JPH11501801A

JPH11501801A - 耐熱性が向上し、かつ、プライマーエクステンションの長さと効率が向上したｄｎａポリメラーゼ

Info

Publication number: JPH11501801A
Application number: JP6522506A
Authority: JP
Inventors: ウエインエムバーンズ，
Original assignee: 寳酒造株式会社
Priority date: 1993-02-19
Filing date: 1994-02-22
Publication date: 1999-02-16
Anticipated expiration: 2014-04-19
Also published as: EP0693078A1; EP0693078A4; WO1994026766A1; JP3404716B2; AU6246494A; US5436149A; DE69419248D1; JP2885324B2; DK0693078T3; JPH11239492A; ES2136730T3; AU671204B2; EP0693078B1; ATE181573T1; NZ262663A; DE69419248T2

Abstract

(57)【要約】ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端２８０アミノ酸残基、または、ＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端２７９アミノ酸残基を除いて、実質的にＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓまたはＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメラーゼと同じアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼと、上記ＤＮＡポリメラーゼをコード化する組換えＤＮＡ配列と、上記ＤＮＡ配列からなるベクターとこのようなベクターを含む宿主細胞。また、少なくとも１つの耐熱性又はその他の上記型のＤＮＡポリメラーゼであって３’−エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼからなる主成分と、３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈する少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼからなる少量成分とからなる耐熱性またはその他のＤＮＡポリメラーゼの配合と、限定はされないが、特に、この配合がなされプライマーエクステンションを触媒するのに使用されるポリメラーゼ連鎖反応によって核酸配列を増幅する間にＤＮＡ鎖の酵素伸長を行うための改善された方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】耐熱性が向上し、かつ、プライマーエクステンションの長さと効率が向上したＤＮＡポリメラーゼこの発明は、ＤＮＡポリメラーゼに、より詳細には、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ及びＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメラーゼの新規の突然変異であって現在知られるあらゆる形のこれらの酵素よりも向上した耐熱性（熱安定性）を呈するものに関するものである。また、この発明は、このようなＤＮＡポリメラーゼをコード化する組換えＤＮＡ配列と、これら組換えＤＮＡ配列の発現に適したベクタープラスミド及び宿主細胞とに関するものである。さらに、この発明は、本願発明のＤＮＡポリメラーゼ及び他のＤＮＡポリメラーゼの新規の配合（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）に関するものである。この酵素配合は、非常に長くかつ信頼性の高い生成物のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による増幅に対して効果的に触媒作用を及ぼすことが出来る。温泉細菌のＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓから得られるＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）は、耐熱性であるため、ＤＮＡの増幅、ＤＮＡ配列決定及び関連するＤＮＡプライマーエクステンション技術において、かなり有用であることが立証されている。ここで、耐熱性であるとは、不可逆的に変性せずに長時間９５℃に達する温度に耐えうる能力、及びＤＮＡを高温（６０〜７５℃）で重合（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅ）する能力を備えていることと定義する。ローヤー（Ｌａｗｙｅｒ）氏他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６４２７（１９８９年）に記載された、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ０４６３９の、ＤＮＡ及びアミノ酸配列は、遺伝子コード化ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ及び酵素ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼを、本願でそれらの用語を使用しているように定義している。これと密接に関連する細菌Ｔｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓにより発現する、非常によく似たＤＮＡポリメラーゼ（ＴｆｌＤＮＡポリメラーゼ）は、アクメチヤノフ（Ａｋｈｍｅｔｚｊａｎｏｖ，Ａ．Ａ．）氏及びヴァクヒトフ（Ｖａｋｈｉｔｏｖ，Ｖ．Ａ．）氏、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２０：５８３９（１９９２年）に記載された、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ６６１０５の、ＤＮＡ及びアミノ酸配列により定義されている。これらの酵素も、耐熱性である、ＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼをも含む１種のＤＮＡポリメラーゼ族を表している。これらの酵素には、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、及びファージＴ７、Ｔ３、及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡポリメラーゼにおける校正（ｅｄｉｔｔｉｎｇ）を行う目的に対して有効であるような３’−エキソヌクレアーゼ活性が欠けている。ゲルファンド（Ｇｅｌｆａｎｄ）氏他による米国特許第４８８９８１８号には、野生型（ここではＷＴの略号を用いる）の自然のＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼが記載されている。ゲルファンド氏他による米国特許第５０７９３５２号には、ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端２８９アミノ酸が消去されたＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼの突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）をコード化する組換えＤＮＡ配列（米国特許第５０７９３５２号のクレーム３、商品名ＳｔｏｆｆｅｌＦｒａｇｍｅｎｔ、ここではＳＴの略号を用いる）と、ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端３アミノ酸が消去されたＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼの突然変異タンパク質をコード化する組換えＤＮＡ配列（米国特許第５０７９３５２号のクレーム４、商標名ＡｍｐｌｉＴａｑ、ここではＡＴの略号を用いる）とが記載されている。これらの突然変異タンパク質はＤＮＡポリメラーゼの検定において「十分に活性」であることがゲルファンド氏他により報告されているが、その最大耐熱性に関するデータは示されていない。しかし、ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼの他の酵素活性の突然変異タンパク質誘導体の開発については、何らかの特殊な修飾がこのタンパク質の構造的及び機能的特性に対して及ぼす影響を予測できないため進んでいない。発現を行うためにＤＮＡ及び酵素を修飾する場合には、折り畳みパタン（ｆｏｌｄｉｎｇｐａｔｔｅｒｎ）及び臨界結合（ｃｒｉｔｉｃａｌｂｏｎｄｉｎｇ）の起こりうる分裂（ｐｏｔｅｎｔｉａｌｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）を含む多くの因子を考慮しなくてはならない。高温ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端欠失突然変異タンパク質の発生に関する重大な問題として、高温度範囲において新しいタンパク質のアミノ末端が著しく不秩序となり、そのためにタンパク質の（１又は複数の）触媒領域との好ましくない相互作用が生じて変性が起こるという予測がある。実際、ＤＮＡポリメラーゼの識別可能領域が損なわれずに残っていると思われる幾つかの欠失体（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）が構成されたが、これらの欠失体はいずれも９９℃もの高温度における耐熱性を持たない。ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼは、他のＤＮＡポリメラーゼが呈するよりもずっと高い温度での顕著な耐熱性を示すが、９５〜９７℃よりも高い温度にさらされると酵素活性を失う。更に、その７２℃（ＤＮＡ合成を行うに好ましい温度）における忠実度（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）は、約１／９０００ｂｐの有効エラー率に限定される。ゲルファンド氏他のＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼの突然変異タンパク質ＳＴ（Ｎ−末端２８９ａ．ａ．欠失を有するもの）はＡＴよりもずっと安定であるが、ＰＣＲサイクルの変性段階期間中に、９８℃にサイクルするとＳＴが呈する活性は非常に低下し、９９℃にサイクルすると活性があったとしてもさらに小さなものとなる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡスパンの増幅は、触媒用に耐熱性ＴａｑＤＮＡポリメラーゼが導入されて以来遺伝分析の重要な手法として普及した。ＰＣＲの先行技術の方法には、最終生成物の忠実度と増幅することができる生成物スパンのサイズという２つの制限要素がある。忠実度の問題は、突然変異／ｂｐ／サイクルを約１０^-4から約１０^-5に減少させることが明らかである一体型（ｉｎｔｅｇｒａｌ）３’−（校正）エキソヌクレアーゼを与えるＰｆｕ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼをＴａｑＤＮＡポリメラーゼの代わりに使うことによって部分的に処理されている。しかし、実験によれば、この酵素は、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８（Ｋｌｅｎｔａｑ１としても知られている）（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端欠失体、ＷＭＢ未公開）又はＡｍｐｌｉＴａｑ（無欠損（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、参考文献３）が容易に増幅できる１．５〜２ｋｂのサイズの範囲の所定のＤＮＡ配列を増幅することができず、また、Ｐｆｕは、あらゆる形体のＴａｑＤＮＡポリメラーゼと同様にしか５〜７ｋｂを超えるＤＮＡ生成物スパンを増幅することが出来ない（即ち増幅不可能である）ということが分かっている。無欠損ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ及びＮ−末端切断変異体Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８、Ｋｌｅｎｔａｑ５及びＳｔｏｆｆｅｌＦｒａｇｍｅｎｔについて、標的のスパンの長さが５〜６ｋｂを超えると、ＰＣＲ増幅が急速に効果を失ったり、存在しなくなったりすることが明らかである。このことは、各サイクルの伸長（エクステンション）ステップ期間に３０分が費やされても起こった。非能率的ではあるが検出可能である、９〜１０ｋｂの標的の長さでの増幅及び１５ｋｂのものでの増幅の報告が幾つかあるが、殆どの一般利用は５ｋｂのものに限定されている。カインツェ（Ｋａｉｎｚｅ）氏他（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍ．２０２：４６−４９（１９９２年））によれば、未公開の生物源の酵素（「ＨｏｔＴｕｂ」ＤＮＡポリメラーゼとして市販されている）を利用した、１０ｋｂよりも大きい、即ち、１０．９ｋｂ及び１５．６ｋｂの生成物のＰＣＲ増幅が報告されている。カインツェ氏他は、反応容量１００ｕｌにつき１ｎｇのλＤＮＡ鋳型で開始して３０サイクル後、１５．６ｋｂにかろうじて見えるバンドを得たことを報告している。この増幅効率の量的な計算は示されていないが、増幅効率は比較的低かったことが示されている。カインツェ氏他によるＷＴＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼを１０〜１５ｋｂのサイズ範囲で機能させるという試みは成功ではなかったし、他の誰かによってもこのサイズ範囲のＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのいずれかの形体に関する成功の結果は報告されていない。ＰＣＲにより増幅可能な長いＤＮＡ生成物についての報告は全く無いのである。９８°又は９９℃での耐熱性を保持するＤＮＡポリメラーゼが存在すれば、「コロニーＰＣＲ」（図５参照）を含む幾つかの状況においてより効率的で便利なＤＮＡ分析を行うことが出来、及び／又は、酵素活性の不活化なしに熱サイクラー（ｃｙｃｌｅｒ）のオーバーシュートを許容することが出来るであろう。合成に最適な温度に於けるＡＴ又はＷＴＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼに対する忠実度を向上させた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡポリメラーゼ配合は、標的及び生成物のＤＮＡが単に検出されるのではなくこれを発現させる使用分野において非常に望ましいものである。６ｋｂを超えたＤＮＡスパンの効率的な増幅を行うことが出来るＤＮＡポリメラーゼ配合は、ＰＣＲの使用分野の範囲を大きく広げるものとなろう。例えば、全プラスミド及び全プラスミドのサイズの構成体は、問題とするＤＮＡの一部がＥ．ｃｏｌｉに導入されるとき毒性であったり、プラスミド複製と両立しない場合に特に有用なこの方法で調製することができる。同時にこの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの調製によってＰＣＲ増幅に対して忠実度が増加するならば、その結果得られる大きな生成物は非常に正確、活性であり、及び／または研究および種々の利用において、特に、増幅された配列の発現に関する状況において有用なものとなろう。さらに、この耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの調製によって非常に高い濃度の収率の純生成物が得られるならば、このことによって、ＰＣＲの方法を、所望のＤＮＡフラグメントを大量に生成する手法として、プラスミド複製に換えてより効率的に使用するところまで向上させることが出来るであろう。発明の概要そのため、この発明の幾つかの目的のうち、有意味的に９９℃の温度に繰り返しさらしても耐えることが出来るＤＮＡポリメラーゼを提供すること、標準的なＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ伸長反応温度において利用する際にＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼよりも高い忠実度を呈する高耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを提供すること、ＤＮＡ鋳型からの及びＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉ一本鎖（線形）増幅の単コロニーからのＰＣＲ増幅技術、核酸の配列決定、ＤＮＡ制限消化フィリング（ｄｉｇｅｓｔｆｉｌｌｉｎｇ）、ＤＮＡの標識化、ｉｎｖｉｖｏフットプリント法（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔｉｎｇ）、及びプライマー指向性（ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発に有用であるようなＤＮＡポリメラーゼの提供について述べる。この発明のさらに別の目的には、上記ＤＮＡポリメラーゼの発現用の組換えＤＮＡ配列、ベクター及び宿主細胞の提供がある。さらなる目的としては、フレキシビリティ、特異性及び効率性をあまり犠牲にすることなく、特に先行技術のＤＮＡポリメラーゼに比べて、かつ、いかなる標的の長さについてもＰＣＲプロセスにより生じる突然変異原性を減少させ、ＰＣＲの標的フラグメントの収率をできるだけ高くすると同時にＰＣＲ生成物バンドの強度と鮮鋭度を高める、少なくとも３５キロベースまでの長さを含む、従来の配合で可能なものよりも長い長さをもつプライマーエクステンション生成物に効率的に触媒作用を及ぼすことができるＤＮＡポリメラーゼの配合の提供と、より長い長さの核酸配列を信頼性を持って合成するために利用され、かつ、プライマーとしてＰＣＲ生成物を効果的に利用することが出来るＰＣＲによる増幅のための改良型プロセスの提供がある。従って、簡単に言えば、本願発明は、ＷＴＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓのＮ−末端２８０アミノ酸残基あるいはＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端２７９アミノ酸を除いて、実質的にＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ又はＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメラーゼと同じアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼをコード化する新規の組換えＤＮＡ配列に関するものである。さらに言えば、この発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ又はＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と実質的に同じであるが、ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端２８０アミノ酸残基あるいはＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ −末端２７９アミノ酸が欠けたものからなるアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼに関するものである。さらに実施例において、本願発明は、３’−エキソヌクレアーゼ活性を持たない少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼからなる主成分と、３’−（校正）エキソヌクレアーゼ活性を呈する少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼからなる少量成分とを含む耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの新規の配合に関係している。また、本願発明は、野生型形体において３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈しかつ温度サイクル型ポリメラーゼ連鎖反応に触媒作用を及ぼすことが出来る少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡポリメラーゼの配合であって、この少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼの３’−エキソヌクレアーゼ活性が、その野生型形体における少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼの３’−エキソヌクレアーゼ活性の約０．２％〜７％の範囲にまで低減された配合に関するものである。別の点では、Ｅ１及びＥ２からなるＤＮＡポリメラーゼの配合が提供されている。Ｅ１は有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を全く持たない１つ又はそれ以上のＤＮＡポリメラーゼであり、Ｅ２は有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈する１つ又はそれ以上のＤＮＡポリメラーゼである。この与えられた混合物については、Ｅ１のＥ２に対する相対ＤＮＡポリメラーゼ単位比が少なくとも約４：１である。さらに、この発明は、上記した型のＤＮＡポリメラーゼを配合することを含む、ＰＣＲによる核酸配列の増幅を行うためのプロセスにおける改良に関するものである。これにより生じた配合は、ＰＣＲプロセス中のプライマーエクステンションに触媒作用を及ぼすために使用されるものであり、従って、効率的なＰＣＲ増幅に使用できるサイズの範囲を拡大するものである。本願で検討されているようなＤＮＡポリメラーゼは、通常、５’−エキソヌクレアーゼ、３’−エキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端からＣ−末端までの物理的順序において、酵素活性の３つまでの識別可能及び分離可能領域から構成される。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、３’−エキソヌクレアーゼを全く有していなかったものであるが、この発明の最初の部分は、その５’−エキソヌクレアーゼの欠失に関するものである。ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ等の他の上記したＤＮＡポリメラーゼは、５’−エキソヌクレアーゼを有していないが、それらの３’−エキソヌクレアーゼ機能は、ＤＮＡポリメラーゼＥ１（有意味的な３’−エキソヌクレアーゼを持たないもの）及びＥ２（３’−エキソヌクレアーゼを有するもの）の混合物に関するこの発明の特徴について中核をなすものである。５’−エキソヌクレアーゼの存在がこれらの混合物のＥ１またはＥ２のいずれにおいてもこの発明の主要な利点にとって不可欠であることは示されていない。他の目的及び特徴については、一部は明らかであり、一部は以下に示す略号一覧次に列挙した、本願明細書で使用する略号を以下のように定義する。略号ｂｐ＝塩基対ｋｂ＝キロベース、１０００塩基対ｎｔ＝ヌクレオチドＢＭＥ＝ベーターメルカプトエタノールＰＰ_i ＝ピロリン酸ナトリウムＰｆｕ＝ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓＴａｑ＝ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＴｆｌ＝ＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓＴｌｉ＝ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｅｒａｌｉｓＫｌｅｎｔａｑ−ｎｎｎ＝コドンｎｎｎ＋１で開始される、Ｎ−末端が欠失したＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ。但し、開始コドン及びその次のコドンは適当な制限サイト（ｓｉｔｅ）を生成するためのＤＮＡ配列の改変のためＷＴ配列に適合しない場合がある。ＷＴ＝野生型（無欠損）または３ａａのみ欠失。ａａ＝アミノ酸ＳＴ＝Ｓｔｏｆｆｅｌｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｋｌｅｎｔａｑ−２８８と呼ばれることもあるＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端欠失体 −ＬＡ＝ＬｏｎｇａｎｄＡｃｃｕｒａｔｅ；少なくとも１つは有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を持たず、少なくとも１つは有意味的な３’ −エキソヌクレアーゼ活性を呈する２つのＤＮＡポリメラーゼの不均衡な混合物ＰＣＲ＝（名詞）１．ポリメラーゼ連鎖反応２．１つの上記反応／増幅実験（動詞）３．ポリメラーゼ連鎖反応を介して増幅することｕｌ＝マイクロリッターＡＴＣＣ＝アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）メガプライマー（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ）＝複数ステップ処理の後続ＰＣＲ段においてプライマーとして使用される二本鎖ＤＮＡ・ＰＣＲ生成物ＤｅｅｐＶｅｎｔ＝Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種ＧＢ−ＤからのＤＮＡポリメラーゼ；精製酵素はＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社から入手できる。ＤｅｅｐＶｅｎｔｅｘｏ^- ＝３’（校正）−エキソヌクレアーゼを持たない、ＤｅｅｐＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼの突然変異体形体Ｖｅｎｔ＝ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓからのＤＮＡポリメラーゼ；精製酵素はＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社から入手できる。Ｖｅｎｔｅｘｏ^- ＝３’（校正）−エキソヌクレアーゼを持たない、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼの突然変異体形体Ｐｆｕ＝３’（校正）−エキソヌクレアーゼを持たない、ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓからのＤＮＡポリメラーゼ；精製酵素はＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ社から入手できる。Ｐｆｕｅｘｏ^- ＝ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの突然変異体形体；精製酵素はＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ社から入手できる。シークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）＝ファージＴ７又はＴ３ＤＮＡポリメラーゼの、化学的に修飾された、あるいは、突然変異した形体であって、その修飾あるいは突然変異によって３’−エキソヌクレアーゼ活性が消失したもの。図面の簡単な説明図１は、この発明のＤＮＡポリメラーゼの推奨実施例に関する遺伝子の増幅に使用できるプライマーのヌクレオチド配列を示す図である。（プライマー間の）遺伝子に対するＤＮＡ配列及び結果として得られる酵素のアミノ酸配列のバルク部分は、上記したＧｅｎＢａｎｋ登録によって定義されている。図２は、図１と同じプライマーのヌクレオチド配列を示す図であり、これらの同じプライマーがＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓからの類似する遺伝子の増幅に使用できることが示されている。図３は、従来技術の酵素ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ；ＡＴ）及びこの発明の推奨実施例のＤＮＡポリメラーゼを使用して行い、２０サイクルに対して各々２分間完全に持続させるピーク変性温度を変えて試験したＰＣＲ増幅反応を示すアガロースゲルの写真である。この発明の推奨実施例については、９８°において完全な活性を呈しており、９９ °においては不完全ではあるが有用な活性を呈している。一方ＡＴはこれらの温度に耐えられない。図３は、本願発明の酵素が、実地試験即ちＰＣＲ増幅において、ＡＴよりも高い耐熱性を有することを明示している。図４は、４つの酵素を使用して行ったＰＣＲ増幅反応を示すアガロースゲルの写真である。４つの酵素とは、先行技術の酵素ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ；ＡＴ）、この発明のＤＮＡポリメラーゼ（ＫｌｅｎＴａｑ−２７８）、先行技術の酵素ＡｍｐｌｉＴａｑＳｔｏｆｆｅｌＦｒａｇｍｅｎｔ（ＳＴ）、及びＫｌｅｎＴａｑ−２９１である。これら全てを、ＰＣＲ変性ステップを９５℃（制御標準温度）及び９８℃で行って試験した。全てについて、酵素のレベルを２つにして試験した。低い方のレベルは、制御温度での反応を維持するために必要な最小値に、実際に使用できる程度まで近づけている。ＫｌｅｎＴａｑ−２９１及びＳＴの双方は、９８℃にて使用した際、同様に挙動し、全部ではないが殆どの活性を失うが、ＫｌｅｎＴａｑ−２７８は高い変性温度の使用に対して少なくとも２倍の耐性があることに注意されたい。ＡＴは９８℃の温度にさらされると有効性が激烈に低減することがわかる。これらの酵素の挙動は、ＳＴを除いて再現できる。ＳＴは、提示した実験においては最もよい結果を示すが、製造者により推奨された量を使用した場合の作用はそれよりも劣る。図５は、この発明の酵素により使用できるようにされた９８℃の新しい実施可能温度と９５℃の標準ピーク変性温度とで比較して行われたコロニーＰＣＲの生成物のアガロースゲル分析の写真である。図５によって、新しく実施可能となったピーク変性温度を使用するについての応用的な利点が明示されている。図６（Ａ−Ｃ）は、各々に、試験したＰＣＲ実験の一部がローディングされたアガロースゲルの３枚の写真である。図６は、この発明の推奨実施例の酵素配合を様々に変えることによって得られる高ＤＮＡスパンＰＣＲの効率が大幅に増大することを明示している。ＫｌｅｎＴａｑ−２７８あるいはＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを単独で使用すると、６．６ｋｂＰＣＲ生成物形成に及ぼす触媒作用が低レベルであることが示されているが、これら２つを種々に組み合わせると、非常に効率が増大することがわかる。ＫｌｅｎＴａｑ−２７８と組み合わせるＰｆｕの量を徐々に少なくして図示の最小値１／６４０まで低減すると、効果的であることがわかる。図示したもののうち、ＫｌｅｎＴａｑ−２７８及びＰｆｕの組合せのみが６．６ｋｂの効率的な増幅に触媒作用を及ぼすことが出来る。１００ｕｌに対して表示レベルの各酵素（単位濃度については、例８の方法を参照）を使用して、１９ｎｇのλｐｌａｃ５ＤＮＡ及びプライマーＭＢＬ及びＭＢＲで鋳型処理（ｔｅｍｐｌａｔｅ）されたＰＣＲ反応に触媒作用を与えた。９４°で２分、６０°で２分、７２°で１０分の２０サイクルである。図７は、６．６ｋｂよりもさらに長いフラグメントの増幅に触媒作用を及ぼす場合において、ＰＣＲ実験の生成物を分析してこの発明の実施例の性能を調査したアガロースゲルの写真である。図７は、この発明の酵素配合の比率１／６４０の実施例を利用した場合、８．４ｋｂ、１２．５ｋｂ、１５ｋｂ及び１８ｋｂの増幅能力に高い効率性と高い収率が付与されていることを示している。標的生成物のサイズは、各レーンに対しｋｂとして上記に表示している。１００ｕｌに対する鋳型のレベルは、ｎｇλとして示されている。即ち、ＰＣＲは、各々、９４ °で２秒、７０°で１１分の２０又は３０サイクルである。これらの早期の増幅は、現在の最適手法（例８の方法を参照）に比べて幾つかの点で、最適とは言えないものであった。従って、薄壁の管ではなく厚い壁の管を使用し、触媒として１ｕｌのＫｌｅｎｔａｑＬＡ−６４（６３：１のＫｌｅｎｔａｑ−２７８：Ｐｆｕ）をＫｌｅｎｔａｑＬＡ−１６の代わりに使用し、２７ｍｅｒ（２７量体）のプライマーを長いプライマーの代わりに使用し（表１参照）、伸長／アニーリング温度を６８°ではなく７０°にし、オムニゲン（Ｏｍｎｉｇｅｎｅ）熱サイクラーを使用した。図８は、ほぼ無損失の先行技術の−３欠失のＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼによってＰＣＲ生成物であるｌａｃＺ遺伝子に導入された突然変異の数とＫｌｅｎｔａｑ−２７８によって導入された突然変異の数とを比較して、差を計数している棒グラフである。図９は、４３ｍｅｒオリゴヌクレオチドプライマーＢｔＶ５と対にされた３８４ｂｐメガプライマー（二本鎖ＰＣＲ生成物）を用いて行われたＰＣＲ増幅を示すアガロースゲルの写真である。１００ｕｌの反応容量に対して、以下の酵素（単位濃度については例８の方法を参照）を使用して増幅に対して触媒作用を与えた。レーン１、１ｕｌのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ；レーン２、１／１６ｕｌのＰｆｕ；レーン３、１ｕｌのＫｌｅｎｔａｑ−２７８；レーン４、両酵素を同時使用（１ｕｌのＫｌｅｎｔａｑ−２７８＋１／１６ｕｌのＰｆｕ）。ゲルの底部付近の３８４ｂｐのバンドはメガプライマーであり、最初にＫｌｅｎｔａｑ−２７８を使用して増幅されたものである。λＨ３＝ＨｉｎｄIIIで消化されたラムダＤＮＡ。２つの酵素の組合せ（レーン４）によってのみ良好な増幅が得られた。ＰｆｕのかわりにＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼを使用した場合も同じ結果が得られた（データは示していない）。図１０は、３３ｍｅｒの方が２７ｍｅｒよりも良好な結果を得られることを示すアガロースゲルの写真である。２７ｍｅｒプライマー（レーン１〜３、７〜９）又は３３ｍｅｒプライマー（レーン４〜６、１０〜１２）を使用して、１００ｕｌの反応容量に対して、２ｎｇ（レーン１〜６）または１０ｎｇ（レーン７〜１２）のラムダ導入ファージ鋳型を増幅した。３３ｍｅｒラムダプライマー配列は、長いだけでなく、ラムダゲノムにおいて、プライマーＭＢＬの左側に１００ｂｐで、また、プライマーＭＢＲの右側に２００ｂｐで配置されている。１．２、１．４及び１．６ｕｌの量のＫｌｅｎｔａｑＬＡ−１６を使用して、１２．５、１５及び１８ｋｂのそれぞれの増幅に触媒作用を与えた。１５ｕｌのアリコート（０．３又は１．５ｎｇのλ鋳型と等価）を０．８％のアガロースの電気泳動で分析した。図１１は、ｐＨ（ＰＣ２バッファをそのまま使用）及び熱サイクラー（オムニゲン）に関して最適次善の条件下でＫｌｅｎｔａｑＬＡ−１６（１．２ｕｌ）によって増幅された高ＰＣＲ生成物のＣＨＥＦパルスフィールド分析（参考文献１１、４秒の切換時間）を示すアガロースゲルの写真である。開始鋳型（表１参照）は０．１ｎｇ／ｕｌであり、各サイクルにおける６８°での時間は、２０ｋｂを超える生成物については２１分、レーン４及び５については１３分、及びレーン１１〜１４については１１分であった。ローディングされたＰＣＲ反応生成物の体積は、ほぼ等しい強度を示すように調整されており、ｕｌ単位で１２、１２、４、２；１０、１０、１０；２、２、４、１である。標準のサイズのレーン（Ｓ）は、λＤＮＡのＨｉｎｄIII消化物と混合された無欠損λｐｌａｃ５ＤＮＡ（４８６４５ｂｐ）を示している。表１については、５桁のサイズが、λｐｌａｃ５ＤＮＡの配列についてプライマーの位置から予測された塩基対で示されており、小数点の付いたサイズは、このゲルから求めたｋｂで示されている。図１２は、制限酵素ＨｉｎｄIIIによる消化が行われていない（レーン２、３）及び消化が行われた（レーン５、６）２８ｋｂと３５ｋｂの生成物を示すアガロースゲルの写真である。ＨｉｎｄIII消化の前に、２８ｋｂ生成物は１サイクルにつき２１分の伸長時間で、及び、３５ｋｂ生成物は２４分の伸長時間で増幅され、かつ、双方ともに最適なｐＨ（例８の方法を参照）にてロボサイクラー（Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ）で増幅された。レーンＳ（１、４、７）は、未消化のλ ｐｌａｃ５及びＨｉｎｄIII消化がなされたλｐｌａｃ５ＤＮＡのマーカーを含んでいる。図１３は、Ｐｆｕｅｘｏ^-突然変異体の試験結果を示すアガロースゲルの写真である。３０単位（０．７ｕｇ）のＫｌｅｎｔａｑ−２７８を単独で用いて（レーン１、７）、また、これを古細菌Ｐｆｕ野生型ｅｘｏ⁺ＤＮＡポリメラーゼ（＋；レーン２、３）又はその３’−エキソヌクレアーゼ活性を持たない突然変異体（−；レーン４、５）の非常に少量の混合物（１／１６ｕｌ又は１／６４ｕｌ、１／６又は１／２５単位と等価）と組み合わせて、８．４ｋｂのＰＣＲ増幅を行った。レーン６は、１ｕｌ（２．５単位）の単独のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ｗｔ、ｅｘｏ⁺）が使用された場合の結果である。使用されている。推奨実施例の説明図１を参照すると、この発明の推奨実施例のＤＮＡポリメラーゼ（ここではＫｌｅｎｔａｑ−２７８と称する）をコード化する組換えＤＮＡ配列のＰＣＲによる増幅についてのプライマーと論理が示されている。図１に示すように、開始メチオニン及びグリシン残基が、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８の最初の２つのＮ−末端位置を占めているが、それは、その前にＷＴＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼの残基２７８及び２８０が占めていた位置である。そのあとに、ローヤー氏他の記載のように、位置２８１のアミノ酸残基から始まって、野生型ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列が続いている。そのため、ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼの１から２８０のアミノ酸残基をコード化するコドンが欠失しており、１〜２８０のアミノ酸は、結果として得られる遺伝子生成物中に存在しない。この発明の別の推奨実施例のＤＮＡポリメラーゼを図２に示す。この推奨実施例では、上記したと同じ欠失突然変異が、非常に類似した酵素ＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメラーゼに生じている。アミノ酸配列を実質的に上記したように保持し、かつ、ポリメラーゼの耐熱性にあまり影響しない、ここに記載するアミノ酸配列に対するＤＮＡコード化又はアミノ酸配列になされる些細な改変は、この発明の範囲内に含まれることを理解されたい。突然変異体ＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｔａｑ−２７８が、それ以前のＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのあらゆる変異型に関して報告された温度よりも高い温度において耐熱性を呈し、ＤＮＡ合成に適した７２℃ の温度で使用する場合に、最終的なＰＣＲ生成物において、ＷＴＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼよりも高い忠実度を示すことは驚くべきことである。さらに、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８には（Ｎ−末端欠失の結果として除去された）ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼに関連する５’−エキソヌクレアーゼ活性がないため、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８はＤＮＡ配列決定について野生型ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼに比して非常に優れたものである。突然変異誘発の結果及びミスマッチ化プライマーの調査によって、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８が、野生型ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼよりも進行的でなく、誤対合した塩基を伸長させにくいことが分かる。Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８、ＳｔｏｆｆｅｌＦｒａｇｍｅｎｔ（ＳＴ、別名称Ｋｌｅｎｔａｑ−２８８）及びＫｌｅｎｔａｑ−２９１について耐熱性試験を行った。行った試験は、９７℃、９８℃又は９９℃等のピーク試験温度において各々完全に２分を有する２０ＰＣＲサイクルを含んでおり、得られる増幅バンドの強度を９７℃で又は９５℃等の低い制御変性温度（この温度では、これら全ての変異型が安定である）で２分間のものと比較する。これらのデータは、ＳＴとＫｌｅｎｔａｑ−２９１が同様の挙動を示し、これらの試験において９８℃で検出可能な熱不安定性を殆ど呈することのなかったＫｌｅｎｔａｑ−２７８とは異なって、互いに同様の９８℃での不安定性を有していることを示している。これらのデータによれば、Ｎ−末端アミノ酸の数はこの発明のＤＮＡポリメラーゼが呈する耐熱性の増強にとって重要であることがわかる。欠失ＳＴ及びＫｌｅｎｔａｑ−２９１が、この発明のＫｌｅｎｔａｑ−２７８が示す最適の安定性に対して過剰のアミノ酸（１０過剰及び１３過剰）を除去したクラスであることは明らかである。Ｔｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓと表示されることがある（及びＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓであることもある、ＡＴＣＣのカタログ参照）細菌から得たＤＮＡポリメラーゼは、ＷＴＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼに対して非常に相同である。ここで検討する欠失の領域においては、酵素及び遺伝子が正確に相同であり、類似の欠失が構成された場合、対のＳＴ、Ｋｌｅｎｔａｑ−２９１及び優れているＫｌｅｎｔａｑ−２７８の違いはそのままとなると思われる。実際に、図２のプライマーをＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓＤＮＡに使用して、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８の構成及び単離のために正確にここで記載する態様でＫｌｅｎＴｆ１−２７７を構成することができよう。ＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメラーゼ−２７７酵素及び同様の耐熱性を呈するその改変体もこの発明の範囲内である。また、この発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ又はＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列からなるＤＮＡポリメラーゼをコード化する組換えＤＮＡ配列を含むベクターを特徴として有する。但し、これがＮ−末端にメチオニン及びグリシン残基を付加すること及び野生型ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端２８０アミノ酸を排除すること（ローヤー氏他、上記参照）を除く。推奨実施例において、ベクターはＡＴＣＣ第６９２４４号として供託されたプラスミドｐＷＢ２５４ｂ（配列番号５）として存在する核酸あるいはそのようなベクターを含む宿主細胞である。関連する点では、この発明は、上記したようなアミノ酸配列を有する精製ＤＮＡポリメラーゼを特徴としている。ここで使用されているとおり、「精製」とはこの発明のポリメラーゼを、通常それに関連する大多数の宿主細胞タンパク質から単離することを意味する。このポリメラーゼは調製物中のタンパク質の少なくとも１０％（ｗ／ｗ）であることが好ましい。それが均一系調製物、例えば、均一系溶液とされていれば更に好ましい。概略的には、この発明の組換えＤＮＡ配列は、ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓゲノムＤＮＡから、あるいは、ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の所望のスパンよりも大きい部分のクローンから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、サイキ（Ｓａｉｋｉ）氏他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９、４８７（１９８８年））によって、後続の消化のために適切な制限サイトが含まれている図２に示すようなプライマーを用いて増幅される。その後、組換えＤＮＡ配列は、当業者に周知の手法によって発現ベクターにクローニングされる。ベクターの特定のヌクレオチド配列は、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄIII等のサイト特異的制限酵素により切断される。次いで、ベクターを任意にアルカリ性ホスファターゼ処理した後、ベクター及び標的フラグメントの配位子結合が、結果としてなされる、所望の対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）及び発現配列に隣接した位置への標的コドンの挿入とともになされる。使用される特定のベクターは、遺伝子発現に使用されるために選択される宿主細胞の型にある程度依存することとなる。代表的には、アンピシリン又はテトラサイクリン耐性等のマーカー用遺伝子を含み、かつ、適切なプロモーター及びターミネーター配列を含む宿主親和性（ｈｏｓｔ−ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）プラスミドが使用される。推奨実施例において、この発明の組換えＤＮＡ発現配列は、バックボーンがｐＴＡＣ２（ワシントン大学メージャーズ（Ｊ．Ｍａｊｏｒｓ）氏）、ｐＢＲ３２２誘導体である、プラスミドｐＷＢ２５０（ルシフェラーゼ／ＮＰＴII融合を発現させる）あるいはｐＷＢ２５３（ＡＴＣＣ第６８４３１号として供託されたＫｌｅｎＴａｑ−２３５を発現させる）についてクローニングされる。その結果得られる、ｐＷＢ２５４ｂと呼ばれるプラスミドの特定の配列は、配列番号５である。Ｅ．ｃｏｌｉの種々の菌株等の細菌及びパン酵母等の酵母菌は、ＤＮＡポリメラーゼの発現用宿主細胞として非常によく用いられるが、さらに複雑な細胞を使用する技術も知られている。例えば、デピッカー（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ，Ａ．）氏他による、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１、５６１（１９８２年）に記載の植物細胞を使用する手法を参照されたい。この発明の推奨実施例においては、ｌａｃオペロンをカバーする欠失Ｘ７４を有するＥ．ｃｏｌｉ宿主菌株Ｘ７０２９、野生型Ｆが使用されている。宿主細胞は、所定の宿主細胞に対して特定的に作られたプロトコル（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いて形質転換される。Ｅ．ｃｏｌｉについては、コーエン（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．）氏によるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９、２１１０（１９７２年）記載のカルシウム処理によって形質転換が生じる。あるいは、より効果的であるのは、ドワー（Ｄｏｗｅｒ）氏他によるＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１６、６１２７−６１４５（１９８８年）に記載の方法を行った後、無塩（ｓａｌｔ−ｆｒｅｅ）Ｅ．ｃｏｌｉのエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を行うことである。形質転換後、形質転換宿主を、アンピシリン耐性等の発現ベクターから得られる特性に基づいて他の細菌から選択して、細菌の形質転換コロニーを、高レベルのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導化耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を生じさせる能力に関してさらにスクリーニングする。次いで、形質転換Ｅ．ｃｏｌｉのコロニーを大量に生長させて、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８ＤＮＡポリメラーゼの発現を誘導し、単離及び精製を行う。精製技術は様々なものが知られているが、それら全ては、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の破壊、自然タンパク質の不活性化及び除去、及び核酸の沈殿のステップを含んでいる。ＤＮＡポリメラーゼの分離は、その重量（遠心分離）、サイズ（透析、ゲル濾過クロマトグラフィ）または電荷（イオン交換クロマトグラフィ）のような特性を利用することによってなされる。一般的には、精製プロセスにおいて、これらの技法は一緒に組み合わせて使用される。Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８を精製するための推奨プロセスでは、リゾチームを用いてＥ．ｃｏｌｉ細胞を弱め、この細胞を溶解させ、また、細胞懸濁液を８０℃に急速加熱して８０〜８１℃で２０分間インキュベートすることによって殆ど全ての自然タンパク質を変性させる。次いでこの懸濁液を冷却し遠心分離して変性タンパク質を沈殿させる。その後、この上澄み液（Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８が含まれている）を高塩（ｈｉｇｈ−ｓａｌｔ）ポリエチレン−イミン処理して核酸を沈殿させる。抽出物の遠心分離によって核酸が除去される。好ましくは、ヘパリン−アガロースカラムでのクロマトグラフィによってほぼ純粋な酵素が得られる。この単離についての詳細は例３に後述する。この発明の新規のＤＮＡポリメラーゼは、このような酵素を有利に使用できるあらゆるプロセスに使用できる。具体的には、この酵素は、ＰＣＲ増幅技術、核酸の配列決定、サイクル配列決定、ＤＮＡ制限消化の標識化及び平滑末端化（ＤＮＡｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｄｉｇｅｓｔｌａｂｅｌｌｉｎｇａｎｄｂｕｌｕｎｔｉｎｇ）、ＤＮＡの標識化、ｉｎｖｉｖｏＤＮＡフットプリント法、及びプライマー指向性突然変異誘発に有用である。増幅ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、幾何進行において、１００万以上の折り畳みにまでＤＮＡの特定のセグメントを急速に増幅するための方法である。例えば、参考文献として本願明細書の一部とするミュリス（Ｍｕｌｌｉｓ）氏による米国特許第４６８３２０２号を参照されたい。この技法は、増幅されるべきＤＮＡセグメントの５’末端と及び３’末端の補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）と相同関係を有する一対のプライマーからの、ＤＮＡポリメラーゼで触媒作用を与えられた伸長の繰り返しサイクルに基づくものである。このプロセスの主要なステップは、別の増幅ラウンドが得られるようにＤＮＡプライマーエクステンション生成物をその鋳型から熱変性することである。この変性ステップの実施可能温度範囲は、通常、約９３℃から約９５℃の範囲である。この範囲では殆どのＤＮＡポリメラーゼが不可逆的に変性してしまうので、各変性サイクル後にさらに別のポリメラーゼを付加することが必要とある。しかし、ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合は、二本鎖核酸を変性させる温度での活性を保持することが出来るため、更にＤＮＡポリメラーゼを付加する必要はない。例４に後述するように、Ｋｌｅｎｔａｑ− ２７８は、以前に知られていたあらゆるＤＮＡポリメラーゼに対するものよりも高い９９℃の温度に有意味的に繰り返しさらしてもそれに耐え得る能力を示している。また、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、推奨合成温度である７２℃において、野生型ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼよりも高い忠実度を有することが分かっている。これに関するデータは、２つの選択可能なマーカーが横に配置されたｌａｃＺＤＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅に関する方法（バーネス（Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．）氏、Ｇｅｎｅ１１２、２９−３５（１９９２年））で収集された。この発明の推奨実施例Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８とＡＴ及び類似した別のＮ−末端欠失であるＫｌｅｎｔａｑ−２３５とを比較する代表的なデータが図８に示されており、これにより、相異なるＮ−末端欠失が、最終ＰＣＲ生成物において測定されたような異なる忠実度を再現可能に呈することがわかっている。酵素ＳＴについては、この酵素の市販の調剤で、この検定に用いられる長い試験フラグメント（４．８ｋｂ）のＰＣＲに触媒作用を及ぼすことが難しいため、同様の忠実度のデータが得られない。しかし、ＳＴに関するこれらの実験の難点が単に配合（２ｋｂＰＣＲ増幅に必要な容積が１０〜１５倍も多い容積となるほどその濃度が低く、これらの欠失について、長い標的ＤＮＡを得るのに必要な酵素がもっと必要である）によるものなのか、ＳＴがこのような長い標的のＰＣＲ増幅に触媒作用を及ぼすことが本質的に出来ないのかということについては分かっていない。ＤＮＡ配列決定所定のＤＮＡ配列は、ジデオキシ類似体を用いて、サンガー法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．）氏、ニクレン（Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ｓ）氏及びクールソン（Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．）氏による鎖終結阻害剤を用いたＤＮＡ配列決定、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４、５４６３−５４６７（１９７７年））によって解明することが出来る。これらの方法では、ＤＮＡポリメラーゼを使用して核酸連鎖の伸長に触媒作用を及ぼす。しかし、その自然形体において、ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼは（多くの他のポリメラーゼと同様に）５’−エキソヌクレアーゼ活性に関する領域を有している。この関連するエキソヌクレアーゼ活性は、僅かに過剰の酵素が存在することやインキュベートの時間が過剰にされた場合を含む所定の条件下で、１〜３のヌクレオチドを配列決定プライマーの５’末端から取り除くことができ、それによって、アルファ標識化配列決定用ゲルにおける各バンドが多かれ少なかれ多重線として現れるようにすることができる。配列決定用ゲルの標識が５’である場合には、エキソヌクレアーゼによって多重線を生じさせることは出来ないが、そのかわりにシグナルを減少させる。ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端２８０アミノ酸残基の欠失の結果として、Ｋｌｅｎｔａｑ− ２７８にはエキソヌクレアーゼ活性がなく、５’−エキソヌクレアーゼ活性により生じる配列決定の危険性が回避される。Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ配列決定に効果的に使用することが出来る。基本的には、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８を使用するに適したジデオキシＤＮＡ配列決定には２種類ある。即ち、元来のジデオキシ配列決定（上述のサンガー氏他；イニス（Ｉｎｎｉｓ）氏他によるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５、９４３６（１９８８年））及びサイクル配列決定である。イニス氏他によりジデオキシ配列決定に適した手法が記載されているが、ＷＴＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼを使用すると、この手法は、審査官には入手可能でありかつ参考文献として本願明細書の一部とする特許出願第０７／５９４６３７号に明示されているように、配列決定用ゲル上で二重又は三重のバンドを示す傾向がある。Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、この問題の解決において、上記特許出願の主題であるＫｌｅｎｔａｑ−２３５，ａ．ｋ．ａ．ＤｅｌｔａＴａｑと同じ効果をもつ。Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８による元来型（非サイクル型、イニス氏他）のジデオキシ配列決定を行うに好ましい手法は、ＵＳＢのＴａｑｕｅｎｃｅ２．０ジデオキシ配列決定キットにおけるものである。この手法の表題紙を本願に添付し（付録１）、その記述全体を参考文献として本願明細書の一部とする。サイクル配列決定に好ましい手法は、ＵＳＢサイクル配列決定キットにおけるものである。この手法の表題紙を本願に添付し（付録２）、その記述全体を参考文献として本願明細書の一部とする。その他の用途Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、プライマー指向性突然変異誘発、ｉｎｖｉｖｏフットプリント法、ＤＮＡの標識化及び非スティッキー・ラムダＤＮＡフラグメントのサイズ標準の調製にも有効に利用されたものである。これらの手法については以下に述べる。Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、特に配合Ｋｌｅｎｔａｑ−ＬＡ（後述）において、一本鎖鋳型になるようにアニーリングされるサイト特異的突然変異原生プライマーを伸長させるために使用することが出来る。それは、このプロセスではクレノウ酵素（Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩの大きなフラグメント）及びＴ７ＤＮＡポリメラーゼと置き換わるが、３７℃におけるクレノウ酵素よりも高いプライマー選択性を６０〜６５℃で示し、クレノウ酵素に必要な時間が１時間以上であるのに比べて１２分で完全あるいは十分な取り込みの状態になる。また、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、リガーゼ仲介ＰＣＲ補助ｉｎｖｉｖｏフットプリント法における第３（第２ネスト（ｓｅｃｏｎｄ−ｎｅｓｔｅｄ））プライマーでのＰＣＲ後の標識化ステップに対して有用（及び野生型ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼよりも優れたもの）である。この情報がえられたのは、ミズーリ州セントルイスのワシントン大学のガッタス（Ｉ．Ｇｈａｔｔａｓ）氏のおかげである。これらの研究は、ガリッティ氏及びウォルド氏にの研究（Ｇａｒｒｉｔｙ，Ｐ．Ａ．及びＷｏｌｄ，Ｂ．Ｊ．（１９９２年）、連結反応仲介ＰＣＲ増強遺伝子配列決定及びｉｎｖｉｖｏフットプリント法における種々のＤＮＡポリメラーゼの効果、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８９、１０２１−１０２５）と同様である。さらに、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８はＤＮＡ標識化に有用である。ランダムプライマーについては、少なくとも９ｎｔの長さが推奨され、反応を３７℃から６５ ℃にゆっくりと（２０〜３０分かけて）温めて行うことが好ましい。最も好ましいのは、当業者に周知である手法を用いて、プログラム可能な熱ブロックをＤＮＡ標識化に利用することである。Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８の別の用途は、部分的に付着末端（スティッキーエンド）が付着し合っていないラムダＤＮＡ制限消化物の調製に使用することである。５５℃で反応が行われるＨｉｎｄIII消化物にＫｌｅｎｔａｑ−２７８及び４つのＤＮＡｄＮＴＰが含まれていると、その結果として、バンド１及び４が部分的に相互に結びつかない。供託菌株ｐＷＢ２５４ｂ／Ｘ７０２９は、１９９３年２月１８日にメリーランドのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに供託されており、ＡＴＣＣ６９２４４号の番号が付与されている。出願人は、これについて付与された特許の存続期間の終了前、培養に対する最後の請求をしてから５年、或いは、３０年のいずれか長い方の期間の経過前にこの培養が死んでしまった場合にこの培養を取り替える責任、及び、供託物が公に入手できるようになる特許付与の時点に、このような特許の付与の受託者を告知する責任のあることを認めるものである。その時まで、供託物は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．セクション１〜１４及び３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２の条件のもとに特許局の長に対して入手可能となろう。この発明のさらに別の特徴については、標的長さがＤＮＡのＰＣＲ増幅に制限されることが確認され、取り扱われている。それに付随して、塩基対の忠実度、ＰＣＲ生成物をプライマーとして使用する能力、及び標的フラグメントの最大収率が増加した。これらの向上は、有意的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＫｌｅｎｔａｑ−２７８と、低レベルの、有意的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ、又はＤｅｅｐＶｅｎｔ）とを組み合わせることによって得られた。驚くべきことに、この系で、例えば１ｎｇのラムダＤＮＡ鋳型から少なくとも３５ｋｂの標的フラグメントが、高い収率になるまで増幅可能である。更に、少なくとも１つの３’−エキソヌクレアーゼ活性を持たない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼからなる主成分と、少なくとも１つの３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼからなる少量成分とから構成される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配合によって、６．６〜８．８ｋｂの範囲の生成物を効果的に増幅することが出来る。先行技術の方法では、このサイズの範囲のフラグメントはあまり効力のない形でかつ散発的にしか増幅されず、比較的弱い生成物バンドが生じたり、検出可能な生成物が全く生じなかったりした。本願の開示をみると、先願技術の無効性の理由が（何らかの特殊な理論に制限されることなく）理解されるものと思われる。ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ及びその変異型は、（それらに３’−エキソヌクレアーゼがないため除去できない）誤対合した塩基対を容易に伸長させないものと思われる。誤対合した塩基の除去によって伸長を有効にし、かつ、より正確にコピーされた生成物を生成させることが出来るであろうと思われる、３’−（校正）エキソヌクレアーゼを呈する耐熱性酵素は、２社（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって導入された。実際には、これら２つの酵素（Ｖｅｎｔ及びＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ）は信頼性がなく、期待されていた程の効果はあまり得られていない。ＰＣＲに関しこれらの酵素に信頼性がないことに対して考えられる説明の１つとして、３’−エキソヌクレアーゼが見かけ上プライマーを攻撃してこれを劣化させることがよくあり、ＰＣＲが殆ど或いは全く起こりえないということがある。このプライマー攻撃の問題は、あるプライマーに対しては他のものよりもさらに悪いものとなる。ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼが５’１５ｎｔに影響を及ぼさないようにして、アニーリング条件によってその１５ｎｔをプライマー化（ｐｒｉｍｅ）させる場合にＰＣＲをおそらく進行させることが出来るようにすることが報告されている（作者不明、ＮＥＢＴｒａｎｓｃｒｉｐｔ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、（１９９１年３月）４頁）。勿論、この場合、アニーリングはより低い、非選択的な温度でしか行われないものとなり、プライマーの５’１５ｎｔは鋳型に対して正確に相同でなければならない。出願人は、３’−エキソヌクレアーゼの有益な効果が、ある古細菌ＤＮＡポリメラーゼ等の、有意味的な（この定義は生化学的に分析可能ということである）３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈する１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ（ここではＥ２と呼ぶ）が意外にも微小に存在することによって得られる一方、有効な伸長が、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８或いはＡＴ等の、有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性をなんら持たない１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ（ここではＥ１と呼ぶ）が大量に存在することによって触媒作用を受けることを発見した。ＤＮＡポリメラーゼの配合又は混合物の少量成分としては、上述した、３’−エキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼの信頼性に欠ける点及び無効力な点が、実質的に緩和されていたり、無くなっていたりする。更に、３’−エキソヌクレアーゼが誤対合を除去して誤対合での一時減衰（ｐａｕｓｉｎｇ）を無くすと考えられるため、結果として生成したＤＮＡが呈する塩基対の変化はより少なくなり、それによって、忠実度、特異性及び効率を犠牲にすることなくＰＣＲの突然変異誘発が減少して有用なものとなる。実際には、２０００もの高いＫｌｅｎｔａｑ−２７８／Ｐｆｕ単位比についてさえ、組合せが呈する増幅の効率は非常に増加する。大抵の使用分野については、ＤＮＡポリメラーゼの混合物は、増強された生成物長さ及び収率が得られるまでは少なくとも約４：１のＥ１のＥ２に対する相対ＤＮＡポリメラーゼ単位比でなければならない。ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを配合に使用した場合、その比は、プライマー−鋳型の組合せにある程度左右されるが、Ｐｆｕ１部（単位）につき８０〜１００部のＫｌｅｎｔａｑ−２７８の範囲にあることが好ましく、さらに好ましくは、約１５０〜約１７０：１であり、最も好ましいのは、約１６０：１である。同様の比は、ＰｆｕとＫｌｅｎｔａｑ−２９１の混合物についても好ましい。Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８又は２９１と組み合わせて使用する際にＰｆｕの代わりにＤｅｅｐＶｅｎｔを使う場合では、殆どの使用分野において最も好ましいＥ１のＥ２に対する比は、約４５０〜約５００：１に増大する。また、Ｅ１として無損失（ＷＴ）Ｔａｑ又はＡｍｐｌｉｔａｑが含まれている場合、その最も好ましいＰｆｕ又は他のＥ２成分に対する比は、Ｅ１のＥ２に対する比が約１０〜約１５：１の範囲にある場合である。この発明のＥ２には、Ｐｆｕ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ、Ｔ７コリファージ、Ｔｍａ又はその組合せからの遺伝子によってコード化されたＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、これに限定されるものではない。この発明のＥ１には、突然変異体、Ｅ２ＤＮＡポリメラーゼの３’−エキソヌクレアーゼ陰性形体、或いは、Ｔａｑ、Ｔｆｌ又はＴｔｈ或いはその組合せからの遺伝子によってコード化されたＤＮＡポリメラーゼ等の、突然変異していない形体の中で有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を示さないＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、これに限定されるものではない。以下に述べるように、この発明のＤＮＡポリメラーゼ配合も、Ｅ１がシークエナーゼ等の逆転写酵素からなるＤＮＡポリメラーゼの配合を含んでいる。この発明の配合の更なる例として、Ｅ１がＴ７又はＴ３ＤＮＡポリメラーゼの突然変異体或いは化学的な修飾を含み又はそれから構成され、Ｅ２が野生型Ｔ７又はＴ３ＤＮＡポリメラーゼを含み又はそれから構成されている混合物、或いは、別の変形として、Ｅ１が、何ら有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を持たないＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔｅｘｏ^-としてＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから販売されている）を含み又はそれから構成され、また、Ｅ２がＶｅｎｔを含み又はそれから構成されているものがある。ここで発見された原理、即ち、３’エキソヌクレアーゼを持たないＤＮＡポリメラーゼによりプライマーの伸長を行う間に低レベルの３’エキソヌクレアーゼを使用するということは、標準温度インキュベーション（即ち、非耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用すること）、及び、３’−（校正）エキソヌクレアーゼを持たないことが知られている逆転写酵素（Ｂａｔｔｕｌａ及びＬｏｅｂ、１９７６年）を含む、一般的なＤＮＡポリメラーゼのプライマーエクステンション法に適用できる。前者の例は、主成分の酵素としてシークエナーゼ（ｅｘｏ^-）を使用し、少量成分として野生型Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（ｅｘｏ⁺）又はクレノウ・フラグメントを使用することである。後者の例は、ＡＭＶ（ＡｖｉａｎＭｙｏｂｌａｓｔｏｓｉｓＶｉｒｕｓ）又はＭＬＶ（ＭｕｒｉｎｅＬｅｕｋｅｍｉａＶｉｒｕｓ）の逆転写酵素を主成分とし、クレノウ・フラグメント、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは、Ｐｆｕ又はＤｅｅｐＶｅｎｔ等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを少量成分として使用することである。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはこれらの逆転写酵素によって使用される３７度及び４２度の温度では活性がより低くなるため、ＰＣＲにおいて使用する場合よりも必要と思われるレベルは高くなりやすい。クレノウ・フラグメントＤＮＡポリメラーゼは、鋳型としてＲＮＡを使用する際には好ましいＤＮＡポリメラーゼではないが、特に、付加したＭｎイオンの存在下で、この鋳型（Ｋａｒｋａｓ、１９７３年；Ｇｕｌａｔｉ，Ｋａｃｉａｎ及びＳｐｉｅｇｅｌｍａｎ、１９７４年）を認識する作用を行う。付加したＭｎイオンは、（先行技術では）残念ながらｅｘｏ⁺成分の恩恵を受けることなく、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＴｔｈによって逆転写を行うために型通りに使用される。逆転写酵素反応にｅｘｏ⁺成分を使用するについては、ｅｘｏ⁺ 成分がＲＮＡｓｅに完全に汚染されていない状態にするように特別な注意が必要であることを強調しておかなければならない。次の参考文献には、逆転写酵素を使用する技術分野において周知である方法が記載されており、これらを参考文献として本願明細書の一部とする。バッツラ（ＢａｔｔｕｌａＮ．）氏、ロエブ（ＬｏｅｂＬＡ．）氏ＤＮＡ複製の忠実度について。トリ骨髄芽球症ウィルス（ａｖｉａｎｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓｖｉｒｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼにおけるエキソデオキシリボヌクレアーゼ活性及びエラー補正機能の欠如。ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２５１（４）、９８２−６、１９７６年２月２５日。グラチ（ＧｕｌａｔｉＳＣ）氏、スピーゲルマン（ＳｐｉｅｇｅｌｍａｎＳ．）氏ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとしてＤＮＡポリメラーゼＩを使用するための条件。ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ７１（４）、１０３５−９、１９７４年４月。カーカス（ＫａｒｋａｓＪＤ．）氏大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩによる逆転写。ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．７０（１２）、３８３４−８、１９７３年１２月。ポリメラーゼ活性がなく３’−エキソヌクレアーゼ活性しか持たないＤＮＡポリメラーゼ：出願人は、特殊な理論に限定するわけではないが、少量（Ｅ２）成分の酵素活性は、３’−エキソヌクレアーゼ活性であってＤＮＡポリメラーゼ活性ではないと考える。実際、このＤＮＡポリメラーゼ活性は、少量成分ではなく主要（Ｅ１）成分に最適な条件下で望ましくない合成あるいはあまり正確ではない合成を生じさせる厄介なものとなりえるとも考えられる。Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの「領域Ｉ」ＤＮＡ変換ＤＮＡポリメラーゼのモチーフを突然変異させたバーナード（Ｂｅｒｎａｄ）氏、ブランコ（Ｂｌａｎｃｏ）氏及びサラス（Ｓａｌａｓ）氏のＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼのＹＣＤＴＤＳアミノ酸モチーフのサイト指向性突然変異誘発（Ｇｅｎｅ９４、４５−５１（１９９０年））に教示されている様に、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の領域III又は領域Ｉのいずれかに突然変異が起こり、それらは、ウエモリ（Ｕｅｍｏｒｉ，Ｔ．）氏、イシノ（Ｉｓｈｉｎｏ，Ｙ）氏、トウ（Ｔｏｈ，Ｈ．）氏、アサダ（Ａｓａｄａ，Ｆ）氏及びカトウ（Ｋａｔｏ，Ｉ．）氏によって（古（ａｒｃｈａｅｏｎ）ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓＦｕｒｉｏｓｕｓからのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の機構とヌクレオチド配列、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２１、２５９−２６５（１９９３年））配列決定された。この発明の更に別の実施例では、野生型形体において３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈し、かつ、上記した１以上のＤＮＡポリメラーゼの３’−エキソヌクレアーゼ活性を無くしてはいないが実質的に低減させた温度サイクル型ポリメラーゼ連鎖反応に触媒作用を与えることが出来る、少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼを含み或いはこれから構成されているＤＮＡポリメラーゼの配合が提供されている。低減した３’−エキソヌクレアーゼ活性は、突然変異によって、又は、当業者には周知である化学的又はその他の手段によって得られる。その際、ＤＮＡポリメラーゼの配合を、ＰＣＲ増幅においてプライマーエクステンションに触媒作用を与えるために使用してもよい。また、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ及びＤｅｅｐＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼを含むアルファ類の遠縁のＤＮＡポリメラーゼを研究しているスペインの研究者（ソエンガス（Ｓｏｅｎｇａｓ，Ｍ．Ｓ．）氏、エステバン（Ｅｓｔｅｂａｎ，Ｊ．Ａ．）氏、ラザロ（Ｌａｚａｒｏ，Ｊ．Ｍ．）氏、ベルナッド（Ｂｅｒｎａｄ，Ｓ．）氏、ブラスコ（Ｂｌａｓｃｏ，Ｍ．Ａ．）氏、ルサラス（．ｌＳａｌａｓ，Ｍ．）氏及びブランコ（Ｂｌａｎｃｏ，Ｌ．）氏、ＥｍｂｏＪｏｕｒａｎｌ１１、４２２７−４２３７（１９９２年））も、３’−エキソヌクレアーゼ領域の突然変異を識別及び立証し、さらに、（１又は複数の）ＤＮＡポリメラーゼモチーフが突然変異している間に分離し容易に回避した。この同じ報告において、彼らは、保存Ｔｙｒ残基をＰｈｅ又はＣｙｓに変えることによってエキソヌクレアーゼを４〜７％の活性に低減することが出来る一方、保存ＡｓｐをＡｌａで置換することによって０．１％だけの活性に低減することが出来ることを立証している。長く正確なＰＣＲについては、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ又はＤｅｅｐＶｅｎｔ等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで生じるに最適なｅｘｏ^-（３’−エキソヌクレアーゼ陰性）突然変異は、エキソヌクレアーゼを消去はしないが低減するものであり、例えば、野生型ＤＮＡポリメラーゼの３’−エキソヌクレアーゼ活性の、０．２〜７％、好ましくは０．５〜７％、最も好ましくは１〜７％までの低減となる。突然変異を導入する別の方法として（及び上記のＢｔＣｒｙＶ遺伝子例について実証するように）、Ｋｌｅｎｔａｑ−ＬＡ、この発明が２つの相同ＲＥＧＩＯＮ III及びＲＥＧＩＯＮＩに対するＤＮＡ配列コード化に及ぶ小さなＰＣＲ生成物に変化を導入するために使用される。この変化は、ＭＡＣＡＷコンピュータ・プログラムの助けを借りて以下に示す保存モチーフをガイドとして使用して、ＲＥＧＩＯＮ III及び／又はＲＥＧＩＯＮＩの保存アミノ酸を変化させるように選択される。出願人は、（表示しないが、上記のように例１に相似であり、当業者によって容易に実行されるデータの詳細）ガイドとしてウエモリ（Ｕｅｍｏｒｉ）氏他によって公表された配列を用いて、ＰｆｕＤＮＡからのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のＯＲＦをＰＣＲ増幅した。上記例２に相似的に、このＯＲＦを、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８の発現に使用したように同じ発現ベクターにクローニングし、また、ＤＮＡポリメラーゼが上記例３にてＫｌｅｎｔａｑ−２７８に対してここに述べたと同じ手法で精製可能であることを示した。突然変異を導入する別の（上記ソエンガス氏他によるものに代わる）方法として（及び上記のＢｔＣｒｙＶ遺伝子例について実証するように）、Ｋｌｅｎｔａｑ−ＬＡ、この発明が２つの相同ＲＥＧＩＯＮ III及びＲＥＧＩＯＮＩに対するＤＮＡ配列コード化に及ぶ小さなＰＣＲ精製物に変化を導入するために使用される。この変化は、ＭＡＣＡＷコンピュータ・プログラムの助けを借りて以下に示す保存モチーフをガイドとして使用して、ＲＥＧＩＯＮ III及び／又はＲＥＧＩＯＮＩの保存アミノ酸を変化させるように選択される。以下は、ＤＮＡポリメラーゼ保存モチーフの２つを実行する、コンピュータ・プログラムＭＡＣＡＷからの番号を付された出力である。また、これら及び他のＤＮＡポリメラーゼモチーフの有用な発表はパーラー（Ｐｅｒｌｅｒ）氏他によるＰ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８９、５５７７−５５８１（１９９２年）にも見られる。次の例によってこの発明を説明する。実施例１Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８として表される遺伝子の構築図１にヌクレオチド配列として示す組換えＤＮＡ配列を有するＫｌｅｎｔａｑ −２７８ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み立てる（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）ために、次の手順に従った。変異遺伝子は図１の２つの合成ＤＮＡプライマーから用意した（ｐｒｉｍｅｄ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，Ｓａｉｋｉｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：４８７，１９８８）を用いて全ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡの０．２５ｕｇから増幅した。プライマーＫＴ１，配列番号：１は、コドン２８０でスタートする野生型ＤＮＡと異体同形であり、このプライマーは生成ａｍｐｌｉｆｉｅｄしたＤＮＡ中にＮｃｏＩサイトに組込むことを意図している。プライマーＫｌｅｎｔａｑ３２，配列番号：３，３３ｍｅｒはＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼをコード化する野生型遺伝子の他の鎖上で停止コドンに及びＨｉｎｄIIIサイトと生成ＤＮＡ中で二重停止コドンに組込まれる。ＰＣＲ反応の緩衝剤は２０ｍＭのトリスＨＣｌｐＨ８．５５、２．５ｍＭのＭｇＣＬ₂、１６ｍＭの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１５０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２００ｕＭのｄＮＴＰよりなる。サイクルパラメーター（ｃｙｃｌｅｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）は２′９５°、２′６５°、５′７２°である。ＰＣＲ（Ｓａｉｋｉｅｔａｌ．，上記）によって導入される突然変異を最少とするために、ＰＣＲの１６サイクルだけ（ｏｎｌｙ）はフェノール抽出、エタノール沈殿前に制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄIIIで消化を行った。実施例２発現ベクターの調製生成物ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄIIIフラグメントは、ＮｃｏＩ，ＨｉｎｄIII，そして子牛腸内のアルカリ性フォスファターゼで加水分解（ｄｉｇｅｓｔｅｄ）したプラスミドｐＷＢ２５４ｂ中に分枝した。このプラスミドのバックボーンは、予め命名されたｐＴＡＣ２で、Ｊ．Ｍａｊｏｒｓによって得られたものであり、ｐＢＲ３２２（発現の方向が時計の針と反対方向でなく、時計の針方向であるものはアポストロフィー ’を付す）のＰｖｕIIサイトから時計の針と反対方向に次の元素を導く：１部分のｌａｃＺ’配列、ｌａｃＩ’、ｌａｃＰＵＶ５（配向は知られていない）、ＰＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓＰｈａｒｍａｃｉａ− ＬＫＢ；カタログｎｏ．２７−４８８３）からのｔａｃプロモーターの２つの複写、Ｔ７遺伝子１０プロモーターそしてＮｃｏＩサイト、ＨｉｎｄIIIサイトからなる修飾した開始コドン、ｔｒｐＡターミネータ（ＰＬｎｏ．２７−４８８４ −０１）、複製のＭ１３オリジン、ｐＢＲ３２２のＡｍｐ ^R遺伝子である。クローン化遺伝子の発現は０．１ｍＭＩＰＴＧによって誘発されるべきであると予想される。クローニングから起こるアンピシリン耐性コロニーズは、Ｓａｇｎｅｒｅｔａｌ．（１９９１）〔ＧＥＮＥ９７：１１９−２３〕のシングルコロニー耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ測定によって測定した。そして、４ｓｔｒｏｎｇｐｏｓｉｔｉｖｅｓはトゥースピック（ｔｏｏｔｈｐｉｃｋ）分析（Ｂａｒｎｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９５：３９３、１９７７）によって分画（ｓｉｚｅｄ）した。これらの１つで、ナンバー２５４．７は二重挿入の小部分を除いて期待した大きさであった。このプラスミドは、さらにＥ．ｃｏｌｉＸ７０２９中でエレクトロポレーションによって精製され、トゥースピック分析によってサイズを揃えるためにスクリーニングし、そして、二重挿入不純物のない期待したサイズの１つのプラスミドはｐＷＢ２５４ｂと命名された。このプラスミドはここに述べたＫｌｅｎｔａｑ−２７８の製造に使用されるものである。実施例３大量のＫｌｅｎｔａｑ−２７８の精製プラスミドｐＷＢ２５４ｂは二重（直列反復）のｔａｃプロモーターとＴ７遺伝子１０リーダー配列、ＡＴＧ開始コドン、グリシンコドン、そしてＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼの２８０−８３２のコドンを持っていて、停止コドンの直列対はｔｒｐ転写末端に続いている。このｐＢＲ３２２−ベースプラスミドベクター（ＪｏｈｎＭａｊｏｒｓからのｐＴａｃ２）はアンピシリン耐性がある。細胞は非常にリッチな培地（下記参照）の上で成長する。細菌性宿主Ｘ７０２９はラクトースオペロンのＸ７４欠失を除いて野生型Ｆ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。培地（Ｍｅｄｉｕｍ）：水１リッター当り、１００ｍｇのｔｉｃａｒｃｉｌｌｉｎ（冷やして加える）、１０ｇのＹ．Ｅ．、２５ｇのトリプトン、１０ｇのグルコース、ＮａＣｌではない１０ＸＭ９塩（４２ｍＭのＮａ₂ＰＯ₄、２２ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄、１９ｍＭのＮＨ₄Ｃｌ）からなる。グルコースと１０ＸＭ９を一緒にしオートクレーブに入れないで、それらを１つづつ分けてオートクレーブに入れ、後で混合する。５ＭのＮａＯＨ（約１ｍｌ）でｐＨ８に調節する。ＯＤ₅₅₀＝１または２で０．１ｍＭのＩＰＴＧを加え、３０℃で充分に振とうする。ＯＤ＝２から８〜１０に達してから半時間毎に次のことを行う。１．ｐＨｓｔｉｃｋｓ５〜１０でｐＨを読み取る。５ＭのＮａＯＨでｐＨ８．５に調節し、ｐＨが８以下に下がったときはいつでも（リッター当り２〜５ｍｌで）ｓｗｉｒｌｉｎｇする。２．ＯＤ₅₅₀を通常１／１０あるいは１／５０希釈液として読み取り、記録する。３．このグルコースの付加は、任意であり、必ずしも何らかの価値のあるものではない（この時期にこの問題の評価は不十分である）。グルコースｓｔｉｃｋでグルコースレベルを読み、もしレベルが０．２％以下に落ちていたら付加物０．５％（５０％の１０ｍｌ）を加える。もし、その添加が遅れるなら、細胞は最後のｐＨ調節後一晩中３０℃で振とうすることができる。代わりに、もしそれらが数時間で充分に成長しないならば、冷たい室内それらを置いておく。細胞は、例えばＧＳ３ローターにて８ｋｒｐｍで８分間遠心分離することで濃縮する。上澄みを洗い流し、同じペレット上にゆっくりした回転で培養液を加える。細胞の破壊と溶解（Ｌｙｓｉｓ）：パックした細胞のｇ重量の２倍に等しいＴＭＮバッファー（５０ｍＭのトリス −ＨＣｌｐＨ８．５５、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１６ｍＭの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄）のミリリッターに細胞を再懸濁する。細胞懸濁液の各３００ｍｌに６０ｍｇのリソチームを加え、１５分間時々ｓｗｉｒｌｉｎｇしながら５〜１０℃で細胞を培養する。それから、ＮＰ４０あるいはＴｒｉｔｏｎＸ１００を０．１％、Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％、各々に１０％溶液の１／１００容積付加の形で加える。それから細胞懸濁液を煮沸水浴中でｓｗｉｒｌｉｎｇしながら急速に８０℃まで加熱し、細胞（素早く抽出物となる）を２０分間、８０〜８１℃に維持する。温度を測定するために細胞内にきれいな温度計を用いる。フラスコの口縁まで一様に十分な熱処理が得られるようにするために、フラスコや浴は確実に覆うべきである。この処理の後、少量の酵素を除いた殆どを不活性とすることを期待して、抽出物を３７℃あるいはそれ以下に氷浴で冷却し、それから２ｍｌのプロテアーゼ阻害剤（イソプロパノールに溶かした１００ｍＭのＰＭＳＦ）を加える。この点に進んでから、フラスコや撹拌棒や他のものでの混合、もしくはオートクレーブに入れられていない溶剤を接触させようとしてはいけない。（デタージェントとＢＭＥはオートクレーブ処理できない。ＰＥＩと硫酸アンモニウムもまたオートクレーブ処理されない。）オートクレーブする目的は、微生物汚染を避けるだけでなく、ＤＮＡあるいはヌクレアーゼによる汚染を避けるためである。遠心分離機の容器に分配し２℃で遠心分離する（例えば、ＳｏｒｖａｌＳＳ −３４ローターでは１５ｋｒｐｍで３０分、あるいはＧＳ３ローターでは４ｋｒｐｍで１４時間である）。上澄みはフラクションＩと呼び、ＤＮＡポリメラーゼ活性度に対する測定ができる。高−塩ＰＥＩ沈殿フラクションＩを０．２５ＭのＮａＣｌ（リッター当り１４．６ｇ加える）に溶かしたのち、５％のポリミン−Ｐ（ＰＥＩ，ポリエチレン−イミン，Ｓｉｇｍａ）を核酸を沈殿させるために氷上で撹拌しながら滴状に加える。十分なポリミン−Ｐが加えられたことを確認するために、そして必要最少量以上の添加を避けるために、ポリミン−Ｐの一滴の添加によって遠心分離した抽出物１／２ｍｌをテストし、多量の沈殿物が生ずる時は、大部分の抽出物に多くのポリミン−Ｐを加え、よく混合して再テストする。抽出物の試験結果を汚すことなく容器に戻す。十分にＰＥＩが加えられたことを確認するために、遠心分離物３ｍｌと１／２ｍｌアリコート中に上澄みをアリコートする。５％のＰＥＩを０、２、４、６あるいは１０ｕｌ加える。氷の上において振とうし、そして冷たい中で遠心分離した。これらのアリコート上澄みの１５ｕｌを臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）を含むアガロースゲル上に載せ、青色素が２ｃｍに及ぶまで電気泳動する。上澄みにＤＮＡあるいはＲＮＡを検出するためにＵＶ光ボックス上でゲルを詳しく調べる。大部分の抽出物に対しては、アガロースゲルテストによる全てのＤＮＡを除去するために最少必要量以上の過剰の５％ＰＥＩを約１／１００容積（即ち、３００ｍｌの抽出物に対して２〜３ｍｌ）使用する。少なくとも１５分冷中で撹拌する。それから抽出物の遠心分離を行って大部分の核酸を除去する。上澄みはペレットの少しの痕跡も避けるように保つ。伝導度が下がるまでＫＴＡバッファーでＰＥＩ上澄みを希釈する、あるいは２２ｍＭの硫酸アンモニウムを加えることでＫＴＡバッファーの伝導度を低下させる。（ＫＴＡに純正の２２ｍＭＡ．Ｓ．の類似の希釈液に比べて１／４０の希釈液を加えて伝導度をチェックする）。通常これは約５倍の希釈液である。Ｂｉｏ−Ｒｅｘ７０（Ｊｏｙｃｅ＆Ｇｒｉｎｄｌｅｙで用いた）（Ｊｏｙｃｅ，Ｃ．Ｍ．＆Ｇｒｉｎｄｌｅｙ，Ｎ．Ｄ．Ｅ．（１９８３）Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼの多くのタンパク質分解フラグメントを過剰に生産するプラスミド構築、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０，１８３０ −１８３４）によるクロマトグラフィーは不成功（結合しない）であるが、それなしでは次のカラム（ヘパリンアガロース）が効率的に作用しないであろうから止むを得ない。我々はＢｉｏ−ＲＥＸ７０ステップの重要な作用が幾つかのタンパク質をよく除去することができるけれども、過剰のＰＥＩを全て除去することであると信じている。ＣＭ−セルロースはＢｉｏ−Ｒｅｘ７０に対する代用物ではない。希釈したＰＥＩ上澄みにそれに釣り合うＢｉｏ−Ｒｅｘ７０を通す（１００ｇ細胞当り１０ｍｌ）。ポリメラーゼ活性は流れ通ってしまう。２カラム容積の２２ｍＭＡ．Ｓ．／ＫＴＡでカラムを濯ぐ。我々の手順は、Ｂｉｏ−ＲＥＸ７０をカラムに直接流すようにして次のようなヘパリンアガロースカラムをセットアップする。ヘパリンアガロースクロマトグラフィー（室温、フラクションをそれらが離れるように氷上に置く）。ヘパリンアガロース（シグマ；細胞の１００ｇ当り１０ｍｌ〔これはヘパリンアガロースを非常に少なくできる〕。）の上にＢｉｏ−Ｒｅｘをゆっくり流し入れて充填する。ＫＴＡ＋２２ｍＭＡ．Ｓ．の数カラム容積分、それからＫＴＡ＋６３％グリセロール＋１１ｍＭＡ．Ｓ．の３カラム容積分で洗浄する、それからＫＴＡ＋６３％グリセロール＋２２２ｍＭＡ．Ｓ．＋０．５％Ｔｈｅｓｉｔ（これは最終溶離のためのＴｈｅｓｉｔである）で純粋な酵素を溶離する。ポリメラーゼ活性あるいはＯＤ₂₈₀／（２２２ｍＭでスタート後１つのカラム容積の２／３でスタートする、それはおよそ２カラム容積分の広さである）のピークをプールする。−２０℃でプールを貯蔵する。貯蔵バッファーは混成物であり、僅かな変異体である、即ち、Ｐｅｒｋｉｎ− ＦｌｍｅｒＣｅｔｕｓにより推薦されるＡｍｐｌｉＴａｑ貯蔵バッファー、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍが用いたＴａｇ貯蔵バッファー：５０％グリセロール（ｖ／ｖ；６３％ｗ／ｖ），２２２ｍＭ硫酸アンモニウム（ベンチ強さサンプルに対して約５０ｍＭに希釈）、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ８．５５、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭメルカプトエタノール、０．５％Ｔｈｅｓｉｔ）である。このＴｈｅｓｉｔは幾つかの厚さと曇りを−１０℃以下で引き起こす。これは害を引き起こすことはないと思われるが、我々は使用に当たってアリコーティングする前に氷の上で０℃で酵素を温めることを提案する。Ｔｈｅｓｉｔは２者択一として考えられ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，０．５％Ｔｗｅｅｎ２０の化合物に置き換える。凍結は酵素の活動を阻止することを我々は折々に報告した。問題はこの点にある。この問題は現在研究されている。−８０℃での貯蔵（液体窒素で急冷後）はテストされつつあり、そして見込みのあるように思われるが、１回より多い凍結融解サイクルは数回の酵素調製で有害であった。７リッター（１００ｇ細胞）からの酵素の最終収率は、ｍｌ当り（４ｘベンチ強さ）１２０，０００ユニットの濃度で２８ｍｌであった。１／４ｕｌのベンチ強さの酵素は１００μｌ反応において２ｋｂスパンのＤＮＡのＰＣＲを支持する。鋳型は５〜１０ｎｇのプラスミドＤＮＡである。各サイクルは１ｍｉｎ９８℃、１ｍｉｎ６５℃、６ｍｉｎ７２℃である。サイクル数は１６〜２０である。より小さい酵素はより小径の生成物（５００ｂｐに対して１／８ｕｌ）のために必要であり、より大きい酵素はより大きな生成物（５ｋｂに対して１ｕｌ）に必要である。ＫＴＡバッファー１リッター当り２０ｍＭトリス８．５５１０ｍｌの２Ｍ１０ｍＭＢＭＥ０．７ｍｌニート１０％ｗ／ｖグリセロール１００ｇ０．１ｍＭＥＤＴＡ０．２ｍｌの０．５Ｍ０．１％ｗ／ｖＴｈｅｓｉｔ１０ｍｌの１０％ラフなＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ分析１ＸＰＣ２バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８．５５、２．５ｍＭＭｇＣｌ₂、１６ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１００ｕｇ／ｍｌＢＳＡ）２００〜２５０ｕｇ／ｍｌ活性化したサーモン（ｓａｌｍｏｎ）スペルム（ｓｐｅｒｍ）ＤＮＡ４０ｕＭの各ｄＮＴＰ＋ｍｌ当り１０〜５０ｕＣｉα−³²Ｐ−ｄＡＴＰ氷の上の２５ｕｌの分析混合物に未希釈のあるいは８ｕｌの１ＸＰＣ２バッファー（あるいはその１／５または１／２５希釈物）で希釈した０．２ｕｌの酵素断片を加える。標準ＫｌｅｎｔａｑあるいはＡｍｐｌｉｔａｑ、ゼロ酵素とインプットする全試料を準備する。７２℃で１０分インキュベートし、それから冷やす。濾紙上に５あるいは８ｕｌスポットし、５〜１０分で２回５％ＴＣＡ，１％ＰＰで洗う。若し、数枚の紙を用いる時は、セレンコフ（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ）放射線あるいはハンドモニターでそれぞれカウントする。若し、１枚の三ＭＭ紙を使用したときは、６０′でオートラジオグラフする。２ｋｂ生成物を得るためのＰＣＲ分析５０ｎｇのプラスミドｐＬｃ（とうもろこし（ｍａｉｚｅ）からのＲ色対照ｃＤＮＡのクローン（ｃｌｏｎｅ）ＰＮＡＳ８６：７０９２；サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４７：４４９））を含む１ｍｌのＰＣＲ反応物を調合し、プライマーＬｃ５（配列番号：１１）およびＬｃ３（配列番号：１２）、ＰＣ２バッファーと２００ｕＭのｄＮＴＰのそれぞれ２００ｐモルを加える、しかし酵素は加えない。チューブの１つのなかに１００ｕｌを、そして残りの８〜１０のチューブのなかに５０ｕｌを分配する。チューブの１つにＫｒｅｎＴａｑのファイナルプール（ｆｉｎａｌｐｏｏｌ）１ｕｌを加え混合する。それから、５０ｕｌの２つのチューブを切り離し、それを混合し、２段階で減少しつつある量の酵素を加える。各５０ｕｌの反応物に鉱油、スピンの１滴を加えて蓋をし、そして２′９５° 、２′６５°、５′７２°でＰＣＲ１６をサイクルする。最終的なＫｌｅｎｔａｑ−２７８酵素のベンチ長さ２２２ｍＭの硫酸アンモニウムを含む６３％グリセロール／ＫＴＡ（．５％Ｔｈｅｓｉｔ）バッファーを用いながら、ＰＣＲによる２ｋｂスパンの増幅をその１／４ｕｌを触媒として用いてプールを慎重に希釈する。硫酸アンモニウム濃度は５０ｍＭ以下に減少させない。貯蔵は−２０℃である。実施例４ＤＮＡ増幅図３にレポートしたように、ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ）（先行技術、ＤＮＡポリメラーゼ）とＫｌｅｎｔａｑ−２７８を用いて導かれた２ｋｂのＤＮＡ生成物を作るためにＰＣＲ増幅を測定する。ポリメラーゼの耐熱性をテストするために、温度を上げ、ＰＣＲ増幅反応のＤＮＡ変性段階を等級別にした濃度のＤＮＡポリメラーゼを用いながら、それぞれ２分で９７℃、９８℃、９９℃で導いた。増幅手段は、Ｓａｉｋｉｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：４８７，１９８８によって概要が述べられた増幅する核酸配列のための、おおよそ次のようなプロトコルを用いた。１００ｎｇのプラスミドｐＬＣ，プライマーＬｃ５（配列番号：１１）とＬｃ３（配列番号：１２）の夫々２００ｐモル、反応バッファー（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ８．５５、１６ｍＭの硫酸アンモニウム、２．５ｍＭのＭｇＣｌ₂および１５０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ）、２００ｕＭのｄＮＴＰを含有する１ｍｌの反応混合物を準備した。酵素は用いない。反応混合物の１００ｕｌはチューブの中においた。それから、ＡｍｐｌｉＴａｑとＫｌｅｎｔａｑ−２７８の割り切れる数を加え、そしてＰＣＲの２０サイクルを行った（ｕｎｄｅｒｔａｋｅｎ）。図３は実用の耐熱性限界を比較するために行った実験の結果を示すものである。３枚のパネルの間で示される唯一の違いは、２分、変性段階：９７℃、９８℃ 、９９℃の温度である。酵素濃度の範囲は効果的なＰＣＲ触媒活性度の上に小さな効果を検出するために用いた。鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）は１０ｎｇのｐＬｃ（とうもろこしからのＲ色対照ｃＤＮＡのクローン）。ＰＮＡＳ８６：７０９２，サイエンス２４７：４４９））である。プライマーはＬｃ５（配列番号：１１）とＬｃ３（配列番号：１２）である。この反応の他の詳細は実施例３の測定の項に与えられている。この実験において、９８℃がＫｌｅｎＴａｑ−２７８に対して損害が検出されず、なおかつＡＴはこの温度で殆ど完全に不活性になるということを見ることができる。図４に示す実験において、４つの酵素（ＡＴ，ＫｌｅｎＴａｑ−２７８，ＳＴ，ＫｌｅｎＴａｑ−２９１）のそれぞれの９８℃での耐熱性のテストを行った。それぞれを２つのファクターによって異なる２つの濃度の対（ペア）にしてテストした。現実の酵素調製の容量はｕｌにて上記各レーンに示した。使用した量は、活性度において２倍のドロップオフ（ｄｒｏｐ−ｏｆｆ）を検出したように、前以て滴定で調節した（実施例３と図３における凡例で２ｋｂのＰＣＲ測定のために記述したようにして導いた。）９５℃で対照ＰＣＲを機能させるために多量のＳＴを必要とする。前述のこの実験の試み（データは示していない）は、ＳＴの１／４量のみを用いた（ＳＴはＫＴ−２９１とＫＴ−２７８を比較した同等標準ＤＮＡポリメラーゼ導入ユニットである）が、生成物は得られなかった。実施例５単コロニーＰＣＲＰＣＲによるシングルＥ．ｃｏｌｉの分析は、クローニングあるいはリクローニング中に所望するＤＮＡフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）の存在および／または配向を決定するための都合のよいスクリーン（ｓｃｒｅｅｎ）である。先行技術において、細菌はそれらがＰＣＲにとって鋳型となるべきプラスミドＤＮＡを解放するために十分に有効なリーゼ（ｌｙｓｅ）でないことが明らかなので、完全なＰＣＲ反応に対して容易に加えることはできない。その代わりとして、そして厄介な全く余分のラベル付きテストチューブを必要とするので、細菌は最初に水で懸濁し、バッファーなしで任意に、しかし推薦された（Ｒｉｇｇｓｅｔａｌ）キレート樹脂の存在下で数分間（１０のような）１００℃に加熱する。それから加熱した細菌懸濁液の１〜１０ｕｌを別の反応容器に加える。それからこのＰＣＲ反応を循環し、普通に分析する。ここに改良は、各ＰＣＲサイクルの変性段階中、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は９８〜９９℃を凌ぐことがあるので、細菌は直接加えることができ、そして完全な（Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８酵素を含んでいる）ＰＣＲ反応にとって都合がよく、それからさらに予備処理することなくＰＣＲサイクリングを開始することができいるということである。普通のＰＣＲサイクリングと唯一異なるのは十分な９８ ℃（２分）あるいは９９℃（１分）の温度がＰＣＲの各変性段階（あるいは少なくとも最初の５〜１０段階）中で用いられることである。図５における実験では全２５サイクルに対して９８℃で２分を使用し、そしてこの方法では１０′１００℃の分離処理を利用するこれまでの方法よりもっと強靭で確実に区別した生成物バンドが与えられることを示している。この改良はＡＴ酵素が９８℃（図３および４に示すように）で不活性化されるので、ＡＴ酵素と一緒には行うことはできない。図５はコロニーＰＣＲの標準９５℃の温度と比較した９８℃での変性段階の利益の実例を示すアガロースゲルの写真である。レーン１と３はＰＣＲ反応への付加の前に１００℃で１０分間、蒸留した水で細菌の先行技術の予備処理を行ったものである。レーン２と４は、都合よくこの段階を免除して同じ量の細菌懸濁液（約２〜４Ｘ１０⁶細胞、しかし同一容量の同じ細菌懸濁液）を完全なＰＣＲ反応（バッファー、トリ燐酸塩、プライマーそして酵素ＫｌｅｎＴａｑ−２７８）に単に導入したものである。レーン１と２は標準９５℃で使用し、レーン３と４は新たに可能な９８℃変性／細胞破壊温度を用いた。サイクル条件は２５サイクルに対して９８℃あるいは９５℃で２分、６５℃で２分、７２℃で５′である。プライマーはＫＴ２（３７ｍｅｒＧＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＣＴＧＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＡＧＧＧＧＧＡ）とＫｌｅｎＴａｑ−３２（図１参照）を使用した。細菌細胞はプラスミドｐＷＢ３１９を含むＸ７０２９、ＫｌｅｎＴａｑ−２７８に対する遺伝子のコーディング域を含む広い宿主範囲のプラスミドを用いた。レーン４は最も都合のよい、最も効率のよい方法であって、ＫｌｅｎＴａｑ− ２７８の新しい安定性を利用するものである。実施例６長いＤＮＡターゲットの効率的で適格なＰＣＲ増幅：（ＰａｒｔＡ）上式（ＫｌｅｎＴａｑ−ＬＡ）の好ましい具体例：貯蔵したバッファーに精製した酵素、２．５ｕ．／ｕｌで１ｕｌのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、２５ｕ．／ｕｌで６４ｕｌのＫｌｅｎＴａｑ−２７８を入れてスタートする。貯蔵は−２０℃である。大量のＰｆｕは幾らかのＰＣＲ増幅に対して損害を生じ、幾らかに対しては同等であり、そして幾らかに対しては有益である。Ｐｆｕの最適レベルのテストについて、ＫｌｅｎＴａｑ−２７８とともに幾つかの反応を果たすには、左から右へ７５ｕｌ、２５ｕｌ、２５ｕｌの量の割り切れる数のＰｆｕが必要である。そして多くの付加において所望されるのは２５ｕｌの割り切れる数である。それから、３／８ｕｌのＰｆｕ（１００ｕｌ当り０．５ｕｌで当量−これは要望されるところのほぼ最大である）が最も左の７５ｕｌ反応物に加えられ、混合される。引き続き、２倍の希釈液がチューブの列に沿って左から右に２５ｕｌ＋２５ｕｌのように作られ、ＫｌｅｎＴａｑ−２７８のみの対照とする最後のものにはＰｆｕは加えない。また、Ｐｆｕのみの１／２あるいは１ｕｌ（１００ｕｌ当り）も行う。反応バッファーは上記のようなＰＣ２であって、各２００ｕＭのｄＮＴＰで補足され、そして８００ｕＭのＭｇＣｌ₂（トータルＭ⁺⁺３．３ｍＭ）、反応容量の１００ｕｌ当り各プライマーＭＢＬ（配列番号：７）とＭＢＲ（配列番号：８）の２０ｐモルと損なわれていないファージλｐｌａｃ５の３０ｎｇを加える。反応容量の１００ｕｌ当り、１あるいは１／２ｕｌのＫＴＬＡが酵素の効率的なレベルである。適当なＰＣＲサイクリング条件は２つの温度である：それは２０サイクルに対し、９４℃で２０秒、７０℃で１１分である。２つの温度を含む交互のサイクリング条件９８℃で１分と６５℃で１０分をＰＣＲに適用した。臭化エチジウムで着色することによって生成物分析のためにアガロースゲルの上に１０〜１６ｕｌを入れた。他の詳細と変異は図６を参照されたい。鋳型はλｐｌａｃ５であり、これはＥ．ｃｏｌｉゲノムのｌａｃオペロン領域の部分に運ばれる。３０ｎｇのＤＮＡは反応容量の各１００ｕｌに含まれていて、そっくりファージ粒子として導入される。プライマーは野生型ラムダＤＮＡと同族体であり、ｌａｃＤＮＡではなくλＤＮＡを拡大する。プライマーＭＢＬＮｏ．８７５７（５’ヌクレオチド組合わせ塩基対２７９１４のλＤＮＡ）はＧＣＴＴＡＴＣＴＧＣＴＴＣＴＣＡＴＡＧＡＧＴＣＴＴＧＣ（配列番号：７）である。プライマーＭＢＲＮｏ．８８３５（５’ヌクレオチド組合わせｂｐ３４５７０のλＤＮＡ）はＡＴＡＡＣＧＡＴＣＡＴＡＴＡＣＡＴＧＧＴＴＣＴＣＴＣＣ（配列番号：８）である。従って増幅した生成物の大きさは６６５７ｂｐであると断定される。図６Ａと６Ｂに示すように、各ＤＮＡポリメラーゼ酵素（ＫｌｅｎＴａｑ−２７８あるいはＰｆｕ）のみは弱い生成物バンド（幾つかの反応を除いて、Ｐｆｕのきは少しも作用しない時）に対してのみ生ずるが、それ自身触媒の働きをすることができる酵素より２０〜５０倍強い生成物バンドに対しては全て結合を生ずる。図６Ｃの右から２番目のレーンは１ｕｌのＫｌｅｎＴａｑ−２７８（１ユニットに対する割合１／６４０）に対して１／６４ｕｌのＰｆｕの少量を加えることで驚くべき結果を示している。データは示されていないが、１／２００ｕｌ（ユニットに対し１／２０００）のＰｆｕ少量がこの増幅テストの効率の改良に顕著に寄与する。ベント（Ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼは類似の機能性のために１０倍以上の量（しかしまだ少量）が要求される。加うるに、ＰＣＲ反応における有利なそして期待しない特性はＫｌｅｎＴａｑ −ＬＡによる触媒作用が驚くべきことで、決してＰＣＲ生成物バンドに対する前もって観察した強烈で鋭いというほどではない。ある程度までこの増加した収量は撮影した写真の中央のバンド部に暗い領域として明らかにされている。エチジウム蛍光によるこの暗い領域はバンドの外側部分におけるＵＶ吸収によるものと思われ、ポテンシャルＵＶ−活性の蛍光で減少する。このシステムは先行技術からした時、生成物の大きな収量の増加を明白に認めており、そしてこれは生成物の広い汚れを作りだす傾向にあり、そして増幅がこの評価を続けた時、副生物の量を増加させる。実施例７長いＤＮＡターゲットの効率的で適格なＰＣＲ増幅：（ＰａｒｔＢ）８．４ｋｂ、１２．５ｋｂ、１８ｋｂの有効な増幅が図７に描かれた実験によって示された。この実験は、発明の１／６４０ＫｌｅｎＴａｑ−ＬＡ、さらに同等の好ましい具体例の性能表示を拡大したものである。この増幅は８．４〜１５ｋｂの大きさの範囲における大いなる成功であり、１８ｋｂにおいても上首尾を確かめたが１９．７ｋｂの試みに対しては不成功であった。８つの異なるＰＣＲ反応が、この実験において行われた。図７に凡例で示すように、鋳型あるいは鋳型の量あるいはプライマーの対におけるお互いの差異が用いられた。各反応は３つの方法に分けられ、パートＡ，Ｂ，Ｃに別々に循環した。パートＡとＢの間では、この実験は変性相を９４°で３０サイクルに対して２０サイクルの比較を行った。パートＢとＣにおいては、この実験は３０サイクルにおける９３°と９４°の比較を行った。この実験は、反応の１００ｕｌ当り１．３ｕｌのＫｌｅｎｔａｑ−ＬＡ（Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８／Ｐｆｕの比は６４０）を用いた。高酵素が前以ての実験においてゲルを入れることができない大異変の生成物合成が想起されたことから、チャンネル２Ｂと６Ｃにおいてはここで反応生成物が生じるので、ありにも多い酵素を少量とした。発明で用いている長い（ｌｏｎｇ）ＰＣＲの成長の一般に知られている段階では約１０％の時間ではこれは僅かな結果が生じている。条件ＢとＣを比較すると、多少低い変性温度が必要であることは明らかである。これは９４℃で同じような実験で比較した時間と一致しており、長いＰＣＲ生成物の収量は、各サイクルの変性段階で９４℃で２、２０、６０、そして１８０秒において変性時間の増加につれて減少することがわかっている。これらのデータはそれが少なくとも１つの弱点であることを示しており、即ち、反応において最少の耐熱性成分は９４°で不活性となるのである。９４°がＤＮＡポリメラーゼ活性度とこのＤＮＡに損害を与える低い温度であることが知られているので、それは不耐熱性の成分ではないと信じられている。本発明でこの点の別の具体例において、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼは少量の成分として多くの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの３’−エキソヌクレアーゼと置き換えられるが、制限はなく、それは古代細菌株ＥＳ４で知られ、１１４℃以上の温度で成長できるものであり（Ｐｌｅｄｇｅｒ，Ｒ．ＪおよびＢａｒｏｓｓ，Ｊ．Ａ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３７（１９９１）、その最大成長温度はＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（１０３℃；Ｂｌｕｍｅｎｔａｌｓ，Ｉ．Ｉ．ｅｔａｌ．（１９９０）ＡｎｎａｌｓｏｆｔｈｅＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５８９：３０１−３１４．）のそれを越えるものである。図７の実験において、１５ｋｂバンドの最終の強さは、類似サイズのバンドで３０サイクルにおいてＫａｉｎｚｅｅｔａｌ上記が得た収量および類似のλ ＤＮＡ鋳型量に２０サイクルのみにおけるものを組み合わせたものである。これは発明で用意した改良した効率の物差しであり、そしてさらなる結果は、３０サイクルで発明が触媒とした収量が３０サイクルでこれらの人達が報告した収量を大きく越えるものである。この２つの方法の効率を測定しての正確な量はまだわからないが、図７の検査はＫａｉｎｚｅｅｔａｉが公にした数量に比べると、１５ｋｂフラグメントの収量は約１００倍高いと見積もられることを示している。これはＰＣＲ拡張のおよそ２倍の効率に対応する。実施例８長いＤＮＡターゲットの効率的で適格なＰＣＲ増幅：（ＰａｒｔＣ）材料と方法ＤＮＡポリメラーゼ。ＤＮＡポリメラーゼ開口（Ｖｅｎｔ）と深部開口（ＤｅｅｐＶｅｎｔ）は新しい英国の生化学研究所から供給されている。ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼとそのエキソ突然変異体はＳｔｒａｔａｇｅｎｅから２．５ユニット／ｕｌで供給されている。Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８はＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＷＭＢ，未公開）のＮ−末端欠失変異型である。この欠失終点はＫｌｅｎｔａｑ５（１０）とＳｔｏｆｆｅｌフラグメント（３）のそれとの間である。精製したＫｌｅｎｔａｑ−２７８は２５〜３５ユニット／ｕｌ（約０．７ｕｇ／ｕｌのタンパク質濃度）で抗体ペプタイド、セントルイス、ＭＯ，ＵＳＡから供給されている。１ユニットのＤＮＡポリメラーゼ活性度は７２℃で３０分で１０ｎモルのヌクレオチドに導入され、鋳型として活性化した（部分的に退化した）子牛の胸腺ＤＮＡが利用されている。活性化した子牛の胸腺ＤＮＡは多少はっきりしない基質であり、構造上ＰＣＲ反応基質とは異なっている。この分析は上のＫｌｅｎｔａｑ−２７８の貯蔵濃度にセットしてＰＣＲ−塩基対を測定する一定した手順を避けた：６５℃で７分のアニーリング／伸長を含むサイクリング条件で、１０ｎｇのプラスミド基質から２ｋｂ標的スパンの増幅を触媒する（しかし、１２ｕｌより少ないことが効率的）のに０．２５ｕｌが効率的であるので、貯蔵しているＫｌｅｎｔａｑ−２７８の濃度を調節した。１５／１６ｕｌのＫｌｅｎｔａｑ−２７８＋１／１６ｕｌのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの混合物はＫｌｅｎｔａｑＬＡ−１６と呼ばれている。アガロースゲルの電気泳動は装填する色素中にグリセロールに代えて３％のフィコルと２〜３ｖ／ｃｍの１ＸＧＧＢ（ＴＥＡ）バッファー〔４０ｍＭのトリス酢酸塩ｐＨ８．３、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．２ｍＭのＥＤＴＡ〕に０．７％〜１％のアガロースが使用される。図１１は４秒のスイッチング時間で１％のアガロースパルス型ＣＨＥＦ（１１）を使用した。各図における標準ＤＮＡフラグメントサイズはキロベース（ｋｂ）において２３．１、９．４、６．６、４．４２．３、２．０、そして０．５６である。また、図１１と１２はλｐｌａｃ５標準バンドの全長は４８６４５ｂｐであった。全アガロースゲルを注ぎあるいは０．５ｕｇ／ｍｌの臭化エチジウムにて着色し、そしてＵＶ光の下で写真（３５ｍｍＡＳＡ４００，白黒フィルム）かビデオグラフ（アルファＩｎｎｏｔｅｃｈあるいはＳｔｒａｔａｇｅｎｅＥａｇｌｅＥｙｅ）に撮った。ゲル写真を印刷したところ、図７と１０の左半分は右半分より５０％露光が少なかった。表１と配列表に載せたＤＮＡプライマー。 λＤＮＡ鋳型。Ｓ．Ｐｈａｄｎｉｓからの贈り物であるλｖａｃＡは蝸牛状のｐｙｌｏｒｉＤＮＡの細胞傷害遺伝子領域のλＥＭＢＬ４−ベクトルクローンである。このＤＮＡは抽出して凍結貯蔵される。他のファージ鋳型ＤＮＡｓλｐｌａｃ５（１２）とλＫ１３８（１３）はＣｓＣｌの平衡遠心分離によって精製されたそのままのファージ粒子として加えられ、透析され、そして１ＸＰＣ２バッファーにて希釈される。長くそして正確なＰＣＲ。２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ２５℃のｐＨ８．５５、１５０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、１６ｍＭの硫酸アンモニウム、３．５ｍＭのＭｇＣｌ₂各ｄＮＴＰよりなるＰＣ２反応バッファー（１０）。上記の２８ｋｂ（ａｔ３５ｋｂ）を成功させるために、２５℃で水に２０ｍＭのみのトリス−ＨＣｌ成分を加えて測定したｐＨ９．１に対応させるべく、１．５ｕｌの２Ｍのトリスベースを各々の反応液に加えた。反応に有害であるものはｐＨ探査で接触させ、そこでｐＨを分離アリコートのみについて測定し、２５℃で最終反応物はｐＨ８．７６であった。反応容量の各１００ｕｌには各プライマー２０ｐモルを含んでおり、そして０．１〜１０ｎｇのファージＤＮＡ鋳型を含んでいる。夫々に２０ｋｂ下または２０ｋｂ以上で０．８あるいは１．２ｕｌのＫｌｅｎｔａｑＬＡ−１６を加えた。チューブ当りの反応容量は３３〜５０ｕｌであり、プラスチックテストチューブの薄壁（ＰＧＣあるいはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）に４０ｕｌの鉱油を加えた。ＰＣＲ反応はファージ粒子を引き裂くために、そしてプライマー同族体を完成するためのλ付着末端の充満を認めるために６８〜７２℃で５分の前保温（ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）を必要とする末端λのプライマーを利用している。最適のサイクリング条件は、複合のブロック器具（ロボサイクラー、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で表１に示す範囲を越えて標的長さに依存しながら、サイクル当り９９°で３０秒、６７°で３０秒そして６８°で１１〜２４分で段取りした。第２の最良サイクラーはオムニゲン（ＨｙｂＡｉｄ）で類似のアニーリング／拡張時間に対してサイクル当り９５°で２秒でチューブ管理の下で段取りした。別の状態がなければ、ここでの実験の全ては２４サイクルを用いて記録した。サイクリング温度と時間、熱サイクラー機、厚くそして薄い壁を有するチューブ等のような条件の比較結果を記録するために、反応物を１００ｕｌとして調合し、それからＰＣＲサイクリングに委ねる前に同一の３３ｕｌのアリコート中で分離した。表１に対する凡例整数ベース対で生成物の大きさはＧｅｎｂａｎｋ受入番号Ｊ０２４５９と参考文献（２１）に記録された配列とλとλｐｌａｃ５の構造から予示されたものである。ｋｂの小数点による生成物サイズは、それらの生成物とλＨ３を標準標識とするλ＋ＨｉｎｄIIIとの比較によって決定される。プライマーの配列は配列表に与えられている。メガプライマーはＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（１４）のＣｒｙＶＩＣＰとしてコーディングされる遺伝子のＥｃｏＲＩサイトとＢａｍＨ１との間の領域に対する同類のゲルー純化した３８４ｂｐＰＣＲ生成物ＤＮＡからなり、そしてこれらの制限サイトを除去するためにプライマー修飾した。図１０おけるＰＣＲ反応は、メガプライマー（３９９ｎｇ）、プライマーＢｔＶ５そしてＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株ＮＲＤ１２（１５）からの２０ｎｇのゲノミック（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡそして上記図９の記載に示されている酵素を夫々使用している。サイクリング条件は２０サイクルで９５ °で３０秒、６０°で７分である。ＨｉｎｄIII消化作用。未分別、全ＰＣＲ反応は１／１０容量の１０ＸＮａＴＭＳ（１Ｘ＝５０ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭのトリスーＨＣｌｐＨ７．７，１０ｍＭのＭｇＣｌ₂，１０ｍＭのメルカプトエタノール）と２ｕｌ（１０ユニット）の制限酵素ＨｉｎｄIII，そして５５℃で９０分のインキュベートを行った。エキソー（ｅｘｏ−）Ｐｆｕのテスト。各１００ｕｌの反応（４０ｕｌのオイルの下で３３ｕｌとしてインキュベートした）は、１ｕｌのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（２．５ｕ．）のみを含む反応６を除いて、純化したファージ粒子として２ｎｇのλｐｌａｃ５ＤＮＡ、プライマーＭＢＬ−１．７そしてＭＢＲの各２０ｐモル、反応バッファーＰＣ２および１ｕｌのＫｌｅｎｔａｑ−２７８（０．７ｕｇ）を含んでいる。他の詳細は図１２の記述にある。温度条件は９４°で２秒、７０°で１１分の２４サイクルである。本発明のＤＮＡポリメラーゼ混合物を導く発見は、ＰＣＲに不適当な組み合わせであるＡ−Ａ塩基対でその３’末端を持つプライマーを利用する試みの中から作られたものである。事実プライマーはそれ自身ＰＣＲ生成物”メガプライマー ”の３８４ｂｐであり、そして不適当な組み合わせＡはＤＮＡポリメラーゼ（１６）にふつう非−鋳型末端トランスフェラーゼ活性度を有するＫｌｅｎｔａｑ− ２７８が加えられる。Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８（図９、レーン３）もＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（図９、レーン１および２、そして他の酵素のレベルは示していない）もＰＣＲ−生成物メガプライマーと４２ｍｅｒオリゴヌクレオチドプライマーの間に横たわっている１５００ｂｐ標的の増幅を触媒することはできない。しかしながら、２つの酵素の結合は所望する標的フラグメント（図９、レーン４）の増幅を十分に触媒することはできる。明らかに、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼは敢えて３’Ａ−Ａを除去し、ＰＣＲの各段階を効率的に続行するために、Ｋ１ｅｎｔａｑ−２７８を触媒とすることができる。同じ結果はＰｆｕをベントＤＮＡポリメラーゼで置き換えることで得られた（データは示していない）。私は一般に不適当な組み合わせの３’−末端が少数のｋｂより大きな標的のＰＣＲ中で能率的でないプライマーを延長させられるという仮説をたてた。テストシステムとして私は、種々の標準状況でＡｍｐｌｉｔａｑ，Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８あるいはＰｆｕＤＮＡポリメラーゼによって貧弱にではあるが、拡大して検出しうる６．６ｋｂのλＤＮＡ標的を用いた。１００ｕｌの反応容量当り、１ｕｌのＫｌｅｎｔａｑ−２７８を種々の量のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼと結合し、１／２ｕｌからＰｆｕの１／２００ｕｌまでさげる。Ｐｆｕ群（ｓｔｏｃｋ）（２．５ユニット／ｕｌ）はＫｌｅｎｔａｑ−２７８群（２５〜３０ユニット／ｕｌ）より少なくとも１０倍少ない濃度であるので、実際のテスト比はＤＮＡポリメラーゼユニットに対して１／２０〜１／２０００である。これらのテストの明らかな結果は図６Ｂに示されている。高収量の標的バンドは２つの酵素の結合を全てテストして観察されるが、各酵素の幾つかのレベルはそれ自身弱い検出増幅より多く触媒するため失敗することがある。最も低いレベルのＰｆｕテストでは１／２００ｕｌで僅かな有益な効果を示す。Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８対Ｐｆｕ１の外見の最適の割合は容積にして１６あるいは６４であり、これはＤＮＡポリメラーゼ導入ユニットを基準として約１６０あるいは６４０である。６〜８ｋｂでテストしたとき（データは示していない）、３’−ｅｘｏ^-および３’−ｅｘｏ⁺耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの他の結合もまたＡｍｐｌｉｔａｑ／Ｐｆｕ，Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８／Ｖｅｎｔ，Ｋｌｅｎｔａｑ５（デルタＴａｑ，ＵＳＢ）／Ｐｆｕ，ＳｔｏｆｆｅｌＦｒａｇｍｅｎｔ／Ｐｆｕ，Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８／ＤｅｅｐＶｅｎｔ（我々の第２の選択）、そしてＰｆｕｅｘｏ^-／Ｐｆｕｅｘｏ⁺を含むとき、効果を示した。たとえ、比較的に少ない試験で楽観的に実施したとはいえ、他の結合試験はＫｌｅｎｔａｑ−２７８／Ｐｆｕと同じ効果はなかった。非常に短い加熱段階が好適である。次に私はλ導入ファージ鋳型で８．４〜１８ｋｂのサイズ範囲でＤＮＡ増幅を企てた。我々の早期のサイクリング原案は９５°あるいは９８°で１あるいは２分の変性段階を用いたが、この加熱段階のパラメーターを９３°あるいは９４°で２秒あるいは２０秒に減ずるまで過剰の８．４ｋｂで有用な生成物は得られなかった。９４°で２０、６０、あるいは１８０秒の実験において、８．４ｋｂ生成物はこの加熱段階（データは示していない）の長さを増すことで減少した収量を示した。明らかに、反応の構成成分が耐熱性の限界である。図７は短い２秒を用いての結果を示している。８．４〜１８ｋｂの範囲内において全サイズで幾つかの反応で得られる標的フラグメントは、変性段階でもし３０ＰＣＲサイクルを用いるならば、１５ｋｂで非常に高い生成物収量で得ることができる。また、図７は私が説明できない幾つかの失敗した反応を示している。塊状のエチジウムで試料を汚す（３０サイクル、レーン２）ことで引き起こす失敗モードは特に高酵素レベルでは普通のことである。より長いプライマー。プライマーの長さを２７〜３３に変えると、失敗反応の頻度を非常に減少させることができる。図１０は２７ｍｅｒのプライマーで所望の標的生成物に対して引き起こした失敗において、別に最適の高酵素の条件下でより長い３３ｍｅｒで１２．５、１５および１８ｋｂで増幅すると、信頼度を改良できることを示している。この結果はプライマー長さの広範な調査を示すものではなく、そして以下の改良で繰り返されるものでもない。そのため、長いＰＣＲとして留まるプライマー長さの最適条件を決めるべきである。図１１に分析した増幅の幾つかは、真の末端λから３６ｍｅｒのプライマーを利用したものである。６８〜７２°（２２）で２〜５分の前保温はファージ粒子から鋳型ＤＮＡを解放するため、そして鋳型同族体を完成するために接着端部のλにプライマーλ Ｌ３６とλＲ３６を満たすために必要である。急速サイクリング。薄い壁面のチューブに対する変化は、より低い熱容量とより多い熱伝導効率を持たせることで更に反応を改良できる。図１１はＤＮＡスパン６−２６サイズの増幅を成功させるＣＨＥＦｐｕｌｓｅ−ｆｉｅｌｄアガロースゲル分析を示す。２８ｋｂの標的はオムニゲン熱サイクラー（データは示していない）で増幅しないが、ロボサイクラーを用いたときは増幅が現れる（図１２、レーン２）。熱的サイクラーの幾つかの型を用いたところ、すべては最適化できないが、幾つかは長いＰＣＲとして好ましい。熱サイクラーの様々なモデルが使用されており、そして全てが楽観的ではないが、幾つかは長いＰＣＲに対して好ましい。上記に記した薄壁チューブの有用性から断定できるように、成功は熱サイクラーのデザインで決まる温度変化の高いスピードと積極的に相互関係があると思われる。ロボサイクラーは塊から塊へチューブを運動することによって急速な温度変化をなし遂げるのであり、そしてサーミスター温度探針の指示で観察するもので、僅か５秒で反応温度は９３〜９５°まで上がり、変性条件下で（９９°ブロックで３０秒）、急速前（３０秒以内）６８°反応を返す、のように使用した。より高いｐＨ。現在の記録３５ｋｂ（図１２、レーン３）はｐＨが上がると増幅性のみである。より高いｐＨの予備調査を実施し（データは示していない）、ｐＨ８．８〜９．２で３５ｋｂバンドの外見でみたところ、（上記）方法で述べたように９．１が最適であるという結果を得た。さらに３５ｋｂ生成物の高収量に対する改良では２４分まで延長時間を長くすることで達成された。より高いｐＨであるほかに、長いＰＣＲ手順はこれらの楽観的な８．４ｋｂからバッファー条件の変化からは未だ何らの潜在利益も実現していない。２０ｋｂｓ以上の標的にとって延長時間は２０分を越えることが好ましく、そして延長温度は６０℃以下が好ましい。ＰＣＲ生成物の同一性。図７、１０そして１１でわかるように、大きなＤＮＡ生成物の成功の流動性は表１に予言した使用したプライマーの既知のマップポジションに一致している。未純化の２８そして３５ｋｂ生成物（図１２、レーン６と７）のＨｉｎｄIII 制限消化酵素はλ（２３ｋｂ）の左腕と２．３ｋｂバンドの両方から期待された結果で、そして右ＰＣＲプライマーで末端化した予想されるバンドである：２８ｋｂから４４７ｂｐ（やっと目で見える）の生成物と２８ｋｂから７３３１ｂＰの生成物。エキソヌクレアーゼ突然変異体。３’−エキソヌクレアーゼ活性度において欠陥のあるＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの有用な突然変異体をテストした。図１３はＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの３’−ｅｘｏ^-突然変異体が長いＤＮＡ標的の効果的な増幅を増進することに失敗したことを示している。これはこのサイズ範囲内で３’−エキソヌクレアーゼ活性度がＰＣＲ増幅の効率化のために重要であるという我々の仮説を支持している。忠実度テスト。３’−エキソヌクレアーゼの生物学的目的から、忠実に高複製するためのミスマッチ塩基対が編集されており、、２つの選択的マーカー（１０）が側面を接する完全なｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）遺伝子の増幅と分子クローニングを含むアッセイを用いて我々はＰＣＲ生成物の忠実度をテストした。これまでにＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（２）で触媒されたＰＣＲ増幅の最高の忠実度を報告した。表２はＫｌｅｎｔａｑ−２７８とＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの６４０：１混合物で増幅した生成物の忠実度が、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼのみが得られるという、各々が１６サイクルのＰＣＲを用いた時、少なくとも釣り合っていることを示している。我々のＫｌｅｎｔａｑ−ＬＡ（長くて正確なＫｌｅｎＴａｑ）のような酵素混合物の指摘は、高い忠実度の性能を跳ね返すものである。（ａ）Ｋｌｅｎｔａｑ⁵は参考文献１０に述べられたＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端欠失である。（ｂ）参考文献１０の式１はｂｐ当りの誤差を解きあかすために次のように再配列したものであって：Ｘ＝−（１ｎ（２Ｆ^(1/m-1)−１））／１０００、でここでＸはｂｐ当り組み込まれる誤差、１０００はｌａｃＺ遺伝子（１０）における有効標的サイズであり、Ｆは青コロニーの分別、そしてｍは有効サイクル数である。（ｃ）参考文献１０におけるように有効サイクル数は現実の反応効率に反映するマシンサイクルより少なく算出されるが、しかし組合わせ増幅から計算した最小値より高い。生成物鎖の不完全合成によるべき鎖ロスは理想的な増幅効率より低い予想される。このため、成功（失敗なし）生成物分子は計算した最少複製数より少ないと判断される。ＫＴＬＡ−６４（容量でＫｌｅｎｔａｑ−２７８：Ｐｆｕ：：６４：１）はその反応が生成物の比較レベルで計算して１０倍の欠失ＤＮＡ（１．５ｎｇｖｓ．１５ｎｇプラスミドｐＷＢ３０５）で開始されるので、より高い有効サイクル数が課されている。討議ＰＣＲ増幅のための先の長さ制限はミスマッチド塩基対の結合サイトで延長の低効率によって生じると主張されている。けれどもそれはこれらのミスマッチのためのキュアーが３’−（校正）−エキソヌクレアーゼとともに酵素に用いられると思われている。私はＰｆｕとベントＤＮＡポリメラーゼが触媒として用いられるとき、それらの失敗は、特に要求される長い合成時間の間中、そして最適な高いＤＮＡポリメラーゼレベルでそれらの３’−エキソヌクレアーゼによるＰＣＲプライマーの減成によるものであると信じている。明らかに、低レベルの３’ −エキソヌクレアーゼはＫｌｅｎｔａｑ−２７８と増幅を進めるミスマッチの除去のために十分で最適である。それは最適な低いレベルの３’−エキソヌクレアーゼが有効に、便利にそして柔軟に混合と希釈によってセットすることができることを表している。好ましくはｅｘｏ^-／ｅｘｏ⁺酵素の割合が高いことである。もし、等レベルの２つのタイプの酵素が用いられるならば、（あるいはＥ２構成成分が過剰にあるところの）あるいはもしｅｘｏ^-／ｅｘｏ⁺が４あるいはそれ以下であるならば、たとえ下記で討議する最適のサイクリング状況であっても、長いＰＣＲの有効性は全く存在しないかあるいは大いに減少する。ある応用のために、ＰＣＲの熱変性段階の長さと温度を最小に保つことが重要である。さらに、増加するｐＨによって得られる改良は僅かに鋳型の除プリンの減少に対応することができる。もし除プリンを減少することができるなら、あるいはもし除プリン位置を迂回するこができるような大多数のＤＮＡポリメラーゼ成分をみつけることができるなら、さらなる改良を得ることができる。短い変性時間が最適であることは分かっており、好ましくは２０秒以下、最も好ましくは５秒あるいはそれ以下で、９５°で反応それ自身３５ｋｂの増幅にとって驚くべき効果である。そうであるから長いＰＣＲ標的が完全に変性するために長い変性時間を要するのである。もしＰＣＲにとって完全な変性が要求され、そしてもしより長いＤＮＡを９５°でほどくためにもっと時間を必要とするなら、要求したほどくための時間は結局、５秒より以上重要となるのである。これは長い変性時間によって生じた増えた除プリンのために増幅性生成物のサイズを限定することができる。これらの増幅は幾つかの異なった標的配列、幾つかのプライマー結合で出来上がったものであり、生成物サイズでλ中にクローンした挿入物の最大サイズの２倍近くである。全ウィルスとプラスミドが長さにおいて３５ｋｂまでアップし、このシステムとともに増幅性となる。この方法はλより非常に複雑なＤＮＡに適用できることが証明され、ゲノミック製図や次にくる応用、ｉｎｖｉｔｒｏ増幅が都合よく、そしてＤＮＡ再配列を避け、そしてｉｎｖｉｖｏクローニングの遺伝子毒性誘惑のために恩恵を証明することができる。上記の見解において、この発明の幾つかの目的が達成され、そして他の有利な結果に達することがわかった。この発明の範囲からはずれることなく、上記の方法と生成物から種々の変化を作り出すことができるので、上記記述に含まれる全ての事柄が例証として説明され、制限を受けるものではない。

【手続補正書】【提出日】１９９８年３月４日【補正内容】 (1) 請求の範囲を別紙のとおり訂正する。 (2) 明細書第８頁２４〜２５行目「後続ＰＣＲ段において」を「後続ＰＣＲ段階において」と訂正する。 (3) 同第１６頁１７〜１８行目「バックボーンがｐＴＡＣ２（ワシントン大学メージャーズ（Ｊ．Ｍａｊｏｒｓ）氏）、」を「バックボーンがｐＴＡＣ２（ワシントン大学のメージャーズ（Ｊ．Ｍａｊｏｒｓ）氏による）、」と訂正する。 (4) 同第２２頁１６行目「６．６〜８．８ｋｂ」を「６．６〜８．４ｋｂ」と訂正する。 (5) 同第２３頁３０行目「８０〜１００部」を「８０〜１０００部」と訂正する。 (6) 同第２４頁１０行目「Ｐｆｕ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ、」を「Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ、」と訂正する。 (7) 同第３１頁２２行目「冷たい室内それら」を「冷たい室内にそれら」と訂正する。 (8) 同第３６頁６行目「ＫｒｅｎＴａｑ」を「ＫｌｅｎＴａｑ」と訂正する。 (9) 同第４０頁１６〜１７行目「Ｐｆｕのきは」を「Ｐｆｕのみは」と訂正する。 (10)同第４１頁２２行目「ありにも多い」を「あまりにも多い」と訂正する。 (11)同第４２頁１７行目「Ｋａｉｎｚｅｅｔａｉ」を「Ｋａｉｎｚｅｅｔａｌ」と訂正する。 (12)同第４２頁２３〜２４行目「ＤＮＡポリメラーゼ開口（Ｖｅｎｔ）と深部開口（ＤｅｅｐＶｅｎｔ）は」を「ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼとＤｅｅｐＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼは」と訂正する。 (13)同第４５頁下から３行目「メガプライマー（３９９ｎｇ）」を「メガプライマー（３００ｎｇ）」と訂正する。 (14)同第５７頁４行目「（Ａ）長さ：３６塩基対」を「（Ａ）長さ：３５塩基対」と訂正する。 (15)添付図面のうち、図３乃至図７を別紙の通り訂正する。 (16)添付図面のうち、図９乃至図１３を別紙の通り訂正する。請求の範囲１．実質的にＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼと同じアミノ酸配列からなるが、前記ＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端２８０アミノ酸残基を欠くアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼをコード化する組換えＤＮＡ配列。２．実質的にＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのそれと同じアミノ酸配列からなり、ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端２８０アミノ酸残基を除くアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼ。３．配列番号：６のアミノ酸配列を有する請求項２に記載のＤＮＡポリメラーゼ。４．プラスミドｐＷＢ２５４ｂに含まれるＤＮＡ配列によってコード化されている請求項２に記載のＤＮＡポリメラーゼ。５．実質的にＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓのＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸２８０−８３１からなるアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼ。６．３′−エキソヌクレアーゼ活性を欠く少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、３′−エキソヌクレアーゼ活性を示す少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとからなる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配合であって、上記３’ −エキソヌクレアーゼ活性を欠く耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの上記３’エキソヌクレアーゼ活性を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ単位比が１対１よりも大きい、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配合。７．３′−エキソヌクレアーゼ活性を欠く少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＫｌｅｎｔａｑ−２７８である請求項６に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配合。８．３′−エキソヌクレアーゼ活性を示す少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓからのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｌｓからのＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ、あるいは前記ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を減少させるか、不活性化させる種々のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼあるいはＴｌｉＤＮＡポリメラーゼからなるグループから選ばれる請求項７に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配合。９．上記配合の上記３’−エキソヌクレアーゼ活性を欠く耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと３’−エキソヌクレアーゼ活性を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、上記３’−エキソヌクレアーゼ活性を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの１単位に対して上記３’−エキソヌクレアーゼ活性を欠く耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを約１０単位から２０００単位の割合で存在させる請求項６に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配合。１０．上記配合の上記３’−エキソヌクレアーゼ活性を欠く耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと３’−エキソヌクレアーゼ活性を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、上記３’−エキソヌクレアーゼ活性を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの１単位に対して上記３’−エキソヌクレアーゼ活性を欠く耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを約１００単位から６００単位の割合で存在させる請求項９に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配合。１１．少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼからなるＤＮＡポリメラーゼの配合であって、野生型形体において、３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈し、かつ、上記少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼの上記３’−エキソヌクレアーゼ活性が上記少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼのその野生型形体における３’− エキソヌクレアーゼ活性の約０．２％から約７％の範囲に低減された温度サイクル型ポリメラーゼ連鎖反応に触媒作用を及ぼすことが出来る少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼからなるＤＮＡポリメラーゼの配合。１２．有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を何ら持たない１またはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼをＥ１とし、有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈する１又はそれ以上のＤＮＡポリメラーゼがＥ２とした場合に、Ｅ１とＥ２からなり、Ｅ１のＥ２に対する量の比がＤＮＡポリメラーゼ単位にして少なくとも約４：１、または、（ｂ）タンパク質の重量にして少なくとも約４：１であるＤＮＡポリメラーゼの配合。１３．Ｅ２がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｅｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種ＧＢ−Ｄ、Ｔ７コリファージ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａあるいはそれらの組み合わせからの遺伝子によってコード化されたＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択され、Ｅ１が、突然変異体、Ｅ２の３’−エキソヌクレアーゼ陰性形体、又は、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ、ＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓまたはＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからの遺伝子によってコード化されたＤＮＡポリメラーゼ等の有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を突然変異していない形体では呈さないＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。１４．Ｅ２がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓからのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼからなり、Ｅ１のＥ２に対する単位比が約１５０から１７０：１の範囲である請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。１５．Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８のＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓＤＮＡポリメラーゼに対する単位比が約１５０から約１７０：１であることを含む請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。１６．Ｋｌｅｎｔａｑ−２９１のＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｌｏｓｕｓＤＮＡポリメラーゼに対する単位比が約１５０から約１７０：１であることを含む請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。１７．Ｅ２がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種ＧＢ−ＤからのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼからなり、Ｅ１のＥ２に対する単位比が約４５０から５００の範囲である請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。１８．野生型又はほぼ無損失のＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓＤＮＡポリメラーゼに対する単位比が約１０から約１５：１であることを含む請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。１９．Ｅ１が逆転写酵素からなる、請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。２０．Ｅ１がＴ７又はＴ３ＤＮＡポリメラーゼの突然変異体或いは化学的修飾からなり、Ｅ２が野生型のＴ７又はＴ３ＤＮＡポリメラーゼからなる、請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。２１．Ｅ１がＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓ又はＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼからなる請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。２２．Ｅ１が有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を何ら持たないＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｅｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ変異型からなり、Ｅ２が野生型のＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｅｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼからなる、請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。２３．各々について異なる特定の配列が増幅される２つの相補鎖を、１つの、１対の、又は、対の混合物をなすオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を、合成に効果的な条件下で各核酸鎖に対して相補的な各プライマーの伸長（エクステンション）生成物の合成に触媒作用を与えるために使用し、また、上記プライマーを各特定配列の異なる鎖に対して十分に相補的になるように選択してそれとハイブリッド形成し、１つのプライマーから合成された伸長生成物が、その補体から分離される際に、同じ又は別に含まれるプライマーを伸長させることによって伸長生成物の相補的な鎖の合成用の鋳型として作用することが出来るようにし、プライマー伸長生成物は、それらが合成されて一本鎖分子を生じた鋳型から分離されて、このようにして生じた一本鎖分子をプライマーで処理し、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を使用してプライマー伸長生成物の合成に有効な条件下で各プライマーの伸長生成物の合成に触媒作用を与え、また、改善点がこのＤＮＡポリメラーゼを請求項６に記載のように配合すること及び上記ＤＮＡポリメラーゼの配合でプライマーエクステンションに触媒作用を及ぼすことを含む、繰り返しサイクル型のポリメラーゼ連鎖反応によって核酸配列を増幅するための方法。２４．各々について異なる特定の配列が増幅される２つの相補鎖を、１つの、１対の、又は、対の混合物をなすオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を、合成に効果的な条件下で各核酸鎖に対して相補的な各プライマーの伸長生成物の合成に触媒作用を与えるために使用し、また、上記プライマーを各特定配列の異なる鎖に対して十分に相補的になるように選択してそれとハイブリッド形成し、１つのプライマーから合成された伸長生成物が、その補体から分離される際に、同じ又は別に含まれるプライマーを伸長させることによって伸長生成物の相補的な鎖の合成用の鋳型として作用することが出来るようにし、プライマー伸長生成物は、それらが合成されて一本鎖分子を生じた鋳型から分離されて、このようにして生じた一本鎖分子をプライマーで処理し、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を使用してプライマー伸長生成物の合成に有効な条件下で各プライマーの伸長生成物の合成に触媒作用を与え、また、改善点がこのＤＮＡポリメラーゼを請求項７に記載のように配合すること及び上記ＤＮＡポリメラーゼの配合でプライマーエクステンションに触媒作用を及ぼすことを含む、繰り返しサイクル型のポリメラーゼ連鎖反応によって核酸配列を増幅するための方法。２５．何らかの繰り返しサイクルに利用されている１つまたはそれ以上のプライマーそのものがＰＣＲ増幅の生成物である、請求項２４に記載の方法。２６．各繰り返しサイクルに変性ステップを更に含み、この変性ステップは反応混合物において約２０秒よりも短い期間を有している、請求項２４に記載の方法。２７．上記変性ステップが反応混合物において約５秒よりも短い期間を有している請求項２６に記載の方法。２８．各々について異なる特定の配列が増幅される２つの相補鎖を、１つの、１対の、又は、対の混合物をなすオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を、合成に効果的な条件下で各核酸鎖に対して相補的な各プライマーの伸長生成物の合成に触媒作用を与えるために使用し、また、上記プライマーを各特定配列の異なる鎖に対して十分に相補的になるように選択してそれとハイブリッド形成し、１つのプライマーから合成された伸長生成物が、その補体から分離される際に、同じ又は別に含まれるプライマーを伸長させることによって伸長生成物の相補的な鎖の合成用の鋳型として作用することが出来るようにし、プライマー伸長生成物は、それらが合成されて一本鎖分子を生じた鋳型から分離されて、このようにして生じた一本鎖分子をプライマーで処理し、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を使用してプライマー伸長生成物の合成に有効な条件下で各プライマーの伸長生成物の合成に触媒作用を与え、また、改善点が、野生型形体において３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈し、かつ、温度サイクル型ポリメラーゼ連鎖反応に触媒作用を与えることが出来る少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼからなるＤＮＡポリメラーゼを配合することを含み、このとき上記少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼの上記３’−エキソヌクレアーゼ活性は、消えてはいないが、上記少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼのその野生型形体における３’−エキソヌクレアーゼ活性の約７％よりも大きくない程度まで低減しており、また、上記ＤＮＡポリメラーゼの配合でプライマーエクステンションに触媒を与えることを含む、繰り返しサイクル型のポリメラーゼ連鎖反応によって核酸配列を増幅するための方法。２９．３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を欠く少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を示す少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとからなる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配合。３０．３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を示す第１の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼからなる組成物を合成プライマー、合成鋳型と混合するステップを含むポリヌクレオチド配列を増幅する方法。３１．（ａ）ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓＤＮＡポリメラーゼ、ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａＤＮＡポリメラーゼ、ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ、そしてＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓＧＢ−ＤＤＮＡポリメラーゼからなる群から選んだ３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を示す第１のＤＮＡポリメラーゼと、（ｂ）ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ、（ｅｘｏ−）ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ、（ｅｘｏ−）ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓＤＮＡポリメラーゼ、そして（ｅｘｏ−）ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓＧＢ−ＤＤＮＡポリメラーゼからなる群から選んだ３′− ５′エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼとからなる組成物を合成プライマー、合成鋳型と混合するステップを含むポリヌクレオチド配列を増幅する方法。３２．上記第１および第２のＤＮＡポリメラーゼが耐熱性である請求項３１に記載の方法。３３．上記第１のＤＮＡポリメラーゼがＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓＤＮＡポリメラーゼである請求項３１に記載の方法。３４．上記第２のＤＮＡポリメラーゼがＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼである請求項３２に記載の方法。３５．上記第２のＤＮＡポリメラーゼがＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼである請求項３３に記載の方法。【図３】【図４】【図５】【図６】【図６】【図７】【図９】【図１０】【図１１】【図１２】【図１３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的にＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼと同じアミノ酸配列からなるが、前記ＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端２８０アミノ酸残基を欠くアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼをコード化する組換えＤＮＡ配列。２．実質的にＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのそれと同じアミノ酸配列からなり、ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端２８０アミノ酸残基を除くアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼ。３．配列番号：６のアミノ酸配列を有する請求項２に記載のＤＮＡポリメラーゼ。４．プラスミドｐＷＢ２５４ｂに含まれるＤＮＡ配列によってコード化されている請求項２に記載のＤＮＡポリメラーゼ。５．実質的にＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓのＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸２８０−８３１からなるアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼ。６．３′−エキソヌクレアーゼ活性を欠く少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む多数成分と、３′−エキソヌクレアーゼ活性を示す少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む少数成分とからなる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配合。７．３′−エキソヌクレアーゼ活性を欠く少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＫｌｅｎｔａｑ−２７８である請求項６に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配合。８．３′−エキソヌクレアーゼ活性を示す少なくとも１つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓからのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓからのＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ、あるいは前記ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を減少させるか、不活性化させる種々のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼあるいはＴｌｉＤＮＡポリメラーゼからなるグループから選ばれる請求項７に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配合。９．配合の多数成分と少数成分は、少数成分の１単位に対して多数成分を約１０単位から２０００単位の割合で存在させる請求項６に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配合。１０．配合の多数成分と少数成分は、少数成分の１単位に対して多数成分を約１００単位から６００単位の割合で存在させる請求項９に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配合。１１．少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼからなるＤＮＡポリメラーゼの配合であって、野生型形体において、３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈し、かつ、上記少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼの上記３’−エキソヌクレアーゼ活性が上記少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼのその野生型形体における３’− エキソヌクレアーゼ活性の約０．２％から約７％の範囲に低減された温度サイクル型ポリメラーゼ連鎖反応に触媒作用を及ぼすことが出来る少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼからなるＤＮＡポリメラーゼの配合。１２．有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を何ら持たない１またはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼをＥ１とし、有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈する１又はそれ以上のＤＮＡポリメラーゼがＥ２とした場合に、Ｅ１とＥ２からなり、Ｅ１のＥ２に対する量の比がＤＮＡポリメラーゼ単位にして少なくとも約４：１、または、（ｂ）タンパク質の重量にして少なくとも約４：１であるＤＮＡポリメラーゼの配合。１３．Ｅ２がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｅｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種ＧＢ−Ｄ、Ｔ７コリファージ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａあるいはそれらの組み合わせからの遺伝子によってコード化されたＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択され、Ｅ１が、突然変異体、Ｅ２の３’−エキソヌクレアーゼ陰性形体、又は、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ、ＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓまたはＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからの遺伝子によってコード化されたＤＮＡポリメラーゼ等の有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を突然変異していない形体では呈さないＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。１４．Ｅ２がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓからのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼからなり、Ｅ１のＥ２に対する単位比が約１５０から１７０：１の範囲である請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。１５．Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８のＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓＤＮＡポリメラーゼに対する単位比が約１５０から約１７０：１であることを含む請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。１６．Ｋｌｅｎｔａｑ−２９１のＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓＤＮＡポリメラーゼに対する単位比が約１５０から約１７０：１であることを含む請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。１７．Ｅ２がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種ＧＢ−ＤからのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼからなり、Ｅ１のＥ２に対する単位比が約４５０から５００の範囲である請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。１８．野生型又はほぼ無損失のＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼのＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓＤＮＡポリメラーゼに対する単位比が約１０から約１５：１であることを含む請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。１９．Ｅ１が逆転写酵素からなる、請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。２０．Ｅ１がＴ７又はＴ３ＤＮＡポリメラーゼの突然変異体或いは化学的修飾からなり、Ｅ２が野生型のＴ７又はＴ３ＤＮＡポリメラーゼからなる、請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。２１．Ｅ１がＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓ又はＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼからなる請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。２２．Ｅ１が有意味的な３’−エキソヌクレアーゼ活性を何ら持たないＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｅｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ変異型からなり、Ｅ２が野生型のＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｅｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼからなる、請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼの配合。２３．各々について異なる特定の配列が増幅される２つの相補鎖を、１つの、１対の、又は、対の混合物をなすオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を、合成に効果的な条件下で各核酸鎖に対して相補的な各プライマーの伸長（エクステンション）生成物の合成に触媒作用を与えるために使用し、また、上記プライマーを各特定配列の異なる鎖に対して十分に相補的になるように選択してそれとハイブリッド形成し、１つのプライマーから合成された伸長生成物が、その補体から分離される際に、同じ又は別に含まれるプライマーを伸長させることによって伸長生成物の相補的な鎖の合成用の鋳型として作用することが出来るようにし、プライマー伸長生成物は、それらが合成されて一本鎖分子を生じた鋳型から分離されて、このようにして生じた一本鎖分子をプライマーで処理し、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を使用してプライマー伸長生成物の合成に有効な条件下で各プライマーの伸長生成物の合成に触媒作用を与え、また、改善点がこのＤＮＡポリメラーゼを請求項６に記載のように配合すること及び上記ＤＮＡポリメラーゼの配合でプライマーエクステンションに触媒作用を及ぼすことを含む、繰り返しサイクル型のポリメラーゼ連鎖反応によって核酸配列を増幅するための方法。２４．各々について異なる特定の配列が増幅される２つの相補鎖を、１つの、１対の、又は、対の混合物をなすオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を、合成に効果的な条件下で各核酸鎖に対して相補的な各プライマーの伸長生成物の合成に触媒作用を与えるために使用し、また、上記プライマーを各特定配列の異なる鎖に対して十分に相補的になるように選択してそれとハイブリッド形成し、１つのプライマーから合成された伸長生成物が、その補体から分離される際に、同じ又は別に含まれるプライマーを伸長させることによって伸長生成物の相補的な鎖の合成用の鋳型として作用することが出来るようにし、プライマー伸長生成物は、それらが合成されて一本鎖分子を生じた鋳型から分離されて、このようにして生じた一本鎖分子をプライマーで処理し、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を使用してプライマー伸長生成物の合成に有効な条件下で各プライマーの伸長生成物の合成に触媒作用を与え、また、改善点がこのＤＮＡポリメラーゼを請求項７に記載のように配合すること及び上記ＤＮＡポリメラーゼの配合でプライマーエクステンションに触媒作用を及ぼすことを含む、繰り返しサイクル型のポリメラーゼ連鎖反応によって核酸配列を増幅するための方法。２５．何らかの繰り返しサイクルに利用されている１つまたはそれ以上のプライマーそのものがＰＣＲ増幅の生成物である、請求項２４に記載の方法。２６．各繰り返しサイクルに変性ステップを更に含み、この変性ステップは反応混合物において約２０秒よりも短い期間を有している、請求項２４に記載の方法。２７．上記変性ステップが反応混合物において約５秒よりも短い期間を有している請求項２６に記載の方法。２８．各々について異なる特定の配列が増幅される２つの相補鎖を、１つの、１対の、又は、対の混合物をなすオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を、合成に効果的な条件下で各核酸鎖に対して相補的な各プライマーの伸長生成物の合成に触媒作用を与えるために使用し、また、上記プライマーを各特定配列の異なる鎖に対して十分に相補的になるように選択してそれとハイブリッド形成し、１つのプライマーから合成された伸長生成物が、その補体から分離される際に、同じ又は別に含まれるプライマーを伸長させることによって伸長生成物の相補的な鎖の合成用の鋳型として作用することが出来るようにし、プライマー伸長生成物は、それらが合成されて一本鎖分子を生じた鋳型から分離されて、このようにして生じた一本鎖分子をプライマーで処理し、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの混合物を使用してプライマー伸長生成物の合成に有効な条件下で各プライマーの伸長生成物の合成に触媒作用を与え、また、改善点が、野生型形体において３’−エキソヌクレアーゼ活性を呈し、かつ、温度サイクル型ポリメラーゼ連鎖反応に触媒作用を与えることが出来る少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼからなるＤＮＡポリメラーゼを配合することを含み、このとき上記少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼの上記３’−エキソヌクレアーゼ活性は、消えてはいないが、上記少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼのその野生型形体における３’−エキソヌクレアーゼ活性の約７％よりも大きくない程度まで低減しており、また、上記ＤＮＡポリメラーゼの配合でプライマーエクステンションに触媒を与えることを含む、繰り返しサイクル型のポリメラーゼ連鎖反応によって核酸配列を増幅するための方法。