JPH09506783A

JPH09506783A - テルモトガ・ネアポリタナからクローニングされたｄｎａポリメラーゼおよびその変異体

Info

Publication number: JPH09506783A
Application number: JP8511997A
Authority: JP
Inventors: ヒューズ，エイ・ジョン，ジュニア; チャッタージー，デブ・ケイ
Original assignee: ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド
Priority date: 1994-09-30
Filing date: 1995-10-02
Publication date: 1997-07-08
Also published as: US5912155A; WO1996010640A1; US6444424B1; CA2174944A1; EP0725827A1; US5939301A; DE69531660D1; EP0725827B1; US20030092018A1; ATE248917T1; EP1361275A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、テルモトガ・ネアポリタナ（Ｔｎｅ）からの実質的に純粋な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびその変異体に関する。本発明のＴｎｅＤＮＡポリメラーゼは約１００キロダルトンの分子量を有し、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼよりも熱安定性である。本発明の変異体ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼは、（１）テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少または除去する第一の変異、（２）該ＤＮＡポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少または除去する第二の変異、および（３）ジデオキシリボヌクレオチドに対して非識別性にする該ＤＮＡポリメラーゼのＯ−ヘリックス中の第三の変異よりなる群から選ばれた少なくとも一つの変異を有する。本発明はまた、野性型または変異体ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの大腸菌中でのクローニングおよび発現、該クローニング遺伝子を含むＤＮＡ分子、および該遺伝子を発現する宿主細胞にも関する。本発明のＴｎｅＤＮＡポリメラーゼは、よく知られたＤＮＡシークエンシングおよび増幅反応に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】テルモトガ・ネアポリタナからクローニングされたＤＮＡポリメラーゼおよびその変異体発明の背景発明の技術分野本発明は、実質的に純粋な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに関する。とりわけ、本発明のＤＮＡポリメラーゼは分子量約１００キロダルトンを有するテルモトガ・ネアポリタナ（Ｔhermotoga neapolitana）ＤＮＡポリメラーゼである。本発明はさらに、大腸菌（Ｅ.coli）におけるテルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼのクローニングと発現、クローニングされた遺伝子を含むＤＮＡ分子、および該遺伝子を発現する宿主にも関する。本発明のＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡシークエンシングおよび増幅反応に用いることができる。本発明はまた、実質的に減少した３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有するテルモトガ・ネアポリタナ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼの変異体；デオキシヌクレオチドとほぼ同程度に効率良くＤＮＡ分子にジデオキシヌクレオチドを取り込む能力を変異体ＤＮＡが獲得することとなるＰｈｅ⁶⁷→Ｔｙｒ⁶⁷（図５の番号に従って）変異を含むテルモトガ・ネアポリタナの変異体；および実質的に減少した３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有する変異体に関する。本発明のＴｎｅ変異体はこれらの特性を１つないしはそれ以上有する。これらのＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ変異体はまたＤＮＡシークエンシングおよび増幅反応に用いることもできる。背景情報ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ鋳型に相補的なＤＮＡ分子を合成する。一本鎖ＤＮＡの鋳型にプライマーがハイブリダイズすると、ポリメラーゼはＤＮＡを５' から３'側の方向に合成し、大きくなりつつある鎖の３'−ヒドロキシル基にヌクレオチドを連続的に付加させる。それゆえ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）およびプライマーの存在下、一本鎖ＤＮＡの鋳型に相補的な新たなＤＮＡ分子を合成することができる。多くのＤＮＡポリメラーゼが大腸菌などの中温菌微生物から単離されている。これらの中温菌ＤＮＡポリメラーゼの多くはまたクローニングされている。リン（Ｌin）らは大腸菌においてＴ４ＤＮＡポリメラーゼをクローニングし発現させた（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８４：７０００−７００４（１９８７））。テイバー（Ｔabor）らはクローニングされたＴ７ＤＮＡポリメラーゼについて記載し（米国特許第４,７９５,６９９号）、一方、ミンクリー（Ｍinkly）ら（Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２５９：１０３８６−１０３９２（１９８４））およびチャッタージー（Ｃhatterjee）（米国特許第５,０４７,３４２号）は、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩおよびＴ５ＤＮＡポリメラーゼのクローニングについてそれぞれ記載している。好熱性菌由来のＤＮＡポリメラーゼは知られているものの、これらの酵素を分離したり、ましてこれら酵素をクローニングするための研究は比較的、ほとんどなされていない。チーン（Ｃhien）らはテルマス・アクアティクス（Ｔhermus a quaticus）（Ｔaq）からポリメラーゼを得るための精製法を記載している（Ｊ. Ｂacteriol.１２７：１５５０−１５５７（１９７６））。その結果得られたタンパク質はゲル濾過分析により約６３,０００ダルトン、ショ糖密度勾配遠心により約６８,０００ダルトンの分子量を有していた。カレディン（Ｋaledin）らは、テルマス・アクアティクスＹＴ１株からＤＮＡポリメラーゼを単離するための精製法を開示している（Ｂiokhymiya ４５：６４４−５１）。精製された酵素は６２,０００ダルトンのモノマータンパク質であると報告された。ゲルファンド（Ｇelfand）ら（米国特許第４,８８９,８１８号）は、テルマス・アクアティクスから熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子をクローニングした。このタンパク質の分子量は約８６,０００〜９０,０００ダルトンであることがわかった。シンプソン（Ｓimpson）らは、テルモトガ種から熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを精製し、部分的に特徴づけた（Ｂiochem.Ｃell.Ｂiol.８６：１２９２−１２９６（１９９０））。シンプソンらによって単離された精製ＤＮＡポリメラーゼは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびサイズ排除クロマトグラフィーにより決定されたように分子量８５,０００ダルトンを示した。この酵素は基質の不在下、９５℃で３分、５０℃で６０分の半減期を示し、その最適ｐＨは、７.５〜８.０の範囲であった。トリトンＸ−１００はこの酵素の熱安定性を増加させるように思われた。シンプソンらによって記載された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを得るために使用した株は、テルモトガ種ＦｊＳＳ３−Ｂ.１であった（フッサー（Ｈussar）ら、ＦＥＭＳＭicrobiology Ｌetters ３７：１２１−１２７（１９８６））。他のＤＮＡポリメラーゼが、バシラス・ステラオテルモフィラス（Ｂacillus steraothermophilus）（ステネッシュ（Ｓtenesh）ら、Ｂio chim.Ｂiophys.Ａcta ２７２：１５６−１６６（１９７２）およびカボエフ（Ｋ aboev）ら、Ｊ.Ｂacteriol.１４５：２１−２６（１９８１））およびいくつかの古細菌種（ロッシ（Ｒossi）ら、Ｓystem.Ａppl.Ｍicrobiol.７：３３７−３４１（１９８６）；クリムクザーク（Ｋlimczak）ら、Ｂiochemistry ２５：４８５０−４８５５（１９８６）；およびエリー（Ｅlie）ら、Ｅur.Ｊ.Ｂiochem. １７８：６１９−６２６（１９８９））を含む熱安定性細菌から分離されてきた。最も広範囲にわたって精製された古細菌ＤＮＡポリメラーゼは、８７℃で１５分の半減期を有すると報告されている（エリーら、前記）。アイニス（Ｉnnis）らは、ＰＣＲプロトコール：ア・ガイド・トゥ・メソッズ・アンド・アンプリフィケーション（Ａ Guide Ｔo Ｍethods and Ａmplification）、アカデミックプレス、サンディエゴ（１９９０）において非常に高温で増殖することができる数種の極めて好熱性の真性細菌および古細菌が存在することを記述し（バーグキスト（Ｂergquist）ら、Ｂiotech.Ｇenet.Ｅng.Ｒev.５：１９９−２４４（１９８７）；およびケリー（Ｋelly）ら、Ｂiotechnol Ｐrog．４：４７−６２（１９８８））、これらの生物が非常に熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを含むかもしれないことを示唆した。知られたポリメラーゼの多くにおいては、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性はポリメラーゼのアミノ末端領域にて存在する（オリス（Ｏlis）ら、Ｎature ３１３：７６２−７６６（１９８５）；フリーモント（Ｆreemont）ら、Ｐroteins １：６６−７３（１９８６）；ジョイス（Ｊoice）、Ｃur.Ｏpin.Ｓtruct.Ｂio l. １：１２３−１２９（１９９１））。５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を担うと考えられている保存されたアミノ酸がいくつか存在している（ガットマン（Ｇut man）＆オリントン（Ｏlinton）、Ｎucl.Ａcids Ｒes．２１：４４０６−４４０７（１９９３））。これらのアミノ酸には大腸菌ポリメラーゼＩにおいてＴｙｒ²² 、Ｇｌｙ¹⁰³、Ｇｌｙ¹⁸⁷、およびＧｌｙ¹⁹²が含まれている。これらのアミノ酸のいかなる変異も５'から３'方向へのエキソヌクレアーゼ活性を減少させるであろう。５'−エキソヌクレアーゼドメインは必ずしも必要でないことがわかっている。最もよく知られた例が大腸菌ポリメラーゼＩのクレノー断片である。クレノー断片は、５'−エキソヌクレアーゼ活性を欠く天然のタンパク質加水分解断片である（ジョイス（Ｊoice）ら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２５７：１９５８−６４（１９９０））。この活性を欠くポリメラーゼはＤＮＡシークエンシングに有用である。ほとんどのＤＮＡポリメラーゼはまた、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性をも含んでいる。このエキソヌクレアーゼ活性はＤＮＡポリメラーゼに校正能を与える。３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴ５ＤＮＡポリメラーゼが、米国特許第５,２７０,１７９号に開示されている。この活性を欠くポリメラーゼはＤＮＡシークエンシングに有用である。 dＮＴＰ結合ドメインを含むポリメラーゼ活性部位は、通常、該ポリメラーゼのカルボキシル末端領域に存在している（オリス（Ｏlis）ら、Ｎature ３１３：７６２−７６６（１９８５）；フリーモントら、Ｐroteins １：６６−７３（１９８６））。大腸菌ポリメラーゼＩのＰhe⁷⁶²がヌクレオチドと直接相互作用するアミノ酸の１つであるということが示されている（ジョイスおよびステイツ（Ｊoice ＆Ｓteitz）、Ａnn.Ｒev.Ｂiochem.６３：７７７−８２２（１９９４）：アスタトク（Ａstatke）、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２７０：１９４５−５４（１９９５））。このアミノ酸をＴｙｒに変換するとジデオキシヌクレオチドに対して非識別性で高度に処理可能な（processive）変異体ＤＮＡポリメラーゼとなる。１９９５年９月８日に出願された発明の名称が『変異体ＤＮＡポリメラーゼおよびその使用』（“Ｍutant ＤＮＡＰolymerases and the Ｕse Ｔhereof”）のデブ・ケイ・チャッタージー（Ｄeb Ｋ．Ｃhatterjee）の米国出願第０８／５２５,０８７号（参照のため本明細書中に引用する）を参照。それゆえ、熱安定性で処理可能なＤＮＡポリメラーゼを開発することが当該技術分野で必要とされている。また、エキソヌクレアーゼ活性を欠きジデオキシヌクレオチドに対して非識別性の野性型または変異体ＤＮＡポリメラーゼを得ることも当該術分野で必要とされている。発明の要約本発明は、分子生物学において有用なＤＮＡポリメラーゼをさらに提供することによって当該技術分野におけるこれら要求を満足させる。詳しくは、本発明は、約１００キロダルトンの分子量を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを包含する。さらに詳しくは、本発明のＤＮＡポリメラーゼはテルモトガ・ネアポリタナ（Ｔhermotoga neapolitana）（Ｔｎｅ）から単離される。本発明のＤＮＡポリメラーゼを単離するのに好ましいテルモトガ種は、アフリカ大陸の硫気孔泉から単離された（ウインドバーガー（Ｗindberger）ら、Ａrch.Ｍicrobiol.１５１、５０６〜５１２（１９８９））。本発明のＤＮＡポリメラーゼは非常に熱安定性で、界面活性剤とともにまたは界面活性剤なしで９０℃で６０分間加熱した後に５０％以上の活性を示す。それゆえ、本発明のＤＮＡポリメラーゼはＴａｑＤＮＡポリメラーゼよりも熱安定性である。本発明はまた、テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードする遺伝子のクローニングに関する。本発明によるＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ分子を宿主細胞に形質転換し、発現させて１００キロダルトンの分子量を有するＴｎｅＤＮＡポリメラーゼを生成させることができる。本発明のテルモトガＤＮＡポリメラーゼを発現させるために、原核細胞および真核細胞を含むいかなる宿主も用いることができる。好ましくは、原核細胞を用いて本発明のＤＮＡポリメラーゼを発現させる。本発明による好ましい原核宿主は大腸菌である。本発明によるＴｎｅＤＮＡポリメラーゼは、よく知られたＤＮＡシークエンシング（ジデオキシＤＮＡシークエンシング、プラスミドＤＮＡのサイクル（cy cle）ＤＮＡシークエンシングなど）およびＤＮＡ増幅反応に用いることができる。本発明はまた、変異体の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにも関する。さらに詳しくは、本発明の変異体ＤＮＡポリメラーゼはテルモトガ・ネアポリタナに由来し、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に減少もしくは欠失しているか、またはジデオキシヌクレオチドに対して非識別性である。本発明はまた、これら特性の１以上を有する変異体、および該変異体ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ酵素遺伝子を含有するＤＮＡ分子にも関する。これら変異体はまた、よく知られたＤＮＡシークエンシングおよびＤＮＡ増幅反応において有用である。図面の簡単な説明図１は、ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの９０℃における経時的な熱安定性を示す。テルモトガ・ネアポリタナ菌体からの粗製の抽出物をアッセイに用いた。図２は、クローニングしたＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する大腸菌宿主からの粗製の抽出物中のＤＮＡポリメラーゼ活性を示す。図３は、放射性ｄＡＴＰおよび［αＳ］ｄＡＴＰを取り込む能力について種々のＤＮＡポリメラーゼを比較したものである。ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼは［ αＳ］ｄＡＴＰの取り込みに関し、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼに比べて一層有効である。図４は、ｐＳｐｏｒｔ１およびｐＵＣ１９中のＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む適当なＤＮＡ断片の制限地図を示す。この図はまた、Ｏ−ヘリックス相同配列を含む領域をも示す。図５は、テルモトガ・ネアポリタナポリメラーゼ遺伝子のＯ−ヘリックス領域を含むカルボキシル末端部分のヌクレオチド配列、およびそれから導かれる３つのすべての読み取り枠でのアミノ酸配列を示す。図６Ａは、プラスミドｐＵＣ−Ｔｎｅ（３'→５'）およびｐＵＣ−ＴｎｅＦＹの構築を示す模式図である。図６Ｂは、プラスミドｐＴｒｃＴｎｅ３５およびｐＴｒｃＴｎｅＦＹの構築を示す模式図である。図７は、プラスミドｐＴｒｃＴｎｅ３５ＦＹおよびｐＴｒｃＴｎｅ５３５ＦＹの構築を示す模式図である。図８は、プラスミドｐＴＴＱＴｎｅ５ＦＹの構築を示す模式図である。好ましい態様の詳細な記載定義以下の記載において、組換えＤＮＡ法において用いられる術語が多数使用されている。明細書および請求の範囲に対する一層明確で一貫した理解を得るため（かかる術語によって示される範囲を含む）、下記定義を記載する。クローニングベクター：宿主細胞において自律的に複製でき、ベクターの本質的な生物学的機能を損なうことなく確定しうる仕方で切断しうる１または少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を有することを特徴とし、複製およびクローニングをもたらすためにその中にＤＮＡをスプライシングしうるプラスミド、コスミドまたはファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ分子。クローニングベクターにはまた、該クローニングベクターで形質転換された細胞の同定に使用するのに適したマーカーが含まれていてよい。マーカーは、たとえば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性である。発現ベクター：クローニングベクターと類似のベクターであるが、宿主中に形質転換した後に、その中にクローニングした遺伝子の発現を増幅しうるもの。クローニング遺伝子は、通常、プロモーター配列などのある種の制御配列の制御下に（すなわち、機能的に連結して）置かれる。組換え宿主：発現ベクター、クローニングベクターまたは他のＤＮＡ分子中の所望のクローニング遺伝子を含む原核性または真核性微生物。「組換え宿主」なる語はまた、宿主染色体またはゲノム上に所望の遺伝子を含むように遺伝的に操作した宿主細胞をも意味する。宿主：複製可能な発現ベクター、クローニングベクターまたは他のＤＮＡ分子のレシピエントである原核性または真核性微生物。該ＤＮＡ分子には、構造遺伝子、プロモーターおよび／または複製起点（これらに限られるものではない）が含まれていてよい。プロモーター：開始コドンの近傍に位置する、遺伝子の５'領域として一般に記載されるＤＮＡ配列。プロモーター領域では、隣接する遺伝子の転写が開始される。遺伝子：ポリペプチドまたはタンパク質の発現に必要な情報を含むＤＮＡ配列。遺伝子には、プロモーターおよび構造遺伝子並びにタンパク質の発現に関与する他の配列が含まれる。構造遺伝子：メッセンジャーＲＮＡに転写され、ついで特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸配列に翻訳されるＤＮＡ配列。機能的に連結：本明細書において、構造遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現の開始を制御するようにプロモーターが配置されていることをいう。発現：発現とは、遺伝子がポリペプチドを産生するプロセスをいう。発現には、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写および該ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が含まれる。実質的に純粋：本明細書において「実質的に純粋」とは、所望の精製タンパク質が、天然の所望のタンパク質には付随する細胞混入物を本質的に含まないことを意味する。混入する細胞成分としては、ホスファターゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼまたは所望でないＤＮＡポリメラーゼ酵素が挙げられるが、これらに限られるものではない。プライマー：本明細書において「プライマー」とは、ＤＮＡ分子の増幅または重合過程でヌクレオチドモノマーの共有結合により伸長される一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。鋳型：本明細書において「鋳型」とは、増幅、合成またはシークエンシングすべき二本鎖または一本鎖ＤＮＡ分子をいう。二本鎖ＤＮＡ分子の場合、これら分子を増幅、合成ないしシークエンシングする前に鎖を変性させて第一鎖および第二鎖を形成させる。ＤＮＡ鋳型の一部に相補的なプライマーを適当な条件下でハイブリダイズさせ、ついで、本発明のＤＮＡポリメラーゼは該鋳型またはその一部に相補的なＤＮＡ分子を合成することができる。本発明に従って新たに合成したＤＮＡ分子は、最初のＤＮＡ鋳型と長さが等しいかまたはそれより短い。新たに合成したＤＮＡ分子の合成または伸長の過程でミスマッチが導入されると、１または幾つかのミスマッチした塩基対が生成する。それゆえ、合成したＤＮＡ分子はＤＮＡ鋳型に正確に相補的である必要はない。取り込み：本明細書において「取り込み」なる語は、ＤＮＡ分子またはプライマーの一部となることをいう。増幅：本明細書において「増幅」とは、ＤＮＡポリメラーゼを用いてヌクレオチド配列のコピー数を増加させるインビトロの方法をいう。核酸増幅の結果、ＤＮＡ分子またはプライマー中にヌクレオチドが導入され、それによってＤＮＡ鋳型に相補的な新たなＤＮＡ分子が生成される。生成したＤＮＡ分子およびその鋳型は、さらにＤＮＡ分子を合成するための鋳型として用いることができる。本明細書において、一つの増幅反応は多くの回数のＤＮＡ複製からなる。ＤＮＡ増幅反応としては、たとえば、複製連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。一つのＰＣＲ反応は、ＤＮＡ分子の変性および合成の３０〜１００「サイクル」からなる。オリゴヌクレオチド：「オリゴヌクレオチド」とは、１のヌクレオチドのペントースの３'位と隣接するヌクレオチドのペントースの５'位との間のホスホジエステル結合により連結された、共有結合により連結されたヌクレオチドの配列からなる合成または天然の分子をいう。ヌクレオチド：本明細書において「ヌクレオチド」とは、塩基−糖−リン酸結合をいう。ヌクレオチドは、核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）のモノマー単位である。ヌクレオチドなる語には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはその誘導体などのデオキシリボヌクレオシド三リン酸が含まれる。かかる誘導体としては、たとえば、ｄｍ、［αＳ］ｄＡＴＰおよび７−デアザ−ｄＧＴＰが挙げられる。本明細書においてヌクレオチドなる語はまた、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびその誘導体も含まれる。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例としては、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰおよびｄｄＴＴＰが挙げられるが、これらに限られるものではない。本発明によれば、「ヌクレオチド」は標識されていないか、またはよく知られた技術により検出可能なように標識されていてよい。検出可能な標識としては、たとえば、放射性同位元素、蛍光標識、化学ルミネセンス標識、バイオルミネセンス標識および酵素標識が挙げられる。熱安定性：本明細書において「熱安定性」とは、ＤＮＡポリメラーゼが熱による不活化に対して耐性であることをいう。ＤＮＡポリメラーゼは、５'→３'の方向にプライマーを伸長することにより一本鎖ＤＮＡ鋳型に相補的なＤＮＡ分子を合成する。この中温菌ＤＮＡポリメラーゼの活性は熱処理により不活化される。たとえば、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ活性は、この酵素を９０℃の温度に３０分間暴露させることにより完全に不活化される。本発明において熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、中温菌ＤＮＡポリメラーゼに比べて熱不活化に対して一層耐性である。しかしながら、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは熱不活化に対して完全に耐性の酵素を意味するものではなく、それゆえ、熱処理によってＤＮＡポリメラーゼ活性はある程度減少する。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、一般に中温菌ＤＮＡポリメラーゼに比べて高い最適温度を有するであろう。ハイブリダイゼーション：「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズ」なる語は、２つの相補的な一本鎖核酸分子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）が対合して二本鎖分子を生成することをいう。本明細書において、塩基対が完全には相補的ではなくとも２つの核酸分子はハイブリダイズすることができる。従って、当該技術分野でよく知られた適当な条件を用いる限り、ミスマッチした塩基は２つの核酸分子のハイブリダイゼーションを妨げることはない。３'→５'エキソヌクレアーゼ活性：「３'→５'エキソヌクレアーゼ活性」とは、当該技術分野でよく知られた酵素活性である。この活性はしばしばＤＮＡポリメラーゼに付随し、ＤＮＡ複製の「校正」または補正機構に関与すると思われる。５'→３'エキソヌクレアーゼ活性：「５'→３'エキソヌクレアーゼ活性」もまた、当該技術分野でよく知られた酵素活性である。この活性は、しばしば、大腸菌ＰｏｌＩやＰｏｌIIIなどのＤＮＡポリメラーゼに付随する。本明細書において「３'→５'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に減少したＤＮＡポリメラーゼ」とは、（１）対応する変異していない野性型の酵素の３'→５' エキソヌクレアーゼ活性の約１０％未満、もしくは好ましくは約１％未満を有する変異ＤＮＡポリメラーゼ、または（２）約１単位／ｍｇタンパク質未満、もしくは好ましくは約０.１単位／ｍｇタンパク質の３'→５'エキソヌクレアーゼ比活性を有するＤＮＡポリメラーゼをいう。３'→５'エキソヌクレアーゼ活性の単位は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）により［³Ｈ］ｄＴＴＰでラムダ（Ｌambda）ＤＮＡのＨｈａＩ断片を３'末端標識し、「ＢＲＬ、１９８９カタログ＆レファレンスガイド（Ｃatalogue ＆Ｒeference Ｇuide）」、５頁の記載に従ってアッセイして、３７℃で６０分間に１０ナノモルの基質末端を可溶化する活性量として定義される。タンパク質の測定は、ブラッドフォード（Ｂradford）のＡnal.Ｂiochem.７２：２４８（１９７６）の方法により行う。比較としては、天然の野性型のＴ５−ＤＮＡＰまたはｐＴＴＱ１９ −Ｔ５−２によってコードされるＴ５−ＤＮＡＰは約１０単位／ｍｇタンパク質の比活性を有するが、一方、ｐＴＴＱ１９−Ｔ５−２（Ｅｘｏ^-）（米国特許第５,２７０,１７９号）によってコードされるＤＮＡポリメラーゼは約０.０００１単位／ｍｇタンパク質の比活性、すなわち非修飾酵素の比活性の０.００１％しか有せず、１０⁵倍の減少である。本明細書において「５'→３'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に減少したＤＮＡポリメラーゼ」とは、（１）対応する変異していない野性型の酵素の５'→３' エキソヌクレアーゼ活性の約１０％未満、もしくは好ましくは約１％未満を有する変異ＤＮＡポリメラーゼ、または（２）約１単位ｍｇタンパク質未満、もしくは好ましくは約０.１単位／ｍｇタンパク質の５'→３'エキソヌクレアーゼ比活性を有するＤＮＡポリメラーゼをいう。これら３'→５'エキソヌクレアーゼ活性および５'→３'エキソヌクレアーゼ活性の両活性は、シークエンシングゲル上で観察することができる。活性な５'→ ３'ヌクレアーゼ活性は、大きくなりつつあるプライマーからヌクレオチドを除去することによりシークエンシングゲル中に非特異的なラダー（ladders）を生成するであろう。３'→５'エキソヌクレアーゼ活性は、シークエンシングゲル中で放射標識したプライマーの分解を追跡することにより測定することができる。それゆえ、これら活性の相対量は、たとえば野性型と変異体のポリメラーゼを比較することにより、これらシークエンシングゲルの特性から決定することができる。Ａ．テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼのクローニングおよび発現：本発明のテルモトガＤＮＡポリメラーゼは、約１００キロダルトンの分子量を有するＤＮＡポリメラーゼを産生するテルモトガのいかなる株からも単離することができる。本発明のテルモトガＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を単離するのに好ましい株は、テルモトガ・ネアポリタナである。本発明のＤＮＡポリメラーゼを単離するのに最も好ましいテルモトガ・ネアポリタナはアフリカ大陸の硫気孔泉から単離され（ウィンドバーガーら、Ａrch.Ｍicrobiol.１５１：５０６〜５１２（１９８９））、ドイテェ・ザマルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルツーラン（Ｄeutsche Ｓammalung von Ｍicroorgan ismen und Ｚellkulturan）ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）（マシェローダーベーク、１ｂＤ−３３００ブラウンシュバイク、ドイツ連邦共和国）から受託番号５０６８で入手することができる。本発明のテルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子をクローニングするため、テルモトガ・ネアポリタナ菌体から得た該ポリメラーゼ遺伝子を含有する単離遺伝子を用い、ベクター中に組換えＤＮＡライブラリーを構築する。本発明の野性型または変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼをクローニングするため、当該技術分野でよく知られたいかなるベクターも用いることができる。しかしながら、使用するベクターは該組換えＤＮＡライブラリーで形質転換する宿主と適合するものでなければならない。プラスミドライブラリーを構築するための原核細胞ベクターとしては、たとえば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＵＣ−ベクター（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９など；モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８２）；およびサンブルックら、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル（第２版）コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９））などのような大腸菌中で増幅しうるものなどのプラスミドが挙げられる。バシラス属のプラスミドとしては、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＣ２１７などが挙げられる。かかるプラスミドはグリクザン（Ｇlyczan,Ｔ.）のザ・モレキュラー・バイオロジー・バシリ（Ｔhe Ｍolecular Ｂiology Ｂacilli）、アカデミックプレス、ヨーク（１９８２）、３０７〜３２９に開示されている。適当なストレプトマイセス属のプラスミドとしては、ｐＩＪ１０１（ケンダル（Ｋendall）ら、Ｊ.Ｂacteriol １６９：４１７７〜４１８３（１９８７））が挙げられる。シュードモナス属のプラスミドは、ジョン（Ｊohn）ら（Ｒad.Ｉnsec.ＤisO、８：６９３〜７０４（１９８６））およびイガキ（Ｉgaki）ら（Ｊpn.Ｊ.Ｂacteriol.３３：７２９〜７４２（１９７８））によって概説されている。ｐＣＰ１３（ダージンズ（Ｄarzins）およびチャクラバーバリー（Ｃhakrabarbary）、Ｊ.Ｂacter iol.１５９：９〜１８（１９８４））などの広範囲宿主プラスミドまたはコスミドも本発明において用いることができる。本発明の遺伝子をクローニングするのに好ましいベクターは原核細胞ベクターである。好ましくは、ｐＣＰ１３やｐＵＣベクターを用いて本発明の遺伝子をクローニングする。本発明の野性型または変異体ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をクローニングするのに好ましい宿主は原核宿主である。最も好ましい原核宿主は大腸菌である。しかしながら、本発明の野性型または変異体ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子はまた他の原核宿主中にクローニングすることもでき、その例としてはエシェリキア、バシラス、ストレプトマイセス、シュードモナス、サルモネラ、セラチア、およびプロテウスが挙げられるが、これらに限られるものではない。特に興味の持たれる細菌宿主としては大腸菌ＤＨ１０Ｂ株が挙げられ、これはライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド（ＬＴＩ）（ゲイザーズバーグ、メリーランド洲）から入手することができる。本発明の野性型または変異体ＤＮＡポリメラーゼのクローニングおよび発現のための真核宿主としては、酵母、真菌、および哺乳動物細胞が挙げられる。かかる真核細胞中での所望のＤＮＡポリメラーゼの発現には、真核プロモーターを含む真核制御領域を用いることが必要である。真核細胞中での本発明の野性型または変異体ＤＮＡポリメラーゼのクローニングおよび発現は、よく知られた真核ベクター系を用いてよく知られた技術により行うことができる。ＤＮＡライブラリーが特定のベクター中で構築されたら、適当な宿主をよく知られた技術により形質転換する。形質転換したコロニーをペトリ皿当たり約２００〜３００コロニーの密度でプレーティングする。ついで、形質転換した大腸菌コロニーをニトロセルロース膜に移すことにより熱安定なＤＮＡポリメラーゼの発現についてスクリーニングする。移した細胞をニトロセルロース上で増殖させた後（約１２時間）、細胞を標準法により溶解させ、ついで膜を９５℃にて５分間処理して内生の大腸菌酵素を不活化させる。使用した宿主およびクローニングすべきＤＮＡポリメラーゼの温度安定性に応じて、他の温度を用いて宿主ポリメラーゼを不活化することもできる。ついで、よく知られた方法を用いてＤＮＡポリメラーゼ活性の存在についてアッセイすることにより安定なＤＮＡポリメラーゼ活性を検出する。サグナー（Ｓagner）ら、Ｇene ９７：１１９〜１２３（１９９１）（参照のためその全体を本明細書中に引用する）。本発明のＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、上記サグナーらの方法を用いてクローニングすることができる。ＤＮＡポリメラーゼをコードする野性型遺伝子を含有する組換え宿主である大腸菌ＤＨ１０Ｂ（ｐＵＣ−Ｔｎｅ）は、パテント・カルチャー・コレクション（Ｐatent Ｃulture Ｃollection）、ノーザン・リージョナル・リサーチ・センター（Ｎorthern Ｒegional Ｒesearch Ｃenter）、ＵＳＤＡ、１８１５ノース・ユニバーシティー・ストリート、ペオリア、６１６０４、イリノイ州（米国）に受託番号ＮＲＲＬＢ−２１３３８として１９９４年９月３０日に寄託した。ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼが３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有しているなら、ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を変異させることによって、この活性を減少させ、実質的に減少させ、または除去することができる。かかる変異としては、点変異、フレームシフト変異、欠失および挿入が挙げられる。好ましくは、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性をコードしている領域を当該技術分野でよく知られた方法を用いて欠失させる（サンブルックら（１９８９）、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（第２版）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）。３'→５'エキソヌクレアーゼ活性の欠失は、３'→５'エキソヌクレアーゼドメイン内に部位特異的突然変異を誘発することにより行うことができる。上記文献参照。本発明の特定の態様において、ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼのＡｓｐ³²²をＡｌａ³²²に変化させて３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少させた。ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性は、ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を変異させることにより減少させまたは除去することができる。かかる変異としては、点変異、フレームシフト変異、欠失および挿入が挙げられる。好ましくは、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性をコードする遺伝子の領域を当該技術分野でよく知られた方法を用いて欠失させる。本発明の態様において、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性に付随するある保存されたアミノ酸を変異させることができる。これら保存されたアミノ酸の例としてはＧｌｙ³⁷が挙げられる。他の態様において、たとえばＴｎｅまたはＴｍａポリメラーゼの５ '→３'エキソヌクレアーゼの全ドメインを、タンパク質分解開裂によりまたは遺伝子操作により欠失させることができる。たとえば、唯一のＳｐｈＩ制限部位を用い、ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの２１９のアミノ末端アミノ酸をコードするヌクレオチドを欠くクローンを得ることができる。かかるクローンの例は、ｐＴＴＱＴｎｅ５３５ＦＹおよびｐＴＴＱＴｎｅ５ＦＹである。ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ変異体はまた、ジデオキシヌクレオチドなどのような天然に存在しないヌクレオチドに対して非識別性にすることができる。その例として、この特性を有する一つのＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ変異体は、図５において６７番目のアミノ酸においてＰｈｅがＴｙｒに置換されている。他の点変異、欠失および挿入などの種々のポリメラーゼのＯヘリックス内の他の変化も生成させることができる。Ｂ．テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの発現の促進本発明の野性型または変異体テルモトガＤＮＡポリメラーゼの発現を最適化するため、誘導性または構成的プロモーターがよく知られており、高レベルのポリメラーゼ構造遺伝子を組換え宿主中で発現させるために用いることができる。同様に、当該技術分野でよく知られている高コピー数のベクターを用いて高レベルの発現を達成することができる。誘導性の高コピー数を有するベクターはまた、組換え宿主中でのテルモトガＤＮＡの発現を促進するうえでも有用である。原核細胞（大腸菌、枯草菌、シュードモナスなど）中で所望の構造遺伝子を発現させるため、所望の構造遺伝子を機能的な原核プロモーターに機能的に連結させる必要がある。しかしながら、天然のテルモトガ・ネアポリタナプロモーターは原核宿主中で機能してポリメラーゼ遺伝子を発現させることができるかもしれない。それゆえ、天然のテルモトガプロモーターまたは他のプロモーターを用いてＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現させることができる。かかる他のプロモーターを用いて発現を促進することができ、構成的であるかまたは制御可能な（すなわち、誘導性または脱抑制性）プロモーターであってよい。構成的プロモーターの例としては、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、およびｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーターが挙げられる。誘導性原核プロモーターの例としては、バクテリオファージλの主要右および左プロモーター（Ｐ_LおよびＰ_R）、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｃＩ、ｇａｌ、ｔｒｃおよびｔａｃプロモーターが挙げられる。枯草菌プロモーターとしては、α−アミラーゼプロモーター（ウルマネン（Ｕlmanen）ら、Ｊ.Ｂacteriol.１６２：１７６〜１８２（１９８５））およびバシラスバクテリオファージプロモーター（グリクザン（Ｇlyczan,Ｔ.）、ザ・モレキュラー・バイオロジー・オブ・バシライ、アカデミックプレス、ニューヨーク（１９８２））が挙げられる。ストレプトマイセスのプロモーターはウォード（Ｗard）らのＭol.Ｇen.Ｇenet. ２０３：４６８４７８（１９８５）に記載されている。原核プロモーターはまた、グリック（Ｇlick）（Ｊ.Ｉnd.Ｍicrobiol.１：２７７〜２８２（１９８７））；セナチエンポ（Ｃenatiempo,Ｙ.）（Ｂiochimie ６８：５０５〜５１６（１９８６））；およびゴッテスマン（Ｇottesman）（Ａnn.Ｒev.Ｇenet.１８：４１５〜４４２（１９８４））によっても概説されている。原核細胞での発現にはまた、遺伝子をコードしている配列の上流にリボソーム結合部位が存在していることが必要である。かかるリボソーム結合部位は、たとえば、ゴールド（Ｇold ）らのＡnn.Ｒev.Ｍicrobiol.３５：３６５４０４（１９８１）に開示されている。真核細胞中でのＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの発現を促進するため、よく知られた真核プロモーターおよび宿主を用いることができる。しかしながら、好ましくは、ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの促進された発現は原核宿主中で行う。この酵素を過剰発現するのに好ましい原核宿主は大腸菌である。Ｃ．テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの単離および精製本発明の酵素（テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼであるＴｎｅおよびその変異体）は、クローニングした該ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有し発現する組換え宿主を発酵させることにより産生させるのが好ましい。しかしながら、本発明の野性型または変異体ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼは、本発明のポリメラーゼを産生するいかなるテルモトガ種からも単離することができる。Ｔｎｅポリメラーゼの断片もまた本発明に包含される。かかる断片としては、タンパク質加水分解断片およびポリメラーゼ活性を有する断片が挙げられる。テルモトガ・ネアポリタナまたはクローニングしたＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む宿主によって資化されうるいかなる栄養も培地に加えることができる。最適の培養条件は、使用した株および培地の組成に従ってケースバイケースで選択すべきである。発現すべき所望の遺伝子を含むベクターＤＮＡの維持を保証するため、抗生物質を培地に加えることもできる。テルモトガ・ネアポリタナの培養条件は、たとえば、フーバー（Ｈuber）らのＡrch.Ｍicrobiol.１４４：３２４〜３３３（１９８６）に記載されている。培地の調製はまた、ＤＳＭまたはＡＴＣＣカタログおよびサンブルックらのモレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（第２版）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）にも記載されている。本発明のＤＮＡポリメラーゼを産生するテルモトガ・ネアポリタナおよび組換え宿主細胞は、たとえば遠心分離により液体培地から分離することができる。一般に、回収した菌体を適当な緩衝液中に分散させ、ついで超音波処理または他のよく知られた方法により破砕して酵素を緩衝液により抽出させる。細胞の破片を超遠心分離または遠心分離により除去した後、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの標準タンパク質精製法によりＤＮＡポリメラーゼを精製することができる。精製過程でのＤＮＡポリメラーゼの存在を検出するためのアッセイは当該技術分野でよく知られており、通常の生化学的精製法に用いてこれら酵素の存在を決定することができる。Ｄ．テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの使用本発明の野性型および変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｎｅ）は、よく知られたＤＮＡシークエンシング、ＤＮＡ標識、およびＤＮＡ増幅反応に用いることができる。３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を欠くもしくは実質的に減少している、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠くもしくは実質的に減少している、またはＰｈｅ⁶⁷→Ｔｙｒ⁶⁷変異を有するＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ変異体は、本質的にＤＮＡシークエンシング、ＤＮＡ標識、およびＤＮＡ増幅反応に有用である。さらに、これら特性を２またはそれ以上有するＴｎｅポリメラーゼ変異体もまた、ＤＮＡシークエンシング、ＤＮＡ標識、またはＤＮＡ増幅反応に特に有用である。よく知られているように、シークエンシング反応（ジデオキシＤＮＡシークエンシングおよびプラスミドＤＮＡのサイクルＤＮＡシークエンシング）にはＤＮＡポリメラーゼを使用する必要がある。ジデオキシによるシークエンシングにはチェインターミネーション法が含まれ、これはＤＮＡポリメラーゼによる伸長のための特定のポリマー、塩基特異的な鎖停止剤、および最初のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定することができるように新たに合成された鎖停止されたＤＮＡ分子をサイズによって分離するためのポリアクリルアミドゲルを使用するものである。詳しくは、各反応が異なる塩基特異的な停止剤を含む４つの別個のＤＮＡ配列反応を用いることによりＤＮＡ分子の配列を決定する。たとえば、第一の反応にはＧ−特異的な停止剤が含まれ、第二の反応にはＴ−特異的な反応が含まれ、第三の反応にはＡ−特異的な反応が含まれ、第四の反応にはＣ−特異的な反応が含まれるであろう。好ましい停止剤ヌクレオチドとしては、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＣＴＰなどのジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）が挙げられる。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の類似体も用いることができ、当該技術分野でよく知られている。ＤＮＡ分子のシークエンシングを行う場合、ｄｄＮＴＰはデオキシリボース塩基の３'位のヒドロキシル残基を欠き、それゆえ、これらは大きくなりつつあるＤＮＡ鎖中にＤＮＡポリメラーゼによって組み込まれ得るが、該３'−ヒドロキシ残基の不存在によってホスホジエステル結合を生成することができず、その結果、ＤＮＡ分子の伸長が停止する。それゆえ、少量の一つのｄｄＮＴＰをシークエンシング反応混合物中に加えておくと、鎖の伸長と塩基特異的な停止との間で競合が起こり、配列決定しようとするＤＮＡ鋳型よりも長さの短い合成ＤＮＡ分子の集団が得られる。４つの別個の酵素反応において４つの異なるｄｄＮＴＰを用いることにより、最初のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定することができるように、合成ＤＮＡ分子の集団をサイズにより分離することができる。ジデオキシ−ヌクレオチドによるＤＮＡシークエンシングはよく知られており、サンブルックらのモレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）に記載されている。容易に認識されるであろうように、本発明のＴｎｅＤＮＡポリメラーゼは、かかるシークエンシング反応に用いることができる。よく知られているように、検出可能なように標識したヌクレオチドは一般にシークエンシング反応に含まれる。放射性同位元素、蛍光標識、化学ルミネセンス標識、バイオルミネセンス標識、および酵素標識を含む（これらに限られるものではない）いかなる数の標識ヌクレオチドもシークエンシング（または標識）反応に用いることができる。本発明の野性型および変異体ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼは、シークエンシング（または標識）反応の過程でαＳヌクレオチド（［α Ｓ］ｄＡＴＰ、［αＳ］ｄＴＴＰ、［αＳ］ｄＣＴＰおよび［αＳ］ｄＧＴＰ）を取り込むのに有用であることがわかった。たとえば、シークエンシング反応において普通に用いられる検出可能なように標識したヌクレオチドである［α³⁵Ｓ］ｄＡＴＰは、本発明のＴｎｅＤＮＡポリメラーゼを用いるとＴａｑＤＮＡポリメラーゼに比べて３倍以上効率的に取り込まれる。それゆえ、本発明の酵素は、［α³⁵Ｓ］ｄＡＴＰでＤＮＡ分子をシークエンシングまたは標識するのに特に適している。よく知られたＤＮＡ増幅法である複製連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を用いて標的ＤＮＡ鋳型を増幅させる方法である。かかるＰＣＲ反応においては、２つのプライマー、すなわち、増幅しようとするＤＮＡ分子の第一の鎖の３'末端（または３'末端の近傍）に相補的なプライマー、および増幅しようとするＤＮＡ分子の第二の鎖の３'（または３'末端の近傍）に相補的な第二のプライマーを、それぞれのＤＮＡ分子にハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下でＤＮＡポリメラーゼを作用させ、増幅しようとするＤＮＡ分子の第一の鎖に相補的な第三のＤＮＡ分子および第二の鎖に相補的な第四のＤＮＡ分子を合成させる。この合成の結果、２つの二本鎖ＤＮＡ分子が得られる。ついで、これら二本鎖ＤＮＡ分子をＤＮＡ鋳型として用い、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を提供することによってさらにＤＮＡ分子を合成させる。よく知られているように、最初の反応をサイクルすることによって（過剰のプライマーおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を用いて）さらに合成を行い、複数の変性および合成工程を行う。一般に、二本鎖ＤＮＡ分子を変性して一本鎖ＤＮＡ鋳型とすることは、高温にすることにより行う。本発明の野性型および変異体テルモトガＤＮＡポリメラーゼは熱安定性のＤＮＡポリメラーゼであり、それゆえＤＮＡ増幅反応の過程においてかかる熱サイクルを生き残るであろう。それゆえ、本発明の野性型および変異体ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼは、とりわけ増幅過程でのＤＮＡ分子の変性に高温を用いる場合にＰＣＲ反応に理想的に適している。Ｅ．キット本発明の野性型および変異体テルモトガ・ネアポリタナ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼは、キットの調製に適している。野性型または変異体ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼを含むキットは、キットの内容物に応じて、よく知られた方法によりＤＮＡ分子の検出可能な標識、ＤＮＡシークエンシング、またはＤＮＡ分子の増幅に用いることができる。かかるキットは、バイアル、試験管などの１または２以上の容器手段を密に詰め込んで収容すべく区画化された運搬手段を含んでいてよい。かかる容器手段はそれぞれ、ＤＮＡシークエンシング、ＤＮＡ標識、またはＤＮＡ増幅を行うのに必要な成分または成分の混合物を含有する。ＤＮＡをシークエンシングするためのキットは、幾つかの容器手段を含む。第一の容器には、たとえば、約１００キロダルトンの分子量を有するＴｎｅＤＮＡポリメラーゼまたはその変異体の実質的に純粋な試料が含まれていてよい。第二の容器手段は、ＤＮＡ鋳型に相補的なＤＮＡ分子を合成するのに必要な１または幾つかの種類のヌクレオチドを含んでいてよい。第三の容器手段は、１または幾つかの種類のジデオキシヌクレオチド三リン酸を含んでいてよい。上記容器手段に加え、１または幾つかのＤＮＡプライマーを入れた容器手段がさらにキットに含まれていてよい。ＤＮＡ増幅に用いるキットは、たとえば、実質的に純粋な変異体または野性型のＴｎｅＤＮＡポリメラーゼを含む第一の容器手段、および単一の種類のヌクレオチドまたはヌクレオチドの混合物を含む１または幾つかの別の容器手段を含むであろう。種々のプライマーは、ＤＮＡ増幅のためのキットに含まれていても含まれていなくてもよい。所望なら、本発明のキットはまた、ＤＮＡ分子の合成またはシークエンシング過程で用いる検出可能なように標識したヌクレオチドを含む容器手段を含んでいてもよい。かかるヌクレオチドを検出するには幾つかの標識の一つを用いることができる。標識の例としては、放射性同位元素、蛍光標識、化学ルミネセンス標識、バイオルミネセンス標識および酵素標識が挙げられるが、これらに限られるものではない。以上、本発明を一般的に記載したが、本発明は下記実施例を参照することによって一層容易に理解されるであろう。これら実施例は、特に断らない限り本発明を説明するために記載するものであって、本発明を限定することを意図するものではない。実施例１：細菌株および増殖条件テルモトガ・ネアポリタナＤＳＭＮｏ.５０６８を、ＤＳＭカタログに記載の嫌気条件下（培地に窒素を通しながら、レサズリン（resazurin）、Ｎａ₂Ｓ、および硫黄顆粒を添加する）、８５℃にて油浴中で１２〜２４時間増殖させた。ブロスをファットマン♯１濾紙で濾過することにより菌体を回収した。上澄み液を氷浴中に回収し、ついで８,０００ｒｐｍで２０分間冷凍遠心分離した。得られた菌体のペーストを全ゲノムＤＮＡを単離する前に−７０℃で貯蔵した。大腸菌株を２×ＬＢブロス基礎（レノックスＬブロス基礎：ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）培地中で増殖させた。形質転換した細胞をプレーティングする前にＳＯＣ（１リットル当たり２％トリプトン、０.５％酵母エキス、酵母１０ｍＭＮａＣｌ、２.５ＭＫＣｌ、２０ｍＭグルコース、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、および１０ｍＭＭｇＳＯ₄）中でインキュベートした。適当な場合は抗生物質として２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリンおよび１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを添加した。宿主株として大腸菌株ＤＨ１０Ｂ（ロロウ（Ｌorow）ら、Ｆocus １２：１９〜２０（１９９０））を用いた。コンピテントなＤＨ１０Ｂはライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド（ＬＴＩ）（ゲイザーズバーグ、メリーランド州）から入手することができる。実施例２：ＤＮＡの単離菌体を２.５ｍｌのＴＮＥ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ）中に懸濁し、１％ＳＤＳで３７℃で１０分間処理することにより、テルモトガ・ネアポリタナの染色体ＤＮＡを単離した。溶解した菌体を４℃にて一夜穏やかに揺することにより、ＤＮＡをフェノールで抽出した。翌日、溶解した菌体をクロロホルム：イソアミルアルコールで抽出した。得られた染色体ＤＮＡをＣｓＣｌ密度勾配中の遠心分離によりさらに精製した。密度勾配から単離した染色体ＤＮＡをイソプロパノールで３回抽出し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）および１ｍＭＥＤＴＡを含有する緩衝液に対して一夜透析した。実施例３：ゲノムライブラリーの構築実施例２で単離した染色体ＤＮＡを用い、プラスミドｐＣＰ１３中でゲノムライブラリーを構築した。簡単に説明すると、それぞれ１０μｇのテルモトガ・ネアポリタナ染色体ＤＮＡを入れた１０本の試験管を、０.０１〜１０単位のＳａｕ３Ａ１で３７℃にて１時間消化した。消化したＤＮＡの一部をアガロース（１ .２％）ゲル中で試験して消化の程度を決定した。消化が５０％未満の試料をプールし、エタノール沈殿し、ＴＥ中に溶解した。６.５μｇの部分的に消化した染色体ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化しウシ小腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化した１.５μｇのｐＣＰ１３コスミド中にライゲートした。部分的に消化したテルモトガＤＮＡとＢａｍＨＩ開裂したｐＣＰ１３とのライゲーションは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い、２２℃で１６時間かけて行った。ライゲーション後、約１μｇのライゲートしたＤＮＡをλ−パッケージング抽出物（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド、ゲイザーズバーグ、メリーランド州より入手）を用いてパッケージングした。ついで、ＤＨ１０Ｂ細胞（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド）を１００μｌのパッケージング物質で感染させた。感染させた細胞をテトラサイクリン含有プレート上にプレーティングした。プレート当たり約２００〜３００のテトラサイクリン耐性コロニーが得られるように系列希釈を行った。実施例４：テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼを発現するクローンのスクリーニング本発明のテルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の同定を、サンガーらのＧene ９７：１１９〜１２３（１９９１）（該文献を参照のためその全体を本明細書中に引用する）に記載の方法を用いてクローニングした。簡単に説明すると、実施例３の大腸菌のテトラサイクリン耐性コロニーをニトロセルロース膜に移し、１２時間増殖させた。ついで、菌体をクロロホルム：トルエン（１：１）のヒュームで２０分間溶解し、室温で１０分間乾燥させた。ついで、膜を９５℃で５分間処理して内生の大腸菌酵素を不活化させた。残留するＤＮＡポリメラーゼ活性を、膜を１５ｍｌのポリメラーゼ反応混合物（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.８）、１ｍＭＭｇＣｌ₂、３ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０μＭｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、および１５μＣｉの３,０００Ｃｉ／ミリモル［α³²Ｐ］ｄＡＴＰ）中に６５℃にて３０分間浸漬することにより検出した。オートラジオグラフィーを用い、テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼを発現する３つのコロニーを同定した。これら菌体を液体培地中で増殖させ、タンパク質抽出物を超音波処理により調製した。クローニングした熱安定性ポリメラーゼの存在は、９０℃で処理し、ついで酸性の不溶性ＤＮＡ中への放射性デオキシリボヌクレオシド三リン酸の取り込みにより確認した。ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼを発現するこれらクローンのうちの一つはｐＣＰ１３−３２と称するプラスミドを含有しており、さらに研究するために用いた。実施例５：ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼのサブクローニングＴｎｅポリメラーゼ遺伝子を発現するｐＣＰ１３−３２クローンは約２５ｋｂのテルモトガ・ネアポリタナＤＮＡを含有しているので、本発明者らはＴｎｅポリメラーゼ遺伝子の一層小さな断片のサブクローニングを試みた。大腸菌／ｐＣＰ１３−３２から精製したＴｎｅポリメラーゼの分子量は約１００ｋｄであった。それゆえ、２.５〜３.０ｋｂのＤＮＡ断片が完全長のポリメラーゼをコードするに充分であろう。実施例３と同様の第２回目のＳａｕ３Ａ部分消化をｐＣＰ１３−３２ＤＮＡを用いて行った。この場合、３.５ｋｂ領域をアガロースゲルから切り出し、ジーンクリーン（Ｇene Ｃlean）（ＢＩＯ１０１、ラジョラ、カリフォルニア）により精製し、ＢａｍＨＩで線状化しウシ腸ホスファターゼで脱リン酸したプラスミドｐＳｐｏｒｔ１（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド）中にライゲートした。ライゲーション後、ＤＨ１０Ｂを形質転換し、コロニーを実施例４の記載と同様にしてＤＮＡポリメラーゼ活性を試験した。ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼを発現する幾つかのコロニーを同定した。約３ｋｂの挿入物を含むこれらコロニーのうちの一つ（ｐＳｐｏｒｔ−Ｔｎｅ）をさらに特徴付けた。このＤＮＡ断片の制限地図を図４に示す。さらに、２.７ＫｂのＨｉｎｄIII−ＳｓｔＩ断片をｐＵＣ１９中にサブクローニングしてｐＵＣ１９−Ｔｎｅとした。大腸菌ｐＵＣ１９−ＴｎｅもまたＴｎｅＤＮＡポリメラーゼを産生した。上記Ｔｎｅポリメラーゼクローンを当該技術分野で知られた方法によりシークエンシングした。開始ＡＴＧの前の５'末端の得られたヌクレオチド配列を配列番号１に示す。Ｔｎｅポリメラーゼをコードする得られたヌクレオチド配列を配列番号２に示す。配列番号２が翻訳されると、配列番号２に示すヌクレオチド配列中のフレームシフトエラーのためにＴｎｅポリメラーゼの完全なアミノ酸配列を生成することができない。しかしながら、配列番号２の３つのすべての読み枠を翻訳し、これら配列を公知のポリメラーゼアミノ酸配列と比較し、ついでＴｎｅポリメラーゼ配列を一緒にスプライシングして配列番号３に示すアミノ酸配列を生成させることにより、Ｔｎｅポリメラーゼのアミノ酸配列を得ることができた。実施例６：大腸菌からのテルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの精製クローニングしたＴｎｅＤＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌細胞（ＤＨ１０Ｂ／ｐＳｐｏｒｔ−Ｔｎｅ）（１２ｇ）を、２０ｍｌの氷冷抽出緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７.４、８％グリセロール、５ｍＭメルカプトエタノール、１０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０.５ｍＭＰＭＳＦ）中で超音波処理（ヒート・システムズ・ウルトラソニックス（Ｈeat Ｓystems Ｕltrasonic s Ｉnc.）、モデル３７５ソニケーターを用い、９のセッティング、中位のチップにて３０秒のバーストを４回）することにより溶解させた。超音波処理した抽出物を８０℃で１５分間加熱し、ついで氷中で５分間冷却した。５０ｍＭＫＣｌおよびＰＥＩ（０.４％）を加えて核酸を除去した。抽出物を遠心分離にかけて清澄化した。硫酸アンモニウムを６０％で加え、ペレットを遠心分離により回収し、１０ｍｌのカラム緩衝液（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.４、８％グリセロール、０.５％ＥＤＴＡ、５ｍＭ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭＫＣｌ）中に再懸濁した。ブルー−セファロース（Ｂlue−Ｓepharose）（ファルマシア）カラム、または好ましくはトーソー（Ｔoso）ヘパリン（Ｔosohaas）カラムを７カラム容量のカラム緩衝液で洗浄し、１５カラム容量の１０ｍＭから２ＭＫＣｌの緩衝液Ａの勾配で溶出した。ポリメラーゼ活性を有するフラクションをプールした。フラクションを２０容量のカラム緩衝液に対して透析した。プールしたフラクションをトーソー６５０Ｑカラム（Ｔosohaas）に適用した。カラムをベースラインＯＤ₂₈₀に洗浄し、２５ｍＭトリス、ｐＨ７.４、８％グリセロール、０.５ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＫＣｌ、５ｍＭ β−メルカプトエタノールから同緩衝液プラス６５０ｍＭＫＣｌの直線状１０カラム容量勾配で溶出を行った。活性なプラクションをプールした。実施例７：精製したＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの特徴付け１．テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの分子量の決定レムリ（Ｌaemmli,Ｕ.Ｋ.）の方法（Ｎature（Ｌond.）２２７：６８０〜６８５（１９７０））により、１２.５％ＳＤＳゲル中での電気泳動によって１００キロダルトンの分子量が決定された。タンパク質の検出は、クマシーブリリアントブルーで染色することにより行った。１０ｋｄのタンパク質ラダー（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド）を標準として用いた。２．³Ｈ−ｄＡＴＰと比較した［α³⁵Ｓ］−ｄＡＴＰの導入の測定法［αＳ］ｄＡＴＰの取り込みを、最終容量５００μｌの反応混合物中で評価した。この反応混合物は７２℃で５分間プレインキュベートしてあり、［³Ｈ］ＴＴＰヌクレオチドカクテル（各１００μＭのＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および９０.３ｃｐｍ／ピコモルの［³Ｈ］ＴＴＰ）、ｄＡＴＰの唯一の源として［αＳ］ｄＡＴＰのみを含有するヌクレオチドカクテル（各１００μＭの［αＳ］ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、および２３５ｃｐｍ／ピコモルの［α³⁵Ｓ］ｄＡＴＰ）、または混合カクテル（５０ｐＭ［αＳ］ｄＡＴＰ、５０μＭｄＡＴＰ、１００μＭＴＴＰ、１００μＭｄＣＴＰ、１００μＭｄＧＴＰ、および１１８ｃｐｍ／ピコモルの［³⁵αＳ］ｄＡＴＰおよび４５.２ｃｐｍ／ピコモルの［³Ｈ］ＴＴＰ）のいずれかを含有していた。反応の開始は、０.３単位のテルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼまたはテルマス・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼを加えることにより行った。このインキュベート時間で２５μｌのアリコートを取り、氷冷ＥＤＴＡを最終濃度８３ｍＭで加えることにより反応停止させた。反応停止させた反応試料の２０μｌアリコートをＧＦ／Ｃフィルターにスポットした。取り込みの比率を比較し、テルマス・アクアティクスに対するテルモトガ・ネアポリタナの比として表した。テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼによる［α³⁵Ｓ］ｄＡＴＰの取り込みは、テルマス・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼよりも３倍高かった。実施例８：逆転写酵素活性 (Ａ)_n：(ｄＴ)_12-18は、ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性のアッセイに最も頻繁に用いられる合成鋳型プライマーである。これはレトロウイルス様の逆転写酵素に対しては特異的でないが、多くの原核および真核ＤＮＡポリメラーゼによりコピーされる（モダク（Ｍodak）およびマーカス（Ｍarcus）、Ｊ.Ｂiol.Ｃ hem.２５２：１１〜１９（１９７７）；ジェラルド（Ｇerard）ら、Ｂiochem.１３：１６３２〜１６４１（１９７４）；スパダリ（Ｓpadari）およびバイスバッハ（Ｗeissbach）、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２４９：５８０９〜５８１５（１９７４））。(Ａ)_n：(ｄＴ)_12-18は、Ｍｎ⁺⁺の存在下、細胞性の複製性ＤＮＡポリメラーゼによって特によくコピーされるが、Ｍｇ⁺⁺の存在下ではコピーの効率ははるかに下がる（モダクおよびマーカス、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２５２：１１〜１９（１９７７）；ジェラルドら、Ｂiochem.１３：１６３２〜１６４１（１９７４）；スパダリおよびバイスバッハ、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２４９：５８０９〜５８１５（１９７４））。対照的に、ほとんどの細胞性の複製性ＤＮＡポリメラーゼはＭｎ⁺⁺ かまたはＭｇ⁺⁺のいずれかの存在下で合成鋳型プライマー(Ｃ)_n：(ｄＧ)_12-18を効率的にコピーしないが、レトロウイルスの逆転写酵素はコピーする。それゆえ、合成鋳型プライマーを用いたＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性の試験においては、試験の厳格さは最も厳格でないものから最も厳格なものに次のように増加する：(Ａ)_n：(ｄＴ)_12-18(Ｍｎ⁺⁺）＜(Ａ)_n：(ｄＴ)_12-18(Ｍｇ⁺⁺）＜＜(Ｃ)_n ：(ｄＧ)_12-18(Ｍｎ⁺⁺)＜(Ｃ)_n：(ｄＧ)_12-18(Ｍｇ⁺⁺)。 (Ａ)_n：(ｄＴ)₂₀および(Ｃ)_n：(ｄＧ)_12-18の両者を用い、テルモトガ・ネアポリタナ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性をテルマス・アクアティクス（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼと比較した。(Ａ)_n：(ｄＴ)₂₀を含有する反応混合物（５０μｌ）には、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.４）、１００ μＭ(Ａ)_n、１００μＭ(ｄＴ)₂₀、および４０ｍＭＫＣｌ、６ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭジチオトレイトールおよび５００μＭ［³Ｈ］ｄＴＴＰ（８５ｃｐｍ／ピコモル）、かまたは１００ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｎＣｌ₂および２００μＭ［³Ｈ］ｄＴＴＰ（９２ｃｐｍ／ピコモル）のいずれかが含まれていた。(Ｃ)_n： (ｄＧ)_12-18を含有する反応混合物（５０μｌ）には、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.４）、６０μＭ(Ｃ)_n、２４μＭ(ｄＧ)_12-18、および５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭジチオトレイトールおよび１００μＭ［³Ｈ］ｄＧＴＰ（１３２ｃｐｍ／ピコモル）、かまたは１００ｍＭＫＣｌ、０.５ｍＭＭｎＣｌ₂および２００μＭ［³Ｈ］ｄＧＴＰ（１０７ｃｐｍ／ピコモル）のいずれかが含まれていた。反応混合物にはまた、２.５単位のＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（パーキン−エルマー（Ｐerkin−Ｅlmer））かまたは２.５単位のＴｎｅＤＮＡポリメラーゼのいずれかも含まれていた。インキュベーションは、４５ ℃で１０分間、ついで７５℃で２０分間行った。下記表は、Ｍｇ⁺⁺およびＭｎ⁺⁺の存在下、(Ａ)_n：(ｄＴ)₂₀および(Ｃ)_n：(ｄＧ)_12-18を用いたＴｎｅおよびＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの取り込みの相対レベルを決定した結果を示す。ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素に対して一層特異的な反応条件下、すなわちＭｇ⁺⁺を用いた(Ａ)_n：(ｄＴ)₂₀およびＭｎ⁺⁺またはＭｇ⁺⁺を用いた(Ｃ)_n：(ｄＧ)_12-18の存在下、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼに比べて一層良好な逆転写酵素であると思われる。(Ａ)_n：(ｄＴ)₂₀および(Ｃ)_n：(ｄＧ)_12-18を用いたＴｔｈおよびＴｎｅＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性実施例９：テルモトガ・ネアポリタナ３'→５'エキソヌクレアーゼ変異体の構築ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの一部のアミノ酸配列を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ７ＤＮＡポリメラーゼなどの他の公知のＤＮＡポリメラーゼのものと比較し、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性の領域、およびｄＮＴＰ結合ドメインをＤＮＡポリメラーゼ内に位置付けた。本発明者らは、種々のＤＮＡポリメラーゼ（ブランコ（Ｂla nco,Ｌ.）ら、Ｇene １１２：１３９〜１４４（１９９２）；ブレイスウエイト（Ｂraithwaite）およびイトー（Ｉto）、Ｎucleic Ａcids Ｒes.２１：７８７〜８０２（１９９３））のアミノ酸配列との比較に基づいて３'→５'エキソヌクレアーゼドメインの一つが下記のとおりであることを決定した。３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴｎｅＤＮＡポリメラーゼを調製する第一の工程として、ｐＳｐｏｒｔ−Ｔｎｅからの２ｋｂＳｐｈ断片をＭ１３ｍｐ１９（ＬＴＩ、ゲイザーズバーグ、メリーランド洲）中にクローニングした。この組換えクローンを大腸菌ＤＨ５αＦ'ＩＱ（ＬＴＩ、ゲイザーズバーグ、メリーランド州）中で選択した。正しい挿入を有するクローンの一つを用い、大腸菌ＤＨ５ａＦ'ＩＱから得られたファージ粒子を大腸菌ＣＪ２３６（バイオラド、カリフォルニア）に感染させることによりウラシル化された一本鎖ＤＨ５を単離した。オリゴヌクレオチドＧＡＣＧＴＴＴＣＡＡＧＣＧＣＴＡＧＧＧＣＡＡＡＡＧＡ（配列番号８）を用いて部位特異的突然変異を行った。この部位特異的突然変異により、Ａｓｐ³²²（上記＊で示す）がＡｌａ³²²に変換された。突然変異誘発後の変異体のスクリーニングを容易にするため、この突然変異誘発の一環としてＥｃｏ４７III制限部位も創出された。この突然変異誘発はバイオラドマニュアル（１９８７）に記載されたプロトコールに従って行ったが、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢ、クリーブランド、オハイオ州）の代わりにＴ７ＤＮＡポリメラーゼを用いた。変異体クローンの選択は、変異オリゴヌクレオチド中に創出されたＥｃｏ４７III制限部位についてスクリーニングすることにより行った。創出されたＥｃｏ４７III制限部位を有する変異体の一つを以下の研究に用いた。３'→５'エキソヌクレアーゼ変異を発現ベクター中に取り込むため、変異体ファージをＳｐｈＩおよびＨｉｎｄIIIで消化した。変異を含む２ｋｂ断片を単離した。この断片をｐＵＣ−Ｔｎｅ中にクローニングして野性型断片と置換した。図６Ａ参照。所望のクローンであるｐＵＣ−Ｔｎｅ（３'→５'）を単離した。変異配列の存在は、唯一のＥｃｏ４７III部位の存在によって確認した。ついで、このプラスミドをＳｓｔＩおよびＨｉｎｄIIIで消化した。全変異体ポリメラーゼ遺伝子（２.６ｋｂ）を精製し、ＳｓｔＩおよびＨｉｎｄIIIで消化したｐＴｒｃ９９発現ベクター（ファルマシア、スウェーデン）中にクローニングした。これらクローンをＤＨ１０Ｂ（ＬＴＩ、ゲイザーズバーグ、メリーランド州）中で選択した。得られたプラスミドをｐＴｒｃＴｎｅ３５と称した。図６Ｂ参照。このクローンは活性な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを産生した。実施例１０：フェニルアラニン→チロシン変異体上記で記載したように、ｄＮＴＰ結合ドメインを含むポリメラーゼ活性部位は、通常、ポリメラーゼのカルボキシル末端領域に存在する。Ｔｎｅポリメラーゼ遺伝子の予備的かつ部分的な配列は、ｄＮＴＰに接触し相互作用すると思われるアミノ酸が内部ＢａｍＨＩ部位から開始する６９４塩基内に存在することを示唆している。図４参照。この結論は、原型ポリメラーゼである大腸菌ポリメラーゼ１との相同性に基づいている。ポリスキー（Ｐolisky）ら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６５：１４５７９〜１４５９１（１９９０）参照。ポリメラーゼ遺伝子のカルボキシル末端部分の配列は図５に示してある。この配列に基づき、Ｏ−ヘリックス内のアミノ酸配列を種々のポリメラーゼについて比較することが可能である。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのフェニルアラニン残基（上記＊で示す）を置換することにより、ポリメラーゼがジデオキシヌクレオチドなどの非天然ヌクレオチドに対して非識別性になることが示された。１９９５年９月８日に出願されたデブ・ケイ・チャッタージーの「変異体ＤＮＡポリメラーゼおよびその使用」という発明の名称の特許出願第０８／５２５,０８７号を参照（参照のため本明細書中に引用する）。この変異は、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼがフェニルアラニンの代わりにチロシン残基を含有しており、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼがジデオキシヌクレオチドに対して非識別性であるとの仮定に基づいていた。大腸菌ＰｏｌＩの対応残基であるＰｈｅ⁷⁶²はヌクレオチドと直接相互作用するアミノ酸である。（ジョイス（Ｊoyce）およびスタイツ（Ｓteitz）、Ａnn.Ｒev.Ｂiochem.６３：７７７〜８２２（１９９４）；アステーク（Ａstake,Ｍ.Ｊ.）、Ｊ.Ｂiol. Ｃhem.２７０：１９４５〜１９５４（１９９５））。本発明者らは、ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの同様の変異体を調製した。図５の番号付けによりＴｎｅＤＮＡポリメラーゼのＰｈｅ⁶⁷をＴｙｒ⁶⁷に変化させるため、本発明者らはオリゴヌクレオチドＧＴＡＴＡＴＴＡＴＡＧＡＧＴＡＧＴＴＡＡＣＣＡＴＣＴＴＴＣＣＡ（配列番号１４）を用いて部位特異的突然変異誘発を行った。このオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発の一環として、変異体のスクリーニングを容易にするためにＨｐａＩ制限部位を創出した。この突然変異誘発にも実施例９と同じウラシル化一本鎖ＤＮＡおよび突然変異誘発法を用いた。突然変異誘発後、変異体をＨｐａＩ部位についてスクリーニングした。所望のＨｐａＩ部位を有する変異体を用いてさらに研究した。野性型ＳｐｈＩ−ＨｉｎｄIII断片を変異体ファージＤＮＡから得られた変異体断片と置換することにより、Ｐｈｅ⁶⁷→Ｔｙｒ⁶⁷変異をｐＵＣ−Ｔｎｅ中に取り込んだ。所望のクローンであるｐＵＣ−ＴｎｅＦＹの存在は、唯一のＨｐａＩ部位の存在によって確認された（図６Ａ参照）。全変異体ポリメラーゼ遺伝子を上記のようにＤＨ１０Ｂ中のｐＴｒｃ９９中にＳｓｔＩ−ＨｉｎｄIIIとしてサブクローニングした。得られたプラスミドをｐＴｒｃＴｎｅＦＹと称した（図６Ｂ）。このクローンは活性な熱安定性ポリメラーゼを産生した。実施例１１：３'→５'エキソヌクレアーゼおよびＰｈｅ⁶⁷→Ｔｙｒ⁶⁷二重変異体３'→５'エキソヌクレアーゼ変異およびＰｈｅ⁶⁷→Ｔｙｒ⁶⁷変異を同じ発現ベクターｐＴｒｃ９９中に導入するため、まず両変異をｐＵＣ−Ｔｎｅクローン中で再構築する必要があった。図７参照。ｐＵＣ−Ｔｎｅ（３'→５'）およびｐＵＣ−ＴｎｅＦＹの両者をＢａｍＨＩで消化した。消化したｐＵＣ−Ｔｎｅ（３ '→５'）を脱リン酸して以下のライゲーションで再環化するのを防いだ。得られた断片を１％アガロースゲル上で精製した。最も大きなＢａｍＨＩ断片（４.４ｋｂ）をｐＵＣ−Ｔｎｅ（３'→５'）消化したＤＮＡから精製し、ついでＰｈｅ⁶⁷ →Ｔｎｅ⁶⁷変異を含む最小のＢａｍＨＩ断片（０.８ｋｂ）を精製し、ライゲートしてｐＵＣ−Ｔｎｅ３５ＦＹを得た。同じプラスミド中の両変異の正しい方向および存在は、Ｅｃｏ４７III、ＨｐａＩ、およびＳｐｈＩ−ＨｉｎｄIII制限消化により確認した。図７参照。両変異を有する全ポリメラーゼをｐＴｒｃ９９中にＳｓｔＩ−ＨｉｎｄIII断片としてサブクローニングし、ＤＨ１０ＢにおいてｐＴｒｃＴｎｅ３５ＦＹを得た。このクローンは活性な熱安定性ポリメラーゼを産生した。実施例１２：３'→５'エキソヌクレアーゼ、５'→３'エキソヌクレアーゼ、およびＰｈｅ⁶⁷→Ｔｙｒ⁶⁷三重変異体知られたポリメラーゼの殆どにおいて、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性はポリメラーゼのアミノ末端領域に存在する（オリス（Ｏllis,Ｄ.Ｌ.）ら、Ｎature ３１３：７６２〜７６６、１９８５；フリーモント（Ｆreemont,Ｐ.Ｓ.）ら、Ｐ roteins １、６６〜７３；ジョイス（Ｊoyce,Ｃ.Ｍ.）、Ｃurr.Ｏpin.Ｓtruct. Ｂiol.１、１２３〜１２９、１９９１）。５'→３'エキソヌクレアーゼ活性に関与すると思われる幾つかの保存されたアミノ酸が存在する（ガットマン（Ｇutma n）およびミントン（Ｍinton）、Ｎucl.Ａcids Ｒes.２１、４４０６〜４４０７、１９９３）。上記参照。５'→３'エキソヌクレアーゼドメインは不可欠のものでないことが知られている。その最もよく知られた例が、大腸菌ＰｏｌＩのクレノー断片である。クレノー断片は、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠く天然のタンパク質加水分解断片である（ジョイスら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２５７、１９５８〜１９６４、１９９０）。５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴｎｅＤＮＡポリメラーゼについても等価な変異体を作成するため、本発明者らはＳｓｔＩ部位から６８０塩基の位置に存在する唯一のＳｐｈＩ部位の存在を調べた。ｐＵＣ−Ｔｎｅ３５ＦＹをＨｉｎｄIIIで消化し、クレノー断片で充填して平滑末端を生成させ、ＳｐｈＩで消化した。この１.９ｋｂ断片を発現ベクターｐＴＴＱ１９（スターク（Ｓtark,Ｍ.Ｊ.Ｒ.）ら、Ｇene ５１、２５５〜２６７、１９８７）中のＳｐｈＩ−ＳｍａＩ部位にクローニングし、ＤＨ１０Ｂ中に導入した。このクローニング法により、該ベクターからのメチオニンの開始コドンを有するインフレームのポリメラーゼクローンが得られた。得られたクローンはＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの２１９のアミノ末端アミノ酸を欠いている。このクローンをｐＴＴＱＴｎｅ５３５ＦＹと称する。このクローンは活性な熱安定性ポリメラーゼを産生した。シークエンシング反応においてプライマー（放射性同位元素で標識）分解の欠失によって示されるように、この変異体ポリメラーゼではエキソヌクレアーゼ活性は全く検出することができなかった。この特別の変異体ポリメラーゼは、ＤＮＡシークエンシングに非常に適している。実施例１３：５'→３'エキソヌクレアーゼ欠失およびＰｈｅ⁶⁷→Ｔｙｒ⁶⁷置換変異体ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼＰｈｅ⁶⁷→Ｔｙｒ⁶⁷変異体の５'→３'エキソヌクレアーゼ欠失変異体を生成するため、ｐＴＴＱＴｎｅ３５ＦＹの１.８ｋｂＳｐｈＩ−ＳｐｅＩ断片をｐＵＣ−ＴｎｅＦＹの同一断片で置換した。図８参照。得られたクローンｐＴＴＱＴｎｅ５ＦＹは活性な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを産生した。標識プライマーの分解速度によって測定されるように、この変異体は野性型のＴｎｅＤＮＡポリメラーゼと比較して制御された低いが検出しうる３' →５'エキソヌクレアーゼ活性を有する。ＬＴＩ（ゲイザーズバーグ、メリーランド州）から入手しうるＭ１３シークエンシングプライマーを、製造業者の記載に従い、［³²Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４キナーゼ（これもＬＴＩ、ゲイザーズバーグ、メリーランド州より入手可能）で標識した。反応混合物には、２０単位の野性型かまたは変異体のいずれかのＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ、０.２５ピコモルの標識プライマー、２０ｍＭのトリシン、ｐＨ８.７、８５ｍＭの酢酸カリウム、１.２ｍＭの酢酸マグネシウム、および８％グリセロールが含まれていた。７０ ℃でインキュベーションを行った。種々の時点で１０ｍｌのアリコートを５ｍｌのサイクルシークエンシング停止溶液に取り、６％ポリアクリルアミドシークエンシングゲル中で分離し、ついでオートラジオグラフィーにかけた。野性型のポリメラーゼは５〜１５分間でプライマーを分解したのに対し、変異体のポリメラーゼでは同じ量のプライマーを分解するのに６０分間以上かかった。予備的な結果は、この変異体ポリメラーゼは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとともに用いた場合に１２ｋｂ以上のゲノムＤＮＡを増幅しうることを示唆した。それゆえ、この変異体ポリメラーゼは大きな断片のＰＣＲに適している。実施例１４：変異体ポリメラーゼの精製変異体ポリメラーゼの精製は、１９９５年１月９日に出願した「テルモトガ・ネアポリタナのためのクローニングＤＮＡポリメラーゼ」という発明の名称の米国特許出願第０８／３７０,１９０号の記載および上記実施例６の記載に本質的に従い、わずかに変更を加えて行った。詳しくは、クローニングした変異体ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼを発現する菌体（５〜１０ｇ）を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.４；８％グリセロール；５ｍＭ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、および０.５ｍＭＰＭＳＦを含む超音波処理緩衝液中、ヒート・システムズ・ウルトラソニック、モデル３７５機械を用いて超音波処理することにより溶解した。この超音波処理試料を７５℃で１５分間加熱した。熱処理後、２００ｍＭＮａＣｌおよび０.４％ＰＥＩを加えて核酸を除去した。この抽出物を遠心分離にかけて清澄化した。硫酸アンモニウムを４８％にて加え、ペレットを２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.４；８％グリセロール、０. ５％ＥＤＴＡ；５ｍＭ２−メルカプトエタノール；１０ｍＭＫＣｌからなるカラム緩衝液中に再懸濁し、ヘパリンアガロースカラムに負荷した。カラムを負荷緩衝液を用いて１０カラム容量で洗浄し、１０ｍＭ〜１ＭＫＣｌの１０カラム容量緩衝液の勾配で溶出した。ポリメラーゼ活性を有するフラクションをプールし、ｐＨを７.８に調節した上記カラム緩衝液中に透析した。透析したフラクションのプールをモノＱカラムに負荷した。カラムを洗浄し、上記ヘパリンカラムと同様にして溶出した。活性なフラクションをプールし、ユニットアッセイを行った。ユニットアッセイ反応混合物は、２５ｍＭＴＡＰＳｐＨ９.３、２ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＤＴＴ、０.２ｍＭｄＮＴＰ、５００μｇ／ｍｌＤＮアーゼＩ処理サケ精子ＤＮＡ、２１ｍＣｉ／ｍｌ［αＰ³²］ｄＣＴＰおよび種々の量のポリメラーゼを最終容量５０ｍｌで含有していた。７０℃で１０分間インキュベートした後、１０ｍｌの０.５ＭＥＤＴＡを試験管に加えた。４０ｍｌの反応混合物を用い、ＴＣＡ沈殿可能なカウントをＧＦ／Ｃフィルター中で測定した。実施例１５：変異体ポリメラーゼを用いたＤＮＡシークエンシング野性型ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼおよび上記３種の変異体、ＴｎｅＦＹ、Ｔｎｅ３５ＦＹおよびＴｎｅ５３５ＦＹのそれぞれを用い、Ｐ³²末端標識したプライマーを用いたサイクルシークエンシング反応を調製した。これら４種のポリメラーゼはいずれもシークエンシングラダーを生成した。ＴｎｅＦＹ変異体は、Ｔａｑサイクルシークエンシング反応条件を用いた場合に９塩基シークエンシングラダーしか生成しなかった。ジデオキシヌクレオチドを１００の因子で希釈すると、約２００塩基にラダーが拡張された。それゆえ、ＴｎｅＦＴポリメラーゼにおけるＦ→Ｙ変異により、ジデオキシヌクレオチドの取り込み頻度が野性型ポリメラーゼに比べてはるかに高くなった。Ｔｎｅ３５ＦＹ変異体は同様のジデオキシヌクレオチドの取り込み活性を示した。この場合、配列は４００塩基を越えて拡張し、過剰のＰ³²末端標識Ｍ１３／ｐＵＣ正２３−塩基シークエンシングプライマーバンドがラダー中の２３−塩基位に残った。２３−塩基プライマーバンドが持続したことにより、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性が有意に減少したことが確認された。Ｔｎｅ５３５ＦＹ変異体は、シグナル強度が少なくとも５倍増加した他はＴｎｅ３５ＦＹ変異体と同様の挙動を示した。バックグラウンドは非常に低く、相対的なバンド強度は極めて均等であり、配列に依存した強度の変異のパターンは存在しないことを示していた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者チャッタージー，デブ・ケイアメリカ合衆国20878メリーランド、エヌ・ポトマック、フォレスト・リッジ・コート６番

Claims

【特許請求の範囲】１．約１００キロダルトンの分子量を有する実質的に純粋なテルモトガ・ネアポリタナ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、またはその断片。２．テルモトガ・ネアポリタナから単離したものである請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。３．テルモトガ・ネアポリタナＤＳＭ５０６８から単離したものである請求項２に記載のＤＮＡポリメラーゼ。４．約１００キロダルトンの分子量を有するＴｎｅＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含む単離ＤＮＡ分子。５．３'→５'エキソ活性が減少するように該遺伝子を修飾してある請求項４に記載の単離ＤＮＡ分子。６．該遺伝子のプロモーターが誘導性プロモーターである請求項４に記載の単離ＤＮＡ分子。７．該誘導性プロモーターが、λ−Ｐ_Lプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、およびｔｒｃプロモーターよりなる群から選ばれたものである、請求項６に記載の単離ＤＮＡ分子。８．１００キロダルトンの分子量を有するＴｎｅＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含む組換え宿主。９．該遺伝子がテルモトガ・ネアポリタナから得られたものである請求項８に記載の組換え宿主。１０．該遺伝子がテルモトガ・ネアポリタナＤＳＭ５０６８から得られたものである請求項９に記載の組換え宿主。１１．該宿主が原核細胞である請求項８に記載の組換え宿主。１２．該宿主が大腸菌である請求項１１に記載の組換え宿主。１３．約１００キロダルトンの分子量を有するＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの製造方法であって、（ａ）該ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含む細胞性宿主を培養し、（ｂ）該遺伝子を発現させ、ついで（ｃ）該ＤＮＡポリメラーゼを該宿主から単離することを特徴とする方法。１４．該宿主が真核細胞性宿主である請求項１３に記載の方法。１５．該宿主が原核細胞性宿主である請求項１３に記載の方法。１６．該原核細胞宿主が大腸菌である請求項１５に記載の方法。１７．（ａ）第一のＤＮＡ分子にプライマーをハイブリダイズさせ、ついで（ｂ）工程（ａ）の該ＤＮＡ分子を、１または２以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸および約１００キロダルトンの分子量を有するＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの存在下、該第一のＤＮＡ分子の全体または一部に相補的な第二のＤＮＡ分子を合成するのに充分な条件下でインキュベートすることを特徴とする二本鎖ＤＮＡ分子の合成方法。１８．該ＤＮＡポリメラーゼがテルモトガ・ネアポリタナから単離されたものである請求項１７に記載の方法。１９．該ＤＮＡポリメラーゼがテルモトガ・ネアポリタナＤＳＭ５０６８から単離されたものである請求項１８に記載の方法。２０．該ＤＮＡポリメラーゼが該ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を発現する組換え宿主から単離されたものである請求項１７に記載の方法。２１．該宿主が真核細胞性宿主である請求項２０に記載の方法。２２．該宿主が原核細胞性宿主である請求項２０に記載の方法。２３．該原核細胞宿主が大腸菌である請求項２２に記載の方法。２４．該デオキシリボヌクレオシド三リン酸が、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＩＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、ｄｄＴＴＰ、［αＳ］ｄＡＴＰ、［αＳ］ＴＴＰ、［αＳ］ｄＧＴＰ、および［αＳ］ｄＣＴＰよりなる群から選ばれたものである請求項１７に記載の方法。２５．該デオキシリボヌクレオシド三リン酸の１または２以上が検出可能なように標識されている請求項２４に記載の方法。２６．該検出可能な標識が、放射性同位元素、蛍光標識、化学ルミネセンス標識、バイオルミネセンス標識、および酵素標識よりなる群から選ばれたものである請求項２５に記載の方法。２７．（ａ）第一のＤＮＡ分子にプライマーをハイブリダイズさせ、（ｂ）工程（ａ）の該ＤＮＡ分子を、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、約１００キロダルトンの分子量を有するＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ、および停止剤ヌクレオチドと接触させ、（ｃ）該第一のＤＮＡ分子に相補的なＤＮＡ分子のランダムな集団を合成するに充分な条件下で工程（ｂ）の混合物をインキュベートし、その際、該合成したＤＮＡ分子は該第一のＤＮＡ分子よりも長さが短く、該合成したＤＮＡ分子はその５'末端に停止剤ヌクレオチドを含み、ついで（ｄ）該第一のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定できるように該合成したＤＮＡ分子をサイズにより分離することを特徴とする、ＤＮＡ分子のシークエンシング方法。２８．該停止剤ヌクレオチドがｄｄＴＴＰである請求項２７に記載の方法。２９．該停止剤ヌクレオチドがｄｄＡＴＰである請求項２７に記載の方法。３０．該停止剤ヌクレオチドがｄｄＧＴＰである請求項２７に記載の方法。３１．該停止剤ヌクレオチドがｄｄＣＴＰである請求項２７に記載の方法。３２．該ＤＮＡポリメラーゼがテルモトガ・ネアポリタナから単離されたものである請求項２７に記載の方法。３３．該ＤＮＡポリメラーゼがテルモトガ・ネアポリタナＤＳＭ５０６８から単離されたものである請求項３２に記載の方法。３４．該ＤＮＡポリメラーゼが該ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を発現する組換え宿主から単離されたものである請求項２７に記載の方法。３５．該デオキシリボヌクレオシド三リン酸の１または２以上が検出可能なように標識されている請求項２７に記載の方法。３６．該標識したデオキシリボヌクレオシド三リン酸が［α³⁵Ｓ］ｄＡＴＰである請求項３５に記載の方法。３７．二本鎖ＤＮＡ分子の増幅方法であって、（ａ）第一のプライマーおよび第二のプライマーを用意し、その際、該第一のプライマーは該ＤＮＡ分子の第一の鎖の３'−末端またはその近傍の配列に相補的であり、該第二のプライマーは該ＤＮＡ分子の第二の鎖の３'−末端またはその近傍の配列に相補的であり、（ｂ）約１００キロダルトンの分子量を有するＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの存在下、該第一の鎖に相補的な第三のＤＮＡ分子および該第二の分子に相補的な第四のＤＮＡ分子が合成されるような条件下で、該第一のプライマーを該第一の鎖に、該第二のプライマーを該第二の鎖にハイブリダイズさせ、（ｃ）該第一の鎖と該第三の鎖、および該第二の鎖と第四の鎖を熱変性させ、ついで（ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）を１回またはそれ以上繰り返すことを特徴とする方法。３８．該ＤＮＡポリメラーゼがテルモトガ・ネアポリタナから単離されたものである請求項３７に記載の方法。３９．該ＤＮＡポリメラーゼがテルモトガ・ネアポリタナＤＳＭ５０６８から単離されたものである請求項３８に記載の方法。４０．該ＤＮＡポリメラーゼが該ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を発現する組換え宿主から単離されたものである請求項３７に記載の方法。４１．（ａ）約１００キロダルトンの分子量を有するＴｎｅＤＮＡポリメラーゼを含む第一の容器手段、（ｂ）１または２以上のジデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む第二の容器手段、および（ｃ）１または２以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む第三の容器手段からなることを特徴とするＤＮＡ分子のシークエンシング用キット。４２．該ＤＮＡポリメラーゼがテルモトガ・ネアポリタナから単離されたものである請求項４１に記載のキット。４３．該ＤＮＡポリメラーゼがテルモトガ・ネアポリタナＤＳＭ５０６８から単離されたものである請求項４２に記載のキット。４４．該ＤＮＡポリメラーゼが該ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を発現する組換え宿主から単離されたものである請求項４１に記載のキット。４５．（ａ）約１００キロダルトンの分子量を有するＴｎｅＤＮＡポリメラーゼを含む第一の容器手段、および（ｂ）１または２以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む第二の容器手段からなることを特徴とするＤＮＡ分子の増幅用キット。４６．該ＤＮＡポリメラーゼがテルモトガ・ネアポリタナから単離されたものである請求項４５に記載のキット。４７．該ＤＮＡポリメラーゼがテルモトガ・ネアポリタナＤＳＭ５０６８から単離されたものである請求項４６に記載のキット。４８．該ＤＮＡポリメラーゼが該ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を発現する組換え宿主から単離されたものである請求項４５に記載のキット。４９．（１）テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少または除去する第一の変異、（２）該ＤＮＡポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少または除去する第二の変異、および（３）ジデオキシリボヌクレオチドに対して非識別性にする該ＤＮＡポリメラーゼのＯ−ヘリックス中の第三の変異よりなる群から選ばれた少なくとも一つの変異を有する変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼ、またはその断片。５０．該第三の変異がＰｈｅ⁶⁷→Ｔｙｒ⁶⁷置換である請求項４９に記載の変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼ。５１．該第一の変異がＡｓｐ³²³→Ａｌａ³²²置換である請求項４９に記載の変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼ。５２．Ｐｈｅ⁶⁷→Ｔｙｒ⁶⁷置換およびＡｓｐ³²²→Ａｌａ³²²置換の両者を有する請求項４９に記載の変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼ。５３．Ｎ−末端５'→３'エキソヌクレアーゼドメインを欠く請求項４９に記載の変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼ。５４．テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの２１９のＮ−末端アミノ酸を欠く請求項５３に記載の変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼ。５５．（１）テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少または除去する第一の変異、（２）該ＤＮＡポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少または除去する第二の変異、および（３）ジデオキシリボヌクレオチドに対して非識別性にする該ＤＮＡポリメラーゼのＯ−ヘリックス中の第三の変異よりなる群から選ばれた少なくとも一つの変異を有する変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼまたはその断片をコードするＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子。５６．ｐＴｒｃＴｎｅ３５、ｐＴｒｃＴｎｅＦＹ、ｐＴｒｃＴｎｅ３５ＦＹ、およびｐＴＴＱＴｎｅ５３５ＦＹよりなる群から選ばれる、請求項５５に記載の単離ＤＮＡ分子。５７．さらに発現制御要素を含む請求項５５に記載の単離ＤＮＡ分子。５８．該発現制御要素が、λＰ_Lプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、およびｔｒｃプロモーターよりなる群から選ばれた誘導性プロモーターを含む請求項５７に記載の単離ＤＮＡ分子。５９．（１）テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少または除去する第一の変異、（２）該ＤＮＡポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少または除去する第二の変異、および（３）ジデオキシリボヌクレオチドに対して非識別性にする該ＤＮＡポリメラーゼのＯ−ヘリックス中の第三の変異よりなる群から選ばれた少なくとも一つの変異を有する変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼまたはその断片をコードするＤＮＡ配列を含む組換え宿主。６０．ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの製造方法であって、（ａ）（１）テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少または除去する第一の変異、（２）該ＤＮＡポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少または除去する第二の変異、および（３）ジデオキシリボヌクレオチドに対して非識別性にする該ＤＮＡポリメラーゼのＯ−ヘリックス中の第三の変異よりなる群から選ばれた少なくとも一つの変異を有する変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼまたはその断片をコードする遺伝子を含む細胞性宿主を培養し、（ｂ）該遺伝子を発現させ、ついで（ｃ）該変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼを該宿主から単離することを特徴とする方法。６１．該宿主が大腸菌である請求項６０に記載のテルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの製造方法。６２．（ａ）第一のＤＮＡ分子にプライマーをハイブリダイズさせ、ついで（ｂ）工程（ａ）の該ＤＮＡ分子を、１または２以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸および変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの存在下、該第一のＤＮＡ分子の全体または一部に相補的な第二のＤＮＡ分子を合成するに充分な条件下でインキュベートし、その際、該変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼは、（１）テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少または除去する第一の変異、（２）該ＤＮＡポリメラーゼの５'→ ３'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少または除去する第二の変異、および（３）ジデオキシリボヌクレオチドに対して非識別性にする該ＤＮＡポリメラーゼのＯ−ヘリックス中の第三の変異よりなる群から選ばれた少なくとも一つの変異を有することを特徴とする、二本鎖ＤＮＡ分子の合成方法。６３．該デオキシリボヌクレオシド三リン酸が、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＩＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、ｄｄＴＴＰ、［αＳ］ｄＡＴＰ、［αＳ］ＴＴＰ、［αＳ］ｄＧＴＰ、および［αＳ］ｄＣＴＰよりなる群から選ばれたものである請求項６２に記載の二本鎖ＤＮＡ分子の合成方法。６４．１または２以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸が検出可能なように標識されている請求項６３に記載の二本鎖ＤＮＡ分子の合成方法。６５．該標識が、放射性同位元素、蛍光標識、化学ルミネセンス標識、バイオルミネセンス標識、および酵素標識よりなる群から選ばれたものである請求項６４に記載の二本鎖ＤＮＡ分子の合成方法。６６．（ａ）第一のＤＮＡ分子にプライマーをハイブリダイズさせ、（ｂ）工程（ａ）の該ＤＮＡ分子を、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼ、および停止剤ヌクレオチドと接触させ、（ｃ）工程（ｂ）の混合物を、該第一のＤＮＡ分子に相補的なＤＮＡ分子のランダムな集団を合成するのに充分な条件下でインキュベートし、その際、該合成されたＤＮＡ分子は該第一のＤＮＡ分子よりも長さが短く、該合成されたＤＮＡ分子はその５'末端に停止剤ヌクレオチドを含み、ついで（ｄ）該第一のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定することができるように該合成されたＤＮＡ分子をサイズによって分離し、その際、該変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼは、（１）テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少または除去する第一の変異、（２）該ＤＮＡポリメラーゼの５'→ ３'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少または除去する第二の変異、および（３）ジデオキシリボヌクレオチドに対して非識別性にする該ＤＮＡポリメラーゼのＯ−ヘリックス中の第三の変異よりなる群から選ばれた少なくとも一つの変異を有する、ことを特徴とするＤＮＡ分子のシークエンシング方法。６７．該停止剤ヌクレオチドが、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＣＴＰよりなる群から選ばれたものである請求項６６に記載のＤＮＡ分子のシークエンシング方法。６８．二本鎖ＤＮＡ分子の増幅方法であって、（ａ）第一のプライマーおよび第二のプライマーを用意し、その際、該第一のプライマーは該ＤＮＡ分子の第一の鎖の３'−末端またはその近傍の配列に相補的であり、該第二のプライマーは該ＤＮＡ分子の第二の鎖の３'−末端またはその近傍の配列に相補的であり、（ｂ）テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの存在下、該第一の鎖に相補的な第三のＤＮＡ分子および該第二の分子に相補的な第四のＤＮＡ分子が合成されるような条件下で、該第一のプライマーを該第一の鎖に、該第二のプライマーを該第二の鎖にハイブリダイズさせ、（ｃ）該第一の鎖と該第二の鎖、および該第二の鎖と第四の鎖を熱変性させ、ついで（ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）を１回またはそれ以上繰り返し、その際、該変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼは、（１）テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少または除去する第一の変異、（２）該ＤＮＡポリメラーゼの５'→ ３'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少または除去する第二の変異、および（３）ジデオキシリボヌクレオチドに対して非識別性にする該ＤＮＡポリメラーゼのＯ−ヘリックス中の第三の変異よりなる群から選ばれた少なくとも一つの変異を有する、ことを特徴とする方法。６９．（ａ）変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼを含む第一の容器手段、（ｂ）１または２以上のジデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む第二の容器手段、および（ｃ）１または２以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む第三の容器手段からなり、その際、該変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼは、（１）テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少または除去する第一の変異、（２）該ＤＮＡポリメラーゼの５'→ ３'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少または除去する第二の変異、および（３）ジデオキシリボヌクレオチドに対して非識別性にする該ＤＮＡポリメラーゼのＯ−ヘリックス中の第三の変異よりなる群から選ばれた少なくとも一つの変異を有する、ことを特徴とするＤＮＡ分子のシークエンシング用キット。７０．（ａ）変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼを含む第一の容器手段、および（ｂ）１または２以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む第二の容器手段からなり、その際、該変異体テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼは、（１）テルモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少または除去する第一の変異、（２）該ＤＮＡポリメラーゼの５'→ ３'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少または除去する第二の変異、および（３）ジデオキシリボヌクレオチドに対して非識別性にする該ＤＮＡポリメラーゼのＯ−ヘリックス中の第三の変異よりなる群から選ばれた少なくとも一つの変異を有する、ことを特徴とするＤＮＡ分子の増幅用キット。