EP1198571A2 - Chimäre proteine - Google Patents

Chimäre proteine

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Publication number
EP1198571A2
EP1198571A2 EP00958230A EP00958230A EP1198571A2 EP 1198571 A2 EP1198571 A2 EP 1198571A2 EP 00958230 A EP00958230 A EP 00958230A EP 00958230 A EP00958230 A EP 00958230A EP 1198571 A2 EP1198571 A2 EP 1198571A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
nucleic acid
interaction
chimeric protein
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00958230A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christian Kilger
Michael Motz
Eva Löser
Manfred KÖGL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sygnis Pharma AG
Original Assignee
Lion Bioscience AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lion Bioscience AG filed Critical Lion Bioscience AG
Publication of EP1198571A2 publication Critical patent/EP1198571A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to recombinant chimeric proteins which have a nucleic acid synthesis activity, complexes containing them, nucleic acids coding for them, vectors and cells containing them, an antibody directed against them, uses of these proteins, kits containing them and methods for elongation, amplification, reverse transcription, Sequencing and labeling of nucleic acids.
  • proteins are not present in the cell as monomers, but are part of a functional multimeric complex. Examples of such complexes are described in almost all areas of cell biology (e.g. transcription, translation, replication, cytoskeleton, signal transduction, mRNA processing).
  • donor proteins are to be understood as those proteins which interact with another protein and optionally bind another protein.
  • acceptor proteins are understood to be those proteins which interact with another protein and optionally bind another protein
  • the interaction-related sequence of a protein-protein interaction site includes (i) the determination of the three-dimensional structure of a complex of donor and / or acceptor protein by X-ray structure analysis or (ii) NMR methods.
  • a further method is (iii) to reconstitute a complex binding in vitro with recombinant proteins and to determine the interaction-dependent sequence (s) by targeted modification of the donor or acceptor protein.
  • targeted changes include the mutation of individual amino acids, for example to alanine (alanine scanning) or the deletion of sequences in the protein.
  • the interaction-dependent sequence can be defined in this way.
  • Enzymes dihydrofolate reductase, beta-galactosidase
  • signal transduction proteins Cdc25 from Saccharomyces cerevisiae
  • transcription activators Gal4, LexA-VP16
  • the determination of the binding region with the help of the two hybrid system is based on the same considerations as for the / n-wrro reconstitution of the binding: If the change or deletion of an amino acid or sequence leads to the loss of binding activity, it is part of the interaction-dependent sequence, and vice versa , if the modification or deletion of a sequence does not lead to the loss of binding activity, it is not part of the interaction-dependent sequence.
  • the interaction-related sequence can be defined by examining a large number of fragments of the protein with regard to their interaction and determining which parts of the protein are always present in the interacting or interacting fragments. This area that is always present is the interaction-dependent sequence.
  • individual amino acids can be changed by targeted mutations. Loss or increase in binding activity indicates that these positions are directly involved in the interaction.
  • the complexes which are particularly preferred for in vitro applications include the thermostable complexes of prokaryotic and eukaryotic replication apparatuses, which often contain polymerases as an important enzyme activity.
  • the replication apparatus includes a variety of components. These include, inter alia, a) proteins having polymerase activity, b) proteins which are involved in the formation of a clamp structure, the clamp structure having, inter alia, the task of binding polymerase activity to its template or template and stabilizing the binding and thus to change the dissociation constant of the complex of polymerase and nucleic acid accordingly, c) proteins which load the clip onto the template, d) proteins which stabilize the template and, if appropriate, e) proteins which carry the polymerase to the template.
  • Proteins having polymerase activity are understood here to mean in particular those proteins which are able to bind one or more nucleotides or nucleosides to a nucleotide or nucleoside or polynucleotide or polynucleoside. In each of the above cases, these can be ribunucleotides / ribunucleosides or deoxynucleotides / deoxynucleosides or polymers thereof. In addition to DNA polymerases, these proteins also include RNA polymerases, regardless of whether a template is required for the polymerization reaction of the protein or not. Proteins having this polymerase activity are thus also proteins having nucleic acid synthesis activity.
  • Elongation protein is also to be understood here to mean a protein or complex which has polymerase activity and which has at least one or more of the following properties: use of RNA as a template, use of DNA as a template, synthesis of RNA, synthesis of DNA, exonuclease activity in 5'-3 'direction or exonuclease activity in 3'-5' direction, strand displacement activity and processivity or non-processivity.
  • DNA polymerases belong to a group of enzymes that use single-stranded DNA as a template for the synthesis of a complementary DNA strand. These enzymes play an important role in nucleic acid metabolism, including the processes of DNA replication, repair and recombination. DNA polymerases have been identified in all cellular organisms, from bacterial to human cells, in many viruses and in bacteriophages (Kornberg, A. & Baker, TA (1991) DNA replication WH Freeman, New York, NY).
  • the archaebacteria and the eubacteria are grouped together to form the group of procaryonts, the organisms without a real cell nucleus, and the eukaryotes, the organisms with a real cell nucleus, are compared.
  • common to many polymerases from a wide variety of organisms are often similarities in the amino acid sequence and similarities in structure (Wang, J., Sattar, AKMA; Wang, CC, Karam, JD, Königsberg, WH & Steitz, TA (1997) Crystal Structure of pol ⁇ familily replication DNA polymerase from bacteriophage RB69.Cell 89, 1087-1099).
  • Organisms like humans have a large number of DNA-dependent polymerases, but not all of them are responsible for DNA replication, but some also carry out DNA repair.
  • replicative DNA polymerases mostly consist of protein complexes with multiple units that replicate the chromosomes of cellular organisms and viruses.
  • a general property of these replicating polymerases is generally high processivity, that is, their ability to polymerize thousands of nucleotides without deviating from the DNA template. dissociate (Kornberg, A. & Baker, TA (1991) DNA replication. WH Freeman, New York, NY).
  • DNA polymerases are characterized, among other things, by two properties, their elongation rate, that is the number of nucleotides that they can incorporate into a growing DNA strand per second and their dissociation constant. If the polymerase dissociates from the strand again after each nucleotide incorporation step into the growing chain (i.e. one elongation step occurs per binding event), then the processivity has the value 1 and the polymerase is not processive.
  • the polymerase remains attached to the strand for repeated nucleic acid incorporations, then the elongation or the replication mode and thus also the polymerase is referred to as processive and can reach a value of several thousand (see also: Methods in Enzymology Volume 262, DNA Replication, Edited by JL Campbell, Academic press 1995, pp. 270-280).
  • the proteins mentioned under b) form structures that are either open or closed, for example ring-shaped or semi-ring-shaped structures. Such structures can be formed by one or more species of proteins. It is possible that one of said protein species has polymerase activity.
  • glide clip proteins The proteins responsible for the formation of these structures, if they have no polymerase activity, are hereinafter referred to as “glide clip proteins” or “clip proteins”.
  • the glide clip cannot position itself around the DNA in vivo, but must be fixed around the DNA.
  • a protein complex consists of a large number of subunits.
  • the protein complex recognizes the 3 'end of the primer of a "phmer template duplex", which is to be supplemented to a longer double strand by incorporation of nucleotides, and positions the glide clip around the DNA.
  • the phage expresses its own catalytic polymerase, the T7 polymerase, which binds to the gene product of gene 5 and a protein from the host Esche ⁇ chia coli, the thioredoxin, and which, as a replicase, enables highly processing DNA replication.
  • a bracket is also formed here, but this bracket does not have the same structure as, for example, in the case of eukaryotic PCNA.
  • a processivity factor is preferably a compound or molecule that affects the processivity of a polymerase, preferably increases.
  • the sliding clamp proteins represent an example of a processivity factor.
  • this coupling protein is the small subunit of the ⁇ polymerase (Zhang, S.-J., Zeng, X.-R., Zhang, P., Toomey, NL, Chuang, RY, Chang, L.-S., and Lee, MYWT (1994.
  • DNA polymerases are also used in DNA sequence determination (Sanger et al., Proc. N ⁇ tl. Acad. Sei., USA 74: 5463-5467 (1997)).
  • One of the polymerases used here can be, for example, the above-mentioned tag polymerase (US Pat. No. 5,075, 216) or the polymerase from Thermotoga neapolitana (WO 96/10640) or other thermostable polymerases. Newer methods couple the exponential amplification and the sequencing of a DNA fragment in one step, so that it is possible to sequence genomic DNA directly.
  • DEXAS Direct exponential amplification and sequencing
  • a further development of this method consists in the use of a polymerase mixture, one of the two polymerase discriminating between ddNTPs and dNTPs, while the second has a reduced ability to discriminate (Nucleic Acids Res 1997 May 15; 25 (10): 2032-2034 Direct DNA sequence determination from total genomic DNA.Kilger C, Pääbo S).
  • DNA polymerases are also used in the reverse transcription of RNA into DNA.
  • RNA serves as a template and the polymerase synthesizes a complementary DNA strand.
  • thermostable DNA polymerase from the organism Thermus thermusphilus (Tth) (U.S. Patent 5,322,770).
  • Some polymerases have a proof-reading activity, ie a 3'-5 'exonuclease activity. This property is particularly desirable if that is synthesizing product to be manufactured with a low error rate in nucleotide incorporation.
  • Polymerases from the organism Pyrococcus wosei are an example.
  • the above-mentioned elongation proteins which are used in the above-mentioned applications, mostly do not belong to the actual replication enzymes in vivo, but are mostly enzymes that are believed to be involved in DNA repair, which is why their processivity is relative is low.
  • every organism has a large number of polymerases which have a large number of properties.
  • a direct technical use of such in vivo complexes z For example, for purposes of sequencing DNA, performing a polymer chain reaction, or introducing labels into nucleic acids has so far failed for a number of reasons. One reason was and is the lack of knowledge of all factors or individual components involved in the formation of the complex of interest. Another reason is that the multi-component complex has one or more undesirable properties in addition to those desired.
  • a recombinant chimeric protein comprising
  • the interaction mediating sequence forms a complex of nucleic acid synthesis activity and glide clip protein and the complex is different from the complex which the nucleic acid synthesis activity and / or the glide clip protein forms with its natural interaction partner (s).
  • the protein comprises the interaction-mediating portion of the base protein.
  • the interaction-mediating portion mediates a bond between the nucleic acid synthesis activity and a factor influencing the synthesis performance of the nucleic acid synthesis activity.
  • the factor is a glide clip protein.
  • the interaction-mediating sequence comprises a consensus peptide sequence which is selected from the group comprising the sequences SEQ ID NO .: 8, 9, 10 11 and 12. In a particularly preferred embodiment, it is provided that the interaction-mediating sequence comprises a consensus peptide sequence according to SEQ ID NO .: 8.
  • the interaction-mediating sequence is at the C-terminal end of the sequence carrying the nucleic acid synthesis activity.
  • a linker is arranged between the interaction mediating sequence and the sequence carrying the nucleic acid activity.
  • the recombinant chimeric protein can be thermostable.
  • the protein has a DNA polymerase activity. It is particularly preferred if the proteins have a 3 ' -5 ' exonuclease activity.
  • the protein has an RNA polymerase activity.
  • the protein has a reverse transcriptase activity.
  • the incorporation rate of dNTPs and ddNTPs differs by a factor of less than 5 due to the nucleic acid synthesis activity.
  • the object is achieved by a complex comprising
  • the glide clip protein comprises a consensus peptide sequence which is selected from the group comprising the sequences according to SEQ ID NO .: 4, 5, 6 and 7.
  • the complex further comprises a nucleic acid.
  • the object is achieved by a nucleic acid which codes for a chimeric protein according to the invention, in particular recombinant protein.
  • the object is achieved by a vector comprising the nucleic acid according to the invention.
  • the vector is an expression vector.
  • the object is further achieved by using the chimeric protein according to the invention for the elongation of nucleic acids.
  • the object is further achieved by using the chimeric protein according to the invention for the amplification of nucleic acids.
  • the object is further achieved by the use of the chimeric protein according to the invention for the reverse transcription of RNA in DNA.
  • the object is achieved by a kit, in particular a reagent kit for elongation and / or amplification and / or reverse trans description and / or sequencing and / or labeling of nucleic acids, which comprises in one or more separate containers: a) an inventive, preferably recombinant chimeric and / or b) an inventive complex and c) preferably optionally at least one primer, buffer, nucleotide, Cofactors and / or pyrophosphatase.
  • a kit in particular a reagent kit for elongation and / or amplification and / or reverse trans description and / or sequencing and / or labeling of nucleic acids, which comprises in one or more separate containers: a) an inventive, preferably recombinant chimeric and / or b) an inventive complex and c) preferably optionally at least one primer, buffer, nucleotide, Cofactors and / or pyrophosphatase.
  • kits it is provided that, in addition to substances a) and / or b), it comprises deoxynucleotides or / and derivatives thereof for the amplification of nucleic acids.
  • kit contains, in addition to deoxynucleotides or ribonucleotides or / and their derivatives, dideoxynucleotides or / and their derivatives for sequencing.
  • the object is achieved by a method for amplifying a nucleic acid, it being provided that the nucleic acid to be amplified is crosslinked with at least two primers under hybridization conditions, each of the two primers in each case complementary to a part of or a flanking one
  • the region of the nucleic acid to be amplified is and a primer elongation is carried out by a polymerase in the presence of nucleotides.
  • a chimeric protein according to the invention, in particular a recombinant protein, is used as the polymerase and a slide clamp protein is preferably added to the reaction.
  • a polymerase chain reaction is carried out.
  • the reaction mixture comprises two DNA polymerases, at least one of which has a 3'-5 'exonuclease activity, the 3 ' -5 ' exonuclease activity being either by the chimeric protein or by a further polymerase Reaction mixture is added.
  • two chimeric proteins, in particular recombinant one of which is one that has DNA polymerase activity and the other is one that has 3 ' -5 ' exonuclease activity having.
  • the nucleic acid adjacent area is complementary, a template-dependent Elongation or reverse transcription is carried out using deoxynucleotides and dideoxynucleotides or their respective derivatives according to the Sanger method.
  • At least one marker is inserted when the nucleic acids are elongated.
  • an agent which is selected from the group comprising labeled primers, labeled deoxynucleotides and derivatives thereof, labeled dideoxynucleotides and derivatives thereof and labeled ribonucleotides and derivatives thereof.
  • the object is achieved by a method for labeling nucleic acids by generating individual breaks in phosphodiester linkages of the nucleic acid chain and replacing a nucleotide at the break points with a labeled nucleotide with the aid of a polymerase, it being provided that a polymerase chimeric protein according to the invention, in particular recombinant chimeric protein is used.
  • the object is achieved by a method for producing a chimeric protein which comprises a base sequence and a heterologous interaction-dependent sequence and, as a result of the interaction-dependent sequence, forms a bond with an interaction partner or such a bond is strengthened, whereby
  • the sequence of the donor protein or acceptor protein which determines the interaction between the two interaction partners is determined from an interaction system comprising a protein referred to as donor protein and a protein as acceptor protein; and b) the interaction-causing sequence is introduced into a receiving protein which comprises the base sequence and which is different from the donor protein and the acceptor protein.
  • the donor protein and the acceptor protein form a complex that binds nucleic acid.
  • the donor protein and the acceptor protein form a complex which has an activity which is selected from the group, the polymerase activity, DNA binding activity, RNA binding activity, 5 ' -3 ' exonuclease activity, 3 ' -5 ' exonuclease activity and ligase activity.
  • the donor protein is selected from the group comprising elongation protein, glide clip proteins, glide clip loader protein and coupling proteins.
  • the acceptor protein is selected from the group comprising elongation protein, glide clip proteins, glide clip loader protein and coupling proteins.
  • the receiving protein is selected from the group comprising elongation protein, glide clip proteins, glide clip loader protein and coupling proteins.
  • step a) is repeated several times and a consensus sequence which represents an interaction-dependent sequence is determined from the thus determined interaction-dependent sequences, and in step b) as an interaction-dependent sequence in one of the donor protein and the acceptor protein various receiving protein comprising a base sequence is introduced.
  • an in vitro complex for template-dependent elongation of nucleic acid comprising a slide clip protein and an elongation protein, at least one of the proteins being a chimeric protein according to the invention.
  • An embodiment in which the complex is thermostable is particularly preferred.
  • each of the chimeric proteins according to the invention can be a recombinant chimeric protein.
  • the object is also achieved by recombinant chimeric protein comprising a) a first domain with nucleic acid synthesis activity, and b) an interaction-mediating sequence, characterized in that the interaction-mediating sequence forms a complex of nucleic acid synthesis activity and gliding clip protein, the complex being different of the complex that the nucleic acid synthesis activity and / or the glide clip protein forms with their natural interaction partner (s).
  • nucleic acid synthesis activity to a glide clip protein which has the nucleic acid synthesis activity as it occurs in nature, for example. does not come can bind.
  • the natural interaction partner is therefore a partner as it can be present within an organism under normal physiological conditions to which the nucleic acid synthesis activity is bound.
  • the object is achieved by a chimeric protein comprising a portion having nucleic acid synthesis activity, the portion coming from a portion having a nucleic acid synthesis activity and an interaction-imparting portion, and at least one interaction-imparting portion, the interaction-imparting portion being different from that Interaction-mediating portion of the base protein, and a chimeric protein comprising a portion having nucleic acid synthesis activity, the portion originating from a base protein which comprises a portion having nucleic acid synthesis activity but no interaction-imparting portion, and an interaction-imparting portion.
  • the object is further achieved by a method for template-dependent elongation of nucleic acids, the nucleic acid to be elongated or at least one strand thereof being provided with at least one primer under hybridization conditions, the primer being sufficiently complementary to a part of or a flanking region of the is to be elongated nucleic acid and a primer elongation is carried out by a polymerase in the presence of nucleotides, characterized in that a recombinant chimeric protein according to the invention is used as the polymerase and that preferably a slide clamp protein is present in the reaction.
  • “recombinant” is to be understood when the chimeric protein is produced, for example, by genetic engineering (see “Genetic Technology”, Römpp Basislexikon Chemie, Georg Thieme Verlag 1998) or, for example, when it is chemically synthesized.
  • the invention is based on the surprising finding that it is possible, starting from a protein having a nucleic acid synthesis activity, hereinafter referred to as the basic protein, to increase the processivity of this protein, more precisely the nucleic acid synthesis activity, by combining it with a factor which increases the processivity, such as a Sliding clamp protein interacts with which the basic protein as such cannot interact, or in the event that it can interact, this is not associated with an increase in processivity.
  • a factor which increases the processivity such as a Sliding clamp protein interacts with which the basic protein as such cannot interact, or in the event that it can interact, this is not associated with an increase in processivity.
  • nucleic acid synthesis activity-bearing protein with a group of several amino acids, typically in the form of a consecutive amino acid sequence, referred to herein as an interaction-mediating or interaction-causing sequence, and thus an interaction between the said Protein and a factor that increases processivity is only possible.
  • This overcomes the above-described problem of the prior art, consisting in a lack of compatibility of the actually desired individual components of a complex carrying a nucleic acid synthesis activity.
  • the basic protein on which the chimeric protein is based can be in two basic forms.
  • the base protein comprises only the nucleic acid synthesis activity, but not a sequence (also referred to herein as a domain, which, particularly in vivo, can or could mediate an interaction between the nucleic acid synthesis activity and a processivity factor, in particular not such that the interaction causes a Increased processivity is achieved.
  • the base protein comprises a nucleic acid synthesis activity and additionally a sequence which, in particular in vivo, can or could mediate an interaction between the nucleic acid synthesis activity and a processivity factor, in particular in such a way that an increase in the processivity is achieved by the interaction.
  • the chimeric protein according to the invention can be present in various basic embodiments based on the different forms of the basic protein.
  • a first embodiment of the chimeric protein provides that the first form of the base protein is used and a sequence mediating an interaction with a factor which increases the processivity of the nucleic acid synthesis activity is added to it. This addition is typically made in that the interaction-mediating sequence follows the sequence of the nucleic acid synthesis activity, optionally separated by a linker. In this first embodiment of the chimeric protein, the base protein is thus supplemented by an interaction mediating sequence.
  • the second form of the basic protein is used.
  • the sequence inherent in the basic protein is an interaction with a sequence mediating the factor increasing the processivity of the nucleic acid synthesis activity by another sequence mediating an interaction with a factor increasing the processivity of the nucleic acid synthesis activity.
  • This other sequence can originate from another gene of the same organism, from the same gene from another organism or from a different gene from another organism and is therefore in any case of a different origin.
  • Suitable as basic proteins are all proteins, polymerases and elongation proteins mentioned in the introduction, the disclosure of which is hereby incorporated by reference. The same applies to the other components, in particular those of the replication apparatus, such as processivity factors, glide clip proteins and interaction-mediating or interaction-dependent sequences. Finally, the definitions given in the introduction also apply to this part of the disclosure.
  • Thermus thermusphilus Therotoga maritima, Therotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Anaerocellum thermophilum, Bacillus caldotenax, or Bacillus stearothermophilus.
  • nucleic acid sequences are usually addressed directly as nucleic acid sequences.
  • nucleic acids coding for the recombinant chimeric proteins according to the invention can easily be determined by those skilled in the art using the genetic code and then synthesized.
  • Suitable vectors for cloning and expression of the recombinant chimeric proteins according to the invention and methods for their preferred recombinant production are also known to the experts (see, for example, Maniatis et al .; loc. Cit.).
  • the recombinant chimeric protein according to the invention can be used to elongate nucleic acids, e.g. B. for polymerase chain reaction, DNA sequencing, for labeling nucleic acids and other reactions that involve the in vitro synthesis of nucleic acids.
  • Methods for the template-dependent elongation of nucleic acids in which the elongation takes place starting from a primer which has been hybridized to the template nucleic acid and provides a free 3'-OH end for the elongation, are known to the person skilled in the art.
  • a polymerase chain reaction is carried out for the amplification. This is usually based on a double-stranded DNA sequence from which a specific target area is to be amplified.
  • two primers are used, which are complementary to the regions flanking the target sequence in each case on a partial strand of the DNA double strand.
  • the DNA double strands are first denatured, in particular thermally melted.
  • a further preferred use of the recombinant chimeric protein according to the invention is the sequencing of nucleic acids starting from at least one primer which is sufficiently complementary to a part of the nucleic acid to be sequenced, again using template-dependent elongation or, if RNA is sequenced, using reverse transcription of deoxynucleotides and dideoxynucleotides according to the Sanger method.
  • the respective derivatives described above are also considered suitable as deoxynucleotides or dideoxynucleotides.
  • it is preferred for the methods according to the invention for elongating nucleic acids that the nucleic acids formed are labeled.
  • the present invention furthermore relates to a method for labeling nucleic acids by inserting individual breaks in phosphodiester bonds in the nucleic acid chain and replacing a nucleotide at the break points with a labeled nucleotide using a polymerase, a thermostable in vitro complex according to the invention being used as the polymerase.
  • nick translation enables simple labeling of nucleic acids. All of the labeled ribonucleotides or deoxyribonucleotides or derivatives thereof already described above are suitable for this as long as the polymerase accepts them as a substrate.
  • Fig. 2 is a schematic representation of the recombinant according to the invention
  • FIG. 6A shows the entire sequence of an embodiment of a recombinant chimeric protein according to the invention
  • FIG. 7 shows the result of a polymerase chain reaction carried out using a chimeric protein according to the invention
  • 8A shows all fragments of Af0497 which interact with the slide clip protein of Archaeoglobus fulgidus (Af0335);
  • 8B shows an alignment of C-terminal sequences of different genes from nArchaeglobus fulgidus;
  • FIG. 10 shows the result of the amplification of genomic DNA using a recombinant chimeric protein according to the invention.
  • Example 1 Application of the yeast two-hybrid system for determining the amino acids which are important for the interaction between replication factors and gliding clip protein
  • GKP slide clamp proteins
  • RF replication factors
  • the open reading frames of the genes are then amplified by PCR from Archaeoglobus fulgidus genomic DNA.
  • the DNA thus obtained is cloned into the vectors pGBT9 and pGAD424.
  • Other vectors that are used in the two-hybrid system are also suitable for the method described below (these include, for example, pAD-GAL4-2.1, pBD-GAL4, pBD-GAL4 Cam, pCMV-AD, pCMV-BD, pMyr, pSos, pACT2, pAS2-1, pHISi, pLexA, pM, pHISi-1, pB42AD, pVP16, pGAD10, pGBKT7, pLacZi, p ⁇ op-lacZ, pGAD GH, pGilda, pAD GL, pGADT7, pGBDU, pDBLeu, pPC86, pDB86 die
  • modified clones are cloned into the same vectors.
  • the modified clones are deletion mutations and mutations relating to one or more amino acids of the GKP and / or the RF .
  • the ability of the modified clones to interact with one another in the two-hybrid system is then measured. This makes it possible to determine domains or even individual amino acid residues that are important or essential for the interaction.
  • deletions There are a number of ways to insert deletions into a gene.
  • One method of creating deletions is to make DNA fragments that contain the genes for GKP or RF. These fragments are obtained from a suitable vector either by PCR or by restriction digestion. Genomic DNA from the organism from which the two proteins originate is also used. These various DNA fragments and the genomic DNA are crushed by ultrasound treatment and fragments that have lengths between the total length of the genes and about 100 bases are purified by preparative agarose gel electrophresis. The ends of the fragments are filled in or digested by treatment with a suitable enzyme (Klenow, Pwo polymerase, or others), so that both strands have the same length and are therefore blunt.
  • a suitable enzyme Klenow, Pwo polymerase, or others
  • fragments are now inserted by ligation into a Smal cut (or otherwise linearized and blunted) pGAD424 and pGBT9 vector, or other suitable vectors.
  • the DNA of these banks is grown and purified after transformation in Escherichia coli.
  • the two banks are transformed into a haploid yeast strain suitable for the two hybrid system, so that the fusions from GKP or RF with the GAL4 DNA-binding domain are in a strain with a different mating type than the fusions from RF or GKP of GAL4 activation domain.
  • diploid cells are now generated in which the plasmids from both banks are present in the same cell.
  • PJ69-4 James P, Halladay J, Craig EA, Genetics 1996 Dec; 144 (4): 1425-36
  • any other strain with a genotype suitable for the two-hybrid system.
  • Cells in which the reporter genes are activated are isolated, and the plasmid DNA is obtained therefrom by preparation, or the inserts are specifically amplified by PCR.
  • the sequences of the fusion fragments are determined by DNA sequence analysis.
  • the binding region (or regions) is (are) determined by determining those regions which are found in all clones (or which are always found in certain groups of clones) where the two fusion proteins comprising RF and GKP interact. This determination is carried out four times for each of the genes: once with the bank in the vector with the activation domain (preferentially: pGAD424) and once with the bank in the vector with the DNA binding domain (preferentially: pGTB9), in each case once with the total length clone of the binding partner and once with the gene bank of fragments.
  • Example 2 Other methods of mapping the binding region of GKP and RF
  • Another way to map the binding region is to produce peptides and measure the binding of the peptides to the other protein.
  • the sequence of the peptides can be random (Songyang Z, Prog Biophys Mol Biol 1999; 71 (3-4): 359-72) or based on the amino acid sequence of the protein whose binding region is to be identified (petide scans, Brix J, Rudiger S, Bukau B, Schneider-Mergener J, Pfanner N, J Biol Chem 1999 Jun 4; 274 (23): 16522-30).
  • Such peptides can be made by chemical synthesis or other methods such as phage display and offered for binding. An example is shown in FIG. 3. Alignments were used to determine various consensus sequences that are suitable for the production of such peptides.
  • Another method is to produce antibodies against epitopes of the protein whose binding region is to be identified. If the antibody inhibits binding, the epitope of the antibody overlaps with the binding region (e.g. Fumagalli S, Totty NF, Hsuan JJ, Courtneidge SA, Nature 1994 Apr 28; 368 (6474): 871-4).
  • the binding region e.g. Fumagalli S, Totty NF, Hsuan JJ, Courtneidge SA, Nature 1994 Apr 28; 368 (6474): 871-4.
  • one way of determining or mapping the binding region is to clarify the fine structure of the complex using the methods of X-ray structure analysis, nuclear magnetic resonance or electron microscopy.
  • a positive control was amplified by PCR, cloned into the vectors pGBT9 and pGAD424 (see also horizontal rows in FIG.
  • the DNA of the gene for Af0497 was first obtained by restriction of a suitable vector which contained an elongation protein which comprised an interaction-dependent sequence , This DNA was then ultrasonically fragmented and ligated into the two vectors pGAD424 and pGBDU. This resulted in banks of different fragments of the gene in the two vectors. Next, using the yeast two hybrid system, it was determined which of these fragments could interact with Af0335. For this purpose, both banks were transformed into suitable yeast strains (pGAD424: PJ69-4a, PGBDU: PJ69-4alpha).
  • the polymerase Taq does not bind to the GKP (PCNA from Archaeoglobus fulgidus), and no interaction could be measured in the yeast two-hybrid system.
  • GKP PCNA from Archaeoglobus fulgidus
  • the grafting of the interaction-causing sequence of Af0497 to Taq caused a specific interaction of Taq with the gliding clip protein Af0335.
  • the results of the corresponding Y2H expehments are shown in FIG. 4.
  • this fragment (the carboxy-terminal end of the elongation protein Af0497) to cause an interaction with the gliding clip protein Af0335 can be transplanted or transferred to another protein, in particular to another polymerase, in order to interact there with the actually produce specific gliding clip protein for Af0497.
  • Such interaction-related sequences are contained in the last 50 amino acids of the Af0497 protein. Examination of the proteins that interact with PCNA revealed that they all contain a motif that is located just before the carboxy-terminal end of the amino acid sequence. A listing of the related sequences is shown in Fig. 8B, with a black bar indicating the conserved area.
  • This example shows the influence of PCNA on the efficiency of a PCR reaction.
  • a 463 bp fragment was amplified from plasmid DNA.
  • the taq fusion protein as also shown in FIG. 6A, was used as the polymerase.
  • the reaction conditions for the PCR were as follows: 0.4 mM of each dNTP (pH 8.3) and 20 pmol of each primer in one reaction.
  • a first primer (SEQ ID NO .: 13) with the sequence 5'-AGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3 'and a second primer (SEQ ID NO .: 14) with the sequence 5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3' were used.
  • Example 6 Yeast two-hybrid system for the detection of the interaction between the elongation protein Af 0497 from Archaeoglobus fulgidus and the slide clamp protein Af 0335 from Archaeoglobus fulgidus
  • Fig. 9 shows the results of a Y2H experiment where row A is populated with cells carrying the empty pGAD424 vector (Clontech, Palo Alto, USA) so that a transcription activation domain is expressed; the row B with cells which carry the pGAD424 vector from which the Sacharomyces cerevesiae gene CDC48 is expressed as a fusion protein with the transcription activation domain; row C is populated with cells carrying the pGAD424 vector, from which the Archaeoglobus fulgidus glide gene is expressed as a fusion protein with the transcriptional activation domain; row D is not populated with cells and row E is populated with cells that carry the pGAD424 vector from which the elongation protein gene from Archaeoglobus fulgidus is expressed as a fusion protein with the transcription activation domain.
  • row A is populated with cells carrying the empty pGAD424 vector (Clontech, Palo Alto, USA) so that a transcription activ
  • Column 1 is populated with cells that carry the empty pGBT9 vector (Clontech, Palo Alto, USA); column 2 is populated with cells which carry the pGBT9 vector, of which the Saccharomyces cerevisiae gene UFD3 is expressed as a fusion protein with the DNA binding domain; column 3 is populated with cells which carry the pGBT9 vector, from which the sliding clip protein from Archaeoglobus fulgidus is expressed as a fusion protein with the DNA binding domain; column 4 is populated with cells that carry the pGBT9 vector from which the coupling protein from Archaeoglobus fulgidus is expressed as a fusion protein with the DNA binding domain, and column 5 is populated with cells that carry the pGBT9 vector from which the elongation protein originates Archaeoglobus fulgidus is expressed as a fusion protein with the DNA binding domain.
  • Example 7 Polymerase chain reaction of genomic DNA using a chimeric elongation protein
  • Example 7 shows the influence of the slide clamp protein on the efficiency of a PCR reaction on longer DNA fragments using the recombinant recombinant chimeric protein according to the invention.
  • a 4954bp fragment was amplified from human genomic DNA.
  • the recombinant chimeric according to the invention was used as polymerase Protein used.
  • the conditions correspond to the standard conditions of a PCR reaction: pH 8.3, 0.4 mM of each dNTP and 20 pmol of each primer in one reaction.
  • a first primer ((SEQ ID NO .: 15): 5'-AGGAACAACATATGACGCACTCT-3 ')
  • a second primer ((SEQ ID NO . : 16): (5'-TAGGTGGCCTGCAGTAATGTTAG-3') were used.
  • FIG. 1 shows sequence alignments of a total of four different elongation protein domains from different organisms, for example for the elongation protein 1 from humans, Archaeglobus fulgidus, Methanococcus thermoautotrophicusm, PHBT (Pyrococcus horikoshii), and Methanococcus janashii.
  • the figures often have a consensus sequence in a spelling, in which varying positions are indicated by a single character.
  • the square ones Amino acids given in brackets represent those amino acids, expressed in the one-letter code, that can appear at the specific position.
  • amino acids are named in accordance with the standard IUPAC one-letter nomenclature and listed in accordance with the Prosite Pattern description standard.
  • amino acid groups are often summarized:
  • Figure 1 gives four different consensus sequences for different areas of elongation proteins, e.g. the ionization protein 3 can often be found in eubacteria, the elongation protein 4 also includes the Taq polymerase and can often be found in Pol I type polymerases. Elongation protein 3 thus shows an alignment of a conserved region of the elongation protein from eubacteria, and the consensus sequences derived therefrom.
  • DP3A_ECOLI DNA Pol III, alpha subunit, Escherichia coli, BB0579: DNA Pol III, alpha subunit, Borrelia burgdorferi, DP3AJHELPY: DNA Pol III, alpha subunit, Helicobacter pylori AA50: Aquifex aeolicus, section 50 and DP3A_ALT DNA Pol III, alpha subunit, Salmonella typhimurium).
  • FIG. 3 shows four slide bracket consensus sequences
  • region 1 glide clip Human PCNA, as well as an orthologist, from Archaeoglobus fulgidus, from Methanococcus janashii, from Pyrococcus horikoschü and from Methanococcus thermoautothrophicus.
  • Region 2 shows an alignment of a second conserved region of the gliding clip from eukaryotes and archae, as well as the consensus sequences derived from them. The alignment was created using a second region of the slide clamps already used in region 1 above.
  • Region 3 shows an alignment of a conserved region of the gliding clip from eubacteria, as well as the consensus sequences derived from it.
  • the following genes are shown: AAPOL3B, DP3B_ECOLI, S.TYPHIM, DP3B_PROMI, DP3B_PSEPU and DP3B_STRCO (AAPOL3B: Aqufex Aeolicus section 93: DP3B_ECOLI: DNA Pol III, beta chain, Escherichia coli, S.TYPHIM: DNA Polmon typhimurium, P3B_PROMI: DNA Pol III, beta chain, Proteus mirabilis DP3B_PSEPU: DNA Pol III, beta chain, Pseudomonas putida DP3B_STRCO: DNA Pol III, beta chain, Streptomyces coeiicolor).
  • Region 4 shows an alignment of a second conserved region of the gliding clip from eubacteria (see organisms in region 3), as well as the consensus sequences derived therefrom
  • FIG. 4 shows the interaction of chimeric proteins in the yeast two-hybrid system.
  • the result shown in Fig. 4 proves that the property interacts with to condition the gliding clip protein Af0335, can be transplanted to another protein, in particular to another polymerase, in order to produce an interaction with the gliding clip protein.
  • the GKP binds itself and the GKP binds a Taqfusionsprotein which comprises an interaction-dependent sequence from Archaeglobus fulgidus.
  • Sequence 1 (polymerase gene, Af 0497 homologs): Archaeoglobus fulgidus, Pyrodicti- um occultum, Aeropyrum pernix, Pyrococcus glycovorans, Pyrococcus furiosus, Thermococcus gorgonarius, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshii l
  • Sequence 3 (Af 1347 homologs), Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshii, Methanobacterium thermoautotrophicum and Aeropyrum pernix.
  • the interaction-dependent sequences can be introduced into a chimeric protein according to the invention in order to bind a GKP.
  • the interaction-dependent sequences can be introduced into a chimeric protein according to the invention in order to bind a GKP.
  • 5C shows a list of characters which are used to identify one or more different amino acids, with "amino acid” or the property of the group under “class”, the character used under “key” and the amino acids under “rest” of the group.
  • FIG. 6A shows the overall sequence of a preferred embodiment of the recombinant chimeric protein according to the invention.
  • the elongation protein and thus the nucleic acid synthesis activity comes from Thermus aquaticus and the interaction-dependent sequence from Archaeglobus fulgidus.
  • FIG. 6B shows a graphic overview of the structure of a preferred embodiment of the recombinant chimeric protein according to the invention.
  • Elongation protein from Thermus aquaticus.
  • interaction-related sequence from Archaeglobus fulgidus.
  • FIG. 7 shows the use of a recombinant chimeric protein according to the invention in PCR, the sequence of which is shown in FIG. 6A.
  • plasmid DNA pCR 2.1 vector including a 463bp fragment; In Vitrogen, 9704 CH Groningen; Netherlands
  • the reactions were applied to the gel in each case with 20 ⁇ l of a 50 ⁇ l mixture, track 7 shows a size standard.
  • 8B shows an alignment of the C-terminal sequences of the following genes Af 0497-grUE, Af 1195 Rfc, Af 0264 Rad2-Fen1, Af 0621 RNAseH,, Archaeglobus fulgidus.
  • FIG. 9 shows the result of a yeast two-hybrid test and demonstrates a bond between the yeast proteins ufd3 and cdc48 (2B; positive control), between the elongation protein and the glide clip protein (3E; and in the reverse orientation 5C), between the glide clip protein and the glide clip protein ( 3C) and between the coupling protein and the glide clip protein (4C).
  • the fusion proteins are expressed from the vectors pGBT9 (vector) in column 1, pGBT9 :: ufd3 (positive control) in 2, pGBT9: .PCNA in 3, pGBT9 :: klUE in 4, pGBT9 :: grUE in 5, pGAD424 (vector) in row A, pGAD424 :: cdc48 in B (positive control), pGAD424 :: PCNA in C, empty in D and pGAD :: grUE in E.
  • the amplificate of a PCR reaction based on human genomic DNA with a size of 4954 base pairs is among the following conditions: 95 ° C 5 ' denaturation; 35 x ⁇ 95 ° C 30 " denaturation; 47 ° C 30 " hybridization; 72 ° C 12 ' elongation ⁇ ; 72 ° C 10 additional elongation was carried out, 20 ⁇ l of a 50 ⁇ l batch was applied to the gel.

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Abstract

The invention relates to a recombinant chimeric protein comprising a) a first domain with a nucleic acid synthesis activity and b) an interaction mediating sequence, whereby said interaction mediating sequence can form a complex through the nucleic acid synthesis activity and a slide bracketing protein. Said complex is different from the complex formed through the nucleic acid synthesis activity and/or the slide tying protein with their natural interaction partner(s).

Description

Chimäre Proteine
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Chimäre Proteine, die eine Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisen, diese enthaltende Komplexe, für diese codierende Nukleinsäuren, diese enthaltende Vektoren und Zellen, einen dagegen gerichteten Antikörper, Verwendungen dieser Proteine, diese enthaltende Kits sowie Verfahren zur Elongation, Amplifikation, reversen Transkription, Sequenzierung und Markierung von Nukleinsäuren.
Viele Proteine liegen in der Zelle nicht als Monomere vor, sondern sind Teil eines funktioneilen multimeren Komplexes. Beispiele für solche Komplexe sind in fast allen Bereichen der Zellbiologie beschrieben (z.B. Transkription, Translation, Replikation, Zytoskelett, Signaltransduktion, mRNA processing).
Die Wechselwirkung oder Bindung eines Proteins mit einem oder an ein anderes Protein, hierin im folgenden Donorprotein und Akzeptorprotein genannt, erfolgt über bestimmte Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen, die im gefalteten Protein meist an der Oberfläche des Proteins liegen und für die spezifische Bindung oder Wechselwirkung an oder mit dem Partner verantwortlich sind. Diese Aminosäuren bzw. eine solche Aminosäuresequenz wird hierin im folgenden als "Wechselwirkungbedingende Sequenz" oder Wechselwirkung-vermittelnde Sequenz bezeichnet. Den Fachleuten ist dabei bekannt, daß die Aminosäuren, die an der Ausbildung einer Wechselwirkung beteiligt sind, nicht notwendigerweise in der primären Aminosäuresequenz unmittelbar aufeinanderfolgen, sondern ggf. mehr oder weniger stark konservierte Positionen innerhalb der Aminosäuresequenz des Proteins oder Peptids dafür verantwortlich zeichnen. Wenn hierin im folgenden von der Ermittlung der Wechselwirkung vermittelnden oder Wechselwirkung bedingenden Sequenz gesprochen wird, sollen damit beide vorstehend genannten Aspekte verstanden werden. In diesem Zusammenhang sind als Donorproteine solche Proteine zu verstehen, die mit einem weiteren Protein interagieren und gegebenenfalls ein weiteres Protein binden. Gleichermaßen sind als Akzeptorproteine solche Proteine zu verstehen, die mit einem weiteren Protein interagieren und gegebenenfalls ein weiteres Protein binden
Es gibt eine Reihe von Methoden, um die Wechselwirkung-bedingende Sequenz einer Protein-Protein-Interaktionsstelle zu ermitteln. Dazu gehört (i) die Bestimmung der dreidimensionalen Struktur eines Komplexes aus Donor- und/oder Akzeptorprotein durch Röntgenstrukturanalyse oder (ii) NMR-Methoden. Eine weitere Methode ist (iii) eine Komplexbindung in vitro mit rekombinanten Proteinen zu rekonstituieren und durch gezielte Veränderung des Donor- oder Akzeptorproteins die Wechselwirkung-bedingende^) Sequenz(en) zu ermitteln. Solche gezielten Veränderungen be- Inhalten die Mutation von einzelnen Aminosäuren, zum Beispiel zu Alanin (Alanin- scanning) oder die Deletion von Sequenzen im Protein. Führt die Veränderung oder Deletion einer Aminosäure oder Sequenz zum Verlust der Wechselwirkungs- oder Bindeaktivität, so ist sie Teil der Wechselwirkung-bedingende Sequenz, und umgekehrt, führt die Veränderung oder Deletion einer Aminosäure oder Sequenz nicht zum Verlust der Wechselwirkungs- oder Bindeaktivität so ist sie nicht Teil der Wechselwirkung-bedingende Sequenz. Auf diese Art und Weise läßt sich die Wechselwirkung-bedingende Sequenz definieren.
Eine weitere Methode zur Bestimmung der Wechselwirkung-bedingende Sequenz eines Proteins beruht auf der Verwendung eines Zweihybridsystems, hierin im folgenden auch als "Y2H" abgekürzt. Y2H Systeme beruhen darauf, daß man ein Pro- tein mit einer nachweisbaren Aktivität (wie z.B. das Enzym "Dihydrofolatreduktase") als zwei nicht kovalent miteinander verbundene Teile exprimiert. Dieses Protein ist inaktiv, wenn die beiden Teile sich nicht in räumlicher Nähe zu einander befinden. Die beiden zu untersuchenden Proteine, von denen man weiß, daß oder untersuchen möchte, ob sie miteinander in Wechselwirkung treten und somit einen Komplex ausbilden können, d.h. Donorprotein und Akzeptorprotein, werden unter Ausbildung jeweils eines Fusionsproteins mit jeweils einem der beiden Teile des Proteins mit der nachweisbaren Aktivität (wie z.B. Dihydrofolatreduktase) fusioniert und exprimiert so daß zwei Fusionsproteine entstehen. Wenn das fusionierte Donorprotein das fusio- nierte Akzeptorprotein bindet, kommen die beiden Hälften des nachweisbaren Proteins (wie z.B. Dihydrofolatreduktase) in räumliche Nähe zueinander. Dadurch wird die Aktivität des Proteins wiederhergestellt, die sodann nachgewiesen werden kann. Als Proteine mit nachweisbarer Aktivität können Enzyme (Dihydrofolatreduktase, beta-Galactosidase) Signaltransduktionsproteine (Cdc25 aus Saccharomyces cere- visiae) oder Transkriptionsaktivatoren (Gal4, LexA-VP16) eingesetzt werden. Die Ermittlung der Bindungsregion mit Hilfe des Zweihybridsystems beruht auf der gleichen Überlegung wie bei der /n-wrro-Rekonstitution der Bindung: Führt die Veränderung oder Deletion einer Aminosäure oder Sequenz zum Verlust der Bindeaktivität so ist sie Teil der Wechselwirkung-bedingende Sequenz, und umgekehrt, führt die Ver- änderung oder Deletion einer Sequenz nicht zum Verlust der Bindeaktivität so ist sie nicht Teil der Wechselwirkung-bedingende Sequenz.
Zusätzlich dazu kann man die Wechselwirkung-bedingende Sequenz darüber definieren, daß eine Vielzahl von Fragmenten des Proteins bezüglich ihrer Interaktion untersucht und bestimmt wird, welche Teile des Proteins in den interagierenden oder wechselwirkenden Fragmenten immer vorhanden sind. Dieser stets vorhandene Bereich ist die Wechselwirkung-bedingende Sequenz. Um die in einer Wechselwirkungbedingende Sequenz für die Wechselwirkung oder Bindung wesentlichen Aminosäuren zu identifizieren, kann man durch gezielte Mutationen einzelne Aminosäuren ver- ändern. Verlust oder Erhöhung der Bindeaktivität weisen darauf hin, daß diese Positionen direkt an der Wechselwirkung beteiligt sind. Unter den für in vitro Anwendungen besonders bevorzugten Komplexen gehören die thermostabilen Komplexe prokaryontischer und eukaryontischer Replikationsappa- rate, die als wichtige Enzymaktivität häufig Polymerasen beinhalten.
Wie eingangs erwähnt spielt die Wechselwirkung zwischen Proteinen in vivo eine große Rolle, so z. B bei der Replikation der Nukleinsäure in biologischen Systemen. So sind hochprozessive Replikationsmechanismen bekannt, wobei es sich dabei zum einen um zelluläre Mechanismen und zum anderen um die bei den Bakteriophagen T4 und T7 auftretetenden Repliaktionsmechanismen handelt.
Der Replikationsapparat umfaßt eine Vielzahl von Komponenten. Dazu gehören, unter anderem, a) Polymeraseaktivität aufweisende Proteine, b) Proteine, die an der Ausbildung einer Klammerstruktur beteiligt sind, wobei der Klammerstruktur unter anderem die Aufgabe zukommt, eine Polymeraseaktivität an ihr Template oder Matrize zu binden und die Bindung zu stabilisieren und somit die Dissoziationskonstante des Komplexes aus Polymerase und Nukleinsäure entsprechend zu ändern, c) Proteine, welche die Klammer auf das Template laden, d) Proteine, welche das Template stabilisieren und gegebenenfalls e) Proteine, welche die Polymerase an das Template führen .
Unter Polymeraseaktivität aufweisenden Proteinen werden hierin insbesondere solche Proteine verstanden, die ein oder mehrere Nukleotide oder Nukleoside an ein Nukleotid oder Nukleosid oder Polynukleotid oder Polynukleosid zu binden in der Lage sind. Dabei kann es sich in einem jeden der vorstehenden Fälle um Ribunukleoti- de/ Ribunukleoside oder Deoxynukleotide/ Deoxynukleoside oder Polymere davon handeln. Zu diesen Proteinen gehören somit neben DNA-Polymerasen auch RNA- Polymerasen, unabhängig davon, ob für die Polymerisationsreaktion des Proteins eine Matrize benötigt wird oder nicht. Diese Polymeraseaktivität aufweisende Protei- ne sind somit auch Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisende Proteine. Zu ihnen gehören auch die als solches im Stand der Technik bekannten Elongationsproteine. Unter Elongationsprotein soll hierin im übrigen ein Polymeraseaktivität-aufweisendes Protein oder Komplex verstanden werden, das oder der mindestens eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweißt: Verwendung von RNA als Template, Verwendung von DNA als Template, Synthese von RNA, Synthese von DNA, Exonukleaseak- tivität in 5'-3' Richtung oder Exonukleaseaktivität in 3'-5' Richtung, Strangverdrängungsaktivität (engl. strand-displacement activity) und Prozessivität oder Nicht- Prozessivität.
DNA-Polymerasen gehören zu einer Gruppe von Enzymen, die einzelsträngige DNA als Template für die Synthese eines komplementären DNA Stranges verwenden. Diese Enzyme spielen eine bedeutende Rolle im Nukleinsäurestoffwechsel, einschließlich der Prozesse DNA-Replikation, Reparatur und Rekombination. DNA- Polymerasen wurden in allen zellulären Organismen identifiziert, von bakteriellen bis zu menschlichen Zellen, in vielen Viren sowie in Bakteriophagen (Kornberg, A. & Baker, T. A. (1991) DNA Replikation WH Freeman, New York, NY). Man faßt in der Regel die Archaebakterien und die Eubakterien zusammen zu der Gruppe der Proka- ryonten, der Organismen ohne echten Zellkern, und stellt ihnen die Eukaryonten, die Organismen mit echtem Zellkern, gegenüber. Gemeinsam sind vielen Polymerasen aus den verschiedensten Organismen oftmals Ähnlichkeiten in der Aminosäuresequenz sowie Ähnlichkeiten in der Struktur (Wang, J., Sattar, A.K.M.A.; Wang, C.C., Karam, J.D., Königsberg, W.H. & Steitz, T.A. (1997) Crystal Structure of pol α familily replication DNA polymerase from bacteriophage RB69.Cell 89, 1087-1099). Organismen wie der Mensch besitzen eine Vielzahl von DNA-abhängigen Polymerasen, von denen jedoch nicht alle für die DNA Replikation zuständig sind, sondern einige auch DNA-Reparatur durchführen. Replikative DNA-Polymerasen bestehen in vivo meist aus Proteinkomplexen mit mehreren Einheiten, welche die Chromosomen der zellulären Organismen und Viren replizieren. Eine generelle Eigenschaft dieser replizierenden Polymerasen ist im allgemeinen eine hohe Prozessivität, das heißt, deren Fähigkeit, Tausende von Nukleotide zu polymerisieren ohne vom DNA Template ab- zudissoziieren (Kornberg, A. & Baker, T. A. (1991) DNA Replikation. WH Freeman, New York, NY).
DNA-Polymerasen werden unter anderem durch zwei Eigenschaften charakterisiert, ihre Elongationsrate, das heißt die Anzahl der Nukleotide, die sie pro Sekunde in einen wachsenden DNA-Strang inkorporieren können und ihre Dissoziationskonstante. Wenn die Polymerase nach jedem Inkorporationsschritt eines Nukleotids in die wachsende Kette wieder vom Strang abdissoziiert (d.h. ein Elongationsschritt erfolgt pro Bindungsereignis), dann hat die Prozessivität den Wert 1 und die Polymerase ist nicht prozessiv. Wenn die Polymerase für wiederholte Nukleinsäureinkorporationen mit dem Strang verbunden bleibt, dann wird die Elongation oder der Replikationsmodus und damit auch die Polymerase als prozessiv bezeichnet und kann einen Wert von mehreren Tausend erreichen (siehe hierzu auch: Methods in Enzymology Volume 262, DNA Replication, Edited by J. L. Campbell, Academic press 1995, pp. 270-280).
Die unter b) genannten Proteine bilden Strukturen aus, die entweder offen oder geschlossen sind, beispielsweise ringförmige oder halbringförmige Strukturen. Derlei Strukturen können durch eine oder mehrere Spezies von Proteinen ausgebildet werden. Dabei ist es möglich, daß eine der besagten Proteinspezies eine Polymerase- aktivität aufweist.
Die für die Ausbildung dieser Strukturen verantwortlichen Proteine werden, sofern sie keine Polymeraseaktivität aufweisen, hierin im folgenden als „Gleitklammerproteine" oder „Klammerproteine" bezeichnet.
Es ist bekannt, daß der Replikationsapparat in Archaea dem eukaryontischen Replika- tionsapparat ähnlich ist, obwohl die Genomorganisation in Eukaryonten und Archaea gänzlich verschieden ist und die zelluläre Struktur der Eubakterien der der Archaea ähnelt. (Edgell, D.R. and Doolittle, W.F. (1997). Archaea and the origin(s)of DNA replicati- on proteins. Cell 89, 995-998.). Die Gleitklammer ist häufig über ein oder mehrere weitere Proteine an ein Elongations- protein gebunden, mit anderen Worten an das Elongationsprotein gekoppelt. Ein derartiges koppelndes Protein wird hierin im folgenden als Kopplungsprotein bezeichnet, wobei gegebenenfalls die Kopplung über eine Mehrzahl von Kopplungsproteinen erfolgen kann.
Die dreidimensionale Struktur von verschiedenen Gleitklammerproteinen wurde bereits bestimmt. Die Gesamtstruktur dieser Gleitklammern ist sehr ähnlich; die Bilder der ringförmig ausgebildeten Proteingesamtstruktur von PCNA, der ß-Untereinheit und gp45 Ringe sind übereinandergelegt deckungsgleich (Kelman, Z. & O'Donnell, M. (1995) Structural and functional similarities of prokaryotic and eukaryotic sliding clamps. Nucleid Acids Res. 23, 3613-3620). Jeder Ring hat vergleichbare Dimensionen und eine zentrale Öffnung, die groß genug ist, um Duplex-DNA, also einen DNA- Doppelstrang, bestehend aus den zwei komplementären DNA-Strängen, zu umschließen.
Die Gleitklammer kann sich in vivo nicht selbst um die DNA herum positionieren, sondern muß um die DNA fixiert werden. In Prokaryonten und Eukaryonten besteht ein derartiger Proteinkomplex aus einer Vielzahl von Untereinheiten. Der Proteinkomplex erkennt das 3'-Ende des Primers eines „Phmer-Template-Duplexes", der zu einem längeren Doppelstrang durch Einbau von Nukleotiden ergänzt werden soll, und positioniert die Gleitklammer um die DNA.
Im Falle des Bacteriophagen T7 wird das gleiche Ziel, eine prozessive DNA-Synthese, wie unten definiert, mittels eines strukturell anderen Proteinkomplexes erreicht. Der Phage exprimiert eine eigene katalytische Polymerase, die T7-Polymerase, die das Genprodukt des gene 5 und mit einem Protein aus dem Wirt Escheπchia coli, dem Thioredoxin, eine Bindung eingeht und als Replikase eine hochprozessive DNA- Replikation ermöglicht. Auch hierbei kommt es zur Ausbildung einer Klammer, jedoch weist diese Klammer nicht die gleiche Struktur auf, wie z.B. im Falle des eukaryonti- schen PCNA. Oft ist es nötig, wie zum Beispiel im Falle der humanen Polymerase δ, daß Proteine (Kopplungsproteine) die Verbindung zwischen dem katalytisch aktiven Teil der Polymerase und einem Prozessivitätsfaktor schaffen. Ein Prozessivitätsfaktor ist eine Verbindung oder ein Molekül, das die Prozessivität einer Polymerase beeinflußt, bevorzugterweise erhöht. Ein Beispiel für einen Prozessivitätsfaktor stellen die Gleitklammerproteine dar. Beim Menschen ist dieses Kopplungsprotein die kleine Untereinheit der δ- Polymerase (Zhang, S.-J., Zeng, X.-R., Zhang, P., Toomey, N.L., Chuang, R.Y., Chang, L.-S., and Lee, M.Y.W.T. (1994). A conserved region in the amino terminus of DNA polymerase δ is involved in proliferating cell nuclear antigen binding. J. Biol. Chem. 270, 7988-7992). Im Falle der T7 Polymerase jedoch bindet der Prozessivitätsfaktor die katalytische Einheit der Polymerase direkt ohne Beteiligung eines Kopplungsproteins.
Die in vitro Anwendung von Proteinen mit Nukleinsäuresyntheseaktivität wie Polymerasen oder Elongationsproteinen ist in der Technik weit verbreitet, so z.B. bei der Polyme- rase-Kettenreaktion (PCR), Sequenzierung von Nukleinsäuren oder reversen Transkription. Dabei ist bei den meisten in vitro Anwendungen, wie PCR oder Sequenzierungsprozesse, Prozessivität eine wünschenswerte Eigenschaft, die allerdings die bis- lang in diesen Reaktionen eingesetzten thermostabilen Enzyme nach dem Stand der Technik nur in geringem Maße besitzen.
Die U.S. Patente 4,683,195, 4,800,195 und 4,683,202 beschreiben die Anwendung solcher thermostabiler DNA-Polymerasen in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). In der PCR wird unter Verwendung von Primern, Template (auch Matrize genannt), Nu- kleotiden, einer DNA-Polymerase, eines entsprechenden Puffers und bei geeigneten Reaktionsbedingungen DNA neu synthetisiert. In dieser PCR wird bevorzugt eine thermostabile Polymerase verwendet, die das zyklische thermische Aufschmelzen der DNA-Stränge übersteht. So wird häufig Taq DNA-Polymerase verwendet (U.S. Patent 4,965,188). Die Prozessivität der Taq DNA-Polymerase ist jedoch, wie oben ausgeführt, relativ gering im Vergleich zu derjenigen der T7-Polymerase. DNA-Polymerasen finden auch bei der DNA -Sequenzbestimmung Anwendung (Sanger et al., Proc. Nάtl. Acad. Sei., USA 74:5463-5467 (1997)). Eine der hierbei verwendeten Polymerasen kann z.B. die oben erwähnte Tag-Polymerase (U.S. Patent 5,075, 216) oder die Polymerase von Thermotoga neapolitana (WO 96/10640) oder andere thermostabile Polymerasen sein. Neuere Verfahren koppeln die exponentielle Amplifi- kation und die Sequenzierung eines DNA Fragmentes in einem Schritt, so daß es möglich ist, genomische DNA direkt zu sequenzieren. Eines der Verfahren, das sogenannte DEXAS-Verfahren (Nucleic Acids Res 1997 May 15;25(10):2032-2034 Direct DNA se- quence determination from total genomic DNA. Kilger C, Pääbo S, Biol. Chem. 1997 Feb; 378(2):99-105 Direct exponential amplification and sequencing (DEXAS) of genomic DNA. Kilger C, Pääbo S und DE 19653439.9 sowie DE 19653494.1) verwendet eine Polymerase mit verminderter Diskriminierungsfähigkeit gegenüber Dideoxynukleo- tiden (ddNTPs) im Vergleich zu Deoxynukleotiden (dNTPs) sowie einen Reaktionspuffer, zwei Primer, die bevorzugt nicht äquimolar vorliegen, und die oben genannten Nukleotide, um dann in mehreren Zyklen eine komplette, sequenzspezifische DNA-Leiter eines Fragmentes zu erhalten, welches von den Primern flankiert ist. Eine Weiterentwicklung dieses Verfahrens besteht in der Verwendung eines Polymerasegemisches, wobei eine der beiden Polymerase zwischen ddNTPs und dNTPs diskriminiert, wäh- rend die zweite eine verminderte Diskriminierungsfähigkeit aufweist (Nucleic Acids Res 1997 May 15;25(10):2032-2034 Direct DNA sequence determination from total genomic DNA. Kilger C, Pääbo S).
DNA-Polymerasen finden des weiteren Anwendung bei der reversen Transkription von RNA in DNA. Hierbei dient RNA als Template und die Polymerase synthetisiert einen komplementären DNA-Strang. Zur Anwendung kommt hier z.B. die thermostabile DNA- Polymerase aus dem Organismus Thermus thermusphilus (Tth) (U.S. Patent 5,322,770).
Manche Polymerasen besitzen eine 'proof-reading'- Aktivität, also eine 3'-5' Exonuklea- seaktivität. Diese Eigenschaft ist insbesondere dann wünschenswert, wenn das zu synthetisierende Produkt mit einer niedrigen Fehlerrate bei der Nukleotidinkorporation hergestellt werden soll. Ein Beispiel stellen Polymerasen aus dem Organismus Pyro- coccus wosei dar.
Die oben genannten Elongationsproteine, die in den vorstehend genannten Anwendungen zum Einsatz kommen, gehören in vivo größtenteils nicht zu den eigentlichen Replikationsenzymen, sondern es sind zumeist Enzyme, von denen man annimmt, daß sie bei der DNA-Reparatur beteiligt sind, weshalb deren Prozessivität relativ gering ist. Zudem besitzt jeder Organismus eine Vielzahl von Polymerasen die eine Vielzahl von Eigenschaften besitzen.
Solche Elongationsproteine weisen, wie oben ausgeführt, z.B. die folgenden Eigenschaften auf: Verwendung von RNA als Template, Verwendung von DNA als Template, Synthese von RNA, Synthese von DNA, Exonukleaseaktivität in 5'-3' Richtung und Exonukleaseaktivität in 3'-5' Richtung, Strangverdrängungsaktivität (strand- displacement activity), Prozessivität oder Nicht-Prozessivität oder Thermostabilität oder Thermosensitivität auf. In vivo ist es jedoch häufig so, daß ein Proteinkomplex eine oder mehrere dieser Eigenschaften vereint. Insbesondere liegen in vivo oftmals Repli- kationskomplexe vor, deren Prozessivität, wie oben ausgeführt, durch das Vorhanden- sein eines Gleitklammerproteins gesteigert wird.
Neben den oben genannten Bestandteilen von Replikationsapparaten findet man in vivo häufig auch andere DNA-modifizierende Proteine in größeren Komplexen mit weiteren Proteinen. In solchen Komplexen kommt es oftmals dazu, daß von einem ersten Protein "eine DNA-modifizierende Aktivität", wie beispielsweise terminale- Transkriptase-Aktivität, vereinigt wird mit einer oder mehreren, durch ein weiteres Protein in den Komplex eingebrachten Aktivität(en), wie beispielsweise Exonukleaseaktivität. Unter DNA-modifizerender Aktivität ist hierin jede enzymatische Aktivität, die zu einer chemischen, physikalischen oder strukturellen Veränderung einer Ausgangs- Nukleinsäure führt, zu verstehen. Es kommt auch vor, daß eine DNA-modifizierende Aktivität erst durch die Interaktion mit mindestens einem weiteren Protein zustande kommt. Weiter ist es möglich, daß eine DNA-modifizierende Aktivität verringert oder gesteigert wird durch die Interaktion mit mindestes einem weiteren Protein. Somit entsteht in vivo oftmals ein Proteinkomplex der z.B. die Summe der Einzelaktivitäten trägt oder dessen Aktivität gegenüber der Einzelaktivität verbessert ist.
Wie sich aus dem Vorstehenden ergibt, weisen in vivo Komplexe, die eine Nukleinsäuresyntheseaktivität umfassen, oftmals weitere, für die technische, d.h. in vitro Anwendung erwünschte Eigenschaften auf, die über die eigentliche Nukleinsäuresyntheseaktivität hinausgehen und von den weiteren, den Komplex ausbildenden Komponenten beigesteuert werden.
Eine unmittelbare technische Verwendung derartiger in vivo Komplexe z. B. zu Zwek- ken der Durchführung einer Sequenzierung von DNA, Durchführen einer Polyme- raseketten-Reaktion oder Einführen von Markierungen in Nukleinsäuren scheiterte bisher aus einer Reihe von Gründen. Ein Grund war und ist die fehlende Kenntnis aller an der Ausbildung des interessierenden Komplexes beteiligter Faktoren oder Einzelkomponenten. Ein weiterer Grund besteht darin, daß der mehrere Komponenten umfassende Komplex neben den erwünschten auch eine oder mehrere unerwünschte Eigenschaften aufweist.
Ein zur in vitro Verwendung von in vivo Komplexen alternativer Ansatz sieht vor, Komponenten mit verschiedenem Ursprung, die jedoch für sich die erwünschte Eigenschaft besitzen, miteinander zu kombinieren und auf diese Weise den Komplex mit den erwünschten Eigenschaften auszubilden. Eine derartige Eigenschaft kann bspw. eine höhere Prozessivität sein. Dieser Ansatz scheiterte in der Technik daran, daß die den Komplex ausbildenden Einzelkomponenten, die miteinander in Wechselwirkung treten müßten, dies nicht oder nur schlecht taten und somit dem Komplex ebenfalls nicht die erwünschten Eigenschaften verliehen werden konnten.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Proteine mit einer Nukleinsäuresyntheseaktivität bereitzustellen, die eine erhöhte Prozessivität aufweisen. Es ist weiterhin eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das die Konstruktion derartiger Proteine erlaubt.
Schließlich ist es eine Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur Amplifikation, insbesondere durch PCR, sowie Sequenzierung von Nukleinsäuren bereitzustellen, die die Amplifizierung und/oder Sequenzierung längerer Nukleinsäuren erlauben.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein rekombinantes chimäres Protein umfassend
a) eine erste Domäne mit Nucleinsäuresyntheseaktivität, und b) eine Wechselwirkung vermittelnde Sequenz, wobei
durch die Wechselwirkung vermittelnde Sequenz ein Komplex aus Nukleinsäuresyntheseaktivität und Gleitklammerprotein gebildet wird und der Komplex verschieden ist von dem Komplex, den die Nukleinsäuresyntheseaktivität und/oder das Gleitklammerprotein mit ihren natürlichen Wechselwirkungspartner (n) ausbildet.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst durch ein chimäres Protein umfassend einen Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisenden Anteil, wobei der Anteil aus einem einen Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisenden Anteil und einen Wechselwirkung vermittelnden Anteil umfassenden Basisprotein stammt, und mindestens einen eine Wechselwirkung vermittelnden Anteil, wobei der Wechselwirkung vermittelnde Anteil verschieden ist von dem Wechselwirkung vermittelnden Anteil des Basisproteins.
In einer Ausführungsform ist dabei vorgesehen, daß das Protein den Wechselwirkung vermittelnden Anteil des Basisproteins umfaßt.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein chimäres Protein umfassend einen Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisenden Anteil, wobei der Anteil aus einem Basisprotein stammt, das einen Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisenden Anteil aber keinen Wechselwirkung vermittelnden Anteil umfaßt, und einen Wechselwirkung vermittelnden Anteil.
Bei den erfindungsgemäßen Chimären Proteinen kann vorgesehen sein, daß der Wechselwirkung vermittelnde Anteil eine Bindung zwischen der Nukleinsäuresyntheseaktivität und einem die Syntheseleistung der Nukleinsäuresyntheseaktivität beeinflussenden Faktor vermittelt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist dabei vorgesehen, daß der Faktor ein Gleitklammerprotein ist.
In einer Ausführungsform kann vorgesehen sein, daß die Nucleinsäuresyntheseaktivität eine Konsensuspeptidsequenzen umfaßt, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die die Sequenzen SEQ ID NO.: 1 , 2 und 3 umfaßt.
In einer weiteren Ausführungsform kann vorgesehen sein, daß das Gleitklammerprotein eine Konsensuspeptidsequenz umfaßt, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die die Sequenzen SEQ ID NO.: 4, 5, 6 und 7 umfaßt .
In einer noch weiteren Ausführungsform kann vorgesehen sein, daß die Wechselwir- kung vermittelnde Sequenz eine Konsensuspeptidsequenz umfaßt, welche ausgewählt ist aus der Gruppe, die die Sequenzen SEQ ID NO.: 8, 9, 10 11 und 12 umfaßt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist dabei vorgesehen, daß die Wechselwirkung vermittelnde Sequenz eine Konsensuspeptidsequenz gemäß SEQ ID NO.: 8 umfaßt.
In einer anderen Ausführungsform ist vorgesehen, daß die Wechselwirkung vermittelnde Sequenz am C-terminalen Ende der die Nucleinsäuresyntheseaktivität tragenden Sequenz liegt. In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß zwischen der Wechselwirkung vermittelnden Sequenz und der die Nukleinsäureaktivität tragenden Sequenz ein Linker angeordnet ist.
Weiterhin kann in einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Chimären Proteine das rekombinante chimäre Protein thermostabil sein.
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Chimären Proteine kann vorgesehen sein, daß das Protein eine DNA Polymerase-Aktivität aufweist. Dabei ist beson- ders bevorzugt, wenn die Proteine eine 3'-5'- Exonukleaseaktivität aufweisen.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Chimären Proteine ist vorgesehen, daß das Protein eine RNA-Polymerase-Aktivität aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Chimären Proteine ist vorgesehen, daß das Protein eine reverse Transkriptase-Aktivität aufweist.
In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Chimären Proteine ist vorgesehen, daß sich die Einbaurate von dNTPs und ddNTPs durch die Nukleinsäuresyntheseaktivität um einen Faktor von weniger als 5 unterscheidet.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst durch einen Komplex umfassend
a) ein erfindungsgemäßes rekombinantes chimäres Protein und b) ein Gleitklammerprotein.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Komplexes ist vorgesehen, daß das Gleitklammerprotein eine Konsensuspeptidsequenz umfaßt, wel- ehe ausgewählt ist aus der Gruppe, die die Sequenzen gemäß SEQ ID NO.: 4, 5, 6 und 7 umfaßt. In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß der Komplex weiter eine Nukleinsäure umfaßt.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäßes chimäres Protein, insbesondere rekombinantes Protein codiert.
In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine die erfindungs- gemäße Nukleinsäure umfassenden Vektor. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Vektor um einen Expressionsvektor.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine Zelle, die den erfindungsgemäßen Vektor umfaßt.
Die Aufgabe wird weiter gelöst durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Chimären Protein zur Elongation von Nukleinsäuren.
Die Aufgabe wird weiter gelöst durch die Verwendung der erfindungsgemäßen chi- mären Protein zur Amplifikation von Nukleinsäuren.
Die Aufgabe wird weiter gelöst durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Chimären Protein zur reversen Transkription von RNA in DNA.
Die Aufgabe wird weiter gelöst durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Chimären Protein zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, insbesondere von DNA.
In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch einen Kit, insbesonde- re Reagenzien-Kit zur Elongation und/oder Amplifikation und/oder reversen Tran- skription und/oder Sequenzierung und/oder Markierung von Nukleinsäuren, der in einem oder mehreren getrennten Behältern umfaßt: a) ein erfindungsgemäßes, bevorzugt rekombinantes chimäres und/oder b) einen erfindungsgemäßen Komplex und c) bevorzugterweise gegebenenfalls zumindest einen Primer, Puffer, Nukleotide, Kofaktoren und/oder Pyrophosphatase.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Kits ist vorgesehen, daß er zur Amplifikation von Nukleinsäuren neben den Substanzen a) und/oder b), Deoxynukleotide oder/und Derivate davon umfaßt.
In einer weiteren Ausführungsform umfaßt der Kit eine DNA Polymerase mit 3'-5' Exonukleaseaktivität umfaßt.
In einer noch weiteren Ausführungsform enthält der Kit zur Reversen Transkription Substanzen nach a) und/oder b), welche eine Reverse Transkriptase-Aktivität aufweisen, und bevorzugterweise Deoxynukleotide und/oder Derivate davon.
Bei dem erfindungsgemäßen Kit kann vorgesehen sein, daß er zur Sequenzierung neben Deoxynukleotiden oder Ribonukleotiden oder/und deren Derivaten, Dideoxynukleotide oder/und deren Derivate enthält.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Templateabhängigen Elongation von Nukleinsäuren, wobei die zu elongierende Nukleinsäure oder zumindest ein Strang davon mit mindestens einem Primer unter Hybridisierungsbedingungen versehen wird, wobei der Primer hinreichend komplementär zu einem Teil der oder einem flankierenden Bereich der zu elongierenden Nukleinsäure ist und durch eine Polymerase in Anwesenheit von Nukleotiden eine Primer-Elongation erfolgt, wobei vorgesehen ist, daß als Polymerase ein erfindungsgemäßes chimäres, bevorzugt chimäres Protein verwendet wird und daß bevorzugterweise ein Gleitklammerprotein in der Reaktion vorliegt.
In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure, wobei vorgesehen ist, daß die zu amplifizierende Nukleinsäure mit mindestens zwei Primern unter Hybridisierungsbedingungen vesetzt wird, wobei ein jeder der beiden Primer jeweils komplementär zu einem Teil der oder einem flankierenden Bereich der zu amplifizierenden Nukleinsäure ist und durch eine Polymerase in Anwesenheit von Nukleotiden eine Primer-Elongation erfolgt.wobei als Polymerase ein erfindungsgemäßes chimäres Protein, insbesondere ein rekombinantes, verwendet wird und bevorzugterweise ein Gleitklammerprotein der Reaktion zugesetzt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist dabei vorgesehen, daß eine Polymerase- Ketten-Reaktion durchgeführt wird.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist dabei vorgesehen, daßder Reaktionsansatz zwei DNA Polymerasen umfaßt, von denen mindestens eine eine 3'-5' Exonukleaseaktivität aufweist, wobei die 3 '-5 '-Exonukleaseaktivität entweder durch das chimäre Protein oder durch eine weitere Polymerase dem Reaktionsansatz zugesetzt wird.
In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß zwei chimäre Proteine, insbesondere rekombinante, , wobei eines der Proteine ein solches ist, das eine DNA-Polymerase-Aktivität aufweist, und das andere ein solches ist, das eine 3'-5'- Exonukleaseaktivität aufweist.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Template-abhängigen Elongation kann in einer Ausführungsform vorgesehen sein, daß man zur Sequenzierung von
Nukleinsäuren ausgehend von einem Primer, der zu einem der zu sequenzierenden
Nukleinsäure benachbarten Bereich komplementär ist, eine Template-abhängige Elongation bzw. Reverse-Transkription unter Verwen-dung von Deoxynukleotiden und Dideoxynukleotiden oder deren jeweiligen Derivaten gemäß der Methode von Sanger durchführt.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren zur Templateabhängigen Elongation kann vorgesehen sein, daß bei der Elongation der Nukleinsäuren mindestens eine Markierungen eingefügt wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist dabei vorgesehen, daß ein Agens verwendet wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die markierte Primer, markierte Deoxynukleotide und Derivate davon, markierte Dideoxynukleotide und Derivate davon und markierte Ribonukleotide und Derivate davon umfaßt.
In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren durch Erzeugung einzelner Brüche in Phosphodiesterbin- dungen der Nukleinsäurekette und Ersatz eines Nukleotids an den Bruchstellen durch ein markiertes Nukleotid mit Hilfe einer Polymerase, wobei vorgesehen ist, daß als Polymerase ein erfindungsgemäßes chimäres Protein, insbesondere rekombinantes chimäres Protein eingesetzt wird.
In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Chimären Proteins, das eine Basissequenz und eine heterologe Wehcselwirkung-bedingende Sequenz umfaßt und infolge der Wechselwirkungbedingenden Sequenz mit einem Wechselwirkungspartner eine Bindung eingeht oder eine solche Bindung verstärkt wird, wobei
a) aus einem Wechselwirkungssystem umfassend ein als Donorprotein und ein als Akzeptorprotein bezeichnete Protein diejenige Sequenz des Donorproteins oder Akzeptorproteins ermittelt wird, die die Wechselwirkung zwischen beiden Wechselwirkungspartnern bedingt; und b) die Wechselwirkung-bedingende Sequenz in ein vom Donorprotein und Akzeptorprotein verschiedenes aufnehmendes Protein, das die Basis sequenz umfaßt, eingebracht wird.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, daß das Donorprotein und das Akzeptorprotein einen Komplex bilden, der Nukleinsäure bindet.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß das Donorprotein und das Akzeptorprotein einen Komplex bilden, der eine Aktivität aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Polymeraseaktivität, DNA-Bindungsaktivität, RNA- Bindungsaktivität, 5'-3'-Exonukleaseaktivität, 3 '-5 '-Exonukleaseaktivität und Ligaseaktivität umfaßt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, daß das Donorprotein ausgewählt ist aus der Gruppe, die Elongationsprotein, Gleitklammerproteine, Gleitklammerladerproteins und Kopplungsproteine umfaßt.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß das Akzeptorprotein ausgewählt ist aus der Gruppe, die Elongationsprotein, Gleitklammerproteine, Gleitklammerladerproteins und Kopplungsproteine umfaßt.
In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß das aufnehmende Protein ausgewählt ist aus der Gruppe, die Elongationsprotein, Gleitklammerproteine, Gleitklammerladerproteins und Kopplungsproteine umfaßt.
In einer Ausführungsform des erfindugnsgemäßen Verfahrens kann vorgesehen sein, daß Schritt a) mehrfach wiederholt wird und aus den solchermaßen ermittelten Wechselwirkung-bedingenden Sequenzen eine Konsensussequenz ermittelt wird, die eine Wechselwirkung-bedingende Sequenz darstellt, und im Schritt b) als Wechselwirkung-bedingende Sequenz in ein vom Donorprotein und Akzeptorprotein verschiedenes aufnehmendes Protein, das eine Basissequenz umfaßt, eingebracht wird.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein chimäres Protein, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist. In einer bevorzgten Ausführungsform ist die Basissequenz ein Teil der Aminosäuersequenz eines Proteins, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Elongationsproteine, Gleitklammerproteine, Gleitklammeriaderproteine und Kopplungsproteine umfaßt.
Schließlich wird die Aufgabe auch gelöst durch einen in vitro-Komplex zur Templateabhängigen Elongation von Nukleinsäure umfassend ein Gleitklammerprotein und ein Elongationsprotein, wobei mindestens eines der Proteine ein erfindungsgemäßes chimäres Protein ist. Besonders bevorzugt ist dabei eine Ausführungsform, bei der der Komplex thermostabil ist.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gilt, daß ein jedes der erfindungsgemäßen Chimären Proteine ein rekombinantes chimäres Protein sein kann.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe auch gelöst durch rekombinantes Chimäres Protein umfassend a) eine erste Domäne mit Nukleinsäuresyntheseaktivität, und b) eine Wechselwirkung vermittelnde Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Wechselwirkung vermittelnde Sequenz ein Komplex aus Nukleinsäuresyntheseaktivität und Gleitklammerprotein gebildet wird, wobei der Komplex verschieden ist von dem Komplex, den die Nukleinsäuresyntheseaktivität und/oder das Gleitklammerprotein mit ihren natürlichen Wechselwirkungspartner (n) ausbildet.
Es ist somit mittels dem erfindungsgemäßen rekombinanten Chimären Protein mög- lieh eine Nukleinsäuresyntheseaktivität an ein Gleitklammerprotein zu binden welches jene Nukleinsäuresyntheseaktivität, wie es beispielsweise in der Natur vor- kommt nicht binden kann. Der natürliche Wechselwirkungspartner ist also ein Partner wie er innerhalb eines Organismus unter normalen physiologischen Bedingungen an der der Nukleinsäuresyntheseaktivität gebunden vorliegen kann.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Chimäres Protein umfassend einen Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisenden Anteil, wobei der Anteil aus einem einen Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisenden Anteil und einen Wechselwirkung vermittelnden Anteil umfassenden Basisprotein stammt, und mindestens einen eine Wechselwirkung vermittelnden Anteil, wobei der Wechselwirkung vermittelnde Anteil verschieden ist von dem Wechselwirkung vermittelnden Anteil des Basisproteins, sowie ein Chimäres Protein umfassend einen Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisenden Anteil, wobei der Anteil aus einem Basisprotein stammt, das einen Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisenden Anteil aber keinen Wechselwirkung vermittelnden Anteil umfaßt, und einen Wechselwirkung vermittelnden Anteil.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe weiterhin gelöst durch ein Verfahren zur Template-abhängigen Elongation von Nukleinsäuren, wobei die zu elongierende Nukleinsäure oder zumindest ein Strang davon mit mindestens einem Primer unter Hybridisierungsbedingungen versehen wird, wobei der Primer hinreichend komplementär zu einem Teil der oder einem flankierenden Bereich der zu elongierenden Nukleinsäure ist und durch eine Polymerase in Anwesenheit von Nukleotiden eine Primer- Elongation erfolgt, dadurch gekennzeichnet, daß als Polymerase ein erfindungsgemäßes rekombinantes chimäres Protein verwendet wird und daß bevorzugterweise ein Gleitklammerprotein in der Reaktion vorliegt.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist unter „rekombinant" zu verstehen, wenn das chimäre Protein beispielsweise gentechnisch hergestellt wird (siehe „Gentechnologie", Römpp Basislexikon Chemie, Georg Thieme Verlag 1998) oder aber beispielsweise wenn es chemisch synthetisiert wird.
Weitere Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen. Der Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, daß es möglich ist ausgehend von einem eine Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisenden Protein, hierin im folgenden als Basisprotein bezeichnet, die Prozessivität dieses Proteins, genauer der Nukleinsäuresyntheseaktivität dadurch zu erhöhen, daß es mit einem die Prozessivität erhöhenden Faktor, wie einem Gleitklammerprotein, in Wechselwirkung tritt, mit dem das Basisprotein als solches nicht in Wechselwirkung treten kann, bzw. für den Fall, daß es in Wechselwirkung treten kann, dies nicht mit einer Erhöhung der Prozessivität verbunden ist. Dies wird dadurch bewerkstelligt, daß das die Nuklein- säuresyntheseaktivität-tragende Protein mit einer Gruppe von mehreren Aminosäuren versehen wird, typischerweise in der Form einer konsekutiven Aminosäuresequenz, die hierin als Wechselwirkung vermittelnde oder Wechselwirkung bedingende Sequenz bezeichnet wird, und damit eine Wechselwirkung zwischen dem besagten Protein und einem die Prozessivität erhöhenden Faktor erst möglich wird. Damit wird das oben geschilderte Problem des Standes der Technik bestehend in einer fehlenden Kompatibilität der eigentlich erwünschten Einzelkomponenten eines eine Nukleinsäuresyntheseaktivität tragenden Komplexes überwunden.
Ohne darauf beschränkt sein zu wollen, ergeben sich somit zumindest die folgenden drei Möglichkeiten, was die Ausbildung eine derartigen Chimären, eine Nukleinsäuresyntheseaktivität tragenden Proteins anbelangt.
Das dem Chimären Protein zugrundeliegende Basisprotein kann dabei in zwei grundsätzlichen Formen vorliegen. In der ersten Form umfaßt das Basisprotein lediglich die Nukleinsäuresyntheseaktivität, jedoch keine Sequenz (hierin auch als Domäne bezeichnet, die, insbesondere in vivo, eine Wechselwirkung zwischen der Nukleinsäuresyntheseaktivität und einem Prozessivitätsfaktor vermitteln kann oder könnte, insbesondere nicht dergestalt, als daß durch die Wechselwirkung eine Erhöhung der Prozessivität erreicht wird. In einer zweiten Form umfaßt das Basisprotein eine Nukleinsäuresyntheseaktivität und zusätzlich eine Sequenz, die, insbesondere in vivo, eine Wechselwirkung zwischen der Nukleinsäuresyntheseaktivität und einem Prozessivitätsfaktor vermitteln kann oder könnte, insbesondere dergestalt, als daß durch die Wechselwirkung eine Erhöhung der Prozessivität erreicht wird.
Das erfindungsgemäße chimäre Protein kann ausgehend von den verschiedenen Formen des Basisproteins in verschiedenen grundsätzlichen Ausführungsformen vorliegen.
(i) Eine erste Ausführungsform des Chimären Proteins sieht vor, daß die erste Form des Basisproteins verwendet wird und daran eine eine Wechselwirkung mit einem die Prozessivität der Nukleinsäuresyntheseaktivität erhöhenden Faktor vermittelnde Sequenz angefügt wird. Diese Anfügung erfolgt typischerweise dadurch, daß die Wechselwirkung vermittelnde Sequenz sich der Sequenz der Nukleinsäuresyntheseaktivität, gegebenenfalls getrennt durch einen Linker, anschließt. In dieser ersten Ausführungsform des Chimären Proteins wird somit das Basisprotein um eine eine Wechselwirkung vermittelnde Sequenz ergänzt.
(ii) In einer zweiten Ausführungsform des Chimären Proteins wird die zweite
Form des Basisproteins verwendet. Dabei wird die dem Basisprotein immanente eine Wechselwirkung mit einem die Prozessivität der Nukleinsäuresyntheseaktivität erhöhenden Faktor vermittelnde Sequenz durch eine andere eine Wechselwirkung mit einem die Prozessivität der Nukleinsäuresyntheseaktivität erhöhenden Faktor vermittelnde Sequenz ausgetauscht. Diese andere Sequenz kann dabei von einem anderen Gen des gleichen Organismus, vom gleichen Gen eines anderen Organismus oder von einem anderen Gen eines anderen Organismus stammen und ist somit in einem jeden Fall eines anderen Ursprungs. Infolgedessen wird durch eine derartige Konstruktion, ggf. erstmals, ggf. aber auch nur in verstärktem Maße, eine Wechsel- Wirkung zwischen der Nukleinsäuresyntheseaktivität des Basisproteins und einem die Prozessivität der Nukleinsäuresyntheseaktivität erhöhenden Faktor möglich. (iii) In einer dritten Ausführungsform des Chimären Proteins wird die zweite Form des Basisprόteins verwendet. Dabei wird die dem Basisprotein immanente eine Wechselwirkung mit einem die Prozessivität der Nukleinsäuresyntheseaktivität erhöhenden Faktor vermittelnde Sequenz ergänzt durch eine andere eine Wechselwirkung mit einem die Prozessivität der Nukleinsäuresyntheseaktivität erhöhenden Faktor vermittelnde Sequenz. Diese andere Sequenz kann dabei von einem anderen Gen des gleichen Organismus, vom gleichen Gen eines anderen Organismus oder von einem anderen Gen eines anderen Organismus stammen und ist somit in einem jeden Fall eines anderen Ursprungs. Infolgedessen wird durch eine derartige Konstruktion, ggf, erstmals, ggf. aber auch nur in verstärktem Maße, eine Wechselwirkung zwischen der Nukleinsäuresyntheseaktivität des Basisproteins und einem die Prozessivität der Nukleinsäuresyntheseaktivität erhöhenden Faktor möglich.
Für alle der oben geschilderten Ausführungsformen des Chimären Proteins kann man feststellen, daß sich typischerweise die (Aminosäure-)Sequenz eines derartigen Chimären Proteins von der Sequenz des Basisproteins. Unterscheidet. Eine weitere, allerdings nicht obligatorische Folge kann darin gesehen werden, daß der durch das chimäre Protein ausgebildete Komplex aus Nukleinsäuresyntheseaktivität aufwei- sendem Protein und Prozessivität erhöhendem Faktor verschieden ist von dem Komplex aus Basisprotein und Prozessivität erhöhendem Faktor.
Als Basisproteine eignen sich alle in der Einleitung hierin erwähnten Proteine, Polymerasen und Elongationsproteine, deren Offenbarung hiermit durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden. Gleiches gilt für die anderen Komponenten, insbesondere derjenigen des Replikationsapparates, wie Prozessivitätsfaktoren, Gleitklammerproteine und Wechselwirkung-vermittelnde oder Wechselwirkung-bedingende Sequenzen. Schließlich gelten auch für diesen Teil der Offenbarung die in der Einleitung gegebenen Definitionen. Wenngleich die Nukleinsäuresyntheseaktivität aus einer Vielzahl von Organismen stammen kann so ist es bevorzugt, wenn sie z.B. aus dem Organismus Carboxydo- thermus hydrogenoformans (European Patent Application EP 0 834 569 A1) oder einem der Organismen wie z.B. Thermus aquaticus, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermus oshimai, Thermus ruher, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sp. 17, Thermus thermusphilus, Therotoga maritima, Therotoga neapolitana, Ther- mosipho africanus, Anaerocellum thermophilum, Bacillus caldotenax, oder Bacillus stearothermophilus stammt.
Sofern hierin von Sequenz gesprochen wird, wird damit in der Regel Bezug genommen auf eine Aminosäuresequenz. Nukleinsäuresequenzen werden in der Regel direkt als Nukleinsäuresequenzen angesprochen.
Die verschiedenen für die erfindungsgemäßen rekombinanten Chimären Proteine codierenden Nukleinsäuren können von den Fachleuten auf dem Gebiet mittels des genetischen Codes leicht ermittelt und sodann synthetisiert werden. Den Fachleuten sind ebenfalle geeignete Vektoren zur Klonierung und Expression der erfindungsgemäßen rekombinanten Chimären Proteine sowie Verfahren zu deren bevorzugterwei- se rekombinanten Produktion bekannt (siehe z.B. Maniatis et al.; aaO).
Den Fachleuten ebenfalls bekannt sind Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, einschließlich monoklonalen Antikörpern, die gegen die erfindungsgemäßen rekombinanten Chimären Proteine gerichtet sind.
Das erfindungsgemäße rekombinante chimäre Protein kann zur Elongation von Nukleinsäuren verwendet werden, z. B. zur Polymerase-Ketten-Reaktion, DNA- Sequenzierung, zur Markierung von Nukleinsäuren und anderen Reaktionen, die die in vitro Synthese von Nukleinsäuren beinhalten. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Template-abhängigen Elongation, wobei die zu elongierende Nukleinsäure oder zumindest ein Strang davon mit mindestens einem Primer unter Hybridisierungsbedingungen versehen wird, wobei der Primer hinreichend komplementär zu einem Teil der oder einem flankierenden Bereich der zu elongierenden Nukleinsäure ist und durch eine Polymerase in Anwesenheit von Nukleotiden eine Primer-Elongation erfolgt, wobei als Polymerase ein erfindungsgemäßes rekombinantes chimäres Protein verwendet wird und in einer bevorzugten Ausführungsform weiterhin ein Gleitklammerprotein in der Reaktion bzw. im Reaktionsansatz vorliegt.
Verfahren zur Template-abhängigen Elongation von Nukleinsäuren, bei denen die Elongation ausgehend von einem Primer erfolgt, der an die Template-Nukleinsäure anhybridisiert wurde und ein freies 3'-OH-Ende für die Elongation zur Verfügung stellt, sind dem Fachmann bekannt. Zur Amplifikation wird insbesondere eine Polymerasekettenreaktion durchgeführt. Hierbei wird üblicherweise von einer doppelsträngigen DNA-Sequenz ausgegangen, von welcher ein bestimmter Zielbereich amplifiziert werden soll. Hierbei werden zwei Primer eingesetzt, welche zu der Zielsequenz flankierenden Bereichen auf jeweils einem Teilstrang des DNA- Doppelstranges komplementär sind. Zur Anhybridisierung der Primer werden allerdings die DNA-Doppelstränge zuerst denaturiert, insbesondere thermisch aufgeschmolzen. Nach Anhybridisierung der Primer erfolgt eine Elongation mittels der Polymerase, daraufhin wird nochmals denaturiert und damit die neu gebildeten DNA-Stränge von den Template-Strängen getrennt, woraufhin für einen weiteren Elongationszyklus neben den ursprünglichen Templatesträngen auch die im ersten Schritt gebildeten Nukleinsäurestränge als Template zur Verfügung stehen, diese jeweils erneut mit Primern hybridisiert werden und eine erneute Elongation stattfindet. Diese Vorgehensweise wird zyklisch durchgeführt unter jeweils thermischer Denaturierung als Zwischenschritte. Auch möglich ist die Anwendung des erfindungsgemäßen rekombinanten chimäre Proteins in der reversen Transkription, wobei entweder das erfindungsgemäße Protein selbst Reverse-Transkriptase-Aktivität besitzt, oder aber zusätzlich ein geeignetes Enzym hinzugefügt wird, das eine Reverse-Transkriptase-Aktivität aufweist, unabhängig davon ob der thermostabile in vitro Komplex selbst eine Reverse- Transkriptase-Aktivität hat.
Zur erfindungsgemäß bevorzugten reversen Transkription von RNA in DNA wird ebenfalls ein erfindungsgemäßes rekombinantes chimäres Protein eingesetzt, wobei dessen Nukleinsäuresyntheseaktivität selbst eine Reverse Transkriptase-Aktivität aufweist. Diese Reverse Transkriptase-Aktivität kann die einzige Polymeraseaktivität sein, kann aber auch zusätzlich zu einer vorhandenen 5'-3'-DNA-Polymeraseaktivität vorliegen. Eine erfindungsgemäß bevorzugte Ausführungsform des rekombinanten Chimären Proteins umfaßt das Elongationsprotein aus dem Organismus Carboxydothermus hydrogenoformans wie offenbart in EP-A 0 834 569 stammt.
Eine weitere bevorzugte Verwendung des erfindungsgemäßen rekombinanten Chimären Proteins ist die Sequenzierung von Nukleinsäuren ausgehend von mindestens einem Primer, der zu einem Teil der zu sequenzierenden Nukleinsäure hinreichend komplementär ist, wobei wiederum eine Template-abhängige Elongation oder aber bei Sequenzierung von RNA eine Reverse Transkription unter Verwendung von Deoxynukleotiden und Dideoxynukleotiden gemäß der Methode von Sanger durchgeführt wird. Als Deoxynukleotide oder Dideoxynukleotide werden im Rahmen dieser bevorzugten Ausführungsform auch die oben beschriebenen jeweiligen Derivate als geeignet angesehen. Insbesondere ist es für die erfindungsgemäßen Verfahren zur Elongation von Nukleinsäuren bevorzugt, daß die gebildeten Nukleinsäuren markiert werden. Hierzu ist es möglich, markierte Primer und/oder markierte Deoxynukleotide oder/und markierte Dideoxynukleotide und/oder markierte Ribonukleotide oder jeweils entsprechende Derivate, wie sie oben bereits beispielsweise beschrieben sind, einzusetzen. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren durch Einfügung einzelner Brüche in Phosphodiesterbindungen der Nukleinsäurekette und Ersatz eines Nukleotids an den Bruchstellen durch ein markiertes Nukleotid mit Hilfe einer Polymerase, wobei als Polymerase ein erfindungsgemäßer thermostabiler in vitro-Komplex eingesetzt wird.
Ein solches Verfahren, allgemein Nick-Translation genannt, ermöglicht eine einfache Markierung von Nukleinsäuren. Alle oben bereits beschriebenen markierten Ribonukleotide oder Deoxyribonukleotide oder Derivate davon sind hierfür geeignet, solange die Polymerase sie als Substrat akzeptiert.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und Figuren weiter erläutert, aus denen sich weitere Vorteile und Ausführungsformen ergeben, dabei zeigt
Fig. 1 vier Sequenzalignments von verschiedenen Elongationsportein- domänen;
Fig. 2 eine schematische Darstellung des erfindugnsgemäßen rekombinanten
Chimären Proteins; Fig. 3 vier Konsensussequenzen von Gleitklammerproteinen;
Fig. 4 in tabellarischer Form das Ergebnis eines Hefe-Zweihybrid-system;
Fig. 5, 5 A-C Alignments mehrerer konservierter Regionen der Wechselwirkung bedingenden Sequenz;
Fig. 6 A die gesamte Sequenz einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen rekombinanten Chimären Proteins;
Fig. 6 B eine graphische Darstellung des prinzipiellen Aufbaus eines erfindungsgemäßen Chimären Proteins;
Fig. 7 das Ergebnis einer unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Chimären Proteins durchgeführten Polymerase-Kettenreaktion; Fig. 8 A eine Darstellung aller Fragmente von Af0497, die mit dem Gleitklammerprotein von Archaeoglobus fulgidus (Af0335) wechselwirken; Fig. 8 B ein Alignment C-terminaler Sequenzen verschiedener Gene vo nAr- chaeglobus fulgidus;
Fig. 9 das Ergebnis eines Hefe-Zweihybridexperimentes, das die Wechselwirkung zwischen einem Elongationsprotein und einem Gleitklammerprotein darstellt; und
Fig. 10 das Ergebnis der Amplifikation genomischer DNA unter Verwendung eines erfindungsgemäßen rekombinanten Chimären Proteins.
Beispiel 1 : Anwendung des Hefe-Zweihybridsystems zur Bestimmung der für die Wechselwirkung zwischen Replikationsfaktoren und Gleitklammerprotein bedeutsamen Aminosäuren
Zur Bestimmung der Binderegion von Gleitklammerproteinen (hierin im folgenden als GKP bezeichnet) und Replikationsfaktoren (hierin im folgenden als RF bezeichnet) wird das Hefe-Zweihybridsystem (Fields S., Song O., Nature 1989 Jul 20; 340 (6230):245-6) verwendet. Die Gene für GKPs und RFs werden in den Vektoren pGBT9 und pGAD424 (CLONTECH Laboratories, Inc.). exprimiert, so daß Fusionsproteine mit der DNA-Bindedomäne bzw. der Aktivierungsdomäne von GAL4 entstehen: DNA wird mittels der bekannten Verfahren aus dem Organismus Archaeoglobus fulgidus (DSM No. 4304) gereinigt. Die Aufzucht der Mikroorganismen geschah hierbei durch die DSM (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen). Dann werden die offenen Leseraster der Gene mittels PCR aus genomischer DNA von Archaeoglobus fulgidus amplifiziert. Die solchermaßen erhaltene DNA wird in die Vektoren pGBT9 und pGAD424 kloniert. Andere Vektoren, die im Zweihybridsystem verwendet werden, eignen sich auch für das im Folgenden beschriebene Verfahren (darunter sind zum Beispiel pAD-GAL4-2.1 , pBD-GAL4, pBD-GAL4 Cam, pCMV-AD, pCMV-BD, pMyr, pSos, pACT2, pAS2-1 , pHISi, pLexA, pM, pHISi-1 , pB42AD, pVP16, pGAD10, pGBKT7, pLacZi, pδop-lacZ, pGAD GH, pGilda, pAD GL, pGADT7, pGBDU, pDBLeu, pPC86, pDBTrp, die erhältlich sind von CLONTECH Laboratories, Inc.). Zusätzlich werden veränderte Klone in die gleichen Vektoren kloniert. Bei den veränderten Klonen handelt es sich um Deletionsmutationen und um Mutationen betreffend einzelne oder mehrere Aminosäuren des GKP und/oder des RF. Anschließend wird die Fähigkeit der veränderten Klone, im Zweihybridsystem miteinander zu interagieren, gemessen. Dadurch wird es möglich, Domänen oder sogar einzelne Aminosäurereste zu bestimmen, die für die Interaktion wichtig oder essentiell sind.
s gibt eine Reihe von Methoden, Deletionen in ein Gen einzuführen. Eine Methode zur Herstellung von Deletionen besteht darin, DNA-Fragmente herzustellen, die die Gene für das GKP oder den RF enthalten. Diese Fragmente werden entweder durch PCR oder durch Restriktionsverdau aus einem geeignetem Vektor gewonnen. Des weiteren wird genomische DNA des Organisimus verwendet, aus dem die beiden Proteine stammen. Diese verschiedenen DNA-Fragmente und die genomische DNA werden durch Ultraschallbehandlung zerkleinert und Fragmente, die Längen zwischen der Gesamtlänge der Gene und etwa 100 Basen aufweisen, werden durch präparative Agarosegelelektrophrese gereinigt. Die Enden der Fragmente werden durch Behandlung mit einem geeigneten Enzym (Klenow, Pwo-Polymerase, oder andere) aufgefüllt bzw. abverdaut, so daß beide Stränge die gleiche Länge haben und somit glattendig ("blunt") sind. Diese Fragmente werden nun durch Ligation in einen mit Smal geschnittenen (oder anders linearisierten und blunt gemachten) pGAD424 und pGBT9 Vektor, oder andere geeignete Vektoren, eingebaut. So entstehen Banken von einer Vielzahl von Subfragmenten der Gene für GKP und RF, jeweils in beiden Vektoren des Zweihybridsystems. Die DNA dieser Banken wird nach Transformation in Escherichia coli vermehrt und gereinigt. Im nächsten Schritt werden die beiden Banken in einen für das Zweihybridsystem geeigneten haploiden Hefestamm transformiert, so daß die Fusionen aus GKP bzw. RF mit der GAL4 DNA- Bindedomäne in einem Stamm mit einem anderen Paarungstyp vorliegen als die Fusionen aus RF bzw. GKP der GAL4 Aktivierungsdomäne. Durch Paarung der beiden Stämme werden nun diploide Zellen erzeugt, in denen die Plasmide aus beiden Banken in derselben Zelle vorliegen. Als Stamm eignet sich PJ69-4 (James P, Halladay J, Craig EA, Genetics 1996 Dec; 144(4): 1425-36) oder jeder andere Stamm mit einem für das Zwejhybridsystem geeigneten Genotyp. Zellen, in denen die Reportergene aktiviert werden, werden isoliert, und die Plasmid-DNA daraus durch Präparation gewonnen, oder die Inserts durch PCR spezifisch vermehrt. Die Sequenzen der Fusionsfragmente werden durch DNA-Sequenzanalyse ermittelt. Die Bindungsregion (oder die Bindungsregionen) wird (werden) durch Bestimmung jener Bereiche ermittelt, die in allen Klonen (oder die in bestimmten Gruppen von Klonen immer gefunden werden), bei denen es zu einer Wechselwirkung der beiden RF und GKP umfassenden Fusionsproteine kommt. Diese Bestimmung wird für jedes der Gene viermal durchgeführt: einmal mit der Bank im Vektor mit der Aktivierungsdomäne (präferentiell: pGAD424) und einmal mit der Bank im Vektor mit der DNA-Bindedomäne (präferentiell: pGTB9), jeweils einmal mit dem Gesamtlängenklon des Bindepartners und einmal mit der Genbank der Fragmente.
Durch die beschriebenen Versuche ist es möglich, minimale Binderegionen zu definieren, die man für die Konstruktion von rekombinanten Chimären Proteinen mit Affinität für GKP nutzen kann. Zur genaueren Charakterisierung der Binderegion werden Aminosäuremutationen eingeführt und deren Wirkung auf die Bindeeigenschaft getestet. Dadurch wird der Bereich weiter eingeengt und die an der Bindung beteiligten Positionen im Protein bestimmt. In einem parallelen Ansatz wird durch das Einführen zufälliger Mutationen in die Binderegion und der Analyse der Wirkung auf die Bindung ebenfalls die an der Bindung beteiligten Positionen bestimmen. In beiden Fällen wird bestimmt, ob die Mutationen das Protein instabil machen und also einen indirekten Effekt haben, oder ob sie keine Auswirkungen auf die Stabilität des Proteins haben und so einen direkten Effekt haben.
Die hierfür nötigen experimentellen Verfahren sind beschrieben in Maniatis et al. (Molecular Cloning (2"d edition, 3 Volume set): A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.(1989)), in Ausübet et al (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (1988)), in Abelson, J.N., and Simon, M.l. (Editoren) 1991 (Methods in Enzymology, Volume 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Academic Press, ) oder in Adams, A. Gottschling, D.E. Kaiser, CA, and Stearns, T., 1997, (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbour Laboratory Press). Die Handhabung des Zweihybridsystems (two-hybrid System) erfolgte gemäß der Anleitung der Firma Clontech (yeast protocols handbook, PT3024-1.
Beispiel 2: Weitere Verfahren zur Kartierung der Bindungsregion von GKP und RF
Es wurden GKP und RF als rekombinante Proteine gewonnen. Jeweils eines der beiden Proteine wurde an einem Träger immobilisiert, dann wurde das jeweils andere Protein in ungebundener Form zugeben, um die Bindung an den immobilisierten Partner erlauben. Freies, d.h. nicht gebundenes Material wurde ausgewaschen, und das gebundene Protein z.B. durch Denaturierung eluiert. Die Menge des gebundenen Proteins ist ein Mass für die Bindung (z.B. angewandt in Anderson D, Koch CA, Grey L, Ellis C, Moran MF, Pawson T, Science 1990 Nov 16;250(4983):979-82).
Die Analyse von Deletionsmutanten der Proteine und von Mutanten mit veränderter Aminosäuresequenz erlaubte die Kartierung der Bindungsregion. Deletionen können durch proteolytischen Verdau oder mittels der rekombinanten Expression von dele- tierten Genen erzeugt werden. In gleicher Weise kann man durch Co- Immunpräzipitation aus Zellextrakten, die deletierte Formen der Proteine enthalten, die Binderegion bestimmen. Die Kompetition der Bindung durch Peptide kann Aufschluß über die Sequenz der Binderegion geben.
Eine weitere Möglichkeit zur Kartierung der Binderegion besteht darin, Peptide herzustellen und die Bindung der Peptide an das jeweils andere Protein zu messen. Die Sequenz der Peptide kann zufällig (Songyang Z, Prog Biophys Mol Biol 1999;71 (3- 4):359-72) oder auf der Aminosäuresequenz des Proteins beruhen, dessen Binderegion identifiziert werden soll (petide scans, Brix J, Rudiger S, Bukau B, Schneider- Mergener J, Pfanner N, J Biol Chem 1999 Jun 4;274(23): 16522-30). Solche Peptide können durch chemische Synthese oder durch andere Methoden wie phage display hergestellt und zur Bindung angeboten werden. Ein Beispiel ist in Fig. 3 gezeigt. Hier wurden durch Alignments verschiedene Konsensussequenzen ermittelt, die zur Herstellung derartiger Peptide geeignet sind.
Ein weiteres Verfahren besteht darin, Antikörper herzustellen gegen Epitope des Proteins, dessen Binderegion identifiziert werden soll. Wenn der Antikörper die Bindung inhibiert, so überschneidet sich das Epitop es Antikörpers mit der Binderegion (z.B. Fumagalli S, Totty NF, Hsuan JJ, Courtneidge SA, Nature 1994 Apr 28;368(6474):871-4).
Schließlich besteht eine Möglichkeit zur Bestimmung oder Kartierung der Binderegion (Wechselwirkung-bedingende Sequenz) darin, die Feinstruktur des Komplexes mit den Methoden der Röntgenstrukturanalyse, der Nuclear Magnetic Resonance oder der Elektronenmikroskopie aufzuklären.
Beispiel 3: Studium der Wechselwirkung von Proteinen aus Archaeoglobus fulgidus unter Verwendung des Hefe-Zweihybridsystems (Y2H)
Die kodierenden Bereiche von Genen aus Archaeoglobus fulgidus, deren Genprodukte in vitro als Wechselwirkung-bedingende Sequenz und/oder Nukleinsäure- synthseaktivität verwendet werden können, wurden mittels PCR amplifiziert, in die Vektoren pGBT9 (vertikale Spalten der Fig. 9) und pGAD424 (horizontale Reihen der Fig. 9) kloniert und durch gap-repair in Hefe PJ69-4a (für pGAD424) und PJ69- 4alpha (für pGBT9) als Hybridproteine zur Expression gebracht. Ebenso wurde eine positive Kontrolle mittels PCR amplifiziert, in die Vektoren pGBT9 und pGAD424 (siehe auch horizontale Reihen der Fig. 9) kloniert und durch gap-repair in den Hefestamm PJ69-4a (für pGAD424) und PJ69-4alpha (für pGBT9) als Hybridproteine zur Expression gebracht. Diploide Zellen, die beide Vektoren enthalten, wurden durch Paarung erzeugt. Die Expression von drei unabhängigen Reportern (HIS3, ADE2 und MEL1) wurde gemessen. Die Expression des HIS3 bzw. ADE2 Gens führt zu einer Histidin- bzw. Adenin-Prototrophie der Zellen. Transkription des MEL1 Genes führt zur Produktion des Beta-Galaktosidase Enzyms, dessen Aktivität sich z.B. über eine Farbreaktion nachweisen läßt. In dem in Fig. 9 gezeigten Experiment wachsen jene Zellen in einem Histidin- und Adenin-Mangelmedium, die beide Vektoren tragen und in denen zudem die Expressionsprodukte dieser beiden Vektoren aneinander binden. Die Interaktion der Fusionsproteine bewirkt die Rekonstitution eines funktionellen Transkriptionsfaktors, der die Transkription der Reportergene initiiert. Die Produktion der auf den Reportergenen codierten Proteine führt zu einer Aufhe- bung der Histidin- und Adenin-Auxotrophie. Dies wird dadurch bedingt, daß in Folge der Bindung der Expressionsprodukte eine Transkription initiiert wird, die dazu führt, daß die Zellen wachsen können.
Alle hier positiven Klone waren auch positiv bezüglich der Expression des MEL1- Gens. Die Handhabung des two-hybrid Systems erfolgte gemäß der Anleitung der Firma Clontech (yeast protocols handbook, PT3024-1).
Beispiel 4: Ermittlung der Wechselwirkung bedingenden Sequenz von Af0497
Zur Ermittlung der Wechselwirkung-bedingenden Sequenz auf dem Protein Af0497 (ein Elongationsprotein), die die Wechselwirkung mit dem Gleitklammerprotein bedingt, wurde zunächst die DNA des Gens für Af0497 durch Restriktion eines geeigneten Vektors, welcher eine Elongationsprotein beinhaltete welches eine Wechselwirkung-bedingende Sequenz umfaßte gewonnen. Diese DNA wurde dann durch Ultraschall fragmentiert und in die beiden Vektoren pGAD424 und pGBDU ligiert. So entstanden Banken von verschiedenen Fragmenten des Gens in den beiden Vektoren. Als nächstes wurde unter Verwendung des Hefe-Zweihybridsystems ermittelt, welches dieser Fragmente eine Wechselwirkung mit Af0335 bedingen kann. Dazu wurden beide Banken in geeignete Hefestämme (pGAD424: PJ69-4a, PGBDU: PJ69-4alpha) transformiert. Durch Paarung der Hefestämme wurden dann diploide Zellen erzeugt, die sowohl die Banken (Af 0497) als auch das Gleitklammerproteins in einem für die Verwendung der Zweihybridsystems passenden Vektor enthalten. Alle Klone, die den HIS2 Reporter (siehe oben) aktivierten, wurden auf Platten ohne Histidin isoliert, und die Inserts wurden durch PCR von der Hefekolonie selektiv amplifiziert. Die Sequenz der Inserts wurde ermittelt und ihre Position am Gen Af0497 bestimmt. Das Ergebnis ist in Figure 8A graphisch dargestellt: Alle gefunden Klone mit Ausnahme eines Klons beinhalteten das carboxyterminale Ende des Elonagti- onsproteins, welches eine oder mehrere Wechselwirkung-bedingende Sequenz umfaßt. Der kleinste Klon bestand aus 51 Aminosäuren.
Um zu ermitteln, ob die Wechselwirkung-bedingende Sequenz des homologen Proteins eines anderen Organismus ebenfalls am carboxyterminalen Ende des Proteins beinhaltet ist, wurde das Experiment mit dem Polymeraseprotein und dem Gleitklammerprotein aus Pyrococcus horikoshi wiederholt. Dazu wurden Banken der großen Untereinheit der Polymerase aus P. horikosii hergestellt und wie mittels des oben beschriebenen Verfahrens auf Interaktion mit dem Gleitklammerprotein aus P. horikosii getestet. Wieder umfaßten die interagierenden Fragmente das carboxyterminale Ende des Elonagtionsproteins.
Um zu überprüfen, ob die Wechselwirkung zwischen dem carboxyterminalen Ende des Proteins Af0497 und dem Gleitklammerprotein spezifisch ist, wurde getestet, ob das carboxyterminal Proteinfragment von Af0497 mit anderen Proteinen aus Ar- chaeglobus fulgidus und anderen Organismen ebenso wechselwirkt. In keinem Fall konnte eine Wechselwirkung gemessen werden, was zeigt, daß die Bindung sehr spezifisch für das Gleitklammerprotein ist.
So bindet die Polymerase Taq nicht an das GKP (PCNA aus Archaeoglobus fulgidus), und es konnte im Hefe-Zweihybridsystem keinerlei Wechselwirkung gemessen werden. Um zu testen, ob das carboxyterminale Ende des Proteins Af0497 eine Wechselwirkung mit einem anderen Protein, an das es fusioniert ist, bedingen kann, wurde ein Fusionsprotein aus Taq und den carboxyterminale 51 Aminosäuren von Af0497 hergestellt. Diese Protein wurde im Hefe- Zweihybridsystem auf Wechselwirkung getestet. Wie in Fig. 4 dargestellt, bewirkte die Verpflanzung der Wechselwirkung-bedingenden Sequenz von Af0497 an Taq eine spezifische Wechselwirkung von Taq mit dem Gleitklammerprotein Af0335. Die Ergebnisse der entsprechenden Y2H-Expehmente sind in Fig. 4 dargestellt.
Das beweist, daß die Eigenschaft dieses Fragments (das carboxyterminale Ende des Elongationsproteins Af0497) eine Wechselwirkung mit dem Gleitklammerprotein Af0335 zu bedingen, auf ein anders Protein, insbesondere auf eine andere Polyme- rase, verpflanzt oder transferiert werden kann, um dort eine Wechselwirkung mit dem eigentlich für Af0497 spezifischen Gleitklammerprotein hervorzurufen.
Es wurde bei sechs Proteinen (siehe auch Fig. 5 und Fig. 5B) aus A. fulgidus eine Interaktion mit PCNA gemessen. Daraus ergibt sich, daß alle diese Proteine ähnlich Wechselwirkung-bedingende Sequenzen beinhalten, die die Wechselwirkung mit PCNA vermitteln. So z.B. die Polymerase delta grosse Untereinheit (Af 0497, TREMBL Nummer: 029753), die Polymerase delta kleine Untereinheit (Af 1790, TREMBL Nummer: 028484), DP2 (Af 1722, TREMBL Nummer: 028552), RPA2 (Replication factor A), RFC2 (Replication factor C) und PCNA (Af 0335, TREMBL Nummer: 029912)
Solche Wechselwirkung-bedingende Sequenzen sind in den letzten 50 Aminosäuren des Proteins Af0497 enthalten. Bei einer Untersuchung der Proteine, die mit PCNA interagieren, ergab sich, daß alle ein Motiv enthalten, das knapp vor dem carboxyterminalen Ende der Aminosäuresequenz angeordnet ist. Eine Aufstellung der verwandten Sequenzen ist in Fig. 8B dargestellt, wobei ein schwarzer Balken den konservierten Bereich kennzeichnet.
Dieses Motiv ist auch in anderen Organismen und Genen konserviert. Fig. 5 zeigt das Ergebnis der Suche nach solchen Wechselwirkung-bedingende Sequenzen sowie die daraus generierten Konsensussequenzen. Beispiel 5: Steigerung der Effizienz einer PCR bei Verwendung von PCNA als GKP und eines erfindungsgemäßen Chimären Elongationsproteins
Dieses Beispiel zeigt den Einfluß von PCNA auf die Effizienz einer PCR - Reaktion. In dieser PCR - Reaktion wurde ein 463 bp großes Fragment ausgehend von Plas- mid-DNA amplifiziert. Als Polymerase wurde das Taqfusionsprotein, wie es auch in Fig. 6A dargestellt ist, verwendet. Die Reaktionsbedingungen für die PCR waren wie folgt: 0,4mM jedes dNTP (pH 8,3) und 20 pmol von jedem Primer in einer Reaktion. Zur Anwendung kam ein erster Primer (SEQ ID NO.: 13) mit der Sequenz 5'- AGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3' und ein zweiter Primer (SEQ ID NO.: 14) mit der Sequenz 5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'.
Es zeigt sich, daß die Fusion einer 50 Aminosäuren großen Domäne an den C- Terminus der nativen Taq DNA Polymerase keinen nachteiligen Einfluß auf die Polymerase - Eigenschaften hat, da das Taqfusionsprotein per se schon ein Produkt in einer PCR - Reaktion liefert. Mittels dieser Domäne kann nun das Gleitklammerprotein, PCNA aus Archaeoglobus fulgidus, mit dem Taqfusionsprotein interagieren und in seiner Eigenschaft als Prozessivitätsfaktor die Effizienz der PCR - Reaktion erhö- hen, was sich in einer deutlich höheren Ausbeute an PCR Produkt widerspiegelt. Das Ergebnis ist auch in Fig. 7 dargestellt.
Beispiel 6: Hefe-Zweihybridsystem zum Nachweis der Wechselwirkung zwischen dem Elongationsprotein Af 0497 von Archaeoglobus fulgidus und dem Gleitklammerprotein Af 0335 von Archaeoglobus fulgidus
Fig. 9 zeigt die Ergebnisse eines Y2H Experimentes, wobei die Reihe A mit Zellen bestückt ist, die den leeren pGAD424 Vektor (Clontech, Palo Alto, USA) tragen, so daß eine Transkriptions-Aktivierungsdomäne exprimiert wird; die Reihe B mit Zellen bestückt ist, die den pGAD424 Vektor tragen, von dem das Sacharomyces cereve- siae Gen CDC48 als Fusionsprotein mit der Transkriptions-Aktivierungsdomäne exprimiert wird; die Reihe C mit Zellen bestückt ist, die den pGAD424 Vektor tragen, von dem das Gleitklammergen aus Archaeoglobus fulgidus als Fusionsprotein mit der Transkriptions-Aktivierungsdomäne exprimiert wird; die Reihe D nicht mit Zellen bestückt ist und die Reihe E mit Zellen bestückt ist, die den pGAD424 Vektor tragen, von dem das Elongationsproteingen aus Archaeoglobus fulgidus als Fusionsprotein mit der Transkriptions-Aktivierungsdomäne exprimiert wird.
Die Spalte 1 ist mit Zellen bestückt, die den leeren pGBT9 Vektor (Clontech, Palo Alto, USA) tragen; die Spalte 2 ist bestückt mit Zellen, die den pGBT9 Vektor tragen, von dem das Saccharomyces cerevisiae Gen UFD3 als Fusionsprotein mit der DNA- Bindedomäne exprimiert wird; die Spalte 3 ist bestückt mit Zellen, die den pGBT9 Vektor tragen, von dem das Gleitklammerprotein aus Archaeoglobus fulgidus als Fusionsprotein mit der DNA-Bindedomäne exprimiert wird; die Spalte 4 ist bestückt mit Zellen, die den pGBT9 Vektor tragen, von dem das Kopplungsprotein aus Archaeoglobus fulgidus als Fusionsprotein mit der DNA-Bindedomäne exprimiert wird, und Spalte 5 ist bestückt mit Zellen, die den pGBT9 Vektor tragen, von dem das Elongationsprotein aus Archaeoglobus fulgidus als Fusionsprotein mit der DNA- Bindedomäne exprimiert wird.
Beispiel 7: Polymeraseketten-Reaktion von genomischer DNA unter Verwendung eines Chimären Elongationsproteins
Beispiel 7 zeigt den Einfluß des Gleitklammerproteins auf die Effizienz einer PCR - Reaktion an längeren DNA - Fragmenten unter Verwendung des erfindungsgemäßen rekombinanten rekombinanten Chimären Proteins. In dieser PCR - Reaktion wurde ein 4954bp großes Fragment ausgehend von humaner genomischer DNA amplifiziert. Als Polymerase wurde das erfindungsgemäße rekombinante chimäre Protein verwendet. Die Bedingungen entsprechen den Standardbedingungen einer PCR-Reaktion: pH 8,3, 0,4mM jedes dNTP und 20 pmol von jedem Primer in einer Reaktion. Eingesetzt wurde ein erster Primer ((SEQ ID NO.: 15): 5'- AGGAACAACATATGACGCACTCT-3') und ein zweiter Primer ((SEQ ID NO.: 16): (5'-TAGGTGGCCTGCAGTAATGTTAG-3').
Es zeigt sich, daß nur das erfindungsgemäße rekombinante chimäre Protein, in seiner Sequenz dargestellt in Fig. 6A, unter Stimulation durch das Gleitklammerproteins PCNA ein eindeutiges und spezifisches PCR - Produkt generieren ließ, während der gleiche Reaktionsansatz mit nativer Taq DNA-Polymerase kein eindeutiges Produkt ergab. Das erklärt sich durch die Interaktion des Gleitklammerproteins mit dem erfindungsgemäß rekombinanten Chimären Protein und einer damit verbundenen geringeren Dissoziation des erfindungsgemäßen rekombinanten Chimären Proteins von der Ziel- DNA.
Im folgenden werden die Figuren detaillierter besprochen, auf die in den vorstehenden Beispielen zum Teil bereits Bezug genommen wurde.
Sämtliche Sequenzalignments, wie sie hierin in den folgenden Figuren offenbart wer- den, wurden mit dem BLAST Algorithmus nach Altschul, S.F., Gish, W. Miller, W., Myers.E.W., and Lipman, D ., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990) erstellt.
Fig. 1 :
Fig. 1 zeigt Sequenzalignments von insgesamt vier verschiedenen Elongations- proteindomänen aus verschiedenen Organismen, so für das Elongationsprotein 1 aus Mensch, Archaeglobus fulgidus, Methanococcus thermoautotrophicusm, PHBT (Pyrococcus horikoshii), und Methanococcus janashii. Direkt unter der Alignierung steht bei den Figuren häufig eine Konsensussequenz in einer Schreibweise, bei der variierende Positionen durch ein einzelnes Zeichen angeben werden. Die in eckigen Klammern angegeben Aminosäuren stellen jene Aminosäuren, ausgedrückt im Einbuchstabencode, dar, die an der speziellen Position stehen können.
Die Aminosäuren werden hierbei gemäß der Standard -lUPAC-Einbuchstaben- Nomenklatur benannt und gemäß dem Prosite Pattern- Beschreibungsstandard aufgeführt. Dabei sind die folgenden Aminosäuregruppen häufig zusammengefaßt:
G,A,V,L,I,M.P,F oder W (Aminosäuren mit nicht polaren Seitenketten), direkt unter der Sequenz oftmals auch als "$" geschrieben,
S,T,N,Q,Y, oder C (Aminosäure mit ungeladenen polaren Seitenketten), K,R,H,D oder E (Aminosäure mit geladenen und polaren Seitenketten) direkt unter der Sequenz oftmals auch als "&" geschrieben, außerdem bedeutet X in den Sequenzen bzw. Sequenzprotokollen jede beliebige Aminosäure oder Insertion oder Deletion
Fig. 1 gibt vier verschiedene Konsensussequenzen für verschiedene Bereiche von Elongationsproteinen an, wobei z.B. das Eionagtionsprotein 3 häufig in Eubakterien gefunden werden kann, das Elongationsprotein 4 auch die Taq-Polymerase umfaßt und häufig in Pol I-Typ-Polymerasen gefunden werden kann. Elongationsprotein 3 zeigt somit ein Alignment einer konservierten Regionen des Elongationsproteins aus Eubakterien, sowie die daraus hergeleiteten Konsensussequenzen. Folgende Gene sind gezeigt: DP3A_ECOLI: DNA Pol III, alpha subunit, Escherichia coli, BB0579: DNA Pol III, alpha subunit, Borrelia burgdorferi, DP3AJHELPY: DNA Pol III, alpha subunit, Helicobacter pylori AA50: Aquifex aeolicus, section 50 und DP3A_SALTY: DNA Pol III, alpha subunit, Salmonella typhimurium).
Fig. 2:
Fig. 2 zeigt die Skizze einer möglichen Form des erfindungsgemäßen rekombinanten Chimären Proteins, wobei die Gleitkammer als die Syntheseaktivität der Polymerase erhöhender Faktor über die Domäne mit Wechselwirkung-bedingender Sequenz an das die Nukleinsäuresynthese-aktivität tragende Elongationsprotein bindet. Fig. 3:
Fig. 3 zeigt vier Gleitklammerkonsensussequenzen
Folgende Gene sind für Gleitklammer Region 1 gezeigt: Humanes PCNA, sowie Orthologe dazu, aus Archaeoglobus fulgidus, aus Methanococcus janashii, aus Py- rococcus horikoschü und aus Methanococcus thermoautothrophicus.
Region 2 zeigt ein Alignment einer zweiten konservierten Regionen der Gleitklammer aus Eukaryonten und Archae, sowie die daraus hergeleiteten Konsensussequenzen. Das Alignment wurde dabei unter Verwendung einer zweiten Region der oben bei Region 1 bereits verwendeten Gleitklammern erstellt.
Region 3 zeigt ein Alignment einer konservierten Regionen der Gleitklammer aus Eubakterien, sowie die daraus hergeleiteten Konsensussequenzen. Folgende Gene sind gezeigt: AAPOL3B, DP3B_ECOLI, S.TYPHIM, DP3B_PROMI, DP3B_PSEPU und DP3B_STRCO (AAPOL3B: Aqufex Aeolicus Sektion 93: DP3B_ECOLI : DNA Pol III, beta chain, Escherichia coli, S.TYPHIM: DNA Pol III, beta chain, Salmonella ty- phimurium, P3B_PROMI : DNA Pol III, beta chain, Proteus mirabilis DP3B_PSEPU: DNA Pol III, beta chain, Pseudomonas putida DP3B_STRCO: DNA Pol III, beta chain, Streptomyces coeiicolor).
Region 4 zeigt ein Alignment einer zweiten konservierten Regionen der Gleitklammer aus Eubakterien (siehe Organismen in Region 3), sowie die daraus hergeleiteten Konsensussequenzen
Fig. 4:
Fig. 4 zeigt die Interaktion von Chimären Proteinen im Hefe-Zweihybridsystem. Das in Fig. 4 dargestellte Ergebnis beweist, daß die Eigenschaft eine Wechselwirkung mit dem Gleitklammerprotein Af0335 zu bedingen, auf ein anders Protein, insbesondere auf eine andere Polymerase, verpflanzt werden kann, um dort eine Wechselwirkung mit dem Gleitklammerprotein hervorzurufen. Es ist gezeigt, daß das GKP sich selbst bindet und das GKP eine Taqfusionsprotein bindet, welches eine Wechselwirkungbedingende Sequenz aus Archaeglobus fulgidus umfaßt.
Fig. 5:
Fig. 5 zeigt drei Alignments konservierter Regionen Wechselwirkung-bedingender Sequenz aus verschiedenen Organismen und für verschiedene Gene:
Sequenz 1 (Polymerasegen, Af 0497 Homologe): Archaeoglobus fulgidus, Pyrodicti- um occultum, Aeropyrum pernix, Pyrococcus glycovorans, Pyrococcus furiosus, Thermococcus gorgonarius, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshii, Thermococ- cus litoralis, Thermococcus fumicolans und Methanococcus jannaschii
Sequenz 2 (Polymerasegen, Af 1722 Homologe), Archaeoglobus fulgidus, Methanococcus jannaschii, Pyrococcus furiosus, Methanobacterium thermoautotrophicum, Pyrococcus horikoshii und Pyrococcus abyssi und
Sequenz 3 (Af 1347 Homologe), Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshii, Methanobacterium thermoautotrophicum und Aeropyrum pernix.
Die Wechselwirkung-bedingende Sequenzen können in ein erfindungsgemäßes chimäres Protein eingebracht werden um ein GKP zu binden.
Fig. 5B:
Fig. 5B zeigt zwei Alignments konservierter Regionen Wechselwirkung-bedingender Sequenz aus verschiedenen Organismen und für verschiedene Gene: Sequenz 4 (RNAse-Gen, Af 0621 Homologe): Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshii und Arabidopsis thaliana und
Sequenz 5 (Polymerase-Gen): Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus abyssi, Methanococcus thermoautotrophicus, Methanococcus janashii, Mus musculus und Homo sapiens.
Die Wechselwirkung-bedingende Sequenzen können in ein erfindungsgemäßes chi- märes Protein eingebracht werden um ein GKP zu binden.
Fig. 5C:
Fig. 5C zeigt eine Liste von Charakteren die verwendet werden um ein oder mehrere verschiedene Aminosäuren zu Kennzeichnen, wobei unter "Klasse" die Aminosäure oder die Eigenschaft der Gruppe steht, unter "key" das verwendete Zeichen und unter "Rest" die Aminosäuren die in der Gruppe sind.
Fig. 6A:
Die Fig. 6A zeigt die Gesamtsequenz einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen rekombinanten Chimären Proteins. Hier stammt das Elongationsprotein und damit die Nukleinsäuresyntheseaktivität aus Thermus aquaticus und die Wechselwirkung-bedingende Sequenz aus Archaeglobus fulgidus.
Fig. 6B:
Die Fig. 6B zeigt eine graphische Übersicht des Aufbaus einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen rekombinanten Chimären Proteins. Hier ist das Elongationsprotein aus Thermus aquaticus. und die wechselwirkungsbedingende sequenz aus Archaeglobus fulgidus.
Fig. 7:
Fig. 7 zeigt die Verwendung eines erfindungsgemäßen rekombinanten Chimären Proteins in der PCR, dessen Sequenz in Fig. 6A abgebildet ist. In allen Spuren dieses 1% Agarose Gels ist jeweils eine Bande für das Amplifikat einer PCR - Reaktion ausgehend von Plasmid-DNA (pCR 2.1 Vektor inclusive eines 463bp Fragments; In- vitrogen, 9704 CH Groningen; Netherlands), die unter folgenden Bedingungen (95°C 5' Denaturierung; 30 x {95°C 30" Denaturierung; 55°C 30" Hybridisierung; 72°C 40" Elongation}; 72°C 7 zusätzliche Elongation) durchgeführt wurde, mit einer Größe von 463 bp zu erkennen. Die Reaktionen wurden zu je 20μl eines 50μl Ansatzes auf das Gel aufgetragen. Spur 7 zeigt einen Größenstandard.
In den Spuren 2 (0,3μg PCNA) und 3 (2,4μg PCNA) kann man erkennen, daß sich die Intensität der Bande nach Zugabe steigender Mengen Gleitklammerprotein (PCNA) als stimulierendes Agens bei gleichbleibender Mg2+ - lonenkonzentration (2,5mM) gegenüber der Spur 1 (PCR-Reaktion ohne PCNA) erhöht. Eine weitere Steigerung der Intensität der Bande und damit verbunden eine erhöhte Ausbeute der PCR-Reaktion kann man bei einer höheren Mg2+ - lonenkonzentration (3,5mM) erreichen, siehe Spur 4 (ohne PCNA) und Spuren 5 (0,3μg PCNA) und 6 (2,4μg PCNA) bei zunehmender Menge an PCNA.
Fig. 8A:
Graphische Darstellung aller Fragmente von Af0497 (siehe oben) , die mit dem Gleitklammerprotein aus Archaeoglobus fulgidus (Af0335) interagieren. Mit "B" gekennzeichnete Pfeile repräsentieren Klone, die als Fusion mit der DNA-Bindedomäne gefunden wurden, Mit "A" gekennzeichnete Pfeile repräsentieren Klone, die als Fusion mit der Aktivierungsdomäne gefunden wurden.
Fig. 8B:
Fig. 8B zeigt ein Alignement der C-terminalen Sequenzen der folgenden Gene Af 0497-grUE, Af 1195 Rfc, Af 0264 Rad2-Fen1 , Af 0621 RNAseH, , Archaeglobus fulgidus.
Fig. 9:
Fig. 9 zeigt das Ergebnis eines Hefe-Zweihybridtests und belegt eine Bindung zwischen den Hefeproteinen ufd3 und cdc48 (2B; Positivkontrolle), zwischen dem Elongationsprotein und dem Gleitklammerprotein (3E; und in der umgekehrten Orientierung 5C), zwischen dem Gleitklammerprotein und dem Gleitklammerprotein (3C) und zwischen dem Kopplungsprotein und dem Gleitklammerprotein (4C). Die Fusionsproteine werden exprimiert von den Vektoren pGBT9 (Vektor) in Spalte 1 , pGBT9::ufd3 (Positivkontrolle) in 2, pGBT9:.PCNA in 3, pGBT9::klUE in 4, pGBT9::grUE in 5, pGAD424 (Vektor) in Reihe A, pGAD424::cdc48 in B (Positivkon- trolle), pGAD424::PCNA in C, leer in D und pGAD::grUE in E.
Interaktionen von Proteinen aus Archaeoglobus fulgidus wurden mit dem Y2H System gezeigt. Die kodierenden Bereiche von Genen aus Archaeoglobus fulgidus, deren Genprodukte in vitro verwendeten werden können, wurden mittels PCR amplifiziert, in die Vektoren pGBT9 (vertikale Spalten der Fig. 27) und pGAD424 (horizontale Reihen der Fig. 9) kloniert und durch gap-repair in Hefe PJ69-4a (für pGAD424) und PJ69-4alpha (für pGBT9) als Hybridproteine zur Expression gebracht. Ebenso wurde eine positive Kontrolle mittels PCR amplifiziert, in die Vektoren pGBT9 (siehe auch vertikale Spalten der Fig. 9) und pGAD424 (siehe auch horizontale Reihen der Fig. 9) kloniert und durch gap-repair in den Hefestamm PJ69-4a (für pGAD424) und PJ69-4alpha (für pGBT9) als Hybridproteine zur Expression gebracht. Diploide Zellen, die beide Vektoren enthalten, wurden durch Paarung entsprechend dem gezeigten Raster in Fig. 9 erzeugt. Die Expression von drei unabhängigen Reportern (HIS3, ADE2 und MEL1) wurde gemessen. Gezeigt ist in Fig 9 das Wachstum auf Medium ohne Histidin und Adenin. In diesem Experiment wachsen jene Zellen, die beide Vektoren tragen und zudem die Expressionsprodukte dieser beiden Vektoren einander binden. Was dadurch bedingt wird, daß in Folge der Bindung der Expressionsprodukte Transkription initiiert wird, die dazu führt, daß die Histidin und Adenin Auxotrophie aufgehoben wird.
Alle hier positiven Klone waren auch positiv bezüglich der Expression des MEL1 Gens. Die Handhabung des two-hybrid Systems erfolgte gemäß der Anleitung der Firma Clonetech (yeast protocols handbook, PT3024-1).
Fig. 10
In allen Spuren dieses 1% Agarose Gels mit Ausnahme von Spur 5, die einen Größenstandard zeigt, ist das Amplifikat einer PCR - Reaktion ausgehend von humaner genomischer DNA mit einer Größe von 4954 Basenpaaren (Röche Diagnostics, D - 68305 Mannheim), die unter den folgenden Bedingungen: 95°C 5' Denaturierung; 35 x {95°C 30" Denaturierung; 47°C 30" Hybridisierung; 72°C 12' Elongation}; 72°C 10 zusätzliche Elongation, durchgeführt wurde, zu je 20μl eines 50μl Ansatzes auf das Gel aufgetragen worden. In Spur 3 (2,4μg PCNA) kann man erkennen, daß man eine Bande nach Zugabe steigender Mengen des Gleitklammerproteins (PCNA aus Archaeoglobus fulgidus) zum erfindungsgemäßen rekombinanten Chimären Proteinkomplexe als stimulierendes Agens bei gleichbleibender Mg2+ - lonenkonzentration (6mM) gegenüber der Spur 1 (PCR-Reaktion ohne PCNA) und Spur 2 (0,3μg PCNA) erhält, während sich hingegen bei gleicher Mg2+ - lonenkonzentration mit Taq DNA- Polymerase (Spur 4) kein eindeutiges Produkt in der PCR - Reaktion generieren ließ. Die in der vorliegenden Beschreibung sowie in den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

Claims

Ansprüche48
1. Rekombinantes Chimäres Protein umfassend
a) eine erste Domäne mit Nucleinsäuresyntheseaktivität, und b) eine Wechselwirkung vermittelnde Sequenz,
dadurch gekennzeichnet, daß durch die Wechselwirkung vermittelnde Sequenz ein Komplex aus Nukleinsäuresyntheseaktivität und Gleitklammerprotein gebildet wird, wobei der Komplex verschieden ist von dem Komplex, den die Nukleinsäuresyntheseaktivität und/oder das Gleitklammerprotein mit ihren natürlichen Wechselwirkungspartner (n) ausbildet.
2. Chimäres Protein umfassend
einen Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisenden Anteil, wobei der Anteil aus einem einen Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisenden Anteil und einen Wechselwirkung vermittelnden Anteil umfassenden Basisprotein stammt, und
mindestens einen eine Wechselwirkung vermittelnden Anteil,
wobei der Wechselwirkung vermittelnde Anteil verschieden ist von dem Wechselwirkung vermittelnden Anteil des Basisproteins.
3. Chimäres Protein nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein den Wechselwirkung vermittelnden Anteil des Basisproteins umfaßt.
4 Chimäres Protein umfassend
einen Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisenden Anteil, wobei der Anteil aus einem Basisprotein stammt, das einen Nukleinsäuresyntheseaktivität aufweisenden Anteil aber keinen Wechselwirkung vermittelnden Anteil umfaßt, und
einen Wechselwirkung vermittelnden Anteil
5 Chimäres Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Wechselwirkung vermittelnde Anteil eine Bindung zwischen der Nukleinsäuresyntheseaktivität und einem die Syntheseleistung der Nukleinsäuresyntheseaktivität beeinflussenden Faktor vermittelt
6 Chimäres Protein nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Faktor ein Gleitklammer-protein ist
7 Rekombinantes chimäres Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß
die Nucleinsäuresyntheseaktivität eine Konsensuspeptidsequenzen umfaßt, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die die Sequenzen SEQ ID NO 1 , 2 und 3 umfaßt
8 Rekombinantes chimäres Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß
das Gleitklammerprotein eine Konsensuspeptidsequenz umfaßt, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die die Sequenzen SEQ ID NO 4, 5, 6 und 7 umfaßt
9. Rekombinantes chimäres Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß
die Wechselwirkung vermittelnde Sequenz eine Konsensuspeptidsequenz umfaßt, welche ausgewählt ist aus der Gruppe, die die Sequenzen SEQ ID NO.: 8, 9, 10 11 und 12 umfaßt.
10. Rekombinantes chimäres Protein nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß
die Wechselwirkung vermittelnde Sequenz eine Konsensuspeptidsequenz gemäß SEQ ID NO.: 8 umfaßt.
11. Rekombinantes chimäres Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß
die Wechselwirkung vermittelnde Sequenz am C-terminalen Ende der die Nucleinsäuresyntheseaktivität tragenden Sequenz liegt.
12. Rekombinantes chimäres Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß
zwischen der Wechselwirkung vermittelnden Sequenz und der die Nukleinsäureaktivität tragenden Sequenz ein Linker angeordnet ist.
13. Rekombinantes chimäres Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß
das rekombinante chimäre Protein thermostabil ist.
14 Rekombinantes chimäres Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß
das Protein eine DNA Polymerase-Aktivitat aufweist
15 Rekombinantes chimäres Protein nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß
das Protein eine 3'-5' Exonukleaseaktivität aufweist
16 Rekombinantes chimäres Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß
das Protein eine RNA Polymerase-Aktivitat aufweist
17 Rekombinantes chimäres Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß
das Protein eine reverse Transkriptase-Aktivität aufweist
18 Rekombinantes chimäres Protein gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß
sich die Einbaurate von dNTPs und ddNTPs durch die Nukleinsäuresyntheseaktivität um einen Faktor von weniger als 5 unterscheidet
19 Komplex umfassend
a) ein rekombinantes chimäres Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 und b) ein Gleitklammerprotein
20 Komplex gemäß Anspruch 19,
wobei das Gleitklammerprotein eine Konsensuspeptidsequenz umfaßt, welche ausgewählt ist aus der Gruppe, die die Sequenzen gemäß SEQ ID NO 4, 5, 6 und 7 umfaßt
21 Komplex nach Anspruch 19 oder 20, weiter umfassend eine Nukleinsäure
22 Nukleinsäure kodierend für ein rekombinantes chimäres Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18
23 Vektor umfassend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 22
24 Vektor gemäß Anspruch 23, wobei dieser ein Expressionsvektor ist
25 Zelle umfassend einen Vektor gemäß Anspruch 23 oder 24
26 Verwendung eines rekombinanten chimaren Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Elongation von Nukleinsäuren
27 Verwendung eines rekombinanten chimaren Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Amplifikation von Nukleinsäuren
28 Verwendung eines rekombinanten chimaren Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 zur reversen Transkription von RNA in DNA
29. Verwendung eines rekombinanten chimaren Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Sequenzierung von DNA
30 Reagenzien-Kit zur Elongation und/oder Amplifikation und/oder reversen
Transkription und/oder Sequenzierung und/oder Markierung von Nukleinsäuren, umfassend in einem oder mehreren getrennten Behältern a) ein rekombinantes chimäres Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 18 und/oder b) einen Komplex nach einem der Ansprüche 19 bis 21 und bevorzugterweise c) gegebenenfalls zumindest einen Primer, Puffer, Nukleotide, Kofaktoren und/oder Pyrophosphatase
31. Kit nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet,
daß er zur Amplifikation von Nukleinsäuren neben den Substanzen a) und/oder b), Deoxynukleotide oder/und Derivate davon umfaßt
32 Kit nach Anspruch 30 oder 31 , dadurch gekennzeichnet,
daß er eine DNA Polymerase mit 3'-5' Exonukleaseaktivität umfaßt. 33 Kit nach Anspruch 30 dadurch gekennzeichnet,
daß er zur Reversen Transkription Substanzen nach a) und/oder b) enthalt, welche eine Reverse Transkriptase-Aktivität aufweisen, und bevorzugterweise Deoxynukleotide und/oder Derivate davon
34 Kit nach Anspruch 30 dadurch gekennzeichnet,
daß er zur Sequenzierung neben Deoxynukleotiden oder Ribonukleotiden oder/und deren Derivaten, Dideoxynukleotide oder/und deren Derivate enthalt
35 Verfahren zur Template-abhangigen Elongation von Nukleinsäuren, wobei die zu elongierende Nukleinsäure oder zumindest ein Strang davon mit mindestens einem Pnmer unter Hybridisierungsbedingungen versehen wird, wobei der Primer hinreichend komplementär zu einem Teil der oder einem flankierenden Bereich der zu elongierenden Nukleinsäure ist und durch eine Polymerase in Anwesenheit von Nukleotiden eine Primer-Elongation erfolgt, dadurch gekennzeichnet,
daß als Polymerase ein rekombinantes chimäres Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 verwendet wird und
daß bevorzugterweise ein Gleitklammerprotein in der Reaktion vorliegt
36 Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure, wobei die zu amplifizierende Nukleinsäure mit mindestens zwei Pπmern unter Hybridisierungsbedingungen vesetzt wird, wobei ein jeder der beiden Pnmer jeweils komplementär zu einem Teil der oder einem flankierenden Bereich der zu amplifizierenden Nukleinsäure ist und durch eine Polymerase in Anwesenheit von Nukleotiden eine Primer-Elongation erfolgt dadurch gekennzeichnet,
daß als Polymerase ein chimäres Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 18 verwendet wird und daß bevorzugterweise ein Gleitklammerprotein der Reaktion zugesetzt wird
Verfahren nach Anspruch 36 dadurch gekennzeichnet,
daß man eine Polymerase-Ketten-Reaktion durchfuhrt
Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet,
daß der Reaktionsansatz zwei DNA Polymerasen umfaßt, von denen mindestens eine eine 3'-5' Exonukleaseaktivität aufweist, wobei die 3'-5'- Exonukleaseaktivitat entweder durch das rekombinante chimare Protein oder durch eine weitere Polymerase dem Reaktionsansatz zugesetzt wird
Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet,
daß zwei rekombinante chimare Proteine nach einem der Ansprüche 1 bis 18 in der Reaktion vorliegen, wobei eines ein solches nach Anspruch 14 und das andere ein solches nach Anspruch 15 ist
Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet,
daß man zur Sequenzierung von Nukleinsäuren ausgehend von einem Pnmer, der zu einem der zu sequenzierenden Nukleinsäure benachbarten Bereich komplementär ist, eine Template-abhangige Elongation bzw Reverse-Transkription unter Verwendung von Deoxynukleotiden und Dideoxynukleotiden oder deren jeweiligen Derivaten gemäß der Methode von Sanger durchfuhrt
Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Elongation der Nukleinsäuren Markierungen einfugt
42 Verfahren nach Anspruch 41 , dadurch gekennzeichnet, daß ein Agens verwendet wird das ausgewählt ist aus der Gruppe die markierte Pnmer, markierte Deoxynukleotide und Derivate davon, markenerte Dideoxynukleotide und Derivate davon und markierte Ribonukleotide und Derivate davon umfaßt
43 Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren durch Erzeugung einzelner
Bruche in Phosphodiesterbindungen der Nukleinsaurekette und Ersatz eines Nukleotids an den Bruchstellen durch ein markiertes Nukleotid mit Hilfe einer Polymerase, dadurch gekennzeichnet
daß als Polymerase ein rekombinantes chimäres Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 18 eingesetzt wird
44 Antikörper gerichtet gegen ein chimäres Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 18
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