CN109797199A - 使用纳米孔的高速分子感测 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用纳米孔的高速分子感测。描述使用纳米孔来捕获和确定分子的身份的方法和设备。所述分子可使用大量的纳米孔(例如，在1小时内读取180百万个分子的132,000个纳米孔)以平行方式快速地进行计数、分选和/或分箱。分子的这种快速捕获和读取可用于捕获探针分子或已经产生以代表最初的难以检测的分子或最初分子的部分的其它分子。可发生样品分子或样品分子的代用品的精确计数。在一些情况下，所述设备和方法捕获特定分子或分子的代用品并且保持于所述纳米孔中并且接着将其喷射于洁净溶液中以类似于流式细胞仪执行捕获、分选和分箱功能。

Description

使用纳米孔的高速分子感测
本申请是国际申请日为2014年10月23日的国际申请PCT/US2014/061852进入中国、申请号为201480056841.2的题为“使用纳米孔的高速分子感测”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年10月23日提交的美国临时申请号61/894,577的权益，该申请以引用的方式整体并入本文。
技术领域和背景技术
基因组分析中的一些应用需要拷贝数变化的检测。例如，产前筛查可确定染色体13、19和21的某些部分是否在胎儿自由浮动脱氧核糖核酸(DNA)中复制或缺失。实现此举的一种方式是针对选择染色体上的具体区域富集完整基因组样品(例如，经由PCR)。然而，PCR可以数种不同方式在产物中引入偏差或误差，包括酶的速率之间的不一致或引物对特定位点的结合亲和力之间的差异。
发明内容
本文描述使用纳米孔来捕获和确定分子的身份的方法、设备和系统。所述分子可使用大量的纳米孔(例如，在1小时内读取180百万个分子的132,000个纳米孔)以平行方式快速地进行计数、分选和/或分箱。分子的这种快速捕获和读取可用于捕获探针分子或已经产生以代表最初的难以检测的分子或最初分子的部分的其它分子。这可用于例如检测核酸(例如DNA)多态现象，如拷贝数变化。可发生样品分子或样品分子的代用品的精确计数。本文所述的方法和设备可尤其替换流式细胞仪和其它计数仪器(例如，当相对于流式细胞仪提供增加的精确度和通量时)。在一些情况下，所述设备和方法捕获特定分子或分子的代用品并且保持于所述纳米孔中并且接着将其喷射于洁净溶液中以类似于流式细胞仪执行捕获、分选和分箱功能。
一方面，本公开提供一种用于分子计数和/或分选的方法，所述方法包括：(a)提供纳米孔的阵列，其中所述阵列的个别纳米孔可通过邻近感测电极单独寻址；(b)提供多个各自包含核苷酸的标记物，其中所述核苷酸中的至少两种与核酸样品杂交，并且其中所述标记物能够由所述个别纳米孔捕获并且使用所述感测电极鉴别；以及(c)用所述纳米孔的阵列以每秒每个纳米孔至少约1个标记物的速率捕获并且鉴别所述标记物。
在一些实施方案中，所述感测电极以法拉第模式操作。
在一些实施方案中，所述感测电极以非法拉第模式操作。
在一些实施方案中，所述核酸样品来源于患者。
另一方面，本公开提供一种用于分子计数和/或分选的方法，所述方法包括：(a)提供纳米孔的阵列，其中所述阵列的个别纳米孔可通过以非法拉第模式操作的邻近感测电极单独寻址；(b)提供多个能够由所述个别纳米孔捕获并且使用所述感测电极鉴别的标记物；以及(c)用所述纳米孔的阵列以每秒每个纳米孔至少约1个标记物的速率捕获并且鉴别所述标记物。
在一些实施方案中，所述标记物以每秒每个纳米孔至少约四个标记物的速率被捕获并且鉴别。
在一些实施方案中，所述多个标记物包含至少四种不同标记物。
在一些实施方案中，所述标记物包含具有至少四种不同长度的尾端。
在一些实施方案中，所述标记物基于所述标记物离开所述纳米孔时的电压来鉴别。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述纳米孔释放所述被捕获的标记物。
在一些实施方案中，所述多个标记物包含待分选的标记物，其中所述待分选的标记物被捕获、鉴别并且保持于所述纳米孔中，并且其中除所述待分选的标记物外的标记物被捕获、鉴别并且从所述纳米孔释放。
在一些实施方案中，所述待分选的标记物成组释放并且加以收集。
在一些实施方案中，当待分选的标记物的数目除以由所述纳米孔捕获并且鉴别的标记物的剩余数目的比率增加超过阈值时，所述待分选的标记物成组释放。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括定量构成标记物的总数的不足约0.05％的标记物。
在一些实施方案中，其中所述捕获和鉴别包含每小时捕获并且鉴别至少约1百万个标记物。
在一些实施方案中，所述速率为每小时至少约100百万个标记物。
在一些实施方案中，所述速率为每小时至少约10亿个标记物。
在一些实施方案中，所述捕获和鉴别包含计数和/或分选至少约8种不同类型的标记物。
在一些实施方案中，所述捕获和鉴别包含计数和/或分选至少约32种不同类型的标记物。
在一些实施方案中，所述捕获和鉴别包含计数和/或分选至少约100种不同类型的标记物。
在一些实施方案中，所述捕获和鉴别包含计数和/或分选至少约500种不同类型的标记物。
在一些实施方案中，所述捕获和鉴别包含计数和/或分选至少约500种不同类型的标记物
在一些实施方案中，所述纳米孔的阵列被配置为具有多个能够对不同样品执行所述方法的区域。
在一些实施方案中，所述标记物基于流动通过所述个别纳米孔的电流和/或所述标记物离开所述纳米孔时的电压来鉴别。
在一些实施方案中，所述标记物各自包含附接于珠粒的单链核酸分子。
在一些实施方案中，所述标记物如下产生：(a)使第一探针与核酸样品杂交；(b)使第二探针与邻近于所述第一探针的所述核酸样品杂交；(c)使所述第一探针接合于所述第二探针以产生组合探针；以及(d)用附接于寡核苷酸的珠粒捕获所述组合探针，其中所述寡核苷酸与所述组合探针杂交。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括确定所述核酸样品中的核酸序列的拷贝数变化。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测拷贝数的差异，所述差异小于或等于约0.05％。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括定量所述核酸样品中的相对RNA表达水平。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括对所述核酸样品执行ELISA测定。
在一些实施方案中，所述第一探针包含约20个与约50个之间的核苷酸。
在一些实施方案中，所述第二探针包含约20个与约50个之间的核苷酸。
在一些实施方案中，所述第一探针包含生物素。
在一些实施方案中，所述珠粒为磁性的。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括用磁场集中邻近或接近于所述纳米孔的阵列的标记物。
另一方面，本公开提供一种用于测序、计数和/或分选分子的方法，所述方法包括：(a)提供纳米孔的阵列，其中所述阵列的个别纳米孔可通过以非法拉第模式或法拉第模式操作的邻近感测电极单独寻址；(b)提供多个磁吸珠粒，所述珠粒各自偶合于待使用所述纳米孔的阵列测序、计数和/或分选的多个分子中的分子；
用磁铁集中在所述纳米孔的阵列附近的磁吸珠粒；以及(c)用所述纳米孔的阵列测序、计数和/或分选所述分子。
在一些实施方案中，所述磁吸珠粒包含金属。
在一些实施方案中，所述磁吸珠粒包含永磁材料。
在一些实施方案中，在集中所述磁吸珠粒之前，所述磁吸珠粒的浓度为至多100飞摩尔浓度。
在一些实施方案中，在集中所述磁吸珠粒之前，所述磁吸珠粒的浓度为至多10飞摩尔浓度。
在一些实施方案中，靠近所述纳米孔的阵列的所述磁吸珠粒的浓度通过所述集中增加至少100倍。
所属领域的技术人员由以下详细描述将显而易知本公开的额外方面和优势，其中仅展示并且描述本公开的说明性实施方案。如应了解，本公开能够具有其它和不同的实施方案，且其若干详情能够在各种明显方面具有修改，均未偏离本公开。因此，所述图式和描述应实际上被视为说明性的，而非限制性的。
通过引用并入
本说明书中所提及的所有公布、专利和专利申请均以引用的方式并入本文，其并入程度就如同各个别公布、专利或专利申请特定地且个别地指示以引用的方式并入一般。
附图说明
本发明的新颖特征尤其在随附权利要求书中陈述。对本发明的特征和优势的更好了解将参考以下详细描述和附图(本文中也为“图”)来获得，所述详细描述陈述其中利用本发明的原理的说明性实施方案，在所述附图中：
图1示意性地展示所述方法的步骤；
图2A、2B和2C展示纳米孔检测器的实例，其中图2A具有安置于电极上的纳米孔，图2B具有插入加样孔上方的膜中的纳米孔并且图2C具有在突出电极上方的纳米孔；
图3展示纳米孔检测器的阵列；
图4展示分成两个通道的纳米孔的阵列；
图5展示由传递至纳米孔中的标记物实体(或标记物)产生的信号的实例；
图6展示小型传感器电路的实例；
图7展示使用纳米孔来计数、分选或分箱标记物实体的实例；
图8展示标记物实体和用于产生标记物实体的方法的实例；
图9展示具有单向闸门的标记物实体的实例；
图10展示标记物实体基于其脱落电压的鉴别的实例；
图11展示使用所述脱落电压来校准外加电压的实例；
图12展示用于分选和分箱分子实体的设备和/或方法的实例；以及
图13展示经程序化或以其它方式配置来实施本公开的方法的计算机系统的实例。
具体实施方式
虽然本文已经展示并且描述本发明的各种实施方案，但所属领域的技术人员应显而易见，所述实施方案仅举例提供。多种变化、改变和取代可由所属领域的技术人员想到，而不偏离本发明。应了解，可采用本文所述的本发明的实施方案的多种替换物。
如本文所用，术语“纳米孔”一般是指在膜中形成或以其它方式提供的孔、通道或通路。膜可为有机膜，如脂质双层，或合成膜，如由聚合材料形成的膜。膜可为聚合材料。纳米孔可邻近或接近于感测电路或与感测电路耦合的电极安置，所述感测电路例如为互补金属氧化物半导体(CMOS)或场效应晶体管(FET)电路。在一些实施例中，纳米孔具有大约0.1纳米(nm)至约1000nm的特征性宽度或直径。一些纳米孔为蛋白。α-溶血素为蛋白纳米孔的实例。
如本文所用，术语“核酸”一般是指包含一个或多个核酸亚单位的分子。核酸可包括选自腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)或其变体的一个或多个亚单位。核苷酸可包括A、C、G、T或U，或其变体。核苷酸可包括任何可并入生长中的核酸链的亚单位。所述亚单位可为A、C、G、T或U，或者对一个或多个互补A、C、G、T或U具有特异性或与嘌呤(即A或G，或其变体)或嘧啶(即C、T或U，或其变体)互补的任何其它亚单位。亚单位可使得个别核酸碱基或成组的碱基(例如，AA、TA、AT、GC、CG、CT、TC、GT、TG、AC、CA或其尿嘧啶对应物)能够被解析。在一些实施例中，核酸为脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，或其衍生物。核酸可为单链或双链。
如本文所用，术语“聚合酶”一般是指任何能够催化聚合反应的酶。聚合酶的实例包括不限于核酸聚合酶或连接酶。聚合酶可为聚合作用的酶。
方法和设备
一方面，本公开提供用于分子计数和/或分选的方法和设备，其包括提供纳米孔的阵列，其中各纳米孔可单独寻址并且邻近于感测电极安置。可单独寻址的纳米孔可各自提供其本身的电子信号(例如，使用所述感测电极)。在一些情况下，施加于各可单独寻址的纳米孔的电压可单独加以控制。在一些情况下，所述纳米孔被分组，其中各组纳米孔相对于彼此可单独寻址(例如，提供信号和/或可具有单独施加的电压)。
所述方法可包括提供多个能够由所述纳米孔捕获并且鉴别的标记物实体(本文中也为“标记物”)。所述标记物实体可为任何能够由所述纳米孔捕获并且鉴别的分子或分子复合物。本公开提供标记物实体和分子实体的一些实例。
在一些情况下，所述方法包括用所述纳米孔的阵列捕获并且鉴别所述标记物实体。所述感测电极可以非法拉第(或电容)感测模式操作(例如，其中所述电极和电解质不执行氧化还原反应)。在一些实施方案中，所述标记物实体快速地(例如，以每秒每个纳米孔至少约1个标记物实体的速率)被捕获并且鉴别。
图1展示所述方法的步骤的实例。在一些情况下，所述标记物由核酸样品产生。所述核酸样品可从生物体、组织或细胞提取。所述标记物实体可根据本文所述的方法制备(参见例如图8和相应正文)。所述标记物实体可借助于纳米孔阵列检测。
本公开的设备和方法可能够检测和/或计数数种不同的标记物实体(例如，在同一纳米孔上和/或平行位于所述纳米孔阵列的不同部分上)。所述方法可能够计数和/或分选任何适合数目的标记物实体。在一些情况下，所述方法能够计数和/或分选约2种、约3种、约4种、约5种、约6种、约7种、约8种、约10种、约12种、约15种、约20种、约25种、约30种或约50种不同类型的标记物实体。在一些情况下，所述方法能够计数和/或分选至少约2种、至少约3种、至少约4种、至少约5种、至少约6种、至少约7种、至少约8种、至少约10种、至少约12种、至少约15种、至少约20种、至少约25种、至少约30种或至少约50种不同类型的标记物实体。
纳米孔阵列
本文提供借助于纳米孔来计数、分箱和分选的系统和方法。所述纳米孔可形成或以其它方式包埋于邻近于感测电路的感测电极安置的膜中，所述电路如集成电路。所述集成电路可为专用集成电路(ASIC)。在一些实施例中，所述集成电路为场效应晶体管或互补金属氧化物半导体(CMOS)。所述感测电路可位于具有所述纳米孔的芯片或其它设备中，或脱离所述芯片或设备，如在芯片外配置中。所述半导体可为任何半导体，包括不限于IV族(例如硅)和III-V族半导体(例如砷化镓)。
在一些情况下，当标记物实体流动通过或邻近于所述纳米孔时，所述感测电路检测与所述标记物实体相关的电信号。所述标记物实体可为较大分子的亚单位。所述标记物实体可为核苷酸并入事件或在标记的核酸与所述纳米孔或邻近于所述纳米孔的物质之间的其它相互作用的副产物，所述物质如从核酸裂解标记物实体的酶。所述标记物实体可保持附接于核酸。可收集检测到的信号并且将其存储于存储单元中，并且稍后用于计数所述标记物实体。可对收集的信号进行处理以解释检测到的信号中的任何异常，如误差。
图2A-图2C展示如可根据美国专利申请公布号2011/0193570中所述的方法制备的具有温度控制的纳米孔检测器(或传感器)的实例，所述公布以引用的方式整体并入本文。参考图2A，所述纳米孔检测器包含与导电溶液(例如盐溶液)207接触的顶部电极201。底部导电电极202靠近、邻近或接近于插入膜205中的纳米孔206。在一些情况下，底部导电电极202包埋于半导体203中，其中在半导体衬底204中包埋有电路。半导体203的表面可被处理成疏水性的。所检测的具有标记物实体的样品穿过纳米孔206中的孔。半导体芯片传感器放置于包装208中，而包装208又在温度控制元件209附近。温度控制元件209可为热电加热和/或冷却设备(例如，帕尔贴设备)。多个纳米孔检测器可形成纳米孔阵列。
参考图2B，其中相同的数字表示相同的元件，膜205可安置于加样孔210上方，其中传感器202形成加样孔的表面的一部分。图2C展示一个实例，其中电极202从处理过的半导体表面203突出。
在一些实例中，膜205在底部导电电极202上形成，而非在半导体203上形成。膜205在所述情况下可与底部导电电极202形成耦合相互作用。然而，在一些情况下，膜205在底部导电电极202和半导体203上形成。作为替换，膜205可在半导体203上形成，而非在底部导电电极202上形成，但可延伸超过底部导电电极202。
纳米孔可用于间接地计数、分选或分箱标记物实体，在一些情况下使用电检测。间接检测可为其中标记物实体并未传递通过纳米孔的任何方法。所述标记物实体可在相距和/或接近于纳米孔的任何适合距离内传递，在一些情况下在使得标记物实体在纳米孔中被检测到的距离内传递。
核苷酸并入事件的副产物可通过纳米孔检测。“核苷酸并入事件”为将核苷酸并入生长中的聚核苷酸链中。副产物可与给定类型的核苷酸的并入有关。核苷酸并入事件一般由如DNA聚合酶的酶催化，并且使用与模板分子的碱基对相互作用在可用于在各位置处并入的核苷酸中进行选择。在一些情况下，所述标记物实体用于对核酸分子测序。
所述纳米孔可形成阵列。本公开提供用于检测标记物实体的纳米孔检测器(或传感器)的阵列。参考图3，多个标记物实体可在纳米孔检测器的阵列上检测到。此处，各纳米孔位置(例如301)均包含纳米孔，在一些情况下所述纳米孔附接于聚合酶和/或磷酸酶。在如本文别处所述的各阵列位置处一般还有传感器。所述纳米孔各自可单独寻址。
所述纳米孔的阵列可具有任何适合数目的纳米孔。在一些情况下，所述阵列包含约200、约400、约600、约800、约1000、约1500、约2000、约3000、约4000、约5000、约10000、约15000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000、约200000、约400000、约600000、约800000、约1000000个纳米孔等。所述阵列可包含至少200、至少400、至少600、至少800、至少1000、至少1500、至少2000、至少3000、至少4000、至少5000、至少10000、至少15000、至少20000、至少40000、至少60000、至少80000、至少100000、至少200000、至少400000、至少600000、至少800000或至少1000000个纳米孔。
在一些情况下，标记物实体靠近纳米孔提供或集中(例如，磁力地)。邻近于纳米孔的纳米孔传感器可检测个别标记物实体，或多个标记物实体。可检测到与标记物实体有关的一个或多个信号，并且对其进行处理以产生平均信号。
标记物实体可由所述传感器随时间检测。随时间检测到的标记物实体可用于确定所述标记物实体的身份，如借助于计算机系统(参见例如图13)，所述计算机系统经程序化以记录传感器数据并且由所述数据产生计数、分选或分箱函数。
所述纳米孔检测器的阵列可具有高密度的离散位点。例如，每单位面积相对较大数目的位点(即，密度)允许构建较小设备，所述设备是便携的、廉价的或具有其它有利特征。所述阵列中的个别位点可为可单独寻址的位点。包含纳米孔和感测电路的大量位点可允许同时检测相对大量的标记物实体。所述系统可提高通量和/或降低计数、分选或分箱的成本。
标记物实体可使用具有衬底的传感器(或检测器)进行检测，所述衬底具有包含离散位点的表面，各个别位点具有纳米孔，并且在一些情况下具有附接于所述纳米孔的聚合酶和邻近于所述纳米孔的感测电路。所述系统可进一步包括与所述衬底流体连通的流槽，所述流槽经调适以递送一种或多种试剂至所述衬底。
所述表面包含任何适合密度的离散位点(例如，适用于在给定的时间长度内或以给定的成本确定标记物实体的密度)。各离散位点可包括传感器。所述表面可具有大于或等于每1mm2约500个位点的离散位点密度。在一些实施方案中，所述表面具有每1mm2约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000或约500000个位点的离散位点密度。在一些情况下，所述表面具有每1mm2至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少2000、至少3000、至少4000、至少5000、至少6000、至少7000、至少8000、至少9000、至少10000、至少20000、至少40000、至少60000、至少80000、至少100000或至少500000个位点的离散位点密度。
在一些情况下，所述纳米孔的阵列被配置为具有多个能够对不同样品执行所述方法的区域(例如，通道)。所述样品可为不同的，或所述样品可分成独立体积，其中对各体积执行不同测定。
在一些情况下，多个加样孔(包括加样孔的总数的任何子集)包括公用电解质池。各加样孔可具有安置于其上方的具有纳米孔的膜和在加样孔下方或其中的感测电极。如图4中所示，加样孔401可由壁402分成数行，使得一行加样孔共有在所述加样孔上方的公用电解质池。如此处所述将生物芯片分割成数个区段可允许在单一生物芯片上分析多个样品(例如，通过将不同样品放入所述芯片的不同区段中)。
感测电极和其操作
标记物实体可基于流动通过所述纳米孔的电流和/或所述标记物实体离开所述纳米孔(或从其去除)的电压(例如脱落电压)来鉴别。图5展示预言曲线，其中标记物实体随时间阻断流动通过所述纳米孔的电流。所述电流在所述纳米孔中不存在标记物实体的情况下处于基线水平505下。当不同标签位于所述纳米孔中时(例如501、502、503、504)，所述电流可降低至不同程度。下文描述标记物实体基于脱落电压的检测。
所述电流可用感测电极(例如，其可包括感测电路或与感测电流电连通)检测。所述感测电极可能够为法拉第或非法拉第感测模式。
在法拉第导电模式中，金属电极和导电盐可反应(例如执行氧化/还原(氧化还原)反应)以形成新的金属物质和电子，所述电子稍后由所述芯片的传感器电路感测。在法拉第模式中，可通过电极之间的外加电势产生离子流，从而可使所述电极与溶液中的离子反应。在氯化银(AgCl)电极的实例中，在外加电势下在一个电极处的过量电子可使氯阴离子被排出，而在另一电极处电子的缺乏可使存在的银(Ag)与Cl-反应并且形成AgCl。这一系统(例如，还原：电子+AgCl□Ag(s)+Cl-；氧化：Cl-+Ag(s)□AgCl+电子)被描述为法拉第的并且可代表使用任何金属的氧化和还原来产生离子流的任何模型。为了在操作所述系统时在所述电极处维持Ag和AgCl的平衡并且为了帮助存在于双层或膜和纳米孔的任一侧上的平衡粒子，可有必要偶尔地(或频繁地)逆转所述电极上的电势以逆转所述反应。
所述离子流也可通过非法拉第方式产生。在非法拉第模式(本文中也为“电容模式”和“快速模式”)中，所述金属电极和所述盐一般不反应(例如，并且不执行氧化还原反应)。结果可为，所述金属电极一般不形成新的物质。在非法拉第模式中，可通过在存在于金属与盐或液体之间的电容双层上施加电压(或电势)降来建立盐离子流。在电势下，所述双层的电容可为实质上足够的，使得所述双层可导电并且保留电荷直至所述双层(电容器)达到其存储电荷的最大能力。去除所述电势并且使电容器通过纳米孔放电可产生盐离子流，其可由传感器电路检测。通过足够快地转换电压(例如，转换所述电压的极性或量值)，可将一系列放电周期串联在一起，所述放电周期在时间上足够接近以检测并且表示与纳米孔相互作用的分子的效应。这种技术具有允许极小的金属或非金属导电电极产生离子和电流而不会使所述电极在实验过程中降级或改变的优势。
电容方法可用于从电极吸引和排斥离子，但所述离子无法在所述电极的表面处引起化学反应。还可在所述电极处诱导电子流；然而，其可为电荷影响而非物理化学反应和电子发射或捕获的结果。以非法拉第方法操作电荷和离子流也可受益于偶尔地(或频繁地)逆转施加于所述电极的电势；例如以重置电容值至零或实质上零，或无法检测的极限。
本公开的方法可用法拉第金属电极纳米孔阵列实施，然而非法拉第操作可引起显著更快的计数并且运行显著更长的时间段。另外，非法拉第方法可为极快速吸引和捕获标记物实体的基础。其也可接着用于排斥和或驱逐靠近纳米孔的桶或在纳米孔的桶附近的标记物实体。
在法拉第和非法拉第模式中，逆转所述电势的作用可使纳米孔中的标记物实体逆转方向。在纳米孔系统中，可难以取得正电流和负电流的读数。在仅读取正电流的情况下，所有负的外加电势读数均可读作零。结果，所述标记物实体的位置可丢失。在一些情况下，所述标记物实体可甚至从纳米孔发射并且可有必要在下一个正的外加电势期间再捕获所述标记物实体。
使用小的或显微大小的电极对标记物实体进行法拉第或非法拉第电检测的使用(例如，如在整体平行的纳米孔阵列的情况下)可使所述标记物实体逆转方向。分子可在所述系统中通过测量传递被保留或传递通过纳米孔的分子的离子流来检测并且进行聚合物测序(标记物实体可包含聚合物)。为了产生多个孔并且进行多个类似的或不同的分子的平行读数，可使用多个电极和其相关纳米孔。为了在小的区域中产生多个电极/纳米孔，所述电极可为小的。小的电极和/或在用膜或双层材料密封的电极侧面的少量试剂可使电极在将离子流转变成电流方面失去其有效性。
图6展示紧凑型感测电路的实例。外加电压Va可施加于在MOSFET电流传送器门601之前的运算放大器600。此处还展示了电极602和由设备603检测的所述标记物实体的电阻。
外加电压Va可驱动电流传送器门601。由此在电极上产生的电压为Va-Vt，其中Vt为MOSFET的阈值电压。在一些情况下，这导致向电极施加的实际电压的有限控制，这是由于MOSFET阈值电压可随工艺、电压、温度而显著变化，并且甚至在芯片中的设备之间都有显著变化。这种Vt变化在亚阈值泄漏效应可开始起作用的低电流水平上可更大。因此，为了提供对外加电压的更好的控制，可在具有所述电流传送器设备的跟随器反馈配置中使用运算放大器。这可确保向电极施加的电压为Va，而不依赖于MOSFET阈值电压的变化。在一些情况下，使用如下文所述的脱落电压校准向电极施加的电压。
本文所述的传感器和/或方法可以非法拉第模式或以法拉第模式操作。在一些情况下，在溶液中包括海藻糖允许法拉第模式电极操作约一个小时，其可足够长以执行如本文所述的分子计数和/或分选。在一些情况下，法拉第读数可给出优于非法拉第操作的分辨率。
标记物实体和其检测
本公开的方法可包括用所述纳米孔的阵列捕获并且鉴别所述标记物实体。所述标记物实体可为任何分子或分子复合物，但在一些情况下其为附接于珠粒的聚合物(例如核酸或肽)。图7展示具有附接于珠粒715的不同聚合物的标记物实体(在这种情况下为两种不同标记物705和710)的实例。所述标记物实体的聚合物部分可被拉入纳米孔中，其中其阻断流动通过所述纳米孔的电流。各不同类型的标记物实体可提供独特的电子特征，其中不具有标记物实体的纳米孔720不同于具有第一标记物实体的纳米孔725，所述纳米孔725不同于具有第二标记物实体的纳米孔730。
所述多个标记物实体可包含多个不同的标记物实体和/或本文所述的方法和设备可能够区别多个不同的标记物实体。在一些情况下，所述标记物实体具有附接于珠粒的不同聚合物(例如705对710)。不同聚合物的实例包括聚乙二醇(PEG)、具有不同序列的核酸或具有不同序列的肽。在一些情况下，所述标记物实体具有附接于珠粒的相同聚合物(例如，均为PEG)，但所述聚合物的长度变化(例如705对735)。在一些情况下，聚合物的类型可基于电流的水平来鉴别(例如图5)并且聚合物的长度可基于其脱落电压来鉴别(例如图10)。
所述样品可具有多个不同的标记物实体。在一些情况下，所述样品具有约2种、约3种、约4种、约5种、约6种、约7种、约8种、约10种、约12种、约15种、约20种、约25种、约30种或约50种不同类型的标记物实体。在一些情况下，所述样品具有至少约2种、至少约3种、至少约4种、至少约5种、至少约6种、至少约7种、至少约8种、至少约10种、至少约12种、至少约15种、至少约20种、至少约25种、至少约30种或至少约50种不同类型的标记物实体。
所述多个标记物实体可包含具有多种不同长度的(聚合物)尾端。在一些情况下，所述分子实体包含具有约2种、约3种、约4种、约5种、约6种、约7种、约8种、约9种或约10种不同长度的尾端。在一些情况下，所述分子实体包含具有至少约2种、至少约3种、至少约4种、至少约5种、至少约6种、至少约7种、至少约8种、至少约9种或至少约10种不同长度的尾端。
在一些情况下，所述标记物实体包含附接于珠粒的单链核酸分子。所述标记物实体可以任何适合方式产生。
参考图8，在一些情况下，所述标记物实体通过使第一探针805与基因组DNA样品810杂交，使第二探针815与邻近于所述第一探针的所述基因组DNA样品杂交，并且将所述第一探针接合820至所述第二探针以产生组合探针来产生。在一些情况下，所述第一探针附接825生物素分子。所述第二探针可具有碱基830的序列(例如，两个碱基)，所述碱基在纳米孔中针对给定的标记物提供独特的电流水平。在一些情况下，所述第二探针可确定所述电流水平，并且通过改变所述第一探针的长度，可改变所述标记物实体的尾端的长度以提供第二种确定所述标记物实体的身份的方式(例如电流水平和尾端长度，经由脱落电压)。所述第二探针可杂交至附接于珠粒840(例如，用于所述组合探针的捕获和分离)的寡核苷酸835。所述方法可包括用附接于寡核苷酸的珠粒捕获所述组合探针，其中所述寡核苷酸与所述组合探针杂交。
所述标记物实体、第一探针、第二探针和/或组合探针可具有任何适合的长度。在一些情况下，所述标记物实体、第一探针、第二探针和/或组合探针包含核苷酸。在一些情况下，所述第一探针包含约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约60、约80或约100个核苷酸。在一些情况下，所述第一探针包含至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约60、至少约80或至少约100个核苷酸。在一些实施方案中，所述第一探针包含至多约10、至多约15、至多约20、至多约25、至多约30、至多约35、至多约40、至多约45、至多约50、至多约60、至多约80或至多约100个核苷酸。在一些情况下，所述第一探针包含约20个与约50个之间的核苷酸。
在一些情况下，所述第二探针包含约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约60、约80或约100个核苷酸。在一些情况下，所述第二探针包含至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约60、至少约80或至少约100个核苷酸。在一些实施方案中，所述第二探针包含至多约10、至多约15、至多约20、至多约25、至多约30、至多约35、至多约40、至多约45、至多约50、至多约60、至多约80或至多约100个核苷酸。在一些情况下，所述第二探针包含约20个与约50个之间的核苷酸。
由于所述第一和第二探针在样品DNA上的特定位点处彼此邻近杂交，所述标记物实体携带源于所述样品DNA的信息。略微温度增加可使所述组合探针脱离所述样品。在一些情况下，重复这个循环，直至所述DNA样品的相关区域具有多个组合探针(例如，所述样品可产生多个标记物实体和/或标记物实体可由超过两个探针形成)。
关于线性测序或关于纳米孔中的检测，这些个别的组合探针可具有并入的选择分子，所述分子允许所述组合探针中的每一者的分离和随后连接至长的阅读链(例如，含有2个直至10,000个或更多的组合探针)中。这些阅读链中的这些组合探针可来自一个样品的一个具体序列区域，从而产生重复的同一组合探针的阅读链。在一些情况下，这些阅读链可来自一个样品的多个具体序列区域，从而产生含有不同的(2个至1,000个或更多)组合探针的混合物的阅读链。一种连接这些组合探针的方式是标记一个探针的5’末端和另一探针的3’末端。标记可为F4B和HiNyc(即，Solulink)、抗生蛋白链菌素和生物素或炔和叠氮化物(即，点击化学)的任何组合。
在一些情况下，链介导的接合可用于将个别杂交并且接合的探针一起接合至单一长链中用于基于纳米孔的系统中的单一负载和测序。所述系统可包括未接合的探针和样品DNA与所需的接合探针的接合和分离。
另外，这些阅读链可来自多个不同样品的多个具体序列区域，从而产生含有不同的(2个至1,000个或更多)组合探针的混合物的阅读链，其中各探针并入有样品标识符或样品条形码。
各组合探针可具有特征的任何组合或多种特征，所述特征如在选择用于富集的具体位点处彼此邻近结合的探针分子的独特的杂交区段；鉴别完整探针来自多少样品的非结合区段；以及允许所需的接合探针与未接合的探针的分离的生物素或其它附接分子。
在所述方法的一些实施方案中，可进行所述聚合物的改性以允许所述分子穿过所述纳米孔并且仍无法逆转通过所述纳米孔的方向。这种探针方法可使用单向闸门区段的并入(例如，以允许这一反应的产物在整体平行的电检测、基于纳米孔的系统上的非酶促、链测序)。
在一些情况下，所述标记物实体仅能够在一个方向中(例如，无逆转方向)传递通过所述纳米孔。所述标记物实体可具有附接于所述标记物实体的铰接闸门，当所述闸门与标记物实体尾端在一个方向中而不在另一方向中对准时，所述闸门足够细小以传递通过所述纳米孔。参考图9，本公开提供一种标记物实体分子，所述分子包含第一聚合物链905，所述第一聚合物链905包含第一区段910和第二区段915，其中所述第二区段比所述第一区段窄。所述第二区段可具有小于所述纳米孔的最窄开口的宽度。所述标记物实体分子可包括包含两个末端的第二聚合物链920，其中第一末端粘附于邻近于所述第二区段的所述第一聚合物链并且第二末端并未粘附于所述第一聚合物链。所述标记物实体分子能够在其中第二聚合物链邻近于第二区段925对准的第一方向中穿过纳米孔。在一些情况下，所述标记物实体分子不能够在其中第二聚合物链并未邻近于第二区段930对准的第二方向中穿过纳米孔。所述第二方向可与所述第一方向相对。
所述第一和/或第二聚合物链可包含核苷酸。在一些情况下，当所述第二聚合物链并未邻近于所述第二区段对准时，所述第二聚合物链与所述第一聚合物链碱基配对。在一些情况下，所述第一聚合物链粘附于珠粒935。
所述第二区段可包含当与所述闸门(第二聚合物)对准时足够细以传递通过纳米孔的任何聚合物或其它分子。例如，所述第二区段可包含无碱基核苷酸(即，不具有任何核酸碱基的核酸链)或碳链。
所述闸门的产生可以多种方式进行。所述分子可直接合成，或所述分子可附加或接合在一起。例如，可用待附接闸门的任何位置处并入的炔标记的核苷酸产生DNA链。可使用点击化学附接第二叠氮化物末端标记的核苷酸(例如，其可相对于核苷酸闭锁区域为反义的)。可能使用其它附接化学和技术，包括商业方法(例如Solulink)或胺-COOH组合。
脱落电压
所述标记物实体可基于所述标记物实体从所述纳米孔移出或离开(或去除)的电压(脱落电压)来鉴别。在非法拉第模式中，当所述电压降低时，具有各种长度的尾端(例如聚合物)的标记物实体可在不同电压下从所述纳米孔脱落。图10展示通过所述纳米孔的电流(实线)和外加电压(虚线)对时间的曲线。当在所述纳米孔中捕获分子时1005，所述电流可降低。当所述外加电压随时间降低1010时，所述电流降低直至所述分子从所述纳米孔脱落，此时所述电流在所述外加电压下增加至预期水平。所述分子脱落时的外加电压可取决于所述分子的长度。例如，具有30碱基尾端的标记物实体可在约40毫伏(mV)下脱落1015，而具有50碱基尾端的标记物实体可在约10mV下脱落1020。如这个实施例中所示，具有短于30个碱基的尾端的标记物实体可在高于40mV的外加电压下从所述纳米孔脱落1025。
多种电流水平和脱落电压可用于鉴别标记物实体。例如，检测4种不同的电流水平和2种不同的脱落电压的能力可允许使用8种不同的标记物实体。
在一些情况下，所述外加电压可使用所述脱落电压校准或再校准。所述校准可允许所述标记物实体的鉴别。在一些实施例中，校准包括用具有可鉴别信号的已知标记物实体对具有生物芯片或与生物芯片缔合的计算机处理器(或纳米孔传感器装置)进行程序化，和将所述信号存储于具有所述生物芯片或与所述生物芯片缔合的存储单元中用于后续测量。
参看图11，对于具有平均脱落电压1105的给定的标记物实体，针对不同纳米孔或针对在相同纳米孔上随时间进行的不同测量可存在所述脱落电压的变化1110。调节这一脱落电压至预期值可使数据更容易解释和/或更准确。
来自单分子纳米孔传感器设备的分子特异性输出信号可源于由电解质溶液围绕的离子不透膜上电化学电势差的存在。这种跨膜电势差可确定纳米孔特异性电化学电流的强度，所述电流可由所述设备内的电子仪表经由电极表面处发生的牺牲(即，法拉第)或非牺牲(即，非法拉第)反应检测。
对于所述纳米孔的任何给定的状态(即，开放通道、捕获状态等)，所述时间依赖性跨膜电势可用作输入信号，所述信号可确定所产生的随时间而变的流动通过纳米孔复合物的电流。这种纳米孔电流可提供所述纳米孔传感器设备的特异性分子信号输出。开放通道纳米孔电流可通过所述纳米孔与捕获的分子之间的相互作用而被调节至变化程度，所述捕获的分子部分地阻断通过所述通道的离子流。
这些调节可展现对已经捕获的分子的类型的特异性，从而允许一些分子直接由其纳米孔电流调节来鉴别。对于给定的分子类型和设备条件的固定集合，由这一类型的捕获的分子调节开放通道纳米孔电流的程度可视施加的跨膜电势、各类型的分子针对特定电流对电压(I-V)曲线的定位而变化。
在外加电压设定与跨膜电势之间的系统可变偏移可引入这一I-V曲线沿水平电压轴的水平位移，潜在地降低基于由所述纳米孔传感器设备作为输出信号报告的所测量电流信号进行分子鉴别的准确性。因此，在外加电势与跨膜电势之间的不受控偏移对于在相同条件下准确地比较相同分子的测量结果来说可有问题。
外部施加的电势与实际跨膜电势之间的这种所谓的“电势偏移”可在实验内和实验之间变化。电势偏移的变化可由初始条件的变化并且由所述纳米孔传感器设备内的电化学条件的时间依赖性变化(漂移)引起。
去除这些测量误差可如此处所述通过针对每一个实验校准外加电压与跨膜电势之间的时间依赖性偏移来进行。物理上，观察到纳米孔捕获的分子的逃逸事件的概率可取决于所施加的跨膜电势并且这种概率分布对于在相同条件下的同一的分子样品(例如，所述样品可为不同类型的分子的混合物，只要其比例不在样品之间变化)来说可为相同的。在一些情况下，针对固定的样品类型发生逃逸事件的电压的分布提供外加电势与跨膜电势之间的偏移的度量。可使用这一信息以便校准跨纳米孔的外加电压，从而消除由实验内和实验之间的电势偏移引起的误差的系统来源并且改进分子鉴别和其它测量的准确性。
对于用相同分子样品和试剂操作的给定的纳米孔传感器装置来说，逃逸电压的分布的预期值可由单一分子逃逸事件的统计学样品估算(不过各个别事件可为经受随机波动的随机过程)。这一估算值可为时间依赖性的以解释实验内的电势偏移的暂时漂移。这个值可针对外加电压设定与在所述孔处感知的实际电压之间的可变差异进行校正，从而当在I-V空间中绘制曲线时有效地水平地“排列”所有测量结果。
在一些情况下，电势(即，电压)偏移校准无法解释电流增益和电流偏移变化，所述电流增益和电流偏移变化又可针对纳米孔电流测量结果的改进的准确性和可再现性进行校准。然而，电势偏移校准一般在增益和偏移校正之前进行以防止估算电流增益和电流偏移变化的误差，因为这些电流增益和电流偏移变化又可涉及拟合电流对电压(I-V)曲线，并且这些拟合的结果受电压偏移的变化影响(即，在I-V空间中数据从左至右(水平地)位移可在电流增益和电流偏移校准中引入误差)。
在一些情况下，外加电压经过校准。所述校准可包括针对感测电极估算预期的逃逸电压分布对时间。所述校准可接着计算所述预期的逃逸电压分布与参考点(例如，任意参考点，如零)之间的差异。所述校准可接着通过计算的差异使外加电压位移。在一些情况下，外加电压随时间降低。
在一些情况下，估算预期的逃逸电压对时间的分布。在一些情况下，所述参考点为零伏特。所述方法可去除预期的逃逸电压分布中的检测到的变化。在一些情况下，对多个可独立寻址的纳米孔执行所述方法，所述纳米孔各自邻近于感测电极。
在一些实施方案中，所述纳米孔中所述标记物实体的存在降低了在外加电压下用所述感测电极测量的电流。
在一些情况下，当与执行所述方法而无校准相比时，所述校准增加了所述方法的准确性。在一些情况下，所述校准补偿了电化学条件随时间的改变。在一些情况下，所述校准补偿了具有多个纳米孔的设备中具有不同电化学条件的不同纳米孔。在一些实施方案中，所述校准补偿了针对所述方法的每次执行的不同电化学条件。在一些情况下，所述方法进一步包括校准电流增益的变化和/或电流偏移的变化。
快速、精确并且准确的计数
本文提供使用纳米孔来鉴别和/或计数标记物实体的方法和设备。在一些情况下，所述鉴别和/或计数是快速、精确和/或准确的。
所述标记物实体可以任何适合的速率鉴别和/或计数。在一些情况下，所述标记物实体以每秒每个纳米孔约0.2个、约0.5个、约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约15个、约20个或约30个标记物实体的速率鉴别和/或计数。在一些情况下，所述标记物实体以每秒每个纳米孔至少约0.2个、至少约0.5个、至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约15个、至少约20个或至少约30个标记物实体的速率鉴别和/或计数。
在一些情况下，所述方法和/或纳米孔阵列能够每小时识别约500,000个、约1百万个、约5百万个、约10百万个、约50百万个、约100百万个、约500百万个或约10亿个标记物实体。在一些情况下，所述方法和/或纳米孔阵列能够每小时识别至少约500,000个、至少约1百万个、至少约5百万个、至少约10百万个、至少约50百万个、至少约100百万个、至少约500百万个或至少约10亿个标记物实体。
本文所述的方法和设备可用于确定拷贝数变化或相对RNA表达水平。在一些情况下，所述方法极精确(例如，可检测拷贝数变化或相对RNA表达水平的极小差异)。在一些情况下，所述方法能够检测约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.5％、约1％、约2％、约3％或约5％的拷贝数差异。在一些情况下，所述方法能够检测小于约0.01％、小于约0.05％、小于约0.1％、小于约0.5％、小于约1％、小于约2％、小于约3％或小于约5％的拷贝数差异。
本文所述的方法和设备可用于执行酶联免疫吸附测定(ELISA)的替换方案(例如，定量稀少或罕有实体)。在一些情况下，所述设备或方法能够定量构成标记物实体的总数的约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.5％、约1％、约2％、约3％或约5％的标记物实体。在一些情况下，所述设备或方法能够定量构成标记物实体的总数的小于约0.01％、小于约0.05％、小于约0.1％、小于约0.5％、小于约1％、小于约2％、小于约3％或小于约5％的标记物实体。
分选和分箱
本公开提供可用于分选标记物实体的设备和方法。在一些情况下，收集分选的标记物实体。所述标记物实体可根据其身份收集于独立的储槽中(例如，分箱)。
图12展示用于分选和分箱分子实体的设备和/或方法的实例。不具有分子实体的纳米孔被描绘为空心圆。具有待分选和分箱的分子实体的纳米孔被描绘为填充有黑色的圆。具有除待分选和分箱的分子实体外的分子实体的纳米孔被描绘为填充有灰色的圆。所述纳米孔阵列的纳米孔可捕获并且鉴别包括待分选的标记物实体1205和并非待分选的标记物实体1210在内的标记物实体。在一些情况下，待分选的分子实体保留于所述纳米孔中(例如，通过维持适当高的外加电压)。除待分选的分子实体外的分子实体可从所述纳米孔排出(例如，通过断开或逆转外加电压的极性)，在一些情况下同时仍保留待分选的分子实体(例如，因为所述纳米孔可单独寻址)。不具有捕获的待分选的标记物实体的纳米孔可继续基于标记物实体的身份捕获、鉴别并且保留或排出标记物实体。在这一持续过程期间，可捕获额外的待分选的标记物实体1220。在任何适合的时间和/或任何适合的数目的待分选的标记物实体已经被捕获并且鉴别后，除待分选的那些标记物实体外的大多数或全部标记物实体可排出1225以产生具有全部(或大概全部)待分选的标记物实体的纳米孔阵列。此时，大多数或全部待分选的标记物实体可从所述纳米孔阵列排出(例如，成组)。在一些情况下，排出的待分选的标记物实体可分箱(例如，成组)。在一些情况下，可重复所述方法以特异性地捕获第二组待分选的标记物实体(例如，除第一组待分选的标记物实体外)。在一些情况下，所述纳米孔阵列的第一组纳米孔捕获并且保留第一组待分选的标记物实体并且所述纳米孔阵列的第二组纳米孔捕获并且保留第二组待分选的标记物实体。
在一些情况下，当捕获的待分选的标记物实体的百分比适当高时，待分选的标记物实体成组释放。在一些情况下，当捕获约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约99.5％或约99.9％的待分选的标记物实体时，待分选的标记物实体被释放。在一些情况下，当捕获至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、至少约99.5％或至少约99.9％的待分选的标记物实体时，待分选的标记物实体被释放。
在一些情况下，当待分选的标记物实体除以除由所述纳米孔捕获并且鉴别的待分选的标记物实体外的标记物实体的比率降低至低于阈值时，所述待分选的标记物实体成组释放。在一些情况下，所述阈值为约10％、约5％、约3％、约1％、约0.5％、约0.1％、约0.05％或约0.01％。在一些情况下，所述阈值为小于约10％、小于约5％、小于约3％、小于约1％、小于约0.5％、小于约0.1％、小于约0.05％或小于约0.01％。
磁性集中
在一些情况下，所述标记物实体在与所述纳米孔阵列接触的本体溶液中处于低浓度下(例如，低于所述纳米孔的捕获速率适当高时所处的浓度)，但使用磁性靠近所述纳米孔集中(例如，使得所述标记物实体的捕获和鉴别速率适当高)。在一些情况下，所述标记物实体的珠粒部分(例如，图9的935)为磁性或顺磁性的。在一些情况下，所述方法包括用磁场使所述标记物实体靠近所述纳米孔阵列集中，所述磁场可由磁铁(例如，永久磁铁或电磁铁)提供。
一方面，一种用于测序、计数和/或分选分子的方法包括提供纳米孔的阵列，其中各纳米孔可单独寻址并且邻近于感测电极安置。所述方法还可包括提供多个偶合于待使用所述纳米孔的阵列测序、计数和/或分选的分子的磁吸(或活性)珠粒，和用磁铁在所述纳米孔的阵列附近集中所述磁吸珠粒。所述方法可进一步包括用所述纳米孔的阵列测序、计数和/或分选所述分子。
在一些情况下，所述磁吸珠粒包含金属。在一些情况下，所述磁吸珠粒包含永磁材料。
在集中所述标记物实体和/或磁吸珠粒之前，所述标记物实体和/或磁吸珠粒可处于任何适当低的初始浓度下(例如，在与所述纳米孔阵列接触的本体溶液中)。在一些情况下，所述初始浓度为约1飞摩尔(fM)、约5fM、约10fM、约50fM、约100fM、约500fM或约1微摩尔(μM)。在一些情况下，所述初始浓度为至多约1飞摩尔(fM)、至多约5fM、至多约10fM、至多约50fM、至多约100fM、至多约500fM或至多约1微摩尔(μM)。
所述标记物实体和/或磁吸珠粒可靠近所述纳米孔集中至任何适合程度(例如，在集中后靠近所述纳米孔的浓度与本体溶液中的初始浓度的适当高比率)。在一些情况下，靠近所述纳米孔的阵列的所述磁吸珠粒的浓度增加约5倍、约10倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1000倍、约5000倍或约10000倍。在一些实施方案中，靠近所述纳米孔的阵列的所述磁吸珠粒的浓度增加至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约500倍、至少约1000倍、至少约5000倍或至少约10000倍。
计算机系统
本文所述的设备可耦合至计算机系统(例如，从所述可单独寻址的纳米孔中的每一者收集数据和/或控制所述可单独寻址的纳米孔中的每一者)。在一些情况下，本文所述的方法借助于计算机系统执行。所述计算机系统可包括一个或多个计算机处理器和一个耦合至所述计算机处理器的存储单元。所述存储单元包含机器可执行代码，在由所述计算机处理器执行后，所述代码实施本文所述的任何方法。
图13展示经程序化或以其它方式配置以控制或调节本公开的系统的一个或多个过程参数的系统1300。所述系统1300包括经程序化以实施本文所公开的方法的计算机服务器(“服务器”)1301。所述服务器1301包括中央处理单元(CPU，本文中还为“处理器”和“计算机处理器”)1305，其可为单核或多核处理器，或多个用于平行处理的处理器。所述服务器1301还包括存储器1310(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元1315(例如，硬盘)、用于与一个或多个其它系统通信的通信接口1320(例如，网络适配器)，以及外围设备1325，如高速缓冲存储器、其它存储器、数据存储和/或电子显示适配器。所述存储器1310、存储单元1315、接口1320和外围设备1325通过如主板的通信总线(实线)而与CPU 1305通信。所述存储单元1315可为用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。所述服务器1301可借助于通信接口1320而可操作地耦合至计算机网络(“网络”)1330。所述网络1330可为因特网、因特网和/或外联网，或为与因特网通信的内联网和/或外联网。在一些情况下，所述网络1330为电信和/或数据网络。所述网络1330可包括一个或多个计算机服务器，所述计算机服务器可使得能实现分布式计算，如云计算。在一些情况下，所述网络1330藉助于所述服务器1301可实施对等网络，所述对等网络可使得耦合于所述服务器1301的设备能用作客户端或服务器。所述服务器1301可直接或通过所述网络1330耦合于系统1335。所述系统1335可配置为执行核酸(例如DNA、RNA)或聚合物(例如，蛋白)测序或分子计数。
所述存储单元1315可存储所述系统1335的过程参数(例如，校准参数)。所述过程参数可包括充电和放电参数。在一些情况下，所述服务器1301可包括一个或多个在所述服务器1301外部的额外数据存储单元，如位于通过内联网或因特网与所述服务器1301通信的远程服务器上。
所述服务器1301可通过所述网络1330与一个或多个远程计算机系统通信。在所说明的实施例中，所述服务器1301与远程计算机系统1340通信。所述远程计算机系统1340可为例如个人计算机(例如，便携式PC)、平板PC(例如iPad、GalaxyTab)、电话、智能电话(例如iPhone、启用安卓的设备、)或个人数字助理。
在一些情况下，所述系统1300包括单一服务器1301。在其它情况下，所述系统1300包括多个通过内联网和/或因特网彼此通信的服务器。
如本文所述的方法可通过存储在所述服务器1301的电子存储位置上(例如，在存储器1310或电子存储单元1315上)的机器(或计算机处理器)可执行代码(或软件)的方式来实施。在使用期间，代码可由处理器1305执行。在一些情况下，可从存储单元1315中检索代码并将其存储在存储器1310上以供处理器1305随时访问。在一些情况下，可排除电子存储单元1315，并且在存储器1310上存储机器可执行指令。或者，所述代码可在第二计算机系统1340上执行。
代码可被预编译和配置为与具有适于执行代码的处理器的机器一起使用，或者可在运行期间进行编译。代码可以程序设计语言来提供，可以选择程序设计语言以使代码能够以预编译或当场编译的方式执行。
本文所提供的系统和方法的多个方面(如服务器1301)可在程序设计方面体现。所述技术的多个方面可被视为通常以携载或体现于某种类型的机器可读介质上的机器(或处理器)可执行代码和/或关联数据的形式存在的“产品”或“制品”。机器可执行代码可存储在如存储器(例如只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘的电子存储单元上。“存储”型介质可包括计算机、处理器等的任何或所有的有形存储器或其关联模块，如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可在任何时间为软件程序设计提供非暂时性存储。整个软件或其各部分可不时通过因特网或各种其它电信网络来通信。例如，所述通信可使得软件能从一个计算机或处理器向另一计算机或处理器中(例如，从管理服务器或主机向应用服务器的计算机平台中)加载。因此，可承载软件元素的另一类型的介质包括通过有线和光学陆线网络和经由各种空中链路的光波、电波和电磁波，如跨本地设备之间的物理接口使用的光波、电波和电磁波。携载所述波的物理元素，如有线或无线链路、光学链路等，也可被视为承载软件的介质。如本文所用，除非局限于非暂时性的有形“存储”介质，否则如计算机或机器“可读介质”的术语是指任何参与向处理器提供用于执行的指令的介质。
因此，机器可读介质，如计算机可执行代码，可采取多种形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，如任何一个或多个计算机中的任何存储设备等，如可用于实现附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，如所述计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括构成计算机系统内的总线的线缆。载波传输介质可采用电信号或电磁信号或者声波或光波的形式，如在射频(RF)和红外线(IR)数据通信中生成的那些。计算机可读介质的常见形式因此包括例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其它磁介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其它光学介质、穿孔卡片纸带、任何其它具有孔洞图案的物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其它存储器芯片或匣、传送数据或指令的载波、传送所述载波的电缆或链路，或者计算机可从中读取程序设计代码和/或数据的任何其它介质。这些计算机可读介质形式中的许多形式可涉及向处理器传送一个或多个指令的一个或多个序列以供执行。
本文所述的系统的各种参数可在用户的电子设备的用户界面(UI)上提供给用户。UI的实例包括不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。UI(例如GUI)可提供于用户或服务器1301的电子设备的显示器上。所述显示器可为电容或电阻式触摸显示器。所述显示器可与本公开的其它系统和方法一起使用。
以下实施例意图说明但不限制本发明。
实施例
实施例1：非法拉第阵列的产生和标记物检测的证明
用针对非法拉第、快速模式(例如，非法拉第)操作优化的电极金属产生纳米孔传感器芯片。电极处理产生具有20飞法拉(fF)至60fF的电容的个别电极。测试非法拉第导电盐溶液并且加以选择以提供可重复并且适当的开放通道电流水平。所述盐溶液使得电压能足以容易地捕获自由浮动标记物实体。所述纳米孔传感器芯片的硬件和软件针对快速模式操作进行修改。用最少5个活性孔持续30分钟证明所述纳米孔传感器芯片的持续操作。所述孔以每秒至少2个的速率捕获(例如，DNA)标记物。测试标记物并且选择产生4种不同电流水平的4种不同标记物，其中在1,800次标记物捕获中具有95％或更大的准确性。所述测试重复5次。
实施例2：芯片的优化和表征
产生能够以快速模式操作的操作纳米孔。在十次连续尝试中的五次中产生最少四十个孔。产生能够以快速模式操作的孔并且具有最少二十个持续最少三十分钟的孔。所述芯片以快速模式操作并且证明标记物实体的计数。用至少二十个以快速模式操作的孔读取含有两种不同标记物的溶液。标记物以每秒两个标记物的速率在二十个孔中读取，持续三十分钟，共计72,000次读取。用预期比率检查预期的读取比率。表征四种不同标记物的脱落电压以确定标记物长度是否可用于增加标记物的潜在池。
实施例3：快速分子感测
提供具有264个可单独寻址的纳米孔的纳米孔阵列。约75个纳米孔针对测序的目的操作。提供四种不同标记物实体的混合物。操作纳米孔以每秒约四个标记物实体的速率捕获并且鉴别标记物实体。所述纳米孔阵列每个芯片每秒读取约300个标记物实体，每个芯片每分钟读取约18,000个标记物实体，或每个芯片每小时读取约1,080,000个标记物实体。在两小时中，所述纳米孔阵列每个芯片读取约2,160,000个标记物实体。
实施例4：快速分子感测
提供具有264个可单独寻址的纳米孔的纳米孔阵列。约七十五个纳米孔在操作。提供八种不同标记物实体的混合物，其中一些标记物具有不同的尾端长度。所述纳米孔以每秒每个操作纳米孔约一个的速率捕获并且鉴别标记物实体。所述纳米孔阵列每个芯片每秒读取约七十五个标记物实体。所述纳米孔阵列每个芯片每分钟读取约4，500个标记物实体，每个芯片每小时读取约270,000个标记物实体，或每个芯片在两小时中读取约540,000个标记物实体。
实施例5：快速分子感测
提供具有132,000个可单独寻址的纳米孔的纳米孔阵列。约50,000个纳米孔在操作。提供四种不同标记物实体的混合物。所述纳米孔以每秒每个操作纳米孔约四个的速率捕获并且鉴别标记物实体。所述纳米孔阵列每个芯片每秒读取约200,000个标记物实体，每个芯片每分钟读取约12,000,000个标记物实体，或每个芯片在一小时中读取约720,000,000个标记物实体。
实施例6：快速分子感测
提供具有132,000个可单独寻址的纳米孔的纳米孔阵列。约50,000个纳米孔在操作。提供八种不同标记物实体的混合物，其中一些标记物具有不同的尾端长度。所述纳米孔以每秒每个操作纳米孔约一个的速率捕获并且鉴别标记物实体。所述纳米孔阵列每个芯片每秒读取约50,000个标记物实体，每个芯片每分钟读取约3,000,000个标记物实体，或每个芯片在一小时中读取约180,000,000个标记物实体。
实施例7：快速分子感测
提供具有132,000个可单独寻址的纳米孔的纳米孔阵列。所述阵列分成四个通道，各通道具有约20,000个纳米孔。各通道具有约7,500个操作纳米孔并且能够执行不同的测定。提供三十二种不同标记物实体的混合物。所述混合物在所述四个通道中分配。所述纳米孔以每秒每个操作纳米孔约四个的速率捕获并且鉴别标记物实体。所述纳米孔阵列每个通道每秒读取约30,000个标记物实体，每个通道每分钟读取约18,000,000个标记物实体，或每个通道在一小时中读取约108,000,000个标记物实体。
实施例8：快速分子感测
在96孔板上提供珠粒，使得各孔具有捕获一个标记物的珠粒。由一个样品产生的标记物具有独特的结合位点，所述位点允许其结合于特异性珠粒。可配置标记物的混合物，使得对于各珠粒来说，可结合八个不同标记物。剩余标记物具有用于其它珠粒的结合位点。产生完整标记物混合物，使得仅8个标记物被允许用于各不同珠粒。在这个实施例中，关于各珠粒存在8个标记物并且关于被分成每孔8个一组的768个独特标记物存在96个珠粒。
样品溶液依序暴露于各孔，在各暴露之后将磁性珠粒吸引至所述孔的底部并且移动所述样品溶液至下一孔用于暴露。标记物的集合可分开使用此处所述的纳米孔检测技术进行检测。可执行空间上分开所述珠粒以允许独立集合标记物的其它方法(例如，珠粒连续地暴露于一种含有标记物的溶液，或珠粒在空间上定位于纳米孔阵列芯片上的已知位置处)。
所述96孔板的各孔中的标记物的集合可从珠粒融化掉或留在珠粒上并且流动通过纳米孔检测器芯片上的通道。所述标记物在流槽中检测之后可从流槽冲走，并且可加载附接于不同的珠粒的下一个不同的标记物集合且检测或计数。珠粒和标记物的完全冲洗可由所述珠粒的磁性特性辅助。应用磁引力以及液体洗涤力可帮助确保流槽中几乎所有标记物的完全冲洗。
虽然本文已经展示并且描述本发明的优选实施方案，但所属领域的技术人员应显而易见，所述实施方案仅举例提供。多种变化、改变和取代现将由所属领域的技术人员想到，而不偏离本发明。应了解，本文所述的本发明的实施方案的各种替换方式可用于实践本发明。预期以下权利要求书界定本发明的范围并且由此涵盖在这些权利要求书和其相等物的范围内的方法和结构。

Claims (3)

1.一种用于分子计数和/或分选的方法，所述方法包括：
a.提供纳米孔的阵列，其中所述阵列的个别纳米孔可通过邻近感测电极单独寻址；
b.提供多个各自包含核苷酸的标记物，其中所述核苷酸中的至少两种与核酸样品杂交，并且其中所述标记物能够由所述个别纳米孔捕获并且使用所述感测电极鉴别；和
c.用所述纳米孔的阵列以每秒每个纳米孔至少约1个标记物的速率捕获并且鉴别所述标记物。
2.一种用于分子计数和/或分选的方法，所述方法包括：
a.提供纳米孔的阵列，其中所述阵列的个别纳米孔可通过以非法拉第模式操作的邻近感测电极单独寻址；
b.提供多个能够由所述个别纳米孔捕获并且使用所述感测电极鉴别的标记物；以及
c.用所述纳米孔的阵列以每秒每个纳米孔至少约1个标记物的速率捕获并且鉴别所述标记物。
3.一种用于测序、计数和/或分选分子的方法，所述方法包括：
a.提供纳米孔的阵列，其中所述阵列的个别纳米孔可通过以非法拉第模式或法拉第模式操作的邻近感测电极单独寻址；
b.提供多个磁吸珠粒，所述珠粒各自偶合于待使用所述纳米孔的阵列测序、计数和/或分选的多个分子中的分子；
c.用磁铁集中在所述纳米孔的阵列附近的磁吸珠粒；以及
d.用所述纳米孔的阵列测序、计数和/或分选所述分子。
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