sustancialmente monocatenario”, cuando se usa en referencia a un sustrato de ácido nucleico significa que la molécula existe principalmente como una única cadena de ácido nucleico por el contrario con un sustrato bicatenario que existe como dos cadenas de ácido nucleico que se mantienen juntas mediante interacciones de emparejamiento de bases intra 35 cadena.

La expresión “variación de la secuencia” tal como se usa en el presente documento se refiere a las diferencias en la secuencia de ácido nucleico entre dos ácidos nucleicos. Por ejemplo, un gen estructural natural y una forma mutante de este gen estructural natural pueden variar en la secuencia por la presencia de sustituciones y/o deleciones o inserciones de bases únicas de uno 5 o más nucleótidos. Estas dos formas del gen estructural se dice que varían en la secuencia entre sí. Puede existir una segunda forma mutante del gen estructural. Esta segunda forma mutante se dice que varía en la secuencia procedente del gen natural y de la primera forma mutante del gen.

El término “liberación” tal como se usa en el presente documento se refiere a la liberación de un fragmento de ácido nucleico procedente de u fragmento de ácido nucleico más grande, tal 10 como un oligonucleótido, mediante la acción de, por ejemplo, una nucleasa 5’ tal que el fragmento liberado ya no está covalentemente unido al resto del oligonucleótido.

El término “Km” tal como se usa en el presente documento se refiere a la constante de Michaelis-Menten de una enzima y se define como la concentración del sustrato específico a la cual la enzima proporcionada da como resultado un medio de su velocidad máxima en una 15 reacción catalizada por una enzima.

El término “nucleótido” tal como se usa en el presente documento incluye, pero no se limita a, nucleótidos, nucleótidos análogos, y derivados de nucleótidos que se producen naturalmente y/o de manera sintética. Por ejemplo, el término incluye monómeros de ADN o ARN que se producen naturalmente, nucleótidos con modificaciones estructurales tales como ácido nucleico 20 peptídico (PNA) (M. Egholm y col., Nature 365: 566 [1993]), ADN fosforotioato, ADN fosforoditioato, ADN fosforoamidato ADN, ADN unido a amina, ADN unido a MMI, 2’—metil ARN, alfa ADN y metilfosfonato ADN, nucleótidos con modificaciones de azúcar tales como 2’-O-metil ARN, 2’-fluoro ARN, 2’-amino ARN, 2’-O-alquil ADN, 2’-O-alil ADN, 2’-O-alquinil ADN, hexosa ADN, piranosil ARN, y anhidrohexitol ADN, y nucleótidos que tienen modificaciones de bases tales 25 como pirimidinas C-5 sustituidas (los sustituyentes incluyen flúor, bromo, cloro, yodo, metilo, etilo, vinilo, formilo, etinilo, propinilo, alquinilo, tiazolilo, imidazolilo, piridilo), 7-deazapurinas con sustituyentes C-7 que incluyen flúor, bromo, cloro, yodo, metilo, etilo, vinilo, formilo, alquinilo, alquenilo, tiazolilo, imidazolilo, piridilo), inosina y diaminopurina.

El término “análogo de base” tal como se usa en el presente documento se refiere a bases 30 modificadas o que no se producen naturalmente tales como 7-deazapurinas (por ejemplo, 7-deaza-adenina y 7-deaza-guanina); bases modificadas, por ejemplo, para proporcionar interacciones alteradas tales como emparejamiento de bases no estándar, incluyendo, pero sin limitarse a: IsoC, IsoG, y otras bases y nucleótidos modificados descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos 5.432.272; 6.001.983; 6.037.120; 6.140.496; 5.912.340; 6.127.121 y 35 6.143.877, análogos de bases heterocíclicas basados en sistemas no de anillo de purina o pirimidina, y otras bases heterocíclicas. Los análogos de nucleótidos incluyen análogos de bases y comprenden formas modificadas de desoxirribonucleótidos así como de ribonucleótidos.

El término “locus polimórfico” es un locus presente en una población que muestra variación entre los miembros de la población (por ejemplo, el alelo más común tiene una frecuencia de 5 menos de 0,95). A diferencia de lo anterior, un “locus monomórfico” es un locus genético con poca o ninguna variación entre los miembros de la población (tomado generalmente para ser un locus en el cual el alelo más común excede una frecuencia de 0,95 en el combinado de genes de la población).

El término “microorganismo tal como se usa en el presente documento significa un 10 organismo demasiado pequeño para ser observado a simple vista e incluye, pero no se limita a bacterias, virus, protozoos, hongos y ciliados.

La expresión “secuencias de genes microbianos” se refiere a secuencias de genes derivados de un microorganismo.

El término “bacterias” se refiere a cualquier especie bacteriana incluyendo especies 15 eubacterianas y arqueobacterianas.

El término “virus” se refiere a parásitos intracelulares obligados, ultramicroscópicos incapaces de replicación autónoma (es decir, la replicación requiere el uso de la maquinaria de la célula huésped).

La expresión “multiresistente a fármacos” “o resistente a múltiples fármacos” se refiere a 20 un microorganismo que es resistente a más de uno de los antibióticos o agentes antimicrobianos usados en el tratamiento de dicho microorganismo.

El término “muestra” en la presente memoria descriptiva y reivindicaciones se usa en el sentido más amplio. Por una parte, se entiende que incluye un espécimen o cultivo (por ejemplo, cultivos microbianos). Por otra parte, se entiende que incluye muestras biológicas y ambientales. 25 Una muestra puede incluir un espécimen de origen sintético.

Las muestras biológicas pueden ser animales, incluyendo de ser humano, fluidos, sólidas (por ejemplo, deposición) o de tejidos, así como alimentos líquidos y sólidos y productos e ingredientes alimenticios tales como productos lácteos, vegetales carne y subproductos cárnicos, y residuos. Se pueden obtener muestras biológicas de todas las diversas familias de animales 30 domésticos, así como animales de feria o silvestres, incluyendo, pero sin limitarse a, los mencionados ungulados, oso, peces, lagomorfos, roedores, etc.

Las muestras ambientales incluyen material ambiental tal como materia superficial, suelo, agua y muestras industriales, así como muestras obtenidas de instrumentos de procesado de alimentos y productos lácteos, aparatos, equipo, utensilios, utensilios desechables y no 35 desechables. Estos ejemplos no se construyen como limitantes de los tipos de muestras aplicables a la presente invención.

El término “fuente de ácido nucleico diana” se refiere a cualquier muestra que contenga ácido nucleicos (ARN o ADN). Las fuentes particularmente preferidas de ácidos nucleicos dianas son muestras biológicas que incluyen, pero no se limitan a sangre, saliva, fluido cerebroespinal, 5 fluido pleural, leche, linfa, esputo y semen.

Se dice que un oligonucleótido está presente en “exceso” en relación con otro oligonucleótido (o secuencia de ácido nucleico diana) si este oligonucleótido está presente a una concentración molar mayor que la de otro oligonucleótido (o secuencia de ácido nucleico diana). Cuando un oligonucleótido tal como una sonda de oligonucleótido está presente en una reacción 10 de escisión en exceso en relación con la concentración de la secuencia complementaria del ácido nucleico diana, se puede usar la reacción para indicar la cantidad del ácido nucleico diana presente. Normalmente, cuando está presente en exceso, la sonda de oligonucleótido estará presente al menos en un exceso molar de 100 veces, normalmente al menos 1 pmol de cada sonda de oligonucleótido se usaría cuando la secuencia de ácido nucleico diana estuviera 15 presente a aproximadamente 10 fmoles o menos.

Una muestra “sospechosa de contener” un primer y un segundo ácido nucleico diana puede contener cualquiera, ambas o ninguna molécula de ácido nucleico diana.

El término oligonucleótido de “carga equilibrada” se refiere a un oligonucleótido (el oligonucleótido de entrada en una reacción) que se ha modificado de tal manera que el 20 oligonucleótido modificado soporta una carga, así que cuando el oligonucleótido modificado se escinde (es decir, se acorta) o alarga , un producto resultante soporta una carga diferente de la del oligonucleótido de entrada (el oligonucleótido de carga desequilibrada) permitiendo por tanto la separación de los oligonucleótidos de entrada y reaccionados en la base de la carga. El término “carga equilibrada” no implica que el oligonucleótido modificado o equilibrado tenga una carga 25 neutra neta (aunque este puede ser el caso). El equilibrio de carga se refiere al diseño y a la modificación de un oligonucleótido de tal manera que el producto de reacción específico generado a partir de este oligonucleótido de entrada se puede separar en función de la carga procedente del oligonucleótido de entrada.

Por ejemplo, en un ensayo de escisión dirigido al oligonucleótido INVADER en el que la 30 sonda de oligonucleótido soporta la secuencia: 5’ TTCTTTTCACCAGCGAGACGGG 3’ (es decir, la SEQ ID NO: 136 sin las bases modificadas) y se produce la escisión de la sonda entre el segundo y el tercer restos, una posible versión de carga equilibrada de este oligonucleótido sería: 5’Cy3-AminoT-Amino-TCTTTTCACCAGCGAGACGGG3’. Este oligonucleótido modificado soporta una carga neta negativa. Tras la escisión, se generan los siguientes oligonucleótidos: 5’ Cy3-35 AminoT-Amino-T 3’ y 5’ CTTTTCACCAGCGAGACGGG 3’ (restos 3-22 de la SEQ ID NO: 136). 5’ Cy3-AminoT-Amino-T 3’ soporta un resto detectable (el colorante Cy3 cargado positivamente) y dos aminobases modificadas. Las aminobases modificadas y el colorante Cy3 contribuyen a las cargas positivas en exceso de las cargas negativas a las que contribuyen los grupos fosfato y de esta manera, el oligonucleótido 5’ Cy3-AminoTAmino-T 3’ tiene una carga neta positiva. El otro 5 fragmento de escisión más largo, similar a la sonda de entrada, soporta una carga neta negativa. Debido a que el fragmento 5’ Cy3-AminoT-Amino-T 3’ es separable en función de la carga procedente de la sonda de entrada (el oligonucleótido de carga equilibrada), se denomina oligonucleótido de carga desequilibrada. El producto de escisión más largo no se puede separar en función de la carga procedente del oligonucleótido de entrada ya que ambos oligonucleótidos 10 soportan una carga neta negativa; de esta manera, el producto de escisión más largo no es un oligonucleótido de carga desequilibrada.

El término “carga neta neutra”, cuando se usa en referencia a un oligonucleótido, incluyendo oligonucleótidos modificados, indica que la suma de las cargas presentes (es decir, los grupos R-NH3+ en las timidinas, el nitrógeno N3 de la citosina, presencia o ausencia de grupos 15 fosfato, etc) en las condiciones de reacción o separación deseadas es esencialmente cero. Un oligonucleótido que tiene una carga neta neutra no migraría en un campo eléctrico.

El término “carga neta positiva” cuando se usa en referencia a un oligonucleótido, incluyendo oligonucleótidos modificados, indica que la suma de las cargas presentes (es decir, los grupos R-NH3+ en las timidinas, el nitrógeno N3 de la citosina, presencia o ausencia de grupos 20 fosfato, etc) en las condiciones de reacción deseadas es +1 o más. Un oligonucleótido que tiene una carga neta positiva migraría hacia el electrodo negativo en un campo eléctrico.

El término “carga neta negativa”, cuando se usa en referencia a un oligonucleótido, incluyendo oligonucleótidos modificados, indica que la suma de las cargas presentes (es decir, los grupos R-NH3+ en las timidinas, el nitrógeno N3 de la citosina, presencia o ausencia de grupos 25 fosfato, etc) en las condiciones de reacción deseadas es -1 o menor. Un oligonucleótido que tiene una carga neta negativa migraría hacia el electrodo positivo en un campo eléctrico.

El término “medios de polimerización” o “agente de polimerización” se refiere a cualquier agente capaz de facilitar la adición de nucleósidos trifosfatos a un oligonucleótido. Los medios de polimerización preferidos comprenden ADN y ARN polimerasas. 30

El término “medios de ligadura” o “agente de ligadura” se refiere a cualquier agente capaz de facilitar la ligadura (es decir, la formación de un enlace fosfodiéster entre un 3’-OH y un 5’P localizados en los extremos de dos cadenas de ácido nucleico). Los medios de ligadura preferidos comprenden ADN ligasas y ARN ligasas.

El término “reactivo” se usa en el presente documento en su sentido más amplio El 35 reactivo puede comprender, por ejemplo, un reactivo enzimático, un reactivo químico o luz (por ejemplo, luz ultravioleta, particularmente, se conoce que la luz ultravioleta de longitud de onda corta rompe las cadenas de oligonucleótidos). Cualquier agente capaz de reaccionar con un oligonucleótido tanto para acortar (es decir, escindir) como para alargar el oligonucleótido, está abarcado dentro del término “reactivo”. 5

El término “aducto” se usa en el presente documento en su sentido más amplio para indicar cualquier compuesto o elemento que se puede añadir a un oligonucleótido. Se puede cargar un aducto (positiva o negativamente) o puede ser una carga neutra. Se puede añadir al oligonucleótido mediante enlaces covalentes o no covalentes. Los ejemplos de aductos incluyen, pero no se limitan a, colorante de indodicarbocianina, amiditas , nucleótidos aminosustituidos, 10 bromuro de etidio 1,3-propanodiamino)propidio, (dietilentriamino)propidio, naranja de tiazol, naranja de (N-N’-tetrametil-1,3-propanodiamino)propil tiazol, naranja de (N-N’-tetrametil-1,2-etanodiamino)propil tiazol, homodímero de naranja de tiazol-naranja de tiazol (TOTO), heterodímero de naranja de tiazol-azul de tiazol (TOTAB), heterodímero 1 de naranja de tiazol-etidio (TOED1), heterodímero 2 de naranja de tiazol-etidio (TOED2) y heterodímero de 15 fluoresceína-etidio (FED), psoralenos, biotina, estreptavidina, avidina, etc.

Cuando un primer oligonucleótido es complementario de una región de un ácido nucleico diana y un segundo oligonucleótido tiene complementariedad con la misma región (o una porción de esta región), existe una “región de secuencia solapada” a lo largo del ácido nucleico diana. El grado de solapamiento variará dependiendo de la naturaleza de la complementariedad (véase, por 20 ejemplo, la región “X” en las Figs. 29 y 67 y en las descripciones que las acompañan.

Tal como se usa en el presente documento, el término “purificado” o “purificar” se refiere a la eliminación de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, las nucleasas CLEAVASE recombinantes se expresan en células hospedadoras bacterianas y las nucleasas están purificadas por la eliminación de proteínas de células hospedadoras; el porcentaje de estas 25 nucleasas recombinantes está por tanto aumentado en la muestra.

El término “molécula de ADN recombinante” tal como se usa en el presente documento se refiere a una molécula de ADN que comprende segmentos de ADN unidos conjuntamente por medio de técnicas biológicas moleculares.

El término “proteína recombinante” o “polipéptido recombinante” tal como se usa en el 30 presente documento se refiere a una molécula de proteína que se expresa a partir de una molécula de ADN recombinante.

Tal como se usa en el presente documento, el término “porción” cuando se hace referencia a una proteína (como en “una porción de una proteína dada”) se refiere a fragmentos de esta proteína. Los fragmentos pueden variar de tamaño desde cuatro restos de aminoácidos a la 35 secuencia completa de aminoácidos menos un aminoácido (por ejemplo, 4, 5, 6,…, n-1).

El término “secuencia de ácido nucleico” tal como se usa en el presente documento se refiere a un oligonucleótido, nucleótido o polinucleótido, y a sus fragmentos o porciones, y a ADN o a ARN de origen genómico o sintético que puede ser mono o bicatenario, y representa la cadena de sentido directo o de sentido contrario. De manera similar, “secuencia de aminoácidos”, tal como 5 se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de péptido o proteína.

El término “ácido nucleico peptídico” (“PNA”) tal como se usa en el presente documento se refiere a una molécula que comprende bases o análogos de bases que se encontrarían en un ácido nucleico natural, pero unidas a una estructura peptídica más bien que a una estructura de azúcar-fosfato típica de los ácidos nucleicos. La unión de las bases al péptido es tal que permite a 10 las bases el emparejamiento de bases con las bases complementarias del ácido nucleico de una manera similar a la de un oligonucleótido. Estas pequeñas moléculas, designadas también agentes antigénicos, detienen el alargamiento del transcrito uniéndose a su cadena complementaria del ácido nucleico (Nielsen, y col. Anticancer Drug Des. 8:53 63 [1993]).

Tal como se usa en el presente documento, los términos “purificado” o “sustancialmente 15 purificado” se refieren a moléculas, tanto secuencias nucleicas como de aminoácidos, que se eliminan de su entorno natural, se aíslan o se separan, y están al menos un 60% libres, preferiblemente un 75% libres, y lo más preferible un 90% libres de otros componentes con los que se asocian naturalmente. Un “polinucleótido aislado” u “oligonucleótido aislado” es por tanto un polinucleótido sustancialmente modificado. 20

Tal como se usa en el presente documento, el término “proteína de fusión” se refiere a una proteína quimérica que contiene la proteína de interés (por ejemplo, la nucleasa CLEAVASE BN/trombina y sus porciones o fragmentos) unida a un fragmento de proteína exógena (el compañero de fusión que consiste en una proteína nucleasa no CLEAVASE BN/trombina). El compañero de fusión puede aumentar la solubilidad de la proteína quimérica recombinante (por 25 ejemplo, la nucleasa CLEAVASE BN/trombina) tal como se expresa en una célula huésped, puede proporcionar una etiqueta de afinidad (por ejemplo, una etiqueta his) para permitir la purificación de la proteína de fusión recombinante procedente de la célula huésped o del sobrenadante del cultivo, o de ambos. Si se desea, se puede eliminar la proteína de fusión de la proteína de interés (por ejemplo, la nucleasa CLEAVASE BN/trombina o sus fragmentos) por una variedad de medios 30 enzimáticos o químicos conocidos en la técnica.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “proteína quimérica” y “proteína quimerizada” se refieren a una única molécula de proteína que comprende porciones de secuencias de aminoácidos derivadas de dos o más proteínas parentales. Estas moléculas parentales pueden ser de proteínas similares de orígenes genéticamente distintos, proteínas 35 diferentes de un único organismo, o proteínas diferentes de diferentes organismos. Por medio de ejemplo, pero no como de limitación, una nucleasa específica de estructura quimérica de la presente invención puede contener una mezcla de secuencias de aminoácidos que se han derivado de genes FEN-1 de dos o más de los organismos que tienen dichos genes, combinados para formar una nucleasa que no se produce naturalmente. No se pretende que el término 5 “quimérico” tal como se usa en el presente documento exprese ninguna proporción particular de contribución procedente de los genes que se producen naturalmente, ni que limite la manera en la que se combinan las porciones Cualquier construcción de nucleasa específica de estructura quimérica que tenga actividad de escisión tal como se determina mediante los procedimientos de ensayo descritos en el presente documento está formada por agentes de escisión comprendidos 10 dentro del alcance de la presente invención.

La expresión “cadena continua de ácido nucleico” tal como se usa en el presente documento significa una cadena de ácido nucleico que tiene una estructura de esqueleto continuo, covalentemente unido, sin hendiduras u otras perturbaciones La disposición de la porción de bases de cada nucleótido, tanto si son bases emparejadas, como monocatenarias o emparejadas 15 incorrectamente, no es un elemento en la definición de una cadena continua. El esqueleto de la cadena continua no está limitado a las composiciones de ribosa-fosfato o desoxirribosa-fosfato que se encuentran en los ácidos nucleicos no modificados que se producen naturalmente. Un ácido nucleico de la presente invención puede comprender modificaciones en la estructura del esqueleto, que incluyen pero que no se limitan a restos de fosforotioato, restos de fosfonato, 20 restos de ribosa 2’ sustituidos (por ejemplo, 2’-O-metil ribosa) y restos que contienen un azúcar alternativo (por ejemplo, arabinosa).

El término “dúplex continuo” tal como se usa en el presente documento se refiere a una región de ácido nucleico bicatenario en la que no existe perturbación en la progresión de los pares de bases dentro del dúplex (es decir, los pares de bases a lo largo del dúplex no están 25 distorsionados para acomodar un hueco, protuberancia o emparejamiento incorrecto con los cofines de la región del dúplex continuo) Tal como se usa en el presente documento, el término se refiere únicamente a la disposición de los pares de bases dentro del dúplex, sin implicación de continuidad en la porción del esqueleto de la cadena de ácido nucleico. Los dúplex de ácidos nucleico con emparejamiento de bases interrumpido, pero con hendiduras en una o en ambas 30 cadenas están comprendidos dentro de la definición de un dúplex continuo.

El término “dúplex” se refiere al estado de los ácidos nucleicos en el que las porciones de bases de los nucleótidos en una cadena se unen a través del hidrógeno de sus bases complementarias dispuestas en una segunda cadena. La condición de estar en forma de un dúplex refleja el estado de las bases de un ácido nucleico En virtud del emparejamiento de bases, 35 las cadenas de ácido nucleico asumen la estructura terciaria de una doble hélice, que tiene una hendidura mayor y una menor. La asunción de la forma helicoidal está implícita en el acto de convertirse en dúplex.

La expresión “proteína de unión dependiente de dúplex” se refiere a la unión de las proteínas con un ácido nucleico que es dependiente del ácido nucleico que está en un dúplex, o 5 en forma helicoidal.

La expresión “proteína de unión a sitios o regiones dependiente de dúplex” tal como se usa en el presente documento, se refiere a regiones o secuencias discretas dentro de un ácido nucleico que se unen con afinidad particular mediante proteínas de unión de ácido nucleico dependientes de dúplex específicos. Esto está por el contrario con la unión de proteínas 10 generalizada dependiente de dúplex que no son específicas de sitio, tales como las proteínas histonas que se unen a la cromatina con poca referencia a secuencias o a sitios específicos.

La expresión “región de unión a proteína” tal como se usa en el presente documento, se refiere a una región de ácido nucleico identificada por una secuencia o una estructura tal como la unión a una proteína o tipo de proteínas particulares. Esta comprendido dentro del alcance de esta 15 definición incluir aquellas regiones que contienen suficiente información genética para permitir identificaciones de la región mediante comparación con secuencias conocidas, pero que pueden no tener el requisito de estructura para la unión real (por ejemplo, una cadena individual de un sitio de una proteína de unión a ácido nucleico dependiente de dúplex). Tal como se usa en el presente documento “región de unión a proteína” excluye las regiones de unión a la endonucleasa de 20 restricción.

La expresión “región de unión de proteína bicatenaria completa” tal como se usa en el presente documento se refiere a la mínima región de un dúplex continuo para permitir la unión u otra actividad de una proteína dependiente de dúplex. Se pretende que esta definición abarque la observación de que algunas proteínas de unión a ácido nucleico dependiente de dúplex pueden 25 interactuar con actividad completa con regiones del dúplex que pueden ser más cortas que una región de unión a la proteína natural tal como se observa en una o en otra de las dos cadenas individuales. En otras palabras, se puede permitir que uno o más nucleótidos en la región permanezcan desemparejados sin suprimir la unión. Tal como se usa aquí, el término “región de unión bicatenaria completa” se refiere a la mínima secuencia que acomodará la función de unión. 30 Debido a que algunas de dichas regiones pueden tolerar secuencias no dúplex en múltiples lugares, aunque no necesariamente de manera simultánea, una región de unión a proteína individual puede tener algunas subregiones más cortas que, cuando se forman dúplex, serán completamente competentes para la unión de la proteína.

El término “plantilla” se refiere a una cadena de ácido nucleico a partir de la que se 35 construye una copia complementaria a partir de nucleósidos trifosfatos mediante la actividad de una polimerasa del ácido nucleico dependiente del molde. Dentro de un dúplex, la cadena de la plantilla se representa gráficamente y se describe, por convención, como la cadena “inferior”. De manera similar, la cadena no plantilla se representa y se describe a menudo gráficamente como la cadena superior. 5

La expresión “ARN polimerasa dependiente del molde” se refiere a una polimerasa de ácido nucleico que crea nuevas cadenas de ARN a través de la copia de una cadena plantilla tal como se ha descrito anteriormente y que no sintetiza ARN en ausencia de una plantilla. Esto se diferencia de la actividad de las polimerasas de ácido nucleico independientes del molde que sintetizan o extienden los ácidos nucleicos sin referencia a una plantilla, tal como una 10 desoxinucleotidil transferasa terminal, o una polimerasa poli A.

El término “molécula ARRESTOR” se refiere a un agente añadido a o incluido en una reacción de escisión invasiva con el fin de detener uno o más componentes de la reacción a partir de los que participan en una acción o reacción posterior. Se puede llevar a cabo esto secuestrando o inactivando algún componente de la reacción (por ejemplo, mediante la unión o el 15 emparejamiento de bases de un componente del ácido nucleico, o mediante la unión a un componente de la proteína). El término “oligonucleótido ARRESTOR” se refiere a un oligonucleótido incluido en una reacción de escisión invasiva con el fin de detener o suprimir uno o más aspectos de cualquier reacción (por ejemplo, la primera reacción y/o cualquier reacción o acción posterior; no se pretende que el oligonucleótido ARRESTOR esté limitado por cualquier 20 reacción o etapa de reacción particular). Se puede llevar a cabo esto secuestrando algún componente de la reacción (por ejemplo, el emparejamiento de bases con otro ácido nucleico o la unión con un componente de la proteína). Sin embargo, no se pretende que el término esté tan limitado únicamente a las situaciones en las que se secuestra un componente de la reacción.

Tal como se usa en el presente documento, el término “kit” se refiere a cualquier sistema 25 de administración para administrar materiales. En el contexto de los ensayos de reacción, dichos sistemas de administración incluyen sistemas que permiten el almacenamiento, transporte, o la administración de reactivos de reacción (por ejemplo, oligonucleótidos, enzimas, etc, en los contenedores apropiados) y/o materiales de soporte (por ejemplo, tampones, instrucciones escritas para llevar a cabo el ensayo, etc) de una localización a otra. Por ejemplo, los kits incluyen 30 uno o más cerramientos (por ejemplo, cajas) que contienen los reactivos de reacción relevantes y/o los materiales de soporte. Tal como se usa en el presente documento, el término “kit fragmentado” se refiere a sistemas de administración que comprenden dos o más contenedores separados en los que cada uno contiene una subporción de los componentes totales del kit. Se pueden administrar los contenedores a receptor previsto juntos o por separado. Por ejemplo, un 35 primer contenedor puede contener una enzima para uso en un ensayo, mientras que un segundo contenedor contiene los oligonucleótidos. El término “kit fragmentado” se pretende que abarque los kits que contienen los reactivos específicos del analito (ASR) regulados en la sección 520(e) de la Federal, Food, Drug, and Cosmetic Act, pero no están limitados a la anterior. A su vez, cualquier sistema de administración que comprende dos o más contenedores separados en los 5 que cada uno contiene una subporción de los componentes totales del kit se incluyen en el término “kit fragmentado. A diferencia de lo anterior, un “kit combinado” se refiere a un sistema de administración que contiene todos los componentes de un ensayo de reacción en un contenedor individual (por ejemplo, en una caja individual que aloja cada uno de los componentes deseados). El término “kit” incluye los kits fragmentados y combinados. 10

Tal como se usa en el presente documento, el término “dominio funcional” se refiere a una región, de una proteína (por ejemplo, una enzima) que proporciona una o más características funcionales de la proteína. Por ejemplo, un dominio funcional de una enzima puede proporcionar, directa o indirectamente, una o más actividades de la enzima que incluyen, pero no se limitan a, capacidad de unión a sustrato y actividad catalítica, en la que la mutación del(de los) 15 aminoácido(s) altera la funcionalidad asociada (tal como se mide empíricamente en un ensayo) indicando por tanto la presencia de un dominio funcional.

Tal como se usa en el presente documento, el término “dominio funcional heterólogo” se refiere a un dominio funcional de la proteína que no está en su entorno natural. Por ejemplo, un dominio funcional heterólogo incluye un dominio funcional procedente de una enzima introducido 20 en otra enzima. Un dominio funcional heterólogo incluye también un dominio funcional natural de una proteína que se ha alterado de alguna forma (por ejemplo, mutado, añadido en múltiples copias, etc). Un dominio funcional heterólogo puede comprender una pluralidad de aminoácidos contiguos o puede incluir dos o más aminoácidos distales que son fragmentos de aminoácidos (por ejemplo, dos o más aminoácidos o fragmentos con secuencia no heteróloga interviniente). 25 Los dominios funcionales heterólogos se distinguen de los dominios funcionales endógenos en que el(los) aminoácido(s) heterólogo(s) se une(n) a o contiene(n) secuencias de aminoácidos que no se encuentran asociadas naturalmente con la secuencia de aminoácidos en la naturaleza o están asociadas con una porción de proteína que no se encuentra en la naturaleza.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “funcionalidad alterada en un 30 ensayo de escisión del ácido nucleico” se refiere a una característica de una enzima que se ha alterado de alguna manera para diferir de su estado natural (por ejemplo, para diferir de como se encuentra en la naturaleza). Las alteraciones incluyen, pero no se limitan a, la adición de un dominio funcional heterólogo (por ejemplo, mediante mutación o mediante la creación de proteínas quiméricas). En algunas formas de realización, la característica alterada de la enzima puede ser 35 una que mejore el rendimiento de una enzima en un ensayo de escisión del ácido nucleico. Los tipos de mejoras incluyen, pero no se limitan a, actividad mejorada de la nucleasa (por ejemplo, velocidad de reacción mejorada), unión a sustrato mejorada (por ejemplo unión aumentada o disminuida de algunas especies de ácidos nucleicos [por ejemplo, ARN o ADN] lo que produce un resultado deseado [por ejemplo, mayor especificidad, renovación del sustrato mejorada, etc]), y 5 especificidad de fondo mejorada (por ejemplo, se produce menos producto indeseado). La presente invención no está limitada por el ensayo de escisión del ácido nucleico usado para probar la funcionalidad mejorada. Sin embargo, en algunas formas de realización preferidas de la presente invención, se usa un ensayo de escisión invasivo como el ensayo de escisión del ácido nucleico. En algunas formas de realización particularmente preferidas, se usa un ensayo de 10 escisión invasivo que utiliza un ARN diana como el ensayo de escisión del ácido nucleico.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “N-terminal” y “C-terminal” en referencia a las secuencias del polipéptido, se refieren a regiones de polipéptidos que incluyen porciones de las regiones N-terminales y C-terminales del polipéptido, respectivamente. Una secuencia que incluye una porción de la región N-terminal del polipéptido incluye aminoácidos 15 predominantemente de la mitad N-terminal de la cadena del polipéptido, pero no está limitada a dichas secuencias. Por ejemplo, una secuencia N-terminal puede incluir una porción interior de la secuencia del polipéptido que incluye las bases de las mitades N-terminal y C-terminal del polipéptido. Lo mismo aplica a las regiones C-terminales. Las regiones N-terminal y C-terminal pueden, pero no necesariamente, incluir el aminoácido que define los extremos N-terminal y C-20 terminal en último extremo del polipéptido, respectivamente.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra una representación esquemática de reacciones de escisión invasivas secuenciales. En la etapa A, un oligonucleótido INVADER en la dirección 5’ y una sonda en la 25 dirección 3’ se combinan con una cadena de ácido nucleico diana para formar una estructura de escisión. En la etapa B, la porción de la sonda señal escindida de A se combina con una segunda cadena del ácido nucleico diana y una sonda señal marcada para formar una segunda estructura de escisión. En la etapa C, la escisión de la segunda estructura de escisión marcada da como resultado una señal detectable. 30

La Figura 2 muestra representaciones esquemáticas de algunos ejemplos de estructuras de escisión invasivas que comprenden cadenas de ARN diana (SEQ ID NO: 114). El panel A representa gráficamente un oligonucleótido INVADER (SEQ ID NO: 142) y la sonda (SEQ ID NO: 143). El panel B representa gráficamente un oligonucleótido INVADER (SEQ ID NO: 144) y la sonda (SEQ ID NO: 143) el panel C representa gráficamente un oligonucleótido INVADER (SEQ 35 ID NO: 145) y la sonda (SEQ ID NO: 145). El panel D representa gráficamente un oligonucleótido INVADER (SEQ ID NO: 145) y la sonda (SEQ ID NO: 146)

La Figura 3 muestra representaciones esquemáticas de dos ejemplos de estructuras que no son estructuras de escisión invasivas marcadas, SEQ ID Nos: 147-152.

La Figura 4 muestra una representación esquemática de una configuración de escisión 5 invasiva que es útil para la detección de variaciones en la secuencia diana. En A, se forma una estructura de escisión invasiva que tiene solapamiento entre las dos sondas, y la flecha indica que es escindible por las enzimas de la presente invención. En B, la variación de la secuencia diana elimina una región de complementariedad con la sonda en la dirección 3’ y elimina el solapamiento. La ausencia de una flecha en el panel B indica una velocidad reducida de escisión 10 de esta estructura en comparación con la representada esquemáticamente en el panel A.

La Figura 5 muestra un diagrama de la estructura mediante rayos X de un complejo ternario de Kentaq1 con cebador/plantilla de ADN, en el modo de polimerización determinado por Li et al. (Li y col., Protein Sci., 7: 1116 [1998]). Sin pretender representar límites precisos entre las características de la forma física, las porciones denominadas en el texto como las regiones de los 15 “dedos”, “pulgar” y “palma” están aproximadamente indicadas por el círculo, rectángulo, y óvalo, respectivamente.

La Figura 6 muestra un diagrama esquemático del gen de la ADN polimerasa de Thermus aquaticus. Se han indicado anteriormente los sitios de restricción usados en estos estudios. A continuación se indican las regiones aproximadas que codifican diversos dominios estructurales o 20 funcionales de la proteína mediante flechas de doble cabeza.

La Figura 7 muestra un diagrama esquemático de las construcciones quiméricas que comprenden porciones del gen TaqPol y del gen TthPol. Las cajas abiertas y sombreadas denotan las secuencias de TaqPol y TthPol, respectivamente. Los números corresponden a la secuencia de aminoácidos de TaqPol. Los dominios de la nucleasa 5’ y de la polimerasa de TaqPol y las 25 regiones de la palma, el pulgar, y los dedos se indican. Las abreviaturas de los sitios de restricción utilizados en la recombinación son como sigue: E, EcoRI; N, Notl; Bs, BstBI; D, NDeI; B, BamHI; y S, Sall.

La Figura 8A-H muestra una comparación de la estructura de nucleótidos de los genes de la polimerasa aislados de Thermus aquaticus (SEQ ID NO: 153), Thermus flavus (SEQ ID NO: 30 154) y Thermus thermophilus (SEQ ID NO: 155); la secuencia consenso (SEQ ID NO: 156) se muestra en la parte superior de cada hilera.

La Figura 9A-C muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de la polimerasa aislada de Thermus aquaticus (SEQ ID NO: 157), Thermus flavus (SEQ ID NO: 158), y Thermus thermophilus (SEQ ID NO: 1); la secuencia consenso (SEQ ID NO: 159) se muestra en 35 la parte superior de cada hilera.

La Figura 10 muestra las secuencias y las estructuras propuestas de sustratos para la reacción invasiva de amplificación de la señal con la cadena de ARN diana de IL-6 humana (SEQ ID NO: 160) y la sonda en la dirección 5’ (SEQ ID NO: 161). El sitio de escisión de la sonda en la dirección 3’ (SEQ ID NO: 162) se indica por una flecha. Se muestra a continuación la secuencia 5 de la cadena de ADN diana de IL-6 (SEQ ID NO: 163).

La Figura 11 muestra la imagen generada por un formador de imágenes con fluorescencia que muestra los productos de los ensayos de escisión invasivos usando las enzimas indicadas, y el sustrato IL-6 de la Figura 10 que tiene tanto una cadena de ADN diana (A) como una cadena de ARN diana (B). 10

La Figura 12 compara las actividades de escisión de la ciclación de las enzimas quiméricas Taq DN RX HT, Tth DN RX HT, y Taq-Tth con el sustrato de IL-6 que tiene una cadena de ARN diana.

La Figura 13 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de los fragmentos BstI-BamHI de TaqPol (SEQ ID NO: 164) y TthPol (SEQ ID NO: 165). Las parejas de 15 aminoácidos similares están sombreadas con un gris claro. Los aminoácidos alineados que tienen una diferencia de carga están sombreados con un gris oscuro. Los números corresponden a la secuencia de aminoácidos de TaqPol. Los aminoácidos de TaqPol cambiados por los correspondientes aminoácidos de TthPol mediante mutagénesis sitiodirigida se indican por (+).

La Figura 14 compara las actividades de escisión de la ciclación de Taq DN RX HT, las 20 enzimas quiméricas Taq-Tth, y las enzimas quiméricas que tienen las modificaciones de aminoácidos adicionales indicadas, teniendo el sustrato de IL-6 una cadena de ARN diana.

La Figura 15 compara las actividades de escisión de la ciclación de Taq DN RX HT, Tth DN RX HT, y Taq DN RX HT que tienen las modificaciones de aminoácidos indicadas, teniendo el sustrato de IL-6 una cadena de ARN diana. 25

La Figura 16 compara las actividades de polimerización de las enzimas quiméricas TaqPol, TthPol, y Taq-Tth, teniendo TaqPol las modificaciones de aminoácidos indicadas.

La Figura 17 muestra un diagrama de la estructura mediante rayos X de un complejo ternario de Klentaq 1 con cebador/plantilla de ADN en el modo de polimerización determinado por Li et al. (Li y col., Protein Sci., 7: 1116 [1998]). Se indican los aminoácidos G418 y E507. 30

Las Figuras 18 A-D muestran diagramas esquemáticos de ejemplos de sustratos que se pueden usar para medir diversas actividades de escisión de enzimas. Los sustratos se pueden marcar, por ejemplo, con un colorante fluorescente y un resto inactivador para la detección FRET, tal como se muestra, para facilitar la detección y la medida. Los sustratos de 18A y 18B son estructuras de escisión invasivas que tienen cadenas de ARN y ADN dianas, respectivamente. 35 18C muestra un ejemplo de una estructura-X y 18D muestra un ejemplo de una estructura en horquilla, ambas cuales se pueden usar para evaluar la actividad de las enzimas en estructuras alternativas que pueden estar presentes en reacciones de escisión invasivas.

La Figura 19 muestra diagramas esquemáticos de construcciones quiméricas que comprenden porciones del gen TaqPol y del gen TthPol. Las secuencias abiertas y sombreadas 5 denotan secuencias de TaqPol y TthPol, respectivamente. Las quimeras incluyen también las modificaciones DN, RX, y HT. Una tabla compara la actividad de escisión de cada proteína en los sustratos de escisión indicados.

La Figura 20A muestra un diagrama esquemático de un ARN que contiene un sustrato de escisión invasivo. Tal como se describe, el extremo 5’ de la molécula diana (SEQ ID NO: 166) está 10 modificado con biotina y bloqueado con estreptavidina. Se muestra también la sonda en la dirección 3’ (SEQ ID NO: 167) con el sitio de escisión. Los paneles B-D muestran el análisis de las propiedades del mutante Taq DN RX HT G418K/E507Q en la escisión del sustrato que se muestra en condiciones de temperatura de reacción, concentración de KCl, y concentración de MgSO4 variables. 15

La Figura 21 muestra diagramas esquemáticos de los sustratos modelos usados para ensayar enzimas para la actividad de escisión invasiva. La molécula que se muestra en 21A proporciona una cadena de ADN diana (SEQ ID NO: 168), mientras que el modelo que 21B proporciona un ARN que contiene una cadena diana (SEQ ID NO: 167). 21A y B muestran la sonda de la SEQ ID NO: 166 en la dirección 3’. 20

La Figura 22 muestra diagramas esquemáticos de los sustratos modelos usados para ensayar enzimas para la actividad de escisión en estructuras no invasivas alternativas.

La Figura 23 muestra un diagrama esquemático de un sustrato modelo usado para ensayar enzimas para la actividad de escisión invasiva.

La Figura 24 muestra diagramas esquemáticos de un sustrato modelo usado para ensayar 25 enzimas para la actividad de escisión invasiva en cadenas de ARN o ADN dianas.

La Figura 25 compara las actividades de escisión de la ciclación de las enzimas mutantes derivadas de Tth DN RX HT, Taq 2M, TfiPol, Tsc Pol, and Tfi y Tsc.

Descripción general de la invención 30

La tecnología INVADER (Véanse por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos 5.846.717, 5.985.557, 5.994.069, y 6.001.567 y las publicaciones PCT WO97/27214 y WO98/42873) proporciona un sistema de amplificación de la señal que se puede aplicar para la detección y cuantificación de secuencias específicas de ácido nucleico, que incluye mutaciones puntuales individuales y variantes similares de ARNm. Además, debido a que esta tecnología no 35 depende exclusivamente de la hibridación específica de alelo, es muy adecuada para cuantificar ARN estrechamente relacionados en la misma muestra. La presente invención se define en las reivindicaciones y se refiere a enzimas y procedimientos mejorados para crear enzimas para la detección de ácidos nucleicos basada en el ensayo INVADER, particularmente, ácidos nucleicos de ARN. La presente invención se refiere también a kits para el rendimiento de ensayos INVADER 5 que usan las enzimas mejoradas de la presente invención.

Los ensayos INVADER detectan la hibridación de sondas con una diana mediante la escisión enzimática de estructuras específicas por enzimas específicos de estructura (Véase INVADER assays, Third Wave Technologies; Véanse por ejemplo, la Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.846.717; 5.985.557; 6.090.543; 6.001.567; 5.985.557; 6.090.543; 5.994.069; 10 Lyamichev y col., Nat. Biotech., 17:292 (1999), Hall y col., PNAS, USA, 97:8272 (2000), WO97/27214 y WO98/42873). Adicionalmente a su uso para la medida cuantitativa de secuencias específicas de ácido nucleico, la elevada especificidad proporciona la capacidad de detectar cambios de bases individuales. La base de la tecnología INVADER es la escisión de las moléculas de ADN y ARN en localizaciones específicas en respuesta a la estructura en lugar de a la 15 secuencia. La escisión está catalizada normalmente por una enzima nucleasa 5’. Las enzimas nucleasas 5’ reconocen una estructura precisa que se forma cuando dos sondas de oligonucleótidos, una sonda INVADER en la dirección 5’ y una sonda señal en la dirección 3’, se hibridan en tándem con un ácido nucleico diana para generar el complejo del sustrato (Figura 1A). La elevada especificidad de la tecnología Invader surge de la combinación de la hibridación de la 20 sonda específica de secuencia con la escisión enzimática específica de estructura. El complejo del sustrato contiene una característica que es importante para el preciso reconocimiento de la enzima: un solapamiento entre los oligonucleótidos hibridados. Para formar una estructura invasiva, el extremo 3’ del oligonucleótido INVADER en la dirección 5’ debe solaparse con la región hibridada de la sonda señal en al menos una base (Lyamichev y col., Nat. Biotechnol., 17: 25 292 [1999]). Se puede crear este solapamiento mediante una duplicación de la secuencia entre la porción 3’ del oligonucleótido INVADER y la porción 5’ de la región complementaria de la diana de la sonda de oligonucleótido en la dirección 3’. La región de la secuencia duplicada de esta manera puede ser tan pequeña como una base individual. Con respecto a la longitud de la secuencia duplicada (es decir, el solapamiento) de la base en el extremo 3’ del oligonucleótido INVADER en 30 la dirección 5’, no necesita ser complementaria de la cadena diana, y puede ser cualquier nucleótido. En algunas formas de realización, este nucleótido terminal puede volverse a sustituir por un resto que tiene características químicas similares con un nucleótido tal como un nucleótido análogo o un compuesto de anillo orgánico (véase por ejemplo, Patente de los Estados Unidos Nº 5.985.557). En una forma de realización alternativa, el solapamiento no necesita implicar cualquier 35 duplicación de la secuencia entre las regiones complementarias con la diana de las dos sondas (Lyamichev y col., Nat. Biotechnol., 17: 292 [1999] y Patente de los Estados Unidos 5.985.557). En esta forma de realización, el INVADER y las sondas señal tienen regiones complementarias con las regiones adyacentes de la diana que son contiguas y que no se solapan. Cuando no se comparte la secuencia, el extremo 3’ del oligonucleótido INVADER en la dirección 5’ incluye al 5 menos un nucleótido adicional o análogo de tipo nucleótido que no es complementario de la cadena diana (Lyamichev y col., Nat. Biotechnol., 17: 292 [1999]). Se puede denominar esto como un solapamiento físico, por el contrario con un solapamiento de la secuencia. Un solapamiento de cualquier tipo satisfará el requerimiento del solapamiento, esto es el hito de la escisión invasiva del ensayo INVADER. En la Figura 2, se muestran esquemáticamente algunas de estas formas de 10 realización. Por el contrario con las configuraciones de solapamiento descritas anteriormente, si la sondas tienen regiones complementarias con las regiones adyacentes de la diana que son contiguas y que no se solapan, y el extremo 3’ del oligonucleótido en la dirección 5’ no tiene ninguna base o resto adicional, no se forma la estructura invasiva (Figura 3A). Incluso la presencia de una o más bases adicionales en el extremo 5’ del oligonucleótido en la dirección 3’ que no son 15 complementarias con la cadena diana no creará el requisito del solapamiento. Esta última estructura (Figura 3B), tal como se describe en el documento U.S. 5.874.283 no es una “escisión invasiva”, aunque dichas estructuras encuentran uso en algunas formas de realización de la presente invención.

Algunas nucleasa 5’ pueden no requerir un oligonucleótido en la dirección 5’ para ser 20 activas en la reacción de escisión. Aunque la escisión puede ser más lenta sin el oligonucleótido en la dirección 5’, puede seguirse produciendo (Lyamichev y col., Science 260: 778 [1993], Kaiser y col., J. Biol. Chem., 274: 21387 [1999]). Cuando una cadena de ADN es la cadena plantilla o diana sobre la cual se hibridan las sondas de oligonucleótidos, las nucleasas 5’ derivadas de ADN polimerasas y algunas endonucleasas flap (FEN), tales como las de Methanococcus jannaschii, 25 pueden escindirse bien rápidamente sin que un oligonucleótido en la dirección 5’ proporcione un solapamiento (Lyamichev y col., Science 260: 778 [1993], Kaiser y col., J. Biol. Chem., 274: 21387 [1999], y patente de los Estados Unidos Nº. 5.843.669, incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad). Otras FEN, tales como las procedentes de Archeaoglobus fulgidus (Afu) y Pyrococcus furiosus (Pfu), escinden una estructura solapada en un ADN diana con mucha 30 más velocidad de la que lo hacen en una estructura no solapante (es decir, tanto con un oligonucleótido desaparecido en la dirección 5’ en el caso de tener un oligonucleótido no solapante en la dirección 5’) que se pueden ver como que tienen un requerimiento esencialmente absoluto para el solapamiento (Lyamichev y col., Nat. Biotechnol., 17: 292 [1999], Kaiser y col., J. Biol. Chem., 274: 21387 [1999]). Cuando se hibrida un ARN diana con sondas de oligonucleótidos de 35 ADN para formar una estructura de escisión, muchas FEN escinden de manera deficiente la sonda de ADN en la dirección 3’, con respecto a la presencia de un solapamiento. Unas de dichas estructuras que contienen ARN, las nucleasas 5’ derivadas de las ADN polimerasas, tienen una fuerte necesidad de solapamiento, y son esencialmente inactivas en su ausencia.

Llevar a cabo el ensayo INVADER en condiciones que tengan una necesidad obligada de 5 solapamiento (por ejemplo, usando la FEN Afu para la detección del ADN diana o la nucleasa 5’ de la ADN polimerasa Tth para la detección del ARN diana) proporciona unos medios superiores para detectar nucleótidos individuales u otras variaciones de la secuencia. En una forma de realización, la sonda señal se selecciona de tal manera que la base diana sospechosa de variar se sitúa en el extremo 5’ de la región complementaria de la diana de esta sonda. El oligonucleótido 10 INVADER en la dirección 5’ se sitúa para proporcionar una base individual de solapamiento. Si la diana y la sonda señal son complementarias en la base en cuestión, se forma el solapamiento y se puede producir la escisión. Esta forma de realización se representa gráficamente en la Figura 4A. Sin embargo, si la diana no complementa la sonda en esta posición, la base en la sonda llega a ser parte de un brazo 5’ no complementario, no existen solapamientos entre las sondas, y se 15 suprime la expresión. Esta forma de realización se representa gráficamente en la Figura 4B. En cualquiera de las formas de realización anteriormente mencionadas, la sonda en la dirección 3’ puede incluir opcionalmente una región que no es complementaria de la diana. En una forma de realización preferida, esta región no complementaria de la diana está en el extremo 5’ de la sonda y produce una solapa 5’ no emparejada cuando la sonda señal se hibrida con la diana. Tras la 20 escisión mediante una enzima CLEAVASE, se puede incorporar una solapa 5’ liberada en una reacción INVADER posterior para la amplificación adicional de la señal (Véanse por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 5.994.069 y la Publicación PCT WO 98/42873, incorporadas en el presente documento por referencia en su totalidad). Un medio que se puede usar es un oligonucleótido INVADER, que se puede combinar con una diana secundaria y una sonda 25 secundaria previstas. Tras la hibridación de la solapa 5’ liberada por la enzima CLEAVASE en la primera reacción de escisión invasiva, se completa un complejo de estructura secundaria invasiva, de tal manera que se puede reconocer por la enzima CLEAVASE y se puede escindir la sonda de oligonucleótido secundaria (Kwiatkowski y col., Molec. Diagn., 4: 353 [1999]), Figura 1.

Los ensayos INVADER usan a menudo enzimas CLEAVASE termoestables, que permiten 30 reacciones que van a transcurrir próximas a la temperatura de fusión (Tm) de la sonda de oligonucleótido en la dirección 3’, de esta manera, las sondas escindidas y no escindidas ciclan y desciclan la diana durante el curso de la reacción. En una forma de realización preferida, un oligonucleótido INVADER más largo puede no ciclar fácilmente. Cada vez que una sonda de longitud completa se une con la diana en presencia del oligonucleótido INVADER, se puede 35 escindir éste, dando como resultado la acumulación de producto de escisión que es muy específico para la secuencia que se está detectando, y que es generalmente proporcional con respecto al tiempo y a la concentración de la diana. La diana es generalmente el componente limitante en una escisión invasiva, debido a que los oligonucleótidos INVADER y de la sonda señal se suministran generalmente en un exceso molar. En una segunda escisión invasiva enlazada, es 5 el componente creado en la primera reacción de escisión (por ejemplo, una solapa 5’ liberada) el que el limitante. Cuando se llevan a cabo secuencialmente dos de las mencionadas reacciones de escisión, la señal procedente de la reacción del material compuesto se acumula linealmente con respecto a la cantidad de ácido nucleico diana mientras que la secuencia de la reacción da como resultado un tremendo aumento en la amplificación de la señal (Kwiatkowski y col., Molec. Diagn., 10 4: 353 [1999]).

Algunos de los dominios de las 5’ nucleasas de las ADN polimerasas Pol A eubacterianas y de las proteínas de reparación del ADN estructuralmente homólogas, denominados endonucleasas flap (FEN) pueden funcionar para escindir la estructura secundaria formada entre los oligonucleótidos INVADER y de la sonda señal (Kaiser y col., J. Biol. Chem., 274: 21387 15 [1999], Xu y col., J. Biol. Chem., publicado en línea como 10.1074/jbc.M909135199 en wwwd.jbc.org/pips/pips.2.shtml, 9 de mayo de 2000). Ambos tipos de enzimas contienen un posible motivo de ADN en hélice-horquilla-hélice (HhH), importante para el reconocimiento del ADN, basado en la estructura, independiente de la secuencia (Doherty y col., Nucl. Acid. Res., 24: 2488 [1996]). Este tipo de motivo de unión del ADN es adecuado para ensayos llevados a cabo 20 sobre dianas de ADN, pero puede ser problemático para ensayos con dianas de ARN, dando como resultado una sensibilidad más baja del ensayo. Nuevas enzimas que tengan reconocimiento mejorado de la estructura de escisión invasiva formada en una cadena de ARN diana podrían mejorar mucho el comportamiento del ensayo INVADER en la detección y cuantificación de las dianas de ARN. 25

Se han descrito numerosas mejoras de enzimas relacionadas con las nucleasas 5’ y las ADN polimerasas. Por ejemplo, se han descrito por completo ADN polimerasas que tienen una actividad nucleasa 5’ alterada, o que carecen de actividad nucleasa 5’ (Patentes de los Estados Unidos 5.466.591 y 5.795.762). Estas patentes se refieren a ADN polimerasas termoestables que presentan un nivel diferente de actividad exonucleasa 5’ a 3’ que la de sus respectivas 30 polimerasas naturales. En algunas formas de realización, los dominios de aminoácidos particulares conservados en las ADN polimerasas termoestables están mutados o eliminados para alterar la actividad exonucleasa 5’ a 3’ de las polimerasas.

Se han descrito ADN polimerasas que están alteradas con respecto a las polimerasas naturales de tal manera que presentan actividad sintética del ADN alterada (Kaiser y col., J. Biol. 35 Chem., 274: 21387 [1999], Lyamichev y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 96: 6143 [1999], Patentes de los Estados Unidos 5.541.311, 5.614.402, 5.795.763 y Solicitud de Patente de los Estados Unidos con Nº de Serie. 08/758.314). En formas de realización relacionadas, estas ADN polimerasas están alteradas de tal manera que presentan actividad sintética reducida en comparación con la de la ADN polimerasa natural. A este respecto, se han creado enzimas que son 5 predominantemente nucleasas 5’ y que son capaces de escindir ácidos nucleico de una manera específica de estructura en ausencia de actividad sintética interferente. Las alteraciones realizadas es estas polimerasas no se seleccionaron con respecto a su efecto de la escisión de estructuras que comprenden ARN.

Las ADN polimerasas que tienen la capacidad de usar ARN como una cadena plantilla, 10 conocidas como transcriptasas inversas, se asocian usualmente con una actividad RNasa que escinde específicamente las bases de ARN emparejadas en un heterodúplex con una cadena de ADN. Dicha actividad RNasa se denomina generalmente RNasa H. Se han descrito transcriptasas inversas alteradas que tienen esta actividad RNasa H eliminada (Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 5.244.797). Esta patente se refiere a un gen que codifica una transcriptasa 15 inversa que tiene actividad ADN polimerasa y poca o ninguna actividad RNasa H. La invención se refiere también a un procedimiento para producir ADNc a partir de ARNm usando la transcriptasa inversa. Esta patente no describe las enzimas que tienen capacidad mejorada para escindir un miembro del ADN de una estructura que comprende cadenas de ADN y ARN, ni se refiere a enzimas que tienen rendimiento mejorado en los ensayos de detección basados en la escisión de 20 un miembro del ADN de una estructura que comprende una cadena de ARN diana.

Se han descrito enzimas RNasa H termoestables (por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos 5.268.289, 5.459.055 y 5.500.370). Estas enzimas termoestables escinden el miembro de ARN de un heterodúplex que comprende cadenas de ADN y ARN. Estas patentes no describen las enzimas que tienen capacidad mejorada de escindir un miembro del ADN de una 25 estructura que comprende cadenas de ADN y de ARN, ni se refieren a enzimas que tienen rendimiento mejorado en los ensayos de detección basados en la escisión de un miembro de ADN de una estructura invasiva que comprende una cadena de ARN diana.

Sigue existiendo una necesidad de enzimas que tengan una capacidad mejorada de escindir miembros de ADN de estructuras que comprenden cadenas de ADN y ARN. En particular, 30 permanece una necesidad de enzimas termoestables que tengan rendimiento mejorado en los ensayos de detección basados en la escisión de miembros de ADN de complejos invasivos que comprenden una cadena de ARN diana.

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Descripción detallada de la invención

La reacción de escisión invasiva INVADER ha demostrado ser útil en la detección de cadenas de ARN diana (Véase por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 6.001.567). Como con el ensayo INVADER para la detección del ADN (Lyamichev y col., Nat. Biotechnol., 17: 292 [1999]), las reacciones pueden transcurrir en condiciones que permitan la escisión de muchas 5 copias de una sonda para cada copia del ARN diana presente en la reacción. En una forma de realización relacionada, se puede llevar a cabo la reacción a una temperatura cercana a la temperatura de fusión Tm de la sonda que se escinde, de tal manera que las sondas escindida y no escindida ciclan y desciclan fácilmente la cadena diana sin ciclación de la temperatura. Cada vez que una sonda de longitud completa se une a la diana en presencia del oligonucleótido 10 INVADER, puede escindirse mediante una enzima nucleasa 5’, dando como resultado una acumulación del producto de escisión. La acumulación es muy específica de la secuencia que se está detectando, y se puede configurar para ser proporcional tanto en el tiempo como en la concentración diana de la reacción. En otra forma de realización relacionada, se puede cambiar la temperatura de la reacción (es decir, se puede aumentar hasta una temperatura que producirá 15 que la sonda se disocie), a continuación disminuye hasta una temperatura a la cual una nueva copia de la sonda se hibrida con la diana y se escinde por la enzima. En una forma de realización adicional, el procedimiento de aumentar y disminuir la temperatura se repitió muchas veces, o se cicló, como en la PCR (Mullis y Faloona, Methods in Enzymology, 155: 335 [1987], Saiki y col., Science 230: 1350 [1985]). 20

Tal como se ha señalado anteriormente, se prefieren nucleasas 5’ procedentes de las ADN polimerasas de tipo Pol A para la escisión de una estructura de escisión invasiva que comprende una cadena de ARN diana. La presente invención se refiere a enzimas que tienen rendimiento mejorado en ensayos de detección basados en la escisión de una estructura que comprende ARN. En particular, las polimerasas alteradas de la presente invención presentan rendimiento 25 mejorado en los ensayos de detección basados en la escisión de un miembro de ADN de una estructura de escisión invasiva que comprende una cadena de ARN diana.

Se pueden derivar las nucleasas 5’ de la presente invención de ADN polimerasas de tipo Pol A. La terminología usada para describir las alteraciones en este tipo de nucleasas 5’ se refiere a las descripciones de estructuras de ADN polimerasa conocidas en la técnica. Se ha descrito el 30 fragmento Klenow de la polimerasa Pol A de E. coli (los dos tercios C terminales, que tienen la actividad sintetizadora de ADN pero que carecen de la actividad de la nucleasa 5’) que tiene una forma física que se asemeja a una mano derecha, que tiene una región abierta denominada la “palma”, y un surco que sujeta el dúplex cebador/plantilla definido en un lado por un dominio de “dedos” y en el otro por un dominio de “pulgar” (Joyce y Steitz, Trends in Biochemical Science 12: 35 288 [1987]). Esto se muestra esquemáticamente en la Figura 5. Debido a que esta forma física ha demostrado ser común a todas las ADN polimerasas Pol A y a numerosas enzimas polimerizadoras dependientes del molde tales como las transcriptasas inversas, la terminología de la mano ha llegado a ser conocida en la técnica, y los sitios de actividad de estas enzimas se describen a menudo por referencia a su posición en la mano. Por referencia, y no se pretende 5 como limitación de la presente invención, la palma se crea de manera grosera a partir de los primeros 200 aminoácidos del dominio de la polimerasa, el pulgar a partir de la mitad 140, y los dedos por la siguiente a 160, con la base del surco formada a partir de las restantes regiones (Figuras 6). Aunque algunas enzimas pueden apartarse de estas descripciones estructurales, los dominios y las secuencias equivalentes que corresponden a dichos dominios se pueden identificar 10 por la homología de las secuencias para conocer las secuencias de las enzimas, por comparación de las estructuras cristalinas de las enzimas, y otros procedimientos similares.

En la creación de las enzimas mejoradas de la presente invención se han adoptado algunos enfoques, aunque la presente invención no está limitada a ningún enfoque concreto. Se compararon las primeras dos ADN polimerasas, Taq y Tth, que tienen diferentes velocidades de la 15 actividad de escisión de la cadena de ADN en las dianas de ARN. Para identificar los dominios relacionados con diferencias en la actividad, se crearon una serie de construcciones quiméricas y se midieron las actividades. Este procedimiento identificó dos regiones de la polimerasa Tth que podrían, si se transfirieran en la polimerasa Taq, conferir en la TaqPol una actividad de escisión dependiente de ARN equivalente a la de la proteína Tth natural. Una vez se identificaron estas 20 regiones, se examinaron los aminoácidos particulares implicados en la actividad. Debido a que las dos proteínas son aproximadamente un 87 por ciento idénticas en la secuencia de aminoácidos global, las regiones identificadas tuvieron únicamente un pequeño número de diferencias de aminoácidos. Alterando estos aminoácidos individualmente y en combinaciones, se identificó una pareja de aminoácidos en TthPol que si se introdujeron en la proteína TaqPol, aumentaron la 25 velocidad de escisión hasta la de TthPol natural.

Estos datos demuestran dos aspectos importantes de la invención. En primer lugar, se pueden cambiar aminoácidos específicos para conferir actividad de escisión dependiente de ARN similar a la de TthPol a una polimerasa que tiene una actividad inferior. De manera más amplia, sin embargo, estos resultados proporcionan regiones de estas polimerasas que están implicadas 30 en el reconocimiento de la estructura de escisión que contiene ARN. La identificación de estas importantes regiones, combinada con la información publicada sobre las relaciones de otros aminoácidos con las diversas funciones de estas ADN polimerasas y la modelización molecular asistida por ordenador durante el desarrollo de la presente invención, ha permitido un enfoque de diseño racional para crear nucleasas 5’ mejoradas adicionales. La información permitió también un 35 enfoque en la mutagénesis aleatoria focalizada acoplada con procedimiento de cribado rápido para crear e identificar rápidamente enzimas que tengan propiedades mejoradas.

Los procedimientos usados para crear y seleccionar las nucleasas 5’ mejoradas de la presente invención se describen en detalle a continuación y en los ejemplos experimentales. Un procedimiento general para cribar y caracterizar la actividad de escisión de cualquier nucleasa 5’ 5 está incluido en los ejemplos experimentales. Las discusiones de los procedimientos se dividen en las siguientes secciones: I) Creación y selección de construcciones quiméricas; II) Mutagénesis sitioespecífica basada en la información procedente de las construcciones quiméricas; III) mutagénesis sitioespecífica basada en la modelización molecular y en los estudios físicos publicados; y IV) mutagénesis aleatoria focalizada. 10

La invención proporciona una composición que comprende una enzima nucleasa 5’ que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2857.

La invención proporciona un kit que comprende la composición de la reivindicación 1.

La invención proporciona un procedimiento para escindir un ácido nucleico que comprende: a) proporcionar: i) la enzima de la reivindicación 1; y ii) una muestra que comprende 15 ácido nucleico sustrato; y b) exponer dicho ácido nucleico sustrato a dicha enzima.

I) Creación y selección de construcciones quiméricas

Las ADN polimerasas de tipo Pol A, que incluyen, pero que no se limitan a enzimas ADN polimerasas de especies de Thermus, comprenden dos dominios distintivos, los dominios de la 20 nucleasa 5’ y de la polimerasa, que se muestran esquemáticamente en la Figura 6. Los dominios de la polimerasa residen en los dos tercios C terminales de las proteínas y son responsables de las actividades de las ADN polimerasas dependientes de ADN y dependientes de ARN. Un tercio de la porción N terminal contiene los dominios de la nucleasa 5’. En el género Thermus la región de la palma de la polimerasa Pol A está compuesta, groseramente, por los aminoácidos 300-500, 25 la región del pulgar incluye los aminoácidos 500-650, mientras que la región de los dedos está formada por los restantes aminoácidos desde el 650 al 830 (Figura 6).

Los derivados, Taq DN RX HT y Tth DN RX HT, de Taq y TthPol usados en muchos de los experimentos de la presente invención, y descritos en el presente documento, están modificados para reducir la actividad sintética y para facilitar la construcción de quimeras, pero tienen una 30 actividad nucleasa 5’ esencialmente idéntica a la TaqPol y TthPol sin modificar. A no ser que se especifique otra cosa, las enzimas TaqPol y TthPol de la siguiente descripción se refieren al derivado DN RX HT.

TthPol tiene una velocidad de escisión 4 veces mayor que la de la plantilla de ARN de IL-6 (que se muestra en la Figura 10) diferente de TaqPol (que se muestra en la Figuras 11 y 12), 35 aunque la Taq y las TthPol muestran similitudes de escisión en las estructuras del ADN diana (Figura 10). Debido a que las secuencias de aminoácidos de TaqPol y TthPol (Figuras 8 y 9) comparten aproximadamente un 87% de identidad y más de un 92% de similitud, el elevado grado de homología entre las enzimas permitió la creación de una serie de enzimas quiméricas entre TthPol y TaqPol. Se usó la actividad de las enzimas quiméricas como un parámetro para 5 identificar la(s) región(es) de estas proteínas que afectaban a la actividad de la nucleasa 5’ dependiente de ARN.

Se crearon las construcciones quiméricas entre los genes TthPol y TaqPol que se muestran esquemáticamente en las Figuras 7 y 19 mediante fragmentos de ADN intercambiados definidos por los sitios de las endonucleasas de restricción, EcoRI y BamHI, comunes a ambos 10 genes, el sitio SaII del vector de clonación y los nuevos sitios, Notl, BstBI y NdeI, creados en las posiciones homólogas de ambos genes mediante mutagénesis sitiodirigida. Se han abreviado las enzimas de restricción como sigue: EcoRI es E; NotI es N; BstBI es Bs; NdeI es D, BamHI es B, y SalI es S.

Se evaluó la actividad de cada enzima quimérica usando el ensayo invasivo de 15 amplificación de la señal con el ARN diana de IL-6 (Figura 10), y se determinaron las velocidades de escisión de la ciclación que se muestran en la Figura 12 tal como se describe en los Ejemplos Experimentales. La comparación de las velocidades de escisión de las primeras dos quimeras, TaqTth(N) y TthTaq(N), creadas mediante intercambio de los dominios de la polimerasa y de la nucleasa 5’ en el sitio NotI (Figura 7), muestra que TaqTth(N) tiene la misma actividad que TthPol, 20 mientras que su contraparte TthTaq(N) retiene la actividad de TaqPol (Figura 12). Este resultado indica que la mayor velocidad de escisión de TthPol está asociada con su dominio de la polimerasa y sugiere un importante papel del dominio de la polimerasa en la actividad de la nucleasa 5’.

La siguiente etapa fue identificar una región mínima de la polimerasa TthPol que pudiera 25 proporcionar un aumento en la actividad de la nucleasa 5’ dependiente de ARN similar a TthPol cuando se sustituyó por la correspondiente región de la secuencia TaqPol. Con este fin, se seleccionó la quimera TaqTth(N) para generar una serie de nuevas construcciones sustituyendo su secuencia TthPol con las regiones homólogas de TaqPol. En primer lugar, se sustituyeron las partes N terminal y C terminal del dominio de la polimerasa TaqPol por las correspondientes 30 regiones de TaqTth(N) usando el sitio BamHI común como punto de rotura para crear las quimeras TaqTth(N-B) y TaqTth(B-S), respectivamente (Figura 7). TaqTth(N-B), que tiene la secuencia TthPol entre los aminoácidos 328 y 593 es aproximadamente 3 veces más activa que la TaqTth(B-S) y un 40% más activa que TthPol (Figura 12). Este resultado establece que la porción NotI-BamHI del dominio de la polimerasa TthPol determina actividad nucleasa 5’ dependiente de 35 ARN superior de la de TthPol.

A partir de estos datos se determinó que una porción central de la TthPol, cuando se usó para sustituir la porción homóloga de TaqPol (la construcción TaqTth(N-B) podría conferir superior reconocimiento del ARN sobre la proteína quimérica compuesta principalmente por proteína Taq. De hecho, la velocidad de ciclación de esta proteína quimérica excedió la de la TthPol parental. La 5 comparación de las quimeras que incluyó subporciones de la región mejoradora de la actividad de TthPol, aproximadamente un 50% de la región en cada caso (Véanse, TaqTth(N-D) y TaqTth(D-B), Figuras 7 y 12) no mostró mejora significativa en la actividad dependiente de ARN en comparación con la TaqPol parental. Este resultado indica que se necesitan los aspectos de cada mitad de la región para esta actividad. Una construcción que tenía una porción solo ligeramente 10 más pequeña de la porción de la inserción Tth (TaqTth(Bs-B)) mostró una actividad que fue cercana a la de la TthPol parental, pero que fue menor que la de la construcción TaqTth(N-B).

II) Mutagénesis sitioespecífica basada en la información procedente de construcciones quiméricas 15

La comparación entre las secuencias de aminoácidos de TthPol y TaqPol entre los sitios BstBI y BamHI desvela únicamente 25 diferencias (Figura 13). Entre aquellas, existen 12 cambios conservativos y 13 sustituciones que dan como resultado un cambio en la carga. Debido a que el análisis de las enzimas quiméricas ha sugerido que algunos cambios de aminoácidos críticos se localizan en las regiones BstBI-NdeI y NdeI-BamHI de TthPol, se usó la mutagénesis sitiodirigida 20 para introducir los aminoácidos específicos de TthPol en las regiones BstBI-NdeI y NdeI-BamHI de las quimeras TaqTth(D-B) y TaqTth (N-D), respectivamente. Se generaron seis sustituciones específicas de TthPol en la región BstBI-NdeI de la TaqTth(D-B) mediante mutagénesis individual o doble de aminoácidos y únicamente una mutación doble, W417L/G418K, fue capaz de restablecer la actividad de TthPol en el ARN diana de IL-6 (Véase por ejemplo, la Figura 14). De 25 manera similar, se introdujeron 12 aminoácidos específicos de TthPol en las posiciones homólogas de la región NdeI-BamHI de la TaqTth(N-D) y únicamente una de ellas, E507Q, aumentó la velocidad de escisión al nivel de TthPol (Véase por ejemplo, la Figura 14).

Para confirmar que las sustituciones W417L, G418K y E507Q son suficientes para aumentar la actividad de TaqPol al nivel de TthPol, se crearon variantes de TaqPol que 30 transportaban estas mutaciones y se compararon sus velocidades de escisión con el ARN sustrato de IL-6 con la de TthPol. La Figura 15 muestra que los mutantes TaqPol W417L/G418K/E507Q y TaqPol G418K/E507Q tienen 1,4 veces más actividad que TthPol y más de 4 veces más actividad que TaqPol, mientras que el mutante TaqPol W417L/E507Q tiene la misma actividad que TthPol, que es aproximadamente 3 veces mayor que TaqPol. Estos 35 resultados demuestran que K418 y Q507 de TthPol son aminoácidos importantes en la definición de su superior actividad nucleasa 5’ dependiente de ARN en comparación con TaqPol.

Se ensayó la capacidad de estos aminoácidos para mejorar la actividad nucleasa 5’ dependiente de ARN de una ADN polimerasa introduciendo las correspondientes mutaciones en los genes de la polimerasa A de dos organismos adicionales: Thermus filiformus y Thermus 5 scotoductus. TaqPol mostró actividad dependiente de ARN mejorada cuando se modificó para contener las mutaciones W417L y E507Q, que la volvieron más similar en estos restos a los correspondientes restos de TthPol (K418 y Q507). Se modificó TfiPol para tener p420K y E507Q, creando TfiDN 2M, mientras que se modificó TscPol para tener E416K y E505Q, para crear TscDN 2M. Se determinó la actividad de estas enzimas para escindir diversas estructuras que 10 contienen ADN y ARN tal como se describe en el Ejemplo 1, usando las estructuras IdT2, IrT3, en horquilla y X representadas gráficamente en las Figuras 21 y 22, mostrándose los resultados en la Figura 25 y en la Tabla 7. Ambas enzimas tienen mucha menos actividad de escisión dependiente de ARN que cualquiera de las enzimas TthPol o la Taq 2M. Sin embargo, la introducción de las mutaciones citadas anteriormente en estas polimerasas aumentó la actividad de escisión 15 dependiente de ARN en 2 veces en comparación con las enzimas no modificadas (Figura 25). Estos resultados demuestran la transferibilidad de la actividad de escisión mejorada dependiente de ARN en una amplia gama de polimerasas usando los procedimientos de la presente invención.

III) Mutagénesis sitioespecífica basada en la modelización molecular y en los estudios 20 físicos publicados

En la Figura 17 se muestran las posiciones de las mutaciones G418H y E507Q en la estructura cristalina de un complejo del fragmento grande de TaqPol (Klentaq1) con un cebador/plantilla de ADN de terminado por Li y col. (Li y col., Protein Sci., 7: 1116 [1998]). La mutación E507Q se localiza en la punta del subdominio del pulgar a una distancia más cercana de 25 3,8 Å y 18 Å del esqueleto de fosfatos de las cadenas del cebador y la plantilla, respectivamente. La interacción entre el pulgar y el surco menor del cebador/plantilla de ADN se sugirió anteriormente por las estructuras cristalinas simultáneas de la ADN polimerasa I del fragmento Klenow (Breese y col., Science 260: 352 [1993]) y TaqPol (Eom y col., Nature 382: 278 [1996]). La deleción de una porción de 24 aminoácidos de la punta del pulgar en el fragmento Klenow, 30 correspondiente a los aminoácidos 494-518 de TaqPol, reduce la afinidad de unión del ADN en más de 100 veces (Minnick y col., J. Biol. Chem., 271: 24954 [1996]). Estas observaciones son consistentes con la hipótesis de que la región del pulgar, que incluye el resto E507, está implicada en las interacciones con el sustrato dúplex en la dirección 5’.

Las mutaciones W417L y G418K en la región de la palma de TaqPol (Figura 17) están 35 localizadas aproximadamente a 25 Å desde los fosfatos más cercanos de la plantilla en las cadenas en la dirección 5’, de acuerdo con las estructuras cristalinas simultáneas de TaqPol con el dúplex de ADN unido en el modo de polimerización (Li y col., Protein Sci., 7: 1116 [1998], Eom y col., Nature 382: 278 [1996]). Se observó la misma distancia entre los aminoácidos W513 y P514 análogos del fragmento Klenow y la plantilla de la cadena de ADN unida en el modo de edición 5 (Breese y col., Science 260: 352 [1993]). De esta manera, no se pueden sugerir interacciones entre TaqPol y el sustrato solapante a partir de los estudios de cristales simultáneos disponibles de esta región.

Aunque no es necesaria una comprensión del mecanismo de acción de las enzimas para la práctica de la presente invención y la presente invención no está limitada a ningún mecanismo 10 de acción, se propone que los aminoácidos en las posiciones 417 y 418 en la región de la palma de TaqPol interactúan con el sustrato dúplex en la dirección 5’ únicamente cuando la enzima funciona como una nucleasa 5’, pero si no se produce interacción con estos aminoácidos cuando TaqPol regula el modo de polimerización. Esta hipótesis sugiere un novedoso modo de unión al sustrato por las ADN polimerasas denominado aquí el “modo nucleasa 5’. Algunas líneas de 15 evidencias apoyan esta hipótesis. El estudio de las enzimas quiméricas descrito aquí separa claramente las regiones del dominio de la polimerasa implicadas en las actividades de la nucleasa 5’ y de la polimerasa. De acuerdo con esto, las mutaciones W417L y G418K, junto con la mutación E507Q, afectan la actividad nucleasa 5’ de TaqPol en sustratos que tienen una cadena de ARN diana (Figura 15), pero no tienen efecto tanto en las actividades de las polimerasas dependientes 20 de ARN o dependientes de ADN (Figura 16). Por otra parte, las mutaciones en el sitio activo de TaqPol, tales como R573A, R587A, E615A, R746A, N750A y D785N, que corresponden a sustituciones en el fragmento Klenow de la ADN Pol I de E. coli que afectan a la actividad de la polimerasa y a la afinidad de unión del sustrato en el modo de polimerización (Polesky y col., J. Biol. Chem., 265: 14579 [1990], Polesky y col., J. Biol. Chem., 267: 8417 [1992], Pandey y col., 25 Eur. J. Biochem., 214: 59 [1993]) mostraron tener poco o ningún efecto sobre la actividad nucleasa 5’. La superposición de los dominios de la polimerasa de TaqPol (Eom y col., Nature 382: 278 [1996]), E.coli Pol I and Bacillus stearothermophilus Pol I (Kiefer y col., Nature 391: 304 [1998]) usando los programas DALI (Holm y Sander, J. Mol. Biol., 233: 123 [1993], Holm y Sander, Science 273: 595 [1996]) e Insight II (Molecular Simulation Inc., Naperville, IL) muestra que la 30 región de la palma de TaqPol entre los aminoácidos 402-451, incluyendo W417 y G418, está estructuradamente muy conservada entre las tres polimerasa, aunque no existe similitud estructural entre el resto de los subdominios de la palma. Esta observación sugiere un importante papel de esta región en ADN polimerasas eubacterianas.

Las actividades de la nucleasa 5’ y de la polimerasa deberían sincronizarse con precisión 35 para crear una estructura hendida en lugar de un hueco o un saliente que podría producir una deleción o una inserción durante el procesamiento del fragmento Okazaki o la reparación del ADN, si la ligasa se une a los extremos de forma inapropiada. De acuerdo con el modelo propuesto anteriormente (Kaiser y col., J. Biol. Chem., 274: 21387 [1999]), el nucleótido del extremo 3’ de la cadena en la dirección 5’ está secuestrado por el dominio de la nucleasa 5’ para evitar su 5 extensión, deteniendo de esta manera la síntesis. La interacción con el nucleótido 3’ activa aparentemente la nucleasa 5’ que elimina endonucleolíticamente el brazo 5’ desplazado de la cadena en la dirección 3’. Esta escisión se produce por la incisión precisa en el sitio definido por el nucleótido 3’, creando de esta manera el surco. Este modelo requiere una redisposición sustancial del complejo sustrato-enzima, que puede incluir una translocación del complejo al modo nucleasa 10 5’ para separar el cebador/plantilla del sitio activo de la polimerasa.

Es posible que se pueda inducir una reubicación del sustrato lejos del sitio activo de la polimerasa por la interacción entre el dúplex formado entre la plantilla y las cadenas entrantes y el surco formado por los subdominios del dedo y el pulgar. Dicha interacción podría forzar transiciones conformacionales en el pulgar que pondrían en contacto el dúplex del molde/cebador 15 con los aminoácidos W417 y G418. Se ha informado anteriormente de una significativa flexibilidad del pulgar que puede explicar dichos cambio (Beese y col., Science 260: 352 [1993], Eom y col., Nature 382: 278 [1996], Ollis y col., Nature 313: 762 [1985], Kim y col., Nature 376: 612 [1995], Korolev y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 9264 [1995], Li y col., EMBO J., 17: 7514 [1998]). Los cambios conformacionales adicionales del dominio de los dedos que pueden ayudar a abrir el 20 surco, tal como la transición de la estructura ‘cerrada’ a la ‘abierta’ descrita por Li y col. (Li y col., EMBO J., 17: 7514 [1998]), son consistentes con este modelo. Puede ser que no se observara el modo de unión de la nucleasa 5’ en ninguna de las estructuras cristalinas simultáneas publicadas de una ADN Pol I debido a que la mayoría de las estructuras se resolvió únicamente para el dominio de la polimerasa, con un sustrato de cebador/plantilla más bien que con un solapamiento 25 del sustrato de la nucleasa 5’.

Se han determinado valores de la Km de 200-300 nM para las TaqPol, TthPol y TaqPol G418K1E507Q del sustrato que contiene ARN. Estos valores son mucho mayores que el valor de la Km de < 1 nM estimado para la TthPol con un sustrato que solapa todo el ADN sugiriendo que la plantilla de ARN afecta adversamente la unión del sustrato. Se podría explicar la baja afinidad por 30 la interacción desfavorable entre la enzima y cualquiera del dúplex de forma A adoptado por el sustrato con un ARN diana, o los hidroxilos 2’ de la ribosa de la cadena de ADN. Entre estos dos factores, el último parece más probable, debido a que las nucleasas 5’ de las ADN polimerasas eubacterianas pueden escindir eficazmente sustratos con una sonda de ARN en la dirección 3’ (Lyamichev y col., Science 260: 778 [1993]), que tendría presumiblemente una forma A. Además, 35 los estudios de cristales simultáneos sugieren que el dúplex del molde/cebador adopta parcialmente una conformación cercana a la forma A en su complejo con la ADN polimerasa (Eom y col., Nature 382: 278 [1996], Kiefer y col., Nature 391: 304 [1998], Li y col., EMBO J., 17: 7514 [1998]). Las mutaciones G418K/E507Q aumentan la kcat de TaqPol más de dos veces, pero tienen poco efecto sobre la Km. Se podría esperar dicho efecto si las mutaciones sitúan el sustrato en una 5 orientación más apropiada para la escisión más bien que aumentar simplemente la constante de unión.

Adicionalmente al análisis mutacional descrito anteriormente, otro enfoque para estudiar regiones específicas de enzimas, relaciones estructura-función de enzimas, e interacción enzima-sustrato es investigar la estructura física real de la molécula. 10

Con los avances en la cristalografía, la RMN, y la tecnología informática y de software, el estudio de la estructura molecular ha llegado a ser una herramienta viable para aquellos interesados en la configuración, organización y dinámica de las biomoléculas. La modelización molecular ha incrementado la comprensión de la naturaleza de las interacciones en las que se basan la estructura de las proteínas y en cómo interactúan las proteínas funcionalmente con el 15 sustrato. Numerosas publicaciones describiendo las estructuras de diversas polimerasas o porciones de la proteína polimerasa, la transcriptasa inversa de VIH, y otras proteínas de unión a ácidos nucleicos han proporcionado nuevas percepciones mecanísticas en la conformación de las proteínas, los cambios en la conformación, y en las interacciones moleculares necesarias para la función. 20

Como ejemplo, el informe de Doublie y col. (Doublie y col., Nature 391: 251 [1998]) da a conocer la estructura cristalina de la ADN polimerasa T7 y proporciona información acerca de cuales regiones de aminoácidos es probable que tengan un efecto sobre la unión del sustrato, lo que se requiere para poner en contacto el sustrato para la polimerización, y qué aminoácidos se unen a cofactores, tales como iones metálicos. Se señala en este artículo y en otros que muchas 25 de las polimerasas comparten no solo similitud de la secuencia, sino también homología estructural. Cuando se sobreimponen algunos dominios estructurales de diferentes polimerasas (por ejemplo, la polimerasa T7, el complejo de edición del fragmento Klenow, la ADN polimerasa Taq sin ligar y el complejo de Polimerasa Taq-ADN), los motivos conservados son claramente discernibles. 30

Específicamente, combinando la información de todas estas fuentes y referencias estructurales diferentes, se puede preparar un modelo de la proteína que interactúa con el ADN, el ARN, o el heterodúplex. A continuación se puede examinar el modelo para identificar los aminoácidos que pueden estar implicados en el reconocimiento del sustrato o en el contacto del sustrato. Se pueden llevar a cabo cambios en loa aminoácidos basándose en estas 35 observaciones, y se evaluaron los efectos sobre diversas actividades de las proteínas nucleasas 5’ usando procedimientos de cribado tales como los de la presente invención, descritos en los ejemplos experimentales.

El análisis de intercambio del dominio descrito anteriormente demostró que las secuencias de la TthDN que son importantes en la actividad de la nucleasa 5’ dependiente de ARN se basan 5 en el dominio de la polimerasa de la proteína. Por tanto, el estudio de los datos estructurales del dominio de la polimerasa con respecto al reconocimiento de ácidos nucleicos proporciona un procedimiento para localizar aminoácidos que cuando se alteran, alteran el reconocimiento de ARN en una reacción de la nucleasa 5’. Por ejemplo, el análisis realizado durante el desarrollo de la presente invención examinó los análisis publicados en relación con la unión del cebador/plantilla 10 por el dominio de la polimerasa de la Pol 1 de E. coli, el fragmento Klenow. La Tabla 1 muestra un muestreo de constantes cinéticas determinado para el fragmento Klenow, y muestra los efectos de numerosas mutaciones en estas medidas. Los aminoácidos correspondientes o similarmente situados en la TaqPol se indican en la columna a mano derecha. Se postuló que las mutaciones que tenían un impacto perceptible sobre las interacciones del fragmento Klenow con la plantilla de 15 ADN o el dúplex de cebador/plantilla, tal como se indicó por los cambios en la Kd y en los valores de afinidad relativa del ADN, pueden tener también efectos cuando se hacen en los sitios correspondientes en la TaqPol y en derivados quiméricos o mutantes relacionados. Se creó una selección de las mutaciones que produjeron un mayor valor de la Kd o un menor valor de la afinidad relativa del ADN cuando se introdujeron en el fragmento Klenow y se examinó en la 20 TaqPol. Estos derivados de Taq incluyen, pero no se limitan a, los indicados por asteriscos en la columna a mano derecha de la Tabla 1.

Para algunas variantes Klenow, tales como los mutantes R682, no se hizo la selección para el ensayo basándose en las medidas de afinidad del ADN, sino debido a que la modelización molecular sugirió una interacción entre un aspecto determinado del dúplex de la plantilla/cebador y 25 el aminoácido. Similarmente, se dirigieron regiones adicionales de la polimerasa Taq (o de derivados de Taq) para la mutagénesis, basándose en los datos estructurales y en la información procedente de la modelización molecular. Basándose en la modelización, se postuló la región del pulgar para poner en contacto con una plantilla de ADN. De esta manera, se observaron para esto si los aminoácidos en la región del pulgar que estaban alterados, pueden alterar este contacto. Por 30 ejemplo, las Figuras 6 y 17 muestran que los aminoácidos 502, 504, y 507 están localizados en la punta del pulgar. Se postuló que alterar estos aminoácidos podía tener un efecto sobre la interacción enzima-sustrato. Usando los procedimientos de cribado de la actividad descritos en el Ejemplo 1, se identificaron las mutaciones que produjeron efectos beneficiosos. Se usó este enfoque para crear numerosas enzimas mejoradas. Por ejemplo, la posición H784 de TaqPol, 35 correspondiente al aminoácido H881 de Klenow, es un aminoácido en la región de los dedos y, como tal, puede estar implicado en la unión del sustrato a cebador/plantilla. Cuando se sustituye el aminoácido H881 en la enzima Klenow por alanina, el cambio disminuye la afinidad de la enzima por el ADN a solo un 30 a 40% de la del nivel natural. Se ensayó una sustitución análoga en la enzima derivada de TaqPol. Comenzando con el derivado W417L/G418K/E507Q de Taq, se 5 cambió el aminoácido 784 de Histidina (H) a Alanina (A) para dar como resultado el mutante W417L/G418K/E507Q/H784A, denominado Taq 4M. Esta variante mostró actividad nucleasa 5’ mejorada en el sustrato de ensayo IrT1 del ensayo del ARN (Figura 24) (datos en la Tabla 2). El aminoácido R587 está en la región del pulgar, y se seleccionó para la mutación basándose en su estrecha proximidad con el dúplex del cebador/plantilla en modelos informáticos. Cuando se 10 añadió una mutación R587A a la variante Taq 4M, la actividad del sustrato de ensayo IrT1 del ensayo mejoró más todavía. Adicionalmente, la reducción, con respecto a la variante 4M, en la escisión de la estructura X que se muestra en la Figura 22 constituye una mejora adicional en la función de esta enzima.

No todos los cambios de aminoácidos que reducen la unión del ADN durante la 15 polimerización afectan a la actividad de la nucleasa 5’. Por ejemplo, las mutaciones E615A, R677A, que afectan a los aminoácidos que están también en los dominios del pulgar y los dedos, respectivamente, tienen tanto efecto adverso, como ningún efecto sobre las actividades de la nucleasa 5’, respectivamente, tal como se midió usando los sustratos de ensayo en las Figuras 21 y 22, y en comparación con las variantes parentales que carecen de estos cambios. Se añadió la 20 mutación R677A a, y en comparación con la variante TaqSS, mientras que se añadió la mutación E615A a y en comparación con la variante Taq 4M. Los procedimientos de ensayo descritos en el presente documento proporcionan unos medios convenientes para analizar cualquier variante para las alteraciones en la actividad de escisión de sustratos invasivos y no invasivos, para las estructuras que contienen ADN y ARN. De esta manera, la presente invención proporciona 25 procedimientos para identificar todas las enzimas mejoradas adecuadas.

Se examinaron también las alteraciones que pueden aumentar la afinidad de las enzimas por las dianas de ácido nucleico. Se seleccionaron de las mutaciones descritas anteriormente se seleccionaron debido a que producían que la enzima del fragmento Klenow tuviera una afinidad disminuida por el ADN, con el fin de crear enzimas que aceptaran más las estructuras de las 30 cadenas que no contienen ADN. En general, las ADN polimerasas naturales muestran una menor afinidad por los dúplex de ARN/ADN, en comparación por su afinidad por los dúplex de ADN/ADN. Durante el desarrollo de la presente invención, se procuró aumentar la afinidad general de las proteínas de la presente invención por un sustrato de ácido nucleico sin restablecer o aumentar cualquier preferencia por las estructuras que tienen cadenas de ADN más bien que de ARN diana. 35 Se examinó la sustitución de aminoácidos que tenían diferentes cargas como un medio para alterar la interacción entre las proteínas y los sustratos de ácido nucleico. Por ejemplo, se postuló que la adición de restos de aminoácidos positivamente cargados, tales como lisina (k) podía aumentar la afinidad de una proteína por un ácido nucleico cargado negativamente.

Tal como se ha señalado anteriormente, las alteraciones en la región del pulgar podrían 5 afectar las interacciones de la proteína con el sustrato de ácido nucleico. En un ejemplo, se introdujo la mutación G504K (punta del pulgar) en Taq 4M y produjo una potenciación de la actividad nucleasa en un 15% sobre un ARN diana. Mutaciones adicionales cargadas positivamente (A502K y E507K) mejoran además la actividad dependiente del ARN diana en un 50% en comparación con la enzima Taq 4M parental. 10

El uso de los datos de estudios publicados y de la modelización molecular, en combinación con los resultados acumulados durante el desarrollo de la presente invención permitieron la identificación de regiones de las proteínas en las que los cambios en aminoácidos produciría probablemente diferencias observables en al menos un aspecto de la función de escisión. Aunque se podrían dirigir regiones de esta forma, que observó que los cambios en diferentes aminoácidos, 15 incluso si fueron próximos o inmediatamente adyacentes en la proteína, podrían tener diferentes efectos. Por ejemplo, mientras que la sustitución A502K creó un marcado aumento en la actividad de escisión dependiente de ARN de Taq 4M, el cambio del aminoácido 499 de G a K, a solo 3 aminoácidos de 502, proporcionó una mínima mejora. Como se puede observar en los Ejemplos Experimentales, el enfoque de la presente invención fue cambiar algunos aminoácidos en una 20 región candidata, tanto solos como en combinación, usar a continuación el procedimiento de cribado proporcionado en el Ejemplo 1 para evaluar rápidamente los efectos de los cambios. De esta forma, el enfoque del diseño racional se aplicó fácilmente a la tarea de diseñar genotecnológicamente la proteína.

Adicionalmente a las regiones del pulgar, la palma y de la mano que se encuentran en el 25 dominio de la polimerasa de estas proteínas, se examinaron las regiones que eran específicas de los dominios de las nucleasas 5’ y de las nucleasas. Los estudios comparativos sobre una variedad de nucleasas 5’ han mostrado que, aunque las secuencias de aminoácidos varían drásticamente de enzima a enzima, existen características estructurales comunes a la mayoría. Dos de estas características son el motivo hélice-horquilla-hélice (H-h-H) y el arco o estructura de 30 bucle. Se cree que los motivos H-h-H median en la unión del ADN no específica de secuencia. Se ha encontrado en al menos 14 familias de proteínas, incluyendo nucleasas, N-glicosilasas, ligasas, helicasas, topoisomerasas, y polimerasas (Doherty y col., Nucl. Acid. Res., 24: 2488 [1996]). La estructura cristalográfica de la ADN polimerasa pol β de rata unida a plantilla/cebador de ADN muestra puentes de hidrógeno no específicos entre los nitrógenos del esqueleto del motivo HhH 35 de pol β y los oxígenos del fosfato del cebador del dúplex de ADN (Pelletier y col., Science 264: 1891 [1994]). Debido a que el dominio HhH de los dominios de la nucleasa 5’ de las polimerasas Taq y Tth puede funcionar de una manera similar, se contempla que las mutaciones en la región HhH de la enzima alteran la actividad. Se pueden introducir mutaciones para alterar la forma y la estructura del motivo, o cambiar la carga del motivo para aumentar o disminuir la afinidad por el 5 sustrato.

Otra estructura común a muchas nucleasas 5’ procedentes de diversas fuentes tales como eucariotas, eubacterias, archaea y fagos, es el dominio del arco o bucle: La estructura cristalina de la exonucleasa 5’ del bacteriófago T5 mostró un arco distinto formado por dos hélices, una cargada positivamente y una que contenía restos hidrófobos (Ceska y col., Nature 382: 90 [1996]). 10 De manera interesante, tres restos que se conservan entre T5 y Taq, Lys 83, Arg 86 y Tyr 82 están todos en el arco. Estos corresponden a los aminoácidos Lys 83, Arg 86, y Tyr 82 en la ADN polimerasa Taq. Se ha determinado también la estructura cristalina de Taq (nucleasa 5’) (Kim y col., Nature 376: 612 [1995]).

La estructura cristalina de la endonucleasa-1 flap de Methanococcus janneschii muestra 15 también dicho motivo de bucle (Hwang y col., Nat. Struct. Biol., 5: 707 [1998]). Se puede sobreimponer la estructura cristalina del esqueleto de las moléculas FEN-1 de Mja sobre la exonucleasa T5, la exonucleasa 5’ Taq y la RNasa H T4. Una característica común interesante a todas éstas es la longitud del bucle. El bucle de FEN-1 está compuesto por numerosos restos aromáticos cargados positivamente y forman un hueco con dimensiones suficientemente grandes 20 para acomodar una molécula de ADN monocatenario. La correspondiente región en la exonucleasa T5 está compuesta por tres hélices que forman un arco helicoidal. El tamaño del hueco formado por el arco helicoidal en la exonucleasa T5 es menor de la mitad que el formado por el bucle L1 en la FEN-1 de Mj. En la RNasa H T4 o en la exonucleasa 5’ Taq, esta región está desordenada. Algunas regiones del arco se unen a metales, mientras que otras regiones del arco 25 entran en contacto con el sustrato de ácido nucleico. La alineación de las secuencias de aminoácidos de los seis dominios nucleasa 5’ de las ADN polimerasas en la familia pol I muestra seis motivos de secuencias muy conservados que contienen diez restos ácidos conservados (Kim y col., Nature 376 [1995]).

Se examinaron los efectos de las alteraciones en la región del arco. En la polimerasa Taq, 30 la región del arco está formada por los aminoácidos 80-95 y 96-109. Se llevó a cabo la mutagénesis sitiodirigida en la región del arco. La alineación de las secuencias de aminoácidos de las nucleasa 5’ polimerasa y de las FEN sugirió el diseño de mutaciones con sustitución de 3 aminoácidos, P88E, P90E y G80E. Se realizaron estas sustituciones en el mutante de la polimerasa Taq 4M como enzima parental. Los resultados indicaron que aunque la actividad de 35 fondo en los sustratos HP y X que se muestra en la Figura 22, se suprimió drásticamente en todos los mutantes, se redujo también la actividad nucleasa 5’ deseable en los sustratos apropiados (IdT e IrT, Figura 24). A pesar de la homología de las secuencias entre las polimerasas Taq y Tth, hay una actividad muy diferente en los sustratos HP y X. La alineación de las regiones de arco de las polimerasas Taq y Tth demuestra también regiones de de extensa homología de secuencias así 5 como diferencias menores. Estas diferencias conducen al diseño de las mutaciones L109F y A110T usando Taq 4M para generar Taq4M L109F/A110T, y el mutante Taq 4M A502K/G504K/E507K/T514S para generar el mutante Taq 4M L109F/A110T/A502K/G504K/E507K/T514S. Estas dos mutaciones han convertido drásticamente la enzima Taq 4M para llegar a ser más similar a la enzima Tth en términos de especificidad del 10 sustrato de fondo mientras que las actividades nucleasa 5’ en ambos sustratos de ADN y ARN no han cambiado prácticamente.

IV) Mutagénesis aleatoria focalizada

Tal como se ha descrito anteriormente, se pueden usar los estudios físicos y la 15 modelización molecular solos o en combinación para identificar las regiones en los enzimas en la que cambios en los aminoácidos es posible que produzcan diferencias observables en al menos un aspecto de la función de escisión. En la sección anterior, se describió el uso de esta información para seleccionar y cambiar aminoácidos o combinaciones específicas de aminoácidos. Otro procedimiento para generar una enzima con la función alterada es introducir 20 mutaciones aleatoriamente. Se pueden introducir dichas mutaciones mediante numerosos procedimientos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, amplificación mediante la PCR en condiciones que favorezcan la incorporación incorrecta de nucleótidos (REF), amplificación usando cebadores que tienen regiones de degeneración (es decir, posiciones de bases en las que diferentes oligonucleótidos individuales, pero de otra forma similares, en una 25 reacción, pueden tener diferentes bases) y síntesis química. Se conocen en la técnica muchos procedimientos de mutagénesis aleatoria (Del Rio y col., Biotechniques 17: 1132 [1994]), y se pueden incorporar en la producción de las enzimas de la presente invención. Las descripciones de cualquier medio particular contenido en el presente documento se presentan únicamente por medio de ejemplo y no se pretenden como limitación. Cuando se lleva a cabo la mutagénesis 30 aleatoria de tal manera que únicamente está variada una región particular de una proteína completa, se puede describir como “mutagénesis aleatoria focalizada”. Tal como se describe en los Ejemplos Experimentales, se aplicó un enfoque de mutagénesis aleatoria focalizada para variar algunos dominios de HhH y del pulgar de las variantes de enzimas creadas anteriormente. Se escogieron estos dominios para proporcionar ejemplos de este enfoque, y no se pretende que 35 el enfoque de la mutagénesis aleatoria esté limitado a ningún dominio concreto, o a un dominio individual. Puede aplicarse a cualquier dominio o a cualquier proteína completa. Se ensayaron las proteínas modificadas de esta manera para la actividad de escisión en las reacciones de cribado descritas en el Ejemplo 1, usando los sustratos de ensayo representados gráficamente en las Figuras 22 y 24, con los resultados descritos en las Tablas 5 y 6. 5

Se llevó a cabo la mutagénesis aleatoria en la región HhH con los mutantes H785A de TaqSS o TthDN parentales. Ninguno de los 8 mutantes generados mostró una mejora en la actividad en comparación con la enzima parental (Tabla 5). De hecho, las mutaciones de la región entre los restos 198-205 tienen aproximadamente una actividad 2-5 veces menor en ambos sustratos de ADN y ARN, sugiriendo que esta región es esencial para el reconocimiento del 10 sustrato. La mutagénesis en la región del pulgar dio como resultado nuevas mutaciones con la actividad nucleasa 5’ mejorada en un 20-100% en el ADN diana y aproximadamente en un 10% en el ARN diana (Tabla 6).

Numerosos aminoácidos en cada uno de los distintos subdominios juegan papeles en el contacto del sustrato. La mutagénesis de estos puede alterar la especificidad del sustrato 15 alterando la unión del sustrato. Además, las mutaciones introducidas en los aminoácidos que no entran en contacto directamente con el sustrato pueden alterar la especificidad del sustrato a lo largo de un intervalo más amplio o la conformación general alterando los efectos. Se pueden introducir estas mutaciones mediante cualquiera de los diversos procedimientos conocidos en la técnica, que incluyen, pero que no se limitan a mutagénesis aleatoria, mutagénesis sitiodirigida, y 20 generación de proteínas quiméricas.

Tal como se ha señalado anteriormente, se conocen en la técnica numerosos de mutagénesis aleatoria. Los procedimientos aplicados en la mutagénesis aleatoria focalizada descritos en el presente documento se pueden aplicar a genes completos. Se contempla también que se pueden crear construcciones quiméricas útiles adicionales mediante el uso de la 25 diseminación molecular (Véanse por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 5.837.458 y las Publicaciones PCT WO 00/18906, WO 99/65927, WO 98/31837, y WO 98/27230). Con respecto al procedimiento de mutagénesis escogido, el procedimiento de cribado rápido descrito en el presente documento proporciona unos medios rápidos y eficaces para identificar cambios beneficiosos dentro de un gran conjunto de moléculas recombinantes. Esto convierte al 30 procedimiento de mutagénesis aleatoria en una herramienta gestionable y práctica para crear un gran conjunto de nucleasas 5’ alteradas que tienen mejoras beneficiosas. Las estrategias de clonación y mutagénesis empleadas para las enzimas usadas como ejemplos son aplicables a otras polimerasas de Tipo A termoestables y no termoestables, debido a que la similitud de la secuencia de ADN entre estas enzimas es muy alta. Los expertos en la materia comprenderán 35 que diferencias en la secuencia necesitarán diferencias en las estrategias de clonación, por ejemplo, se puede requerir el uso de diferentes endonucleasas de restricción para generar quimeras. La selección de sitios alternativos existentes, o la introducción mediante mutagénesis de sitios alternativos son procedimientos bien establecidos y los conocen los expertos en la materia. 5

Se pueden llevar a cabo la expresión y la purificación de la enzima mediante una variedad de procedimientos de biología molecular. Los ejemplos descritos a continuación enseñan uno de dichos procedimientos, aunque debe entenderse que la presente invención no está limitada por el procedimiento de clonación, expresión de la proteína, o purificación. La presente invención contempla que la construcción de ácido nucleico sea capaz de la expresión en un hospedador 10 adecuado. Están disponibles numerosos procedimientos para unir diversos promotores y secuencias 3’ a una estructura de un gen para conseguir una expresión eficaz.

V) Mutagénesis sitioespecífica

En formas de realización relacionadas de la presente invención, se usa cualquier técnica 15 adecuada (por ejemplo, incluyendo, pero sin limitarse a, una o más de las técnicas descritas anteriormente) para generar enzimas de escisión mejoradas (por ejemplo, SEQ ID NO: 221) con dominios heterólogos.

De acuerdo con esto, en algunas formas de realización, se usa la mutagénesis sitioespecífica (por ejemplo, mutagénesis dirigida a cebador usando un kit comercialmente disponible como el kit de 20 mutagénesis Transformer Site Directed (Clontech) para realizar una pluralidad de cambios a lo largo de una secuencia de ácido nucleico con el fin de generar un ácido nucleico que codifica una enzima de escisión de la presente invención. En algunas formas de realización, se llevan a cabo una pluralidad de mutagénesis dirigidas a cebador en tándem para producir un ácido nucleico que codifica la enzima de la presente invención. 25

En formas de realización relacionadas, una pluralidad de etapas de mutagénesis dirigidas a cebador se dirige a una porción seleccionada de una secuencia de ácido nucleico, para producir cambio en una porción seleccionada de una enzima de escisión de la presente invención. En otras formas de realización relacionadas, un ácido nucleico que tiene cambios en una porción seleccionada se recombina con un ácido nucleico que tiene mutaciones en una porción 30 seleccionada diferente (por ejemplo, mediante clonación, diseminación molecular, o cualquiera de los otros procedimientos de recombinación conocidos en la materia), creando por tanto un ácido nucleico que tiene mutaciones en una pluralidad de porciones seleccionadas, y codificando una enzima de escisión de la presente invención. Se pueden introducir las mutaciones en cada porción seleccionada mediante cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, o mediante 35 cualquier combinación de dichos procedimientos, incluyendo, pero sin limitarse a los procedimientos de mutagénesis aleatoria y de mutagénesis sitiodirigida.

Por ejemplo, en una forma de realización ilustrativa relacionada de la presente invención, se genera la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 222 (una secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima de escisión de la SEQ ID NO: 221) realizando una pluralidad de 5 mutagénesis dirigidas a cebador con la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 104 (véase el Ejemplo 7 para la construcción de la SEQ ID NO: 104): En algunas formas de realización relacionadas, se introduce cada mutación usando una reacción de mutagénesis separada. Las reacciones se llevan a cabo secuencialmente de tal manera que el ácido nucleico resultante (SEQ ID NO: 222) contiene todas las mutaciones. En otra forma de realización ilustrativa de la presente 10 invención, se genera la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 222 realizando una pluralidad de mutaciones dirigidas a cebador, tal como se ha descrito anteriormente, en la porción nucleasa (por ejemplo, tal como se representa gráficamente en la Figura 6) de la SEQ ID NO: 111. A continuación se combina la porción nucleasa mutante con la porción “polimerasa” de la SEQ ID NO: 104 en el sitio Not I, usando los procedimientos de recombinación descritos en el Ejemplo 4, 15 creando por tanto un ácido nucleico individual que tiene la SEQ ID NO: 222, y que codifica la enzima de escisión de la SEQ ID NO: 221. En las siguientes mutaciones se produjeron los polipéptidos alterados resultantes y se ensayaron para la actividad de escisión usando cualquier ensayo adecuado (por ejemplo, incluyendo, pero sin limitarse a, los descritos en los Ejemplos 1 y 6). En algunas formas de realización relacionadas, la secuencia de ácido nucleico que codifica la 20 enzima de escisión de la SEQ ID NO: 221 (por ejemplo, SEQ ID NO: 222) se modifica adicionalmente usando cualquier procedimiento adecuado.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar algunas formas de realización y aspectos 25 preferidos de la presente invención, y no deben tomarse como limitantes del alcance de la misma.

En la siguiente memoria descriptiva, se aplican las siguientes abreviaturas: Afu (Archaeoglobus fulgidus); Mth (Methanobacterium thermoautotrophicum); Mja (Methanococcus jannaschii); Pfu (Pyrococcus furiosus); Pwo (Pyrococcus woesei); Taq (Thermos aquaticus); Taq DNAP, DNAPTaq, y Taq Pol I (ADN polimerasa I de T. aquaticus); DNAPStf (el fragmento Stoffel 30 de DNAPTaq); DNAPEc1 (polimerasa I de E. coli); Tth (Thermus thermophilus); Ex. (Ejemplo); Fig. (Figura);˚C (grados centígrados); g (campo gravitatorio); h (hora); min (minuto); oligo (oligonucleótido); rec (reacción); vol (volumen); p/v (peso a volumen); v/v (volumen a volumen); BSA (albúmina de suero bovino); CTAB (bromuro de cetiltrimetil amonio); HPLC (cromatográfica líquida de alta presión); ADN (ácido desoxirribonucleico); p (plásmido); µl (microlitros); ml 35 (mililitros); µg (microgramos); mg (miligramos); M (molar); µM (micromolar); mM (milimolar); pmoles (picomoles); amoles (attomoles); zmoles (zeptomoles); nm (nanómetros); kdal (kilodaltons); DO (densidad óptica); EDTA (ácido etilendiaminotetraacético); FITC (isotiocianato de fluoresceína); SDS (dodecil sulfato sódico); NaPO4 (fosfato sódico); NP-40 (Nonidet P-40); Tris (tris(hidroximetil)-aminometano); PMSF (fluoruro de metilsulfonilo); TBE (Tris-Borato-EDTA, es 5 decir, tampón Tris valorado con ácido bórico en lugar de con HCl y conteniendo EDTA); PBS (solución salina tamponada con fosfato); PPBS (solución salina tamponada con fosfato que contienen PMSF 1 mM); PAGE (electroforesis en gel de acrilamida); Tween (polioxietilensorbitán); ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD); Coriell (Coriell Cell Repositories, Camden, NJ); DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellculturen, Braunschweig, 10 Alemania); Ambion (Ambion, Inc., Austin, TX); Boehringer (Boehringer Mannheim Biochemical, Indianápolis, IN); MJ Research (MJ Research, Watertown, MA; Sigma (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO); Dynal (Dynal A.S., Oslo, Noruega); Gull (Gull Laboratories, Salt Lake City, UT); Epicentre (Epicentre Technologies, Madison, WI); Lampire (Biological Labs., Inc., Coopersberg, PA); MJ Research (MJ Research, Watertown, MA); National Biosciences (National Biosciences, 15 Plymouth, MN); NEB (New England Biolabs, Beverly, MA); Novagen (Novagen, Inc., Madison, WI); Promega (Promega, Corp., Madison, WI); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Clontech (Clontech, Palo Alto, CA) Pharmacia (Pharmacia, Piscataway, NJ); Milton Roy (Milton Roy, Rochester, NY); Amersham (Amersham International, Chicago, IL); and USB (U.S. Biochemical, Cleveland, OH). Glen Research (Glen Research, Sterling, VA); Coriell (Coriell Cell 20 Repositories, Camden, NJ); Gentra (Gentra, Minneapolis, MN); Third Wave Technologies (Third Wave Technologies, Madison, WI); PerSeptive Biosystems (PerSeptive Biosystems, Framington, MA); Microsoft (Microsoft, Redmond, WA); Qiagen (Qiagen, Valencia, CA); Molecular Probes (Molecular Probes, Eugene, OR); VWR (VWR Scientific); Advanced Biotechnologies (Advanced Biotechnologies, INC., Columbia, MD); y Perkin Elmer (también conocida como PE Biosytems y 25 Applied Biosystems, Foster City, CA).

EJEMPLO 1

Cribado rápido de colonias para actividad nucleasa 5’

Las nucleasas 5’ naturales y las enzimas de la presente invención se pueden ensayar 30 directamente para diferentes funciones. Entre estas se incluyen, pero no se limitan a, actividad nucleasa 5’ sobre dianas de ARN o ADN, y especificidad de fondo usando sustratos alternativos que representan estructuras que pueden estar presentes en una reacción de detección de objetivo. Ejemplos de moléculas de ácidos nucleicos que tienen estructuras de prueba adecuadas se muestras en las Figuras 18A-D y en las Figuras 21-24. Las técnicas de cribado descritas a 35 continuación se desarrollaron para caracterizar de manera rápida y eficaz las nucleasas 5’ y para determinar si las nuevas nucleasas 5’ tienen alguna actividad mejorada o deseada. Las enzimas que muestran tasas de ciclación mejoradas sobre dianas de ARN o ADN, o que dan como resultado una escisión reducida independiente de la diana merecen investigación más cuidadosa. Por lo general, las proteínas modificadas desarrolladas mediante mutagénesis aleatoria se 5 ensayaron mediante cribado rápido de las colonias para los sustratos mostrados en las Figuras 18A y 18B. A continuación se realizó la extracción rápida de la proteína, y se llevó a cabo una prueba de la actividad para estructuras alternativas (por ejemplo, como se muestra en las Figuras 18C-D) utilizando el extracto de proteína. Tanto el cribado inicial, como el cribado y caracterización posterior de las enzimas para la actividad potenciada se pueden utilizar otros complejos de 10 escisión, como los esquematizados en la Figuras 21-24. No se pretende que el alcance de la invención quede limitado a las secuencias particulares utilizadas para conformar dichas estructuras de escisión de prueba. Una persona experta en la técnica sabrá la forma en que diseñar y crear ácidos nucleicos para formar estructuras análogas para cribado rápido.

Este orden de la prueba se puede elegir para reducir el número total de ensayos, para 15 ahorrar tiempo y reactivos. El orden de la prueba para la función enzimática no se pretende que constituya una limitación de la presente invención. Aquellos mutantes que muestren tasas de ciclado razonables sobre dianas de ARN o ADN pueden cultivarse a continuación durante toda la noche. Alternativamente, se puede realizar al mismo tiempo cualquier subconjunto o todas las pruebas de escisión. 20

Por conveniencia, cada tipo de cribado rápido puede realizarse en una placa de microvaloración independiente. Por ejemplo, una placa puede configurarse para probar la actividad de RNA INVADER, una placa para probar la actividad de DNA INVADER. Se pueden cribar hasta 90 colonias diferentes en una placa. Las colonias cribadas pueden proceder de diferentes fuentes, como clones de nucleasas 5’ inalteradas (naturales), de una reacción de 25 mutagénesis (por ejemplo, muchas colonias proceden de la misma placa) o de una variedad de reacciones (colonias seleccionadas de muchas placas).

Idealmente, los controles positivos y negativos deben ensayarse en la misma placa que los mutantes, utilizando la misma preparación de reactivos. Un ejemplo de un buen control positivo es una colonia que contiene una enzima no modificada, o una enzima previamente modificada cuya 30 actividad se va a comparar con la de nuevos mutantes. Por ejemplo, si se lleva a cabo una reacción de mutagénesis sobre la construcción Taq DN RX HT (descrita más adelante), la construcción Taq DN RX HT no modificada se escogerá como patrón para coparan los efectos de la mutagénesis sobre la actividad enzimática. También se pueden incorporar enzimas de control adicionales a la prueba de cribado rápido. Por ejemplo, la Tth DN RX HT (descrita más adelante; 35 salvo que se indique otra cosa, las enzimas TaqPol y TthPol de la siguiente discusión se refieren al derivado DN RX HT) también se puede incluir como patrón de la actividad enzimática junto con la Taq DN RX HT. Esto permitiría una comparación de cualesquiera enzimas alterados respecto de dos enzimas conocidas que tienen actividades diferentes. Un control negativo debería analizarse también para determinar los niveles de reacción del fondo, (es decir, la escisión o 5 degradación de la sonda debido a orígenes distintos a las endonucleasas que se están comparando). Un buen control negativo debería ser uno que contuviera únicamente el vector usado en la clonación y la mutagénesis, por ejemplo, colonias que contienen únicamente el vector pTrc99A.

Dos factores que pueden afectar el número de colonias elegidas a partir de una reacción 10 de mutagénesis específica para el cribado inicial rápido son 1) número total de colonias obtenido a partir de la reacción de mutagénesis, y 2) si la reacción de mutagénesis es sitioespecífica o está aleatoriamente distribuida por todo el gen o la región de un gen. Por ejemplo, si solo hay presentes 5-10 colonias en la placa, todas las colonias se pueden probar con facilidad. Si hay cientos de colonias presentes, se pueden analizar un subconjunto de las anteriores Por lo general 15 se ensayan 10-20 colonas de una reacción de mutagénesis sitioespecífica, mientras que se ensayan rutinariamente de 80 a 100 o más colonias procedentes de una reacción de mutagénesis aleatoria individual.

Donde se indica, las nucleasas 5’ descritas en estos ejemplos experimentales se ensayaron como se destaca a continuación. 20

A. Cribado rápido: actividad INVADER de la diana de ARN (Figura 18A)

Se preparó una mezcla de sustrato 2X, comprendiendo MOPS 20 mM, pH 7,5, MgSO4 10 mM, KCl 200 mM, FRET 2 µM – sonda oligo con SEQ ID NO: 223 (5’-Fl-CGCT-cy3-TCTCGCTCGC-3’), oligo INVADER 1 µM con SEQ ID NO: 224 (5’-ACGGAAC- GAGCGTCTTTG-25 3’), y ARN diana 4 nM con SEQ ID NO: 225 (5’-GCG AGC GAGA CAG CGA AAG ACG CUC GUU CCG U-3’). Se dispensaron cinco µl de la mezcla sustrato 2X en cada pocillo de muestra de una placa de microvaloración de 96 pocillos (Low Profile MULTIPLATE 96, M.J. Research, Inc.).

Se prepararon suspensiones celulares repicando colonias independientes (colonias mutantes, controles positivos y controles negativos) y suspendiendo cada una de ellas en 20 µl de 30 agua. Esto se puede realizar convenientemente en un formato de placa de microvaloración de 96 pocillos, utilizando un pocillo por colonia.

Se agregaron cinco ml de la suspensión celular al pocillo de ensayo adecuado, de manera que las condiciones finales de reacción fueron MOPS 10 mM, pH 7,5, MgSO4 5 mM, KCl 10 mM, 1 µM FRET-sonda oligo, oligo INVADER 0,5 µM, y ARN diana 2 nM. Los pocillos se taparon con 10 35 µl de cera líquida CHILLOUT 14 (M.J. Research, Inc.), y las muestras se calentaron a 85˚C durante 3 minutos, y a continuación se incubaron a 59˚C durante 1 hora. Tras la incubación, las placas se leyeron en un lector de fluorescencia de placas Cytofluor utilizando los siguientes parámetros: excitación 485/20, emisión 530/30.

5

B. Cribado rápido: actividad INVADER de la diana de ADN (Figura 18B)

Se preparó una mezcla de sustrato 2X, comprendiendo MOPS 20 mM, pH 7,5, MgSO4 10 mM, KCl 200 mM, FRET 2 µM – sonda oligo con SEQ ID NO: 223 (5’-Fl-CGCT-cy3-TCTCGCTCGC-3’), oligo INVADER 1 µM con SEQ ID NO: 224 (5’-ACGGAACGAGCGTCTTTG-3’), y ARN diana 1 nM con SEQ ID NO: 226 (5’-GCG AGC GAGA CAG CGA AAG ACG CTC GTT 10 CCG T-3’). Se dispensaron cinco µl de la mezcla sustrato 2X en cada pocillo de muestra de una placa de microvaloración de 96 pocillos (MJ Low Profile).

Se prepararon suspensiones celulares repicando colonias independientes (colonias mutantes, controles positivos y controles negativos) y suspendiéndolas en 20 µl de agua, generalmente en un formato de placas de microvaloración de96 pocillos. 15

Se agregaron 5 µl de la suspensión celular al pocillo de ensayo adecuado, de manera que las condiciones finales de reacción fueron MOPS 10 mM, pH 7,5, MgSO4 5 mM, KCl 100 mM, 1 µM FRET-sonda oligo, oligo INVADER 0,5 µM, y ADN diana 0,5 µM. Los pocillos se taparon con 10 µl de cera líquida CHILLOUT 14 (M.J. Research, Inc.), y las reacciones se calentaron a 85˚C durante 3 minutos, y a continuación se incubaron a 59˚C durante 1 hora. Tras la hora de 20 incubación, las placas se leyeron en un lector de fluorescencia de placas Cytofluor utilizando los siguientes parámetros: excitación 485/20, emisión 530/30, ganancia 40, lecturas por pocillo 10.

C. Extracción rápida de proteínas (lisado celular bruto)

Aquellos mutantes que dieron un resultado positivo o inesperado en el ensayo INVADER 25 tanto con ADN como con ARN se analizaron adicionalmente, específicamente para la actividad del fondo en la estructura x o la estructura en horquilla (Figura 18C y D, respectivamente). Se puede emplear un formato de cribado rápido de colonia, como se ha descrito anteriormente. Cambiando de sustrato, simplemente, se pueden llevar a cabo las pruebas de la actividad enzimática de fondo o aberrante. Otro enfoque sería realizar una extracción rápida de proteínas procedentes de un 30 pequeño cultivo de toda la noche de clones positivos, y a continuación ensayar este lisado celular bruto para funciones adicionales de proteína. Se detalla a continuación un procedimiento rápido para extracción de proteína. De dos a cinco ml de LB (conteniendo el antibiótico adecuado para la selección de plásmido; consultar, por ejemplo Maniatis, libros 1, 2 y 3) se inocularon con el volumen restante de la suspensión celular de 20 µl de agua y se incubaron a 37ºC durante toda la 35 noche. Aproximadamente 1,4 ml de cada cultivo se transfirieron a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml; y se microcentrifugaron a máxima velocidad (por ejemplo, 14.000 rpm en una microcentrífuga de sobremesa Eppendorf 5417 a temperatura ambiente durante 3-5 minutos para aglomerar las células. Se retiró el sobrenadante, y el residuo celular se suspendió en 100 µl de tampón TES pH 7,5 (Sigma). Se agregó lisozima (Promega) hasta una concentración final de 0,5 5 µg/µl y las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, las muestras se calentaron a 70˚C durante 10 minutos para inactivar la lisozima, y los residuos celulares se agregaron mediante microcentrifugaron a máxima velocidad durante 5 minutos. Se retiró el sobrenadante, y este lisado celular bruto se usó en los siguientes ensayos de actividad enzimática. 10

D. Cribado rápido: especificidad de fondo de la estructura X del sustrato (Figura 18C)

Las reacciones se llevaron a cabo en las condiciones detalladas a continuación. Se agregó un µl de lisado celular a 9 µl de componentes de reacción hasta un volumen final de 10 µl y concentraciones finales de MOPS 10 mM, pH 7,5, MgSO4 5 mM, KCl 100 mM, 1 µM FRET-sonda 15 oligo (SEQ ID NO: 223), oligo INVADER de estructura X 0,5µlM SEQ ID NO: 227 (5’-ACGGAAC-GAGCGTCTTTCATCTGTCAATC-3’), y diana de ADN 0,5 nM. Los pocillos se taparon con 10 µl de cera líquida CHILLOUT 14 (M.J. Research, Inc.), y las reacciones se calentaron a 85˚C durante 3 minutos, y a continuación se incubaron a 59˚C durante 1 hora. Tras la incubación, las placas se leyeron en un lector de fluorescencia de placas Cytofluor utilizando los siguientes parámetros: 20 excitación 485/20, emisión 530/30, ganancia 40, lecturas por pocillo 10.

E. Cribado rápido: especificidad de fondo de la estructura en horquilla del sustrato (Figura 18D)

Las reacciones se llevaron a cabo en las condiciones detalladas a continuación. Se agregó 25 un µl de lisado celular a 9 µl de componentes de reacción hasta un volumen final de 10 µl y concentraciones finales de MOPS 10 mM, pH 7,5, MgSO4 5 mM, KCl 10 mM, 1 µM FRET-sonda oligo (SEQ ID NO: 223), y diana de ADN 0,5 nM (SEQ ID NO: 226). Los pocillos se taparon con 10 µl de cera líquida CHILLOUT 14 (M.J. Research, Inc.), y las reacciones se calentaron a 85˚C durante 3 minutos, y a continuación se incubaron a 59˚C durante 1 hora. Tras la hora de 30 incubación, las placas se leyeron en un lector de fluorescencia de placas Cytofluor utilizando los siguientes parámetros: excitación 485/20, emisión 530/30, ganancia 40, lecturas por pocillo 10.

F. Ensayos de actividad con dianas IrT1 y IdT (Figuras 24)

Los ensayos de actividad de las nucleasas 5’ se realizaron en 10 µl de una reacción que 35 contenía MOPS 10 mM, pH 7,5, Tween 20 al 0,05%, Nonidet P-40 al 0,05%, ARNt 10 µg/ml, KCl 100 mM y MgSO4 5 mM. La concentración de la sonda (SEQ ID NO: 167) fue 2 mM. Los sustratos (IrT1 (SEQ ID NO: 228) o IdT (SEQ ID NO: 229) a una concentración final de 10 o 1 nM respectivamente) y aproximadamente 20 ng de una enzima, preparada como en el Ejemplo 3, se mezclaron con el tampón de reacción anterior y se taparon con cera líquida Chill Out (MJ 5 Research). Las reacciones se llevaron hasta la temperatura de reacción 57 ˚C, partiendo de la adición de MgSO4, y se incubó durante 10 min. Las reacciones se detuvieron a continuación mediante la adición de 10 µl de formamida al 95% que contenía EDTA 10 mM y violeta de metilo al 0,02% (Sigma). Las muestras se calentaron hasta 90ºC durante 1 minuto antes de someterse a electroforesis mediante un gel de acrilamida desnaturalizante al 20% (reticulado 19:1) con urea 7 10 M, y en tampón Tris-borato 45 mM pH 8,3, EDTA 1,4 mM. A menos que se indique de otro modo, se cargaron en cada hilera 1 µl de cada reacción detenida. A continuación, los geles se escanearon en un escáner para gel fluorescente FMBIO-100 (Hitachi) usando un filtro de 505 nm. La fracción de producto escindido se determinó a partir de las intensidades de las bandas correspondientes al sustrato no cortado y cortado mediante el programa informático FMBIO 15 Analysis (versión 6.0, Hitachi). La fracción de producto escindido no superó el 20% para asegurar que las medidas se aproximaron a las tasas iniciales de rotura. Se define como la velocidad de avance el número de sondas señal escindidas generados por molécula diana por minuto en estas condiciones de reacción (1/min).

20

G. Ensayos de actividad con dianas de estructura X (X) y horquilla (HP) (Figuras 22)

Los ensayos de actividad de las nucleasas 5’ se realizaron en 10 µl de una reacción que contenía MOPS 10 mM, pH 7,5, Tween 20 al 0,05%, Nonidet P-40 al 0,05%, ARNt 10 µg/ml, KCl 100 mM y MgSO4 5 mM. Cada oligo para formación tanto del ensamblaje de la estructura en horquilla (22A, SEQ ID NOS: 230 y 231) como del ensamblaje de la estructura en X (22B, SEQ ID 25 NOS: 230-232) a una concentración final de 1 µM) y aproximadamente 20 ng de la enzima de ensayo preparada como se ha descrito en el Ejemplo 3, se mezclaron con el tampón de reacción anterior y se taparon con cera líquida Chill Out (MJ Research). Las reacciones se llevaron hasta la temperatura de reacción 60 ˚C, partiendo de la adición de MgSO4, y se incubó durante 10 min. Las reacciones se detuvieron a continuación mediante la adición de 10 µl de formamida al 95% que 30 contenía EDTA 10 mM y violeta de metilo al 0,02% (Sigma). Las muestras se calentaron hasta 90ºC durante 1 minuto antes de someterse a electroforesis mediante un gel de acrilamida desnaturalizante al 20% (reticulado 19:1) con urea 7 M, y en tampón Tris-borato 45 mM pH 8,3, EDTA 1,4 mM. A menos que se indique de otro modo, se cargaron en cada hilera 1 µl de cada reacción detenida. A continuación, los geles se escanearon en un escáner para gel fluorescente 35 FMBIO-100 (Hitachi) usando un filtro de 505 nm. La fracción de producto escindido se determinó a partir de las intensidades de las bandas correspondientes al sustrato no cortado y cortado mediante el programa informático FMBIO Analysis (versión 6.0, Hitachi). La fracción de producto escindido no superó el 20% para asegurar que las medidas se aproximaron a las tasas iniciales de rotura. Se define como la velocidad de avance el número de sondas señal escindidas generados 5 por molécula diana por minuto en estas condiciones de reacción (1/min).

H. Ensayos de actividad con la diana IL-6 humana (Figura 10)

Los ensayos de actividad de las nucleasas 5’ se realizaron en reacciones de 10 µl que contenían MOPS 10 mM, pH 7,5, Tween 20 al 0,05%, Nonidet P-40 al 0,05%, ARNt 10 µg/ml, KCl 10 100 mM y MgSO4 5 mM. Las reacciones que comprenden el sustrato de ADN IL-6 contenían diana de ADN IL-6 0,05 nM (SEQ ID NO: 163) y 1 µM de cada sonda (SEQ ID NO: 162) e INVADER (SEQ LID NO: 161) de oligonucleótidos, y se llevaron a cabo a 60˚C durante 30 min. Las reacciones que comprenden la diana de ARN IL-6 (SEQ ID NO: 160) se realizaron en las mismas condiciones, excepto que la concentración de diana de ARN IL-6 fue 1nM y las 15 reacciones se realizaron a 57˚C durante 60 min. Cada reacción contiene aproximadamente 20 ng de la enzima de ensayo preparada como se ha descrito en el Ejemplo 3.

I. Ensayos de actividad con la diana r25mer sintética (Figura 23)

Las reacciones que comprenden la diana de r25mer sintética (SEQ ID NO: 233) se 20 realizaron en las mismas condiciones de reacción (MOPS 10 mM, pH 7,5, Tween 20 al 0,05%, Nonidet P-40 al 0,05%, ARNt 10 µg/ml, KCl 100 mM y MgSO4 5 mM) y 1 µM de cada sonda (SEQ ID NO: 234) e INVADER (SEQ ID NO: 235) de oligonucleótidos, excepto en que la concentración de diana r25mer fue 5 nM y las reacciones se realizaron a 58˚C durante 60 min. Se agregaron a las reacciones 20 ng de cada enzima de ensayo. Las enzimas se prepararon como se ha descrito 25 en el Ejemplo 3.

Cualquiera de los ensayos anteriormente descritos se puede modificar para derivar las condiciones óptimas de actividad enzimática. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo valoraciones enzimáticas para determinar la concentración óptima de la enzima para la máxima actividad de escisión y menor señal de fondo. A modo de ejemplo, y no de limitación, muchas de las enzimas 30 mutantes se ensayaron en cantidades de 10, 20 y 40 ng. Similarmente, también se puede incorporar a las pruebas una temperatura de valoración. Puesto que la modificación de la estructura de una proteína puede alterar sus requisitos de temperatura, se puede probar una gama de temperaturas para identificar la condición más apropiada del mutante en cuestión. [0234] Los ejemplos de los resultados de dichos cribados (usando aproximadamente 20 ng de la 35 enzima mutante) se muestran en las Tablas 3-8, y en las Figuras 12, 14, 15, 19, y 25.

EJEMPLO 2

Clonación y expresión de nucleasas 5’ de ADN polimerasas y polimerasas mutantes

A. ADN polimerasas de Thermus aquaticus y Thermus thermophilus 5

1. Clonación de TaqPol y TthPol

Las ADN polimerasas de tipo A procedentes de eubacterias del género Thermus comparten una extensa identidad de secuencias de proteína (90% en la “región de polimerización”, utilizando el procedimiento de método de Lipman-Pearson en el programa informático para análisis de ADN de DNAStar, WI) y se comportan de manera similar en ensayos 10 de polimerización y de nucleasa. De este modo, los genes de la ADN polimerasa de Thermus aquaticus (TaqPol), Thermus thermophilus (TthPol) y Thermus scotoductus se utilizaron como representantes de esta clase. Los genes de la polimerasa de otros organismos eubacterianos, incluyendo, pero sin limitarse a Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium smegmatis, Thermus thermophilus, Thermus sp., Thermotoga maritima, Thermosipho africanus, y 15 Bacillus stearothermophilus son igualmente adecuados.

a. Aislamiento inicial de TaqPol: mutante TaqA/G

El gen de la ADN polimerasa Taq se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa a partir de ADN genómico procedente de Thermus aquaticus, cepa YT-1 (Lawyer y col, 20 más arriba), usando como cebadores los oligonucleótidos descritos en las SEQ ID NOS:236 y 237. El fragmento de ADN resultante tuvo una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción EcoRI en el extremo 5’ de la secuencia de codificación y una secuencia BglII en el extremo 3’ de la cadena codificante. La escisión mediante BglII deja un saliente o "extremo pegajoso" en 5' que es compatible con el extremo generado mediante BamHI. El ADN amplificado 25 mediante PCR se digirió con EcoRI y BamHI. El fragmento de 2512 pb que contenía la región codificante del gen de la polimerasa se purificó en gel y a continuación se ligó en un plásmido que contenía un promotor inducible.

En una forma de realización de la invención, se utilizó el vector pTTQ18, que contenía el promotor híbrido trp-lac (tac) (M.J.R. Stark, Gene 5:255 [1987]). El promotor tac está controlado 30 por la proteína represora lac de E. coli. La represión permite que la síntesis de producto génico se suprima hasta alcanzarse el nivel de crecimiento bacteriano deseado, en cuyo momento se elimina la represión por adición de un inductor específico, isopropil-b-D-tiogalactopiranósido (IPTG). Dicho sistema permite la expresión controlada de proteínas extrañas que pueden ralentizar o evitar el crecimiento de transformantes. 35

En particular, los promotores bacterianos fuertes, como el Ptac sintético, pueden no suprimirse adecuadamente cuando está presente en un plásmido de copias múltiples. Si se pone una proteína muy tóxica bajo un promotor de ese tipo, la pequeña cantidad que expresión que escapa al control pude, incluso en ausencia de un inductor, dañar a la bacteria. En otra forma de realización de la invención, se contempla otra opción para reprimir la síntesis del producto génico 5 clonado. Un promotor no bacteriano procedente del bacteriófago T7, encontrado en la serie de vectores plásmidos pET-3, se utilizó para expresar los genes clonados de la polimerasa Taq mutante (Studier y Moffatt, J. Mol. Biol., 189:113 [1986]). Este promotor inicia la transcripción únicamente mediante la ARN polimerasa de T7. En una cepa adecuada, como BL21(DE3)pLYS, el gen de la ARN polimerasa del fago T7 se transporta en el genoma bacteriano bajo el control del 10 operador lac. Esta disposición tiene la ventaja de que la expresión del gen multicopia (en el plásmido) es completamente dependiente de la expresión de la ARN polimerasa de T7, que se suprime fácilmente porque está presente en una sola copia.

Estos son únicamente dos ejemplos de vectores que tienen promotores inducibles adecuados. Otros son bien conocidos de una persona experta en la técnica, y no se pretende que 15 las nucleasas potenciadas de la presente invención queden limitadas por la elección del sistema de expresión.

Para ligadura en el vector pTTQ18 el ADN producto de la PCR que contiene la región codificante de la polimerasa Taq (denominada mutTaq por razones debatidas más adelante SEQ ID NO: 238) se digirió con EcoRI y BglII y este fragmento se ligó en condiciones estandarizadas 20 de “extremo pegajoso” (Sambrook y col. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, pp. 1.63-1.69 [1989]) en los sitios EcoRI y BamHI del vector plásmido pTTQ18. La expresión de esta construcción proporciona un producto de fusión traduccional en el que los dos primeros restos de la proteína natural (Met-Arg) se han sustituido por tres procedentes del vector (Met-Asn-Ser), pero el resto de la secuencia de proteína del producto de la PCR 25 permanece inalterado (SEQ ID NO: 239). La construcción se transformó en la cepa JM109 de E. coli, y los transformantes se plaquearon en condiciones de represión incompleta que no permiten el crecimiento de las bacterias que expresan la proteína natural. Estas condiciones de plaqueado permiten el aislamiento de genes que contienen mutaciones preexistentes como las resultantes de la infidelidad de la polimerasa Taq durante el proceso de amplificación. 30

Mediante este protocolo de amplificación/selección, se aisló un clon que contenía un gen mutado de la polimerasa Taq (mutTaq). El mutante se detectó por primera vez por su fenotipo, para el que la actividad nucleasa 5’ estable con la temperatura en un extracto celular bruto fue normal, pero la actividad de polimerización estaba prácticamente ausente (aproximadamente menos del 1% de la actividad de la polimerasa Taq de tipo natural). La actividad polimerasa se 35 determinó mediante reacciones de extensión del cebador. Las reacciones se realizaron en 10 µl de tampón que contenía MOPS 10 mM, pH 7,5, MgSO4 5 mM, KCl 10 mM. En cada reacción, se usaron 40 ng de enzima para extender el cebador (dT)25-30 10 µM en presencia bien del molde poli (A)286 10 µM o poli (dA)273 1 µM, dTTP 45 µM y Fl-dUTP 5 µM a 60˚C durante 30 minutos. Las reacciones se detuvieron con 10 µl de disolución de detención (formamida al 95%, EDTA 10 mM, 5 colorante de violeta de metilo al 0,02%). Las muestras (3 µl) se fraccionaron en un gel de acrilamida desnaturalizante al 15% (reticulado 19:1) y la fracción que incorporaba Fl-dUTP se cuantificó usando un escáner FMBIO-100 para gel fluorescente (Hitachi) equipado con un filtro de emisión de 505 nm.

El análisis de la secuencia de ADN del gen recombinante mostró que tenía cambios en el 10 dominio de la polimerasa que daba por resultado dos sustituciones de aminoácidos: un cambio de A a G en la posición del nucleótido 1394, que origina un cambio de Glu a Gly en la posición del aminoácido 465 (numerado según las secuencias nucleicas y de aminoácidos naturales, SEQ ID NOS:153 y 157), y otro cambio de A a G en la posición del nucleótido 2260, que origina un cambio de Gln a Arg en la posición del aminoácido 754. Puesto que la mutación de Gln a Gly es una 15 posición no conservada, y puesto la mutación de Glu a Arg altera un aminoácido en que está conservado en prácticamente todas las polimerasas de Tipo A conocidas, la última mutación es más posiblemente la responsable de interrumpir la actividad de síntesis de esta proteína. La secuencia de nucleótidos de la construcción se proporciona en la SEQ ID NO: 39. La enzima codificada mediante esta secuencia se denomina como Taq A/G. 20

b. Aislamiento inicial de TthPol

El ADN de la enzima ADN polimerasa procedente de la especie Thermus thermophilus (Tth) se produjo clonando el gen de esta proteína en un vector de expresión y sobreproduciéndolo en células de E. coli. El ADN genómico se preparó a partir de 1 vial de la cepa HB-8 de Thermus 25 thermophilus procedente de ATCC (ATCC nº27634). El gen de la ADN polimerasa se amplificó mediante la PCR utilizando los siguientes cebadores: 5’-CACGAATTCCGAGGCGATGCTTCCGCTC-3’ (SEQ ID NO: 240) y 5’-TCGACGTCGACTAACCCTTGGCGGAAAGCC-3’ (SEQ ID NO: 241). El producto resultante de la PCR se digirió con las endonucleasas de restricción EcoRI y SalI y se insertaron en el vector 30 plásmido pTrc99G digerido con EcoRI/SalI (descrito en el Ejemplo 2C1) para crear el plásmido pTrcTth-1. Esta construcción de polimerasa Tth carece de un único nucleótido que se omitió inadvertidamente por el oligonucleótido 5’, dando como resultado un gen de la polimerasa que estaba fuera del marco. Este error se corrigió mediante mutagénesis sitioespecífica de pTrcTth-1 según se describe en los Ejemplos 4 y 5 mediante el siguiente oligonucleótido 5’-35 GCATCGCCTCGGAATTCATGGTC-3’ (SEQ ID NO: 242), para crear el plásmido pTrcTth-2. La proteína y la secuencia de ácido nucleico que codificaba la proteína se denominan TthPol, y se relacionan respectivamente como las SEQ ID NOS: 243 y 244.

c. Preparación a gran escala de proteínas recombinantes 5

Las proteínas recombinantes se purificaron mediante la siguiente técnica que es un derivado de un protocolo de preparación de la ADN polimerasa Taq (Engelke y col., Anal. Biochem., 191:396 [1990]) como sigue. Células E. coli (cepa JM109) que contenían bien pTrc99A TaqPol, o pTrc99GTthPol se inocularon en 3 ml de LB que contenían 100 mg/ml de ampicilina y crecieron durante 16 h a 37˚C. El cultivo completo de toda la noche se inocularon en 200 ml o 350 10 ml de LB que contenían 100 mg/ml de ampicilina y crecieron a 37˚C con agitación vigorosa hasta una A600 de 0,8. Se agregó IPTG (disolución madre 1 M) hasta una concentración final de 1 mM y el crecimiento continuó durante 16 h a 37˚C.

Las células inducidas se aglomeraron y se pesó el residuo celular. Un volumen equivalente de tampón 2X DG (Tris-HCl 100 mM, pH 7,6, EDTA 0,1 mM) se añadió, y el residuo se suspendió 15 por agitación. Se agregaron cincuenta mg/ml de lisozima (Sigma) hasta una concentración final de 1 mg/ml y las células se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min. Se agregó ácido desoxicólico (disolución al 10%) gota a gota hasta una concentración final del 0,2 % con vortización. Se agregaron un volumen de H2O y un volumen de tampón 2X DG, y la mezcla resultante se sonicó durante 2 minutos en hielo para reducir la viscosidad de la mezcla. Tras la 20 sonicación, se agregó (NHa)2SO4 3 M hasta una concentración final de 0,2 M, y el lisado se centrifugó a 14000 x g durante 20 min a 4˚C. El sobrenadante se eliminó y se incubó a 70˚C durante 60 min en cuyo momento se agregó polietilimina (PEI) al 10% hasta el 0,25%. Tras incubación en hielo durante 30 min., la mezcla se centrifugó a 14.000 x g durante 20 min a 4˚C. En este punto, el sobrenadante se eliminó y la proteína se precipitó mediante la adición de (NH4)2SO4 25 como sigue:

Se agregaron dos volúmenes de (NH4)2SO4 3 M para precipitar la proteína. La mezcla se incubó durante toda la noche a temperatura ambiente durante 16 h y se centrifugó a 14.000 x g durante 20 min a 4˚C. El residuo de proteína se suspendió en 0,5 ml de tampón Q (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM, Tween 20 al 0,1 %). Para la preparación de Mja FEN-1, se agregó 30 (NHa)2SO4 hasta una concentración final de 3 M (saturado ∼75%), la mezcla se incubó en hielo durante 30 min., y la proteína se centrifugó y suspendió como se ha descrito anteriormente.

Las preparaciones de proteína en suspensión se cuantificaron por determinación de la A279 dializada y se almacenó en glicerol al 50%, Tris HCl 20 mM, pH 8,0, KCl 50 mM, Tween 120 al 0,5%, Nonidet P-40 al 0,5%, con 100 µg/ml de BSA. 35

B. ADN polimerasas de Thermus filiformis y Thermus scotoductus

1. Clonación de Thermus filiformis y Thermus scotoductus

Un vial de Thermus filiformis (Tfi) obtenido de la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellculturen, Braunschweig, Alemania, cepa nº4687) se rehidrató en 1 ml de medio Castenholz (medio 86 DSMZ9 y se inoculó en 500 ml de medio Castenholz precalentado a 5 50ºC. El cultivo se incubó a 70ºC con agitación vigorosa durante 48 horas. Tras el crecimiento, las células se cosecharon por centrifugación a 8000 x g durante 10 minutos, el residuo celular se suspendió en 10 ml de TE (TrisHCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM), y las células se congelaron a -20˚C en alícuotas de 1 ml. Se descongeló una alícuota de 1 ml, se agregó lisozima hasta 1 mg/ml, y las células se incubaron a 23ºC durante 30 minutos. Se agregó una disolución de SDS al 20% 10 (docecilsulfato de sodio) hasta una concentración final del 0,5% seguido por extracción con fenol tamponado. La fase acuosa se volvió a extraer con 1:1 fenol:cloroformo, y se extrajo una vez más con cloroformo. Un décimo de volumen de acetato de sodio 3 M, pH 5,0 y 2,5 volúmenes de etanol se agregaron a la fase acuosa, y se mezclaron. El ADN se aglomeró por centrifugación a 20.000 x g durante 5 minutos. El residuo de ADN se lavó con etanol al 70%, se secó al aire y se 15 volvió a suspender en 200 µl de TE y se usó directamente para la amplificación. Se hizo crecer Thermus scotoductus (Tsc, ATCC nº 51532) y el ADN genómico se preparó como se ha descrito anteriormente para Thermus filiformis.

El gen de la ADN polimerasa I procedente de Tfi (número de acceso GenBank nº AF030320) no se pudo amplificar como segmento único. Por tanto, fue clonado en dos fragmentos 20 independientes en el vector de expresión pTrc99a. Los dos fragmentos se solapan y comparten un sitio Not I creado introduciendo una mutación silenciosa en la posición 1308 del marco de lectura abierto (ORF) de Tfi de la ADN polimerasa de los oligonucleótidos de la PCR. La mitad 3’ del gen se amplificó usando el kit Advantage cDNA PCR (Clontech) con los siguientes oligonucleótidos; 5’-ATAGCCATGGTGGAGCGGCCGCTCTCCCGG (SEQ ID NO: 245) y 5’-25 AAGCGTCGACTCAATCCTGCTTCGCCTCCAGCC (SEQ ID NO: 246). El producto de la PCR de esta reacción tenía una longitud aproximada de 1200 pares de bases. Se cortó con las enzimas de restricción Not I y Sal I, y el ADN resultante se unió a un pTrc99a cortado con NotI y SalI para crear pTrc99a-Tfi3’. La mitad 5’ del gen se amplificó como se ha descrito anteriormente con los dos cebadores siguientes; 5’AATCGAATTCACCCCACTTTTTGACCTGGAGG (SEQ ID NO: 247) 30 y 5’-CCGGGAGAGCGGCCGCTCCAC (SEQ ID NO: 248). El fragmento resultante de 1300 pares de bases se cortó con las enzimas de restricción Eco RI y Not I en pTrc99a-Tfi3’ cortado con NotI y EcoRI para producir pTrc99a- TftPol, SEQ ID NO: 249 (la correspondiente secuencia de aminoácidos se lista en SEQ ID NO: 250).

El gen de la ADN polimerasa I procedente de Thermus scotoductus se amplificó usando el 35 kit Advantage cDNA PCR (Clontech) utilizando los dos cebadores siguientes; 5’-ACTGGAATTCCTGCCCCTCTTTGAGCCCAAG (SEQ ID NO: 251) y 5’-AACAGTCGACCTAGGCCTTGGCGGAAAGCC (SEQ ID NO: 252). El producto de la PCR se cortó con las enzimas de restricción Eco RI y Sal I y se ligó en pTrc99a cortado con Eco RI, Sal I para crear pTrc99a-TscPol SEQ ID NO: 253 (la correspondiente secuencia de aminoácidos se 5 lista en SEQ ID NO: 254).

2. Expresión y purificación de Thermus filiformis y Thermus scotoductus

Los plásmidos se transformaron en la cepa BL21 de E. coli deficiente en proteasa (Novagen) o en la cepa JM109 (Promega Corp., Madison, WI) para la expresión de proteína. Se 10 inocularon frascos de 200 µl de LB que contenían 100 µg/ml de ampicilina bien con una colonia individual procedente de una placa LB o de una preparación de depósito de la cepa apropiada. Tras varias horas de crecimiento a 37ºC con agitación vigorosa, se indujeron los cultivos por adición de 200 µl de isotiopropil-galactósido (IPTG) 1 M. El crecimiento a 37ºC continuó durante 16 horas antes de la cosecha. Las células se aglomeraron por centrifugación a 8000 x g durante 15 15 minutos, seguido por suspensión del residuo celular en 5 ml de TEN (TrisHCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, (NaCl 100 mM). 100 µl de lisozima 50 mg/ml se agregaron, y las células se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se agregó ácido desoxicólico (10%) hasta una concentración final del 0,2%. Tras mezcla completa, los lisados celulares se sonicaron durante 2 minutos en hielo para reducir la viscosidad de la mezcla. Los residuos celulares se 20 aglomeraron por centrifugación a 4ºC durante 15 minutos a 20.000 x g. El sobrenadante se eliminó y se incubó a 70˚C durante 30 min tras lo cual se agregó polietilimina (PEI) al 10% hasta el 0,25%. Tras incubación en hielo durante 30 minutos, la mezcla se centrifugó a 20.000 x g durante 20 min a 4˚C. En este punto, se retiró el sobrenadante que contenía la enzima, y la proteína se precipitó mediante la adición de 1,2 g de sulfato de amonio e incubación a 4ºC durante 1 hora. La 25 proteína se aglomeró por centrifugación a 4ºC durante 10 minutos a 20.000 x g. El residuo se volvió a suspender en 4 ml de Tampón A para HPLC (TrisHCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). La proteína se purificó adicionalmente por cromatografía de afinidad usando un cartucho Econo-Pac heparina (Bio-Rad) y un instrumento HPLC Dionex DX 500. Brevemente, el cartucho se equilibró con Tampón A para HPLC, y el extracto de la enzima se cargó en la columna y se eluyó con un 30 gradiente lineal de NaCl (0-2 M) en el mismo tampón. La proteína pura se eluye entre 0,5 y 1 M de NaCl. El pico de la enzima se recogió y dializó en glicerol al 50%, Tris HCl 20 mM, pH 8, KCl 50 mM, Tween 20 al 0,5%, Nonidet P40 al 0,5%, con 100 mg/ml de BSA.

35

C. Generación de mutantes de la polimerasa con actividad polimerasa reducida pero actividad nucleasa 5’ inalterada.

Todos los mutantes generados en la sección C se expresaron y purificaron como se describe en el Ejemplo 2A1C.

5

1. Genes TaqPol modificados: TaqDN

Se construyó una polimerización de un mutante deficiente de la ADN polimerasa Taq denominado TaqDN. La nucleasa TaqDN contiene un resto asparagina en lugar del resto ácido aspártico natural en la posición 785 (D785N).

El ADN que codifica la nucleasa TaqDN se construyó a partir del gen que codificaba Taq 10 A/G en dos rondas de mutagénesis sitiodirigida. En primer lugar, la G en posición 1397 y la G en posición 2264 del gen Taq A/G (SEQ ID NO: 238) se cambiaron a A en cada posición para crear un gen TaqPol natural. En una segunda ronda de mutagénesis, el gen TaqPol natural se convirtió en el gen Taq DN al cambiar la G de la posición 2356 a A. Estas manipulaciones se llevaron a cabo de la siguiente forma. 15

El ADN que codifica la nucleasa Taq A/G se volvió a clonar desde el plásmido pTTQ18 al plásmido pTrc99A (Pharmacia) en un procedimiento en dos etapas. En primer lugar, el vector pTrc99A se modificó eliminando la G en la posición 270 del mapa del pTrc99A, creando el vector de clonación pTrc99G. Con este fin, El ADN del plásmido pTrc99A se cortó con NcoI y los extremos 3’ recesivos se rellenaron con el fragmento Klenow de la polimerasa I de E coli en 20 presencia de los cuatro dNTP a 37˚C durante 15 min. Tras inactivación del fragmento Klenow por incubación a 65ºC durante 10 min, el ADN del plásmido se cortó con EcoRI y los extremos se rellenaron de nuevo con el fragmento Klenow en presencia de los cuatro dNTP a 37˚C durante 15 min. A continuación, el fragmento Klenow se inactivó por incubación a 65ºC durante 10 min. El ADN del plásmido se precipitó con etanol, se recircularizó mediante ligadura, y se usó para 25 transformar células E. coli JM109 (Promega). El ADN del plásmido se aisló de colonias independientes, y se confirmó la delección de la G en posición 270 del mapa de pTrc99A mediante secuenciación del ADN

En una segunda etapa, El ADN que codifica la nucleasa Taq A/G se eliminó del plásmido pTTQ18 mediante EcoRI y SalI, y el fragmento de ADN que contiene el gen de la nucleasa Taq 30 A/G se separó en gel de agarosa al 1% y se aisló con el kit Geneclean II (Bio 101, Vista, CA). El fragmento purificado se ligó en el vector pTrc99G que se había cortado con EcoRI y SalI. La mezcla de ligadura se usó para transformar células E. coli JM109 (Promega) competentes. El ADN del plásmido se aisló de colonias independientes, y la inserción del gen de la nucleasa Taq A/G se confirmó por análisis de restricción utilizando EcoRI y SalI. 35

El ADN del plásmido pTrcAG que transportaba el gen de la nucleasa Taq A/G clonado en el vector pTrc99A se purificó a partir de un cultivo de 200 ml de JM109 durante toda la noche mediante el kit QIAGEN Plasmid Maxi (QIAGEN, Chatsworth, CA) según las instrucciones del fabricante. El ADN del plásmido pTrcAG se sometió a mutagénesis usando dos cebadores mutagénicos; E465 (SEQ ID NO: 255) (Integrated DNA Technologies, Iowa) y R754Q (SEQ ID 5 NO: 256) (Integrated DNA Technologies), y el cebador de selección Trans Oligonucleotide AlwNI/SpeI (Clontech, Palo Alto, CA, nº de catálogo 6488-1) según el protocolo del kit de mutagénesis sitiodirigida TRANSFORMER (Clontech, Palo Alto, CA) para producir un gen TaqPol restaurado natural (pTrcWT).

El ADN del plásmido pTrcWT que transportaba el gen TaqPol natural clonado en el vector 10 pTrc99A se purificó a partir de un cultivo de 200 ml de JM109 durante toda la noche mediante el kit QIAGEN Plasmid Maxi (QIAGEN, Chatsworth, CA) según las instrucciones del fabricante. A continuación, pTrcWT se sometió a mutagénesis mediante el cebador mutagénico D785N (SEQ ID NO: 257) (Integrated DNA Technologies) y el cebador de selección Switch Oligonucleotide SpeI/AIwNI (Clontech, Palo Alto, CA, nº de catálogo 6373-1) según el protocolo del kit de 15 mutagénesis sitiodirigida TRANSFORMER (Clontech, Palo Alto, CA) para crear un ADN que contiene un plásmido que codifica la nucleasa Taq DN. El ADN de la secuencia de nucleótidos de la nucleasa Taq DN se proporciona en la SEQ ID NO: 258; la secuencia de aminoácido de la nucleasa Taq DN se proporciona en la SEQ ID NO: 259.

20

2. Gen TthPol modificado: Tth DN

La construcción Tth DN se creó por mutación del TthPol anteriormente descrito. La secuencia que codifica un ácido aspártico en la posición 787 se cambió mediante mutagénesis específica del emplazamiento como se ha descrito anteriormente a una secuencia que codifica asparagina. 25

La mutagénesis de pTrcTth-2 con el siguiente oligonucleótido:

5’-CAGGAGGAGCTCGTTGTGGACCTGGA-3’ (SEQ ID NO: 260) se llevó a cabo para crear el plásmido pTrcTthDN. La proteína mutante y la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína se denominan, respectivamente, TthDN SEQ ID NOS: 261 y 262.

30

3. Taq DN HT y Tth DN HT

Se agregaron seis marcas del aminoácido histidina (etiquetas his) en el extremo carboxiterminal de Taq DN HT y Tth DN HT. Se llevó a cabo mutagénesis sitiodirigida mediante el kit TRANSFORMER Site Directed Mutagenesis (Clontech) según las instrucciones del fabricante. Los oligonucleótidos mutagénicos utilizados en los plásmidos pTaq DN y pTth DN fueron la 35 secuencia 117-067-03, 5’-TCTAGAGGATCTATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCCTTGGCGGAGAGC-3’ (SEQ ID NO: 263) y 5’-TGCCTGCAGGTCGACGCTAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGACCCTTGG CGGAAAGCC-3’ (SEQ ID NO: 264), secuencia 136-037-05. El cebador de selección Trans Oligo AlwNI/SpeI (Clontech, nº de catálogo 6488-1) se usó en ambas reacciones de mutagénesis. Los 5 genes mutantes resultantes se denominaron Taq DN HT (SEQ ID NO: 265, secuencia de ácido nucleico; SEQ ID NO: 266, secuencia de aminoácidos) y Tth DN HT (SEQ ID NO: 267, secuencia de ácido nucleico; SEQ ID NO: 268, secuencia de aminoácidos).

4. Purificación de Taq DN HT y Tth DN HT 10

Ambas proteínas Taq DN HT y Tth DN HT, se expresaron en la cepa JM109 de E. coli como se ha descrito en el Ejemplo 2B2. Tras la precipitación con sulfato de sodio y la centrifugación, el residuo de proteína se suspendió en 0,5 ml de tampón Q (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM, Tween 20 al 0,1%). La proteína se purificó adicionalmente por cromatografía de afinidad usando resina His-Bind y el kit Buffer (Novagen) según las instrucciones del fabricante. 15 1 ml de esta resina His-Bind se transfirió a una columna, se lavó con 3 volúmenes de columna de agua estéril, se cargó con 5 volúmenes de 1X Charge Buffer, y se equilibró con 3 volúmenes de 1X Binding Buffer. Se añadieron cuatro ml de 1X Binding Buffer a la muestra de proteína, y la disolución con la muestra se cargó en la columna. Tras lavar con 3 ml de 1X Binding Buffer y 3 ml de 1X Wash Buffer, la proteína unida a la etiqueta His fue eludía con 1 ml de 1X Elute Buffer. A 20 continuación, la enzima pura se dializó en glicerol al 50%, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, KCl 50 mM, Tween 20 al 0,5%, Nonidet P40 al 0,5%, y 100 µg/ml de BSA. Las concentraciones de la enzima se determinaron midiendo la absorción a 279 mn.

EJEMPLO 3 25

La actividad nucleasa 5’ dependiente del ARN de TthPol se puede conferir a TaqPol por transferencia de la porción N-terminal del dominio de la ADN polimerasa.

A. Preparación y purificación de estructuras sustratos que tienen una cadena diana de ADN o ARN. 30

Las sondas en dirección 3’ (SEQ ID NO: 162) y en dirección 5’ (SEQ ID NO: 161) y el ADN de la cadena diana de IL-6 (SEQ ID NO: 163) (Figure 10) se sintetizaron en un instrumento PerSeptive Biosystems utilizando química de fosforamidita convencional (Glen Research). La diana quimérica IrT de ADN-ARN etiquetada con biotina en el extremo 5’ (Figura 20A) se sintetizó utilizando la química de ARN 2’-ACE (Dharmacon Research). Los grupos protectores en 2’ se 35 eliminaron mediante hidrólisis catalizada con ácido según las instrucciones del fabricante. Las sondas en dirección 3’ marcadas con 5’-fluoresceína (F1) o 5’-tetracloro-fluoresceína (TET) en sus extremos 5’ se purificaron mediante HPLC de fase inversa utilizando una columna Resource Q (Amersham-Pharmacia Biotech). El nucleótido 648 en la diana de ARN IL-6 (SEQ ID NO: 160) (Figura 10) se sintetizó mediante transcripción no iniciada (runoff) de la ARN polimerasa de T7 del 5 fragmento clonado del ADNc de IL-6 humano (nucleótidos 64-691 de la secuencia publicada en May y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:8957 [1986]) usando un kit Megascript (Ambion). Finalmente, todos los oligonucleótidos se purificaron por separación en un gel desnaturalizante de acrilamida al 20% seguido por escisión y elución de la banda principal. La concentración de oligonucleótidos se determinó midiendo la absorción a 260 mn. La diana IrT etiquetada con biotina se incubó con 10 un exceso de 5 veces de estreptavidina (Promega) en un tampón que contenía MOPS 10 mM; pH 7,5, Tween 20 al 0,05%, NP-40 al 0,05% y ARNt 10 µg/ml a temperatura ambiente durante 10 min.

B. Introducción de sitios de restricción para preparar quimeras

Los sitios de restricción usados para la formación de proteínas quiméricas, descrito más 15 adelante, se eligieron por conveniencia. Los sitios de restricción en el siguiente ejemplo se colocaron estratégicamente para rodear regiones que mediante análisis de estructura cristalina y otros análisis se habían mostrado como regiones funcionales (Véase las Figuras 6, 7, y 19). Se pueden emplear diferentes sitios, tanto naturales como creados mediante mutagénesis dirigida para preparar construcciones similares con otros géneros de la polimerasa Tipo A procedentes de 20 organismos relacionados. Es deseable que todas las mutaciones sean silenciosas con respecto a la función de proteína. Mediante el estudio de la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos de la proteína. Se pueden introducir cambios en la secuencia de ácido nucleico que no tengan efecto sobre la correspondiente secuencia de aminoácidos. Si el cambio en el ácido nucleico requerido afecta un aminoácido, se puede preparar la alteración de forma que el nuevo 25 aminoácido tenga propiedades iguales o parecidas a las del aminoácido sustituido. Si ninguna de estas opciones es posible, se puede probar la enzima mutante para su función para determinar si la alteración del ácido nucleico produjo un cambio en la actividad, especificidad o función de la proteína. No se pretende que la invención quede limitada a los sitios de restricción concretos seleccionados o introducidos para la creación de las enzimas potenciadas de la presente 30 invención.

C. Generación de Tth DN RX HT y Taq DN RX HT

Se llevó a cabo la mutagénesis para introducir 3 sitios de restricción adicionales únicos en el dominio de la polimerasa de ambas enzimas Taq DN HT y Tth DN HT. Se llevó a cabo 35 mutagénesis sitiodirigida mediante el kit Transformer Site-Directed Mutagenesis (Clontech) según las instrucciones del fabricante. Se usó uno de dos cebadores de selección diferentes, Trans Oligo AlwNI/SpeI o Switch Oligo SpeI/A1wNI (Clontech, Palo Alto CA nº de catálogo 6488-1 o nº de catálogo 6373-1) para todas las reacciones de mutagénesis descritas. El oligo de selección utilizado en una reacción dada es dependiente del sitio de restricción de selección presente en el 5 vector. Todos los cebadores mutagénicos se sintetizaron mediante química sintética convencional. Las colonias resultantes se expresaron en la cepa JM109 de E. coli.

Los sitios Not I (posición de aminoácido 328) se crearon usando los cebadores mutagénicos 5’-gccgccaggggcggccgcgtc-caccgggcc (SEQ ID NO: 269) y 5’-gcctgcaggggcggccgcgtgcaccggggca (SEQ ID NO: 270) correspondiente a las cadenas de sentido 10 directo de los genes Taq DN HT y Tth DN HT, respectivamente. Los sitios BstI (posición de aminoácido 382) y NdeI (posición de aminoácido 443) se introdujeron en ambos genes utilizando los cebadores mutagénicos de cadenas de sentido directo 5’-ctcctggacccttcgaacac-cacccc (SEQ ID NO: 271) y 5’-gtcctggcccatatggaggccac (SEQ ID NO: 272). Los plásmidos mutantes se expresaron en exceso y se purificaron usando el kit Qiagen QiaPrep Spin Mini Prep (nº de 15 catálogo 27106). Los vectores se probaron para la presencia de sitios de restricción por secuenciación y cartografía de restricción de ADN. Estas construcciones se denominan Tth DN RX HT (secuencia de ADN SEQ ID NO: 273; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 274) and Taq DN RX HT (secuencia de ADN SEQ ID NO: 275; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 276). 20

D. Quimeras

Las construcciones quiméricas mostradas en la Figura 19 se crearon por intercambio de fragmentos de ADN homólogo definido por los sitios de las endonucleasas de restricción EcoRI (E) y BamHI (B), comunes a ambos genes, el sitio SalI (S) del vector de clonación y los sitios 25 nuevos, NotI (N), BstBI (Bs), NdeI (D) creados en las posiciones homólogas de ambos genes mediante mutagénesis sitiodirigida. En la generación de estas enzimas quiméricas, dos partes distintas de ADN se unieron entre sí para conseguir la construcción final. La parte de ADN de mayor tamaño que contiene el vector plásmido así como parte (o partes de ambas) secuencias Taq o Tth se denominará el “vector”. La parte de ADN más pequeña que contiene secuencias de 30 cualquiera de (o partes de ambas) polimerasas Taq o Tth se denominará la “inserción”.

Todas las enzimas de restricción procedían de New England Biolabs o Promega y se utilizaron en reacciones con el tampón adjunto, según las instrucciones del fabricante. Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen de 20 µl con aproximadamente 500 ng de ADN por reacción, a la temperatura óptima para la enzima específica. Se usó más de una enzima en una 35 reacción única (doble digestión) si las enzimas eran compatibles con respecto a las condiciones del tampón de reacción y la temperatura de reacción. Si las enzimas en cuestión no eran compatibles con respecto a las condiciones del tampón, se usó en primer lugar la enzima que requería la menor condición salina. Tras finalizar dicha reacción, se cambiaron las condiciones del tampón para que fueran óptimas o más apropiadas para la segunda enzima, y se llevó a cabo la 5 segunda reacción. Hay estrategias comunes para la digestión con enzimas de restricción, bien conocidas para las personas expertas en la técnica de la biología molecular (Maniatis, más arriba).

Los fragmentos digeridos con restricción se aislaron en gel para una eficacia de ligadura óptima. Se agregaron dos µl de colorante de carga 10X (glicerol al 50%, 1X TAE, azul de bromofenol al 0,5%) a los 20 µl de reacción. Todo el volumen se cargó y analizó en un gel de 10 agarosa al 1%, 1X TAE, que contenía 1 µl de una disolución de bromuro de etidio al 1% por 100 ml de solución de gel de agarosa. Los fragmentos digeridos se visualizaron con luz UV, y los fragmentos adecuados (determinados por tamaños) se extrajeron del gel. A continuación, estos fragmentos se purificaron usando el kit Qiagen Gel Extractio (nº de catálogo 28706) según las instrucciones del fabricante. 15

Las ligaduras se realizaron en un volumen de 10 µl, utilizando 400 unidades por reacción en enzima T4 DNA Ligase de New England Biolabs (nº de catálogo 202L), con el tampón de reacción adjunto. Las reacciones de ligadura se llevaron a cabo a temperatura ambiente durante 1 hora, con 1 µl de cada uno de los fragmentos purificados por Qiagen (aproximadamente 20-50 ng de cada ADN, dependiendo de la recuperación del aislamiento en gel). A continuación, los 20 productos de la ligadura se transformaron en la cepa JM109 de E. coli y se plaquearon en un medio de crecimiento y selección adecuado, tal como LB con 100 µg/ml de ampicilina para seleccionar transformantes.

Para cada reacción de ligadura, se probaron seis transformantes para determinar si la construcción deseada estaba presente. El ADN plásmido se purificó y aisló mediante el kit 25 QiaPrep Spin Mini Prep, según las instrucciones del fabricante. Las construcciones se verificaron mediante secuenciación de ADN y cartografía de restricción.

La expresión y purificación de las enzimas quiméricas se llevó a cabo de la siguiente forma. Los plásmidos se transformaron en la cepa JM109 de E. coli (Promega). Se indujeron cultivos en fase logarítmica (200 ml) de JM109 con IPTG 0,5 mM (Promega) y se hicieron crecer 30 durante 16 horas más antes de cosecharlas. Los extractos brutos que contenían las proteínas solubles se prepararon por lisis de las células aglomeradas en 5 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, EDTA 1 mM, 0,5mg/ml de lisozima durante la incubación a temperatura ambiente durante 15 minutos. El lisado se mezcló con 5 ml de Tris-HCl 10 mM pH 7,8, KCl 50 mM, EDTA 1 mM, Tween 20 al 0,5%, Nonidet P-40 al 0,5%, se calentó a 72˚C durante 30 minutos, y los residuos celulares 35 se eliminaron por centrifugación a 12.000 x g durante 5 minutos. La purificación final de la proteína se llevó a cabo por cromatografía de afinidad usando un cartucho Econo-Pac heparina (Bio-Rad) y un instrumento HPLC Dionex DX 500. Brevemente, el cartucho se equilibró con Tris-HCl 50mM pH 8 EDTA 1 mM, y un extracto de la enzima dializado contra el mismo tampón se cargó en la columna y se eluyó con un gradiente lineal de NaCl (0-2 M) en el mismo tampón. La proteína 5 purificada mediante HPLC se dializó y almacenó en glicerol al 50% (vol/vol), Tris-HCl 20 mM pH 8,0, KCl 50 mM, Tween 20 al 0,5%, Nonidet P-40 al 0,5%, y 100 µg/ml de BSA. Las enzimas se purificaron hasta homogeneidad según SDS-PAGE, y las concentraciones de la enzima se determinaron midiendo la absorción a 279 mn.

10

1. Construcción de TaqTth(N) y TthTaq(N)

El primer intercambio que se llevó a cabo implicó los dominios de la polimerasa de ambas enzimas. La separación del dominio nucleasa (el extremo N-terminal de la proteína) del dominio polimerasa (el extremo C-terminal de la proteína) se llevó a cabo cortando ambos genes con las endonucleasas de restricción EcoRI y NotI. El fragmento de aproximadamente 900 pares de 15 bases procedente del gen Tth DN RX HT se clonó en los sitios homólogos del gen Taq DN RX HT, y el fragmento de aproximadamente 900 pares de bases procedente del gen Taq DN RX HT se clonó en los sitios homólogos del gen Tth DN RX HT, produciendo dos quimeras, TaqTth(N) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 69; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2) que tenía el dominio nucleasa 5’ Taq DN RX HT y el dominio polimerasa Tth DN RX HT, y TthTaq(N) 20 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 70; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3) que está compuesta por el dominio nucleasa 5’ Tth DN RX HT y el dominio polimerasa Taq DN RX HT,

2. Construcción de TaqTth(N-B)

La construcción Taq DN RX HT se cortó con las enzimas NdeI y BamHI y el fragmento del 25 vector más largo se aisló en gel como se ha detallado anteriormente. La construcción Tth DN RX HT también se cortó con NdeI y BamHI y el fragmento Tth más pequeño (aproximadamente 795 pares de bases) se aisló en gel y se purificó. La inserción Tth NdeI-BamHI se ligó en el vector Taq NdeI-BamHI como se ha detallado anteriormente para generar TaqTth(N-B) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 71; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4). 30

3. Construcción de TaqTth(B-S)

La construcción Taq DN RX HT se cortó con las enzimas BamHI y SalI y el fragmento del vector más largo se aisló en gel como se ha detallado anteriormente. La construcción Tth DN RX HT también se cortó con BamHI y SalI y el fragmento Tth más pequeño (aproximadamente 741 35 pares de bases) se aisló en gel y se purificó. La inserción Tth BamID-SalI se ligó en el vector Taq BamHI-SalI como se ha detallado anteriormente para generar TaqTth(B-S) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 72; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5).

4. Construcción de TaqTth(N-D) 5

La construcción Taq DN RX HT se cortó con las enzimas NotI y NdeI y el fragmento del vector más largo se aisló en gel como se ha detallado anteriormente. La construcción Tth DN RX HT también se cortó con NotI y NdeI y el fragmento Tth más pequeño (aproximadamente 345 pares de bases) se aisló en gel y se purificó. La inserción Tth NotI-NdeI se ligó en el vector Taq NotI-NdeI como se ha detallado anteriormente para generar TaqTth(N-D) (secuencia de ADN SEQ 10 ID NO: 73; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6).

5. Construcción de TaqTth(D-B)

La construcción Taq DN RX HT se cortó con las enzimas NdeI y BamHI y el fragmento del vector más largo se aisló en gel como se ha detallado anteriormente. La construcción Tth DN RX 15 HT también se cortó con NdeI y BamHI y el fragmento Tth más pequeño (aproximadamente 450 pares de bases) se aisló en gel y se purificó. La inserción Tth NdeI-BamHI se ligó en el vector Taq NdeI-BamHI como se ha detallado anteriormente para generar TaqTth(D-B) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 74; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7).

20

6. Construcción de TaqTth(Bs-B)

La construcción Taq DN RX HT se cortó con las enzimas BstBI y BamHI y el fragmento del vector más largo se aisló en gel como se ha detallado anteriormente. La construcción Tth DN RX HT también se cortó con BstBI y BamHI y el fragmento Tth más pequeño (aproximadamente 633 pares de bases) se aisló en gel y se purificó. La inserción Tth NdeI-BamHI se ligó en el vector Taq 25 NdeI-BamHI como se ha detallado anteriormente para generar TaqTth(Bs-B) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 75; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8).

7. Construcción de TaqTth(N-Bs)

La construcción Taq DN RX HT se cortó con las enzimas NotI y BstBI y el fragmento del 30 vector más largo se aisló en gel como se ha detallado anteriormente. La construcción Tth DN RX HT también se cortó con NotI y BstBI y el fragmento Tth más pequeño (aproximadamente 162 pares de bases) se aisló en gel y se purificó. La inserción Tth NotI-BstBI se ligó en el vector Taq NotI-BstBI como se ha detallado anteriormente para generar TaqTth(N-Bs) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 76; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9). 35

8. Construcción de TthTaq(B-S)

La construcción Tth DN RX HT se cortó con las enzimas BamHI y SalI y el fragmento del vector más largo se aisló como se ha detallado anteriormente. La construcción Taq DN RX HT también se cortó con BamHI y SalI y el fragmento Tth más pequeño (aproximadamente 741 pares de bases) se aisló en gel y se purificó. La inserción Taq BamHI-SalI se ligó en el vector Tth 5 BamHI-SalI como se ha detallado anteriormente para generar TthTaq(B-S) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 77; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10).

9. Construcción de Tth Taq(N-B)

La construcción Tth DN RX HT se cortó con las enzimas NotI y BamHI y el fragmento del 10 vector más largo se aisló como se ha detallado anteriormente. La construcción Taq DN RX HT también se cortó con NotI y BamHI y el fragmento Tth más pequeño (aproximadamente 795 pares de bases) se aisló en gel y se purificó. La inserción Taq NotI-BamHI se ligó en el vector Tth NotI-BamHI como se ha detallado anteriormente para generar TthTaq(N-B) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 78; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11). 15

Las actividades de escisión de estas proteínas quiméricas se caracterizaron como se describe en el Ejemplo 1, parte A, y se muestra en la Figura 12 una comparación de la velocidad de escisión de la ciclación sobre una diana de ARN. Como se ha detallado más ampliamente en el apartado de Descripción de la invención, estos datos demuestran que los elementos encontrados en el tercio central de la proteína TthPol son importantes para conferir actividad de escisión 20 dependiente del ARN de tipo TthPol a las proteínas quiméricas que comprenden porciones de TaqPol.

EJEMPLO 4

Las alteraciones que afectan la actividad nucleasa 5’ dependiente del ARN no tienen 25 necesariamente influencia sobre la actividad de la ADN polimerasa dependiente de ARN.

Se sabe que TthPol tiene una plantilla de ARN dependiente de la ADN polimerasa más activa que la de TaqPol (Myers y Gelfand, Biochemistry 30:7661 [1991]). Para determinar si la plantilla de ARN dependiente de la actividad de la nucleasa 5’ de las enzimas ADN Pol I procedentes de Thermus está relacionada con su actividad polimerasa dependiente del ARN, se 30 revertieron las mutaciones D785N y D787N usadas para crear versiones de TaqPol y TthPol deficientes en polimerasa, respectivamente. La actividad polimerasa se restauró de forma similar para las quimeras TaqTth (N) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 79; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12), TaqTth (N-B) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 80; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13), TaqTth(B-S) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 81; secuencia de aminoácidos 35 SEQ ID NO: 14), y las proteínas mutantes TaqPol(W417L/G418K/ E507Q) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 82; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15).

La función polimerasa se restauró en todas las enzimas mutantes anteriormente mencionadas por inserción del fragmento BamHI a SalI de la secuencia no DN natural en la enzima quimérica o mutante seleccionada. Por ejemplo, la construcción mutante TaqTth(N-B) se 5 cortó con la enzima de restricción BamHI (aproximadamente en la posición del aminoácido 593) y con la enzima de restricción SalI (aproximadamente en la posición del aminoácido 840). El fragmento de vector más grande se purificó en gel como se ha descrito en el Ejemplo 3D. La construcción natural TaqPol también se cortó con las endonucleasas de restricción BamHI y SalI, y el fragmento de inserción más pequeño que contenía la secuencia de aminoácidos natural 10 también se purificó en gel. El fragmento de inserción se ligó a continuación en el vector como se ha detallado en el Ejemplo Experimental 3D.

Las actividades polimerasa de estas proteínas se evaluaron por extensión del cebador dT25-35-oligonucleótido con dUTP etiquetada con fluoresceína en presencia de cualquier plantilla poli(dA) o poli(A). Las reacciones de extensión del cebador se llevaron a cabo en 10 µl de tampón 15 que contenía MOPS 10 mM, pH 7,5, MgSO4 5 mM, KCl 100 mM. Se usaron 40 ng de enzima para extender el cebador (dT)25-30 10 µM en presencia bien del molde poli (A)286 10 µM o poli (dA)273, 45 µM, dTTP y Fl-dUTP 5 µM a 60˚C durante 30 minutos. Las reacciones se detuvieron con 10 µl de disolución de detención (formamida al 95%, EDTA 10 mM, colorante de violeta de metilo al 0,02%). Las muestras (3 µl) se fraccionaron en un gel de acrilamida desnaturalizante al 15% y la 20 fracción que incorporaba Fl-dUTP se cuantificó usando un escáner FMBIO-100 para gel fluorescente (Hitachi) equipado con un filtro de emisión de 505 nm como se ha descrito anteriormente.

Como se muestra en la Figura 16, las actividades polimerasas dependientes de ADN son muy similares para todas las construcciones usadas en este experimento, mientras que las 25 actividades polimerasas dependientes de ARN de TthPol, TaqTth(N) y TaqTth(B-S) son al menos 6 veces superiores que las actividades de TaqPol, TaqTth(N-B) y del mutante TaqPol W417L/G418K/E507Q. Del análisis de estos resultados, puede concluirse que la actividad de la ADN polimerasa fuertemente dependiente del ARN de TthPol viene determinada por la mitad C-terminal del dominio de la polimerasa (más o menos, los aminoácidos 593—830) y que las 30 actividades nucleasa 5’ y polimerasa dependientes de ARN no están relacionadas entre sí, y están controladas por regiones distintas.

35

EJEMPLO 5

Mutantes puntuales específicos en Taq DN RX HT desarrollados a partir de la información procedente de los estudios con quimeras.

Los estudios con quimeras (Ejemplo 3, más arriba) sugieren que la parte de la secuencia TthPol que determina su elevada actividad nucleasa 5’ dependiente de ARN comprende la región 5 BstBI-BamHI ubicada aproximadamente entre los aminoácidos 382 y 593. La comparación entre las secuencias de aminoácidos comprendidas entre las regiones BstBI y BamHI de DN RX HT y Taq DN RX HT (SEQ ID NOS:165 y164, respectivamente) reveló solamente 25 diferencias (Figura 13). Entre estos, 12 cambios de aminoácidos fueron conservativos mientras que 13 de las diferencias resultaron en un cambio de carga. Puesto que el análisis de las enzimas quiméricas 10 siguiere que las mutaciones críticas se encuentran en ambas regiones BstBI y BamHI de Tth DN RX HT, se utilizó mutagénesis sitioespecífica para introducir los aminoácidos específicos de Tth DN RX HT en las regiones BstBI-NdeI y NdeI-BamHI de TaqTth(D-B) y TaqTth(N-D) respectivamente.

Se generaron seis sustituciones específicas de Tth DN RX HT en la región BstBI-NdeI de 15 TaqTth(D-B) mediante mutagénesis de aminoácidos simple o doble. De forma similar, se introdujeron 12 cambios de aminoácidos específicos de Tth DN RX HT en la posición homóloga de la región NdeI-BamHI de TaqTth(N-D).

El ADN plásmido se purificó a partir de un cultivo de 200 ml de JM109 durante toda la noche mediante el kit QIAGEN Plasmid Maxi (QIAGEN, Chatsworth, CA) según las instrucciones 20 del fabricante para obtener suficiente material de partida para todas las reacciones de mutagénesis. Todas las mutagénesis específicas del sitio se introdujeron mediante el kit TRANSFORMER Site Directed Mutagenesis (Clontech) según el protocolo del fabricante; se proporciona a continuación información específica de los cebadores mutagénicos utilizados para cada sitio. Se usó uno de dos cebadores de selección diferentes, Trans Oligo AlwNI/SpeI o Switch 25 Oligo SpeI/AlwNI (Clontech, Palo Alto, CA nº de catálogo 6488-1 o nº de catálogo 6373-1) para todas las reacciones de mutagénesis descritas. El oligo de selección utilizado en una reacción dada es dependiente del sitio de restricción presente en el vector. Todos los cebadores mutagénicos se sintetizaron mediante química sintética convencional. Las colonias resultantes fueron la cepa JM109 de E. coli. 30

1. Construcción de TaqTth(D-B) E404H (secuencia de ADN SEQ ID NO: 83; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(D-B) utilizando el cebador mutagénico 240-60-01 5’-gag gag gcg ggg cac cgg gcc gcc ctt-3’ (SEQ ID 35 NO: 277) para introducir la mutación E404H.

2. Construcción de TaqTth(D-B) F413H/A414R (secuencia de ADN SEQ ID NO: 84; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 17)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(D-B) 5 utilizando el cebador mutagénico 240-60-02 5’-ctt tcc gag agg ctc cat cgg aac ctg tgg ggg agg-3’ (SEQ ID NO: 278) para introducir las mutaciones F413H y A414R.

3. Construcción de TaqTth(D-B) W417L/G418K (secuencia de ADN SEQ ID NO: 85; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18) 10

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(D-B) utilizando el cebador mutagénico 240-60-03 5’-ctc- ttc gcc aac ctg ctt aag agg ctt gag ggg gag-3’ (SEQ ID NO: 279) para introducir las mutaciones W417L y G418K.

4. Construcción de TaqTth(D-B) A439R (secuencia de ADN SEQ ID NO: 86; secuencia de 15 aminoácidos SEQ ID NO: 19)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(ND-B) utilizando el cebador mutagénico 240-60-04 5’-agg ccc ctt tcc cgg gtc ctg gcc cat-3’ (SEQ ID NO: 280) para introducir la mutación A439R.

20

5. Construcción de TaqTth(N-D) L451R (secuencia de ADN SEQ ID NO: 87; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(N-D) utilizando el cebador mutagénico 240-60-05 5’-gag gag gcg ggg cac cgg gcc gcc ctt-3’ (SEQ ID NO: 281) para introducir la mutación L451. 25

6. Construcción de TaqTth(N-D) R457Q (secuencia de ADN SEQ ID NO: 88; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(N-D) utilizando el cebador mutagénico 240-60-06 5’-gtg gcc tat ctc cag gcc ttg tcc ctg-3’ (SEQ ID NO: 30 282) para introducir la mutación L415Q.

7. Construcción de TaqTth(N-D) V463L (secuencia de ADN SEQ ID NO: 89; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(N-D) 35 utilizando el cebador mutagénico 240-60-07 5’-ctg tcc ctg gag ctt gcc gag gag atc-3’ (SEQ ID NO: 283) para introducir la mutación V463L.

8. Construcción de TaqTth(N-D) A468R (secuencia de ADN SEQ ID NO: 90; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23) 5

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(N-D) utilizando el cebador mutagénico 240-60-08 5’-gcc gag gag atc cgc cgc ctc gag gcc-3’ (SEQ ID NO: 284) para introducir la mutación A468R .

9. Construcción de TaqTth(N-D) A472E (secuencia de ADN SEQ ID NO: 91; secuencia de 10 aminoácidos SEQ ID NO: 24)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99AtaqTth(N-D) utilizando el cebador mutagénico 240-60-09 5’-gcc cgc ctc gag gag gag gtc ttc cgc-3’ (SEQ ID NO: 285) para introducir la mutación A472E .

15

10. Construcción de TaqTth(N-D) G499R (secuencia de ADN SEQ ID NO: 92; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99AtaqTth(N-D) utilizando el cebador mutagénico 240-60-10 5’-ttt gac gag cta agg ctt ccc gcc atc-3’ (SEQ ID NO: 286) para introducir la mutación G499R . 20

11. Construcción de TaqTth(N-D) E507Q (secuencia de ADN SEQ ID NO: 93; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(N-D) utilizando el cebador mutagénico 276-046-04 5’-atc gcc aag acg caa aag acc ggc aag-3’ (SEQ ID 25 NO: 287) para introducir la mutación E507Q.

12. Construcción de TaqTth(N-D) Y535H (secuencia de ADN SEQ ID NO: 94; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(N-D) 30 utilizando el cebador mutagénico 240-60-11 5’-aag atc ctg cag cac cgg gag ctc acc-3’ (SEQ ID NO: 288) para introducir la mutación Y535H .

35

13. Construcción de TaqTth(N-D) S543N (secuencia de ADN SEQ ID NO: 95; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(N-D) utilizando el cebador mutagénico 240-60-12 5’-acc aag ctg aag aac acc tac att gac-3’ (SEQ ID NO: 289) para introducir la mutación S543N. 5

14. Construcción de TaqTth(N-D) 1546V (secuencia de ADN SEQ ID NO: 96; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 29)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(N-D) utilizando el cebador mutagénico 240-60-13 5’-gag agc acc tac gtg gac ccc ttg ccg-3’ (SEQ ID NO: 10 290) para introducir la mutación 1546V .

15. Construcción de TaqTth(N-D) D551S/I553V (secuencia de ADN SEQ ID NO: 97; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 30)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(N-D) 15 utilizando el cebador mutagénico 240-60-14 5’-att gac ccc ttg ccg agc ctc gtc cac ccc agg acg ggc-3’ (SEQ ID NO: 291) para introducir las mutaciones D551S y I553V.

16. Construcción de TaqDN RX HT W417L/G418K/E507Q (secuencia de ADN SEQ ID NO: 98; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 31) 20

El mutante triple TaqDN RX HT W417L/G418K/ES07Q se preparó por combinación de TaqTth(D-B) W417L/G418K con TaqTth(N-D) E507Q. TaqTth(D-B)W417LlG418K se cortó con las enzimas de restricción NdeI y BamHI, y el fragmento de vector más grande se aisló como se ha detallado en el Ejemplo 3. La construcción TaqTth(N-D) E507Q también se cortó con NdeI y BamHI y el fragmento más pequeño (aproximadamente 795 pares de bases) se aisló en gel y se 25 purificó como se ha detallado en el Ejemplo 3. La inserción NdeI-BamHI se ligó en el vector purificado mediante gel, como se ha detallado en el Ejemplo 3.

17. Construcción de TaqDN RX HT W417L/E507Q (secuencia de ADN SEQ ID NO: 99; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 32) 30

A partir del TaqDN RX HT W417L/G418K/ES07Q descrito anteriormente, el cebador mutagénico 337-O1-02: 5’-etc GCC AAC CTG CTT GGG AGG CTT GAG GGG GAG -3’ (SEQ ID NO: 292) se utilice en una reacción de mutagénesis sitioespecífica para cambiar la K en la posición del aminoácido 418 de nuevo a la que posee el aminoácido natural, G. Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica mediante el kit Transformer Site-Directed Mutagenesis (Clontech) 35 según las instrucciones del fabricante, y como se ha descrito en el Ejemplo experimental 4.

18. Construcción de TaqDN RX HT G418K/E507Q (secuencia de ADN SEQ ID NO: 100; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 33)

A partir del TaqDN RX HT W417L/G418K/E507Q descrito anteriormente, el cebador 5 mutagénico 337-01-01: 5’-CTC TTC GCC AAC CTG TGG AAG AGG CTT GAG GGG -3’ (SEQ ID NO: 293) se utilizó en una reacción de mutagénesis sitioespecífica para cambiar la L en la posición del aminoácido 417 de nuevo a la que posee el aminoácido natural, W. Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica mediante el kit Transformer Site-Directed Mutagenesis (Clontech) según las instrucciones del fabricante, y como se ha descrito en el Ejemplo experimental 4. 10

La expresión y purificación de las proteínas mutantes se llevó a cabo como se ha detallado en el Ejemplo 3, y las actividades de escisión de estas proteínas se caracterizaron como se describe en el Ejemplo 1, parte A. Se muestra en la Figura 14 una comparación de la velocidad de escisión de la ciclación de una selección de dichas proteínas mutantes sobre una diana de ARN. Como se ha detallado más ampliamente en el apartado de Descripción de la invención, estos 15 datos demuestran que los aminoácidos de las regiones 417/418 y el aminoácido 507 son importantes para conferir actividad de escisión dependiente del ARN de tipo TthPol a las proteínas quiméricas que comprenden porciones de TaqPol en combinación con porciones de TthPol que no son capaces independientemente de proporcionar actividad potenciada dependiente del ARN (es decir, las porciones D-B y N-D de Tth). Como se ha descrito en el apartado de Descripción de la 20 invención, se creó la variante Taq DN RX HT que llevaba únicamente las sustituciones W417L, G418K y E507Q. Por comparación de sus velocidades de escisión con las de Tth DN RX HT sobre las del sustrato de ARN IL-6 como se ha descrito en el Ejemplo 1, se ha determinado que dichas mutaciones eran suficientes para incrementar la actividad de Taq DN RX HT al nivel de Tth DN RX HT. La Figura 15 muestra que los mutantes Taq DN RX HT W417L/G418K/E507Q y Taq 25 DN RX HT G418K/E507Q tienen una actividad 1,4 superior a la actividad de Tth DN RX HT y más de 4 veces superior a la de Taq DN RX HT, mientras que el mutante Taq DN IRK HT W417L/E507Q tiene la misma actividad que la enzima, que es aproximadamente 3 veces superior a la de Taq DN RX HT. Estos resultados demuestran que K418 y Q507 de TthPol son aminoácidos particularmente importantes para proporcionar una actividad nucleasa 5’ dependiente 30 del ARN que está potenciada en comparación con TaqPol.

35

EJEMPLO 6

Las propiedades nucleasa 5’ dependiente del ARN de la nucleasa 5’ Taq DN RX HT G418h/E507Q son similares a Tth DN RX HT con respecto a salinidad y temperatura óptimas.

Para determinar si las mutaciones G418K/E507Q causaron cualquier cambio significativo 5 en las propiedades del mutante Taq DN RX HT además del aumento en la tasa de escisión en la diana de ARN, las enzimas Taq DN RX HT G418K/E507Q (SEQ ID NO: 33), Taq DN RX HT (SEQ ID NO276), y Tth DN RX HT (SEQ ID NO: 274) se compararon en el ensayo de la nucleasa 5’ dependiente de la plantilla de ARN en condiciones en que se variaron la temperatura y las concentraciones de sales e iones divalentes. Las cadenas de ADN y la plantilla de ARN en 10 dirección 5’ del sustrato usado en este estudio se unieron a una única molécula IrT (SEQ ID NO: 166) como se muestra en la Figura 20A, y la sonda etiquetada en dirección 3’ (SEQ ID NO: 167) estuvo presente en gran exceso. El extremo 5’ de la cadena diana de ARN se bloqueó con un complejo biotina-estreptavidina para evitar cualquier degradación no específica por la enzima durante la reacción (Lyamichev y col., Science 260:778 [1993], Johnson y col., Science 269:238 15 [1995]. Las tasas de escisión de Taq DN RX HT G418K/E507Q, Taq DN RX HT, y Tth DN RX HT se representaron en función de la temperatura en la Figura 20B. Los círculos cerrados representan la enzima Taq DN RX HT, los círculos abiertos representan la enzima Tth DN RX HT, y las X representan la enzima Taq DN RX HT G418K/E507Q. La diferencia entre las actividades de las enzimas Tth y Taq DN RX HT con el sustrato IrT es incluso mayor que la diferencia 20 encontrada con el sustrato ARN IL-6 cuando se probó en un ensayo de escisión como el descrito en el Ejemplo 1. Las mutaciones G418K/E507Q incrementan la actividad de la enzima Taq más de diez veces y en un 25% en comparación con la enzima Tth. Las tres enzimas muestran un perfil de temperatura típico de la reacción invasiva con amplificación de la señal y tienen la misma temperatura óptima. No se ha encontrado un efecto significativo de las mutaciones G418K/E507Q 25 sobre la actividad nucleasa 5’ dependiente de ADN de Taq DN RX HT en todos los sustratos de ADN análogos a IrT (SEQ ID NO: 168) en las mismas condiciones.

Los efectos de las concentraciones de KCl y MgSO4 sobre la actividad nucleasa 5’ de Taq DN RX HT G418K/E507Q, Taq DN RX HT, y Tth DN RX HT en el sustrato IrT se muestran en las Figuras 20C y D. Las actividades de todas las enzimas tienen dependencias salinas similares con 30 una concentración óptima de KCl de 100 mM para Taq DN RX HT G418K/E507Q y Tth DN RX HT y 50 mM para Taq DN RX HT. La concentración óptima de MgSO4 para todas las enzimas es de aproximadamente 8 mM. El análisis de los datos presentados en la Figura 20 sugiere que las propiedades de Taq DN RIP HT G418K/E507Q son mucho más cercanas a las de Tth DN RX HT que las de Taq DN RX HT confirmando el papel clave de las mutaciones G418K/E507Q en el 35 reconocimiento del sustrato con una diana de ARN.

Para comprender el mecanismo de la reducción en la actividad nucleasa 5’ en presencia de una diana de ARN frente a la de ADN, se determinaron la constante de Michaelis (Km) y la máxima velocidad catalítica (kcat) de las tres enzimas, usando un exceso del sustrato IrT (SEQ ID NO: 166) y la sonda en dirección 3’ (SEQ ID NO: 167) y una concentración limitante de la enzima. 5 Para estas medidas, se ensamblaron reacciones de 10 µl que contenían MOPS 10 mM, pH 7,5, Tween 20 al 0,05%, Nonidet P-40 al 0,05%, 10 µg/ml de ARNt, MgCl2 4 mM, 1 nM of enzima (Taq DN RX HT, Tth DN RX HT, o Taq DN RX HT G418K/E507Q) y concentraciones diferentes (0,125, 0,25, 0,5 o 1 µM) de una mezcla equimolar de la diana IrT y la sonda en dirección 3’. La cinética de escisión de cada enzima y cada concentración de sustrato se determinaron a 46˚C. Las 10 reacciones se detuvieron mediante la adición de 10 µl de formamida al 95% que contenía EDTA 10 mM y violeta de metilo al 0,02% (Sigma). Un µl de cada reacción digerida detenida se repartió en un gen de acrilamida desnaturalizante al 20% (reticulación 19:1), con urea 7 M, y en un tampón Tris-borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM). Los geles se escanearon en un escáner para gel fluorescente FMBIO-100 (Hitachi) usando un filtro de 585 nm. La fracción de producto escindido 15 (determinado a partir de las intensidades de las bandas correspondientes al sustrato no cortado y cortado mediante el programa informático FMBIO Analysis, versión 6.0, Hitachi) se representó en función del tiempo de reacción. Las velocidades de escisión iniciales se determinaron a partir de las pendientes de la parte lineal de las cinéticas de escisión, y se definieron como la concentración de producto cortado por la concentración de la enzima y el tiempo de reacción (en minutos). Se 20 determinaron la constante de Michaelis (Km) y la máxima velocidad catalítica (kcat) de cada enzima para el sustrato IrT a partir de las representaciones gráficas de las velocidades de escisión iniciales en función de la concentración de sustrato.

Se ha encontrado que las tres enzimas tienen valores de Km similares (en el intervalo de 200-300 nM) y valores de kcat de aproximadamente 4 min-1 para Taq DN X HT y Tth DN RX HT y 25 de 9 min-1 para Taq DN RX HT G418K/E507Q. El que las mutaciones G418K/E507Q incrementen la kcat de Taq DN RX HT más de dos veces, pero con poco efecto sobre Km sugiere que las mutaciones colocan el sustrato en una orientación más adecuada para la escisión, más que simplemente aumentar la constante de enlace.

30

EJEMPLO 7

Uso de modelado molecular para potenciar adicionalmente la actividad nucleasa 5' dependiente del ARN

A. Mutantes puntuales

Para desarrollar enzimas con función alterada, se introdujeron cambios en la secuencia 35 mediante mutagénesis sitioespecífica en ubicaciones predeterminadas o mediante mutagénesis aleatoria. Las ubicaciones para la mutagénesis sitioespecífica se escogieron basándose en la evidencia de los estudios con quimeras, bibliografía publicada relevante, y modelado molecular. Siete enzimas mutantes adicionales se desarrollaron a partir de la enzima Tth DN RX HT, y se desarrollaron veinte enzimas mutantes adicionales a partir de la enzima Taq DN RX HT, ambas 5 descritas anteriormente. Algunas de las enzimas mutantes son el resultado de varias reacciones de mutagénesis, esto es, se ha introducido más de un cambio para obtener el producto final. Se llevaron a cabo reacciones de mutación usando la construcción Tth DN R HT (SEQ ID NO: 273) descrita en el Ejemplo 2C2, o la construcción Taq DN RX HT (SEQ ID NO: 275), descrita en el Ejemplo 2Cl salvo que se indique otra cosa. El ADN plásmido se purificó a partir de un cultivo de 10 200 ml de JM109 durante toda la noche mediante el kit QIAGEN Plasmid Maxi (QIAGEN, Chatsworth, CA) según las instrucciones del fabricante para obtener suficiente material de partida para todas las reacciones de mutagénesis. Todas las mutagénesis específicas del sitio se introdujeron mediante el kit TRANSFORMER Site Directed Mutagenesis (Clontech) según el protocolo del fabricante. Se usó uno de dos cebadores de selección diferentes, Trans Oligo 15 AlwNI/SpeI o Switch Oligo SpeI/AIwNI (Clontech, Palo Alto CA nº de catálogo 6488-1 o nº de catálogo 6373-1) para todas las reacciones de mutagénesis descritas. El oligo de selección utilizado en una reacción dada es dependiente del sitio de restricción presente en el vector. Todos los cebadores mutagénicos para tanto la mutagénesis sitioespecífica como para la mutagénesis aleatoria se sintetizaron mediante química sintética convencional. Las colonias resultantes de 20 ambos tipos de reacciones fueron la cepa JM109 de E. coli. El procedimiento de la mutagénesis aleatoria se describe a continuación.

Los mutantes se ensayaron mediante el protocolo de cribado rápido descrito en el Ejemplo 1. A continuación, si se desea un análisis más detallado, o si se necesita una preparación de proteína más grande, la expresión y purificación de las proteínas mutantes se realiza como se ha 25 detallado en el Ejemplo 3.

1. Construcción de Tth DN RX HT H641A, Tth DN RX HT H748A, Tth DN R HT H786A

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el pTrc99A Tth DN RX HT DNA usando el cebador mutagénico 583-001-02: 5’-gent tgc ggt ctg ggt ggc gat gtc ctt ccc ctc-3’ (SEQ 30 ID NO: 294) para introducir la mutación H641A (secuencia de ADN SEQ ID NO: 101; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 34), o el cebador mutagénico 583-001-03: 5’ cat gtt gaa ggc cat ggc ctc cgc ggc ctc cct-3’ (SEQ ID NO: 295) para generar el mutante H748A (secuencia de ADN SEQ ID NO: 102; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 35), o el cebador mutagénico 583-001-04: 5’-cag gag gag ctc gtt ggc gac ctg gag gag-3’ (SEQ ID NO: 296) para generar la enzima mutante H786A 35 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 103; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 36).

2. Construcción de Tth DN RX HT (H786A/G506K/Q509K)

Partiendo del mutante Tth DN RX HT H786A, anteriormente generado, se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica utilizando el cebador mutagénico 604-022-02: 5’-gga gcg ctt gcc tgt ctt 5 ctt cgt ctt ctt caa ggc ggg agg cct-3’ (SEQ ID NO: 297) para generar esta variante denominada "TthAKK", (secuencia de ADN SEQ ID NO: 104; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 37).

3. Construcción de Taq DN RX HT (W417L/G418K/E507Q/H784A)

El oligonucleótido mutagénico 158-029-02: 5’-gag gac cag ctc gtt ggc gac ctg aag gag cat-10 3’ (SEQ ID NO: 298) se utilizó en una reacción de mutagénesis sitioespecífica para introducir la mutación H784A y generar esta construcción denominada "Taq4M" (secuencia de ADN SEQ ID NO: 105; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 38).

4. Construcción de Taq4M H639A, Taq4M R587A, Taq4M G504K y Taq4M G80E 15

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el mutante Taq4M, usando el cebador 473-O10-11: 5’-gaggggcggga- catcgccacggagaccgccagc-3’ (SEQ ID NO: 299) para generar el mutante Taq 4M H639A (secuencia de ADN SEQ ID NO: 106; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 39), cebador 473-010-10: 5’-cag aac atc ccc gtc gcc acc ccg ctt ggg cag-3’ (SEQ ID NO: 300) para generar Taq 4M R587A (secuencia de ADN SEQ ID N0:107; secuencia de aminoácidos SEQ 20 ID NO: 40), cebador 300-081-06: 5’-ggg ctt ccc gcc atc aag aag acg gag aag acc-3’ (SEQ ID NO: 301) para generar Taq 4M G504K (secuencia de ADN SEQ ID NO: 108; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 41), y el cebador 330-088-04: 5’-cta ggg ctt ccc gcc atc aag aag acg caa aag acc ggc-3’ (SEQ ID NO: 302) para generar el mutante Taq 4M G80E (secuencia de ADN SEQ ID NO: 109; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 42). 25

5. Construcción de Taq 4M P88E/P90E y Taq 4M L109F/A110T

Partiendo de Taq 4M descrito anteriormente, se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica utilizando el cebador 473-087-03: 5’-ccg ggg aaa gtc ctc ctc cgt ctc ggc ccg gcc cgc ctt-3’ (SEQ ID NO: 303) para generar las mutaciones P88E/P90E (secuencia de ADN SEQ ID NO: 110; 30 secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 43), o el cebador 473-087-05: 5’-cgg gac ctc gag gcg cgt gaa ccc cag gag gtc cac-3’ (SEQ ID NO: 304) para generar las mutaciones L109F/A110T (secuencia de ADN SEQ ID NO: 111; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 44).

35

6. Construcción de Taq DN RX HT (W417L/G418K/G499R/A502K/I503L/G504K/ E507K/H784A)

Se llevaron a cabo dos reacciones PCR, la primera utilizando la construcción Taq4M (Taq W417L/G418K/G504K/E507Q/H784A) como plantilla. Usando los cebadores 158-84-01 5’-CTCCTCCACGAGTTCGGC-3’ (SEQ ID NO: 305) y 535-33-02 5’-ACC GGT CTT CTT CGT CTT 5 CTT CAA CTT GGG AAG CCT GAG CTC GTC AAA-3’ (SEQ ID NO: 306) se generó un fragmento de 620 pares de bases mediante PCR. Se generó otro producto de 510 pares de bases mediante PCR usando el cebador 535-33-01 5’-AAG ACG AAG AAG ACC GGT AAG CGC TCC ACC AGC-3’ (SEQ ID NO: 307) y el 330-06-03 5’-GTC GAC TCT AGA TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CTT GGC CGC CCG GCG CAT C-3’ (SEQ ID NO: 308). Los dos productos de la PCR 10 se solapan lo suficiente para llevar a cabo una amplificación final mediante PCR recombinante utilizando los cebadores externos 158-84-01 y 330-06-03 para dar el producto de 1182 pares de bases. El producto de la PCR recombinante se digirió con las enzimas de restricción NotI y BamHI según las instrucciones del fabricante para dar un fragmento de 793 pares de bases. El plásmido Taq4M pariente también se digirió con las mismas enzimas y se utilizó como el vector para 15 ligadura. Todos los fragmentos de ADN se purificaron en gel de agarosa antes de la ligadura. El fragmento se ligó en el vector, y se transformó en células JM109, incorporando de esta forma las mutaciones G499R, A502K, I503L, y E507K así como el sitio de la endonucleasa de restricción, AgeI. Esta construcción se denomina "Taq 8M" (secuencia de ADN SEQ ID NO: 112; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45). 20

B. Mutagénesis aleatoria

Se generaron varias enzimas con la función alterada mediante mutagénesis aleatoria. Las regiones de la proteína que son diana de la mutagénesis aleatoria se escogieron sobre la base de datos de modelado molecular y de información de la bibliografía. Se utilizaron distintos cebadores 25 mutagénicos para introducir mutaciones en diferentes regiones de la proteína. Se llevó a cabo mutagénesis aleatoria sobre la variante Taq Taq 4M G504K (Taq DN RX HT W417L/G418K/G504K/E507Q/H784A/) (SEQ ID NO: 108) descrita anteriormente, y los fragmentos mutantes generados en la reacción de mutagénesis se intercambiaron por las regiones homólogas a Taq8M (SEQ ID NO: 112) salvo que se indique otra cosa. 30

También se llevó a cabo la mutagénesis aleatoria sobre Tth DN RX HT H786A (SEQ ID NO: 103) anteriormente descrito. Los fragmentos de PCR generados con la plantilla Tth DN RX HT H786A se intercambiaron por las regiones homólogas en Tth DN RX HT H786A sin alterar.

35

1. Mutantes aleatorios en los restos de aminoácido 500-507 ó 513-520

El primer oligonucleótido mutagénico, 535-054-01: 5’-gga gcg ctt acc ggt ctt (ttg cgt ctt ctt gat ctt ggg aag) cct tag ctc gtc aaa gag-3’ (SEQ ID NO: 309) se usó junto a 158-84-01: 5’-CTC CTC CAC GAG TTC GGC-3’ (SEQ ID NO: 310) para implantar restos aleatorios procedentes de la posición de aminoácido 500 a 507 de variante de la polimerasa Taq denominada Taq DN RX HT 5 W417L/G418K/G504K/E507Q/H784A (SEQ ID NO: 108). Esto se llevó a cabo sintetizando el cebador 535-054-01 de forma que únicamente el 91% de las bases indicadas entre paréntesis quedan inalteradas, mientras que el 9% restante de las bases están en mezcla igualada de los 3 nucleótidos restantes. La secuencia inicial sin alteración de este oligo incluye los cambios G499R, A502K y Q507K. 10

Para generar mutaciones en la región 500-507, el cebador 535-054-01 y el cebador 158-84-01 se utilizaron en una reacción de la PCR, usando el kit Advantage cDNA PCR (Clontech) y la variante Taq anteriormente descrita, como diana. Estos fragmentos de la PCR se analizaron en un gel de agarosa al 1% TAE, se recortaron y purificaron con el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen, Valencia CA, nº de catálogo 28706). El fragmento purificado se cortó con NotI y AgeI y se ligaron 15 en pTaq8M que se había linealizado con NotI y AgeI. Células E. coli JM109 (Promega) se transformaron con los productos ligados. Los clones se probaron como se describe a continuación.

El segundo oligonucleótido mutagénico (usado en una reacción diferente) 535-054-02: 5’-caa aag acc ggt aag cgc (tcc acc agc gcc gcc gtc ctg gag) gcc ctc cgc gag gcc cac-3’ (SEQ ID NO: 20 311) se usó junto a 330-06-03: 5’-GTC GAC TCT AGA TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CTT GGC CGC CCG GCG CAT C-3’ (SEQ ID NO: 312) para implantar restos aleatorios desde los aminoácidos 513-520. Las bases indicadas entre paréntesis del cebador 535-054-02 son también un 91% de tipo natural y un 3% de cada uno de los otros 3 nucleótidos.

Para generar mutaciones en la región 513-520, el cebador 535-054-02 y el cebador 535-25 054-02 se utilizaron en una reacción PCR con Taq DN RX HT W417L/G418K/G504K/ E507Q/H784A (SEQ ID NO: 108) como plantilla, como se ha descrito anteriormente. El fragmento resultante de la PCR se purificó como anteriormente y se cortó con las enzimas de restricción AgeI y BamHI. El fragmento cortado se ligó en la construcción Taq8M, también linealizada con AgeI y BamHI. Células E. coli JM109 se transformaron con los productos ligados. Los clones se probaron 30 como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los mutantes desarrollados a partir de los anteriores incluyen:

Taq DN RX HT W417L/G418K/G499R/A502K/K504N/E507K/H784A (M1-13) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 113; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 46).

Taq DN RX HT W 417UG418K1G499RJL500Il A502K1G504K1Q507H/H784A (M-36) (secuencia 35 de ADN SEQ ID NO: 114; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 47).

Taq DN RX HT W417UG418K1G499RJ A502K1I503UG504K/E507K1T514S/H784A (M2-24) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 115; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 48). Taq DN RX HT W417L/G418K/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/ V518L/H784A (M2-06) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 116; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 49). 5

2. Mutagénesis aleatoria de TthDN RX HT H786A

Para generar mutantes en la región hélice-horquilla-hélice de la enzima TthDN RX HT H786A (SEQ ID NO: 36), se llevaron a cabo dos reacciones PCR distintas utilizando el mutante H786A (SEQ ID NO: 103) como plantilla. Los dos productos de la PCR se solapan lo suficiente 10 para llevar a cabo una reacción PCR recombinante (Higuchi, en PCR Technology, H. A. Erlich, ed., Stockton Press, Nueva York. pp61-70 [1989]). Este producto final de la PCR se intercambió a continuación con la región homóloga del mutante TthDN H786A mediante el uso de los sitios de las enzimas de restricción ubicadas en los extremos del fragmento y contenidos en la secuencia TthDN H786A. 15

Partiendo de TthDN H786A descrito anteriormente, y usando el cebador 604-08-06: 5’-gtc gga ggg gtc ccc cac gag-3’ (SEQ ID NO: 313) y el cebador 390-76-08: 5’-tgt gga att gtg agc gg (SEQ ID NO: 314), se generó un fragmento de 620 pares de bases mediante PCR. Se llevaron a cabo reacciones PCR usando el kit Advantage cDNA PCR (Clontech) según las instrucciones del fabricante. Este producto de la PCR incluye los aminoácidos 1-194. No se introdujeron 20 mutaciones mediante esta reacción. Sin embargo, el sitio de la enzima de restricción EcoRI está presente en el extremo 5’.

Partiendo de TthDN RX HT H786A descrito anteriormente, y usando el cebador mutagénico 604-08-05: 5’-ctc gtg ggg gac ccc tcc gac aac ctc (ccc ggg gtc aag ggc atc ggg gag aag acc gcc) ctc aag ctt ctc aag-3’ (SEQ ID NO: 315) y el cebador 209-74-02: 5’-gtg gcc tcc ata tgg 25 gcc agg ac-3’ (SEQ ID NO: 316) se generó un fragmento PCR de 787 pares de bases. Las reacciones PCR se llevaron a cabo como anteriormente. Este fragmento contiene mutaciones aleatorias, debido a la presencia de del cebador mutagénico, 604-08-05. Las bases indicadas entre paréntesis contenidas en este cebador se sintetizaron de forma que el 91 % de la secuencia es natural, mientras que el 9% adicional está dividido equitativamente entre las 3 bases restantes. 30

Los dos fragmentos PCR se solapan, y se combinaron en una reacción PCR recombinante. Se añadieron los cebadores 390-76-08 y 209-74-02, y se utilizó de nuevo el kit Advantage cDNA PCR kit (Clontech) según las instrucciones del fabricante. Se generó un producto de 1380 pares de bases a partir de esta reacción.

El producto de la PCR recombinante se cortó con las enzimas de restricción EcoRI y NotI 35 según las instrucciones del fabricante para dar un fragmento de 986 pares de bases. TthDN RX HT H786A se preparó por corte con las mismas enzimas. El fragmento se ligó a continuación en el vector, y se transformó en células JM109. Los mutantes nuevos desarrollados a partir de este conjunto de reacciones incluyen:

TthDN RX HT H786A/P197R/K200R (secuencia de ADN SEQ ID NO: 117; secuencia de 5 aminoácidos SEQ ID NO: 50).

TthDN RX HT H786A/K205Y (secuencia de ADN SEQ ID NO: 118; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 51).

TthDN RX HT H786A/G203R (secuencia de ADN SEQ ID NO: 119; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 52). 10

3. Construcción de Taq DN RX HT W417L/G418K/H784A L109F/A110T/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/T514S (Taq SS)

Partiendo del mutante Taq DN RX HT

W417L/G418K/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/T514S/H784A (SEQ ID NO: 115) 15 anteriormente descrito, el cebador 473-087-05: 5’-cgg gac ctc gag gcg cgt gaa ccc cag gag gtc cac-3’ (SEQ ID NO: 317) se usó junto con el cebador de selección apropiado en una reacción de mutagénesis sitioespecífica para incorporar las mutaciones L109F y A110T para generar esta enzima, denominada "TaqSS" (secuencia de ADN SEQ ID NO: 120; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 53). 20

4. Construcción de Taq DN RX HT W417L/G418L/H784A P88E/P90E/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/T514S

Partiendo del mutante Taq DN RX HT

W417L/G418K/G499R/A502K/I503L1G504K1E507K/T514S/H784A (SEQ ID NO: 115) 25 anteriormente descrito, el cebador 473-087-03: 5’-ccg ggg aaa gtc ctc ctc cgt ctc ggc ccg gcc cgc ctt-3’ (SEQ ID NO: 318) se usó junto con el cebador de selección apropiado en una reacción de mutagénesis sitioespecífica para generar las mutaciones P88E y P90E (secuencia de ADN SEQ ID NO: 121; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 54) para generar esta enzima.

30

5. Mutagénesis aleatoria de TaqSS

Se utilizó mutagénesis aleatoria para introducir cambios adicionales en la región hélice-horquilla-hélice del mutante TaqSS (SEQ ID NO: 120). La mutagénesis se realizó como se ha descrito en el ejemplo 9 anterior. En la primera etapa, se generaron dos productos de PCR diferentes pero solapantes. Uno de los productos de la PCR, generado con los oligos 390-76-08 35 (SEQ ID NO: 314), y 604-08-04: 5’-gtc gga ctc gtc acc ggt cag ggc-3’ (SEQ ID NO: 319) incorpora el sitio EcoRI en el fragmento, pero no incorpora ninguna mutación. El segundo producto de la PCR utiliza el cebador mutagénico 604-08-03: 5’- ctg acc ggt gac gag tcc gac aac ctt (ccc ggg gtc aag ggc atc ggg gag aag acg gcg) agg aag ctt ctg gag-3’ (SEQ ID NO: 320) y el cebador 209-74-02 (SEQ ID NO: 316). Este fragmento contiene mutaciones puntuales aleatorias, y cuando se 5 combina mediante PCR recombinante con el primer fragmento, se puede cortar con las enzimas de restricción EcoRI y NotI, y ligarse en la construcción TaqSS, también cortado con EcoRI y NotI. La construcción ligada se transformó a continuación en JM109. Las colonias se cribaron como se describe a continuación. Las enzimas desarrolladas a partir de esta mutagénesis incluyen:

TaqSS K198N (secuencia de ADN SEQ ID NO: 112; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 55). 10 TaqSS A205Q (secuencia de ADN SEQ ID NO: 123; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 56).

TaqSS I200M/A205G (secuencia de ADN SEQ ID NO: 124; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 57).

TaqSS K203N (secuencia de ADN SEQ ID NO: 125; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 58). TaqSS T204P (secuencia de ADN SEQ ID NO: 126; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 59). 15

6. Construcción de TaqSS R677A

Para generar enzimas con cambios de secuencia tanto en la región del arco como en la región de la polimerasa, se generaron mutaciones puntuales específicas adicionales en TaqSS. Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica como se ha descrito anteriormente con el 473-060-20 10: 5’-tag ctc ctg gga gag ggc gtg ggc cga cat gcc-3’ (SEQ ID NO: 321) para generar el mutante TaqSS R677A (secuencia de ADN SEQ ID NO: 127; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 60).

7. Construcción de TaqTthAKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 128; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 61) y TthTaq5M (secuencia de ADN SEQ ID NO: 129; secuencia de 25 aminoácidos SEQ ID NO: 62)

Los mutantes quiméricos TaqTthAKK y TthTaq5M se generaron por corte de Tth DN RX HT (H786A/G506K/Q509K) (SEQ ID NO: 104; abreviado aquí TthAKK) o Taq 4M G504 (SEQ ID NO: 108; abreviado aquí Taq 5M) con las endonucleasas de restricción EcoRI y NotI. Los fragmentos de inserción más pequeños, así como los fragmentos más grandes del vector se 30 purificaron en gel como se detalla en el Ejemplo 3D, y los fragmentos de inserción se intercambiaron entre los dos mutantes y se ligaron como se ha descrito en el Ejemplo 3D. El cribado y verificación de la secuencia de la construcción también se realizaron como en el Ejemplo 3D.

35

EJEMPLO 8

Potenciación de la actividad nucleasa 5’ dependiente del ARN en otras polimerasas

La información obtenida de las recombinaciones, mutagénesis y modelado de TaqPol/TthPol se utilizó para preparar mutaciones comparables en otras ADN polimerasas y se examinaron los efectos de las actividades de escisión de dichas enzimas. Las ADN polimerasas 5 de Thermus filiformus (TfiPol) y Thermus scotoductus (TscPol) se clonaron y purificaron como se ha descrito en el Ejemplo 2. La mutagénesis de estas dos proteínas se describe a continuación.

A. Construcción de TfiPolDN2M

La mutagénesis de pTrc99a-TfiPol (SEQ ID NO: 249) se realizó con el kit QuikChange 10 para mutagénesis sitiodirigida (Stratagene) según el protocolo del fabricante. La mutación P420K se preparó con los dos oligonucleótidos siguientes; 5’-CTTCCAGAACCTCTTTAAACGGCTTTCCGAGAAG (SEQ ID NO: 322) y 5’-CTTCTCG- GAAAGCCGTTTAAAGAGGTTCTGGAAG (SEQ ID NO: 323). La mutación E507Q se preparó con los dos oligonucleótidos siguientes; 5’-CCGGTGGGCCGGACGCAGAAGACGGGCAAGC (SEQ 15 ID NO: 324) y 5’-GCTTGCCCGTCT- TCTGCGTCCGGCCCACCGG (SEQ ID NO: 325). La mutación D785N se preparó con los dos oligonucleótidos siguientes; 5’-CTCCTCCAAGTGCACAACGAGCTGGTCCTGG (SEQ ID NO: 326) and 5’-CCAGGACCAGCTCGTTGT-GCACTTGGAGGAG (SEQ ID NO: 327). El plásmido que contiene las tres mutaciones se denominó pTrc99a-TfiPolDN2M, (secuencia de ADN SEQ ID NO: 130; 20 secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 63).

B. Construcción de TscPolDN2M

La mutagénesis de pTrc99a-TscPol (SEQ ID NO: 253) se realizó con el kit QuikChange para mutagénesis sitiodirigida (Stratagene) según el protocolo del fabricante. La mutación E416K 25 se preparó con los dos oligonucleótidos siguientes; 5’-GCCGCCCTCCTGAAGCGGCTTAAGGG (SEQ ID NO: 328) y 5’-CCCTTAAGCCGCTTCAGGAG-GGCGGC (SEQ ID NO: 329). La mutación E505Q se preparó con los dos oligonucleótidos siguientes; 5’-ATCGGCAA- GACGCAGAAGACGGGCAAGC (SEQ ID NO: 330) y 5’-GCTTGCCCGTCTTCTGCGTCTTGCCGAT (SEQ ID NO: 331). La mutación D783N se preparó 30 con los dos oligonucleótidos siguientes; 5’-TTGCAGGTGCACAACGAACTGGTC- CTC (SEQ ID NO: 332) and 5’-GAGGACCAGTTCGTTGTGCACCTGCAA (SEQ ID NO: 333). El plásmido que contiene las tres mutaciones se denominó pTrc99a-TscPolDN2M, (secuencia de ADN SEQ ID NO: 131; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 64).

35

C. Quimeras de los mutantes Tsc, Tfi, Tth y Taq

1. Construcción de TfiTth AKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 132; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 65), TscTthAKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 133; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 66), TfiTaq5M (secuencia de ADN SEQ ID NO: 134; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 67) and TscTaq5M (secuencia de ADN SEQ ID NO: 135; secuencia 5 de aminoácidos SEQ ID NO: 68)

Para generar enzimas quiméricas entre Tth DN RX HT (H86A/G506K/Q509K) (abreviado aquí TthAKK, SEQ ID NO: 104) o Taq 4M G504 (abreviado aquí Taq 5M, SEQ ID NO: 108), y Tfi DN 2M (SEQ ID NO: 130), o Tsc DN 2M (SEQ ID NO: 131), se introdujeron sitios adicionales de endonucleasas de restricción mediante mutagénesis sitioespecífica en los mutantes Tfi y Tsc 10 nombrados. Se utilizaron los cebadores mutagénicos 700-011-01 5’-cag acc atg aat tcc acc cca ctt ttt gac ctg gag-3’ (SEQ ID NO: 334) y 700-011-02 5’-gtg gac gcg gcc gcc cga ggc cgc cgc cag ggc cag-3’ (SEQ ID NO: 335) para introducir un sitio EcoRI en la posición del aminoácido 1 y un sitio NotI en la posición del aminoácido 331 en Tfi DN 2M. Se utilizaron los cebadores mutagénicos 700-011-03 5’-cag acc atg aat tcc ctg ccc ctc ttt gag ccc aag-3’ (SEQ ID NO: 336) y 700-011-04 5’-15 gta aac cgc gcc gcc cca ggc ggc ggc caa ggc gtt-3’ (SEQ ID NO: 337) para introducir un sitio EcoRI en la posición del aminoácido 1 y un sitio NotI en la posición del aminoácido 327 in Tsc DN 2M. Se llevaron a cabo reacciones PCR usando el kit Advantage cDNA PCR (Clontech) según las instrucciones del fabricante y cualquiera de Tfi DN 2M o Tsc DN 2M como diana, con sus correspondientes cebadores. Los productos de la PCR de 1017 pares de bases se cortaron con 20 EcoRI y NotI para dar fragmentos de inserción de 993 pares de bases que se purificaron en gel como se ha descrito en el Ejemplo 3D. Los mutantes Taq4M G504K (SEQ ID NO: 108) y Tth DN RX HT (H786A/G506K/Q509K) (SEQ ID NO: 104) también se cortaron con EcoRI y NotI, y el fragmento de vector más grande se aisló como se ha detallado anteriormente. Las ligaduras se llevaron a cabo como se ha detallado en el Ejemplo 3D, así como el cribado y la verificación de la 25 construcción nueva.

EJEMPLO 9

Enzimas adicionales que tienen potenciada la actividad nucleasa 5’ dependiente del ARN

Generación de Tfi DN 2M(∆N) 30

Para facilitar las últimas etapas de clonación, se retiró un sitio de enzima de restricción endógena (Not I) de la región polimerasa desde el gen TfiPolDN2M (SEQ ID NO: 130 descrito en el Ejemplo 8A), y se insertó un único sitio Not I en una posición más ventajosa.

El sitio de Not I endógeno se eliminó de la siguiente forma. Se utilizó el kit QUIKCHANGE de mutagénesis sitiodirigida de (Stratagene) según las instrucciones del fabricante con los 35 cebadores mutagénicos 5’-gag-gtg-gag-cgg-ccc-ctc-tcc-cgg-gtc-ttg (SEQ ID NO: 338) y 5’-caa-gac-ccg-gga-gag-ggg-ccg-ctc-cac-ctc (SEQ ID NO: 339). La nueva construcción se denominó Tfi DN 2M(∆N) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 340; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 341).

Generación de Tfi DN 2M(N), Tsc DN 2M(N) 5

Para implantar un sitio NotI único (en la posición del aminoácido 328) en Tfi DN 2M(∆N) (SEQ ID NO: 340), los cebadores 886-088-07 (SEQ ID NO: 342) 5’-tgg-cgg-cgg-cct-cgg-gcg-gcc-gcg-tcc-acc-ggg-caa-ca-3’ y 700-010-03 5’-ctt-ctc-tca-tcc-gcc- aaa-aca-gcc (SEQ ID NO: 343) en una reacción de PCR con Tfi DN 2M(∆N) (SEQ ID NO: 340) como plantilla. El fragmento resultante de la PCR se purificó y cortó con las enzimas de restricción NotI y SalI. El fragmento cortado se 10 ligó a continuación en la construcción TfiTthAKK (SEQ ID NO: 132, descrita en el ejemplo 8,C) que también se digirió con NotI y SalI. La nueva construcción se denominó Tfi DN 2M(N) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 345; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 346).

Para introducir un sitio de la endonucleasa de restricción Not I en el mutante TscPol DN 2M (anteriormente descrito en el Ejemplo 8B anterior), se llevó a cabo PCR con los cebadores: 15 886-088-05 (SEQ ID NO: 344) 5’-tgg-ccg-ccg-cct-ggg-gcg-gcc-gcg-ttt- acc-ggg-cgg-ag-3’ y 700-010-03 (SEQ ID NO: 343) 5’-ctt-ctc-tca-tcc-gcc-aaa-aca-gcc-3’ con TscPolDN2M (SEQ ID NO: 131) como plantilla. El fragmento NotI-SalI digerido del producto de la PCR se subclonó a continuación en el vector TscTthAKK NotI y SalI (SEQ ID NO: 133). Esta construcción se denomina "Tsc DN 2M(N)" (secuencia de ADN SEQ ID NO: 347; secuencia de aminoácidos SEQ 20 ID NO: 348).

Generación de Tfi DN 2M(N)AKK y Tsc DN2M(N)AKK

Para generar el conjunto de mutaciones "AKK" (G504K/E507K/H784A/D785N), se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el mutante Tfi DN 2M(N) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 25 345), usando los cebadores 959-022-01 a -04: 5’-ggc-ctc-acc-ccg- gtg-aag-cgg-acg-aag-aag-acg-ggc-aag-cgc-3’, 5’-gcg-ctt-gcc-cgt-ctt-ctt-cgt-ccg-ctt-cac-cgg-ggt-gag-gcc-3’, 5’-ctc-ctc- ctc-caa-gtg-gcc-aac-gag-ctg-gtc-ctg-3’, 5’-cag-gac-cag-ctc-gtt-ggc-cac-ttg-gag-gag-gag-3’ (SEQ ID NO: 354-357) para generar el mutante Tfi 2M(N)AKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 358; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 359). Esta construcción se denominó "TfiAKK". 30

Para introducir el conjunto de mutaciones "AKK" (G502K/E505K/H782A/D783N), en la construcción TscDN 2M (N), (secuencia de ADN SEQ ID NO: 347) los cebadores 959-022-05 a -08: 5’-ggg-ctt-ccc-gcc-atc-aag-aag-acg-aag-aag-acg-ggc-aag-cgc-3’, 5’-gcg-ctt-gcc-cgt-ctt-ctt-cgt-ctt-ctt-gat-ggc-ggg-aag-ccc-3’, 5’-atg-ctt-ttg-cag-gtg-gcc-aac-gaa-ctg-gtc-ctc-3’, 5’-gag- gac-cag-ttc-gtt-ggc-cac-ctg-caa-aag-cat-3’ (SEQ ID NO: 360-363) se usaron para generar el mutante 35 Tsc2M(N)AKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 364; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 365). Esta construcción se denominó "Tsc AKK".

Construcción de mutantes puntuales mediante la PCR recombinante

Construcción de TthAKK(P195A) y TthAKK(P195K) 5

Para introducir mutaciones en la posición de aminoácido 195 (cualquiera de P195A o P195K) en el dominio nucleasa de la construcción TthAKK, el cebador mutagénico 785-073-01 (P195A) 5’-ccc-tcc-gac-aac-ctc-gcc-ggg-gtc-aag-ggc-atc-3’ (SEQ ID NO: 370) o 785-073-02 (P195K) 5’-ccc-tcc-gac-aac-ctc-aag-ggg-gtc-aag-ggc-atc-3’ (SEQ ID NO: 371) y el cebador 209-074-02:5’-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3’ (SEQ ID NO: 316) se usaron en una reacción PCR 10 para generar un fragmento de 787 pares de bases. Otro fragmento de PCR se obtuvo usando los cebadores: 390-076-08 5’-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 785-073-03 5’-gag-gtt-gtc-gga-ggg-gtc-3’ (SEQ ID NO: 372) en una reacción con la misma plantilla.

Los dos fragmentos PCR se solapan, y se combinaron en una reacción PCR recombinante. Se agregaron los cebadores externos 390-076-08 y 209-074-02, y se utilizó el kit 15 Advantage cDNA PCR kit (Clontech) según las instrucciones del fabricante. Se generó un producto de 1380 pares de bases a partir de esta reacción.

El producto de la PCR recombinante se cortó con las enzimas de restricción EcoRI y NotI para dar un fragmento de 986 pares de bases. La construcción TthAKK se preparó por corte con las mismas enzimas. El fragmento se ligó a continuación en el vector, y se transformó en células 20 JM109. Los mutantes nuevos desarrollados a partir de este conjunto de reacciones incluyen: TthAKK(P195A) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 373; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 374) y TthAKK(P195K) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 375; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 376).

25

Construcción de TthAKK(N417K/L418K)

Se utilizó el mismo enfoque para construir TthAKK(N417K/L418K). Se generaron dos fragmentos PCR solapantes a partir de cebadores mutagénicos. 785-73-07 5’-gag-agg-ctc-cat-cgg-aag-aag-ctt-aag-cgc-ctc-gag-3’ (SEQ ID NO: 377) y 700-10-03 5’-ctt-ctc-tca-tcc-gcc-aaa-aca-gcc-3’ (SEQ ID NO: 343), y los cebadores 158-084-01 5’-ctc-ctc-cac-gag-ttc- ggc-3’ (SEQ ID NO: 30 310) y 785-73-08 5’-ccg-atg-gag-cct-ctc-cga-3’ (SEQ ID NO: 378). Los dos productos se combinaron y amplificaron con los cebadores externos 700-10-03 y 158-084-01. El producto de PCR resultante se cortó con las enzimas de restricción NotI y BamHI y se ligó en la construcción TthAKK precortada con NotI/BamHI. Este mutante se denominó TthAKK(N417K/LA 18K) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 379; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 380). 35

Construcción de mutantes puntuales TthAKK adicionales mediante mutagénesis sitiodirigida

Construcción de TthAKK(P255L)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre la construcción TthAKK usando el cebador mutagénico 886-049-05 y 886-049-06: 5’-gtg-cgc-acc-gac-ctc-ctc-ctg-gag-gtg-gac-ctc-3’ 5 (SEQ ID NO: 381), 5’-gag-gtc-cac-ctc-cag-gag-gag- gtc-ggt-gcg-cac-3’ (SEQ ID NO: 382) para generar TthAKK(P255L) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 383; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 384).

Construcción de TthAKK(F311Y) 10

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre la construcción TthAKK usando el cebador mutagénico 886-049-09 y 886-049-10: 5’-ggg-gcc-ttc-gtg-ggc-tac-gtc-ctc-tcc-cgc-ccc-3’ (SEQ ID NO: P385), 5’-ggg-gcg-gga-gag-gac-gta- gcc-cac-gaa-ggc-ccc-3’ (SEQ ID NO: 386) para generar TthAKK(F311Y) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 387; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 388). 15

Construcción de TthAKK(N221H/R224Q)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre la construcción TthAKK usando el cebador mutagénico 886-049-01 y 886-049-02: 5’-gaa-aac-ctc-ctc-aag-cac-ctg-gac-cag-gta-aag-cca-gaa-aac-3’ (SEQ ID NO: 389), 5’-gtt-ttc-tgg-ctt- tac-ctg-gtc-cag-gtg-ctt-gag-gag-gtt-ttc-3’ (SEQ 20 ID NO: 390) para generar TthAKK(N221H/R224Q) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 391; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 392).

Construcción de TthAKK(R251H)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre la construcción TthAKK usando el 25 cebador mutagénico 886-049-03 y 886-049-04: 5’-gag-ctc-tcc-cgg-gtg-cac-acc-gac-ctc-ccc-ctg-3’ (SEQ ID NO: 393), 5’-cag-ggg-gag-gtc-ggt-gtg-cac-ccg- gga-gag-ctc-3’ (SEQ ID NO: 394) para generar TthAKK(R251H) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 395; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 396).

30

Construcción de TthAKK(P255L/R251H)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre la construcción TthAKK(P255L) usando el cebador mutagénico 886-088-01 y 886-088-02: 5’-gag-ctc-tcc-cgg-gtg-cac-acc-gac-ctc-ctc-ctg-3’ (SEQ ID NO: 397), 5’-cag-gag-gag-gtc- ggt-gtg-cac-ccg-gga-gag-ctc-3’ (SEQ ID NO: 398) para generar TthAKK(P255L/R251H) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 399; secuencia de 35 aminoácidos SEQ ID NO: 400).

Construcción de Tth AKK L429V (secuencia de ADN SEQ ID NO: 401; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 402)

Se llevó a cabo mutagénesis con aleatorización en la región de la palma de la construcción 5 Tth AKK utilizando el cebador mutagénico 680-79-02 5’-ctc cat cgg aac ctc ctt [aag cgc ctc gag ggg gag gag aag ctc ctt tgg] ctc tac cac gag gtg-3’ (SEQ ID NO: 403) y el cebador inverso 680-79-04 5’-AAG GAG GTT CCG ATG GAG-3’ (SEQ ID NO: 404) para introducir las mutaciones aleatorias en la región de la Palma. Los paréntesis indican una síntesis del 91% de las bases mostradas y un 3% del resto de bases. 10

Construcción de Tth AKK E425V (secuencia de ADN SEQ ID NO: 405; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 406)

Se llevó a cabo mutagénesis con aleatorización en la región de la palma de la construcción Tth AKK utilizando el cebador mutagénico 680-79-02 5’-ctc cat cgg aac ctc ctt [aag cgc ctc gag 15 ggg gag gag aag ctc ctt tgg] ctc tac cac gag gtg-3’ (SEQ ID NO: 403) y el cebador inverso 680-79-04 5’-AAG GAG GTT CCG ATG GAG-3’ (SEQ ID NO: 404) para introducir las mutaciones aleatorias en la región de la Palma. Los paréntesis indican una síntesis del 91% de las bases mostradas y un 3% del resto de bases.

20

Construcción de Tth AKK L422N/E425K (secuencia de ADN SEQ ID NO: 407; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 408)

Se llevó a cabo mutagénesis con aleatorización en la región de la palma de la construcción Tth AKK utilizando el cebador mutagénico 680-79-02 5’-ctc cat cgg aac ctc ctt [aag cgc ctc gag ggg gag gag aag ctc ctt tgg] ctc tac cac gag gtg-3’ (SEQ ID NO: 403) y el cebador inverso 680-79-25 04 5’-AAG GAG GTT CCG ATG GAG-3’ (SEQ ID NO: 404) para introducir las mutaciones aleatorias en la región de la Palma. Los paréntesis indican una síntesis del 91 % de las bases mostradas y un 3% del resto de bases.

Construcción de Tth AKK L422F/W430C (secuencia de ADN SEQ ID NO: 409; secuencia de 30 aminoácidos SEQ ID NO: 410)

Se llevó a cabo mutagénesis con aleatorización en la región de la palma sobre el ADN de Tth AKK utilizando el cebador mutagénico 680-79-02 5’-ctc cat cgg aac ctc ctt [aag cgc ctc gag ggg gag gag aag ctc ctt tgg] ctc tac cac gag gtg-3’ (SEQ ID NO: 403) y el cebador inverso 680-79-04 5’-AAG GAG GTT CCG ATG GAG-3’ (SEQ ID NO: 404) para introducir las mutaciones 35 aleatorias en la región de la Palma. Los paréntesis indican una síntesis del 91 % de las bases mostradas y un 3% del resto de bases.

Construcción de Tth AKK A504F (secuencia de ADN SEQ ID NO: 411; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 412) 5

Se llevó a cabo mutagénesis de saturación de sitio sobre la construcción Tth AKK utilizando el cebador mutagénico 680-80-03 5’- cag gag ctt agg ctt ccc nnn ttg aag aag acg aag aag aca-3’ (SEQ ID NO: 413) y el cebador inverso 680-80-06 5’-cct aag ctc gtc aaa gag-3’ (SEQ ID NO: 414) para introducir las mutaciones aleatorias en el aminoácido A504.

10

Construcción de Tth AKK A504V (secuencia de ADN SEQ ID NO: 415; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 416)

Se llevó a cabo mutagénesis de saturación de sitio sobre la construcción Tth AKK utilizando el cebador mutagénico 680-80-03 5’- cag gag ctt agg ctt ccc nnn ttg aag aag acg aag aag aca-3’ (SEQ ID NO: 413) y el cebador inverso 680-80-06 5’-cct aag ctc gtc aaa gag-3’ (SEQ 15 ID NO: 414) para introducir las mutaciones aleatorias en el aminoácido A504.

Construcción de Tth AKK A504S (secuencia de ADN SEQ ID NO: 417; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 418)

Se llevó a cabo mutagénesis de saturación de sitio sobre la construcción Tth AKK 20 utilizando el cebador mutagénico 680-80-03 5’- cag gag ctt agg ctt ccc nnn ttg aag aag acg aag aag aca-3’ (SEQ ID NO: 413) y el cebador inverso 680-80-06 5’-cct aag ctc gtc aaa gag-3’ (SEQ ID NO: 414) para introducir las mutaciones aleatorias en el aminoácido A504.

Construcción de Tth AKK S517G (secuencia de ADN SEQ ID NO: 419; secuencia de 25 aminoácidos SEQ ID NO: 420)

Se llevó a cabo mutagénesis de saturación de sitio sobre la construcción Tth AKK utilizando el cebador mutagénico 680-80-07 5’-GGC AAG CGC TCC ACC NNN GCC GCG GTG CTG GAG GCC CTA CGG-3’ (SEQ ID NO: 421) y el cebador inverso 680-80-10 5’-GGT GGA GCG CTT GCC-3’ (SEQ ID NO: 422) para introducir las mutaciones aleatorias en el aminoácido 30 S517.

Construcción de Tth AKK A518L (secuencia de ADN SEQ ID NO: 423; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 424)

Se llevó a cabo mutagénesis de saturación de sitio sobre la construcción Tth AKK 35 utilizando el cebador mutagénico 680-80-07 5’-GGC AAG CGC TCC ACC AGC NNN GCG GTG CTG GAG GCC CTA CGG-3’ (SEQ ID NO: 425) y el cebador inverso 680-80-10 5’-GGT GGA GCG CTT GCC-3’ (SEQ ID NO: 422) para introducir las mutaciones aleatorias en el aminoácido A518.

5

Construcción de Tth AKK A518R (secuencia de ADN SEQ ID NO: 426; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 427)

Se llevó a cabo mutagénesis de saturación de sitio sobre la construcción Tth AKK utilizando el cebador mutagénico 680-80-07 5’-GGC AAG CGC TCC ACC AGC NNN GCG GTG CTG GAG GCC CTA CGG-3’ (SEQ ID NO: 425) y el cebador inverso 680-80-10 5’-ggt gga gcg ctt 10 gcc-3’ (SEQ ID NO: 422) para introducir las mutaciones aleatorias en el aminoácido A518.

Construcción de Taq5M L451R (secuencia de ADN SEQ ID NO: 428; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 429)

Se llevó a cabo mutagénesis sitiodirigida sobre la construcción Taq 5M usando el cebador 15 mutagénico 240-60-05 5’- acg-ggg-gtg-cgc-cgg-gac-gtg-gcc-TAT 3’ (SEQ ID NO: 430) para introducir la mutación L451R en la enzima Taq 5M.

Construcción de Tth AKK A504K (secuencia de ADN SEQ ID NO: 431; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 432) 20

Se llevó a cabo mutagénesis sitiodirigida sobre la construcción Tth AKK usando el cebador mutagénico 680-69-04 5’- ctt agg ctt ccc aag ttg aag aag acg aag aag aca-3’ (SEQ ID NO: 433) y el cebador inverso 680-69-05 5’-tgt ctt ctt cgt ctt ctt caa ctt ggg aag cct aag-3’ (SEQ ID NO: 434) para introducir la mutación A504K en la enzima Tth AKK.

25

Construcción de Tth AKK H641A (secuencia de ADN SEQ ID NO: 435; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 436)

Se llevó a cabo mutagénesis sitiodirigida sobre la construcción Tth AKK usando el cebador mutagénico 680-69-08 5’-gag ggg aag gac atc gcc acc cag acc gca agc-3’ (SEQ ID NO: 437) y el cebador inverso 583-01-02 5’-gct tgc ggt ctg ggt ggc gat gtc ctt ccc ctc- 3’ (SEQ ID NO: 438) para 30 introducir la mutación H641A en la enzima Tth AKK.

Construcción de Tth AKK T508P (secuencia de ADN SEQ ID NO: 439; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 440)

Se llevó a cabo mutagénesis sitiodirigida sobre la construcción TthAKK usando el cebador 35 mutagénico 680-70-01 5’-ccc-gcc ttg aag aag ccg aag aag aca ggc aag-3’ (SEQ ID NO: 441) y el cebador inverso 680-70-02 5’-ctt gcc tgt ctt ctt cgg ctt ctt caa ggc ggg-3’ (SEQ ID NO: 442) para introducir la mutación T508P en la enzima Tth AKK.

Quimeras y mutaciones en quimeras. 5

Fusión entre la enzima TthAKK y alfa-péptido

Se construyó una fusión quimérica TthAKK-lacZ-alfa-péptido para permitir la detección de mutaciones (incluyendo desplazamientos de marco, delecciones, inserciones, etc.) que pueden causar la incapacidad de la expresión de la proteína de fusión basándose en el cribado de colonias de color azul-blanco (Wu y col., Nucleic Acids Research, 24:1710 [1996]). 10

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN TthAKK utilizando los cebadores mutagénicos 959-041-03, 5’-cac-cac-cac-cac-cac-cac-gtc-gac-tag-tgc-tag-cgt-cga-cta-gct-gca-ggc-atg-caa-gct-tgg-c-3’ (SEQ ID NO: 477) y 959-041-04, 5’-gcc-aag-ctt-gca-tgc-ctg-cag-cta-gtc-gac-gct-agc-act-agt-cga-cgt-ggt-ggt-ggt-ggt-ggt-g-3’ (SEQ ID NO: 478) para generar pTthAKK-L con el sitio SalI siguiendo la etiqueta 6xHis en el extremo C de TthAKK para la inserción del péptido alfa 15 lacZ. El péptido alfa (del aminoácido 201) en primer lugar se amplificó mediante PCR a partir del vector pCRII-TOPO (Invitrogen) con los cebadores 959-041-01, 5’-cag-gaa-gcg-gcc-gcg-tcg-aca-tga-cca-tga-tta-cgc-caa-gc-3’ (SEQ ID NO: 479) y 959-093-01, 5’-ggg-ccc-gcc-agg-gtc-gac-tca-ggg-cga-tgg-ccc-act-acg-tga-3’ (SEQ ID NO: 480). El producto de la PCR se digirió a continuación con la enzima de restricción SalI y se ligó en el vector pTthAKK-L, que también se cortó con la 20 misma enzima para generar la construcción quimérica TthAKK-péptido alfa (secuencia de ADN SEQ ID NO: 481; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 482). La orientación de la inserción se confirmó mediante secuenciación.

Construcción de las enzimas TthTscAKK y TthTfiAKK 25

La construcción TthAKK se cortó con las enzimas EcoRI y NotI y el fragmento menor de la inserción se aisló en gel. Las construcciones TscAKK o TfiAKK también se cortaron con EcoRI y NotI y el fragmento mayor se aisló en gel y se purificó. La inserción Tth (dominio nucleasa) se ligó en los vectores TscAKK y TfiAKK (dominio polimerasa) para generar las construcciones quiméricas TthTscAKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 447; secuencia de aminoácidos SEQ ID 30 NO: 448) y TthTfiAKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 449; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 450).

35

Mutaciones FT de la polimerasa Tth para potenciar la especificidad del sustrato

Construcción de Taq(FT)TthAKK

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre la construcción TaqTthAKK construcción usando el cebador mutagénico 473-087-05: 5’-cgg-gac-ctc-gag-gcg-cgt-gaa-ccc-cag-gag-gtc-cac-3’ (SEQ ID NO: 483) para introducir las mutaciones L107F/A108T y generar 5 Taq(FT)TthAKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 484; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 485).

Construcción de Tfi(FT)TthAKK

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre la construcción TfiTthAKK 10 construcción usando el cebador mutagénico 785-096-05: 5’-gtg-gac-ctt-ctg-ggc-ttt-acc-cgc-ctc-gag-gcc-ccg-3’ (SEQ ID NO: 486) y 785-096-02: 5’-cgg-ggc-ctc-gag-gcg-ggt- aaa-gcc-cag-aag-gtc-cac-3’ (SEQ ID NO: 487) para introducir las mutaciones L107F/V108T y generar los mutantes Tfi(FT)TthAKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 349; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 488).

15

Mutantes Tfi(FT) DN 2M(N) y Tsc(FT) DN 2M(N)

Las mutaciones L107F/V108T se introdujeron por aislamiento del fragmento NotI y SalI del mutante Tfi DN 2M(N) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 345) e inserción del mismo en un Tfi(FT)TthAKK predigerido con NotI-SalI (secuencia de ADN SEQ ID NO: 349; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 488) para dar el mutante Tfi(FT) DN 2M(N) (secuencia de ADN SEQ ID 20 NO: 350, secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 351). Para añadir las mutaciones L107F o E108T en esta construcción basada en Tsc, se llevó a cabo un procedimiento idéntico. El fragmento del mutante Tsc DN 2M(N) cortado con NotI y SalI (secuencia de ADN SEQ ID NO: 348) se insertó en el vector Tsc(FT)TthAKK predigerido con NotI-SalI (secuencia de ADN SEQ ID NO: 491) para dar el mutante Tsc(FT) DN 2M(N) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 352, secuencia 25 de aminoácidos SEQ ID NO: 353).

Construcción de Tfi(FT) AKK y Tsc(FT) AKK

Partiendo de la construcción Tfi(FT)DN2M(N) descrita anteriormente (secuencia de ADN SEQ ID NO: 350), los cebadores (959-022-01 a -04: 5’-ggc-ctc-acc-ccg- gtg-aag-cgg-acg-aag-aag-30 acg-ggc-aag-cgc-3’, 5’-gcg-ctt-gcc-cgt-ctt-ctt-cgt-ccg- ctt-cac-cgg-ggt-gag-gcc-3’, 5’-ctc-ctc-ctc-caa-gtg-gcc-aac-gag-ctg-gtc-ctg-3’, 5’-cag-gac-cag-ctc-gtt-ggc-cac-ttg-gag- gag-gag-3’ (SEQ ID NO: 354-357) se utilizaron para introducir el conjunto de mutaciones "AKK" (H784A, G504K y E507K) mediante mutagénesis sitioespecífica. La construcción mutante resultante se denominó Tfi(FT)AKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 366, secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 367). 35

De la misma forma, los cebadores 959-022-05 a -08: 5’-ggg-ctt-ccc-gcc-atc-aag-aag-acg-aag-aag-acg-ggc-aag-cgc-3’, 5’-gcg- ctt-gcc-cgt-ctt-ctt-cgt-ctt-ctt-gat-ggc-ggg-aag-ccc-3’, 5’-atg-ctt-ttg-cag-gtg-gcc-aac-gaa-ctg-gtc-ctc-3’, 5’-gag-gac-cag- ttc-gtt-ggc-cac-ctg-caa-aag-cat-3’ (SEQ ID NO: 360-363) se utilizaron en una reacción de mutagénesis sitioespecífica, con el mutante Tsc(FT)DN2M(N) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 352) como plantilla para generar el mutante 5 Tsc(FT)AKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 368; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 369).

Construcción de Tsc(FT)TthAKK

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre la construcción TscTthAKK construcción usando los cebadores mutagénicos 785-008-03 5’-ttt-acc-cgc-ctc-gag-gtg-ccg-ggc-3’ 10 (SEQ ID NO: 489) y el cebador inverso 680-21-03 5’-cgg cac ctc gag gcg ggt aaa gcc caa aag gtc cac-3’ (SEQ ID NO: 490) para introducir las mutaciones L107F/E108T y generar Tsc(FT)TthAKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 454; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 491).

Construcción de las enzimas Taq(FT)TscAKK y Taq(FT)TfiAKK 15

La construcción Taq(FT)TthAKK se cortó con las enzimas EcoRI y NotI y el fragmento menor de la inserción se aisló en gel. Las construcciones TscAKK o TfiAKK también se cortaron con EcoRI y NotI y el fragmento mayor se aisló en gel y se purificó. La inserción Taq(FT) (dominio nucleasa) se ligó en los vectores TscAKK y TfiAKK (dominio polimerasa) para generar las construcciones quiméricas Taq(FT)TscAKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 443; secuencia de 20 aminoácidos SEQ ID NO: 444) y Taq(FT)TfiAKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 445; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 446).

Construcción de TaqEFT-Tth(AKK) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 501; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 502) 25

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de Taq(FT)-Tth(AKK) (SEQ ID NO: 484) usando los cebadores mutagénicos 436-013-08: 5’-atc-gtg-gtc-ttt-gac-gcc-gag-gcc-ccc-tcc-ttc-c-3’ (SEQ ID NO: 503) y 436-013-09 5’-gga-agg- agg-ggg-cct-cgg-cgt-caa-aga-cca-cga-t-3’ (SEQ ID NO: 504) para introducir la mutación K70E.

30

Mutaciones adicionales para potenciar la actividad de Taq(EFT)TthAKK

Construcción de TaqEFT-Tth(AKK)-A/M1 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 505; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 506)

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de Taq(EFT)-Tth(AKK) (SEQ ID NO: 501) usando los cebadores mutagénicos 1044-038-01: 5’-cag-acc-atg-aat-tcg-gag-gcg-atg-35 ctg-ccc-ctc-ttt-3’ (SEQ ID NO: 507) y 1044-038-02: (SEQ ID NO: 508) 5’-aaa-gag-ggg-cag-cat-cgc-ctc-cga-att-cat-ggt-ctg-3’ para introducir la mutación G4EA.

Construcción de TaqEFT-Tth(AKK)-B/M2 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 509; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 510)

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de Taq(EFT)-Tth(AKK) (SEQ ID 5 NO: 501) usando los cebadores mutagénicos 1044-038-03: 5’-gcc-tac-cgc-acc-ttc-ttt-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-3 and 1044-038-04: 5’-gag-gcc-ctt-cag-ggc-aaa- gaa-ggt-gcg-gta-ggc-3’ (SEQ ID NO: 511 y 512, respectivamente) para introducir la mutación H29F.

Construcción de TaqEFT-Tth(AKK)-C/M3 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 513; secuencia de 10 aminoácidos SEQ ID NO: 514)

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de Taq(EFT)-Tth(AKK) (SEQ ID NO: 501) usando los cebadores mutagénicos 1044-038-05: 5’-ctc-ctc-aag-gcc-ctc-aga-gag-gac-ggg-gac-gcg-3’ y 1044-038-06: 5’-cag-gac-cag-ctc-gtt-ggc-cac-ttg-gag- gag-gag-3’ (SEQ ID NO: 515 y 516, respectivamente) para introducir la mutación K57R. 15

Construcción de TaqEFT-Tth(AKK)-D/M5 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 517; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 518)

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de Taq(EFT)-Tth(AKK) (SEQ ID NO: 501) usando los cebadores mutagénicos 1044-038-09: 5’-gac-gac-gtc-ctg-gcc-acc-ctg-gcc-20 aag-aag-gcg-3’ and 1044-038-10: 5’-cgc-ctt-ctt-ggc-cag-ggt- ggc-cag-gac-gtc-gtc-3’ (SEQ ID NO: 519 y 520, respectivamente) para introducir la mutación S125T.

Construcción de TaqEFT-Tth(AKK)-E/M6 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 521; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 522) 25

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de Taq(EFT)-Tth(AKK) (SEQ ID NO: 501) usando los cebadores mutagénicos 1044-038-11: 5’-ggg-gag-aag-acg-gcg-ctc-aag-ctt-ctg-gag-gag-3’ y 1044-038-12: 5’-ctc-ctc-cag-aag-ctt-gag- cgc-cgt-ctt-ctc-ccc-3’ (SEQ ID NO: 523 y 524, respectivamente) para introducir la mutación R206L.

30

Construcción de TaqEFT-Tth(AKK)-F/M7 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 525; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 526)

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de Taq(EFT)-Tth(AKK) (SEQ ID NO: 501) usando los cebadores mutagénicos 1044-038-11: 5’-gag-ccc-gac-cgg-gag-ggg-ctt-aag-gcc-ttt-ctg-gag-agg-3’ y 1044-038-14: 5’-cct-ctc-cag-aaa- ggc-ctt-aag-ccc-ctc-ccg-gtc-ggg-ctc-3 35 (SEQ ID NO: 527 y 528, respectivamente) para introducir las mutaciones R269G y R271K.

Construcción de TaqEFT-Tth(AKK)-G/M8 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 529; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 530)

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de Taq(EFT)-Tth(AKK) (SEQ ID 5 NO: 501) usando los cebadores mutagénicos 1044-038-15: 5’-cac-gag-ttc-ggc-ctt-ctg-gga-ggg-gag-aag-ccc-cgg-gag-gag-gcc-ccc-tgg-ccc-3’ y 1044-038-16: 5’-ggg-cca-ggg-ggc-ctc-ctc-ccg-ggg-ctt-ctc-ccc-tcc-cag-aag-gcc-gaa-ctc-gtg-3’ (SEQ ID NO: 531 y 532, respectivamente) para introducir las mutaciones E290G, S291G, P292E, A294P, y L295R.

10

Construcción de TaqEFT-Tth(AKK)-H/M9 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 533; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 534)

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de Taq(EFT)-Tth(AKK) (SEQ ID NO: 501) usando los cebadores mutagénicos 1044-038-17: 5’-ctg-gcc-ctg-gcc-gcc- tgc-agg-ggc-ggc-cgc-gtg-3’ y 1044-038-18: 5’-cac-gcg-gcc-gcc-cct-gca-ggc-ggc-cag-ggc-cag-3’ (SEQ ID NO: 15 535 y 536, respectivamente) para introducir la mutación A328C.

Construcción de TaqEFT-Tth(AKK)-I/M10 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 537; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 538)

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de Taq(EFT)-Tth(AKK) (SEQ ID 20 NO: 501) usando los cebadores mutagénicos 1080-015-01 (SEQ ID NO: 539) 5’-ggg gag aag acg gcg agg aag ctt ctg aag gag tgg ggg agc-3’ y 1080-015-02 (SEQ ID NO: 540) 5’-gct ccc cca ctc ctt cag aag ctt cct cgc cgt ctt ctc ccc-3’ para introducir la mutación E210K.

Construcción de TaqEFT-Tth(AKK)-M1-9 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 541; secuencia de 25 aminoácidos SEQ ID NO: 542)

Se llevaron a cabo siete reacciones PCR independientes, utilizando la construcción TaqEFT-Tth(AKK) (SEQ ID: 501) como plantilla. con los siguientes pares de cebadores mutagénicos: Reacción PRC 1; 1044-038-01 5’-cag-acc-atg-aat-tcg-gag-gcg- atg-ctg-ccc-ctc-ttt-3’ (SEQ ID NO: 507) y 1044-038-04 5’-gag-gcc-ctt-cag-ggc-aaa-gaa-ggt-gcg-gta-ggc-3’ (SEQ ID NO: 30 512) para dar un fragmento de 108 pares de bases, Reacción PCR 2; 1044-038-03 5’-gcc-tac-cgc-acc-ttc-ttt-gcc-ctg-aag-ggc- ctc-3’ (SEQ ID NO: 511) y 1044-038-06 5’-cgc-gtc-ccc-gtc-ctc-tct-gag-ggc-ctt-gag-gag-3’ (SEQ ID NO: 516) para dar un fragmento de 117 pares de bases, Reacción PCR 3; 1044-038-05 5’-ctc-ctc-aag-gcc-ctc-aga-gag-gac-ggg-gac-gcg-3’ (SEQ ID NO: 515) y 1044-038-10 5’-cgc-ctt-ctt-ggc-cag-ggt-ggc-cag-gac-gtc-gtc-3’ (SEQ ID NO: 520) para dar un 35 fragmento de 237 pares de bases, Reacción PCR 4; 1044-038-09 5’-gac-gac-gtc-ctg-gcc-acc-ctg-gcc-aag-aag-gcg-3’ (SEQ ID NO: 519) y 1044-038-12 5’-ctc-ctc-cag-aag-ctt-gag-cgc-cgt-ctt-ctc-ccc-3’ (SEQ ID NO: 524) para dar un fragmento de 276 pares de bases, Reacción PCR 5; 1044-038-11 5’-ggg-gag-aag-acg-gcg-ctc-aag-ctt-ctg-gag-gag-3’ (SEQ ID NO: 523) y 1044-038-14 5’- cct-ctc-cag-aaa-ggc-ctt-aag-ccc-ctc-ccg-gtc-ggg-ctc-3’ (SEQ ID NO: 528) para dar un fragmento de 5 228 pares de bases, Reacción PCR 6; 1044-038-13 5’-gag-ccc-gac-cgg-gag-ggg-ctt-aag-gcc-ttt-ctg-gag-agg-3’ (SEQ ID NO: 527) y 1044-038-16 5’-ggg-cca-ggg-ggc-ctc-ctc-ccg-ggg-ctt-ctc-ccc-tcc-cag-aag-gcc-gaa-ctc-gtg-3’ (SEQ ID NO: 532) para dar un fragmento de 113 pares de bases, Reacción PCR 7; 1044-038-15 5’-cac-gag-ttc-ggc-ctt-ctg-gga-ggg-gag-aag-ccc-cgg-gag-gag-gcc-ccc-tgg- ccc-3’ (SEQ ID NO: 531) y 1044-038-18 5’-cac-gcg-gcc-gcc-cct-gca-ggc-ggc-cag-ggc-cag-10 3’ (SEQ ID NO: 536) para dar un fragmento de 157 pares de bases. Los siete productos de la PCR se solapan de manera que la amplificación por PCR en ausencia de cebadores proporcionó el producto adecuado de 1005 pares de bases para introducir las mutaciones K70E, G4EA, H29F, K57R, S125T, R206L, R269G, R271 K, E290G, S291G, P292E, A294P, L295R, y A328C. El producto se amplificó adicionalmente utilizando los cebadores exteriores: 1044-038-1 (SEQ ID 15 NO: 507) y 1044-038-18 (SEQ ID NO: 536) y se clonó en pPCR-Script-Amp. A partir de esta construcción, el dominio nucleasa se amplificó de nuevo utilizando los cebadores: 1044-038-1 (SEQ ID NO: 507) y 1044-038-18 (SEQ ID NO: 536) y se digirió con EcoRI y NotI. Los productos digeridos mediante PCR se ligaron en la construcción TaqEFT-Tth(AKK) digerida con EcoRI y NotI y se transformaron en JM109 para expresión y cribado de las proteínas. 20

Construcción de TaqEFT-Tth(AKK)-M1-10 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 543; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 544)

Se llevaron a cabo siete reacciones PCR independientes, utilizando la construcción TaqEFT-Tth(AKK) (SEQ ID: 501) como plantilla. con los siguientes pares de cebadores 25 mutagénicos: Reacción PRC 1; 1044-038-01 5’-cag-acc-atg-aat-tcg-gag-gcg- atg-ctg-ccc-ctc-ttt-3’ (SEQ ID NO: 507) y 1044-038-04 5’-gag-gcc-ctt-cag-ggc-aaa-gaa-ggt-gcg-gta-ggc-3’ (SEQ ID NO: 512) para dar un fragmento de 108 pares de bases, Reacción PCR 2; 1044-038-03 5’-gcc-tac-cgc-acc-ttc-ttt-gcc-ctg-aag-ggc- ctc-3’ (SEQ ID NO: 511) y 1044-038-06 5’-cgc-gtc-ccc-gtc-ctc-tct-gag-ggc-ctt-gag-gag-3’ (SEQ ID NO: 516) para dar un fragmento de 117 pares de bases, Reacción 30 PCR 3; 1044-038-05 5’-ctc-ctc-aag-gcc-ctc-aga-gag-gac-ggg-gac-gcg-3’ (SEQ ID NO: 515) y 1044-038-10 5’-cgc-ctt-ctt-ggc-cag-ggt-ggc-cag-gac-gtc-gtc-3’ (SEQ ID NO: 520) para dar un fragmento de 237 pares de bases, Reacción PCR 4; 1044-038-09 5’-gac-gac-gtc-ctg-gcc-acc-ctg-gcc-aag-aag-gcg-3’ (SEQ ID NO: 519) y 1080-42-02 5’-gc ttc cag gct ccc cca ctc ctt cag aag ctt gag cgc cgt ctt ctc ccc-3’ (SEQ ID NO: 546) para dar un fragmento de 299 pares de bases, 35 Reacción PCR 5; 1080-42-01 5’-ggg gag aag acg gcg ctc agg ctt ctg aag gag tgg ggg agc ctg gaa gc-3’(SEQ ID NO: 545) y 1044-038-14 5’- cct-ctc-cag-aaa-ggc-ctt-aag-ccc-ctc-ccg-gtc-ggg-ctc-3’ (SEQ ID NO: 528) para dar un fragmento de 228 pares de bases, Reacción PCR 6; 1044-038-13 5’-gag-ccc-gac-cgg-gag-ggg-ctt-aag-gcc-ttt-ctg-gag-agg-3’ (SEQ ID NO: 527) y 1044-038-16 5’-ggg-cca-ggg-ggc-ctc-ctc-ccg-ggg-ctt-ctc-ccc-tcc-cag-aag-gcc-gaa-ctc-gtg-3’ (SEQ ID NO: 532) 5 para dar un fragmento de 113 pares de bases, Reacción PCR 7; 1044-038-15 5’-cac-gag-ttc-ggc-ctt-ctg-gga-ggg-gag-aag-ccc-cgg-gag-gag-gcc-ccc-tgg- ccc-3’ (SEQ ID NO: 531) y 1044-038-18 5’-cac-gcg-gcc-gcc-cct-gca-ggc-ggc-cag-ggc-cag-3’ (SEQ ID NO: 536) para dar un fragmento de 157 pares de bases. Los siete productos de la PCR se solapan de manera que la amplificación por PCR en ausencia de cebadores proporcionó el producto adecuado de 1005 pares de bases para 10 introducir las mutaciones K70E, G4EA, H29F, K57R, S125T, R206L, E210K, R269G, R271K, E290G, S291G, P292E, A294P, L295R, y A328C. El producto se amplificó adicionalmente utilizando los cebadores exteriores: 1044-038-1 (SEQ ID NO: 507) y 1044-038-18 (SEQ ID NO: 536) y se clonó en pPCR-Script-Amp. A partir de esta construcción, el dominio nucleasa se amplificó de nuevo utilizando los cebadores: 1044-038-1 (SEQ ID NO: 507) y 1044-038-18 (SEQ 15 ID NO: 536) y se digirió con EcoRI y NotI. Los productos digeridos mediante PCR se ligaron en la construcción TaqEFT-Tth(AKK) digerida con EcoRI y NotI y se transformaron en JM109 para expresión y cribado de las enzimas.

Mutación K69E de enzimas FEN para potenciar adicionalmente especificidad del sustrato 20

Construcción de Tth(K69E)AKK, Taq(K69E)TthAKK, Tfi(K69E)TthAKK y Tsc(K69E)TthAKK y los mutantes

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre los ADN de TthAKK, TaqTthAKK, TfiTthAKK y TscTthAKK usando los cebadores mutagénicos 5’-atc-gtg-gtc-ttt-gac-gcc-gag-gcc-ccc-tcc-ttc-c-3’ (SEQ ID NO: 492) y 5’-gga-agg-agg-ggg-cct- cgg-cgt-caa-aga-cca-cga-t-3’ (SEQ ID 25 NO: 493) para introducir la mutación K69E y generar las enzimas mutantes Tth(K69E)AKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 452; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 494), Taq(K69E)ThAKK, (secuencia de ADN SEQ ID NO: 495; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 496), Tfi(K69E)TthAKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 497; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 498) y Tsc(K69E)TthAKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 499; secuencia de aminoácidos 30 SEQ ID NO: 500).

Construcción de Tsc(167-334)TthAKK

Se generaron dos fragmentos PCR solapantes a partir de los cebadores 390-76-08: 5’-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 1044-041-01: 5’-ctt-ctc-tca-tcc-gcc-aaa-aca-gcc-3’ (SEQ 35 ID NO: 451) con la plantilla Tth(K69E)AKK, (secuencia de ADN SEQ ID NO: 452), y los cebadores 1044-041-02: 5’-ctc-ctc-cac-gag-ttc-ggc-3’ (SEQ ID NO: 453) y 209-074-02: 5’-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3’ (SEQ ID NO: 316) con la plantilla Tsc(K69E)TthAKK, (secuencia de ADN SEQ ID NO: 454). Los dos productos se combinaron y amplificaron con los cebadores externos 390-76-08 y 209-074-02. El producto PCR recombinante se cortó con las enzimas de restricción EcoRI y NotI 5 y se ligaron en el vector TthAKK que se preparó mediante corte con las mismas enzimas para dar la construcción Tsc(167-333)TthAKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 455; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 456).

Construcción de Tsc(222-334)TthAKK 10

Se generaron dos fragmentos PCR solapantes a partir de los cebadores 390-76-08: 5’-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 1044-041-03: 5’-ttc-cag-gtg-ctt-gag-gag-gtt-ttc-cag-3’ (SEQ ID NO: 457) con la plantilla Tth(K69E)AKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 452), y los cebadores 1044-041-04: 5’-ctc-ctc-aag-cac-ctg-gaa-cag-gtg-aaa-3’ (SEQ ID NO: 458) y 209-074-02: 5’-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3’ (SEQ ID NO: 316) con la plantilla Tsc(K69E)TthAKK, 15 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 454). Los dos productos se combinaron y amplificaron con los cebadores externos 390-76-08 y 209-074-02. El producto PCR recombinante se cortó con las enzimas de restricción EcoRI y NotI y se ligaron en el vector TthAKK que se preparó mediante corte con las mismas enzimas para dar la construcción Tsc(222-334)TthAKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 459; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 460). 20

Construcción de Tfi(222-334)TthAKK

Se generaron dos fragmentos PCR solapantes a partir de los cebadores 390-76-08: 5’-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 1044-058-05: 5’-gtc-cag-gtt-ctt-gag-gag-gtt-ttc-cag-3’ (SEQ ID NO: 461) con la plantilla Tth(K69E)AKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 452), y los 25 cebadores 1044-058-06: 5’-ctc-ctc-aag-aac-ctg-gac-cgg-gta-aag-3’ (SEQ ID NO: 462) y 209-074-02: 5’-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3’ (SEQ ID NO: 316) con la plantilla Tfi(K69E)TthAKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 497). Los dos productos se combinaron y amplificaron con los cebadores externos 390-76-08 y 209-074-02. El producto PCR recombinante se cortó con las enzimas de restricción EcoRI y NotI y se ligaron en el vector TthAKK que se preparó mediante 30 corte con las mismas enzimas para dar la construcción Tfi(222-334)TthAKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 463; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 464).

Construcción de Tfi(167-334)TthAKK

Se generaron dos fragmentos PCR solapantes mediante los cebadores 390-76-08 5’-tgt-35 gga-att-gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 1044-058-07 5’-gac-gtc-ctt-cgg-ggt-gat-gag-gtg-gcc-3’ (SEQ ID NO: 465) con la plantilla Tth(K69E)AKK, (secuencia de ADN SEQ ID NO: 452), y los cebadores 1044-058-08 5’-atc-acc-ccg-aag-gac-gtc-cag-gag-aag-3’ (SEQ ID NO: 466) y 209-074-02 5’-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3’ (SEQ ID NO: 316) con la plantilla Tfi(K69E)TthAKK, (secuencia de ADN SEQ ID NO: 498). Los dos productos se combinaron y amplificaron con los 5 cebadores externos 390-76-08 y 209-074-02. El producto PCR recombinante se cortó con las enzimas de restricción EcoRI y NotI y se ligaron en el vector TthAKK que se preparó mediante corte con las mismas enzimas para dar la construcción Tfi(167-333)TthAKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 467; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 468).

10

Construcción de Tsc(111-334)TthAKK

Se generaron dos fragmentos PCR solapantes mediante los cebadores 390-76-08 5’-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 1044-058-01 5’-ctc-gag-gcg-ggt-aaa-ccc-cag-gag-gtc-3’ (SEQ ID NO: 469) con la plantilla Tth(K69E)AKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 452), y los cebadores 1044-058-02 5’-ggg-ttt-acc-cgc-ctc-gag-gtg-ccc-ggc-3’ (SEQ ID NO: 470) y 209-074-02 15 5’-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3’ (SEQ ID NO: 316) con la plantilla Tsc(K69E)TthAKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 499). Los dos productos se combinaron y amplificaron con los cebadores externos 390-76-08 y 209-074-02. El producto PCR recombinante se cortó con las enzimas de restricción EcoRI y NotI y se ligaron en el vector TthAKK que se preparó mediante corte con las mismas enzimas para dar la construcción Tsc(167-333)TthAKK (secuencia de ADN 20 SEQ ID NO: 471; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 472).

Construcción de Tsc(1-167)TthAKK

Se generaron dos fragmentos PCR solapantes mediante los cebadores 390-76-08 5’-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 1044-058-03 5’-aag-cca-ctc-cgg-ggt-gat-cag-gta-acc-3’ 25 (SEQ ID NO: 473) con la plantilla Tsc(K69E)TthAKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 499), y los cebadores 1044-058-04 5’-atc-acc-ccg-gag-tgg-ctt-tgg-gag-aag-3’ (SEQ ID NO: 474) y 209-074-02 5’-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3’ (SEQ ID NO: 316) con la plantilla Tth(K69E)AKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 452). Los dos productos se combinaron y amplificaron con los cebadores externos 390-76-08 y 209-074-02. El producto PCR recombinante se cortó con las enzimas de 30 restricción EcoRI y NotI y se ligaron en el vector TthAKK que se preparó mediante corte con las mismas enzimas para dar la construcción Tsc(1-167)TthAKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 475; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 476).

35

Modificación de las enzimas AfuFEN

Construcción de pAfuFEN

El plásmido pAfuFEN1 se preparó como se ha descinto [Solicitud de patente de los Estados Unidos con Nº de serie 09/684.938, documento WO 98/23774, cada uno de ellos incorporado al presente documento por referencia en su totalidad]. Brevemente, se preparó ADN 5 genómico a partir de un vial (aproximadamente 5 ml de cultivo) de bacterias vivas A. fulgidus procedente de DSMZ (DSMZ #4304) con el kit DNA XTRAX (Gull Laboratories, Salt Lake City, UT) según las instrucciones del fabricante. El residuo final de ADN se volvió a suspender en 100 µl de TE (Tris HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). Un microlitro de la disolución de ADN se empleó en una PCR usando el kit ADVANTAGE cDNA PCR (Clontech); el PCR se llevó a de acuerdo con las 10 instrucciones del fabricante.

El cebador del extremo 5’ es complementario del extremo 5’ del gen Afu FEN-1 excepto en que tiene la sustitución de 1 par de bases para crear un sitio Nco I. El cebador del extremo 3’ es complementario del extremo 3’ del gen Afu FEN-1 en dirección 3’ a partir de FEN-1 ORF excepto en que contiene la sustitución de 2 pares de bases para crear un sitio Sal I. Las secuencias de los 15 cebadores de los extremos 5’ y 3’ son 5’-CCGTCAACATTTACCATGGGTGCGGA-3’ (SEQ ID NO: 617) y 5’-CCGCCACCTCGTAGTCGACATCCTTT- TCGTG (SEQ ID NO: 618), respectivamente. La clonación del fragmento resultante fue como se ha descrito para el gen PfuFEN1, Patente de los Estados Unidos con Nº de serie 5.994.069, incorporada al presente documento en su totalidad a todos los efectos, para crear el plásmido pTrc99-AFFEN1. Para expresión, el plásmido 20 pTrcAfuHis se construyó por modificación de pTrc99-AFFEN1, agregando una cola de histidina para facilitar la purificación. Para añadir esta cola de histidina, se utilizaron procedimientos de PCR con mutagénesis dirigida por cebadores para insertar la secuencia codificante de seis restos de histidina entre el último codón de aminoácido de la región de codificación de pTrc99-AFFEN1 y el codón de detención. El plásmido resultante se denominó pTrcAfuHis. A continuación la proteína se 25 expresó según se ha descrito y purificado por unión a una columna de afinidad por Ni++.

Construcción de Afu(Y236A), A46-5

Se generaron dos fragmentos PCR solapantes a partir de la plantilla AfuFEN (SEQ ID NO: 556) con los cebadores: 785-73-04 5’-ctg-gtc-ggg-acg-gac-gcc-aat-gag-ggt-gtg-aag-3’ (SEQ ID 30 NO: 547) y 700-10-03 5’-ctt-ctc-tca-tcc-gcc-aaa-aca-gcc-3’ (SEQ ID NO: 343), y los cebadores: 390-076-08 5’-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 785-73-06 5’-gtc-cgt-ccc-gac-cag-aat-3’ (SEQ ID NO: 548). Los dos productos se combinaron y amplificaron con los cebadores externos 700-10-03 y 390-076-08. El producto PCR recombinante se cortó con las enzimas de restricción NcoI y SalI y se ligaron en la construcción AfuFEN que se preparó mediante corte con las mismas 35 enzimas para dar la construcción Afu(Y236A) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 549; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 550).

Construcción de Afu(Y236R), A56-9

Se generaron dos fragmentos PCR solapantes usando la plantilla AfuFEN con los 5 cebadores: 785-73-05 5’-ctg- gtc-ggg-acg-gac-agg-aat-gag-ggt-gtg-aag-3’ (SEQ ID NO: 551) y 700-10-03 5’-ctt-ctc-tca-tcc-gcc-aaa-aca-gcc-3’ (SEQ ID NO: 343), y los cebadores: 390-076-08 5’-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 785-73-06 5’-gtc-cgt-ccc-gac-cag-aat-3’ (SEQ ID NO: 548). Los dos productos se combinaron y amplificaron con los cebadores externos 700-10-03 y 390-076-08. El producto PCR recombinante se cortó con las enzimas de restricción NcoI y SalI y 10 se ligaron en la construcción AfuFEN que se preparó mediante corte con las mismas enzimas para dar la construcción Afu(Y236R) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 552; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 553).

2. Quimeras de enzimas FEN y derivados de Polimerasa de Thermus 15

Las siguientes construcciones de enzima combinan porciones del dominio polimerasa de AfuFEN y del dominio polimerasa de las polimerasas procedentes de Thermus. Estas combinaciones se diseñaron basándose en la información generada a partir de modelado molecular.

20

Construcción de Afu336-Tth296(AKK), AT1-1

Se generaron dos fragmentos PCR solapantes. El primer fragmento se preparó usando la construcción AfuFEN (SEQ ID NO: 556) como plantilla con los cebadores: 390-076-08 5’-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 390-065-05 5’-gaa-cca-cct-ctc-aag-cgt-gg-3’ (SEQ ID NO: 554). El segundo fragmento se preparó usando TthAKK (SEQ ID NO: 558) como plantilla y los 25 cebadores: 700-049-01 5’-acg-ctt-gag-agg-tgg-ttc-ctg-gag-gag-gcc-ccc-tgg-3’ (SEQ ID NO: 555) y 390-076-09 5’-taa-tct-gta-tca-ggc-tg-3’ (SEQ ID NO: 557). Los dos productos contienen una región con solapamiento de secuencia, y se combinaron y amplificaron con los cebadores externos 390-076-08 y 390-076-09 en una reacción PCR recombinante. El producto PCR recombinante se cortó con las enzimas de restricción BspEI y SalI y se ligaron en la construcción AfuFEN que se preparó 30 mediante corte con las mismas enzimas para dar la construcción Afu336-Tth296(AKK) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 559; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 560).

Construcción de Afu328-Tth296(AKK), AT2-3

Se generaron dos fragmentos PCR solapantes, el primero mediante los cebadores: 390-35 076-08 5’-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 700-049-02 5’-ggt-tga-ctt-cag-agc-ttt-gag-3’ (SEQ ID NO: 561) con la plantilla AfuFEN (secuencia de ADN SEQ ID NO: 556), y el segundo con los cebadores: 700-049-03 5’-aaa-gct-ctg-aag-tca-acc-ctg-gag-gag-gcc-ccc- tgg-3’ (SEQ ID NO: 562) y 390-076-09 5’-taa-tct-gta-tca-ggc-tg-3’ (SEQ ID NO: 557) con la plantilla TthAKK (secuencia de ADN SEQ ID NO: 558). Los dos productos se combinaron y amplificaron con los cebadores 5 externos 390-076-08 y 390-076-09. El producto PCR recombinante se cortó con las enzimas de restricción BspEI y SalI y se ligaron en el vector pAfuFEN que se preparó mediante corte con las mismas enzimas para dar la construcción Afu336-Tth296(AKK) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 563; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 564).

10

Construcción de Afu336-Taq5M

La construcción Taq5M (SEQ ID NO: 41) se cortó con las enzimas NotI y SalI y el fragmento menor de la inserción se aisló en gel. La construcción Afu336-Tth296(AKK) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 559) también se cortó con las mismas enzimas de restricción y el fragmento mayor del vector se purificó. La inserción (dominio polimerasa Taq5M) se ligó a continuación en el 15 vector para generar la construcción Afu336-Taq5M (secuencia de ADN SEQ ID NO: 565; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 566).

Construcción de Afu336-TaqDN

La construcción TaqDNHT se cortó con las enzimas NotI y SalI y el fragmento menor de la 20 inserción se aisló en gel. La construcción Afu336-Tth296(AKK) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 559) también se cortó con las mismas enzimas de restricción y el fragmento mayor del vector se purificó. La inserción (dominio polimerasa TaqDN) se ligó a continuación en el vector para generar la construcción Afu336-Taq5M (secuencia de ADN SEQ ID NO: 567; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 568). 25

Quimerización aleatoria de las polimerasas de Thermus

Se generaron numerosas enzimas con funciones alteradas mediante quimerización aleatoria de polimerasas de Thermus basadas principalmente en el desplazamiento de ADN (Volkov y Arnold, Methods in Enzymology 328:456 [2000]). El procedimiento siguiente se utilizó 30 para desarrollar las siguientes quimeras.

Los genes de interés para la quimerización aleatoria se amplificaron mediante la PCR con los cebadores: 390-076-08 5’-tgt-gga-att- gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 209-074-02: 5’-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3’ (SEQ ID NO: 316) para generar la plantilla de aproximadamente 1,4 kpb. Aproximadamente 2 µg de las plantillas de ADN se mezclaron en proporciones iguales, y a 35 continuación se digirieron con DNasa I (0,33 U) en una reacción de 30 µl a 15˚ C durante aproximadamente 1 minuto para generar fragmentos de 50-200 pb de tamaño. Los fragmentos de ADN se purificaron en gel de agarosa al 4 % y se extrajeron mediante el kit de extracción en gel QIAEXII (QIAGEN) según las instrucciones del fabricante. Los fragmentos purificados (10 µl) se añadieron a 10 µl de premezcla 2X PCR (diluida 5 veces, tampón de clonación Pfu, 0,4 mM de 5 cada dNTP, ADN polimerasa clonada 0,06 U/µl, STRATAGENE nº de catálogo 600153, con el tampón de reacción adjunto) para el reensamblaje de los fragmentos de la reacción (programa PCR: 3 min 94 ˚C seguido por 40 ciclos de 30 s a 94 ˚C, 1 min 52 ˚C, 2 min + 5 s/ciclo 72 ˚C, seguido por 4 min a 72 ˚C). Los productos reensamblados (1 µl de una dilución 10 veces) se amplificaron a continuación mediante PCR con un par de cebadores anidados: 072-090-01 5’-gag-10 cgg-ata-aca-att-tca-cac-agg-3’ (SEQ ID NO: 569) y 189-082-01 5’-tgc-ccg-gtg-cac-gcg-gcc-gcc-cct-gca-ggc-3’ (SEQ ID NO: 570) usando el kit CLONTECH GC melt cDNA PCR (nº de catálogo K1907-Y) según las instrucciones del fabricante. Los productos de la PCR purificados se digirieron con las enzimas de restricción EcoRI y NotI y a continuación se ligaron en la construcción TthAKK que se preparó al cortar con las mismas enzimas. La mezcla de ligadura se transformó en células 15 JM109 competentes y se cribaron las colonias por su actividad enzimática.

1. Generación de las quimeras aleatorias S26 y S36

Las plantillas utilizadas para desarrollar estas enzimas quiméricas fueron los dominios nucleasa procedentes de las construcciones TthAKK, TaqTthAKK, TscTthAKK y TthAKK. Se 20 encontró que dos clones mostraban mejora de la actividad basándose en el cribado según la actividad primaria. Las quimeras aleatorias S26 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 571; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 572) y S36 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 573; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 574) se secuenciaron y aislaron a continuación.

25

2. Introducción de las mutaciones L107F/E108T, L109F/V110T y K69E en S26 y S36 para potenciar la especificidad del sustrato

Construcción de S26(FT)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pS26 DNA usando los cebadores mutagénicos: 785-008-03 5’-ttt-acc- cgc-ctc-gag-gtg-ccg-ggc-3’ (SEQ ID NO: 489) y 30 680-21-03 5’-cgg-cac-ctc-gag-gcg-ggt-aaa-gcc-caa-aag-gtc-cac-3’ (SEQ ID NO: 490) para introducir las mutaciones L107F/E108T y generar S26(FT) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 575; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 576).

35

Construcción de S36(FT)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pS36 DNA usando los cebadores mutagénicos: 785-096-01: 5’-gtg-gac-ctt-ctg-ggc-ttt-acc-cgc-ctc-gag-gcc-ccg-3’ (SEQ ID NO: 486) y 785-096-02: 5’-cgg-ggc-ctc-gag-gcg-ggt- aaa-gcc-cag-aag-gtc-cac-3’ (SEQ ID NO: 487) para introducir las mutaciones L109F/V110T y generar S36(FT) (secuencia de ADN SEQ ID 5 NO: 577; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 578).

Construcción de S26(K69E)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de S26 DNA usando los cebadores mutagénicos: 5’-atc-gtg-gtc-ttt-gac-gcc-gag-gcc-ccc-tcc-ttc-c-3’ (SEQ ID NO: 492) y 5’-10 gga-agg-agg-ggg-cct- cgg-cgt-caa-aga-cca-cga-t-3’ (SEQ ID NO: 493) para introducir la mutación K69E y generar S26(K69E) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 579; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 580).

Construcción de S26(FT/K69E) 15

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de S26(FT) DNA usando los cebadores mutagénicos: 5’-atc-gtg-gtc-ttt-gac-gcc-gag-gcc-ccc-tcc-ttc-c-3’ (SEQ ID NO: 492) y 5’-gga-agg-agg-ggg-cct- cgg-cgt-caa-aga-cca-cga-t-3’ (SEQ ID NO: 493) para introducir la mutación K69E y generar S26(FT/K69E) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 581; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 582). 20

3. Más quimeras aleatorias, N3D7, N1A12 N1C4, y N2C3

Las plantillas usadas para generar estas quimeras fueron los dominios nucleasa de las construcciones Tth(K69E)AKK, Taq(K69E)TthAKK, Tsc(K69E)TthAKK y Tfi(K69E)TthAKK. Se demostró que cuatro clones mostraban mejora de la actividad basándose en el cribado según la 25 actividad primaria. Las quimeras aleatorias N3D7 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 583; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 584), N1A12 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 585; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 586), N1C4 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 587; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 588) y N2C3 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 589; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 590) se secuenciaron y aislaron a continuación. 30

Generación de variantes G, L y GL

Se usó una variante de Polimerasa Tth con cambio de Asp a Gly en el aminoácido 385 (D385G) y un cambio Arg a Leu en el aminoácido 455 (R455L), (secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2712; secuencia de genes SEQ ID NO: 2713) para crear derivados y enzimas quiméricas. 35 Las construcciones que comprenden estas dos variaciones de aminoácidos se han indicado con la designación ‘GL’, como se muestra a continuación. Las quimeras que comprenden solamente una de las variaciones se han indicado con ’G’ o ’L’. Para crear una variante no polimerizante, la secuencia que codifica un ácido aspártico en la posición 787 se cambió mediante mutagénesis específica del emplazamiento como se ha descrito anteriormente a una secuencia que codifica 5 asparagina. La mutagénesis de pTrcTth GL-2 con el siguiente oligonucleótido: 5’-CAGGAGGAGCTCGTTGTGGACCTGGA-3’ (SEQ ID NO: 260) se llevó a cabo para crear el plásmido pTrcTthDN GL. La proteína mutante y la secuencia de ácido nucleico codificante se denominan TthDN GL, SEQ ID NOS: 2714 y 2715) respectivamente.

10

A. Tth DN HT GL

Se agregaron seis marcas del aminoácido histidina (etiquetas his) en el extremo carboxiterminal de Tth DN GL. Como se ha descrito anteriormente para Tth DN. El gen mutante resultante se denominaron Tth DN HT GL (SEQ ID NO: 2716, secuencia de ácido nucleico; SEQ ID NO: 2717, secuencia de aminoácidos). La proteína se expresó y purificó como se ha descrito 15 para Tth DN HT, más arriba.

B. Generación de Tth DN RX HT GL

Se llevó a cabo la mutagénesis para introducir 3 sitios de restricción adicionales únicos en el dominio de la polimerasa de las enzimas Tth DN HT, Se llevó a cabo mutagénesis sitiodirigida 20 mediante el kit Transformer Site-Directed Mutagenesis (Clontech) según las instrucciones del fabricante. Se usó uno de dos cebadores de selección diferentes, Trans Oligo AlwNI/SpeI o Switch Oligo SpeI/AlwNI (Clontech, Palo Alto CA nº de catálogo 6488-1 o nº de catálogo 6373-1) para todas las reacciones de mutagénesis descritas. El oligo de selección utilizado en una reacción dada es dependiente del sitio de restricción de selección presente en el vector. Todos los 25 cebadores mutagénicos se sintetizaron mediante química sintética convencional. Las colonias resultantes se expresaron en la cepa JM109 de E. coli.

Los sitios Not I (posición de aminoácido 328) se crearon usando los cebadores mutagénicos 5’-gccgccaggggcggccgcgtc-caccgggcc (SEQ ID NO: 269) y 5’-gcctgcaggggcggccgcgtgcaccggggca (SEQ ID NO: 270) correspondiente a la cadena de sentido 30 directo del gen Tth DN HT GL. Los sitios BstI (posición de aminoácido 382) y NdeI (posición de aminoácido 443) se introdujeron en el gen utilizando los cebadores mutagénicos de cadenas de sentido directo 5’-ctcctggacccttcgaacaccacccc (SEQ ID NO: 271) y 5’-gtcctggcccatatggaggccac (SEQ ID NO: 272). El plásmido mutante se expresó en exceso y se purificó usando el kit Qiagen QiaPrep Spin Mini Prep (nº de catálogo 27106). El vector se probó para la presencia de sitios de 35 restricción por secuenciación y cartografía de restricción de ADN. Esta construcción se denomina Tth DN RX HT GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2718; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2719). Las construcciones quiméricas se crearon mediante Tth DN RX HT GL.

1. Construcción de TaqTth(N) GL 5

El primer intercambio que se llevó a cabo implicó los dominios de la polimerasa de ambas enzimas. La separación del dominio nucleasa (el extremo N-terminal de la proteína) del dominio polimerasa (el extremo C-terminal de la proteína) se llevó a cabo cortando ambos genes con las endonucleasas de restricción EcoRI y NotI. El fragmento de aproximadamente 900 pares de bases procedente del gen Taq DN RX HT se clonó en los sitios homólogos del gen Tth DN RX HT 10 GL. Proporcionando la quimera TaqTth(N) GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2675; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2641) que tenía el dominio nucleasa 5’ Taq DN RX HT y el dominio polimerasa Tth DN RX HT GL,

2. Construcción de TaqTth(N-B) GL 15

La construcción Taq DN RX HT se cortó con las enzimas NdeI y BamHI y el fragmento del vector más largo se aisló como se ha detallado anteriormente. La construcción Tth DN RX HT GL también se cortó con NdeI y BamHI y el fragmento Tth más pequeño (aproximadamente 795 pares de bases) se aisló en gel y se purificó. La inserción Tth GL NdeI-BamHI se ligó en el vector Taq NdeI-BamHI como se ha detallado anteriormente para generar TaqTth(N-B) GL (secuencia de 20 ADN SEQ ID NO: 2676; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2642).

3. Construcción de TaqTth(N-D) G

La construcción Taq DN RX HT se cortó con las enzimas NotI y NdeI y el fragmento del vector más largo se aisló como se ha detallado anteriormente. La construcción Tth DN RX HT GL 25 también se cortó con NotI y NdeI y el fragmento Tth más pequeño (aproximadamente 345 pares de bases) se aisló en gel y se purificó. La inserción Tth GL NotI-NdeI se ligó en el vector Taq NotI-NdeI como se ha detallado anteriormente para generar TaqTth(N-D) G (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2677; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2643).

30

4. Construcción de TaqTth(D-B) L

La construcción Taq DN RX HT se cortó con las enzimas NdeI y BamHI y el fragmento del vector más largo se aisló como se ha detallado anteriormente. La construcción Tth DN RX GL también se cortó con NdeI y BamHI y el fragmento Tth más pequeño (aproximadamente 450 pares de bases) se aisló en gel y se purificó. La inserción Tth GL NdeI-BamHI se ligó en el vector 35 Taq NdeI-BamHI como se ha detallado anteriormente para generar TaqTth(D-B) L (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2678; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2644).

5. Construcción de TaqTth(Bs-B) L

La construcción Taq DN RX HT se cortó con las enzimas BstBI y BamHI y el fragmento del 5 vector más largo se aisló como se ha detallado anteriormente. La construcción Tth DN RX HT GL también se cortó con BstBI y BamHI y el fragmento Tth más pequeño (aproximadamente 633 pares de bases) se aisló en gel y se purificó. La inserción Tth GL NdeI-BamHI se ligó en el vector Taq NdeI-BamHI como se ha detallado anteriormente para generar TaqTth(Bs-B) L (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2679; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2645). 10

6. Construcción de TaqTth(N-Bs) G

La construcción Taq DN RX HT se cortó con las enzimas NotI y BstBI y el fragmento del vector más largo se aisló como se ha detallado anteriormente. La construcción Tth DN RX HT GL también se cortó con NotI y BstBI y el fragmento Tth más pequeño (aproximadamente 162 pares 15 de bases) se aisló en gel y se purificó. La inserción Tth GL NotI-BstBI se ligó en el vector Taq NotI-BstBI como se ha detallado anteriormente para generar TaqTth(N-Bs) G (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2680; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2646).

7. Construcción de TthTaq(B-S) GL 20

La construcción Tth DN RX HT GL se cortó con las enzimas BamHI y SalI y el fragmento del vector más largo se aisló como se ha detallado anteriormente. La construcción Taq DN RX HT también se cortó con BamHI y SalI y el fragmento Taq más pequeño (aproximadamente 741 pares de bases) se aisló en gel y se purificó. La inserción Taq BamHI-SalI se ligó en el vector Tth GL BamHI-SalI como se ha detallado anteriormente para generar TthTaq(B-S) GL (secuencia de ADN 25 SEQ ID NO: 2681; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2647).

8. Construcción de TaqTth(D-B) L E404H (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2684; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2650)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(D-B) L 30 usando el cebador mutagénico 240-60-01:

5’-gag gag gcg ggg cac cgg gcc gcc ctt-3’ (SEQ ID NO: 277) para introducir la mutación E404H.

9. Construcción de TaqTth(D-B) L F413H/A414R (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2685; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2651 35

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(D-B) L utilizando el cebador mutagénico 240-60-02 5’-ctt tcc gag agg ctc cat cgg aac ctg tgg ggg agg-3’ (SEQ ID NO: 278) para introducir las mutaciones F413H y A414R.

10. Construcción de TaqTth(D-B) L W417L/G418K (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2686; 5 secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2652)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(D-B) L utilizando el cebador mutagénico 240-60-03 5’-ctc ttc gcc aac ctg ctt aag agg ctt gag ggg gag-3’ (SEQ ID NO: 279) para introducir las mutaciones W417L y G418K.

10

11. Construcción de TaqTth(D-B) L A439R (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2687; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2653)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(D-B) utilizando el cebador mutagénico 240-60-04 5’-agg ccc ctt tcc cgg gtc ctg gcc cat-3’ (SEQ ID NO: 2itio77) para introducir la mutación A439R. 15

12. Construcción de TaqTth(N-D) G L451R (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2688; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2654)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(N-D) G utilizando el cebador mutagénico 240-60-05 5’-gag gag gcg ggg cac cgg gcc gcc ctt-3’ (SEQ ID 20 NO: 281) para introducir la mutación L451.

13. Construcción de TaqTth(N-D) G R457Q (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2689; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2655)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(N-D) G 25 utilizando el cebador mutagénico 240-60-06 5’-gtg gcc tat ctc cag gcc ttg tcc ctg-3’ (SEQ ID NO: 282) para introducir la mutación L415Q .

14. Construcción de TaqTth(N-D) G V463L (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2690; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2656) 30

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(N-D) G utilizando el cebador mutagénico 240-60-07 5’-ttg gcc tat ctc cag gcc ttg tcc ctg-3’ (SEQ ID NO: 283) para introducir la mutación V463L.

15. Construcción de TaqTth(N-D) G A468R (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2691; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2657) 35

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(N-D) G utilizando el cebador mutagénico 240-60--08 5’-gcc gag gag atc cgc cgc ctc gag gcc-3’ (SEQ ID NO: 284) para introducir la mutación A468R.

16. Construcción de TaqTth(N-D) G A472E (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2692; secuencia 5 de aminoácidos SEQ ID NO: 2658)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(N-D) G utilizando el cebador mutagénico 240-60-09 5’-gcc) cgc ctc gag gag gag gtc ttc cgc-3’ (SEQ ID NO: 285) para introducir la mutación A472E .

10

17. Construcción de TaqTth(N-D) G G499R (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2693; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20) 2659)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(N-D) G utilizando el cebador mutagénico 240-60-10 5’-ttt gac gag cta agg ctt ccc gcc atc-3’ (SEQ ID NO: 286) para introducir la mutación G499R . 15

18. Construcción de TaqTth(N-D) G E507Q (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2694; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2660)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(N-D) G utilizando el cebador mutagénico 276-60-04 5’-atc gcc aag acg caa aag acc ggc aag-3’ (SEQ ID 20 NO: 287) para introducir la mutación E507Q.

19. Construcción de TaqTth(N-D) G Y535H (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2695; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2661)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(N-D) G 25 utilizando el cebador mutagénico 240-60-11 5’-aag atc ctg cag cac cgg gag ctc acc-3’ (SEQ ID NO: 288) para introducir la mutación Y535H .

20. Construcción de TaqTth(N-D) G S543N (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2696; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2662) 30

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(N-D) G utilizando el cebador mutagénico 240-60-12 5’-acc aag ctg aag aac acc tac att gac-3’ (SEQ ID NO: 289) para introducir la mutación S543N.

21. Construcción de TaqTth(N-D) GI546V (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2697; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2663) 35

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(N-D) G utilizando el cebador mutagénico 240-60-13 5’-gag agc acc tac gtg gac ccc ttg ccg-3’ (SEQ ID NO: 290) para introducir la mutación I546V .

22. Construcción de TaqTth(N-D) G D551S/I553V (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2698; 5 secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2664)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TaqTth(N-D) G utilizando el cebador mutagénico 240-60-14 5’-att gac ccc ttg ccg agc ctc gtc cac ccc agg acg ggc-3’ (SEQ ID NO: 291) para introducir las mutaciones D551S y I553V.

23. Construcción de Tth DN RX HT GL H641A, Tth DN RX HT GL H748A, Tth DN RX HT GL 10 H786A

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A Tth DN RX HT GL usando el cebador mutagénico 583-001-02: 5’-gct tgc ggt ctg ggt ggc gat gtc ctt ccc ctc-3’ (SEQ ID NO: 294) para introducir la mutación H641A (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2699; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2665), o el cebador mutagénico 583-001-03: 5’-cat gtt gaa ggc cat ggc 15 ctc cgc ggc ctc cct-3’ (SEQ ID NO: 295) para generar la enzima mutante H748A (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2700; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2666) o el cebador mutagénico 583-001-04: 5’-cag gag gag ctc gtt ggc gac ctg gag gag-3’ (SEQ ID NO: 296) para generar la enzima mutante H786A (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2701; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2667). 20

24. Construcción de Tth DN RX HT GL (H786A/G506K/Q509K)

Partiendo del mutante Tth DN RX HT GL H786A, anteriormente generado, se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica utilizando el cebador mutagénico 604-022-02: 5’-gga gcg ctt gcc tgt ctt ctt cgt ctt ctt caa ggc ggg agg cct-3’ (SEQ ID NO: 297) para generar esta variante denominada 25 "TthAKK GL", (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2702; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2668).

25. Mutagénesis aleatoria de TthDN RX HT H786A

Para generar mutantes en la región hélice-horquilla-hélice de la enzima TthDN RX HT 30 H786A GL (SEQ ID NO: 2667), se llevaron a cabo dos reacciones PCR distintas utilizando el mutante H786A (SEQ ID NO: 2701) como plantilla. Partiendo de TthDN GL H786A descrito anteriormente, y usando el cebador 604-08-06: 5’-gtc gga ggg gtc ccc cac gag-3’ (SEQ ID NO: 313) y el cebador 390-76-08: 5’-tgt gga att gtg agc gg (SEQ ID NO: 314), se generó un fragmento de 620 pares de bases mediante PCR. Se llevaron a cabo reacciones PCR usando el kit 35 Advantage cDNA PCR (Clontech) según las instrucciones del fabricante. Este producto de la PCR incluye los aminoácidos 1-194. No se introdujeron mutaciones mediante esta reacción, sin embargo, el sitio de la enzima de restricción EcoRI está presente en el extremo 5’.

Partiendo de TthDN RX GL HT H786A descrito anteriormente, y usando el cebador mutagénico 604-08-05: 5’-ctc gtg ggg gac ccc tcc gac aac ctc (ccc ggg gtc aag ggc atc ggg gag 5 aag acc gcc) ctc aag ctt ctc aag-3’ (SEQ ID NO: 315) y el cebador 209-74-02: 5’-gtg gcc tcc ata tgg gcc agg ac-3’ (SEQ ID NO: 316) se generó un fragmento PCR de 787 pares de bases. Las reacciones PCR se llevaron a cabo como anteriormente. Este fragmento contiene mutaciones aleatorias, debido a la presencia de del cebador mutagénico, 604-08-05. Las bases indicadas entre paréntesis contenidas en este cebador se sintetizaron de forma que el 91 % de la secuencia 10 es natural, mientras que el 9% adicional está dividido equitativamente entre las 3 bases restantes.

Los dos fragmentos PCR se solapan, y se combinaron en una reacción PCR recombinante. Se añadieron los cebadores 390-76-08 y 209-74-02, y se utilizó de nuevo el kit Advantage cDNA PCR (Clontech) según las instrucciones del fabricante. Se generó un producto de 1380 pares de bases a partir de esta reacción. 15

El producto de la PCR recombinante se cortó con las enzimas de restricción EcoRI y NotI según las instrucciones del fabricante para dar un fragmento de 986 pares de bases. TthDN RX HT GL H786A se preparó por corte con las mismas enzimas. El fragmento se ligó a continuación en el vector, y se transformó en células JM109. Los mutantes nuevos desarrollados a partir de este conjunto de reacciones incluyen: 20

TthDN RX HT GL H786A/P197R/K200R (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2703; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2669).

TthDN RX HT GL H786A/K205Y (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2704; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2670). 25

TthDN RX HT GL H786A/G203R (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2705; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2671).

26. Construcción de TaqTthAKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2706; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2672), 30

El mutante quimérico TaqTthAKK GL se generó por corte de Tth DN RX HT GL (H786A/G506K/Q509K) (SEQ ID NO: 2702; abreviado aquí TthAKK GL) y Taq 4M G504 (SEQ ID NO: 108; abreviado aquí Taq 5M) con las endonucleasas de restricción EcoRI y NotI. El fragmento de inserción más pequeño de Taq 5M y el fragmento más grande del vector Tth AKK GL se purificaron en gel como se ha detallado en el Ejemplo 3D, y los fragmentos de inserción se ligaron 35 como se ha descrito en el Ejemplo 3D. El cribado y verificación de la secuencia de la construcción también se realizaron como en el Ejemplo 3D.

27. Construcción de Tth AKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2707; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2673), TscTthAKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2708; 5 secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2674),

Para generar enzimas quiméricas entre TthAKK GL (SEQ ID NO: 2702), y Tfi DN 2M (SEQ ID NO: 130), o Tsc DN 2M (SEQ ID NO: 131), se cortó Tth DN RX HT GL (H786A/G506K/Q509K) DNA (SEQ ID NO: 2702) con EcoRI y NotI, y el fragmento de vector más grande se aisló como se ha detallado anteriormente. Los fragmentos Eco RI-NotI de 993 pares de bases de Tfi y Tsc se 10 prepararon como se ha descrito en el Ejemplo 8. Las ligaduras se llevaron a cabo como se ha detallado en el Ejemplo 3D, así como el cribado y la verificación de la construcción nueva.

28. Construcción de TthAKK GL (P195A) y TthAKK GL (P195K)

Para introducir mutaciones en la posición de aminoácido 195 (cualquiera de P195A o 15 P195K) en el dominio nucleasa de la construcción TthAKK GL, el cebador mutagénico 785-073-01 (P195A) 5’-ccc-tcc-gac-aac-ctc-gcc-ggg-gtc-aag-ggc-atc-3’ (SEQ ID NO: 370) o 785-073-02 (P195K) 5’-ccc-tcc-gac-aac-ctc-aag-ggg-gtc-aag-ggc-atc-3’ (SEQ ID NO: 371) y el cebador 209-074-02: 5’-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3’ (SEQ ID NO: 316) se usaron en una reacción PCR para generar un fragmento de 787 pares de bases. Otro fragmento de PCR se obtuvo usando los 20 cebadores: 390-076-08 5’-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 785-073-03 5’-gag-gtt-gtc-gga-ggg-gtc-3’ (SEQ ID NO: 372) en una reacción con la misma plantilla.

Los dos fragmentos PCR se solapan, y se combinaron en una reacción PCR recombinante. Se agregaron los cebadores externos 390-076-08 y 209-074-02, y se utilizó el kit Advantage cDNA PCR kit (Clontech) según las instrucciones del fabricante. Se generó un 25 producto de 1380 pares de bases a partir de esta reacción.

El producto de la PCR recombinante se cortó con las enzimas de restricción EcoRI y NotI para dar un fragmento de 986 pares de bases. La construcción TthAKK GL se preparó por corte con las mismas enzimas. El fragmento se ligó a continuación en el vector, y se transformó en células JM109. Los mutantes nuevos desarrollados a partir de este conjunto de reacciones 30 incluyen: TthAKK GL(P195A) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2721; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2722) y TthAKK GL (P195K) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 723; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2724).

29. Construcción de TthAKK GL (N417K/L418K)

Se utilizó el mismo enfoque para construir TthAKK GL (N417K/L418K). Se generaron dos 35 fragmentos PCR solapantes a partir de cebadores mutagénicos. 785-73-07 5’-gag-agg-ctc-cat-cgg-aag-aag-ctt-aag-cgc-ctc-gag-3’ (SEQ ID NO: 377) y 700-10-03 5’-ctt-ctc-tca-tcc-gcc-aaa-aca-gcc-3’ (SEQ ID NO: 343), y los cebadores 158-084-01 5’-ctc-ctc-cac-gag-ttc- ggc-3’ (SEQ ID NO: 310) y 785-73-08 5’-ccg-atg-gag-cct-ctc-cga-3’ (SEQ ID NO: 378). Los dos productos se combinaron y amplificaron con los cebadores externos 700-10-03 y 158-084-01. El producto de 5 PCR resultante se cortó con las enzimas de restricción NotI y BamHI y se ligó en la construcción TthAKK GL precortada con NotI/BamHI. Este mutante se denominó TthAKK GL (N417K/L418K) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2725; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2726).

30. Construcción de TthAKK GL (P255L)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre la construcción TthAKK GL usando el 10 cebador mutagénico 886-049-05 y 886-049-06: 5’-gtg-cgc-acc-gac-ctc-ctc-ctg-gag-gtg-gac-ctc-3’ (SEQ ID NO: 381), 5’-gag-gtc-cac-ctc-cag-gag-gag-gtc-ggt-gcg-cac-3’ (SEQ ID NO: 382) para generar TthAKK GL (P255L) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2727; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2728).

15

31. Construcción de TthAKK GL (F311Y)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre la construcción TthAKK GL usando el cebador mutagénico 886-049-09 y 886-049-10: 5’-ggg-gcc-ttc-gtg-ggc-tac-gtc-ctc-tcc-cgc-ccc-3’ (SEQ ID NO: P385), 5’-ggg-gcg-gga-gag-gac-gta- gcc-cac-gaa-ggc-ccc-3’ (SEQ ID NO: 386) para generar TthAKK GL (F311Y) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2729; secuencia de aminoácidos 20 SEQ ID NO: 2730).

32. Construcción de TthAKK GL (N221H/R224Q)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre la construcción TthAKK GL usando el cebador mutagénico 886-049-01 y 886-049-02: 5’-gaa-aac-ctc-ctc-aag-cac-ctg-gac-cag-gta-aag-25 cca-gaa-aac-3’ (SEQ ID NO: 389), 5’-gtt-ttc-tgg-ctt- tac-ctg-gtc-cag-gtg-ctt-gag-gag-gtt-ttc-3’ (SEQ ID NO: 390) para generar TthAKK GL (N221H/R224Q) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2731; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2732).

33. Construcción de TthAKK GL (R251H) 30

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre la construcción TthAKK GL usando el cebador mutagénico 886-049-03 y 886-049-04: 5’-gag-ctc-tcc-cgg-gtg-cac-acc-gac-ctc-ccc-ctg-3’ (SEQ ID NO: 393), 5’-cag-ggg-gag-gtc-ggt-gtg-cac-ccg- gga-gag-ctc-3’ (SEQ ID NO: 394) para generar TthAKK GL (R251H) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2733; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2734). 35

34. Construcción de TthAKK GL (P255L/R251H)

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre la construcción TthAKK(P255L) GL usando el cebador mutagénico 886-088-01 y 886-088-02: 5’-gag-ctc-tcc-cgg-gtg-cac-acc-gac-ctc-ctc-ctg-3’ (SEQ ID NO: 397), 5’-cag-gag-gag-gtc- ggt-gtg-cac-ccg-gga-gag-ctc-3’ (SEQ ID NO: 5 398) para generar TthAKK GL (P255L/R251H) (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2735; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2736).

35. Construcción de Tth AKK GL L429V (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2737; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2738) 10

Se llevó a cabo mutagénesis con aleatorización en la región de la palma de la construcción Tth AKK GL utilizando el cebador mutagénico 680-79-02 5’-ctc cat cgg aac ctc ctt [aag cgc ctc gag ggg gag gag aag ctc ctt tgg] ctc tac cac gag gtg-3’ (SEQ ID NO: 403) y el cebador inverso 680-79-04 5’-AAG GAG GTT CCG ATG GAG-3’ (SEQ ID NO: 404) para introducir las mutaciones aleatorias en la región de la Palma. Los paréntesis indican una síntesis del 91% de las bases 15 mostradas y un 3 % del resto de bases.

36. Construcción de Tth AKK GL E425V (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2739; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2740)

Se llevó a cabo mutagénesis con aleatorización en la región de la palma de la construcción 20 Tth AKK GL utilizando el cebador mutagénico 680-79-02 5’-ctc cat cgg aac ctc ctt [aag cgc ctc gag ggg gag gag aag ctc ctt tgg] ctc tac cac gag gtg-3’ (SEQ ID NO: 403) y el cebador inverso 680-79-04 5’-AAG GAG GTT CCG ATG GAG-3’ (SEQ ID NO: 404) para introducir las mutaciones aleatorias en la región de la Palma. Los paréntesis indican una síntesis del 91% de las bases mostradas y un 3% del resto de bases. 25

37. Construcción de Tth AKK GL L422N/E425K (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2741; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2742)

Se llevó a cabo mutagénesis con aleatorización en la región de la palma de la construcción Tth AKK GL utilizando el cebador mutagénico 680-79-02 5’-ctc- cat cgg aac ctc ctt [aag cgc ctc 30 gag ggg gag gag aag ctc ctt tgg] ctc tac cac gag gtg-3’ (SEQ ID NO: 403) y el cebador inverso 680-79-04 5’-AAG GAG GTT CCG ATG GAG-3’ (SEQ ID NO: 404) para introducir las mutaciones aleatorias en la región de la Palma. Los paréntesis indican una síntesis del 91% de las bases mostradas y un 3 % del resto de bases.

35

38. Construcción de Tth AKK GL L422F/W430C (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2743; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2744)

Se llevó a cabo mutagénesis con aleatorización en la región de la palma del ADN de Tth AKK GL utilizando el cebador mutagénico 680-79-02 5’-ctc cat cgg aac ctc ctt [aag cgc ctc gag ggg gag gag aag ctc ctt tgg] ctc tac cac gag gtg-3’ (SEQ ID NO: 403) y el cebador inverso 680-79-04 5 5’-AAG GAG GTT CCG ATG GAG-3’ (SEQ ID NO: 404) para introducir las mutaciones aleatorias en la región de la Palma. Los paréntesis indican una síntesis del 91% de las bases mostradas y un 3% del resto de bases.

39. Construcción de Tth AKK GL A504F (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2745; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2746) 10

Se llevó a cabo mutagénesis de saturación sobre la construcción Tth AKK GL utilizando el cebador mutagénico 680-80-03 5’- cag gag ctt agg ctt ccc nnn ttg aag aag acg aag aag aca-3’ (SEQ ID NO: 413) y el cebador inverso 680-80-06 5’-cct aag ctc gtc aaa gag-3’ (SEQ ID NO: 414) para introducir las mutaciones aleatorias en el aminoácido A504.

15

40. Construction of Tth AKK GL A504V (DNA sequence SEQ ID NO: 2747; amino acid sequence SEQ ID NO: 2748)

Se llevó a cabo mutagénesis de saturación sobre la construcción Tth AKK GL utilizando el cebador mutagénico 680-80-03 5’- cag gag ctt agg ctt ccc nnn ttg aag aag acg aag aag aca-3’ (SEQ ID NO: 413) y el cebador inverso 680-80-06 5’-cct aag ctc gtc aaa gag-3’ (SEQ ID NO: 414) 20 para introducir las mutaciones aleatorias en el aminoácido A504.

41. Construcción de Tth AKK GL A504S (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2749; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2750)

Se llevó a cabo mutagénesis de saturación sobre la construcción Tth AKK GL utilizando el 25 cebador mutagénico 680-80-03 5’- cag gag ctt agg ctt ccc nnn ttg aag aag acg aag aag aca-3’ (SEQ ID NO: 413) y el cebador inverso 680-80-06 5’-cct aag ctc gtc aaa gag-3’ (SEQ ID NO: 414) para introducir las mutaciones aleatorias en el aminoácido A504.

42. Construcción de Tth AKK GL S517G (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2751; secuencia de 30 aminoácidos SEQ ID NO: 2752)

Se llevó a cabo mutagénesis de saturación sobre la construcción Tth AKK GL utilizando el cebador mutagénico 680-80-07 5’-GGC AAG CGC TCC ACC NNN GCC GCG GTG CTG GAG GCC CTA CGG-3’ (SEQ ID NO: 421) y el cebador inverso 680-80-10 5’-GGT GGA GCG CTT GCC-3’ (SEQ ID NO: 422) para introducir las mutaciones aleatorias en el aminoácido S517. 35

43. Construcción de Tth AKK GL A518L (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2753; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2754),

Se llevó a cabo mutagénesis de saturación sobre la construcción Tth AKK GL utilizando el cebador mutagénico 680-80-07 5’-GGC AAG CGC TCC ACC AGC NNN GCG GTG CTG GAG 5 GCC CTA CGG-3’ (SEQ ID NO: 425) y el cebador inverso 680-80-10 5’-GGT GGA GCG CTT GCC-3’ (SEQ ID NO: 422) para introducir las mutaciones aleatorias en el aminoácido A518.

44. Construcción de Tth AKK GL A518R (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2755; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2756), 10

Se llevó a cabo mutagénesis de saturación sobre la construcción Tth AKK GL utilizando el cebador mutagénico 680-80-07 5’-GGC AAG CGC TCC ACC AGC NNN GCG GTG CTG GAG GCC CTA CGG-3’ (SEQ ID NO: 425) y el cebador inverso 680-80-10 5’-gg gga gcg ctt gcc-3’ (SEQ ID NO: 422) para introducir las mutaciones aleatorias en el aminoácido A518.

15

45. Construcción de Tth AKK GL A504K (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2757; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2758),

Se llevó a cabo mutagénesis sitiodirigida sobre la construcción Tth AKK GL usando el cebador mutagénico 680-69-04 5’- ctt agg ctt ccc aag ttg aag aag acg aag aag aca-3’ (SEQ ID NO: 433) y el cebador inverso 680-69-05 5’-tgt ctt ctt cgt ctt ctt caa ctt ggg aag cct aag-3’ (SEQ ID NO: 20 434) para introducir la mutación A504K en la enzima Tth AKK GL.

46. Construcción de Tth AKK GL H641A (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2759; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2760),

Se llevó a cabo mutagénesis sitiodirigida sobre la construcción Tth AKK GL usando el 25 cebador mutagénico 680-69-08 5’-gag ggg aag gac atc gcc acc cag acc gca agc-3’ (SEQ ID NO: 437) y el cebador inverso 583-01-02 5’-gct tgc ggt ctg ggt ggc gat gtc ctt ccc ctc- 3’ (SEQ ID NO: 438) para introducir la mutación H641A en la enzima Tth AKK GL.

47. Construcción de Tth AKK GL T508P (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2761; secuencia de 30 aminoácidos SEQ ID NO: 2762),

Se llevó a cabo mutagénesis sitiodirigida sobre la construcción TthAKK GL usando el cebador mutagénico 680-70-01 5’-ccc-gcc ttg aag aag ccg aag aag aca ggc aag-3’ (SEQ ID NO: 441) y el cebador inverso 680-70-02 5’-ctt gcc tgt ctt ctt cgg ctt ctt caa ggc ggg-3’ (SEQ ID NO: 442) para introducir la mutación T508P en la enzima Tth AKK GL. 35

48. Construcción de Taq(FT)TthAKK GL

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre la construcción TaqTthAKK construcción usando el cebador mutagénico 473-087-05: 5’-cgg-gac-ctc-gag-gcg-cgt-gaa-ccc-cag-gag-gtc-cac-3’ (SEQ ID NO: 483) para introducir las mutaciones L107F/A108T y generar 5 Taq(FT)TthAKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2779 secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2780).

49. Construcción de Tfi(FT)TthAKK GL

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre la construcción TthAKK GL usando 10 los cebadores mutagénicos 785-096-05: 5’-gtg-gac-ctt-ctg-ggc-ttt-acc-cgc-ctc-gag-gcc-ccg-3’ (SEQ ID NO: 486) y 785-096-02: 5’-cgg-ggc-ctc-gag-gcg-ggt- aaa-gcc-cag-aag-gtc-cac-3’ (SEQ ID NO: 487) para introducir las mutaciones L107F/V108T y generar Tfi(FT)TthAKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2720 secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2781).

15

50. Construcción de Tsc(FT)TthAKK GL

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre la construcción TscTthAKK GL usando los cebadores mutagénicos 785-008-03 5’-ttt-acc-cgc-ctc-gag-gtg-ccg-ggc-3’ (SEQ ID NO: 489) y el cebador inverso 680-21-03 5’-cgg cac ctc gag gcg ggt aaa gcc caa aag gtc cac-3’ (SEQ ID NO: 490) para introducir las mutaciones L107F/E108T y generar Tsc(FT)TthAKK GL (secuencia 20 de ADN SEQ ID NO: 2764; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2782).

51. Fusión entre la enzima TthAKK y alfa-péptido

Se construyó una fusión quimérica TthAKK GL-lacZ-alfa-péptido para permitir la detección de mutaciones (incluyendo desplazamientos de marco, delecciones, inserciones, etc.) que pueden 25 causar la incapacidad de la expresión de la proteína de fusión basándose en el cribado de colonias de color azul-blanco (Wu y col., Nucleic Acids Research, 24:1710 [1996]).

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN TthAKK GL utilizando los cebadores mutagénicos 959-041-03, 5’-cac-cac-cac-cac-cac-cac-gtc-gac-tag-tgc-tag-cgt-cga-cta-gct-gca-ggc-atg-caa-gct-tgg-c-3’ (SEQ ID NO: 477) y 959-041-04, 5’-gcc-aag-ctt-gca-tgc-ctg-cag-30 cta-gtc-gac-gct-agc-act-agt-cga-cgt-ggt-ggt-ggt-ggt-ggt-g-3’ (SEQ ID NO: 478) para generar pTthAKK GL-L con el sitio SalI siguiendo la etiqueta 6xHis en el extremo C de TthAKK GL para la inserción del péptido alfa lacZ. El péptido alfa (del aminoácido 201) en primer lugar se amplificó mediante PCR a partir del vector pCRII-TOPO (Invitrogen) con los cebadores 959-041-01, 5’-cag-gaa-gcg-gcc-gcg-tcg-aca-tga-cca-tga-tta-cgc-caa-gc-3’ (SEQ ID NO: 479) y 959-093-01, 5’-ggg-35 ccc-gcc-agg-gtc-gac-tca-ggg-cga-tgg-ccc-act-acg-tga-3’ (SEQ ID NO: 480). El producto de la PCR se digirió a continuación con la enzima de restricción SalI y se ligó en el vector pTthAKKGL-L, que también se cortó con la misma enzima para generar la construcción quimérica TthAKK GL péptido alfa (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2777; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2778). La orientación de la inserción se confirmó mediante secuenciación. 5

52. Construcción de TaqEFT-Tth(AKK) GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2790; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2791)

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de Taq(FT)-Tth(AKK) GL (SEQ ID NO: 2779) usando los cebadores mutagénicos 436-013-08: 5’-atc-gtg-gtc-ttt-gac-gcc-gag-gcc-10 ccc-tcc-ttc-c-3’ (SEQ ID NO: 503) y 436-013-09 5’-gga-agg- agg-ggg-cct-cgg-cgt-caa-aga-cca-cga-t-3’ (SEQ ID NO: 504) para introducir la mutación K70E.

53. Construcción de TaqEFT-Tth(AKK) GL-A/M1 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2792; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2793) 15

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de Taq(FT)-Tth(AKK) GL (SEQ ID NO: 2790) usando los cebadores mutagénicos 1044-038-01: 5’-cag-acc-atg-aat-tcg-gag-gcg-atg-ctg-ccc-ctc-ttt-3’ (SEQ ID NO: 507) y 1044-038-02: (SEQ ID NO: 508); 5’-aaa-gag-ggg-cag-cat-cgc-ctc-cga-att-cat-ggt-ctg-3’ para introducir la mutación G4EA.

20

54. Construcción de TaqEFT-Tth(AKK) GL-B/M2 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2794; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2795)

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de Taq(EFT)-Tth(AKK) GL (SEQ ID NO: 2790) usando los cebadores mutagénicos 1044-038-03: 5’-gcc-tac-cgc-acc-ttc-ttt-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-3 and 1044-038-04: 5’-gag-gcc-ctt-cag-ggc-aaa- gaa-ggt-gcg-gta-ggc-3’ (SEQ ID NO: 25 511 y 512, respectivamente) para introducir la mutación H29F.

55. Construcción de TaqEFT-Tth(AKK) GL-C/M3 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2796; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2797)

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de Taq(EFT)-Tth(AKK) GL (SEQ 30 ID NO: 2790) usando los cebadores mutagénicos 1044-038-05: 5’-ctc-ctc-aag-gcc-ctc-aga-gag-gac-ggg-gac-gcg-3’ y 1044-038-06: 5’-cag-gac-cag-ctc-gtt-ggc-cac-ttg-gag- gag-gag-3’ (SEQ ID NO: 515 y 516, respectivamente) para introducir la mutación K57R.

56. Construcción de TaqEFT-Tth(AKK) GL-D/M5 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2798; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2799 35

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de Taq(EFT)-Tth(AKK) GL (SEQ ID NO: 2790) usando los cebadores mutagénicos 1044-038-09: 5’-gac-gac-gtc-ctg-gcc-acc-ctg-gcc-aag-aag-gcg-3’ and 1044-038-10: 5’-cgc-ctt-ctt-ggc-cag-ggt- ggc-cag-gac-gtc-gtc-3’ (SEQ ID NO: 519 y 520, respectivamente) para introducir la mutación S125T.

5

57. Construcción de TaqEFT-Tth(AKK) GL-E/M6 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2800; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2801)

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de Taq(EFT)-Tth(AKK) GL (SEQ ID NO: 2790) usando los cebadores mutagénicos 1044-038-11: 5’-ggg-gag-aag-acg-gcg-ctc-aag-ctt-ctg-gag-gag-3’ y 1044-038-12: 5’-ctc-ctc-cag-aag-ctt-gag-cgc-cgt-ctt-ctc-ccc-3’ (SEQ ID NO: 10 523 y 524, respectivamente) para introducir la mutación R206L.

58. Construcción de TaqEFT-Tth(AKK) GL-F/M7 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2802; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2803)

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de Taq(FT)-Tth(AKK) GL (SEQ 15 ID NO: 2790) usando los cebadores mutagénicos 1044-038-13: 5’-gag-ccc-gac-cgg-gag-ggg-ctt-aag-gcc-ttt-ctg-gag-agg-3’ y 1044-038-14: 5’-cct-ctc-cag-aaa- ggc-ctt-aag-ccc-ctc-ccg-gtc-ggg-ctc-3 (SEQ ID NO: 527 y 528, respectivamente para introducir las mutaciones R269G y R271K.

59. Construcción de TaqEFT-Tth(AKK) GL-G/M8 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2804; 20 secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2805)

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de Taq(EFT)-Tth(AKK) GL (SEQ ID NO: 2790) usando los cebadores mutagénicos 1044-038-15: 5’-cac-gag-ttc-ggc-ctt-ctg-gga-ggg-gag-aag-ccc-cgg-gag-gag-gcc-ccc-tgg-ccc-3’ y 1044-038-16: 5’-ggg-cca-ggg-ggc-ctc-ctc-ccg-ggg-ctt-ctc-ccc-tcc-cag-aag-gcc-gaa-ctc-gtg-3’ (SEQ ID NO: 531 y 532, respectivamente) para 25 introducir las mutaciones E290G, S291G, P292E, A294P, y L295R.

60. Construcción de TaqEFT-Tth(AKK) GL-H/M9 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2806; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2807)

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de Taq(EFT)-Tth(AKK) GL (SEQ ID NO: 2790) usando los cebadores mutagénicos 1044-038-17: 5’-ctg-gcc-ctg-gcc-gcc- tgc-agg-30 ggc-ggc-cgc-gtg-3’ y 1044-038-18: 5’-cac-gcg-gcc-gcc-cct-gca-ggc-ggc-cag-ggc-cag-3’ (SEQ ID NO: 535 y 536, respectivamente) para introducir la mutación A328C.

61. Construcción de TaqEFT-Tth(AKK) GL-I/M10 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2808; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2809) 35

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de Taq(EFT)-Tth(AKK) GL (SEQ ID NO: 2790) usando los cebadores mutagénicos 1080-015-01 (SEQ ID NO: 539) 5’-ggg gag aag acg gcg agg aag ctt ctg aag gag tgg ggg agc-3’ y 1080-015-02 (SEQ ID NO: 540) 5’-gct ccc cca ctc ctt cag aag ctt cct cgc cgt ctt ctc ccc-3’ para introducir la mutación E210K.

5

62. Construcción de TaqEFT-Tth(AKK) GL-M1-9 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2810; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2811)

Se llevaron a cabo siete reacciones PCR independientes, utilizando la construcción TaqEFT-Tth(AKK) GL (SEQ ID: 2790) como plantilla. con los siguientes pares de cebadores mutagénicos: Reacción PRC 1; 1044-038-01 5’-cag-acc-atg-aat-tcg-gag-gcg- atg-ctg-ccc-ctc-ttt-3’ 10 (SEQ ID NO: 507) y 1044-038-04 5’-gag-gcc-ctt-cag-ggc-aaa-gaa-ggt-gcg-gta-ggc-3’ (SEQ ID NO: 512) para dar un fragmento de 108 pares de bases, Reacción PCR 2; 1044-038-03 5’-gcc-tac-cgc-acc-ttc-ttt-gcc-ctg-aag-ggc- ctc-3’ (SEQ ID NO: 511) y 1044-038-06 5’-cgc-gtc-ccc-gtc-ctc-tct-gag-ggc-ctt-gag-gag-3’ (SEQ ID NO: 516) para dar un fragmento de 117 pares de bases, Reacción PCR 3; 1044-038-05 5’-ctc-ctc-aag-gcc-ctc-aga-gag-gac-ggg-gac-gcg-3’ (SEQ ID NO: 515) y 15 1044-038-10 5’-cgc-ctt-ctt-ggc-cag-ggt-ggc-cag-gac-gtc-gtc-3’ (SEQ ID NO: 520) para dar un fragmento de 237 pares de bases, Reacción PCR 4; 1044-038-09 5’-gac-gac-gtc-ctg-gcc-acc-ctg-gcc-aag-aag-gcg-3’ (SEQ ID NO: 519) y 1044-038-12 5’-ctc-ctc-cag-aag-ctt-gag-cgc-cgt-ctt-ctc-ccc-3’ (SEQ ID NO: 524) para dar un fragmento de 276 pares de bases, Reacción PCR 5; 1044-038-11 5’-ggg-gag-aag-acg-gcg-ctc-aag-ctt-ctg-gag-gag-3’ (SEQ ID NO: 523) y 1044-038-14 5’- 20 cct-ctc-cag-aaa-ggc-ctt-aag-ccc-ctc-ccg-gtc-ggg-ctc-3’ (SEQ ID NO: 528) para dar un fragmento de 228 pares de bases, Reacción PCR 6; 1044-038-13 5’-gag-ccc-gac-cgg-gag-ggg-ctt-aag-gcc-ttt-ctg-gag-agg-3’ (SEQ ID NO: 527) y 1044-038-16 5’-ggg-cca-ggg-ggc-ctc-ctc-ccg-ggg-ctt-ctc-ccc-tcc-cag-aag-gcc-gaa-ctc-gtg-3’ (SEQ ID NO: 532) para dar un fragmento de 113 pares de bases, Reacción PCR 7; 1044-038-15 5’-cac-gag-ttc-ggc-ctt-ctg-gga-ggg-gag-aag-ccc-cgg-gag-gag-gcc-25 ccc-tgg- ccc-3’ (SEQ ID NO: 531) y 1044-038-18 5’-cac-gcg-gcc-gcc-cct-gca-ggc-ggc-cag-ggc-cag-3’ (SEQ ID NO: 536) para dar un fragmento de 157 pares de bases. Los siete productos de la PCR se solapan de manera que la amplificación por PCR en ausencia de cebadores proporcionó el producto adecuado de 1005 pares de bases para introducir las mutaciones K70E, G4EA, H29F, K57R, S125T, R206L, R269G, R271K, E290G, S291G, P292E, A294P, L295R, y A328C. El 30 producto se amplificó adicionalmente utilizando los cebadores exteriores: 1044-038-1 (SEQ ID NO: 507) y 1044-038-18 (SEQ ID NO: 536) y se clonó en pPCR-Script-Amp. A partir de esta construcción, el dominio nucleasa se amplificó de nuevo utilizando los cebadores: 1044-038-1 (SEQ ID NO: 507) y 1044-038-18 (SEQ ID NO: 536) y se digirió con EcoRI y NotI. Los productos digeridos mediante PCR se ligaron en la construcción TaqEFT-Tth(AKK) GL digerida con EcoRI y 35 NotI y se transformaron en JM109 para expresión y cribado de las proteínas.

63. Construcción de TaqEFT-Tth(AKK) GL-M1-10 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2812; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2813

Se llevaron a cabo siete reacciones PCR independientes, utilizando la construcción 5 TaqEFT-Tth(AKK) GL (SEQ ID: 2790) como plantilla. con los siguientes pares de cebadores mutagénicos: Reacción PRC 1; 1044-038-01 5’-cag-acc-atg-aat-tcg-gag-gcg- atg-ctg-ccc-ctc-ttt-3’ (SEQ ID NO: 507) y 1044-038-04 5’-gag-gcc-ctt-cag-ggc-aaa-gaa-ggt-gcg-gta-ggc-3’ (SEQ ID NO: 512) para dar un fragmento de 108 pares de bases, Reacción PCR 2; 1044-038-03 5’-gcc-tac-cgc-acc-ttc-ttt-gcc-ctg-aag-ggc- ctc-3’ (SEQ ID NO: 511) y 1044-038-06 5’-cgc-gtc-ccc-gtc-ctc-tct-gag-10 ggc-ctt-gag-gag-3’ (SEQ ID NO: 516) para dar un fragmento de 117 pares de bases, Reacción PCR 3; 1044-038-05 5’-ctc-ctc-aag-gcc-ctc-aga-gag-gac-ggg-gac-gcg-3’ (SEQ ID NO: 515) y 1044-038-10 5’-cgc-ctt-ctt-ggc-cag-ggt-ggc-cag-gac-gtc-gtc-3’ (SEQ ID NO: 520) para dar un fragmento de 237 pares de bases, Reacción PCR 4; 1044-038-09 5’-gac-gac-gtc-ctg-gcc-acc-ctg-gcc-aag-aag-gcg-3’ (SEQ ID NO: 519) y 1080-42-02 5’-gc ttc cag gct ccc cca ctc ctt cag aag ctt 15 gag cgc cgt ctt ctc ccc-3’ (SEQ ID NO: 546) para dar un fragmento de 299 pares de bases, Reacción PCR 5; 1080-42-01 5’-ggg gag aag acg gcg ctc agg ctt ctg aag gag tgg ggg agc ctg gaa gc-3’(SEQ ID NO: 545) y 1044-038-14 5’- cct-ctc-cag-aaa-ggc-ctt-aag-ccc-ctc-ccg-gtc-ggg-ctc-3’ (SEQ ID NO: 528) para dar un fragmento de 228 pares de bases, Reacción PCR 6; 1044-038-13 5’-gag-ccc-gac-cgg-gag-ggg-ctt-aag-gcc-ttt-ctg-gag-agg-3’ (SEQ ID NO: 527) y 1044-038-16 5’-20 ggg-cca-ggg-ggc-ctc-ctc-ccg-ggg-ctt-ctc-ccc-tcc-cag-aag-gcc-gaa-ctc-gtg-3’ (SEQ ID NO: 532) para dar un fragmento de 113 pares de bases, Reacción PCR 7; 1044-038-15 5’-cac-gag-ttc-ggc-ctt-ctg-gga-ggg-gag-aag-ccc-cgg-gag-gag-gcc-ccc-tgg- ccc-3’ (SEQ ID NO: 531) y 1044-038-18 5’-cac-gcg-gcc-gcc-cct-gca-ggc-ggc-cag-ggc-cag-3’ (SEQ ID NO: 536) para dar un fragmento de 157 pares de bases. Los siete productos de la PCR se solapan de manera que la amplificación por 25 PCR en ausencia de cebadores proporcionó el producto adecuado de 1005 pares de bases para introducir las mutaciones K70E, G4EA, H29F, K57R, S125T, R206L, E210K, R269G, R271K, E290G, S291G, P292E, A294P, L295R, y A328C. El producto se amplificó adicionalmente utilizando los cebadores exteriores: 1044-038-1 (SEQ ID NO: 507) y 1044-038-18 (SEQ ID NO: 536) y se clonó en pPCR-Script-Amp. A partir de esta construcción, el dominio nucleasa se 30 amplificó de nuevo utilizando los cebadores: 1044-038-1 (SEQ ID NO: 507) y 1044-038-18 (SEQ ID NO: 536) y se digirió con EcoRI y NotI. Los productos digeridos mediante PCR se ligaron en la construcción TaqEFT-Tth(AKK) GL digerida con EcoRI y NotI y se transformaron en JM109 para expresión y cribado de las enzimas.

35

64. Construcción de Tth(K69E)AKK, Taq(K69E)TthAKK, Tfi(K69E)TthAKK y Tsc(K69E)TthAKK y los mutantes

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre TthAKK GL, TaqTthAKK GL, TthAKK GL y TscTthAKK GL usando los cebadores mutagénicos 5’-atc-gtg-gtc-ttt-gac-gcc-gag-gcc-ccc-tcc-ttc-c-3’ (SEQ ID NO: 492) y 5’-gga-agg-agg-ggg-cct- cgg-cgt-caa-aga-cca-cga-t-3’ (SEQ ID 5 NO: 493) para introducir la mutación K69E y generar las enzimas mutantes Tth(K69E)AKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2763 secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2783), Taq(K69E)ThAKK GL, (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2784; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2785), Tfi(K69E)TthAKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2786 secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2787) y Tsc(K69E)TthAKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2788; secuencia de 10 aminoácidos SEQ ID NO: 2789; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2789).

65. Construcción de Tsc(167-334)TthAKK GL

Se generaron dos fragmentos PCR solapantes a partir de los cebadores 390-76-08: 5’-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 1044-041-01: 5’-ctt-ctc-tca-tcc-gcc-aaa-aca-gcc-3’ (SEQ 15 ID NO: 451) con la plantilla Tth(K69E)AKK GL, (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2763), y los cebadores 1044-041-02: 5’-ctc-ctc-cac-gag-ttc-ggc-3’ (SEQ ID NO: 453) y 209-074-02: 5’-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3’ (SEQ ID NO: 316) con la plantilla Tsc(K69E)TthAKK GL, (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2764). Los dos productos se combinaron y amplificaron con los cebadores externos 390-76-08 y 209-074-02. El producto PCR recombinante se cortó con las enzimas de 20 restricción EcoRI y NotI y se ligó en el vector TthAKK GL que se preparó mediante corte con las mismas enzimas para dar la construcción Tsc(167-333)TthAKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2765; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2766).

66. Construcción de Tsc(222-334)TthAKK GL 25

Se generaron dos fragmentos PCR solapantes a partir de los cebadores 390-76-08: 5’-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 1044-041-03: 5’-ttc-cag-gtg-ctt-gag-gag-gtt-ttc-cag-3’ (SEQ ID NO: 457) con la plantilla Tth(K69E)AKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2763), y los cebadores 1044-041-04: 5’-ctc-ctc-aag-cac-ctg-gaa-cag-gtg-aaa-3’ (SEQ ID NO: 458) y 209-074-02: 5’-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3’ (SEQ ID NO: 316) con la plantilla Tsc(K69E)TthAKK GL, 30 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2764). Los dos productos se combinaron y amplificaron con los cebadores externos 390-76-08 y 209-074-02. El producto PCR recombinante se cortó con las enzimas de restricción EcoRI y NotI y se ligó en el vector TthAKK GL que se preparó mediante corte con las mismas enzimas para dar la construcción Tsc(222-334)TthAKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2767; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2768). 35

67. Construcción de Tfi(222-334)TthAKK GL

Se generaron dos fragmentos PCR solapantes a partir de los cebadores 390-76-08: 5’-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 1044-058-05: 5’-gtc-cag-gtt-ctt-gag-gag-gtt-ttc-cag-3’ (SEQ ID NO: 461) con la plantilla Tth(K69E)AKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2763), y los 5 cebadores 1044-058-06: 5’-ctc-ctc-aag-aac-ctg-gac-cgg-gta-aag-3’ (SEQ ID NO: 462) y 209-074-02: 5’-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3’ (SEQ ID NO: 316) con la plantilla Tfi(K69E)TthAKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: Los dos productos se combinaron y amplificaron con los cebadores externos 390-76-08 y 209-074-02. El producto PCR recombinante se cortó con las enzimas de restricción EcoRI y NotI y se ligó en el vector TthAKK GL que se preparó mediante 10 corte con las mismas enzimas para dar la construcción Tfi(222-334)TthAKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2769; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2770).

68. Construcción de Tfi(167-334)TthAKK GL

Se generaron dos fragmentos PCR solapantes mediante los cebadores 390-76-08 5’-tgt-15 gga-att-gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 1044-058-07 5’-gac-gtc-ctt-cgg-ggt-gat-gag-gtg-gcc-3’ (SEQ ID NO: 465) con la plantilla Tth(K69E)AKK GL, (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2763), y los cebadores 1044-058-08 5’-atc-acc-ccg-aag-gac-gtc-cag-gag-aag-3’ (SEQ ID NO: 466) y 209-074-02 5’-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3’ (SEQ ID NO: 316) con la plantilla Tfi(K69E)TthAKK GL, (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2787). Los dos productos se combinaron y amplificaron con los 20 cebadores externos 390-76-08 y 209-074-02. El producto PCR recombinante se cortó con las enzimas de restricción EcoRI y NotI y se ligó en el vector TthAKK GL que se preparó mediante corte con las mismas enzimas para dar la construcción Tfi(167-333)TthAKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2771; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2772).

25

69. Construcción de Tsc(111-334)TthAKK GL

Se generaron dos fragmentos PCR solapantes mediante los cebadores 390-76-08 5’-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 1044-058-01 5’-ctc-gag-gcg-ggt-aaa-ccc-cag-gag-gtc-3’ (SEQ ID NO: 469) con la plantilla Tth(K69E)AKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2763), y los cebadores 1044-058-02 5’-ggg-ttt-acc-cgc-ctc-gag-gtg-ccc-ggc-3’ (SEQ ID NO: 470) y 209-074-02 30 5’-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3’ (SEQ ID NO: 316) con la plantilla Tsc(K69E)TthAKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2788). Los dos productos se combinaron y amplificaron con los cebadores externos 390-76-08 y 209-074-02. El producto PCR recombinante se cortó con las enzimas de restricción EcoRI y NotI y se ligó en el vector TthAKK GL que se preparó mediante corte con las mismas enzimas para dar la construcción Tsc(167-333)TthAKK GL (secuencia de 35 ADN SEQ ID NO: 2773; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2774).

70. Construcción de Tsc(1-167)TthAKK GL

Se generaron dos fragmentos PCR solapantes mediante los cebadores 390-76-08 5’-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 1044-058-03 5’-aag-cca-ctc-cgg-ggt-gat-cag-gta-acc-3’ 5 (SEQ ID NO: 473) con la plantilla Tsc(K69E)TthAKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2788), y los cebadores 1044-058-04 5’-atc-acc-ccg-gag-tgg-ctt-tgg-gag-aag-3’ (SEQ ID NO: 474) y 209-074-02 5’-gtg-gcc-tcc-ata-tgg-gcc-agg-ac-3’ (SEQ ID NO: 316) con la plantilla Tth(K69E)AKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2763). Los dos productos se combinaron y amplificaron con los cebadores externos 390-76-08 y 209-074-02. El producto PCR recombinante se cortó con las 10 enzimas de restricción EcoRI y NotI y se ligó en el vector TthAKK GL que se preparó mediante corte con las mismas enzimas para dar la construcción Tsc(1-167)TthAKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2775; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2776).

71. Construcción de Afu336-Tth296(AKK) GL, AT1-1 15

Se generaron dos fragmentos PCR solapantes. El primer fragmento se preparó usando la construcción AfuFEN (SEQ ID NO: 556) como plantilla con los cebadores: 390-076-08 5’-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 390-065-05 5’-gaa-cca-cct-ctc-aag-cgt-gg-3’ (SEQ ID NO: 554). El segundo fragmento se preparó usando TthAKK GL (SEQ ID NO: 2702) como plantilla y los cebadores: 700-049-01 5’-acg-ctt-gag-agg-tgg-ttc-ctg-gag-gag-gcc-ccc-tgg-3’ (SEQ ID NO: 20 555) y 390-076-09 5’-taa-tct-gta-tca-ggc-tg-3’ (SEQ ID NO: 557). Los dos productos contienen una región con solapamiento de secuencia, y se combinaron y amplificaron con los cebadores externos 390-076-08 y 390-076-09 en una reacción PCR recombinante. El producto PCR recombinante se cortó con las enzimas de restricción BspEI y SalI y se ligó en la construcción AfuFEN que se preparó mediante corte con las mismas enzimas para dar la construcción Afu336-25 Tth296(AKK) GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2814; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2815).

72. Construcción de Afu328-Tth296(AKK) GL, AT2-3

Se generaron dos fragmentos PCR solapantes, el primero mediante los cebadores: 390-30 076-08 5’-tgt-gga-att-gtg-agc-gg-3’ (SEQ ID NO: 314) y 700-049-02 5’-ggt-tga-ctt-cag-agc-ttt-gag-3’ (SEQ ID NO: 561) con la plantilla AfuFEN (secuencia de ADN SEQ ID NO: 556), y el segundo con los cebadores: 700-049-03 5’-aaa-gct-ctg-aag-tca-acc-ctg-gag-gag-gcc-ccc- tgg-3’ (SEQ ID NO: 562) y 390-076-09 5’-taa-tct-gta-tca-ggc-tg-3’ (SEQ ID NO: 557) con la plantilla TthAKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2702). Los dos productos se combinaron y amplificaron con los 35 cebadores externos 390-076-08 y 390-076-09. El producto PCR recombinante se cortó con las enzimas de restricción BspEI y SalI y se ligó en el vector pAfuFEN que se preparó mediante corte con las mismas enzimas para dar la construcción Afu336-Tth296(AKK) GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2817).

El procedimiento de quimerización aleatoria anteriormente descrito se utilizó para 5 desarrollar las siguientes quimeras.

73. Generación de las quimeras aleatorias S26 y S36

Las plantillas utilizadas para desarrollar estas enzimas quiméricas fueron los dominios nucleasa procedentes de las construcciones TthAKK GL, TaqT- thAKK GL, TscTthAKK GL y 10 TthAKK GL. Se encontró que dos clones mostraban mejora de la actividad basándose en el cribado según la actividad primaria. Las quimeras aleatorias S26 GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2818; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2819) y S36 (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2820; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2821) se secuenciaron y aislaron a continuación.

15

74. Construcción de S26(FT) GL

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pS26 GL usando los cebadores mutagénicos: 785-008-03 5’-ttt-acc- cgc-ctc-gag-gtg-ccg-ggc-3’ (SEQ ID NO: 489) y 680-21-03 5’-cgg-cac-ctc-gag-gcg-ggt-aaa-gcc-caa-aag-gtc-cac-3’ (SEQ ID NO: 490) para introducir las mutaciones L107F/E108T y generar S26(FT) GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 20 2822; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2823).

75. Construcción de S36(FT) GL

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pS36 GL usando los cebadores mutagénicos: 785-096-01: 5’-gtg-gac-ctt-ctg-ggc-ttt-acc-cgc-ctc-gag-gcc-ccg-3’ (SEQ ID 25 NO: 486) y 785-096-02: 5’-cgg-ggc-ctc-gag-gcg-ggt- aaa-gcc-cag-aag-gtc-cac-3’ (SEQ ID NO: 487) para introducir las mutaciones L109F/V110T y generar S36(FT) GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2824; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2825).

76. Construcción de S26(K69E) GL 30

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de S26 GL usando los cebadores mutagénicos: 5’-atc-gtg-gtc-ttt-gac-gcc-gag-gcc-ccc-tcc-ttc-c-3’ (SEQ ID NO: 492) y 5’-gga-agg-agg-ggg-cct- cgg-cgt-caa-aga-cca-cga-t-3’ (SEQ ID NO: 493) para introducir la mutación K69E y generar S26(K69E) GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2827).

35

77. Construcción de S26(FT/K69E) GL

Se llevó a cabo la mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de S26(FT) GL usando los cebadores mutagénicos: 5’-atc-gtg-gtc-ttt-gac-gcc-gag-gcc-ccc-tcc-ttc-c-3’ (SEQ ID NO: 492) y 5’-gga-agg-agg-ggg-cct- cgg-cgt-caa-aga-cca-cga-t-3’ (SEQ ID NO: 493) para introducir la mutación K69E y generar S26(FT/K69E) GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: secuencia de aminoácidos 5 SEQ ID NO: 2829).

78. Más quimeras aleatorias, N3D7, N1A12 N1C4, y N2C3

Las plantillas usadas para generar estas quimeras fueron los dominios nucleasa de las construcciones Tth(K69E)AKK GL, Taq(K69E)TthAKK GL, Tsc(K69E)TthAKK GL y 10 Tfi(K69E)TthAKK GL. Se demostró que cuatro clones mostraban mejora de la actividad basándose en el cribado según la actividad primaria. Las quimeras aleatorias N3D7 GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2830; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2831), N1A12 GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2832; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2833), N1C4 GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2834; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2835) y N2C3 GL (secuencia 15 de ADN SEQ ID NO: 2836; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2837) se secuenciaron y aislaron respectivamente.

Generación de variantes DL, GR y DR de la enzima TthAKK GL

Se creó una serie de variantes de TthAKK GL con un cambio Gly a Asp en el aminoácido 20 385 (G385D) y/o un cambio Leu a Arg en el aminoácido 455 (L455R). Las construcciones que comprendes ambas variaciones de aminoácidos se indican como "DR". Las quimeras que comprenden solamente una de las variaciones se han indicado con ’DL’ o ’GR’.

1. Construcción del mutante TthAKK DL 25

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TthAKK GL (SEQ ID NO: 2702) usando los cebadores mutagénicos 1144-60-01: 5’-cgc-cta-cct-cct-gga-ccc-ttc-gaa-cac-cac-c-3’ (SEQ ID NO: 2858) y 1144-60-02, 5’-ggt-ggt-gtt- cga-agg-gtc-cag-gag-gta-ggc-g-3’ (SEQ ID NO: 2859) para introducir la mutación G383D para dar TthAKK DL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2838; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2839). 30

2. Construcción del mutante TthAKK GR

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TthAKK GL (SEQ ID NO: 2702) usando los cebadores mutagénicos 1144-60-03: 5’-ggt-acg-gcg-gga-cgt-ggc-cta-cct-tca-g-3’ (SEQ ID NO: 2860) y 1144-60-04, 5’-ggt-ggt-gtt- cga-agg-gtc-cag-gag-gta-ggc-g-3’ (SEQ 35 ID NO: 2861) para introducir la mutación L453R para dar TthAKK GR (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2840; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2841).

3. Construcción del mutante TthAKK DR

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TthAKK GL (SEQ ID 5 NO: 2702) usando los cebadores mutagénicos 1144-60-01: 1144-60-02, 1144-60-03 y 1144-60-04 (SEQ ID NOS:2858, 2859, 2860 y 2861, respectivamente para introducir las mutaciones G383D y L453R para der el mutante TthAKK DR (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2842; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2843).

10

4. Construcción de TthAKK(F29R) GL

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TthAKK GL (SEQ ID NO: 2702) usando los cebadores mutagénicos 1249-26-01: 5’-cac-ctg-gcc-tac-cgc-acc-cgc-ttc-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-3’ (SEQ ID NO: 2862) y 1249-26-02, 5’-gag-gcc-ctt-cag-ggc-gaa-gcg-ggt-gcg-gta-ggc-cag-gtg-3’ (SEQ ID NO: 2863) para introducir la mutación F29R para dar el mutante 15 TthAKK(F29R) GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2844; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2845).

5. Construcción de TthAKK(F29R/F30H) GL

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TthAKK GL (SEQ ID 20 NO: 2702) usando los cebadores mutagénicos 1249-26-03: 5’-cac-ctg-gcc-tac-cgc-acc-cgc-cac-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-3’ (SEQ ID NO: 2864) y 1249-26-04, 5’-ggt-gag-gcc-ctt-cag-ggc-gtg-gcg-ggt-gcg-gta-ggc-cag-gtg-3’ (SEQ ID NO: 2865) para introducir las mutaciones F29R/F30H para dar el mutante TthAKK(F29R/F30H) GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2846; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2847). 25

6. Construcción de TthAKK(F29R/F30R) GL

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TthAKK GL (SEQ ID NO: 2702) usando los cebadores mutagénicos 1249-26-05: 5’-cac-ctg-gcc-tac-cgc-acc-cgc-cgc-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-3’ (SEQ ID NO: 2866) y 1249-26-06, 5’-ggt-gag-gcc-ctt-cag-ggc-gcg-gcg-ggt-30 gcg-gta-ggc-cag-gtg-3’ (SEQ ID NO: 2867) para introducir las mutaciones F29R/F30R para dar el mutante TthAKK(F29R/F30R) GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2848; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2849).

7. Construcción de Tsc(F26R)TthAKK GL

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TscTth(AKK) GL 35 (SEQ ID NO: 2708) usando los cebadores mutagénicos 1249-26-01: 5’-cac-ctg-gcc-tac-cgc-acc-cgc-ttc-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-3’ (SEQ ID NO: 2862) y 1249-26-02, 5’-gag-gcc-ctt-cag-ggc-gaa-gcg-ggt-gcg-gta-ggc-cag-gtg-3’ (SEQ ID NO: 2863) para introducir la mutación F29R para dar el mutante Tsc(F26R)TthAKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2851).

8. Construcción de Tsc(F26R/F27H)TthAKK GL 5

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TscTthAKK GL (SEQ ID NO: 2708) usando los cebadores mutagénicos 1249-26-03: 5’-cac-ctg-gcc-tac-cgc-acc-cgc-cac-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-3’ (SEQ ID NO: 2864) y 1249-26-04, 5’-ggt-gag-gcc-ctt-cag-ggc-gtg-gcg-ggt-gcg-gta-ggc-cag-gtg-3’ (SEQ ID NO: 2865) para introducir las mutaciones F26R/F27H para dar el mutante Tsc(F26R/F27H)TthAKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2852; secuencia 10 de aminoácidos SEQ ID NO: 2853).

9. Construcción de Tsc(F26R/F27R)TthAKK GL

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A TscTthAKK GL (SEQ ID NO: 2708) usando los cebadores mutagénicos 1249-26-05: 5’-cac-ctg-gcc-tac-cgc-acc-15 cgc-cgc-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-3’ (SEQ ID NO: 2866) y 1249-26-06, 5’-ggt-gag-gcc-ctt-cag-ggc-gcg-gcg-ggt-gcg-gta-ggc-cag-gtg-3’ (SEQ ID NO: 2867) para introducir las mutaciones F26R/F27R para dar el mutante Tsc(F26R/F27R)TthAKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2854; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2855).

20

10. Construcción de Taq(F28R)TthAKK GL

Se llevó a cabo mutagénesis sitioespecífica sobre el ADN de pTrc99A-TaqTthAKK GL (SEQ ID NO: 2706) usando los cebadores mutagénicos 1249-26-03: 5’-cac-ctg-gcc-tac-cgc-acc-cgc-cac-gcc-ctg-aag-ggc-ctc-3’ (SEQ ID NO: 2864) y 1249-26-04: 5’-ggt-gag-gcc-ctt-cag-ggc-gtg-gcg-ggt-gcg-gta-ggc-cag-gtg-3’ (SEQ ID NO: 2865) para introducir la mutación F28R y generar el 25 mutante Taq(F28R)TthAKK GL (secuencia de ADN SEQ ID NO: 2856; secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2857).

TABLA 2

Klenow: Kcat (s-1) Km(dNTP) (µM) Kd (nM) Afinidad relativa del ADN Referencia Taq Pol

Natural: 2,4 2,8 8 1 2
Natural

S610A: n.d. - n.d. - 5 S515

30 (continuación)

R668A: 0,006 6,5 140,150 0,06,0,05 1,2 R573*

N678A: n.d. - n.d. - 5 N583

E710A: 0,1 15 250 0,03 2 E615*

E710D: 1,7 7,7 110 0,07 2 E615*

K758A: 0,131 15,6 - 0,63 4 K663

K758R: 2,0 2,1 - 1,125 4 K663

Y766S: 0,8 6,4 13 0,4,0,6 1,2 Y671

R841A: 0,3 9,8 40,53 0,2 1,2 R746*

N845A: 1,0 23 8,5 1,0,1,7 1,2 N750*

N845Q: 0,03 1,7 80,55 0,1,0,2 1,2 N750*

Q849A: 0,02 3,8 100,160 0,08,0,05 1,2 Q754

Q849E: 0,001 n.d. 90,91 0,09 1,2 Q754

H881A: 0,3 3,3 20,28 0,4,0,3 1,2 H784*

D882N: <0,0001 n.d. 30 0,6 2 D785

Referencias: 1. JBC (1990) 265:14579-14591 2. JBC (1992) 267:8417-8428 3. Eur. J. Biochem (1993) 214:59-65 4. JBC (1994) 269:13259-13265 5. Nature (1996) 382:278-281

TABLA 3: mutaciones racionales en la región de la polimerasa

A. Tabla de actividad del ADN

: IdT % de Tth % de Taq4M HP X

Tth DN RX HT: 31,91 100% 83% 3,81 101,9

Tth DN RC HT H641A: 23,61 74% 62% 5,32 221,24

Tth DN RX HT R748A: 22,1 69% 58% 4,39 88,17

Tth DN RX HT H786A: 34,31 108% 90% 7,75 185,35

Tth DN RX HT H786A/G506K/ Q509K (AKK): 32,1 101% 84% 5,7 332,8

5 (continuación)

Taq DN RX HT W417L/G418K/ E507QH784A (Taq 4M): 38,23 120% 100% 68,21 1100,18

Taq 4M G504K: 36,04 113% 94% 31,76 417,40

Taq 4M H639A: 42,95 135% 112% 91,46 2249,67

Taq 4M R587A: 44,78 140% 117% 143,0 252,69

Taq DN RX HT W417L/G418K/ G499R/A502K/ I503L/K504N/ E07K/H784A (Taq8M): 43,95 138% 115% 122,53 346,56

TaqSS R677A: 32,2 101% 84% 206,9 2450,0

B. Tabla de actividad del ARN

: IrT1 % de Tth % de Taq4M

Tth DN RX HT: 0,89 100% 34%

Tth DN RX HT H641A: 1,18 133% 45%

Tth DN RX HT R748A: 1,34 151% 51%

Tth DN RX HT H786A: 1,31 147% 49%

Tth DN RX HT H786A/G506K/ Q509K (AKK): 1,59 179% 60%

Taq DN RX HT W417L/G418K/ E507Q/H784A (Taq 4M): 2,65 298% 100%

Taq 4M G504K: 2,76 310% 114%

Taq 4M H639A: 3,89 437% 147%

Taq 4M R587A: 3,13 352% 118%

(continuación)

Taq DN RX HT W417L/G418K/ G499R/A502K/ I503L/K504N/ E07K/H784A (Taq8M): 4,00 450% 151%

TaqSS R677A: 2,22 249% 84%

TABLA 4: Mutaciones racionales del arco

Tabla de actividad del ADN

: IdT % de Tth % de Taq4M HP X

Taq 4M P88E/P90E: 10,20 32% 27% 2,00 97,00

Taq 4M G80E: 26,30 82% 69% 103,6 2900

Taq 4M L109F/A110T: 36,45 114% 95% 19,71 749,69

5

Tabla de actividad del ARN

: IrT1 % de Tth % de Taq 4M

Taq 4M P88E/P90E: 0,10 11% 4%

Taq 4M G80E: 3,11 349% 117%

Taq 4M L109F/A110T: 2,45 275% 92%

TABLA 5: Combinaciones arco/pulgar

Tabla de actividad del ADN

: IdT % de Tth % de Taq4M HP X

Taq W417L/ G418K/E507K/ H784A/L109F/ A110T/G499R/ A502K/I503L/ G504K/E507K/ T514S (Taq SS): 63,33 198% 166% 177,05 202,32

10 (continuación)

Taq P88E/p90E/ W417L/G418K/ G499R/A502K/ I503L/G504K/ E507K/T514S/ H784A: 36,48 114% 95% 9,44 70,35

Tabla de actividad del ARN

: IrT1 % de Tth & de Taq4M

Taq W417L/ G418K/E507K/ H784A/L109F/ A110T/G499R/ A502K/I503L/ G504K/E507K/ T514S (Taq SS): 3,16 355% 119%

Taq P88E/P90E/ W417L/G418K/ G499R/A502K/ I503L/G504K/ E507K/T514/S H784A: 0,22 25% 8%

TABLA 6: mutagénesis aleatoria de hélice-horquilla-hélice 5

Tabla de actividad del ADN

: IdT % de Tth % de Taq4M HP X

TaqSS K198N: 23,4 73% 61% 25,7 1233,1

TaqSS A205Q: 25,6 80% 67% 13,4 699,1

TaqSS T204P: 11,2 35% 29% 1,9 209,4

TaqSS I200M/A205G: 16,8 53% 44% 7,8 597,2

TaqSS K203N: 25,9 81% 68% 36,6 1429,8

Tth DN RX HT H786A/P197R/K200R: 10,7 33% 28% 3,2 66,3

Tth DN RX HT H786A/K205Y: 11,5 36% 30% 6,1 327,5

(continuación)

Tth DN RX HT H786A/G203R: 18,3 57% 48% 2,1 98,8

Tabla de actividad del ADN

: IrT1 % de Tth % de Taq4M

TaqSS K198N: 1,22 137% 46%

TaqSS A205Q: 0,62 70% 23%

TaqSS T204P: 0,36 40% 14%

TaqSS I200M/A205G: 0,77 87% 29%

TaqSS K203N: 2,09 235% 79%

Tth DN RX HT H786A/P197R/K200R: 0,47 52% 18%

Tth DN RX HT H786A/K205Y: 0,68 77% 26%

Tth DN RX HT H786A/G203R: 1,61 180% 61%

TABLA 7: Mutaciones aleatorias del pulgar 5

Tabla de actividad del ADN

: IdT % de Tth % de Taq4M HP X

Taq DN RX HT W417L/G418K/ E507K/H784A/G499R A502K/K504N/(M1-13): 59,96 188% 157% 133,65 907,41

Taq DN RX HT W417L/G418K/ /H784A/L500I/Q507H A502K/G504K (M1-36): 46,74 146% 122% 123,11 822,61

Taq DN RX HT W417L/G418K/G499R/ A502K/G504K/E507K/ H784A/T514S (M2-24): 85,7 269% 224% 369,96 3752,12

Taq DN RX HT W417L/G418K/G499R/ A502K/G504K/E507K/ H784A/V518L (M2-06): 76,7 240% 201% 355,87 2038,19

Tabla de actividad del ARN

: IrT1 % de Tth % de Taq4M

Taq DN RX HT W417L/G418K/ E507K/H784A/G499R/ A502K/K504N/ (M1-13): 2,55 287% 96%

Taq DN RX HT W417L/G418K/ /H784A/L500I/Q507H A502K/G504K (M1-36): 2,71 304% 102%

Taq DN RX HT W417L/G418K/G499R/ A502K/G504K/E507K/ H784A/T514S (M2-24): 4,43 498% 167%

Taq DN RX HT W417L/G418K/G499R/ A502K/G504K/E507K/ H784A/V518L (M2-06): 3,56 400% 134%

TABLA 8: Mutantes quiméricos

A. Tabla de actividad del ADN 5

: IdT2 % de TthAKK HP X

TthAKK: 34,18 100% 5 393

Taq 4M G504K: 40,19 105% 28 1991

Tfi DN 2M: 36,60 106% 289 1326

Tsc DN 2M: 25,49 75% 283 2573

TaqTthAKK: 63,89 187% 32 1658

TthTaq 4M G504K: 25,03 73% 8 627

TfiTthAKK: 34,13 100% 15 459

TscTthAKK: 35,23 103% 15 459

TfiTaq 4M G504K: 35,69 104% 37 872

TscTaq 4M G504K: 30,04 88% 25 2008

B. Tabla de actividad del ARN

: IrT3 % de TthAKK

TthAKK: 2,27 100%

Taq 4M G504K: 2,31 102%

Tfi DN 2M: 0,20 9%

Tsc DN 2M: 0,29 13%

TaqTthAKK: 6,81 300%

10

(continuación)

TthTaq 4M G504K: 1,09 48%

TfiTthAKK: 1,24 55%

TscTthAKK: 9,65 4,25%

TfiTaq 4M G504K: 1,05 46%

TscTaq 4M G504K: 2,95 130%

5

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Una composición que comprende una enzima nucleasa 5’ que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2857.

5
2.- Una composición que comprende un ácido nucleico que codifica la enzima de la Reivindicación 1, en la que dicho ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2856.
3.- La composición de la Reivindicación 2 que comprende además un vector de expresión, 10 comprendiendo dicho vector de expresión dicho ácido nucleico de la Reivindicación 2.
4.- Una composición que comprende una célula huésped que contiene el vector de expresión de la Reivindicación 3.

15
5.- Un kit que comprende la composición de la Reivindicación 1.
6.- El kit de la Reivindicación 5, que comprende además al menos un sustrato de escisión del ácido nucleico.

20
7.- El kit de la Reivindicación 6, que comprende además al menos un ARN capaz de hibridarse con dicho sustrato de escisión del ácido nucleico.
8.- El kit de la Reivindicación 5, que comprende además un oligonucleótido marcado.

25
9.- El kit de la Reivindicación 5, que comprende además un oligonucleótido invasivo.
10.- Un procedimiento para escindir un ácido nucleico que comprende:

a) proporcionar:

i) la enzima de la Reivindicación 1; y 30

ii) una muestra que comprende ácido nucleico sustrato; y

b) exponer dicho ácido nucleico sustrato a dicha enzima.
11.- El procedimiento de la Reivindicación 10, en el que dicha exposición de dicho ácido nucleico sustrato a dicha enzima produce al menos un producto de escisión. 35
12.- El procedimiento de la Reivindicación 11, que comprende además la etapa de c) detectar dicho producto de escisión.
13.- El procedimiento de la Reivindicación 10 que comprende un lisado celular que comprende ácido nucleico sustrato. 5