JP2003510084A

JP2003510084A - インビトロでの核酸合成および増幅の改善のための熱安定ｄｎａポリメラーゼの忠実度を促進する熱安定酵素

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Publication number: JP2003510084A
Application number: JP2001526965A
Authority: JP
Inventors: アンケンバウアー，ヴァルトラウト; ラウエ，フランク; ソーベク，ハラルト; グライフ，ミヒァエル
Original assignee: ロシュダイアグノスティックスゲーエムベーハー
Priority date: 1999-09-28
Filing date: 2000-09-27
Publication date: 2003-03-18
Anticipated expiration: 2020-09-27
Also published as: NO20012561D0; US20060078928A1; CA2351634A1; EP1088891B1; JP3655240B2; RU2260055C2; ES2269189T3; NZ511759A; ATE286981T1; WO2001023583A3; DE69923180T2; NO20012561L; CA2351634C; IL143141A0; DE69923180D1; AU7907700A; ATE335825T1; WO2001023583A2; CN1343254A; DE60029927D1

Abstract

(57)【要約】精製された熱安定酵素は、熱安定性古細菌アーケオグロブス・フルギダスに由来する。この酵素は、天然または組換え体であり得、ＰＣＲ条件下で安定であり、２本鎖特異的エキソヌクレアーゼ活性を示す。これは、３’−５’エキソヌクレアーゼであり、５’−モノヌクレオチドを産生するように切断する。熱安定エキソヌクレアーゼは、Ｔａｇなどの熱安定ＤＮＡポリメラーゼと組み合わされて、多くの組換えＤＮＡ技術において、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸増幅に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、分子生物学の分野に関し、より詳細にはポリヌクレオチド合成に関
する。また、本発明は、実質的に純粋な熱安定エキソヌクレアーゼ、大腸菌にお
ける熱安定エキソヌクレアーゼＩＩＩのクローニングおよび発現、ならびに増幅
反応におけるそれの使用に関する。本発明は、持ち越し汚染からの除染を可能に
する条件下でのＤＮＡの高忠実度増幅および長鎖産物の合成を促進する。

【０００２】インビトロ核酸合成は、ＤＮＡポリメラーゼを用いてさらなるポリペプチド有
りまたは無しでルーチン的に行われる。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ複製およ
び修復に関連する酵素のファミリーである。大腸菌等の中温微生物からのＤＮＡ
ポリメラーゼの単離に関して広範な研究が行われてきた。例えば、ベスマン（
Ｂｅｓｓｍａｎ）ら、（１９５７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２３：１７１〜
１７７、およびブーチン（Ｂｕｔｔｉｎ）およびコーンバーグ（Ｋｏｒｎｂｅｒ
ｇ）、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１：５４１９−５４２７参照
。

【０００３】サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）等の好熱
菌からのＤＮＡポリメラーゼの単離および精製に関する研究が行われてきた。キ
ーエン（Ｃｈｉｅｎ），Ａら、（１９７６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２７：
１５５０−１５５７は、サーマス・アクアティカスＹＴ１株からの８０℃の至適
温度を有するＤＮＡポリメラーゼの単離および精製を開示している。米国特許第
４，８８９，８１８号は、約８６，０００〜９０，０００ダルトンの分子量を有
するＴ．アクアティカスに由来する精製された熱安定ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａ
ｑポリメラーゼを開示している。さらに、欧州特許出願０２５８０１７は、
ＰＣＲプロセスにおける使用に好ましい酵素としてＴａｑポリメラーゼを開示し
ている。

【０００４】ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、５’−３’ポリメラーゼ依存性エキソヌクレア
ーゼ機能を有するが、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレア
ーゼＩＩＩ機能を保持しないことが研究により示されている［ローヤー（Ｌａｗ
ｙｅｒ），Ｆ．Ｃ．ら、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：６４
２７−６４３７；バーナード（Ｂｅｒｎａｄ）Ａ．ら、（１９８９）Ｃｅｌｌ
５９：２１９］。ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、
「プルーフリーディング活性」と一般に呼ばれる。３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性は、プライマー−テンプレート二重鎖の３’末端でミスマッチした塩基を
除去する。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の存在は、核酸鎖の複製の忠実度
における増大および成熟前に終結した産物の伸長を導くので有利であり得る。Ｔ
ａｑＤＮＡポリメラーゼは、ミスマッチしたプライマー末端を除去し得ないので
、塩基取り込みエラーを生じやすく、所定の適用においてはその使用は望ましく
ない。例えば、遺伝子のいずれのコピーもランダムな誤取り込み現象のためにエ
ラーを含み得るので、増幅した遺伝子をクローンニングしようとする試みは問題
がある。エラーが生じるサイクル（例えば、初期の複製サイクルにおける）に依
存して、増幅したＤＮＡ全体が、誤って取り込んだ塩基を含み、従って、変異し
た遺伝子産物を生じうる。

【０００５】高忠実度ＤＮＡ増幅に使用される熱安定古細菌に由来するＢ型ポリメラーゼの
ような３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す数種の熱安定ＤＮＡポリメラー
ゼが当該技術分野において知られている。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
示す熱安定ポリメラーゼは、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）［精製され
た熱安定ピロコッカス熱安定ＤＮＡポリメラーゼ、マザー（Ｍａｔｈｕｒ）Ｅ．
、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、国際公開第９２／０９６８９号パンフレット、ＵＳ５
，５４５，５５２；ピロコッカス種由来の精製された熱安定ＤＮＡポリメラーゼ
、コーム（Ｃｏｍｂ）Ｄ．Ｇ．ら、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，
Ｉｎｃ．，ＥＰ０５４７３５９；古細菌ピロコッカスフリオサス由来のＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子の機能とヌクレオチド配列、ウエモリ（Ｕｅｍｏｒｉ）Ｔ
ら、（１９９３）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２１：２５９−２６５．］
、ピロディクタム種から（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）［熱安定核酸ポリメラーゼ
、ゲルファンド（Ｇｅｌｆａｎｄ）Ｄ．Ｈ．，Ｆ．ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ
）−ＬａＲｏｃｈｅＡＧ、ＥＰ０６２４６４１；ピロディクタム種由来
の精製された熱安定核酸ポリメラーゼおよびＤＮＡコード配列、ゲルファンド
Ｄ．Ｈ．，Ｆ．，ホフマン−ＬａＲｏｃｈｅＩｎｃ．，ＵＳ５，４９１，０
８６］、サーモコッカスから［例えば、サーモコッカス種に由来する熱安定DNA
ポリメラーゼＴＹ、ニーハウス（Ｎｉｅｈａｕｓ）Ｆ．ら、国際公開第９７／
３５９８８号；精製されたテルモコッカス・バロッシィ（Ｔｈｅｒｍｏｃｃｕｓ
ｂａｒｏｓｓｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、ルーム（Ｌｕｈｍ）Ｒ．Ａ．、Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、国際公開第９６／２２３８９号；
ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ等に有用な中間エキソヌクレアーゼ活性および高温でよ
り長期間の安定性を有するサーモコッカス・バロッシィ由来のＤＮＡポリメラー
ゼ、デネゼル（Ｄｈｅｎｎｅｚｅｌ）Ｏ．Ｂ．、ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔ
ｅｃｈＩｎｃ．、国際公開第９６／２２３８９号；ＤＮＡ操作における使用の
ためのサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａ
ｌｉｓ）由来の精製された熱安定ＤＮＡポリメラーゼ、ＣｏｍｂＤ．Ｇ．、Ｎ
ｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、ＵＳ５，３２２，７８５、
ＥＰ０４５５４３０；古細菌由来の組換え熱安定ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｏ
ｍｂＤ．Ｇ．、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、ＵＳ５
，３５２，７７８、ＥＰ０５４７９２０、ＥＰ０７０１０００；サーモ
コッカス・ゴルゴナリウスから得られる新規に単離された熱安定ＤＮＡポリメラ
ーゼ、アンゲラー（Ａｎｇｅｒｅｒ）Ｂ．ら、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎ
ｈｅｉｍＧｍｂＨ、国際公開第９８／１４５９０号］から単離され、クローン
化され得る。

【０００６】プルーフリーディング機能の存在下でＰＣＲを付与する他の可能性は、ポリメ
ラーゼ酵素、かかるプルーフリーディング活性を示すポリメラーゼの混合物の使
用である。（例えば、増大された熱安定性を有する熱安定ＤＮＡポリメラーゼな
らびに増強された長さおよび効率のプライマー伸長法、バルネス（Ｂａｒｎｅｓ
）Ｗ．Ｍ．，ＵＳ５，４３６，１４９、ＥＰ０６９３０７８；新規ポリメラ
ーゼ組成物およびその使用、ソージ（Ｓｏｒｇｅ）Ｊ．Ａ．，Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ、国際公開第９５／１６０２８号）。少なくとも１つの熱安定ＤＮＡポリメ
ラーゼの主要な成分と３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および３’−５’エキ
ソヌクレアーゼ活性を示す微少成分とを含有する熱安定ＤＮＡポリメラーゼ、例
えばＴａｑポリメラーゼおよびＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ等の製剤を使用するこ
とは一般的な慣習である。これらの混合物中において、進行性（ｐｒｏｃｅｓｓ
ｉｖｉｔｙ）は、ＴａｑポリメラーゼのようなｐｏｌＩ型酵素と、Ｐｆｕのよう
な熱安定Ｂ型ポリメラーゼによるプルーフリーディング機能とにより付与される
。高忠実度ＤＮＡ合成は、核酸増幅における１つの所望されるパラメータであり
、他の重要な特徴は、除染の可能性である。

【０００７】ポリメラーゼ連鎖反応は、単一分子を十億倍より多くに増幅しうる。従って、
微少量の夾雑物でさえも、増幅され、偽陽性結果を導きうる。かかる夾雑物は、
しばしば以前のＰＣＲ増幅に由来する産物である（持ち越し汚染）。それゆえ、
研究者らは、かかる汚染を回避する方法を開発した。

【０００８】手順は、ウラシル含有ＤＮＡ（Ｕ−ＤＮＡ）を産生するためにＰＣＲ増幅の間
にｄＵＴＰでＴＴＰを置き換えることに依存している。続いて、ＰＣＲ増幅の前
にＰＣＲ反応混合物をウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）で処理する
ことにより、増幅に適さない混入した核酸を分解する。ｄＵＴＰは、ｐｏｌＩ型
熱安定ポリメラーゼにより容易に取り込まれるが、Ｂ型ポリメラーゼには取り込
まれない［Ｇ．スルップハウク（Ｓｌｕｐｐｈａｕｇ）ら、（１９９３）Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１１：１６４−１６９］。Ｂ型ポリメラーゼによるｄＵ
ＴＰの低取り込みは、テンプレートの同じ型がＰＣＲ増幅により繰り返し分析さ
れる研究室におけるそれらの使用を制限する。

【０００９】３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す熱安定ＤＮＡポリメラーゼは、サー
モトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）［サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔ
ｏｇａｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）に由来する好熱性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｌ
ａｔｅｒＭ．Ｒ．ら、ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、国際公開第
９６／４１０１４号；テルモトガ・ネアポリタナ由来のクローン化されたＤＮＡ
ポリメラーゼおよびその変異体、ヒュース（Ｈｕｇｈｅｓ）Ａ．Ｊ．ら、Ｌｉｆ
ｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．国際公開第９６／１０６４０号；テル
モトガ・マリチマ（Ｔｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａ）に由来する精製さ
れた熱安定核酸ポリメラーゼ酵素、ゲルファンド（Ｇｅｌｆａｎｄ）Ｄ．Ｈ．ら
、ＣＥＴＵＳＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、国際公開第９２／０３５５６号］のよ
うな真正細菌からも単離された。これらの酵素は、誤取り込みまたはミスマッチ
した塩基を除去しうる強い３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。この酵
素の遺伝学的に操作された改変体は、ＵＬＴｍａ、ＰＣＲプロセスにさらなるポ
リペプチドなしで使用されうるＤＮＡポリメラーゼとして市販されている。この
酵素は、誤取り込みされた塩基を除去し、ｄＵＴＰを取り込みうるが、忠実度が
、不明な理由のためにＴａｑポリメラーゼのそれよりも高くない［ポリメラーゼ
連鎖反応における複製の正確さ、ディアズ（Ｄｉａｚ）Ｒ．Ｓ．ら、Ｂｒａｚ．
Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．（１９９８）３１：１２３９−１２４２；Ｐｆ
ｕＤＮＡポリメラーゼおよび他の熱安定ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲ忠実度、ク
ライン（Ｃｌｉｎｅ）Ｊ．ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９９
６）２４：３５４６−３５５１］。

【００１０】高忠実度ＤＮＡ合成のために、Ｂ型ポリメラーゼまたはそれらを含有する混合
物の使用に代わる他のものは、好熱性ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素、１８
ポリペプチド鎖の複合体の使用である。これらの複合体は、細菌の染色体のレプ
リカーゼと同一であり、数百キロベースまたは全染色体のＤＮＡ鎖を合成するの
に必要な全ての因子を含む。この酵素の１０個の異なるサブユニット（それらの
いくつかはマルチコピーで存在する）は、組換え技術により作製され、再構築さ
れ、インビトロＤＮＡ合成に使用されうる。これらの複合体の考えられうる使用
としては、数千から数十万塩基対の核酸のＰＣＲ増幅が提案される［染色体レプ
リカーゼとして機能する好熱性生物酵素に由来する酵素、その調製および使用、
ユリーバ（Ｙｕｒｉｅｖａ）Ｏ．ら、ＴｈｅＲｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒＵｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ，国際公開第９８／４５４５２号；新規好熱性ポリメラーゼＩＩ
Ｉホロ酵素、マックヘンリー（ＭｃＨｅｎｒｙ）Ｃ．、ＥＮＺＹＣＯＩｎｃ．
、国際公開第９９／１３０６０号）。

【００１１】本発明の目的は、好ましくは同時にｄＵＴＰを取り込むことができる高忠実度
ＰＣＲ系を開発することであった。本発明によれば、３’−エキソヌクレアーゼ
活性を示すが、本質的にＤＮＡポリメラーゼ活性を示さない熱安定酵素が提供さ
れ、この酵素は、ポリメラーゼ活性を示す第２の酵素に加えられた場合に増幅の
忠実度を増強する。提供される酵素は、ＤＮＡ合成プロセスの間にミスマッチし
たプライマー末端を切り出し、ポリメラーゼ活性を示す第２の酵素を再会合させ
、伸長を再開させることを可能にしうる。本発明の酵素は、プルーフリーディン
グ酵素としてポリメラーゼ活性を示す第２の酵素と協力しうる。当該課題に適す
ることが見出された酵素は、例えば、熱安定エキソヌクレアーゼＩＩＩである。
３’から５’方向に働き、５’のリン酸を切断し、３’ヒドロキシル基を保存し
、理想的には２本鎖ＤＮＡのみで働くエキソヌクレアーゼＩＩＩが好ましい。Ｄ
ＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ機能は、２本鎖および単鎖Ｄ
ＮＡにおいて有効である。後者の活性は、ＰＣＲアッセイにおいて所望されない
プライマー分解を導き得る。上記酵素は、７０℃〜８０℃で活性であり、変性サ
イクルを乗り越えるのに十分に活性であり、ＰＣＲプロセスの完了後に未分解の
ＰＣＲ産物を保存するための低温では不活性であることが好ましい。これらの特
徴を示す酵素は、好熱性真正細菌に由来するか、または好熱性古細菌（ａｒｃｈ
ａｅａ）由来の酵素に関連しうる。３つの熱安定古細菌のゲノムが配列決定され
ている。メタノコッカス・ヤナシィ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａ
ｓｃｈｉｉ）［メタン生成古細菌、メタノコッカス・ヤナシィの完全なゲノム配
列、ブルト（Ｂｕｌｔ）Ｃ．Ｊ．ら、（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７３：１
０５８−１０７２）、メタノバクテリウム・サーモオートトロヒクム（Ｍｅｔｈ
ａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）［メタ
ノバクテリウム・サーモオートトロヒクムΔＨの完全なゲノム配列：機能的解析
および比較ゲノミクス、スミス（Ｓｍｉｔｈ）Ｄ．Ｒ．ら、Ｊ．ｏｆＢａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９９７）１７９：７１３５−７１５５］およびアーケオグ
ロブス・フルギダス（超好熱性、硫酸還元古細菌アーケオグロブス・フルギダス
の完全なゲノム配列、クレング（Ｋｌｅｎｋ）Ｈ．−Ｐ．ら、（１９９７）Ｎａ
ｔｕｒｅ３９０：３６４−３７０］。

【００１２】詳細には、２本鎖ＤＮＡにおいて３’から５’方向にプライマーまたはポリヌ
クレオチドのミスマッチした末端の分解を触媒する、アーケオグロブス・フルギ
ダスから得られうる熱安定酵素が提供される。アーケオグロブス・フルギダス
（Ａｆｕ）から得られうる熱安定エキソヌクレアーゼＩＩＩをコードする遺伝子
を、クローン化し、大腸菌において発現させ、単離した。上記酵素は、ＰＣＲ反
応に使用されるインキュベーションおよび温度条件下で活性である。上記酵素は
、良好な収率で反応混合物に存在するｄＵＴＰを伴うか、伴うことなく、低エラ
ー率のＤＮＡ合成およびゲノムＤＮＡにおける３ｋｂよりも大きな産物（Ｔａｑ
ポリメラーゼにより合成される産物の上方の範囲）の合成を行うことにおいてＴ
ａｑのようなＤＮＡポリメラーゼを支持する。好ましくは、２，５ＵのＴａｑポ
リメラーゼ当たり５０〜５００ｎｇのＡｆｕから得られうるエキソヌクレアーゼ
ＩＩＩを、至適なＰＣＲパフォーマンスを得るために使用した。より好ましくは
、ＰＣＲ反応中の２，５ＵのＴａｑポリメラーゼ当たり６７ｎｇ〜３８０ｎｇの
Ａｆｕから入手可能であるエキソヌクレアーゼＩＩＩの使用である。

【００１３】従って、本発明の酵素は、プルーフリーディング酵素としてＴａｑポリメラー
ゼと協力しうる。他の酵素と比較した本発明の酵素の使用の利点は、本発明の酵
素が、２本鎖ＤＮＡにおいて好適に活性であることである。本発明の熱安定酵素
は、かかる酵素が必要または所望されるいかなる目的のためにも使用され得る。
特に好ましい態様において、上記酵素は、成熟前の停止を導くミスマッチしたプ
ライマー末端を除去するため、ポリメラーゼによりさらに効率的に伸長されるプ
ライマー末端を提供するため、塩基取り込みエラーを校正するため、ポリメラー
ゼが長いＰＣＲ産物を産生することを可能にするために、ＰＣＲとして知られる
核酸増幅反応において熱安定ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて使用される。

【００１４】さらに、本発明の主題は、３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的に
ＤＮＡポリメラーゼ活性を示さない第１の熱安定酵素およびポリメラーゼ活性を
示す第２の酵素を含有する組成物に関し、ここで、増幅プロセスの忠実度は、第
２の酵素単独の使用と比較してこの組成物の使用により増強される。また、本発
明の３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、ＤＮＡポリメラーゼ活性を示さな
い熱安定酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ活性の減少を示すか、またはかかる活性を
全く示さない適切な酵素を含む。本発明においてＤＮＡポリメラーゼ活性の減少
とは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す酵素の該活性の５０％よりも少ないことを
意味する。好ましい態様において、本発明の組成物の第２の酵素は、プルーフリ
ーディング活性を欠失している。特に好ましくは、第２の酵素は、Ｔａｑポリメ
ラーゼである。

【００１５】本発明のさらなる主題は、３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的に
ＤＮＡポリメラーゼ活性を示さない第１の熱安定酵素およびポリメラーゼ活性を
示す第２の酵素を含有する混合物を用いるＤＮＡの合成方法である。この方法に
よれば、成熟前に終結した鎖が、３’から５’の分解によりトリミングされる。
プライマーまたは成長する鎖のいずれかのミスマッチした末端がこの方法により
除去される。

【００１６】本発明は、ｄＵＴＰが反応混合物中に存在し、部分的または完全にＴＴＰを置
換する上記の方法をさらに含む。本方法により、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ
（ＵＤＧまたはＵＮＧ）が、混入する核酸の分解のために使用されることが好ま
しい。

【００１７】好ましくは、本方法によると、 −３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にＤＮＡポリメラーゼ活性を
示さない第１の熱安定酵素と −ポリメラーゼ活性を示す第２の酵素との混合物は、３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にＤＮＡポリメラ
ーゼ活性を示さない第１の熱安定酵素の非存在下でポリメラーゼ活性を示す第２
の酵素により産生されるＰＣＲ産物と比較してより低いエラー率を有するＰＣＲ
産物を産生する。本方法において、３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本
質的にＤＮＡポリメラーゼ活性を示さない第１の熱安定酵素とポリメラーゼ活性
を示す第２の酵素との混合物が、３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質
的にＤＮＡポリメラーゼ活性を示さない第１の熱安定酵素の非存在下でポリメラ
ーゼ活性を示す第２の酵素により産生されるＰＣＲ産物と比較してより長いＰＣ
Ｒ産物を産生する。さらに、３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的に
ＤＮＡポリメラーゼ活性を示さない第１の熱安定酵素は、大腸菌のエキソヌクレ
アーゼＩＩＩに関連するが、本方法により熱安定である。上記方法のさらなる態
様は、平滑末端を有するＰＣＲ産物が得られる方法である。

【００１８】本発明の主題はまた、３’エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にＤＮＡ
ポリメラーゼ活性を示さない本発明の熱安定酵素を得る方法およびこの酵素を産
生するための手段および材料、例えば、ベクターおよび宿主細胞（例えば、ＤＳ
Ｍ番号１３０２１）である。

【００１９】以下の実施例は、説明するために提供され、限定することを意図しない。

【００２０】好ましい態様の詳細な説明

【００２１】実施例Ｉコード配列の単離本明細書の好ましい熱安定酵素は、アーケオグロブス・フルギダスＶＣ−１
６株（ＤＳＭＮｏ．４３０４）から得られうる高度熱安定エキソデオキシリボ
ヌクレアーゼである。該株をイタリア、ナポリ（Ｎａｐｌｅｓ、Ｉｔａｌｙ）の
ヴルカーノ島（ＶｕｌｃａｎｏＩｓｌａｎｄ）およびストゥーフェ・ディ・ネ
ローネ（ＳｔｕｆｅｄｉＮｅｒｏｎｅ）の海底熱水系から単離した〔ステッ
ター（Ｓｔｅｔｔｅｒ），Ｋ．Ｏ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３６：８
２２−８２４〕。この生物は、最適条件８３℃で６０℃〜９５℃の増殖範囲を有
する高度好熱性硫黄代謝古細菌である。〔クレンク（Ｋｌｅｎｋ），Ｈ．Ｐ．ら
、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３９０：３６４−３７０〕。ゲノム配列はＴＩＧＲ
データベースに寄託されている。エキソヌクレアーゼＩＩＩ（ｘｔｈＡ) をコー
ドすると推定される遺伝子は、Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ０５８０を有する。

【００２２】既知の分子量のタンパク質標準と比較した場合、アーケオグロブス・フルギダ
スから得られうるエキソデオキシリボヌクレアーゼの見かけの分子量は、約３２
，０００ダルトンである（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ) 。本発明の熱安定酵素の正確な分
子量は、アーケオグロブス・フルギダスエキソデオキシリボヌクレアーゼＩＩ
Ｉ遺伝子のコード配列から決定され得る。

【００２３】実施例ＩＩアーケオグロブス・フルギダス由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩをコードする遺
伝子のクローニング所望の発現ベクターの多クローニング部位に適合性があり、アーケオグロブス
・フルギダスエキソヌクレアーゼＩＩＩ遺伝子のＮおよびＣ末端に相補的な制
限部位を有する以下のプライマーを設計した：配列番号：１Ｎ末端（ＢａｍＨＩ部位）： 5'-GAA ACG AGG ATC CAT GCT CAA AAT CGC CAC C
-3' 配列番号：２Ｃ末端（ＰｓｔＩ部位）： 5'-TTG TTC ACT GCA GCT ACA CGT CAA ACA CAG C-3'

【００２４】最初に、１つの２ｍｌエッペンドルフキャップで５，０００ｒｐｍで遠心分離
を繰り返すことにより細胞を集めた。ＤＮＡ単離は、細菌細胞からの単離につい
て記載されたいずれの方法で行なってもよい。今回は、ＨｉｇｈＰｕｒｅ^TM
ＰＣＲテンプレート調製キット（ロシュディアグノスティクス（ＲＯＣＨＥ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）ＧｍｂＨ、Ｎｏ．１７９６８２８）で、アーケオグ
ロブス・フルギダスゲノムＤＮＡを調製した。この方法で、染色体ＤＮＡ約６μ
ｇを７２ｎｇ／μｌの濃度で得た。

【００２５】Ｅｘｐａｎｄ^TM ＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲシステム（ロシュデ
ィアグノスティクスＧｍｂＨ、Ｎｏ．１７３２６４１）中で、４つの同一の調
製でキャップ当たり１００ｎｇのアーケオグロブス・フルギダスゲノムＤＮＡで
、上記プライマーを用いてＰＣＲを行なった。下記の条件で、ＰＣＲを行なった
：１ × ９４℃、２分；１０× ９４℃、１０秒；５４℃、３０秒；６８℃、３分；２０× ９４℃、１０秒；５４℃、３０秒；６８℃、３分、各サイクルにつき
２０秒サイクル延長を伴う；１ × ６８℃、７分；終濃度１０ｍＭまでＭｇＣｌ₂を添加した後、各１０ユニットのＢａｍＨＩおよ
びＰｓｔＩでＰＣＲ産物を２時間３７℃で切断した。低融解アガロースゲルで
反応生成物を分離した。電気泳動後、適切なバンドを切り出して、ゲルスライス
をあわせ、溶解し、ＤＮＡフラグメントをアガラーゼ（ａｇａｒａｓｅ）消化に
より単離し、ＥｔＯＨで沈澱させた。乾燥ペレットを３０μｌのＨ₂Ｏで希釈し
た。

【００２６】適切な発現ベクター、本明細書ではｐＤＳ５６Ｔを、挿入に使用するように
同一の制限酵素で消化して、同一の方法で洗浄した。

【００２７】ＲａｐｉｄＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ（ロシュディアグノスティ
クスＧｍｂＨ、Ｎｏ．１６３５３７９）での挿入物とベクターのライゲーショ
ン後、プラスミドを発現宿主Ｅ．ｃｏｌｉ３９２ｐＵＢＳ５２０で形質転換
した〔ブリンクマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ）Ｕ．ら（１９８９）Ｇｅｎｅ８５：
１０９−１１４〕。

【００２８】ＨｉｇｈＰｕｒｅ^TMプラスミド単離キット（ロシュディアグノスティク
スＧｍｂＨ、Ｎｏ．１７５４７７７）を用いて形質転換体のプラスミドＤＮＡ
を単離して、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩでの制限消化およびアガロースゲル電気
泳動により特徴付けた。

【００２９】 −７０℃のグリセロール培養で、陽性Ｅ．ｃｏｌｉｐＵＢＳ５２０Ｅｘｏ
ＩＩＩ形質転換体を保存した。ＤＮＡ配列決定で、エキソヌクレアーゼＩＩＩを
コードする遺伝子の配列を確認した。それを図１に示す。

【００３０】アーケオグロブス・フルギダスまたは他の好熱性生物由来のエキソヌクレアー
ゼＩＩＩのクローニングおよび発現は、当該分野における従来技術を用いる他の
技術によって行なってもよい（例えば、サンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂ．、１９８９を参照のこ
と）。

【００３１】実施例ＩＩＩ組換えＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩの発現実施例Ｉからの形質転換体を、適切な抗生物質を含むリッチ培地で発酵槽中で
培養した。細胞を光学密度〔Ａ₅₄₀〕５．５で遠心分離により収集し、必要とな
るまで凍らせるか、またはリゾチームでの処理により溶解してアーケオグロブス
・フルギダスエキソヌクレアーゼＩＩＩ活性を含む粗細胞抽出物を作製した。

【００３２】アーケオグロブス・フルギダスエキソヌクレアーゼＩＩＩ活性を含む粗抽出
物を、実施例ＩＶに記載された方法もしくはアフィニティークロマトグラフィー
、イオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー等の
他の精製技術により精製する。

【００３３】実施例ＩＶ組換えＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩの精製１０ｌの発酵槽でトリプトン（２０ｇ／ｌ）、酵母抽出物（１０ｇ／ｌ）、Ｎ
ａＣｌ（５ｇ／ｌ）およびアンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）を含む培地で、実施
例ＩからのＥ．ｃｏｌｉｐＵＢＳ５２０ＥｘｏＩＩＩ（ＤＳＭＮｏ．１３
０２１）を３７℃で増殖し、ＩＰＴＧ（０．３ｍＭ）で指数増殖期の中間に誘導
し、さらに４時間インキュベートした。遠心分離により細胞約４５ｇを収集し、
−７０℃で保存した。細胞２ｇを溶解し、４ｍｌの緩衝液Ａ（４０ｍＭＴｒｉ
ｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５；０．１ｍＭＥＤＴＡ；７ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール；１ｍＭＰｅｆａｂｌｏｃＳＣ）で懸濁した。リゾチーム１．２ｍｇ
を添加して４℃で３０分間、デオキシコール酸ナトリウム４．５６ｍｇを添加し
て室温で１０分間次いで０℃で２０分間の攪拌下で、細胞を溶解した。粗抽出物
を７５０ｍＭＫＣｌに調整し、７２℃で１５分間加熱し、変性タンパク質の除
去のために遠心分離した。

【００３４】９０℃までの温度の加熱はまた、アーケオグロブス・フルギダスエキソヌク
レアーゼＩＩＩを破壊（変性）することなく可能である。１０ｍＭＭｇＣｌ₂ に調整した緩衝液Ｂ（１０％グリセロールを含む緩衝液Ａ）に対して上清を透析
し、緩衝液Ｂで平衡化した寸法１×７ｃｍおよび５．５ｍｌベッド容積を有する
ＢｌｕｅＴｒｉｓａｃｒｙｌＭカラム（ＳＥＲＶＡ、Ｎｏ．６７０３１）に
供した。１６．５ｍｌの緩衝液Ｂでカラムを洗浄し、緩衝液Ｂ中に０〜３ＭＮ
ａＣｌの８２ｍｌリニアグラジエントでエキソヌクレアーゼタンパク質を溶出し
た。１０〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥグラジエントゲルの電気泳動によるアーケ
オグロブス・フルギダスエキソデオキシリボヌクレアーゼタンパク質に対する
カラム画分をアッセイした。１６．５ｍｌの活性な画分をプールし、Ａｑｕａｃ
ｉｄｅＩＩ（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＮｏ．１７８５１）で濃縮し、保存緩衝
液Ｃ（１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．９；１０ｍＭ２−メルカプトエ
タノール；０．１ｍＭＥＤＴＡ；５０ｍＭＫＣｌ；５０％グリセロール）に
対して透析した。透析後、ＴｈｅｓｉｔおよびＮｏｎｉｄｅｔＰ４０を、それ
ぞれ終濃度０．５％となるように添加した。この調製物を−２０℃で保存した。

【００３５】得られたアーケオグロブス・フルギダスエキソヌクレアーゼＩＩＩは、ＳＤ
Ｓゲル電気泳動による見積もりで９５％の純度であった。収量は、２．３ｇ細胞
質量当たりタンパク質５０ｍｇであった（湿重量）。

【００３６】実施例Ｖアーケオグロブス・フルギダス由来の組換えエキソヌクレアーゼＩＩＩの熱安定
性熱変性に対する耐性を解析することによって、実施例ＩＩに記載のクローン化
されたアーケオグロブス・フルギダス由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩの熱安定
性を測定した。実施例ＩＶに記載の溶解後、エッペンドルフ遠心分離機で１０分
間１５，０００ｒｐｍで粗抽出物１００μｌを遠心分離した。５つの新しいエッ
ペンドルフキャップに上清をアリコートした。５つの異なる温度、５０℃、６０
℃、７０℃、８０℃および９０℃で１０分間、キャップをインキュベートした。
上記の遠心分離後、１０〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥグラジエントゲルでの電気泳
動により上清のアリコートを解析した。図２に示されるように、９０℃でのイン
キュベーション後のアーケオグロブス・フルギダスエキソヌクレアーゼＩＩＩ
タンパク質の量は、より低温で処理されたサンプルの量と同じであった。熱変性
により検出可能な有意な損失はなかった。この結果から、半減期が９０℃で１０
分間より長いと結論できる。

【００３７】実施例ＶＩＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩの活性エキソヌクレアーゼＩＩＩは、二重鎖ＤＮＡの３’ヒドロキシル末端からモノ
ヌクレオチドの段階除去を触媒する〔ロジャース（Ｒｏｇｅｒｓ）Ｇ．Ｓ．およ
びヴァイス（Ｗｅｉｓｓ）Ｂ．（１９８０）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ
．６５：２０１−２１１）。限定数のヌクレオチドを、各結合事象の間に除去す
る。好ましい基質は、平滑または陥凹３’末端である。酵素は一本鎖ＤＮＡ上で
は活性ではなく、３’突出末端は、開裂に対してより耐性がある。ＤＮＡ分子量
マーカーＩＶ（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ、Ｎｏ．１０６２５９
０）は、ＨｉｎｆＩ消化したｐＢＲ３２８と混合したＢｇｌＩ消化したｐＢＲ３
２８からなる。ＨｉｎｆＩ消化の産物は、３’陥凹末端を有し、エキソヌクレア
ーゼＩＩＩによる分解に好ましい基質であると予期され、ＢｇｌＩ開裂の産物は
、３塩基突出部分を伴う３’突出末端を有し、エキソヌクレアーゼＩＩＩによる
開裂に対してより耐性がある。

【００３８】２５μｌの以下のインキュベーション緩衝液：１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、
ｐＨ８．０；５ｍＭＭｇＣｌ₂；１ｍＭ２−メルカプトエタノール；１００
ｍＭＮａＣｌ中で、パラフィンで覆って、ＤＮＡ分子量マーカーＩＶ（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ、Ｎｏ．１０６２５９０）０．５μｇと共に
、実施例ＩＶからのアーケオグロブス・フルギダスエキソヌクレアーゼＩＩＩの
連続希釈物を７２℃で２時間インキュベートした。Ｅ．ｃｏｌｉのエキソヌクレ
アーゼＩＩＩ（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ、Ｎｏ．７７９７０９
）１０ユニットを対照として含ませた。対照反応を３７℃で行なった。５μｌの
停止溶液（０．２％アガロース、６０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．８、１０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー）
を添加後、混合物を１％アガロースゲルで分離した。結果を図３に示す。Ａｆｕ
エキソヌクレアーゼＩＩＩは２つの異なる型の基質を識別する。好ましい基質は
、３’陥凹末端を有するフラグメント（例えば、１７６６ｂｐフラグメント）で
あり、３’突出末端（例えば、２１７６ｂｐ、１２３０ｂｐ、１０３３ｂｐフラ
グメント）は、分解に対してより耐性である。より多い量のタンパク質で、レー
ン１と同程度に基質を分解し、大腸菌のエキソヌクレアーゼＩＩＩの産物を解析
した。Ａｆｕエキソヌクレアーゼタンパク質の量を増加させることによりＤＮＡ
基質はほとんど残らず（レーン１５〜１９）、残りのフラグメントの妨害は調製
物中の不純物としてのＤＮＡ結合タンパク質のためであり得る。

【００３９】実施例ＶＩＩＰＣＲにおけるＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩでのミスマッチプライマー補正ＰＣＲにおけるＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ／Ｔａｑポリメラーゼ混合物
の修復効率を、３’末端のミスマッチプライマーを用いて試験した。アッセイの
原理を図４に示す。ＰＣＲのために、フォワードプライマーがテンプレートＤＮ
Ａと塩基対形成できない１つまたは２つのヌクレオチドを３’末端に有するプラ
イマーの増幅セットを使用する。ミスマッチプライマー末端の切り出しおよび修
復されたプライマーの増幅は、その後制限エンドヌクレアーゼＢｓｉＥＩで切断
し得る産物を生じ、一方、ミスマッチプライマーから生じる産物は、切断に対し
て耐性を有する。

【００４０】使用したプライマー配列：１．リバース： 5'- GGT TAT CGA AAT CAG CCA CAG CG - 3'（配列番号：３）２．フォワード１（ｇ：ａミスマッチ）： 5'- TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA C
GG TCA - 3' （配列番号：４）３．フォワード２（ｇ：ｔミスマッチ）： 5'- TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA C
GG TCT - 3' （配列番号：５）４．フォワード３（ｇ：ｃミスマッチ）： 5'- TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA C
GG TCC - 3' （配列番号：６）５．フォワード４（２塩基ミスマッチ）： 5'- TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA C
GG TAT - 3' （配列番号：７）

【００４１】２．５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ロシュディアグノスティク
スＧｍｂＨ、Ｎｏ．１４３５０９４）、実施例ＩＶからのアーケオグロブス・
フルギダスエキソヌクレアーゼＩＩＩを０．２５μｇ、バクテリオファージλ
由来のＤＮＡ１０ｎｇ、各プライマー０．４μＭ、２００μＭｄＮＴＰ’、１
．５ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．２、１６ｍＭ
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲを５０μｌのＰＣＲ容積
で、以下の条件で行なった：１ × ９４℃、２分；４０× ９４℃、１０秒；６０℃、３０秒；７２℃、１分；１ × ７２℃、７分；エキソヌクレアーゼ／Ｔａｑポリメラーゼ混合物の機能を、２．５ユニットのＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼ、０．３ユニットのＴｇｏＤＮＡポリメラーゼ（ロ
シュディアグノスティクスＧｍｂＨ）の対照および０．７５μｌのＥｘｐａ
ｎｄ^TM ＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲシステム（ロシュディアグノス
ティクスＧｍｂＨ、Ｎｏ．１７３２６４１）と比較した。ＢｓｉＥＩでのＰＣ
Ｒ産物の十分な消化により示されるように、Ａ．フルギダスエキソヌクレアー
ゼＩＩＩは、記載された全てのミスマッチ補正活性を９０〜１００％の効率で示
した（図５）。予期されるようにＴａｑＤＮＡポリメラーゼは補正活性を示さ
なかったが、一方、その３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴｇｏＤ
ＮＡポリメラーゼは同様に完全に補正した。Ｅｘｐａｎｄ^TM ＨｉｇｈＦｉｄ
ｅｌｉｔｙＰＣＲシステムは、２塩基ミスマッチでのみ１００％補正活性を示
した。他のミスマッチを約５０％の効率で修復した。

【００４２】実施例VIII PCR プロセスにおけるAfu エキソヌクレアーゼIII/Taq DNA ポリメラーゼ混合物
の忠実度 PCR プロセスにおけるAfu エキソヌクレアーゼIII/Taq DNA ポリメラーゼ混合
物の忠実度は、機能的なlac Iq^qアレレを含むpUC19 誘導体pUCIQ17 の増幅、環
化および形質転換に基づくアッセイで決定された (フレイ(Frey, B.)およびサッ
プマン(Suppmann B.) (1995) Biochemica 2 ：34-35)。lac I におけるPCR で得
られた変異は、lacZαの発現の脱抑制と続くX-gal 呈示プレート上の容易に検出
されうる機能的βガラクトシダーゼ酵素の形成をもたらす。本lac I に基づくPC
R 忠実度アッセイで決定されたTaq ポリメラーゼ/Afuエキソヌクレアーゼ混合物
のエラー率は、Taq DNA ポリメラーゼおよびExpand HiFi PCR システム (ロシュ
モレキュラーバイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals)) ならびに対照
としてPwo DNA ポリメラーゼ（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ) と比較し
て決定された。

【００４３】プラスミドpUCIQ17 は、試験される酵素によるPCR 増幅の基質として働くよう
に、DraII による消化によって直鎖状にした。

【００４４】使用される両プライマーは、5'末端にClaI部位を有する：配列番号：８プライマー１： 5'-AGCTTATCGATGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCG-3' 配列番号：９プライマー２： 5'-AGCTTATCGATAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGC-3' 得られるPCR 産物の長さは、3493bpである。前記PCR を、最終容量50μl の1.5mM MgCl₂、50mMトリス-HCl、pH8.5 (25 ℃)
、12.5mM（NH₄)₂SO₄、35mM KCl、200 μM dNTPs 、および2.5 単位のTaq ポリメ
ラーゼとそれぞれ125ng 、175ng 、250ng 、375ng および500ng のAfu エキソヌ
クレアーゼIII の存在下に行なった。

【００４５】サイクル条件は、次の通りであった： PCR の後、PCR 産物を、PEG-沈澱 (バーンズ（Barnes, W. M.) (1992) Gene 1
12：229)し、DNA を、ClaIで制限(restricted)し、アガロースゲル電気泳動によ
りて精製した。単離されたDNA を、Rapid DNA Ligation Kit（ロシュモレキュラ
ーバイオケミカルズ) を用いて連結し、ライゲーション産物を、E.coli DH5αに
形質転換し、TN Amp X-Galプレートにプレーティングした。得られたプラスミド
pUCIQ17 (3632bp)で形質転換されたα相補性E.coli DH5α株は、アンピシリン (
100 μg/ml) とX-Gal (0.004% w/v)とを含むTNプレート(1.5% バクトトリプトン
、1% NaCl 、1.5%寒天）上で、白 (lacI⁺) コロニーを示す。変異は、青コロニ
ーをもたらす。

【００４６】 37℃で一晩培養後、青コロニーと白コロニーをカウントした。キョハボン(Keo
havong) およびツィリー(Thilly)(Keohavong, P.およびThilly, W. (1989) PNAS
USA 86:9253) により刊行された再配列式(rearranged equation) ： f=-lnF/d × b bp ( 式中、F は、白コロニーの分数であり： F= 白 (lacI+ ) コロニー/ 全体のコロニー数； d は、DNA 複製の数であり： 2^dアウトプットDNA/インプットDNA ；およびb は、lacI遺伝子(1080bp)の有効標的サイズであり、ここで、該有効標的
サイズは、プロボスト(Provost) ら(Provostら（1993） Mut. Res. 288:133) に
よれば349bp である) により、bpあたりのエラー率(f) を計算した。

【００４７】図6Aと図6Bに示される結果は、反応混合物中における熱安定性エキソヌクレア
ーゼIII の存在がより低いエラー率をもたらすことを説明する。エキソヌクレア
ーゼに対するポリメラーゼの割合に依存して、エラー率が減少している。最も至
適なTaq ポリメラーゼ/AfuエキソヌクレアーゼIII 混合物 (4,44×10^-6) で達成
される忠実度は、Taq/Pwo 混合物（Expand HiFi ；2,06×10^-6）の忠実度に類似
した範囲である。至適緩衝液条件の評価は、さらに忠実度を改善するであろう。
ポリメラーゼとエキソヌクレアーゼとの間の割合は、至適化されるべきである。
多量のエキソヌクレアーゼは、産物収量を減らし、明らかに増幅効率を減少させ
る（Taq/Exo 1:10は、 2.5単位の Taqポリメラーゼと500ng のAfu エキソヌクレ
アーゼIII に相当する) 。

【００４８】本システムの忠実度は、緩衝液成分を変えること、各成分の濃度を至適化する
ことまたはサイクル条件を変えることによって、例えば、当該分野における慣用
の技術を用いて、さらに最適化されるかもしれない。

【００４９】実施例IX： PCR におけるAfu エキソヌクレアーゼIII の存在下でのdUTPの取り込み dUTPにより完全に置換されるTTP を用いたDNA 合成について、Afu エキソヌク
レアーゼ/Taqポリメラーゼ混合物を試験した。TTP またはdUTP取り込みの各々の
比較は、β- グロビン遺伝子を標的として用い、鋳型としての未変性ヒトゲノム
ＤＮＡについて、0.125 μg 、0.25μg 、0.375 μg および0.5 μg の実施例IV
のアーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)エキソヌクレアーゼ
III の存在下において、2.5 単位のTaq DNA ポリメラーゼを用いるPCR で決定さ
れた。以下のプライマーを使用した：フォワード： 5'-TGG TTG AAT TCA TAT ATC TTA GAG GGA GGG C-3' （配列番号：１０）リバース： 5'-TGT GTC TGC AGA AAA CAT CAA GGG TCC CAT A-3' (配列番号：１１）

【００５０】 PCR は、以下のサイクル条件： 1x 2 分, 94℃； 40x 10秒, 94℃； 30 秒, 60℃； 1分, 72℃； 1x 7 分, 72℃；で50μl 容量で行なわれた。

【００５１】 PCR 反応物のアリコートは、アガロースゲルの上で分離された。図７に示され
るように、本鋳型/ プライマー系により、dUTPの存在下におけるDNA 合成は、37
5ng までのAfu エキソヌクレアーゼIII で可能である。 dUTP 取り込みは、環境
温度における30分間、PCR 反応産物のアリコートをウラシルDNA グリコシラーゼ
処理（ROCHE Diagnostics 社（No.1775367））することおよび、続く95℃5 分の
インキュベーションによる、断片の完全な分解に至るポリヌクレオチドのアプリ
ン部位での切断により、さらに証明されうる。アガロースゲル電気泳動による反
応産物の解析は、図８に示される。

【００５２】実施例X ： PCR 産物の長さにおけるAfu エキソヌクレアーゼIII の影響 Taq ポリメラーゼは、ゲノムの鋳型において、3kb 長までのPCR 産物を合成し
うる。より長い産物の合成についてのTaq ポリメラーゼ/Afuエキソヌクレアーゼ
混合物の能力を推定するために、前記酵素混合物をヒトゲノムDNA を鋳型とし、
9.3kb 、12kbおよび15kp長の産物を増幅するようにデザインされた3 対のプライ
マー対を用いて解析した。使用された緩衝液系は、Expand Long Template PCRシ
ステム由来のものであった（Roche Molecular Biochemicals Cat. No 1 681 834
）。反応は、表１も概説される条件で、250ng のヒトゲノムＤＮＡ、220ng の各
プライマー、350 μM のdNTPs ならびに2.5 単位のTaq ポリメラーゼおよび62,5
ngのAfu エキソヌクレアーゼの50μl 容量で行なわれた：

【００５３】

【表１】

【００５４】使用されたtPA 遺伝子の増幅のための特異的なプライマー：プライマー7a フォワード： 5'-GGA AGT ACA GCT CAG AGT TCT GCA GCA CCC CT
G C-3' （配列番号：１２）プライマー14a リバース： 5'-CAA AGT CAT GCG GCC ATC GTT CAG ACA CAC C −
3' （配列番号：１３）プライマー1 フォワード： 5'-CCT TCA CTG TCT GCC TAA CTC CTT CGT GTG TCC
C-3' （配列番号：１４）プライマー2 リバース： 5'-ACT GTG CTT CCT GAC CCA TGG CAG AAG CGC CTT C-
3' （配列番号：１５）プライマー3 リバース： 5'-CCT TCT AGA GTC AAC TCT AGA TGT GGA CTT AGA G
−3' （配列番号：１６）

【００５５】図９に示されるように、Taq ポリメラーゼ/Afuエキソヌクレアーゼ混合物によ
り、少なくとも15kb長の産物を合成することができる。

【００５６】実施例XI 熱安定エキソヌクレアーゼIII は、ポリメラーゼ活性が減少したが、3 ´エキソ
ヌクレアーゼ- 活性が増加したポリメラーゼ変異体によって置換されうる国際公開第97/35988号パンフレットまたはGene（1997）204 （1-2 ）、153-8
においてニーハウス(Niehaus F.)、フレイ(Frey B.) およびアントラニキャン(A
ntranikian G.)に記載された、チロシンがアスパラギンに置換された385 位のア
ミノ酸置換を有するサーモコッカスアグレガンス(Thermococcuss aggregans)(
Tag)由来のDNA ポリメラーゼ（刊行物と欧州特許出願第00105 155.6 号明細書と
してベールケ（Boehlke)らが提出した）は、野生型DNA ポリメラーゼのわずか6.
4%のポリメラーゼ活性であるが、205%のエキソヌクレアーゼ活性を示す。本酵素
が、発明がエキソヌクレアーゼIII 型酵素に限定されるものではなく、3'エキソ
ヌクレアーゼ活性に寄与する他の型の酵素を含むことを証明するために使われた
。

【００５７】反応1-4 に使用されるサイクルプログラム： 1x 94℃, 2 分 10x 94℃, 10秒 62℃, 30秒 68℃, 4 分 20x 94℃, 10秒 62℃, 30秒 68℃, 4 分プラス1 サイクルあたり20秒のサイクル延長 1x 68℃, 7 分反応5-8 ： 1x 94℃, 2 分 10x 94℃, 10秒 65℃, 30秒 68℃, 8 分 20x 94℃, 10秒 65℃, 30秒 68℃, 8 分プラス1 サイクルあたり20秒のサイクル延長 1x 68℃, 7 分

【００５８】 PCR産物を、エチジウムブロマイド含有1%アガロースゲルで解析した（図10）。
データは、Taq ポリメラーゼが4.8kb の断片を増幅できるが、低い収量であるこ
とを示す。Taq ポリメラーゼとTag ポリメラーゼ変異体またはAfu Exo III との
組み合わせは、産物収量の強い増加をもたらす。Tag ポリメラーゼ変異酵素それ
自体では、本産物を合成できない。類似した結果が、9.3kb 系で得られた。Taq ポリメラーゼだけを用いると、産物
が検出できない。Tag ポリメラーゼ変異体またはAfu Exo III との組み合わせに
より、期待されるPCR 産物が、高収率で得られる。

【００５９】これらの結果は、Taq ポリメラーゼが、ゲノムＤＮＡ由来の数kbのＤＮＡ断片
を増幅できず、PCR 増幅の長さの限界がミスマッチ塩基対の取り込みの部位にお
ける低い効率の伸長に起因するバーンズの仮説 (バーンズ(Barnes, W. M.)(1994
) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91：2216-2220)を支持することを示す。プライ
マー末端でのミスマッチヌクレオチドの除去の後、Taq ポリメラーゼは、DNA 合
成を再び行ないうる。全長産物としての完全な核酸鎖は、ついで、つづくサイク
ルにおけるプライマー結合のために鋳型として働きうる。

【００６０】実施例XII Afu Exo III は、直鎖状一本鎖DNA 上で作用しない 270ng のAfu Exo III 、5 μg の49mer オリゴヌクレオチドを含み、MgCl₂を
有するExpand HiFi PCR 緩衝液50μl 容量で、反応を行ない、65℃で0 、1 、2
、3 、4 および5 時間インキュベートした。10μl のプロテイナーゼK 溶液（20
mg/ml ）の添加後、試料を37℃で20分インキュベートした。反応生成物を、エチ
ジウムブロミド含有3.5%アガロースゲル上で解析した。

【００６１】結果を、図11に示す。全てのレーンにおいて、核酸が、同じサイズを有するこ
とがわかる。Afu Exo III とともに5 時間までインキュベーション後に得られた
産物（レーン6 ）は、対照（レーン1 、7 および8 ）と同じサイズを有する。全
長オリゴヌクレオチドまたは分解産物由来のスミアのいずれの強度の有意な減少
も、観察できない。

【００６２】実施例XIII プライマー分解活性での熱安定B-型ポリメラーゼによるAfu エキソヌクレアーゼ
III の比較熱安定B-型ポリメラーゼが一本鎖および二本鎖ヌクレアーゼ活性 (コング (Ko
ng H.)ら、(1993) Journal Biol. Chem. 268：1965-1975 ）を有することが報告
される。この活性は、鋳型または一本鎖にハイブリダイズするかどうかかかわら
ないプライマー分子を分解することができる。反応混合物における熱安定B-型ポ
リメラーゼの熱安定エキソヌクレアーゼへの置換は、反応混合物における一本鎖
プライマーまたは存在する他の核酸の安定に関して有利であるかもしれない。

【００６３】プライマー分解活性を試験するために、鋳型ＤＮＡのない反応混合物を72℃で
1 時間インキュベートし、ついで、DNA を添加し、PCR を行なった。結果を、熱
安定B-型ポリメラーゼ (アンゲラー（Angerer B.) ら、国際公開第98/14590パン
フレット）の例としてTgo ポリメラーゼ含有反応物と比較した。対照として、同
じ混合物を、インキュベーション前以外に使用した。結果を、表2 にまとめる。

【００６４】

【表２】

【００６５】増幅のための標的として、p53 遺伝子の断片を選び、プライマー： p53I 5 '-
GTC CCA AGC AAT GGA TGA T-3 ' （配列番号： 18 ）およびp53II 5'-TGG AAA C
TT TCC ACT TGA T-3 '（配列番号： 19 ）を使用した。PCR 反応を、50μl の容
量で行なった。反応番号 1〜10は、200ng のヒトゲノムDNA 、40pmole の各プライマー、10mM T
ris-HCl 、pH 8.5、17.5mM（NH₄)₂SO₄、1.25mM MgCl₂、0.5% Tween、2.5% DMSO
、250 μg/ml BSAおよび1 単位のTgo ポリメラーゼ（反応番号1 、3 、5 、7 お
よび9 ）または1.5 単位のTgo ポリメラーゼ（反応番号2 、4 、6 、8 および10
）および200 μM dNTPs を含んだ。反応番号11〜16は、2.5 単位Taq ポリメラーゼ、Mg⁺⁺を含むExpand HiFi 緩衝液
、40pmole のプライマー、200 μM dNTPs 、100ng ヒトゲノムDNA を含んだ。反
応番号12および15は、37.5ngのAfu Exo III を含み、反応番号13および16は、75
ngのAfu Exo III を含んだ。

【００６６】表2 に記載されるように、反応1 、2 、5 、6 および11〜13を、鋳型ＤＮＡの
非存在下に、72℃で1 時間インキュベートした。PCR を開始する前に、鋳型ＤＮ
Ａを添加した。反応5 、6 、9 および10を、ヌクレオチドの非存在下にプレイン
キュベートし、反応9 および10に、プレインキュベーションステップ後、さらに
40pmole のプライマーを補った。Taq ポリメラーゼの5'- エキソヌクレアーゼ活
性のため、プレインキュベーション後、酵素を反応11〜13に添加した。

【００６７】 PCR 条件： 1x 94℃, 2 分 35x 94℃, 10秒 55℃, 30秒 72℃, 4 分 1x 72℃, 10分

【００６８】反応生成物を、アガロースゲル上で解析し、エチジウムブロマイドで染色した
（図12）。

【００６９】鋳型ＤＮＡの非存在下に、Tgo ポリメラーゼを、プライマーとともにインキュ
ベート (反応1 、2 、5 および6)し、プレインキュベーションなしの対応の反応
(3、4 、7 および8)と比較した場合、明らかな違いが観察された。プレインキュ
ベーションは、少なくとも1 つの必須成分、恐らく、PCR プライマーに明らかに
影響を及ぼす強く減少したPCR 産物をもたらす。プレインキュベーションステッ
プ後の40pmole のPCR プライマーの特別な添加（反応9 および10）は、プレイン
キュベートされなかった対照反応に匹敵する強度で、強いシグナルをもたらす。
これは、dNTPs が存在するかどうかに関係なく、熱安定B-型ポリメラーゼである
Tgo ポリメラーゼが、鋳型の非存在下に、PCR プライマーを分解することを示す
。

【００７０】鋳型ＤＮＡおよびTaq ポリメラーゼの添加前に、Afu エキソヌクレアーゼIII
とともに、プライマーがプレインキュベートされた反応12および13で得られたPC
R 産物は、プレインキュベーションステップを用いない反応15および16で得られ
たものと同様のバンドを与えた。類似した強いバンド強度から、プライマーの分
解がほとんど生じないか、あるいは全く生じず、一本鎖オリゴヌクレオチドがAf
u エキソヌクレアーゼIII のための不十分な基質であると結論されるうる。PCR
産物の強いバンド強度または収量の増加から、酵素が増幅プロセスにおける忠実
度を促進すると結論されうる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１：アーケオグロブス・フルギダスのエキソヌクレアーゼＩＩＩに由来するＤＮＡ
ポリメラーゼをコードする遺伝子のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列。

【図２】図２：実施例Ｖに記載される大腸菌において発現されるアーケオグロブス・フルギダ
スの組換えエキソヌクレアーゼＩＩＩの熱変性に対する耐性。レーン１：５０℃でのインキュベーションレーン２：６０℃でのインキュベーションレーン３：７０℃でのインキュベーションレーン４：８０℃でのインキュベーションレーン５：９０℃でのインキュベーションレーン６：ＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩをコードする遺伝子で形質転換さ
れていない大腸菌宿主細胞抽出物レーン７：大腸菌のエキソヌクレアーゼレーン８：分子量マーカー

【図３】図３：実施例ＶＩに記載されるＤＮＡフラグメントにおけるＡｆｕエキソヌクレアー
ゼＩＩＩのエキソヌクレアーゼ活性。レーン１：１０ユニットの大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩ、３７℃でのイン
キュベーションレーン２：５０ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュ
ベーションレーン３：１００ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキ
ュベーションレーン４：１５０ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキ
ュベーションレーン５：１００ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキ
ュベーションレーン６：２００ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキ
ュベーションレーン７：３００ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキ
ュベーションレーン８：２５０ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキ
ュベーションレーン９：７５０ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキ
ュベーションレーン１０：１μｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュ
ベーションレーン１１：５００ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのイン
キュベーションレーン１２：１μｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュ
ベーションレーン１３：１．５μｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのイン
キュベーションレーン１４：１．５μｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのイン
キュベーションレーン１５：３μｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのインキュ
ベーションレーン１６：４．５μｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのイン
キュベーションレーン１７：７．６μｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのイン
キュベーションレーン１８：１５．２μｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのイ
ンキュベーションレーン１９：２２．８μｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、７２℃でのイ
ンキュベーションレーン２０：エキソヌクレアーゼ添加せず

【図４】図４：ミスマッチ補正アッセイの原理。

【図５】図５：実施例ＶＩＩに記載のＰＣＲにおけるミスマッチしたプライマー補正。レーン１：ＤＮＡ分子量マーカーＶ（ロシェモルキュラーバイオケミカルズ（ＲＯＣＨＥＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）Ｎｏ．８２１
０５）レーン２：Ｇ：Ａミスマッチしたプライマー、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼでの
増幅レーン３：レーン２と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断したレーン４：Ｇ：Ａミスマッチしたプライマー、エキスパンドＨｉＦｉＰＣＲシ
ステムでの増幅レーン５：レーン４と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断したレーン６：Ｇ：Ａミスマッチしたプライマー、Ｔａｑポリメラーゼ／Ａｆｕエ
キソヌクレアーゼＩＩＩでの増幅レーン７：レーン６と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断したレーン８：Ｇ：Ａミスマッチしたプライマー、ＴｇｏＤＮＡポリメラーゼで増
幅レーン９：レーン８と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断したレーン１０：Ｇ：Ｔミスマッチしたプライマー、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼで
増幅レーン１１：レーン１０と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断したレーン１２：Ｇ：Ｔミスマッチしたプライマー、エキスパンドＨｉＦｉＰＣＲ
システムでの増幅レーン１３：レーン１２と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断したレーン１４：Ｇ：Ｔミスマッチしたプライマー、Ｔａｑポリメラーゼ／Ａｆｕ
エキソヌクレアーゼＩＩＩでの増幅レーン１５：レーン１４と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断したレーン１６：Ｇ：Ｔミスマッチしたプライマー、ＴｇｏＤＮＡポリメラーゼで
の増幅レーン１７：レーン１６と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断したレーン１８：ＤＮＡ分子量マーカーＶレーン１９：ＤＮＡ分子量マーカーＶレーン２０：Ｇ：Ｃミスマッチしたプライマー、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼで
の増幅レーン２１：レーン２０と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断したレーン２２：Ｇ：Ｃミスマッチしたプライマー、エキスパンドＨｉＦｉＰＣＲ
システムでの増幅レーン２３：レーン２２と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断したレーン２４：Ｇ：Ｃミスマッチしたプライマー、Ｔａｑポリメラーゼ／Ａｆｕ
エキソヌクレアーゼＩＩＩでの増幅レーン２５：レーン２４と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断したレーン２６：Ｇ：Ｃミスマッチしたプライマー、ＴｇｏＤＮＡポリメラーゼで
の増幅レーン２７：レーン２６と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断したレーン２８：ＣＧ：ＡＴミスマッチしたプライマー、ＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼレーン２９：レーン２８と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断したレーン３０：ＣＧ：ＡＴミスマッチしたプライマー、エキスパンドＨｉＦｉＰ
ＣＲシステムレーン３１：レーン２と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断したレーン３２：ＣＧ：ＡＴミスマッチしたプライマー、Ｔａｑポリメラーゼ／Ａ
ｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩレーン３３：レーン２と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断したレーン３４：ＣＧ：ＡＴミスマッチしたプライマー、ＴｇｏＤＮＡポリメラー
ゼでの増幅レーン３５：レーン２と同一であるが、続いてＢｓｉＥＩで切断したレーン３６：ＤＮＡ分子量マーカーＶ

【図６Ａ】図６Ａ：ＰＣＲにおける種々のポリメラーゼのエラー比率。

【図６Ｂ】図６Ｂ：実施例ＶＩＩＩに記載のＰＣＲ混合物中に存在するＡｆｕエキソヌクレアーゼ
ＩＩＩによる忠実度の改善。青色：白色コロニーの比率を、ブロットし、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび
ＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩの種々の混合物（１２５ｎｇ、１７５ｎｇ、２
５０ｎｇ、３７５ｎｇおよび５００ｎｇのＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ、そ
れぞれと混合した２．５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼに相当する、Ｔａ
ｑ／Ｅｘｏ１：３０、Ｔａｑ／Ｅｘｏ１：２０、Ｔａｑ／Ｅｘｏ１：１５、Ｔａ
ｑ／Ｅｘｏ１：１２，５、Ｔａｑ／Ｅｘｏ１：１０）を、ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼ（Ｔａｑ）、エキスパンドＨｉＦｉＰＣＲシステム（ＨｉＦｉ）およびＰｗ
ｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｗｏ）と比較して試験した。

【図７】図７：実施例ＩＸに記載されたＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／Ａｆｕエキソヌクレア
ーゼＩＩＩ混合物によるｄＵＴＰの取り込み。レーン１：ＤＮＡ分子量マーカーＸＩＶ（ロシュモレキュラーバイオケミ
カルズＮｏ．１７２１９３３）レーン２：２．５ユニットＴａｑＤＮＡポリメラーゼでの増幅レーン３：２．５ユニットＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび１２５ｎｇのＡ
ｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩでの増幅レーン４：２．５ユニットＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび２５０ｎｇのＡ
ｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩでの増幅レーン５：２．５ユニットＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび３７５ｎｇのＡ
ｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩでの増幅レーン６：２．５ユニットＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび５００ｎｇのＡ
ｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩでの増幅

【図８】図８：実施例ＩＸに記載されたウラシルＤＮＡグリコシラーゼによるＰＣＲ産物を含
むｄＵＴＰの分解。レーン１：ＤＮＡ分子量マーカーＸＩＶ（ロシュモレキュラーバイオケミ
カルズＮｏ．１７２１９３３）レーン２：ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび１２５ｎｇのＡｆｕエキソヌク
レアーゼＩＩＩで得られた１μｌの増幅産物ならびにその後ＵＮＧおよび熱処理
。レーン３：ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび１２５ｎｇのＡｆｕエキソヌク
レアーゼＩＩＩで得られた２μｌの増幅産物ならびにその後ＵＮＧおよび熱処理
。レーン４：ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび１２５ｎｇのＡｆｕエキソヌク
レアーゼＩＩＩで得られた３μｌの増幅産物ならびにその後ＵＮＧおよび熱処理
。レーン５：ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび１２５ｎｇのＡｆｕエキソヌク
レアーゼＩＩＩで得られた４μｌの増幅産物ならびにその後ＵＮＧおよび熱処理
。レーン６：ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび１２５ｎｇのＡｆｕエキソヌク
レアーゼＩＩＩで得られた５μｌの増幅産物ならびにその後ＵＮＧおよび熱処理
。レーン７：ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび１２５ｎｇのＡｆｕエキソヌク
レアーゼＩＩＩで得られた５μｌの増幅産物、その後ＵＮＧなし熱処理なし。レーン８：ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび１２５ｎｇのＡｆｕエキソヌク
レアーゼＩＩＩで得られた５μｌの増幅産物、その後ＵＮＧなし熱処理あり。レーン９：ＤＮＡ分子量マーカーＸＩＶ（ロシュモレキュラーバイオケミ
カルズＮｏ．１７２１９３３）

【図９】図９：ＰＣＲ産物の長さに対するＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩの効果。実施例Ｘ
に記載されるようにヒトゲノムＤＮＡに関してＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／Ａ
ｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩ混合物を解析した。レーン１：Ｔａｑ／ＥｘｏＩＩＩ混合物と９，３ｋｂｔＰＡフラグメントレーン２：Ｔａｑ−Ｐｏｌ．と９，３ｋｂｔＰＡフラグメントレーン３：Ｔａｑ／ＥｘｏＩＩＩ混合物と１２ｋｂｔＰＡフラグメントレーン４：Ｔａｑ−Ｐｏｌ．と１２ｋｂｔＰＡフラグメントレーン５：Ｔａｑ／ＥｘｏＩＩＩ混合物と１５ｋｂｔＰＡフラグメントレーン６：Ｔａｑ−Ｐｏｌ．と１５ｋｂｔＰＡフラグメント

【図１０】図１０：実施例ＸＩに記載されるように、減少したポリメラーゼ活性を有するが、増大
した３’−エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ変異体により、熱安定
エキソヌクレアーゼＩＩＩを置換できる。レーン１：分子量マーカーレーン２：反応１、Ｔａｑポリメラーゼ、４．８ｋｂフラグメントレーン３：反応２、Ｔａｑポリメラーゼ＋Ｔａｇポリメラーゼ変異体、４．８
ｋｂフラグメントレーン４：反応３、Ｔａｑポリメラーゼなし、Ｔａｇポリメラーゼ変異体、４
．８ｋｂフラグメントレーン５：反応４、Ｔａｑポリメラーゼ＋ＡｆｕＥｘｏＩＩＩ、４．８ｋｂ
フラグメントレーン６：反応５、Ｔａｑポリメラーゼ、９．３ｋｂフラグメントレーン７：反応６、Ｔａｑポリメラーゼ＋Ｔａｇポリメラーゼ変異体、９．３
ｋｂフラグメントレーン８：反応７、Ｔａｑポリメラーゼなし、Ｔａｇポリメラーゼ変異体、９
．３ｋｂフラグメントレーン９：反応８、Ｔａｑポリメラーゼ＋ＡｆｕＥｘｏＩＩＩ、９．３ｋｂ
フラグメントレーン１０：分子量マーカー

【図１１】図１１：実施例ＸＩＩに記載されるように、ＡｆｕエキソヌクレアーゼＩＩＩは線状一
本鎖ＤＮＡ上では活性でない。レーン１：ＡｆｕＥｘｏＩＩＩ、インキュベーョンなしレーン２：ＡｆｕＥｘｏＩＩＩ、６５℃で１時間レーン３：ＡｆｕＥｘｏＩＩＩ、６５℃で２時間レーン４：ＡｆｕＥｘｏＩＩＩ、６５℃で３時間レーン５：ＡｆｕＥｘｏＩＩＩ、６５℃で４時間レーン６：：ＡｆｕＥｘｏＩＩＩ、６５℃で５時間レーン７：酵素なしの反応緩衝液、インキュベーションなしレーン８：酵素なしの反応緩衝液、６５℃で５時間レーン９：分子量マーカー

【図１２】図１２：実施例ＸＩＩＩに記載されるプライマー分解活性でのＡｆｕエキソヌクレアー
ゼＩＩＩの熱安定Ｂ型ポリメラーゼとの比較。レーン１：分子量マーカーレーン２：１ｕＴｇｏプレインキュベート（反応１）レーン３：１．５ｕＴｇｏ、プレインキュベート（反応２）レーン４：１ｕＴｇｏ、プレインキュベートなし（反応３）レーン５：１．５ｕＴｇｏ、プレインキュベートなし（反応４）レーン６：１ｕＴｇｏ、ｄＮＴＰｓ非存在下でプレインキュベート（反応５
）レーン７：１．５ｕＴｇｏ、ｄＮＴＰｓ非存在下でプレインキュベート（反
応６）レーン８：１ｕＴｇｏ、ｄＮＴＰｓ非存在下でプレインキュベートなし（反
応７）レーン９：１．５ｕＴｇｏ、ｄＮＴＰｓ非存在下でプレインキュベートなし
（反応８）レーン１０：１ｕＴｇｏ、ｄＮＴＰｓ非存在下で、追加のプライマーを補足
してプレインキュベート（反応９）レーン１１：１．５ｕＴｇｏ、ｄＮＴＰｓ非存在下で、追加のプライマーを
補足してプレインキュベート（反応１０）レーン１２：Ｔａｑポリメラーゼ、プレインキュベート（反応１１）レーン１３：Ｔａｑ＋３７，５ｎｇＡｆｕＥｘｏＩＩＩ、プレインキュ
ベート（反応１２）レーン１４：Ｔａｑ＋７５ｎｇＡｆｕＥｘｏＩＩＩ、プレインキュベー
ト（反応１３）レーン１５：Ｔａｑポリメラーゼ、プレインキュベートなし（反応１４）レーン１６：Ｔａｑ＋３７，５ｎｇＡｆｕＥｘｏＩＩＩ、プレインキュ
ベートなし（反応１５）レーン１７：Ｔａｑ＋７５ｎｇＡｆｕＥｘｏＩＩＩ、プレインキュベー
トなし（反応１６）レーン１８：分子量マーカー

【手続補正書】

【提出日】平成１３年８月３１日（２００１．８．３１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ソーベク，ハラルトドイツ連邦共和国ペンツベルク 82377 ビルケンシュトラーセ 29 (72)発明者グライフ，ミヒァエルドイツ連邦共和国レンギリース 83661 フレック 28 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA11 CA01 HA08 4B050 CC01 DD02 LL03 LL10 4B064 AF27 CA21 CB04 CC06 CC24 DA13 DA20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリメラーゼ活性を示す第２の酵素に添加された場合に増幅
プロセスの忠実度を増大する、３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的
にＤＮＡポリメラーゼ活性を示さない熱安定酵素。
【請求項２】アーケオグロブス・フルギダスから得られうる請求項１記載
の熱安定酵素。
【請求項３】プルーフリーディング酵素としてポリメラーゼ活性を示す第
２の酵素と協力しうる、請求項１または２記載の熱安定酵素。
【請求項４】ＤＮＡポリメラーゼ活性の減少を示す、請求項１、２または
３記載の熱安定酵素。
【請求項５】３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にＤＮＡポ
リメラーゼ活性を示さない第１の熱安定酵素およびＤＮＡポリメラーゼ活性を示
す第２の酵素を含有してなる組成物であって、第２の酵素単独の使用と比較して
該組成物の使用により増幅プロセスの忠実度が増大される、組成物。
【請求項６】第２の酵素がプルーフリーディング活性を欠失している、請
求項５記載の組成物。
【請求項７】第２の酵素がＴａｑポリメラーゼである、請求項５または６
記載の組成物。
【請求項８】請求項６または７記載の組成物を用いるＤＮＡの調製または
増幅する方法。
【請求項９】成熟前に終結した鎖が、３’から５’への分解によりトリミ
ングされる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】プライマーまたは伸長する鎖のミスマッチした末端が除去
される、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】ＴＴＰのかわりにｄＵＴＰが反応混合物中に存在する、請
求項８〜１０いずれかに記載の方法。
【請求項１２】ＵＮＧが、混入核酸の分解に使用される、請求項１１記載
の方法。
【請求項１３】 − ３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にＤ
ＮＡポリメラーゼ活性を示さない第１の熱安定酵素と − ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す第２の酵素との混合物が、３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にＤＮＡポリメラ
ーゼ活性を示さない第１の熱安定酵素の非存在下で、ＤＮＡポリメラーゼ活性を
示す第２の酵素により産生されるＰＣＲ産物と比較してより低いエラー率を有す
るＰＣＲ産物を産生する、請求項８〜１２いずれかに記載の方法。
【請求項１４】３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にＤＮＡ
ポリメラーゼ活性を示さない第１の熱安定酵素とＤＮＡポリメラーゼ活性を示す
第２の酵素との混合物が、３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にＤ
ＮＡポリメラーゼ活性を示さない第１の熱安定酵素の非存在下で、ＤＮＡポリメ
ラーゼ活性を示す第２の酵素により産生されるＰＣＲ産物と比較してより長いＰ
ＣＲ産物を産生する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】３’−エキソヌクレアーゼ活性を示すが、本質的にＤＮＡ
ポリメラーゼ活性を示さない第１の熱安定酵素が、大腸菌に由来するエキソヌク
レアーゼＩＩＩに関連するが、熱安定である、請求項８〜１４いずれかに記載の
方法。
【請求項１６】平滑末端を有するＰＣＲ産物が得られる、請求項８〜１５
いずれかに記載の方法。
【請求項１７】直鎖状の一本鎖ＤＮＡに対して活性を有さないか、無視で
きる程度の活性のみを有する、３’−エキソヌクレアーゼ活性を示す熱安定酵素
を用いるＤＮＡの増幅方法。
【請求項１８】請求項１〜４いずれかに記載の酵素が使用される請求項１
７記載の方法。