JP5998148B2 - ハイブリダイズされたプローブの相対位置を検出することによる生体分子のシークエンシングのための方法 - Google Patents
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Description
本願は、2010年11月16日に出願された米国仮特許出願第61/414,282号に対する優先権を主張し、その利益を受け、そしてその全体が本明細書中に参考として援用される。
本発明は、一般に、生体分子のシークエンシングのための方法に関する。より詳細には、一定の実施形態において、本発明は、ハイブリダイズされたプローブの相対位置から生体分子の配列を決定することに関する。
生体高分子シークエンシングとは、生体分子(例えばDNAまたはRNA分子)またはそれらの一部中のヌクレオチド塩基(アデニン、グアニン、シトシンおよびチミン)の順序の決定を指す。生体分子シークエンシングには、例えば診断学、生物工学、法生物学および創薬において、非常に多くの用途がある。様々な技術が生体高分子シークエンシングのために開発されてきた。
1タイプだけのプローブとではなく、電気的に区別できる配列既知の異なるプローブの特別に選ばれたプールと生体分子をハイブリダイズさせるシークエンシング方法を提示する。異なるプローブタイプにタグをつけるので、ハイブリダイゼーション支援ナノポアシークエンシング(HANS)検出システムでそれらを互いに区別することができ、また前記生体分子がポアまたはチャネルを通過する間に該生体分子上のそれらの相対位置を決定することができる。一定の実施形態では、相対プローブ位置を直接決定することを可能にすることにより、前記方法は、以前のシークエンシング方法の際に遭遇する曖昧さを無くす、または大きく低減させる。
本願は特定の実施形態において例えば以下の項目を提供する:
(項目1)
生体分子の配列を決定するための方法であって、
(a)該生体分子の配列文字列sの複数の部分文字列を表すk−1長の部分配列のセットを同定するステップ;
(b)該k−1長の部分配列のそれぞれについて、該k−1長の部分配列の4つの異なるkマー伸長物のプールを同定するステップ;
(c)ステップ(b)において同定された各プールについて、
(i)該プールを構成する4つのkマープローブと該生体分子をハイブリダイズさせるステップ;および
(ii)該生体分子に付着した該kマープローブの相対位置を検出するステップ;ならびに
(d)該検出された付着したプローブに対応する部分配列を順序よく配置して、該生体分子の配列文字列sを決定するステップ
を含む方法。
(項目2)
ステップ(c)における前記4つのkマープローブのそれぞれに区別可能なタグが付着されているので、所定のkマープールに使用される4つの異なる検出可能なタグが存在する、項目1に記載の方法。
(項目3)
ステップ(c)(i)が、前記プールを構成する4つすべてのkマープローブと前記生体分子をハイブリダイズさせることを含み、その後、ステップ(c)(ii)においてそれらの付着したkマープローブの相対位置を検出するので、ステップ(c)(ii)が、該プールを構成する4つすべての該kマープローブの相対位置を検出する結果となる、項目2に記載の方法。
(項目4)
ステップ(c)が、
(A)前記プールを構成する前記4つのkマープローブから選択された2つの異なるkマープローブと前記生体分子をハイブリダイズさせることであって、ここで、該2つの選択されたkマープローブには、互いに区別可能であるタグが付着していること;
(B)(A)の後、該選択されたkマープローブの両方が関与する1つ以上の結合事象が起こった場合、該生体分子に付着したそれら2つの異なるkマープローブの相対位置を検出すること;および
(C)該プールを構成する4つのkマープローブから選択された別の2つの異なるkマープローブを用いて、該プールを構成する4つのkマープローブの6ペアの組み合わせすべてについてのハイブリダイゼーションおよび検出が遂行されるまで、(A)および(B)を繰り返し、それによって該プールを構成するkマープローブの4つすべての相対位置を検出すること
を含む、項目1に記載の方法。
(項目5)
ステップ(c)が、
(A)前記プールを構成する4つのkマープローブから選択された3つのkマープローブのセットと前記生体分子をハイブリダイズさせることであって、ここで、該3つの選択されたkマープローブには、互いに区別可能であるタグが付着していること;
(B)(A)の後、該選択されたkマープローブのうちの2つまたは3つが関与する1つ以上の結合事象が起こった場合、該生体分子に付着しているそれら2つまたは3つのkマープローブの相対位置を検出すること;および
(C)該プールを構成する4つのkマープローブから選択された3つのkマープローブの異なるセットを用いて、該プールを構成する4つのkマープローブの4つの3メンバー組み合わせすべてについてのハイブリダイゼーションおよび検出が遂行されるまで、(A)および(B)を繰り返し、それによって該プールを構成する該kマープローブの4つすべての相対位置を検出すること
を含む、項目1に記載の方法。
(項目6)
ステップ(c)(ii)が、前記kマープローブの相対位置を検出するためにHANSを用いることを含む、項目1から5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
ステップ(c)(ii)が、流体チャネルもしくはポアを横切る、またはチャネルもしくはポアの流体体積内の電気信号を、前記ハイブリダイズされた生体分子がそこを通って移動する間にモニターすることを含み、該電気信号が、該生体分子のハイブリダイズされた部分および該生体分子のハイブリダイズされていない部分を示す、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記検出された電気信号が、前記生体分子にハイブリダイズされた前記kマープローブのうちの少なくとも2つの間の識別を可能にする、項目7に記載の方法。
(項目9)
ステップ(c)(ii)が、前記生体分子にハイブリダイズされたkマープローブのうちの少なくとも2つについての相対位置を示す光学信号を検出することを含む、項目1から8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記k−1長の部分配列のセットが、配列文字列s内の長さk−1のすべての可能な部分文字列を表す、項目1から9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
kが3から10までの整数である、項目1から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
sが、少なくとも100bpの長さの配列文字列である、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
生体分子の配列を決定するための方法であって、
(a)該生体分子の配列文字列sの複数の部分文字列を表すkマープローブのスペクトルを同定するステップ;
(b)該部分文字列を配置して複数の候補拡大文字列を作るステップであって、該複数の候補拡大文字列のそれぞれがステップ(a)における部分文字列すべてを含有し、各候補拡大文字列が該部分文字列すべての最短可能配置に対応する長さを有する、ステップ;
(c)該候補拡大文字列に共通する2つ以上のブランチの順序配置の曖昧さを同定し、該2つ以上のブランチのそれぞれに沿った部分文字列に対応する複数のkマープローブを同定するステップ;
(d)ステップ(c)において同定された各kマープローブについて、該生体分子を該kマープローブとハイブリダイズさせ、該生体分子に沿った該kマープローブの絶対位置の近似的尺度を得るステップ;
(e)該ブランチ内にある、ステップ(c)において同定された各kマープローブの絶対位置の尺度の平均を各ブランチについて得ること、および各ブランチについて同定された平均絶対位置尺度に従って該2つ以上のブランチを順序よく配置することにより該2つ以上のブランチの相対的順序を決定し、それによって該生体分子の配列文字列sを同定するステップ
を含む方法。
(項目14)
ステップ(a)と(d)とが同時に行われる、項目13に記載の方法。
(項目15)
ステップ(a)および(d)が、HANSを用いて行われる、項目13または14に記載の方法。
(項目16)
前記ステップ(a)が、SBHを用いて行われる、項目13に記載の方法。
(項目17)
ステップ(d)が、流体チャネルもしくはポアを横切るまたはチャネルもしくはポアの流体体積内の電気信号を、前記ハイブリダイズされた生体分子がそこを通って移動する間にモニターすることを含み、該電気信号が、該生体分子のハイブリダイズされた部分および該生体分子のハイブリダイズされていない部分を示す、項目13から16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記kマープローブのスペクトルが、前記配列文字列sの部分文字列の完全セットを表す、項目13から17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
生体分子の配列を決定するための装置であって、
(a)1セットの命令を規定するコードを記憶するメモリ;および
(b)配列文字列sのk−1長の部分配列の4つの異なるkマー伸長物の各プールについて、該プールを構成する4つのkマープローブと前記生体分子をハイブリダイズさせ、該生体分子に付着したkマープローブの相対位置を検出することによって得たデータを用いて、該命令を実行して、それにより、該生体分子に付着した検出されたプローブに対応する部分配列を順序よく配置して該生体分子の配列文字列sを決定するプロセッサ
を具備する装置。
本願発明のデバイス、システム、方法およびプロセスは、本明細書に記載する実施形態からの情報を用いて開発される変形形態および適応形態を包含すると考えられる。本明細書に記載するデバイス、システム、方法およびプロセスの適応形態および/または修正形態を関連分野の当業者は実施することができる。
特定の好ましい実施形態に関して本発明を詳細に示し、説明したが、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲を逸脱することなく、そこにある形態および詳細を様々に変化させることができることは、当業者には理解されるべきである。
Claims (12)
- 生体分子の配列を決定するための方法であって、
(a)該生体分子の配列文字列sの複数の部分文字列を表すk−1長の部分配列のセットを同定するステップ;
(b)該k−1長の部分配列のそれぞれについて、該k−1長の部分配列の4つの異なるkマー伸長物のプールを同定するステップ;
(c)ステップ(b)において同定された各プールについて、
(i)該プールを構成する4つのkマープローブと該生体分子をハイブリダイズさせるステップ;および
(ii)該生体分子に付着した該kマープローブの相対位置を検出するステップであって、ここで、ステップ(c)における該4つのkマープローブのそれぞれに区別可能なタグが付着されているので、所定のkマープールに使用される4つの異なる検出可能なタグが存在する、ステップ;ならびに
(d)該検出された付着したプローブに対応する部分配列を順序よく配置して、該生体分子の配列文字列sを決定するステップ
を含み、ここで、該生体分子がDNAまたはRNA分子である、方法。 - ステップ(c)(i)が、前記プールを構成する4つすべてのkマープローブと前記生体分子をハイブリダイズさせることを含み、その後、ステップ(c)(ii)においてそれらの付着したkマープローブの相対位置を検出するので、ステップ(c)(ii)が、該プールを構成する4つすべての該kマープローブの相対位置を検出する結果となる、請求項1に記載の方法。
- ステップ(c)が、
(A)前記プールを構成する前記4つのkマープローブから選択された2つの異なるkマープローブと前記生体分子をハイブリダイズさせることであって、ここで、該2つの選択されたkマープローブには、互いに区別可能であるタグが付着していること;
(B)(A)の後、該選択されたkマープローブの両方が関与する1つ以上の結合事象が起こった場合、該生体分子に付着したそれら2つの異なるkマープローブの相対位置を検出すること;および
(C)該プールを構成する4つのkマープローブから選択された別の2つの異なるkマープローブを用いて、該プールを構成する4つのkマープローブの6ペアの組み合わせすべてについてのハイブリダイゼーションおよび検出が遂行されるまで、(A)および(B)を繰り返し、それによって該プールを構成するkマープローブの4つすべての相対位置を検出すること
を含む、請求項1に記載の方法。 - ステップ(c)が、
(A)前記プールを構成する4つのkマープローブから選択された3つのkマープローブのセットと前記生体分子をハイブリダイズさせることであって、ここで、該3つの選択されたkマープローブには、互いに区別可能であるタグが付着していること;
(B)(A)の後、該選択されたkマープローブのうちの2つまたは3つが関与する1つ以上の結合事象が起こった場合、該生体分子に付着しているそれら2つまたは3つのkマープローブの相対位置を検出すること;および
(C)該プールを構成する4つのkマープローブから選択された3つのkマープローブの異なるセットを用いて、該プールを構成する4つのkマープローブの4つの3メンバー組み合わせすべてについてのハイブリダイゼーションおよび検出が遂行されるまで、(A)および(B)を繰り返し、それによって該プールを構成する該kマープローブの4つすべての相対位置を検出すること
を含む、請求項1に記載の方法。 - ステップ(c)(ii)が、前記kマープローブの相対位置を検出するために、ハイブリダイゼーション支援ナノポアシークエンシング(HANS)を用いることを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)(ii)が、流体チャネルもしくはポアを横切る、またはチャネルもしくはポアの流体体積内の電気信号を、前記ハイブリダイズされた生体分子がそこを通って移動する間にモニターすることを含み、該電気信号が、該生体分子のハイブリダイズされた部分および該生体分子のハイブリダイズされていない部分を示す、請求項5に記載の方法。
- 前記検出された電気信号が、前記生体分子にハイブリダイズされた前記kマープローブのうちの少なくとも2つの間の識別を可能にする、請求項6に記載の方法。
- ステップ(c)(ii)が、前記生体分子にハイブリダイズされたkマープローブのうちの少なくとも2つについての相対位置を示す光学信号を検出することを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記k−1長の部分配列のセットが、配列文字列s内の長さk−1のすべての可能な部分文字列を表す、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- kが3から10までの整数である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- sが、少なくとも100bpの長さの配列文字列である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 生体分子の配列を決定するための装置であって、
(a)1セットの命令を規定するコードを記憶するメモリ;および
(b)配列文字列sのk−1長の部分配列の4つの異なるkマー伸長物の各プールについて、該プールを構成する4つのkマープローブと前記生体分子をハイブリダイズさせ、該生体分子に付着したkマープローブの相対位置を検出することによって得たデータを用いて、該命令を実行して、それにより、該生体分子に付着した検出されたプローブに対応する部分配列を順序よく配置して該生体分子の配列文字列sを決定するプロセッサ
を具備し、ここで、該4つのkマープローブのそれぞれに区別可能なタグが付着されているので、所定のkマープールに使用される4つの異なる検出可能なタグが存在し、該生体分子がDNAまたはRNA分子である装置。
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