JP3655240B2 - インビトロでの核酸合成および増幅の改善のための熱安定dnaポリメラーゼの忠実度を促進する熱安定酵素 - Google Patents

インビトロでの核酸合成および増幅の改善のための熱安定dnaポリメラーゼの忠実度を促進する熱安定酵素 Download PDF

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Description

【0001】
本発明は、分子生物学の分野に関し、より詳細にはポリヌクレオチド合成に関する。また、本発明は、実質的に純粋な熱安定エキソヌクレアーゼ、大腸菌における熱安定エキソヌクレアーゼIIIのクローニングおよび発現、ならびに増幅反応におけるそれの使用に関する。本発明は、持ち越し汚染からの除染を可能にする条件下でのDNAの高忠実度増幅および長鎖産物の合成を促進する。
【0002】
インビトロ核酸合成は、DNAポリメラーゼを用いてさらなるポリペプチド有りまたは無しでルーチン的に行われる。DNAポリメラーゼは、DNA複製および修復に関連する酵素のファミリーである。大腸菌等の中温微生物からのDNAポリメラーゼの単離に関して広範な研究が行われてきた。例えば、ベスマン (Bessman)ら、(1957)J.Biol.Chem.223:171〜177、およびブーチン(Buttin)およびコーンバーグ(Kornberg)、(1996)J.Biol.Chem.241:5419−5427参照。
【0003】
サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus)等の好熱菌からのDNAポリメラーゼの単離および精製に関する研究が行われてきた。キーエン(Chien),Aら、(1976)J.Bacteriol.127:1550−1557は、サーマス・アクアティカスYT1株からの80℃の至適温度を有するDNAポリメラーゼの単離および精製を開示している。米国特許第4,889,818号は、約86,000〜90,000ダルトンの分子量を有するT.アクアティカスに由来する精製された熱安定DNAポリメラーゼ、Taqポリメラーゼを開示している。さらに、欧州特許出願0 258 017は、PCRプロセスにおける使用に好ましい酵素としてTaqポリメラーゼを開示している。
【0004】
TaqDNAポリメラーゼは、5’−3’ポリメラーゼ依存性エキソヌクレアーゼ機能を有するが、TaqDNAポリメラーゼは、3’−5’エキソヌクレアーゼIII機能を保持しないことが研究により示されている[ローヤー(Lawyer),F.C.ら、(1989)J.Biol.Chem.,264:6427−6437;バーナード(Bernad)A.ら、(1989)Cell 59:219]。DNAポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性は、「プルーフリーディング活性」と一般に呼ばれる。3’−5’エキソヌクレアーゼ活性は、プライマー−テンプレート二重鎖の3’末端でミスマッチした塩基を除去する。3’−5’エキソヌクレアーゼ活性の存在は、核酸鎖の複製の忠実度における増大および成熟前に終結した産物の伸長を導くので有利であり得る。TaqDNAポリメラーゼは、ミスマッチしたプライマー末端を除去し得ないので、塩基取り込みエラーを生じやすく、所定の適用においてはその使用は望ましくない。例えば、遺伝子のいずれのコピーもランダムな誤取り込み現象のためにエラーを含み得るので、増幅した遺伝子をクローンニングしようとする試みは問題がある。エラーが生じるサイクル(例えば、初期の複製サイクルにおける)に依存して、増幅したDNA全体が、誤って取り込んだ塩基を含み、従って、変異した遺伝子産物を生じうる。
【0005】
高忠実度DNA増幅に使用される熱安定古細菌に由来するB型ポリメラーゼのような3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を示す数種の熱安定DNAポリメラーゼが当該技術分野において知られている。3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を示す熱安定ポリメラーゼは、ピロコッカス(Pyrococcus)[精製された熱安定ピロコッカス熱安定DNAポリメラーゼ、マザー(Mathur)E.、Stratagene、国際公開第92/09689号パンフレット、US5,545,552;ピロコッカス種由来の精製された熱安定DNAポリメラーゼ、コーム(Comb)D.G.ら、New England Biolabs,Inc.,EP0 547 359;古細菌ピロコッカスフリオサス由来のDNAポリメラーゼ遺伝子の機能とヌクレオチド配列、ウエモリ(Uemori)Tら、(1993)Nucl.Acids Res.、21:259−265.]、ピロディクタム種から(Pyrodictium)[熱安定核酸ポリメラーゼ、ゲルファンド(Gelfand)D.H.,F.ホフマン(Hoffmann)−La Roche AG、EP0 624 641;ピロディクタム種由来の精製された熱安定核酸ポリメラーゼおよびDNAコード配列、ゲルファンド D.H.,F.,ホフマン−La Roche Inc.,US5,491,086]、サーモコッカスから[例えば、サーモコッカス種に由来する熱安定DNA ポリメラーゼ TY、ニーハウス(Niehaus)F.ら、国際公開第97/35988号;精製されたテルモコッカス・バロッシィ(Thermoccus barossii)DNAポリメラーゼ、ルーム(Luhm)R.A.、Pharmacia Biotech,Inc.、国際公開第96/22389号;DNA配列決定、PCR等に有用な中間エキソヌクレアーゼ活性および高温でより長期間の安定性を有するサーモコッカス・バロッシィ由来のDNAポリメラーゼ、デネゼル(Dhennezel)O.B.、Pharmacia Biotech Inc.、国際公開第96/22389号;DNA操作における使用のためのサーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)由来の精製された熱安定DNAポリメラーゼ、Comb D.G.、New England Biolabs,Inc.、US5,322,785、EP0 455 430;古細菌由来の組換え熱安定DNAポリメラーゼ、Comb D.G.、New England Biolabs、Inc.、US5,352,778、EP0 547 920、EP0 701 000;サーモコッカス・ゴルゴナリウスから得られる新規に単離された熱安定DNAポリメラーゼ、アンゲラー(Angerer)B.ら、Boehringer Mannheim GmbH、国際公開第98/14590号]から単離され、クローン化され得る。
【0006】
プルーフリーディング機能の存在下でPCRを付与する他の可能性は、ポリメラーゼ酵素、かかるプルーフリーディング活性を示すポリメラーゼの混合物の使用である。(例えば、増大された熱安定性を有する熱安定DNAポリメラーゼならびに増強された長さおよび効率のプライマー伸長法、バルネス(Barnes)W.M.,US5,436,149、EP 0693 078;新規ポリメラーゼ組成物およびその使用、ソージ(Sorge)J.A.,Stratagene、国際公開第95/16028号)。少なくとも1つの熱安定DNAポリメラーゼの主要な成分と3’−5’エキソヌクレアーゼ活性および3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を示す微少成分とを含有する熱安定DNAポリメラーゼ、例えばTaqポリメラーゼおよびPfuDNAポリメラーゼ等の製剤を使用することは一般的な慣習である。これらの混合物中において、進行性(processivity)は、TaqポリメラーゼのようなpolI型酵素と、Pfuのような熱安定B型ポリメラーゼによるプルーフリーディング機能とにより付与される。高忠実度DNA合成は、核酸増幅における1つの所望されるパラメータであり、他の重要な特徴は、除染の可能性である。
【0007】
ポリメラーゼ連鎖反応は、単一分子を十億倍より多くに増幅しうる。従って、微少量の夾雑物でさえも、増幅され、偽陽性結果を導きうる。かかる夾雑物は、しばしば以前のPCR増幅に由来する産物である(持ち越し汚染)。それゆえ、研究者らは、かかる汚染を回避する方法を開発した。
【0008】
手順は、ウラシル含有DNA(U−DNA)を産生するためにPCR増幅の間にdUTPでTTPを置き換えることに依存している。続いて、PCR増幅の前にPCR反応混合物をウラシル−DNA−グリコシラーゼ(UNG)で処理することにより、増幅に適さない混入した核酸を分解する。dUTPは、polI型熱安定ポリメラーゼにより容易に取り込まれるが、B型ポリメラーゼには取り込まれない[G.スルップハウク(Slupphaug)ら、(1993)Anal.Biochem.211:164−169]。B型ポリメラーゼによるdUTPの低取り込みは、テンプレートの同じ型がPCR増幅により繰り返し分析される研究室におけるそれらの使用を制限する。
【0009】
3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を示す熱安定DNAポリメラーゼは、サーモトガ(Thermotoga)[サーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)に由来する好熱性DNAポリメラーゼ、Slater M.R.ら、Promega Corporation、国際公開第96/41014号;テルモトガ・ネアポリタナ由来のクローン化されたDNAポリメラーゼおよびその変異体、ヒュース(Hughes)A.J.ら、Life Technologies、Inc.国際公開第96/10640号;テルモトガ・マリチマ(Termotoga maritima)に由来する精製された熱安定核酸ポリメラーゼ酵素、ゲルファンド(Gelfand)D.H.ら、CETUS Corporation、国際公開第92/03556号]のような真正細菌からも単離された。これらの酵素は、誤取り込みまたはミスマッチした塩基を除去しうる強い3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する。この酵素の遺伝学的に操作された改変体は、ULTma、PCRプロセスにさらなるポリペプチドなしで使用されうるDNAポリメラーゼとして市販されている。この酵素は、誤取り込みされた塩基を除去し、dUTPを取り込みうるが、忠実度が、不明な理由のためにTaqポリメラーゼのそれよりも高くない[ポリメラーゼ連鎖反応における複製の正確さ、ディアズ(Diaz)R.S.ら、Braz.J.Med.Biol.Res.(1998)31:1239−1242;PfuDNAポリメラーゼおよび他の熱安定DNAポリメラーゼのPCR忠実度、クライン(Cline)J.ら、Nucleic Acids Res.(1996)24:3546−3551]。
【0010】
高忠実度DNA合成のために、B型ポリメラーゼまたはそれらを含有する混合物の使用に代わる他のものは、好熱性DNAポリメラーゼIIIホロ酵素、18ポリペプチド鎖の複合体の使用である。これらの複合体は、細菌の染色体のレプリカーゼと同一であり、数百キロベースまたは全染色体のDNA鎖を合成するのに必要な全ての因子を含む。この酵素の10個の異なるサブユニット(それらのいくつかはマルチコピーで存在する)は、組換え技術により作製され、再構築され、インビトロDNA合成に使用されうる。これらの複合体の考えられうる使用としては、数千から数十万塩基対の核酸のPCR増幅が提案される[染色体レプリカーゼとして機能する好熱性生物酵素に由来する酵素、その調製および使用、ユリーバ(Yurieva)O.ら、The Rockefeller University,国際公開第98/45452号;新規好熱性ポリメラーゼIIIホロ酵素、マックヘンリー(McHenry)C.、ENZYCO Inc.、国際公開第99/13060号)。
【0011】
本発明の目的は、好ましくは同時にdUTPを取り込むことができる高忠実度PCR系を開発することであった。本発明によれば、3’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にDNAポリメラーゼ活性を示さない熱安定酵素が提供され、この酵素は、ポリメラーゼ活性を示す第2の酵素に加えられた場合に増幅の忠実度を増強する。提供される酵素は、DNA合成プロセスの間にミスマッチしたプライマー末端を切り出し、ポリメラーゼ活性を示す第2の酵素を再会合させ、伸長を再開させることを可能にしうる。本発明の酵素は、プルーフリーディング酵素としてポリメラーゼ活性を示す第2の酵素と協力しうる。当該課題に適することが見出された酵素は、例えば、熱安定エキソヌクレアーゼIIIである。3’から5’方向に働き、5’のリン酸を切断し、3’ヒドロキシル基を保存し、理想的には2本鎖DNAのみで働くエキソヌクレアーゼIIIが好ましい。DNAポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ機能は、2本鎖および単鎖DNAにおいて有効である。後者の活性は、PCRアッセイにおいて所望されないプライマー分解を導き得る。上記酵素は、70℃〜80℃で活性であり、変性サイクルを乗り越えるのに十分に活性であり、PCRプロセスの完了後に未分解のPCR産物を保存するための低温では不活性であることが好ましい。これらの特徴を示す酵素は、好熱性真正細菌に由来するか、または好熱性古細菌(archaea)由来の酵素に関連しうる。3つの熱安定古細菌のゲノムが配列決定されている。メタノコッカス・ヤナシィ(Methanococcus jannaschii)[メタン生成古細菌、メタノコッカス・ヤナシィの完全なゲノム配列、ブルト(Bult)C.J.ら、(1996)Science 273:1058−1072)、メタノバクテリウム・サーモオートトロヒクム(Methanobacterium thermoautotrophicum)[メタノバクテリウム・サーモオートトロヒクムΔHの完全なゲノム配列:機能的解析および比較ゲノミクス、スミス(Smith)D.R.ら、J.of Bacteriology(1997)179:7135−7155]およびアーケオグロブス・フルギダス(超好熱性、硫酸還元古細菌アーケオグロブス・フルギダスの完全なゲノム配列、クレング(Klenk)H.−P.ら、(1997)Nature 390:364−370]。
【0012】
詳細には、2本鎖DNAにおいて3’から5’方向にプライマーまたはポリヌクレオチドのミスマッチした末端の分解を触媒する、アーケオグロブス・フルギダスから得られうる熱安定酵素が提供される。アーケオグロブス・フルギダス (Afu)から得られうる熱安定エキソヌクレアーゼIIIをコードする遺伝子を、クローン化し、大腸菌において発現させ、単離した。上記酵素は、PCR反応に使用されるインキュベーションおよび温度条件下で活性である。上記酵素は、良好な収率で反応混合物に存在するdUTPを伴うか、伴うことなく、低エラー率のDNA合成およびゲノムDNAにおける3kbよりも大きな産物(Taqポリメラーゼにより合成される産物の上方の範囲)の合成を行うことにおいてTaqのようなDNAポリメラーゼを支持する。好ましくは、2,5UのTaqポリメラーゼ当たり50〜500ngのAfuから得られうるエキソヌクレアーゼIIIを、至適なPCRパフォーマンスを得るために使用した。より好ましくは、PCR反応中の2,5UのTaqポリメラーゼ当たり67ng〜380ngのAfuから入手可能であるエキソヌクレアーゼIIIの使用である。
【0013】
従って、本発明の酵素は、プルーフリーディング酵素としてTaqポリメラーゼと協力しうる。他の酵素と比較した本発明の酵素の使用の利点は、本発明の酵素が、2本鎖DNAにおいて好適に活性であることである。本発明の熱安定酵素は、かかる酵素が必要または所望されるいかなる目的のためにも使用され得る。特に好ましい態様において、上記酵素は、成熟前の停止を導くミスマッチしたプライマー末端を除去するため、ポリメラーゼによりさらに効率的に伸長されるプライマー末端を提供するため、塩基取り込みエラーを校正するため、ポリメラーゼが長いPCR産物を産生することを可能にするために、PCRとして知られる核酸増幅反応において熱安定DNAポリメラーゼと組み合わせて使用される。
【0014】
さらに、本発明の主題は、3’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にDNAポリメラーゼ活性を示さない第1の熱安定酵素およびポリメラーゼ活性を示す第2の酵素を含有する組成物に関し、ここで、増幅プロセスの忠実度は、第2の酵素単独の使用と比較してこの組成物の使用により増強される。また、本発明の3’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、DNAポリメラーゼ活性を示さない熱安定酵素は、DNAポリメラーゼ活性の減少を示すか、またはかかる活性を全く示さない適切な酵素を含む。本発明においてDNAポリメラーゼ活性の減少とは、DNAポリメラーゼ活性を示す酵素の該活性の50%よりも少ないことを意味する。好ましい態様において、本発明の組成物の第2の酵素は、プルーフリーディング活性を欠失している。特に好ましくは、第2の酵素は、Taqポリメラーゼである。
【0015】
本発明のさらなる主題は、3’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にDNAポリメラーゼ活性を示さない第1の熱安定酵素およびポリメラーゼ活性を示す第2の酵素を含有する混合物を用いるDNAの合成方法である。この方法によれば、成熟前に終結した鎖が、3’から5’の分解によりトリミングされる。プライマーまたは成長する鎖のいずれかのミスマッチした末端がこの方法により除去される。
【0016】
本発明は、dUTPが反応混合物中に存在し、部分的または完全にTTPを置換する上記の方法をさらに含む。本方法により、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDGまたはUNG)が、混入する核酸の分解のために使用されることが好ましい。
【0017】
好ましくは、本方法によると、
−3’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にDNAポリメラーゼ活性を示さない第1の熱安定酵素と
−ポリメラーゼ活性を示す第2の酵素と
の混合物は、3’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にDNAポリメラーゼ活性を示さない第1の熱安定酵素の非存在下でポリメラーゼ活性を示す第2の酵素により産生されるPCR産物と比較してより低いエラー率を有するPCR産物を産生する。本方法において、3’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にDNAポリメラーゼ活性を示さない第1の熱安定酵素とポリメラーゼ活性を示す第2の酵素との混合物が、3’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にDNAポリメラーゼ活性を示さない第1の熱安定酵素の非存在下でポリメラーゼ活性を示す第2の酵素により産生されるPCR産物と比較してより長いPCR産物を産生する。さらに、3’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にDNAポリメラーゼ活性を示さない第1の熱安定酵素は、大腸菌のエキソヌクレアーゼIIIに関連するが、本方法により熱安定である。上記方法のさらなる態様は、平滑末端を有するPCR産物が得られる方法である。
【0018】
本発明の主題はまた、3’エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にDNAポリメラーゼ活性を示さない本発明の熱安定酵素を得る方法およびこの酵素を産生するための手段および材料、例えば、ベクターおよび宿主細胞(例えば、DSM番号13021)である。
【0019】
以下の実施例は、説明するために提供され、限定することを意図しない。
【0020】
好ましい態様の詳細な説明
【0021】
実施例I
コード配列の単離
本明細書の好ましい熱安定酵素は、アーケオグロブス・フルギダス VC−16株(DSM No.4304)から得られうる高度熱安定エキソデオキシリボヌクレアーゼである。該株をイタリア、ナポリ(Naples、Italy)のヴルカーノ島(Vulcano Island)およびストゥーフェ・ディ・ネローネ(Stufe di Nerone)の海底熱水系から単離した〔ステッター(Stetter),K.O.ら、Science(1987)236:822−824〕。この生物は、最適条件83℃で60℃〜95℃の増殖範囲を有する高度好熱性硫黄代謝古細菌である。〔クレンク(Klenk),H.P.ら、Nature(1997)390:364−370〕。ゲノム配列はTIGRデータベースに寄託されている。エキソヌクレアーゼIII(xthA) をコードすると推定される遺伝子は、Acc.No.AF0580を有する。
【0022】
既知の分子量のタンパク質標準と比較した場合、アーケオグロブス・フルギダスから得られうるエキソデオキシリボヌクレアーゼの見かけの分子量は、約32,000ダルトンである(SDS−PAGE) 。本発明の熱安定酵素の正確な分子量は、アーケオグロブス・フルギダス エキソデオキシリボヌクレアーゼIII遺伝子のコード配列から決定され得る。
【0023】
実施例II
アーケオグロブス・フルギダス由来のエキソヌクレアーゼIIIをコードする遺伝子のクローニング
所望の発現ベクターの多クローニング部位に適合性があり、アーケオグロブス・フルギダス エキソヌクレアーゼIII遺伝子のNおよびC末端に相補的な制限部位を有する以下のプライマーを設計した:
配列番号:1
N末端(BamHI部位): 5'-GAA ACG AGG ATC CAT GCT CAA AAT CGC CAC C-3'
配列番号:2
C末端(PstI部位): 5'-TTG TTC ACT GCA GCT ACA CGT CAA ACA CAG C-3'
【0024】
最初に、1つの2mlエッペンドルフキャップで5,000rpmで遠心分離を繰り返すことにより細胞を集めた。DNA単離は、細菌細胞からの単離について記載されたいずれの方法で行なってもよい。今回は、High PureTM PCRテンプレート調製キット(ロシュ ディアグノスティクス(ROCHE Diagnostics) GmbH、No.1796828)で、アーケオグロブス・フルギダスゲノムDNAを調製した。この方法で、染色体DNA約6μgを72ng/μlの濃度で得た。
【0025】
ExpandTM High Fidelity PCRシステム(ロシュ ディアグノスティクス GmbH、No.1732641)中で、4つの同一の調製でキャップ当たり100ngのアーケオグロブス・フルギダスゲノムDNAで、上記プライマーを用いてPCRを行なった。下記の条件で、PCRを行なった:
1 × 94℃、2分;
10× 94℃、10秒;54℃、30秒;68℃、3分;
20× 94℃、10秒;54℃、30秒;68℃、3分、各サイクルにつき20秒サイクル延長を伴う;
1 × 68℃、7分;
終濃度10mMまでMgCl2 を添加した後、各10ユニットのBamHIおよびPst IでPCR産物を2時間37℃で切断した。低融解アガロースゲルで反応生成物を分離した。電気泳動後、適切なバンドを切り出して、ゲルスライスをあわせ、溶解し、DNAフラグメントをアガラーゼ(agarase)消化により単離し、EtOHで沈澱させた。乾燥ペレットを30μlのH2 Oで希釈した。
【0026】
適切な発現ベクター、本明細書ではpDS56 Tを、挿入に使用するように同一の制限酵素で消化して、同一の方法で洗浄した。
【0027】
Rapid DNA Ligation Kit(ロシュ ディアグノスティクス GmbH、No.1635379)での挿入物とベクターのライゲーション後、プラスミドを発現宿主E.coli 392 pUBS520で形質転換した〔ブリンクマン(Brinkmann)U.ら(1989)Gene85:109−114〕。
【0028】
High PureTMプラスミド単離キット(ロシュ ディアグノスティクス GmbH、No.1754777)を用いて形質転換体のプラスミドDNAを単離して、BamHIおよびPstIでの制限消化およびアガロースゲル電気泳動により特徴付けた。
【0029】
−70℃のグリセロール培養で、陽性E.coli pUBS520 ExoIII形質転換体を保存した。DNA配列決定で、エキソヌクレアーゼIIIをコードする遺伝子の配列を確認した。それを図1に示す。
【0030】
アーケオグロブス・フルギダスまたは他の好熱性生物由来のエキソヌクレアーゼIIIのクローニングおよび発現は、当該分野における従来技術を用いる他の技術によって行なってもよい(例えば、サンブルーク(Sambrook)ら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Lab.、1989を参照のこと)。
【0031】
実施例III
組換えAfuエキソヌクレアーゼIIIの発現
実施例Iからの形質転換体を、適切な抗生物質を含むリッチ培地で発酵槽中で培養した。細胞を光学密度〔A540 〕5.5で遠心分離により収集し、必要となるまで凍らせるか、またはリゾチームでの処理により溶解してアーケオグロブス・フルギダス エキソヌクレアーゼIII活性を含む粗細胞抽出物を作製した。
【0032】
アーケオグロブス・フルギダス エキソヌクレアーゼIII活性を含む粗抽出物を、実施例IVに記載された方法もしくはアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー等の他の精製技術により精製する。
【0033】
実施例IV
組換えAfuエキソヌクレアーゼIIIの精製
10lの発酵槽でトリプトン(20g/l)、酵母抽出物(10g/l)、NaCl(5g/l)およびアンピシリン(100mg/l)を含む培地で、実施例IからのE.coli pUBS520 ExoIII(DSM No.13021)を37℃で増殖し、IPTG(0.3mM)で指数増殖期の中間に誘導し、さらに4時間インキュベートした。遠心分離により細胞約45gを収集し、−70℃で保存した。細胞2gを溶解し、4mlの緩衝液A(40mM Tris/HCl、pH7.5;0.1mM EDTA;7mM 2−メルカプトエタノール;1mM Pefabloc SC)で懸濁した。リゾチーム1.2mgを添加して4℃で30分間、デオキシコール酸ナトリウム4.56mgを添加して室温で10分間次いで0℃で20分間の攪拌下で、細胞を溶解した。粗抽出物を750mM KClに調整し、72℃で15分間加熱し、変性タンパク質の除去のために遠心分離した。
【0034】
90℃までの温度の加熱はまた、アーケオグロブス・フルギダス エキソヌクレアーゼIIIを破壊(変性)することなく可能である。10mM MgCl2 に調整した緩衝液B(10%グリセロールを含む緩衝液A)に対して上清を透析し、緩衝液Bで平衡化した寸法1×7cmおよび5.5mlベッド容積を有するBlue Trisacryl Mカラム(SERVA、No.67031)に供した。16.5mlの緩衝液Bでカラムを洗浄し、緩衝液B中に0〜3M NaClの82mlリニアグラジエントでエキソヌクレアーゼタンパク質を溶出した。10〜15%のSDS−PAGEグラジエントゲルの電気泳動によるアーケオグロブス・フルギダス エキソデオキシリボヌクレアーゼタンパク質に対するカラム画分をアッセイした。16.5mlの活性な画分をプールし、Aquacide II(Calbiochem No.17851)で濃縮し、保存緩衝液C(10mM Tris/HCl、pH7.9;10mM 2−メルカプトエタノール;0.1mM EDTA;50mM KCl;50%グリセロール)に対して透析した。透析後、ThesitおよびNonidet P40を、それぞれ終濃度0.5%となるように添加した。この調製物を−20℃で保存した。
【0035】
得られたアーケオグロブス・フルギダス エキソヌクレアーゼIIIは、SDSゲル電気泳動による見積もりで95%の純度であった。収量は、2.3g細胞質量当たりタンパク質50mgであった(湿重量)。
【0036】
実施例V
アーケオグロブス・フルギダス由来の組換えエキソヌクレアーゼIIIの熱安定性
熱変性に対する耐性を解析することによって、実施例IIに記載のクローン化されたアーケオグロブス・フルギダス由来のエキソヌクレアーゼIIIの熱安定性を測定した。実施例IVに記載の溶解後、エッペンドルフ遠心分離機で10分間15,000rpmで粗抽出物100μlを遠心分離した。5つの新しいエッペンドルフキャップに上清をアリコートした。5つの異なる温度、50℃、60℃、70℃、80℃および90℃で10分間、キャップをインキュベートした。上記の遠心分離後、10〜15%SDS−PAGEグラジエントゲルでの電気泳動により上清のアリコートを解析した。図2に示されるように、90℃でのインキュベーション後のアーケオグロブス・フルギダス エキソヌクレアーゼIIIタンパク質の量は、より低温で処理されたサンプルの量と同じであった。熱変性により検出可能な有意な損失はなかった。この結果から、半減期が90℃で10分間より長いと結論できる。
【0037】
実施例VI
AfuエキソヌクレアーゼIIIの活性
エキソヌクレアーゼIIIは、二重鎖DNAの3’ヒドロキシル末端からモノヌクレオチドの段階除去を触媒する〔ロジャース(Rogers)G.S.およびヴァイス(Weiss) B.(1980)Methods Enzymol.65:201−211)。限定数のヌクレオチドを、各結合事象の間に除去する。好ましい基質は、平滑または陥凹3’末端である。酵素は一本鎖DNA上では活性ではなく、3’突出末端は、開裂に対してより耐性がある。DNA分子量マーカーIV(ロシュ モレキュラー バイオケミカルズ、No.1062590)は、HinfI消化したpBR328と混合したBglI消化したpBR328からなる。HinfI消化の産物は、3’陥凹末端を有し、エキソヌクレアーゼIIIによる分解に好ましい基質であると予期され、BglI開裂の産物は、3塩基突出部分を伴う3’突出末端を有し、エキソヌクレアーゼIIIによる開裂に対してより耐性がある。
【0038】
25μlの以下のインキュベーション緩衝液:10mM Tris/HCl、pH8.0;5mM MgCl2 ;1mM 2−メルカプトエタノール;100mM NaCl中で、パラフィンで覆って、DNA分子量マーカーIV(ロシュ モレキュラー バイオケミカルズ、No.1062590)0.5μgと共に、実施例IVからのアーケオグロブス・フルギダスエキソヌクレアーゼIIIの連続希釈物を72℃で2時間インキュベートした。E.coliのエキソヌクレアーゼIII(ロシュ モレキュラー バイオケミカルズ、No.779709)10ユニットを対照として含ませた。対照反応を37℃で行なった。5μlの停止溶液(0.2%アガロース、60mM EDTA、10mM Tris−HCl、pH7.8、10%グリセロール、0.01%ブロモフェノールブルー)を添加後、混合物を1%アガロースゲルで分離した。結果を図3に示す。AfuエキソヌクレアーゼIIIは2つの異なる型の基質を識別する。好ましい基質は、3’陥凹末端を有するフラグメント(例えば、1766bpフラグメント)であり、3’突出末端(例えば、2176bp、1230bp、1033bpフラグメント)は、分解に対してより耐性である。より多い量のタンパク質で、レーン1と同程度に基質を分解し、大腸菌のエキソヌクレアーゼIIIの産物を解析した。Afuエキソヌクレアーゼタンパク質の量を増加させることによりDNA基質はほとんど残らず(レーン15〜19)、残りのフラグメントの妨害は調製物中の不純物としてのDNA結合タンパク質のためであり得る。
【0039】
実施例VII
PCRにおけるAfuエキソヌクレアーゼIIIでのミスマッチプライマー補正
PCRにおけるAfuエキソヌクレアーゼIII/Taqポリメラーゼ混合物の修復効率を、3’末端のミスマッチプライマーを用いて試験した。アッセイの原理を図4に示す。PCRのために、フォワードプライマーがテンプレートDNAと塩基対形成できない1つまたは2つのヌクレオチドを3’末端に有するプライマーの増幅セットを使用する。ミスマッチプライマー末端の切り出しおよび修復されたプライマーの増幅は、その後制限エンドヌクレアーゼBsiEIで切断し得る産物を生じ、一方、ミスマッチプライマーから生じる産物は、切断に対して耐性を有する。
【0040】
使用したプライマー配列:
1.リバース: 5'- GGT TAT CGA AAT CAG CCA CAG CG - 3'(配列番号:3)
2.フォワード1(g:aミスマッチ): 5'- TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA CGG TCA - 3' (配列番号:4)
3.フォワード2(g:tミスマッチ): 5'- TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA CGG TCT - 3' (配列番号:5)
4.フォワード3(g:cミスマッチ): 5'- TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA CGG TCC - 3' (配列番号:6)
5.フォワード4(2塩基ミスマッチ): 5'- TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA CGG TAT - 3' (配列番号:7)
【0041】
2.5ユニットのTaq DNAポリメラーゼ(ロシュ ディアグノスティクス GmbH、No.1435094)、実施例IVからのアーケオグロブス・フルギダス エキソヌクレアーゼIIIを0.25μg、バクテリオファージλ由来のDNA10ng、各プライマー0.4μM、200μM dNTP’、1.5mM MgCl2 、50mM Tris−HCl、pH9.2、16mM (NH4 2 SO4 を用いてPCRを行なった。PCRを50μlのPCR容積で、以下の条件で行なった:
1 × 94℃、2分;
40× 94℃、10秒;60℃、30秒;72℃、1分;
1 × 72℃、7分;
エキソヌクレアーゼ/Taqポリメラーゼ混合物の機能を、2.5ユニットのTaq DNAポリメラーゼ、0.3ユニットのTgo DNAポリメラーゼ(ロシュ ディアグノスティクス GmbH)の対照および0.75μlのExpandTM High Fidelity PCRシステム(ロシュ ディアグノスティクス GmbH、No.1732641)と比較した。BsiEIでのPCR産物の十分な消化により示されるように、A.フルギダス エキソヌクレアーゼIIIは、記載された全てのミスマッチ補正活性を90〜100%の効率で示した(図5)。予期されるようにTaq DNAポリメラーゼは補正活性を示さなかったが、一方、その3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有するTgo DNAポリメラーゼは同様に完全に補正した。ExpandTM High Fidelity PCRシステムは、2塩基ミスマッチでのみ100%補正活性を示した。他のミスマッチを約50%の効率で修復した。
【0042】
実施例VIII
PCR プロセスにおけるAfu エキソヌクレアーゼIII/Taq DNA ポリメラーゼ混合物の忠実度
PCR プロセスにおけるAfu エキソヌクレアーゼIII/Taq DNA ポリメラーゼ混合物の忠実度は、機能的なlac Iqq アレレを含むpUC19 誘導体pUCIQ17 の増幅、環化および形質転換に基づくアッセイで決定された (フレイ(Frey, B.)およびサップマン(Suppmann B.) (1995) Biochemica 2 :34-35)。lac I におけるPCR で得られた変異は、lacZαの発現の脱抑制と続くX-gal 呈示プレート上の容易に検出されうる機能的βガラクトシダーゼ酵素の形成をもたらす。本lac I に基づくPCR 忠実度アッセイで決定されたTaq ポリメラーゼ/Afuエキソヌクレアーゼ混合物のエラー率は、Taq DNA ポリメラーゼおよびExpand HiFi PCR システム (ロシュモレキュラーバイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals)) ならびに対照としてPwo DNA ポリメラーゼ(ロシュモレキュラーバイオケミカルズ) と比較して決定された。
【0043】
プラスミドpUCIQ17 は、試験される酵素によるPCR 増幅の基質として働くように、DraII による消化によって直鎖状にした。
【0044】
使用される両プライマーは、5'末端にClaI部位を有する:
配列番号:8
プライマー1: 5'-AGCTTATCGATGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCG-3'
配列番号:9
プライマー2: 5'-AGCTTATCGATAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGC-3'
得られるPCR 産物の長さは、3493bpである。
前記PCR を、最終容量50μl の1.5mM MgCl2 、50mMトリス-HCl、pH8.5 (25 ℃) 、12.5mM(NH4)2SO4、35mM KCl、200 μM dNTPs 、および2.5 単位のTaq ポリメラーゼとそれぞれ125ng 、175ng 、250ng 、375ng および500ng のAfu エキソヌクレアーゼIII の存在下に行なった。
【0045】
サイクル条件は、次の通りであった:
Figure 0003655240
PCR の後、PCR 産物を、PEG-沈澱 (バーンズ(Barnes, W. M.) (1992) Gene 112:229)し、DNA を、ClaIで制限(restricted)し、アガロースゲル電気泳動によりて精製した。単離されたDNA を、Rapid DNA Ligation Kit(ロシュモレキュラーバイオケミカルズ) を用いて連結し、ライゲーション産物を、E.coli DH5αに形質転換し、TN Amp X-Galプレートにプレーティングした。得られたプラスミドpUCIQ17 (3632bp)で形質転換されたα相補性E.coli DH5α株は、アンピシリン (100 μg/ml) とX-Gal (0.004% w/v)とを含むTNプレート(1.5% バクトトリプトン、1% NaCl 、1.5%寒天)上で、白 (lacI+ ) コロニーを示す。変異は、青コロニーをもたらす。
【0046】
37℃で一晩培養後、青コロニーと白コロニーをカウントした。キョハボン(Keohavong) およびツィリー(Thilly)(Keohavong, P.およびThilly, W. (1989) PNAS USA 86:9253) により刊行された再配列式(rearranged equation) :
f=-lnF/d × b bp
( 式中、F は、白コロニーの分数であり:
F= 白 (lacI+ ) コロニー/ 全体のコロニー数;
d は、DNA 複製の数であり:
2d アウトプットDNA/インプットDNA ;
およびb は、lacI遺伝子(1080bp)の有効標的サイズであり、ここで、該有効標的サイズは、プロボスト(Provost) ら(Provostら(1993) Mut. Res. 288:133) によれば349bp である)
により、bpあたりのエラー率(f) を計算した。
【0047】
図6Aと図6Bに示される結果は、反応混合物中における熱安定性エキソヌクレアーゼIII の存在がより低いエラー率をもたらすことを説明する。エキソヌクレアーゼに対するポリメラーゼの割合に依存して、エラー率が減少している。最も至適なTaq ポリメラーゼ/AfuエキソヌクレアーゼIII 混合物 (4,44×10-6) で達成される忠実度は、Taq/Pwo 混合物(Expand HiFi ;2,06×10-6)の忠実度に類似した範囲である。至適緩衝液条件の評価は、さらに忠実度を改善するであろう。ポリメラーゼとエキソヌクレアーゼとの間の割合は、至適化されるべきである。多量のエキソヌクレアーゼは、産物収量を減らし、明らかに増幅効率を減少させる(Taq/Exo 1:10は、 2.5単位の Taqポリメラーゼと500ng のAfu エキソヌクレアーゼIII に相当する) 。
【0048】
本システムの忠実度は、緩衝液成分を変えること、各成分の濃度を至適化することまたはサイクル条件を変えることによって、例えば、当該分野における慣用の技術を用いて、さらに最適化されるかもしれない。
【0049】
実施例IX:
PCR におけるAfu エキソヌクレアーゼIII の存在下でのdUTPの取り込み
dUTPにより完全に置換されるTTP を用いたDNA 合成について、Afu エキソヌクレアーゼ/Taqポリメラーゼ混合物を試験した。TTP またはdUTP取り込みの各々の比較は、β- グロビン遺伝子を標的として用い、鋳型としての未変性ヒトゲノムDNAについて、0.125 μg 、0.25μg 、0.375 μg および0.5 μg の実施例IVのアーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)エキソヌクレアーゼIII の存在下において、2.5 単位のTaq DNA ポリメラーゼを用いるPCR で決定された。以下のプライマーを使用した:
フォワード: 5'-TGG TTG AAT TCA TAT ATC TTA GAG GGA GGG C-3'
(配列番号:10)
リバース: 5'-TGT GTC TGC AGA AAA CAT CAA GGG TCC CAT A-3'
(配列番号:11)
【0050】
PCR は、以下のサイクル条件:
1x 2 分, 94℃;
40x 10秒, 94℃; 30 秒, 60℃; 1分, 72℃;
1x 7 分, 72℃;
で50μl 容量で行なわれた。
【0051】
PCR 反応物のアリコートは、アガロースゲルの上で分離された。図7に示されるように、本鋳型/ プライマー系により、dUTPの存在下におけるDNA 合成は、375ng までのAfu エキソヌクレアーゼIII で可能である。 dUTP 取り込みは、環境温度における30分間、PCR 反応産物のアリコートをウラシルDNA グリコシラーゼ処理(ROCHE Diagnostics 社(No.1775367))することおよび、続く95℃5 分のインキュベーションによる、断片の完全な分解に至るポリヌクレオチドのアプリン部位での切断により、さらに証明されうる。アガロースゲル電気泳動による反応産物の解析は、図8に示される。
【0052】
実施例X :
PCR 産物の長さにおけるAfu エキソヌクレアーゼIII の影響
Taq ポリメラーゼは、ゲノムの鋳型において、3kb 長までのPCR 産物を合成しうる。より長い産物の合成についてのTaq ポリメラーゼ/Afuエキソヌクレアーゼ混合物の能力を推定するために、前記酵素混合物をヒトゲノムDNA を鋳型とし、9.3kb 、12kbおよび15kp長の産物を増幅するようにデザインされた3 対のプライマー対を用いて解析した。使用された緩衝液系は、Expand Long Template PCRシステム由来のものであった(Roche Molecular Biochemicals Cat. No 1 681 834)。反応は、表1も概説される条件で、250ng のヒトゲノムDNA、220ng の各プライマー、350 μM のdNTPs ならびに2.5 単位のTaq ポリメラーゼおよび62,5ngのAfu エキソヌクレアーゼの50μl 容量で行なわれた:
【0053】
【表1】
Figure 0003655240
【0054】
使用されたtPA 遺伝子の増幅のための特異的なプライマー:
プライマー7a フォワード: 5'-GGA AGT ACA GCT CAG AGT TCT GCA GCA CCC CTG C-3' (配列番号:12)
プライマー14a リバース: 5'-CAA AGT CAT GCG GCC ATC GTT CAG ACA CAC C −3' (配列番号:13)
プライマー1 フォワード: 5'-CCT TCA CTG TCT GCC TAA CTC CTT CGT GTG TCC C-3' (配列番号:14)
プライマー2 リバース: 5'-ACT GTG CTT CCT GAC CCA TGG CAG AAG CGC CTT C-3' (配列番号:15)
プライマー3 リバース: 5'-CCT TCT AGA GTC AAC TCT AGA TGT GGA CTT AGA G −3' (配列番号:16)
【0055】
図9に示されるように、Taq ポリメラーゼ/Afuエキソヌクレアーゼ混合物により、少なくとも15kb長の産物を合成することができる。
【0056】
実施例XI
熱安定エキソヌクレアーゼIII は、ポリメラーゼ活性が減少したが、3 ´エキソヌクレアーゼ- 活性が増加したポリメラーゼ変異体によって置換されうる
国際公開第97/35988号パンフレットまたはGene(1997)204 (1-2 )、153-8 においてニーハウス(Niehaus F.)、フレイ(Frey B.) およびアントラニキャン(Antranikian G.)に記載された、チロシンがアスパラギンに置換された385 位のアミノ酸置換を有するサーモコッカス アグレガンス(Thermococcuss aggregans)(Tag)由来のDNA ポリメラーゼ(刊行物と欧州特許出願第00105 155.6 号明細書としてベールケ(Boehlke)らが提出した)は、野生型DNA ポリメラーゼのわずか6.4%のポリメラーゼ活性であるが、205%のエキソヌクレアーゼ活性を示す。本酵素が、発明がエキソヌクレアーゼIII 型酵素に限定されるものではなく、3'エキソヌクレアーゼ活性に寄与する他の型の酵素を含むことを証明するために使われた。
【0057】
反応1-4 に使用されるサイクルプログラム:
1x 94℃, 2 分
10x 94℃, 10秒
62℃, 30秒
68℃, 4 分
20x 94℃, 10秒
62℃, 30秒
68℃, 4 分プラス1 サイクルあたり20秒のサイクル延長
1x 68℃, 7 分
反応5-8 :
1x 94℃, 2 分
10x 94℃, 10秒
65℃, 30秒
68℃, 8 分
20x 94℃, 10秒
65℃, 30秒
68℃, 8 分プラス1 サイクルあたり20秒のサイクル延長
1x 68℃, 7 分
【0058】
PCR産物を、エチジウムブロマイド含有1%アガロースゲルで解析した(図10)。データは、Taq ポリメラーゼが4.8kb の断片を増幅できるが、低い収量であることを示す。Taq ポリメラーゼとTag ポリメラーゼ変異体またはAfu Exo III との組み合わせは、産物収量の強い増加をもたらす。Tag ポリメラーゼ変異酵素それ自体では、本産物を合成できない。
類似した結果が、9.3kb 系で得られた。Taq ポリメラーゼだけを用いると、産物が検出できない。Tag ポリメラーゼ変異体またはAfu Exo III との組み合わせにより、期待されるPCR 産物が、高収率で得られる。
【0059】
これらの結果は、Taq ポリメラーゼが、ゲノムDNA由来の数kbのDNA断片を増幅できず、PCR 増幅の長さの限界がミスマッチ塩基対の取り込みの部位における低い効率の伸長に起因するバーンズの仮説 (バーンズ(Barnes, W. M.)(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2216-2220)を支持することを示す。プライマー末端でのミスマッチヌクレオチドの除去の後、Taq ポリメラーゼは、DNA 合成を再び行ないうる。全長産物としての完全な核酸鎖は、ついで、つづくサイクルにおけるプライマー結合のために鋳型として働きうる。
【0060】
実施例XII
Afu Exo III は、直鎖状一本鎖DNA 上で作用しない
270ng のAfu Exo III 、5 μg の49mer オリゴヌクレオチドを含み、MgCl2 を有するExpand HiFi PCR 緩衝液50μl 容量で、反応を行ない、65℃で0 、1 、2 、3 、4 および5 時間インキュベートした。10μl のプロテイナーゼK 溶液(20mg/ml )の添加後、試料を37℃で20分インキュベートした。反応生成物を、エチジウムブロミド含有3.5%アガロースゲル上で解析した。
【0061】
結果を、図11に示す。全てのレーンにおいて、核酸が、同じサイズを有することがわかる。Afu Exo III とともに5 時間までインキュベーション後に得られた産物(レーン6 )は、対照(レーン1 、7 および8 )と同じサイズを有する。全長オリゴヌクレオチドまたは分解産物由来のスミアのいずれの強度の有意な減少も、観察できない。
【0062】
実施例XIII
プライマー分解活性での熱安定B-型ポリメラーゼによるAfu エキソヌクレアーゼIII の比較
熱安定B-型ポリメラーゼが一本鎖および二本鎖ヌクレアーゼ活性 (コング (Kong H.)ら、(1993) Journal Biol. Chem. 268:1965-1975 )を有することが報告される。この活性は、鋳型または一本鎖にハイブリダイズするかどうかかかわらないプライマー分子を分解することができる。反応混合物における熱安定B-型ポリメラーゼの熱安定エキソヌクレアーゼへの置換は、反応混合物における一本鎖プライマーまたは存在する他の核酸の安定に関して有利であるかもしれない。
【0063】
プライマー分解活性を試験するために、鋳型DNAのない反応混合物を72℃で1 時間インキュベートし、ついで、DNA を添加し、PCR を行なった。結果を、熱安定B-型ポリメラーゼ (アンゲラー(Angerer B.) ら、国際公開第98/14590パンフレット)の例としてTgo ポリメラーゼ含有反応物と比較した。対照として、同じ混合物を、インキュベーション前以外に使用した。結果を、表2 にまとめる。
【0064】
【表2】
Figure 0003655240
【0065】
増幅のための標的として、p53 遺伝子の断片を選び、プライマー: p53I 5 '-GTC CCA AGC AAT GGA TGA T-3 ' (配列番号: 18 )およびp53II 5'-TGG AAA CTT TCC ACT TGA T-3 '(配列番号: 19 )を使用した。PCR 反応を、50μl の容量で行なった。
反応番号 1〜10は、200ng のヒトゲノムDNA 、40pmole の各プライマー、10mM Tris-HCl 、pH 8.5、17.5mM(NH4)2SO4、1.25mM MgCl2、0.5% Tween、2.5% DMSO 、250 μg/ml BSAおよび1 単位のTgo ポリメラーゼ(反応番号1 、3 、5 、7 および9 )または1.5 単位のTgo ポリメラーゼ(反応番号2 、4 、6 、8 および10)および200 μM dNTPs を含んだ。
反応番号11〜16は、2.5 単位Taq ポリメラーゼ、Mg++を含むExpand HiFi 緩衝液、40pmole のプライマー、200 μM dNTPs 、100ng ヒトゲノムDNA を含んだ。反応番号12および15は、37.5ngのAfu Exo III を含み、反応番号13および16は、75ngのAfu Exo III を含んだ。
【0066】
表2 に記載されるように、反応1 、2 、5 、6 および11〜13を、鋳型DNAの非存在下に、72℃で1 時間インキュベートした。PCR を開始する前に、鋳型DNAを添加した。反応5 、6 、9 および10を、ヌクレオチドの非存在下にプレインキュベートし、反応9 および10に、プレインキュベーションステップ後、さらに40pmole のプライマーを補った。Taq ポリメラーゼの5'- エキソヌクレアーゼ活性のため、プレインキュベーション後、酵素を反応11〜13に添加した。
【0067】
PCR 条件:
1x 94℃, 2 分
35x 94℃, 10秒
55℃, 30秒
72℃, 4 分
1x 72℃, 10分
【0068】
反応生成物を、アガロースゲル上で解析し、エチジウムブロマイドで染色した(図12)。
【0069】
鋳型DNAの非存在下に、Tgo ポリメラーゼを、プライマーとともにインキュベート (反応1 、2 、5 および6)し、プレインキュベーションなしの対応の反応(3、4 、7 および8)と比較した場合、明らかな違いが観察された。プレインキュベーションは、少なくとも1 つの必須成分、恐らく、PCR プライマーに明らかに影響を及ぼす強く減少したPCR 産物をもたらす。プレインキュベーションステップ後の40pmole のPCR プライマーの特別な添加(反応9 および10)は、プレインキュベートされなかった対照反応に匹敵する強度で、強いシグナルをもたらす。これは、dNTPs が存在するかどうかに関係なく、熱安定B-型ポリメラーゼであるTgo ポリメラーゼが、鋳型の非存在下に、PCR プライマーを分解することを示す。
【0070】
鋳型DNAおよびTaq ポリメラーゼの添加前に、Afu エキソヌクレアーゼIII とともに、プライマーがプレインキュベートされた反応12および13で得られたPCR 産物は、プレインキュベーションステップを用いない反応15および16で得られたものと同様のバンドを与えた。類似した強いバンド強度から、プライマーの分解がほとんど生じないか、あるいは全く生じず、一本鎖オリゴヌクレオチドがAfu エキソヌクレアーゼIII のための不十分な基質であると結論されるうる。PCR 産物の強いバンド強度または収量の増加から、酵素が増幅プロセスにおける忠実度を促進すると結論されうる。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1:
アーケオグロブス・フルギダスのエキソヌクレアーゼIIIに由来するDNAポリメラーゼをコードする遺伝子のDNA配列および推定アミノ酸配列。
【図2】図2:
実施例Vに記載される大腸菌において発現されるアーケオグロブス・フルギダスの組換えエキソヌクレアーゼIIIの熱変性に対する耐性。
レーン1:50℃でのインキュベーション
レーン2:60℃でのインキュベーション
レーン3:70℃でのインキュベーション
レーン4:80℃でのインキュベーション
レーン5:90℃でのインキュベーション
レーン6:AfuエキソヌクレアーゼIIIをコードする遺伝子で形質転換されていない大腸菌宿主細胞抽出物
レーン7:大腸菌のエキソヌクレアーゼ
レーン8:分子量マーカー
【図3】図3:
実施例VIに記載されるDNAフラグメントにおけるAfuエキソヌクレアーゼIIIのエキソヌクレアーゼ活性。
レーン1:10ユニットの大腸菌エキソヌクレアーゼIII、37℃でのインキュベーション
レーン2:50ngのAfuエキソヌクレアーゼIII、72℃でのインキュベーション
レーン3:100ngのAfuエキソヌクレアーゼIII、72℃でのインキュベーション
レーン4:150ngのAfuエキソヌクレアーゼIII、72℃でのインキュベーション
レーン5:100ngのAfuエキソヌクレアーゼIII、72℃でのインキュベーション
レーン6:200ngのAfuエキソヌクレアーゼIII、72℃でのインキュベーション
レーン7:300ngのAfuエキソヌクレアーゼIII、72℃でのインキュベーション
レーン8:250ngのAfuエキソヌクレアーゼIII、72℃でのインキュベーション
レーン9:750ngのAfuエキソヌクレアーゼIII、72℃でのインキュベーション
レーン10:1μgのAfuエキソヌクレアーゼIII、72℃でのインキュベーション
レーン11:500ngのAfuエキソヌクレアーゼIII、72℃でのインキュベーション
レーン12:1μgのAfuエキソヌクレアーゼIII、72℃でのインキュベーション
レーン13:1.5μgのAfuエキソヌクレアーゼIII、72℃でのインキュベーション
レーン14:1.5μgのAfuエキソヌクレアーゼIII、72℃でのインキュベーション
レーン15:3μgのAfuエキソヌクレアーゼIII、72℃でのインキュベーション
レーン16:4.5μgのAfuエキソヌクレアーゼIII、72℃でのインキュベーション
レーン17:7.6μgのAfuエキソヌクレアーゼIII、72℃でのインキュベーション
レーン18:15.2μgのAfuエキソヌクレアーゼIII、72℃でのインキュベーション
レーン19:22.8μgのAfuエキソヌクレアーゼIII、72℃でのインキュベーション
レーン20:エキソヌクレアーゼ添加せず
【図4】図4:
ミスマッチ補正アッセイの原理。
【図5】図5:
実施例VIIに記載のPCRにおけるミスマッチしたプライマー補正。
レーン1:DNA分子量マーカーV(ロシェモルキュラーバイオケミカルズ (ROCHE Molecular Biochemicals)No.82105)
レーン2:G:Aミスマッチしたプライマー、TaqDNAポリメラーゼでの増幅
レーン3:レーン2と同一であるが、続いてBsiEIで切断した
レーン4:G:Aミスマッチしたプライマー、エキスパンドHiFiPCRシステムでの増幅
レーン5:レーン4と同一であるが、続いてBsiEIで切断した
レーン6:G:Aミスマッチしたプライマー、Taqポリメラーゼ/AfuエキソヌクレアーゼIIIでの増幅
レーン7:レーン6と同一であるが、続いてBsiEIで切断した
レーン8:G:Aミスマッチしたプライマー、TgoDNAポリメラーゼで増幅
レーン9:レーン8と同一であるが、続いてBsiEIで切断した
レーン10:G:Tミスマッチしたプライマー、TaqDNAポリメラーゼで増幅
レーン11:レーン10と同一であるが、続いてBsiEIで切断した
レーン12:G:Tミスマッチしたプライマー、エキスパンドHiFiPCRシステムでの増幅
レーン13:レーン12と同一であるが、続いてBsiEIで切断した
レーン14:G:Tミスマッチしたプライマー、Taqポリメラーゼ/AfuエキソヌクレアーゼIIIでの増幅
レーン15:レーン14と同一であるが、続いてBsiEIで切断した
レーン16:G:Tミスマッチしたプライマー、TgoDNAポリメラーゼでの増幅
レーン17:レーン16と同一であるが、続いてBsiEIで切断した
レーン18:DNA分子量マーカーV
レーン19: DNA分子量マーカーV
レーン20:G:Cミスマッチしたプライマー、TaqDNAポリメラーゼでの増幅
レーン21:レーン20と同一であるが、続いてBsiEIで切断した
レーン22:G:Cミスマッチしたプライマー、エキスパンドHiFiPCRシステムでの増幅
レーン23:レーン22と同一であるが、続いてBsiEIで切断した
レーン24:G:Cミスマッチしたプライマー、Taqポリメラーゼ/AfuエキソヌクレアーゼIIIでの増幅
レーン25:レーン24と同一であるが、続いてBsiEIで切断した
レーン26:G:Cミスマッチしたプライマー、TgoDNAポリメラーゼでの増幅
レーン27:レーン26と同一であるが、続いてBsiEIで切断した
レーン28:CG:ATミスマッチしたプライマー、TaqDNAポリメラーゼ
レーン29:レーン28と同一であるが、続いてBsiEIで切断した
レーン30:CG:ATミスマッチしたプライマー、エキスパンドHiFiPCRシステム
レーン31:レーン2と同一であるが、続いてBsiEIで切断した
レーン32:CG:ATミスマッチしたプライマー、Taqポリメラーゼ/AfuエキソヌクレアーゼIII
レーン33:レーン2と同一であるが、続いてBsiEIで切断した
レーン34:CG:ATミスマッチしたプライマー、TgoDNAポリメラーゼでの増幅
レーン35:レーン2と同一であるが、続いてBsiEIで切断した
レーン36:DNA分子量マーカーV
【図6A】図6A:
PCRにおける種々のポリメラーゼのエラー比率。
【図6B】図6B:
実施例VIIIに記載のPCR混合物中に存在するAfuエキソヌクレアーゼIIIによる忠実度の改善。
青色:白色コロニーの比率を、ブロットし、TaqDNAポリメラーゼおよびAfuエキソヌクレアーゼIIIの種々の混合物(125ng、175ng、250ng、375ngおよび500ngのAfuエキソヌクレアーゼIII、それぞれと混合した2.5ユニットのTaqDNAポリメラーゼに相当する、Taq/Exo1:30、Taq/Exo1:20、Taq/Exo1:15、Taq/Exo1:12,5、Taq/Exo1:10)を、TaqDNAポリメラーゼ(Taq)、エキスパンドHiFiPCRシステム(HiFi)およびPwoDNAポリメラーゼ(Pwo)と比較して試験した。
【図7】図7:
実施例IXに記載されたTaq DNAポリメラーゼ/AfuエキソヌクレアーゼIII混合物によるdUTPの取り込み。
レーン1:DNA分子量マーカーXIV(ロシュ モレキュラー バイオケミカルズ No.1721933)
レーン2:2.5ユニットTaq DNAポリメラーゼでの増幅
レーン3:2.5ユニットTaq DNAポリメラーゼおよび125ngのAfuエキソヌクレアーゼIIIでの増幅
レーン4:2.5ユニットTaq DNAポリメラーゼおよび250ngのAfuエキソヌクレアーゼIIIでの増幅
レーン5:2.5ユニットTaq DNAポリメラーゼおよび375ngのAfuエキソヌクレアーゼIIIでの増幅
レーン6:2.5ユニットTaq DNAポリメラーゼおよび500ngのAfuエキソヌクレアーゼIIIでの増幅
【図8】図8:
実施例IXに記載されたウラシルDNAグリコシラーゼによるPCR産物を含むdUTPの分解。
レーン1:DNA分子量マーカーXIV(ロシュ モレキュラー バイオケミカルズ No.1721933)
レーン2:Taq DNAポリメラーゼおよび125ngのAfuエキソヌクレアーゼIIIで得られた1μlの増幅産物ならびにその後UNGおよび熱処理。
レーン3:Taq DNAポリメラーゼおよび125ngのAfuエキソヌクレアーゼIIIで得られた2μlの増幅産物ならびにその後UNGおよび熱処理。
レーン4:Taq DNAポリメラーゼおよび125ngのAfuエキソヌクレアーゼIIIで得られた3μlの増幅産物ならびにその後UNGおよび熱処理。
レーン5:Taq DNAポリメラーゼおよび125ngのAfuエキソヌクレアーゼIIIで得られた4μlの増幅産物ならびにその後UNGおよび熱処理。
レーン6:Taq DNAポリメラーゼおよび125ngのAfuエキソヌクレアーゼIIIで得られた5μlの増幅産物ならびにその後UNGおよび熱処理。
レーン7:Taq DNAポリメラーゼおよび125ngのAfuエキソヌクレアーゼIIIで得られた5μlの増幅産物、その後UNGなし熱処理なし。
レーン8:Taq DNAポリメラーゼおよび125ngのAfuエキソヌクレアーゼIIIで得られた5μlの増幅産物、その後UNGなし熱処理あり。
レーン9:DNA分子量マーカーXIV(ロシュ モレキュラー バイオケミカルズ No.1721933)
【図9】図9:
PCR産物の長さに対するAfuエキソヌクレアーゼIIIの効果。実施例Xに記載されるようにヒトゲノムDNAに関してTaq DNAポリメラーゼ/AfuエキソヌクレアーゼIII混合物を解析した。
レーン1:Taq/Exo III混合物と9,3kb tPAフラグメント
レーン2:Taq−Pol.と9,3kb tPAフラグメント
レーン3:Taq/Exo III混合物と12kb tPAフラグメント
レーン4:Taq−Pol.と12kb tPAフラグメント
レーン5:Taq/Exo III混合物と15kb tPAフラグメント
レーン6:Taq−Pol.と15kb tPAフラグメント
【図10】図10:
実施例XIに記載されるように、減少したポリメラーゼ活性を有するが、増大した3’−エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ変異体により、熱安定エキソヌクレアーゼIIIを置換できる。
レーン1:分子量マーカー
レーン2:反応1、Taqポリメラーゼ、4.8kbフラグメント
レーン3:反応2、Taqポリメラーゼ+Tagポリメラーゼ変異体、4.8kbフラグメント
レーン4:反応3、Taqポリメラーゼなし、Tagポリメラーゼ変異体、4.8kbフラグメント
レーン5:反応4、Taqポリメラーゼ+Afu ExoIII、4.8kbフラグメント
レーン6:反応5、Taqポリメラーゼ、9.3kbフラグメント
レーン7:反応6、Taqポリメラーゼ+Tagポリメラーゼ変異体、9.3kbフラグメント
レーン8:反応7、Taqポリメラーゼなし、Tagポリメラーゼ変異体、9.3kbフラグメント
レーン9:反応8、Taqポリメラーゼ+Afu ExoIII、9.3kbフラグメント
レーン10:分子量マーカー
【図11】図11:
実施例XIIに記載されるように、AfuエキソヌクレアーゼIIIは線状一本鎖DNA上では活性でない。
レーン1:Afu Exo III、インキュベーョンなし
レーン2:Afu Exo III、65℃で1時間
レーン3:Afu Exo III、65℃で2時間
レーン4:Afu Exo III、65℃で3時間
レーン5:Afu Exo III、65℃で4時間
レーン6::Afu Exo III、65℃で5時間
レーン7:酵素なしの反応緩衝液、インキュベーションなし
レーン8:酵素なしの反応緩衝液、65℃で5時間
レーン9:分子量マーカー
【図12】図12:
実施例XIIIに記載されるプライマー分解活性でのAfuエキソヌクレアーゼIIIの熱安定B型ポリメラーゼとの比較。
レーン1:分子量マーカー
レーン2:1u Tgo プレインキュベート(反応1)
レーン3:1.5u Tgo、プレインキュベート(反応2)
レーン4:1u Tgo、プレインキュベートなし(反応3)
レーン5:1.5u Tgo、プレインキュベートなし(反応4)
レーン6:1u Tgo、dNTPs非存在下でプレインキュベート(反応5)
レーン7:1.5u Tgo、dNTPs非存在下でプレインキュベート(反応6)
レーン8:1u Tgo、dNTPs非存在下でプレインキュベートなし(反応7)
レーン9:1.5u Tgo、dNTPs非存在下でプレインキュベートなし(反応8)
レーン10:1u Tgo、dNTPs非存在下で、追加のプライマーを補足してプレインキュベート(反応9)
レーン11:1.5u Tgo、dNTPs非存在下で、追加のプライマーを補足してプレインキュベート(反応10)
レーン12:Taqポリメラーゼ、プレインキュベート(反応11)
レーン13:Taq+37,5ng Afu Exo III、プレインキュベート(反応12)
レーン14:Taq+75ng Afu Exo III、プレインキュベート(反応13)
レーン15:Taqポリメラーゼ、プレインキュベートなし(反応14)
レーン16:Taq+37,5ng Afu Exo III、プレインキュベートなし(反応15)
レーン17:Taq+75ng Afu Exo III、プレインキュベートなし(反応16)
レーン18:分子量マーカー

Claims (4)

  1. ポリメラーゼ活性を示す第2の熱安定酵素に添加された場合に増幅プロセスの忠実度を増大する、3’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが DNAポリメラーゼ活性を示さない熱安定酵素であって、
    i)アーケオグロブス・フルギダス( Archaeoglobus fulgidus )から得られ得るものであり、かつ
    ii) SDS-PAGE による測定での分子量が約32,000ダルトンである、
    熱安定酵素
  2. 請求項1に記載の第1の熱安定酵素およびDNAポリメラーゼ活性を示す第2の熱安定酵素を含有してなる組成物であって、第2の熱安定酵素単独の使用と比較して該組成物の使用により増幅プロセスの忠実度が増大する、組成物。
  3. 第2の熱安定酵素が、プルーフリーディング活性を欠失しているか、またはTaqポリメラーゼである請求項2記載の組成物を用いてDNAを増幅する方法。
  4. 請求項1に記載の熱安定酵素を用いるDNAの増幅方法。
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Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1088891B1 (en) * 1999-09-28 2005-01-12 Roche Diagnostics GmbH Thermostable enzyme promoting the fidelity of thermostable DNA polymerases - for improvement of nucleic acid synthesis and amplification in vitro
EP1277841B1 (en) * 2001-07-11 2009-08-26 Roche Diagnostics GmbH New composition and method for hot start nucleic acid amplification
EP1275735A1 (en) * 2001-07-11 2003-01-15 Roche Diagnostics GmbH Composition and method for hot start nucleic acid amplification
CA2409775C (en) * 2001-12-03 2010-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Reversibly modified thermostable enzymes for dna synthesis and amplification in vitro
US20030180741A1 (en) * 2001-12-21 2003-09-25 Holly Hogrefe High fidelity DNA polymerase compositions and uses therefor
US9181534B1 (en) 2001-12-21 2015-11-10 Agilent Technologies Inc. High fidelity DNA polymerase compositions and uses thereof
US7932070B2 (en) 2001-12-21 2011-04-26 Agilent Technologies, Inc. High fidelity DNA polymerase compositions and uses therefor
GB0208768D0 (en) 2002-04-17 2002-05-29 Univ Newcastle DNA polymerases
US8283148B2 (en) 2002-10-25 2012-10-09 Agilent Technologies, Inc. DNA polymerase compositions for quantitative PCR and methods thereof
EP1502958A1 (en) * 2003-08-01 2005-02-02 Roche Diagnostics GmbH New detection format for hot start real time polymerase chain reaction
JP4190562B2 (ja) * 2004-12-08 2008-12-03 健 山本 遺伝子配列検査法
US7922177B2 (en) * 2005-05-18 2011-04-12 Diamond Game Enterprises, Inc. Ticket strips that encourage multiple ticket purchasing
EP1960538A2 (en) * 2005-11-18 2008-08-27 Bioline Limited A method for enhancing enzymatic dna polymerase reactions
US8962293B2 (en) 2006-10-18 2015-02-24 Roche Molecular Systems, Inc. DNA polymerases and related methods
US8409805B2 (en) * 2009-02-13 2013-04-02 Asuragen, Inc. Method of amplification of GC-rich DNA templates
EP2411532B1 (en) 2009-03-24 2017-04-05 Asuragen, Inc. Pcr methods for characterizing the 5' untranslated region of the fmr1 and fmr2 genes
BRPI1006682B1 (pt) * 2009-04-16 2020-04-22 Koninl Philips Electronics Nv método para a quantificação relativa de no mínimo um ácido nucleico alvo em uma amostra, método para a quantificação absoluta de no mínimo um ácido nucleico alvo em uma amostra, meios legíveis por máquina e equipamento para a análise das amostras de ácido nucleico
GB0915796D0 (en) * 2009-09-09 2009-10-07 Fermentas Uab Polymerase compositions and uses
US9238832B2 (en) * 2009-12-11 2016-01-19 Roche Molecular Systems, Inc. Allele-specific amplification of nucleic acids
US8759062B2 (en) 2010-06-18 2014-06-24 Roche Molecular Systems, Inc. DNA polymerases with increased 3′- mismatch discrimination
CA2802302C (en) 2010-06-18 2016-04-26 F. Hoffman-La Roche Ag Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination
WO2011157438A1 (en) 2010-06-18 2011-12-22 Roche Diagnostics Gmbh Dna polymerases with increasesed 3'-mismatch discrimination
WO2011157432A1 (en) 2010-06-18 2011-12-22 Roche Diagnostics Gmbh Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination
CA2802239C (en) 2010-06-18 2016-08-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination
JP5926248B2 (ja) 2010-06-18 2016-05-25 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 増大した3’末端ミスマッチ識別能を有するdnaポリメラーゼ
WO2011157434A1 (en) 2010-06-18 2011-12-22 Roche Diagnostics Gmbh Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination
EP2582804B1 (en) 2010-06-18 2015-02-25 Roche Diagnostics GmbH Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination
US8765435B2 (en) 2011-02-15 2014-07-01 Roche Molecular Systems, Inc. DNA polymerases with increased 3′-mismatch discrimination
CN103492559B (zh) 2011-04-11 2016-07-06 霍夫曼-拉罗奇有限公司 具有改进活性的dna聚合酶
ES2553400T3 (es) 2011-07-28 2015-12-09 F. Hoffmann-La Roche Ag ADN polimerasas con actividad mejorada
EP2559774A1 (en) * 2011-08-17 2013-02-20 Roche Diagniostics GmbH Improved method for amplification of target nucleic acids using a multi-primer approach
JP6140182B2 (ja) 2011-12-08 2017-05-31 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 改善された活性を有するdnaポリメラーゼ
ES2668448T3 (es) 2011-12-08 2018-05-18 F. Hoffmann-La Roche Ag ADN polimerasas con actividad mejorada
JP6224613B2 (ja) 2011-12-08 2017-11-01 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 改善された活性を有するdnaポリメラーゼ
ES2759023T3 (es) 2012-07-20 2020-05-07 Asuragen Inc Genotipificación completa de FMR1
GB201611469D0 (en) * 2016-06-30 2016-08-17 Lumiradx Tech Ltd Improvements in or relating to nucleic acid amplification processes
GB2569965A (en) 2018-01-04 2019-07-10 Lumiradx Uk Ltd Improvements in or relating to amplification of nucleic acids
CN112703248A (zh) 2018-09-13 2021-04-23 豪夫迈·罗氏有限公司 具有改良链置换能力的突变型dna聚合酶
CN116391042A (zh) * 2020-10-02 2023-07-04 新加坡国立大学 Dna组装混合物和其使用方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5358990A (en) * 1989-03-21 1990-10-22 Collaborative Research Inc. Multiplex dna diagnostic test
US6410277B1 (en) * 1993-02-19 2002-06-25 Takara Shuzo Co., Ltd. DNA polymersases with enhanced length of primer extension
US5436149A (en) 1993-02-19 1995-07-25 Barnes; Wayne M. Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension
WO1994023066A1 (en) * 1993-03-30 1994-10-13 United States Biochemical Corporation Use of exonuclease in dna sequencing
US5512462A (en) 1994-02-25 1996-04-30 Hoffmann-La Roche Inc. Methods and reagents for the polymerase chain reaction amplification of long DNA sequences
CA2176193A1 (en) * 1995-05-22 1996-11-23 John Wesley Backus Methods for polymerase chain reaction preamplification sterilization by exonucleases in the presence of phosphorothioated primers
AU717156B2 (en) * 1995-12-27 2000-03-16 Takara Bio Inc. Novel DNA polymerase
AU7683998A (en) * 1997-04-08 1998-10-30 Rockfeller University, The Enzyme derived from thermophilic organisms that functions as a chromosomal replicase, and preparation and uses thereof
US6238905B1 (en) * 1997-09-12 2001-05-29 University Technology Corporation Thermophilic polymerase III holoenzyme
DE19810879A1 (de) * 1998-03-13 1999-09-16 Roche Diagnostics Gmbh Polymerasenchimären
DE19813317A1 (de) * 1998-03-26 1999-09-30 Roche Diagnostics Gmbh Verbessertes Verfahren zur Primer Extension Präamplifikations-PCR
WO2000068411A1 (en) * 1999-05-12 2000-11-16 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced sensitivity and specificity of nucleic acid synthesis
EP1088891B1 (en) 1999-09-28 2005-01-12 Roche Diagnostics GmbH Thermostable enzyme promoting the fidelity of thermostable DNA polymerases - for improvement of nucleic acid synthesis and amplification in vitro
EP1275735A1 (en) * 2001-07-11 2003-01-15 Roche Diagnostics GmbH Composition and method for hot start nucleic acid amplification

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