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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine DNA-Polymerase mit erhöhter Reverse
Transkriptase Aktivität,
welche im Vergleich zur Wildtyp-Variante mindestens eine Mutation
in ihrer Aminosäuresequenz
aufweist, sowie eine Wirtszelle und ein Verfahren zur Herstellung
der DNA-Polymerase. Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung
ein Verfahren zur Identifikation einer Nukleinsäure und ein Kit, welches die
DNA-Polymerase enthält.
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Lebensmittelinfektionen
gehören
heutzutage zu den ernsthaftesten öffentlichen Gesundheitsrisiken.
Mit über
die Jahre ansteigendem globalen Reise- und Handelsaufkommen wird
das Risiko der Ausbreitung von Pathogenen ständig anwachsen. Ferner spielt
die mikrobiologische Qualitätskontrolle
in der Nahrungsmittelproduktion zur Vermeidung von Infektionen der
Verbraucher eine immer wichtigere Rolle. Aus diesen Gründen ist
die Entwicklung von schnelleren, robusteren und selektiveren Methoden
zur Detektion und Charakterisierung von Mikroorganismen von herausragendem
Interesse in zahlreichen Forschungsansätzen und -gebieten, in der
biologische Sicherheit eine fundamentale Rolle spielt (vgl. B. Malorny
et al., 2003; P. G. Lantz et al., 2000; P. M. Scheu et al., 1998;
C. A. Foy et al., 2001).
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Traditionelle
und standardisierte Methoden zum Nachweis von unerwünschten
Organismen in Nahrungsmitteln beruhen auf der Vervielfältigung verdächtiger
Kolonien gefolgt von deren biochemischer und/oder serologischer
Identifizierung (vgl. B. Malorny et al., 2003; P. G. Lantz et al.,
2000; P. M. Scheu et al., 1998; C. A. Foy et al., 2001). Diese Methoden
weisen jedoch einige Nachteile auf:
- – Hohe Zeitdauer:
der Zeitraum, der für
die Auswertung und Analyse notwendig ist, kann oft mehrere Tage
bis zu Wochen in Anspruch nehmen.
- – Unzureichende
Robustheit und Verlässlichkeit: Phänotypische
Merkmale werden von manchen Mikroorganismen oft nicht ausreichend
ausgebildet, um einen verlässlichen
Nachweis führen
zu können.
- – Eingeschränkte Eignung:
Lebensfähige
Organismen, die nicht kultivierbar sind, können nicht nachgewiesen bzw.
identifiziert werden.
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Eine
attraktive Alternative zu den herkömmlichen Verfahren ist der
spezifische Nachweis des Genoms des jeweiligen Organismus. Genotypisierende Verfahren
finden daher in der jüngeren
Vergangenheit eine verbreitete Anwendung (vgl. P. Belgrader et al.,
1999; H. K. Nogva et al., 2000; J. Hoorfar et al., 2000; M. Dahlenborg
et al., 2001, R. Knutsson et al., 2002; C. Löfström et al., 2004). Dabei ist
der Nachweis des bakteriellen Genoms durch Amplifikation mittels
der Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) möglich.
Nichtsdestotrotz haben diese Methoden noch signifikante Nachteile,
was ihrer breiten und generellen Anwendung und Akzeptanz noch im
Wege steht. So ist die Spezifität
der PCR oft nicht ausreichend, um geringe Mengen bakterieller DNA
in Gegenwart von DNA des Wirts nachzuweisen. Ein Grund dafür ist die häufig zu
beobachtende Fehlamplifikation wie z.B. von Primerdimeren die zu
falsch-positiven Signalen führt.
Diese Eigenschaft ist nur durch Erhöhung der Ausgangsmenge an zu
untersuchendem Material zu vermeiden und geht somit auf Kosten der
Sensitivität. Ferner
stellen zahlreiche Inhibitoren in Nahrungsmitteln, die eine PCR
inhibieren, ein großes
Problem dar (vgl. D. L. Wiedbrauck et ak., 1995) Hier sind robustere
und verlässlichere
Systeme zwingend erforderlich. Ein weiteres Problem ist die Unterscheidung
von lebenden und abgestorbenen Organismen durch PCR-Methoden. Die
Möglichkeit
des Nachweises von mRNA, welche nur in lebenden Zellen vorkommt, durch
eine mit reverser Transkription gekoppelten PCR (RT-PCR) zeigte bereits
erste Erfolge und ihre prinzipielle Anwendbarkeit (vgl. B. K. R.
Patel et al., 1993; I. Hein et al., 2001; G. E. Sheridan et al.,
1998; E. A. Szabo et al., 1999; A. K. Bej et al., 1991). Sie geht
aber erheblich zu Lasten der Selektivität und Sensitivität, sodass
teilweise mehr als 1000-fach erhöhte
Mengen an Ziel-DNA verwendet werden müssen. Auch hier sind Optimierungen
dringend erforderlich.
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Die
wenigen bereits im Handel erhältlichen Kits
(z.B. Qiagen) für
die Anwendung in solchen RT-PCR-Verfahren enthalten stets zwei Enzyme
(jeweils Reverse Transkriptase und DNA-Polymerase). Der Einsatz
von Tth Polymerase (Roche) als einzelnes Enzym verlangt hingegen
die Verwendung von Mn2+ und erfordert zudem
eine aufwendige Probenmanipulation, in der das Probengefäß geöffnet werden
muss, wodurch eine erhöhte
Gefahr der Kontaminierung besteht.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine DNA-Polymerase
bereitzustellen, welche es ermöglicht,
die Anwesenheit von Mikroorganismen mit hoher Selektivität und Sensitivität ohne aufwendige
Manipulationen und/oder Aufarbeitungschritte nachzuweisen.
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Diese
Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung gelöst.
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Insbesondere
wird erfindungsgemäß eine DNA-Polymerase
bereitgestellt, welche sich durch mindestens eine Mutation von ihrer
Wildtyp-Variante unterscheidet und im Vergleich zur Wildtyp-Variante eine
erhöhte
reverse Transkriptase (RT) Aktivität aufweist.
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Der
Begriff "DNA-Polymerase" umfasst erfindungsgemäß alle DNA-Polymerasen,
welche in einer Amplifikationsreaktion, wie beispielsweise allgemein in
der PCR oder der allelspezifischen Amplifikation, eingesetzt werden
können.
Zur Verwendung einer DNA-Polymerase beispielsweise in der PCR, weist die
DNA-Polymerase vorzugsweise eine Thermostabilität innerhalb des in der PCR
verwendeten Temperaturbereichs auf.
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Die
Begriffe "Amplifikation" bzw. "Amplifikationsreaktion" bezeichnen in diesem
Zusammenhang insbesondere die Replikation bzw. Vervielfältigung
einer Nukleinsäure
wie beispielsweise DNA oder RNA. Desweiteren schließt die vorliegende
Erfindung alle funktionell aktiven Derivate der vorstehend definierten
DNA-Polymerase ein, d.h. auch solche Derivate, die geringfügige Änderungen
in der Aminosäuresequenz
auf weisen, welche keine wesentliche Auswirkung auf die Funktion
der DNA-Polymerase haben.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst in diesem Zusammenhang auch solche
DNA-Polymerasen,
deren Aminosäurekette
entweder durch natürliche
Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische
Verfahren, welche im Stand der Technik bekannt sind, modifiziert
sein können.
Solche Modifikationen können
an verschiedenen Stellen und mehrfach in der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase
vorkommen, wie beispielsweise an dem Peptid-Rückgrat, an den Aminosäure-Seitenketten oder am
Amino- und/oder am Carboxy-Terminus. Sie umfassen beispielsweise
Acetylierungen, Acylierungen, ADP-Ribosylierungen, Amidierungen,
kovalente Verknüpfungen
mit Flavinen, Häm-Anteilen,
Nukleotiden oder Nukleotid-Derivaten,
Lipiden oder Lipid-Derivaten, Cyclisierungen, Disulfidbrückenbindungen,
Methylierungen und Demethylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen,
gamma-Carboxylierungen, Glycolysierungen,
Hydroxylierungen, Phosphorylierungen und tRNA-vermittelte Addition
von Aminosäuren.
Die erfindungsgemäße DNA-Polymerase kann als
individuelles Protein oder als Teil eines größeren Proteins, z.B. eines
Fusionsproteins vorliegen. Desweiteren kann sie Sezernierungs- oder "Leader"-Sequenzen, Pro-Sequenzen,
Sequenzen, die eine einfache Reinigung und/oder Isolierung ermöglichen, wie
mehrfache Histidin-Reste, oder eine einfache Detektion ermöglichen,
wie beispielweise Fluoreszenz- oder radioaktive Marker enthalten.
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Der
Begriff "Mutation" umfasst erfindungsgemäß jede Veränderung
einer Aminosäuresequenz der
Wildtyp-Variante der vorstehend definierten DNA-Polymerase wie beispielsweise
Deletionen, Additionen und/oder Substitutionen von Aminosäuren.
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Weiterhin
unterliegen diese, durch Addition hinzugefügten oder durch Substitution
ersetzenden Aminosäuren
keiner besonderen Einschränkung
und umfassen neben allen natürliche
Aminosäuren
auch nicht-natürliche
Aminosäuren
wie beispielsweise D-Aminosäuren
oder Aminosäuren
mit modifizierten Seitenketten.
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Die
erfindungsgemäße DNA-Polymerase bzw.
ihre Wildtyp-Variante unterliegt hinsichtlich ihrer Herkunft keiner
besonderen Einschränkung,
sondern kann aus jedem beliebigen Organismus stammen, wie beispielsweise
aus Säugern,
Tieren, Pflanzen oder Mikroorganismen. Vorzugsweise leiten sich
die erfindungsgemässe
DNA-Polymerase von
bakteriellen DNA-Polymerasen, wie Polymerasen von E. coli, Aguifex,
Borielia, Bacillus, Chlamydia, Chlamydophila, Chloroflexus, Haemophilis,
Heliobacter, Lacococcus, Methylobakterium, Myocobakterium, Rohodothermus,
Rickettsia, Streptococcus, Streptomyces, Syncechocysts, Treponema,
insbesondere von Polymerasen thermostabiler Organismen wie Thermus aquaticus,
Thermus thermophilus, Thermus fliformis, Rhodothermus obamensis,
Bacillus stearofhermophilus, Thermococcus gorgonarius, Pyrococcus
wosei, Thermococcus litoralis, Pyrococcus species, Thermococcus
kodakaraensis, Pyrococcus furiosus ab.
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Die
Wildtyp-Variante der vorstehend definierten DNA-Polymerase kann
auch einer dem Fachmann bekannten DNA-Polymerase aus der Sequenzfamilie
A entsprechen und beispielsweise aus Mikroorganismen wie Thermus
aquaticus (Taq), E. coli, Thermus thermophilus, Thermus filiformis,
Rhodofhermus obamensis, Bacillus stearothermophilus stammen.
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Gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung stammt die Wildtyp-Variante der vorstehend definierten
DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq) und weist eine Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO: 1 auf. Dies schließt
auch modifizierte Formen der Taq DNA-Polyermase ein, wie beispielsweise
die verkürzte
Form Klentaq DNA-Polymerase.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung weist die Aminosäure-Sequenz der vorstehend
definierten DNA-Polymerase im Vergleich zur Wildtyp-Variante eine,
zwei oder mehrere der Mutationen L322M, L459M, S515R, 1638F, S739G,
E773G, L789F in beliebiger Kombination oder alle diese Mutationen
auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
weist die DNA-Polymerase eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 2 auf.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, umfassend
eine Nukleotidsequenz, welche für
die erfindungsgemäße DNA-Polymerase
kodiert. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform, weist die vorstehend
definierte Nukleinsäure
eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID
NO: 3 auf.
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Desweiteren
wird erfindungsgemäß ein Vektor,
enthaltend die vorstehend definierte Nukleinsäure, bereitgestellt. Der erfindungsgemäße Vektor
unterliegt keiner besonderen Einschränkung, wobei geeignete Vektoren
im Stand der Technik bekannt sind. Der Vektor ist vorzugsweise zur
Expression und/oder Amplifikation in einer prokaryotischen oder
eukaryotischen Zelle befähigt.
Dazu enthält
der Vektor vorzugsweise geeignete regulatorische Elemente, wie Promotoren,
Enhancer, Terminations-Sequenzen usw.
Der Vektor kann auch zur stabilen Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in das
genetische Material einer Wirtszelle verwendet werden. Beispiele
geeigneter Vektoren sind pET15b, pET21b, pTTQ18, pASK-IBA37plus
und pET30 Xa Lic.
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Ein
weiterer Gegenstand betrifft erfindungsgemäß eine solche Wirtszelle, enthaltend
den vorstehend definierten Vektor oder die vorstehend definierte
Nukleinsäure.
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Der
hierin verwendete Ausdruck "Wirtszelle" unterliegt keiner
besonderen Einschränkung
und umfasst sowohl eukaryotische als auch prokaryotische Zellen,
welche zur Produktion heterologer Proteine geeignet und im Stand
der Technik bekannt sind. Dies sind beispielsweise Säugerzellen,
tierische Zellen Pflanzenzellen oder Zellen von Mikroorganismen. Die
erfindungsgemäße Wirtszelle
ist vorzugsweise eine Zelle welche von einem Mikroorganismus abgeleitet
ist, wie beispielsweise E. coli, Saccharomyces, sowohl prokaryontische
Zellen, wie E. coli (insbesondere E. coli XI1-blue, DH5α, B121 (DE3), M15 [pREP4], SG13005
(pREP4], BL21 (DE3)pLysS), Halomonas elongata, Caulobacter sp. Halobacteriumhalobium,
als auch eukaryontische Zellen, wie Hefe- und andere Pilzzellen,
pflanzliche und tierische Zellen, einschliesslich isolierter menschlicher
Zellen, die sich in Zellkultur befinden. Des Weiteren werden unter
dem Begriff "Wirtszelle" auch Zellextrakte
verstanden, die bei Vorlage einer mRNA diese translatieren können, wie
Weizenkeimextrakt als auch Kaninchen- Reticulocytenextrakt. Weiterhin werden
hier auch in vitro Expressionssysteme als "Wirtszelle" verstanden, wie z. B. das T7 Expression
System pBAD Expression System, ThioFusion" Expression Systems, trc Expression
System, PL Expression System, PurePro Caulobacter Expression System,
Microbiological Media and Media Components, Qiagen pQE Expression
System und das Novagen pET Expression System.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Herstellung der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase, umfassend
die Schritte
- (a) des Bereitstellens einer wie
vorstehend definierten Wirtszelle,
- (b) des Züchtens
der Wirtszelle in einem geeigneten Medium und
- (c) des Isolierens der DNA-Polymerase.
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Die
erfindungsgemäße DNA-Polymerase wird
vorzugsweise durch Expression mit Hilfe geeigneter Expressionsysteme,
vorzugsweise als sezerniertes Produkt selektionierbarer stabiler
Transfektanden der Zelllinie E. coli BL21 (DE3) pLysS, hergestellt.
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Die
vorliegende Erfindung schließt
alle im Stand der Technik bekannten Techniken zum Züchten von
Zellen ein. Ebenso unterliegt der hierin verwendete Begriff "Isolieren" keiner besonderen
Einschränkung
und beinhaltet alle dem Fachmann bekannten Techniken zum Isolieren
rekombinant hergestellter Peptide, Proteine und Nukleinsäuren, wie
beispielsweise Elektrophorese, Gelfiltration, Mikrofiltration, Mikrodiafiltration,
Dialyse, chromatographische Verfahren, Zentrifugation usw.
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Desweiteren
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung
einer Nukleinsäure bereit,
umfassend die vorstehend definierte DNA-Polymerase.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung, stammt die vorstehend definierte Nukleinsäure aus
einer Kontamination in einem Nahrungsmittel.
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Der
Begriff "Kontamination" schließt alle
Verunreinigungen ein, die in einem Nahrungsmittel auftreten können, beispielsweise
Verunreinigungen, welche durch die Herstellung, die Verarbeitungen, die
Lagerung oder die Verwendung des Nahrungsmittels eingeführt werden
können.
Insbesondere schließt
der Begriff "Kontamination" Mikroorganismen
wie Bakterien, Viren, Pilze usw. ein.
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Der
hierin verwendete Begriff "Nahrungsmittel" unterliegt in diesem
Zusammenhang keiner besonderen Einschränkung und kann ein Nahrungsmittel,
eine Nahrungsergänzungsmittel
oder ein Futtermittel sein. Desweiteren schließt der Begriff alle Nahrungsmittel
ein, welche durch Mikroorganismen verunreinigt werden können wie
insbesondere solche Nahrungsmittel, die Fleisch, Obst, Fisch, Molkereiprodukte,
Backprodukte und Ähnliches
enthalten.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist die vorstehend definierte Nukleinsäure in dem erfindungsgemäßen Verfahren
eine RNA und/oder stammt aus einem Mikroorganismus.
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Der
Ausdruck "Mikroorganismus", wie er hierin verwendet
wird, schließt
alle Mikroorganismen ein, welche in einem Nahrungsmittel enthalten
sein können.
Insbesondere umfasst der Begriff "Mikroorganismus" solche Mikroorganismen, die gesundheitsschädlich für den Konsumenten
der Nahrung sein können.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung
der vorstehend definierten DNA-Polymerase in einem diagnostischen oder
molekularbiologischen Verfahren. Ferner kann die erfindungsgemäße DNA-Polymerase
zur mRNA-Quantifizierung, beispielsweise durch Echtzeit-PCR, verwendet
werden. Ein Beispiel hierfür
ist eine Quantifizierung der Expression bestimmter Gene.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit
zur Verwendung in einem der vorstehend genannten Verfahren bereitgestellt,
enthaltend die erfindungsgemäße DNA-Polymerase, oder
die erfindungsgemäße Nukleinsäure. Das
erfindungsgemäße Kit unterliegt
jedoch bezüglich
der möglichen
Verwendung keiner besonderen Einschränkung und kann in allen Verfahren
verwendet werden, in denen die erfindungsgemäße DNA-Polymerase einen Effekt
aufweist. Desweiteren kann das Kit neben der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase auch
andere Substanzen, wie beispielsweise Puffer, Indikatoren, Salze,
weitere Enzyme, proteinartige Verbindungen oder Hilfsstoffe enthalten.
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Aufgrund
der im Vergleich zur Wildtyp-Variante mindestens einen enthaltenden
Mutation in der Aminosäure-Sequenz
der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase,
weist diese eine überraschend
erhöhte
Reverse Transkriptase Aktivität
auf. Durch diese vorteilhaften Eigenschaft kann die erfindungsgemäße DNA-Polymerase
beispielsweise in Reverse Transkriptase gekoppelten Amplifikationsverfahren (RT-PCR)
eingesetzt werden und ermöglicht
so den Nachweis von RNA und/oder DNA ohne den Einsatz eines weiteren
Enzyms oder aufwendiger Aufarbeitungsschritt. Durch diesen überraschenden
Effekt erlaubt die erfindungsgemäße DNA-Polymerase
die Entwicklung neuer vorteilhafter Verfahren wie beispielsweise
zum Nachweis von schädlichen
Mikroorganismen in Nahrungsmitteln.
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Die
Figuren zeigen:
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1:
Aminosäure-Sequenz
von Klentaq DNA-Polymerase Wildtyp.
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2:
Aminosäure-Sequenz
der Mutante L322M, L459M, S515R, 1638F, S739G, E773G (2-O7) von
Klentaq DNA-Polymerase.
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3:
14 % SDS-PAGE Gel von gereinigten Polymerasen.
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4:
RT-PCR-Aktivität
von Klentaq wt und der Mutante 2-O7 (0.8 % Agarose-Gel). Das verwendete
Templat ist in der Figur gezeigt.
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5:
Primer-Extension-Assays mit Klentaq wt und der Mutante 2-O7 mittels
eines 50mer RNA Templats (12 % PAGE Gel).
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6:
Primer-Extension-Assays mit Klentaq wt und der Mutante 2-O7 mittels
eines RNA Templats von Roche (12 % PAGE Gel).
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Die
vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden, nicht einschränkenden
Beispiele näher erläutert.
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Beispiel 1: Konstruktion der Bibliothek
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Das
Klentaq Wildtyp-Konstrukt wird durch Klonierung des Gens in die
BsaI-Stelle von pASK-IBA37plus (IBA) erhalten. Das Insert wird sequenziert,
um zu bestätigen,
dass es keine Mutationen aufweist. Die Einführung zufälliger Mutationen wird mit
Error-prone PCR durchgeführt.
PCR-Reaktionen werden unter Verwendung von 5 Einheiten Taq DNA-Polymerase
(Fermentas), 10 mM Tris-HCl (pH 8,8), 50 mM KCl, 0,08% Nonidet P40,
1,5 mM MgCl2, 50 μM MnCl2,
2,5 μM von
jedem dNTP, 20 pM Templat pASK-IBA37plus KTQ wt und 500 nM von jedem Primer
(5'-ATG GTA CGT
CTC AGC GCG CCC TGG AGG AGG CCC CCT-3' forward (SEQ ID NO: 4), 5'-ATG GTA CGT CTC
ATA TCA CTC CTT GGC GGA GAG CCA GTC-3' reverse (SEQ ID NO: 5)) in einem 100 μL Gemisch
durchgeführt.
Es wird durch 14 PCR-Zyklen amplifiziert (95 °C für 1 min., 65 °C für 1 min.
und 72 °C
für 2 min.).
Das Produkt (1655 bp) wird gereinigt (MinEluteTM Reaction
Cleanup Kit, Qiagen) gefolgt von einer Verdauung mit BsmBI. Das Restriktionsfragment
wird dann durch Elektrophorese in einem 0,8% Agarose-Gel isoliert
und gereinigt (MinEluteTM Gel Extraction
Kit, Qiagen). Es wird mit dem durch BsaI verdauten pASK-IBA37plus
durch Inkubieren bei 22 °C
für 1 Stunde
mit T4 DNA Ligase (Fermentas) ligiert. Die resultierende Plasmid-Bibliothek
wird in E. coli BL21 transformiert. 5000 Klone werden von Agarplatten
ausgewählt
und über
Nacht separat in LB-Medium (100 μg/mL
Carbenicillin) enthaltenden 96-well-Platten
gezüchtet.
Die Klentaq-Mutanten werden parallel in 1-mL-Kulturen in 96-well-Platten durch
Induktion mit 200 μg/L
AHT exprimiert. Lysis wird in einem 600 μL Gemisch, welches 50 mM Tris-HCl
(pH 9,2), 16 mM (NH4)2SO4, 0,1 % Tween 20, 2,5 mM MgCl2 und
1 mg/mL Lysozym enthält,
durchgeführt.
Das Lysat wird auf Eis für
30 min. inkubiert, gefolgt von Hitze-Denaturierung aller nicht thermostabilen
Proteine bei 72 °C über 45 min. Nach
dem Zentrifugieren wird das Lysat direkt zum Screenen verwendet.
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Beispiel 2: Screening nach PCR-aktiven
Mutanten
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Reaktionsgemische
(20 μL)
für das
Bibliotheks-Screenen enthalten 50 mM Tris-HCl (pH 9,2), 16 mM (NH4)2SO4,
0,1% Tween 20, 2,5 mM MgCl2, 200 μM von jedem
dNTP, 20 pM Templat MS2 (100mer, 5'-ATC GCT CGA GAA CGC AAG TTC TTC AGC
GAA AAG CAC GAC AGT GGT CGC TAC ATA GCG TGG TTC CAT ACT GGA GGT
GAA ATC ACC GAC AGC ATG AAG TCC G-3' (SEQ ID NO: 6)), 100 nM von jedem Primer
(5'-ATC GCT CGA
GAA CGC AAG TT-3' forward
(SEQ ID NO: 7), 5'-CGG
ACT TCA TGC TGT CGG TG-3' reverse
(SEQ ID NO: 8)) und 0,6 × SYBRgreen
I (Molecular Probes). Diese werden unter Verwendung eines automatischen Flüssigkeits-Manipulationsgerätes (Hamilton
Microlab Star) in 384-well-Platten gegeben, gefolgt von der Zugabe
von 5 μL
Lysat-Lösung.
Als Negativ-Kontrollen werden analog behandelte Kulturen von XL10 Gold
Zellen, welche den nicht-kodierenden
Vektor pASK-IBA37plus enthalten, verwendet. Nach 50 PCR-Zyklen (95 °C für 30 s,
55 °C für 35 s und
72 °C für 40 s)
werden die Fluoreszenz-Intensitäten mittels eines
Fluoreszenzplatten-Lesers (Polarstar Optima, BMG Labtechnologies
GmbH) mit einer Anregung bei 485 nm und einer Emission bei 520 nm
quantifiziert.
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Der
anfängliche
Grenzwert für
die Erkennung eines Treffers war eine 1,2-fach höhere Fluoreszenz in Vergleich
zu dem Wildtyp. Dieser Faktor war ausreichend, um PCR-aktive Enzyme
erfolgreich zu identifizieren. Diese Mutanten wurden getrennt und
weiter in einer mit reverser Transkription gekopplten PCR-Reaktion
(RT-PCR) analysiert.
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Beispiel 3: Screening nach Reverse Transkription (RT)-aktiven
Mutanten
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Die
Reaktionsgemische (20 μL)
enthalten 50 mM Tris-HCl (pH 9,2), 16 mM (NH4)2SO4, 0,1% Tween
20, 2,5 mM MgCl2, 200 μM von jedem dNTP, 50 pg/μL Templat
RNA von Bacteriophage MS2 (Roche), 100 nM von jedem Primer (5'-ATC GCT CGA GAA
CGC AAG TT-3' forward
(SEQ ID NO: 9), 5'-CGG
ACT TCA TGC TGT CGG TG-3' reverse (SEQ
ID NO: 10)) und 0,6 × SYBRgreen
I (Molecular Probes). Diese werden unter Verwendung eines automatischen
Flüssigkeits-Manipulationsgerätes (Hamilton
Microlab Star) in 96-well-PCR-Platten gegeben, gefolgt von der Zugabe
von 5 μL
Lysat-Lösung. Die
Reaktionen werden in einem Echtzeit PCR-Cycler (iCycler, BIO-RAD)
durchgeführt.
Nach einem anfänglichen
reversen Transkriptions-Zyklus (95 °C für 30 s, 55 °C für 35 s und 72 °C für 15 min.)
und 50 PCR-Zyklen (95 °C
für 30
s, 55 °C
für 35
s und 72 °C für 40 s)
werden aktive Mutanten durch Messen der Fluoreszenz-Schmelzkurve
des amplifizierten Produkts identifiziert.
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3%
der PCR-aktiven Mutanten zeigten eine RT-Aktivität. Eine dieser Mutanten (2-O7)
wurde gereinigt und weiter analysiert.
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Beispiel 4: Reinigung von Klentaq-Mutanten
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Klentaq
wt und ausgewählte
Mutanten werden wie oben beschrieben exprimiert und unter Verwendung
von Ni-NTA Agarose (BIO-RAD) gereinigt, wobei dem Protokoll des
Herstellers, unter Weglassen von Imidazol während der Lysis- und Waschschritte,
gefolgt wird.
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Die
auf diese Weise erhaltenen Enzyme waren >95% rein, wie durch Coomassie-Blau gefärbtes SDS-PAGE
bestätigt.
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Nach
dem Puffer-Austausch zu 50 mM Tris-HCl (pH 9,2), 16 mM (NH4)2SO4,
0,1% Tween 20, 2,5 mM MgCl2 und 1 mM DTT,
enthaltend 50% Glycerin, werden die Konzentrationen mittels Nanoorange-Assay
(Molecular Probes) gemessen (vgl. 3).
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Beispiel 5: Vergleich von Klentaq wt und
der Klentaq Mutante 2-O7
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RT-PCR-Aktivität
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Die
Reaktionsgemische (50 μL)
enthalten 50 mM Tris-HCl (pH 9,2), 16 mM (NH4)2SO4, 0,1% Tween
20, 2,5 mM MgCl2, 200 μM von jedem dNTP, 50 pg/μL Templat
RNA von Bacteriophage MS2 (Roche)/20 pM Templat MS2 (100mer, 5'-ATC GCT CGA GAA
CGC AAG TTC TTC AGC GAA AAG CAC GAC AGT GGT CGC TAC ATA GCG TGG
TTC CAT ACT GGA GGT GAA ATC ACC GAC AGC ATG AAG TCC G-3' (SEQ ID NO: 11)),
100 nM von jedem Primer (5'-ATC
GCT CGA GAA CGC AAG TT-3' forward (SEQ
ID NO: 12), 5'-ACC
TCC AGT ATG GAA CCA CG-3' reverse
(SEQ ID NO: 13)) und 50 nM Klentaq DNA-Polymerase. Nach einem anfänglichen
reversen Transpriptions-Zyklus (95 °C für 30 s, 55 °C für 35 s and 72 °C für 15 min.)
wird das Produkt durch 40 PCR-Zyklen (95 °C für 30 s, 55 °C für 35 s and 72 °C für 40 s)
amplifiziert.
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Wie
in 4 zu sehen ist, sind sowohl die Wildtyp-Variante
(wt) als auch die Mutante 2-O7 der Klentaq DNA-Polymerase PCR-aktiv
wenn DNA als Templat angeboten wird. Im Gegensatz zur Wildtyp-Variante
weist die Mutante 2-O7 jedoch überraschenderweise
eine erheblich erhöhte
reverse Transkriptase Aktivität
auf und akzeptiert ebenso RNA als Templat, welches nach anfänglicher
reverser Transkription in DNA effizient amplifiziert wird.
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Primer-Extension-Assays mit
einem RNA-Templat
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Die
Reaktionsgemische (30 μL)
enthalten 50 mM Tris-HCl (pH 0,2), 16 mM (NH4)2SO4, 0,1 % Tween
20, 2,5 mM MgCl2, 10 μM von jedem dNTP, 150 nM Templat
RNA (50mer, 5'-AUC
GCU CGA GAA CGC AAG UUC UUC AGC GAA AAG CAC GAC AGU GGU CGC UA-3' (SEQ ID NO: 14),
vgl. 5)/RNA von Bacteriophage MS2 (Roche, vgl. 6),
100 nM 5'-[32P] primer (5'-TAG CGA CCA CTG TCG TGC TT-3' (SEQ ID NO: 15))
und 25 nM Klenfaq DNA-Polymerase. Nach einer Inkubation bei 95 °C für 30 s,
55 °C für 35 °C und 72 °C für 15 min. bis
4 h, werden die Reaktionen durch Zugabe von 3 Volumina Gel-Beladungspuffer
(80% Formamid, 20 mM EDTA) gestoppt.
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Die
Ergebnisse der Primer-Extension-Assays mit RNA-Templaten sind in
den 5 und 6 abgebildet. Bei beiden untersuchten RNA-Templaten
konnte eine überraschend
erhöhte Aktivität der Mutante
2-O7 der Klentaq DNA-Polymerase gegenüber der Wildtyp-Variante beobachtet werden.
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der
amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.