JP2003508066A - タンパク質−ｄｎａ相互作用の染色体全体の解析 - Google Patents

タンパク質−ｄｎａ相互作用の染色体全体の解析

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JP2003508066A JP2001520923A JP2001520923A JP2003508066A JP 2003508066 A JP2003508066 A JP 2003508066A JP 2001520923 A JP2001520923 A JP 2001520923A JP 2001520923 A JP2001520923 A JP 2001520923A JP 2003508066 A JP2003508066 A JP 2003508066A
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ウィリック，ジョン
ヤング，リチャード，エイ．
レン，ビング
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ホワイトヘッド インスチチュート フォアー バイオメディカル リサーチ
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Abstract

(57)【要約】 本発明は目的タンパク質が結合する細胞のゲノム内の（１つまたはそれ以上の）領域を同定する方法に関する。本明細書に記載する方法では細胞のＤＮＡ結合タンパク質は細胞のゲノムＤＮＡに結合（例えば共有結合により架橋）する。ＤＮＡ結合タンパク質が結合したゲノムＤＮＡを取り出し、同定されたゲノムＤＮＡと細胞のゲノムＤＮＡに相補的な配列との間でハイブリダイゼーションが起こる条件下で、該ゲノムＤＮＡに相補的な配列を含んでなるＤＮＡと合わせるかまたは接触させる。ハイブリダイゼーションの（1 つまたは複数の）領域は該タンパク質が結合する細胞のゲノム内の（1 つまたは複数の）領域である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 多くのタンパク質はゲノムの特定の部位に結合する能力によりゲノム発現、染
色体複製および細胞増殖機能の調節に関与する。例えば転写アクチベーターは特
定のプロモーター配列に結合し、クロマチン修飾複合体および転写器官(apparat
us) を動員(recruit) し、ＲＮＡ合成を開始する。細胞が細胞サイクルを回る場
合、または細胞が環境の変化を感じるときに、転写アクチベーターのＤＮＡ結合
状態の変化により遺伝子発現のリモデリングがいくらか生じる。別のＤＮＡ結合
タンパク質はまたセントロメア、テロメアおよびＤＮＡ複製起点にも結合し、染
色体複製および維持を調節する。遺伝子発現およびＤＮＡ複製の多くの基本的な
態様のかなりの知識がＤＮＡ結合タンパク質の研究から得られているが、これら
のタンパク質およびその機能の理解はゲノムの結合部位に対する知識により限定
されている。
【０００２】 ＤＮＡの特定の領域に結合するタンパク質を公知の方法を用いて検出できる。
しかしながら、生物の全ゲノムのわたるＤＮＡに対するタンパク質結合を研究で
きる方法が必要とされている。
【０００３】 発明の開示 本発明は目的タンパク質が結合する細胞のゲノムの（１つまたはそれ以上の）
領域を同定する方法に関する。本明細書に記載する方法では細胞のＤＮＡ結合タ
ンパク質は細胞のゲノムＤＮＡに結合（例えば共有結合により架橋）する。同定
されたゲノムＤＮＡとゲノムＤＮＡに相補的な配列との間でハイブリダイゼーシ
ョンが起こる条件下で、ＤＮＡ結合タンパク質が結合するゲノムＤＮＡが同定さ
れ、細胞のゲノムＤＮＡ（例えば細胞のゲノムＤＮＡの全てまたは一部、例えば
１つまたはそれ以上の染色体または染色体領域）に相補的な配列を含んでなるＤ
ＮＡと合わせるかまたは接触させる。ハイブリダイゼーションの（1 つまたは複
数の）領域は目的タンパク質が結合する細胞のゲノムの（1 つまたは複数の）領
域である。本発明の方法は好ましくは生存細胞を用いて実施される。
【０００４】 １つの態様では、細胞でＤＮＡに結合するタンパク質を該細胞のＤＮＡに架橋
する。タンパク質が結合したＤＮＡおよびタンパク質が結合していないＤＮＡを
含む、得られた混合物を剪断条件に供する。結果的にＤＮＡ結合タンパク質に架
橋したゲノムのＤＮＡフラグメントを生じ、目的タンパク質が結合した（１つま
たはそれ以上の）ＤＮＡフラグメントが混合物から取り出される。次いで公知の
方法を用いて、得られたＤＮＡフラグメントを目的タンパク質から分離し、増幅
する。ＤＮＡフラグメントとゲノムＤＮＡに相補的な配列の領域との間でハイブ
リダイゼーションが起こる条件下で、ＤＮＡフラグメントを細胞のゲノムＤＮＡ
に相補的な配列を含んでなるＤＮＡと合わせ；ＤＮＡフラグメントがハイブリダ
イズするゲノムＤＮＡに相補的な配列の領域を同定する。同定された（１つまた
はそれ以上の）領域は細胞のゲノムの領域、例えば目的タンパク質が結合する１
つまたは複数の選別された染色体である。
【０００５】 特定の態様では、本発明は目的タンパク質が結合する細胞のゲノムの領域（例
えば染色体の領域）を同定する方法に関し、該方法ではホルムアルデヒドを用い
て細胞のＤＮＡ結合タンパク質を細胞のゲノムＤＮＡに架橋する。架橋したゲノ
ムのＤＮＡフラグメントを生じ、例えば目的タンパク質に特異的に結合する抗体
を用いる免疫沈降により、目的タンパク質が結合するＤＮＡフラグメントを混合
物から除去または分離する。結果的にＤＮＡ−タンパク質複合体が分離される。
例えば複合体を、架橋を逆戻りさせる条件に供することにより、複合体のＤＮＡ
フラグメントを目的タンパク質から分離する。分離したＤＮＡフラグメントをラ
イゲーション媒介ポリメラーゼ連鎖反応（ligation-mediated polymerase chain
reaction）（ＬＭ−ＰＣＲ）を用いて増幅し、次いで蛍光標識する。ＤＮＡフ
ラグメントとゲノムＤＮＡに相補的な配列の領域との間でハイブリダイゼーショ
ンが起こる条件下で、標識されたＤＮＡフラグメントを細胞のゲノムＤＮＡに相
補的な配列を含んでなるＤＮＡマイクロアレイと接触させる。ＤＮＡフラグメン
トがハイブリダイズするゲノムＤＮＡに相補的な配列の領域が蛍光強度を測定す
ることにより同定され、ＤＮＡフラグメントがハイブリダイズするゲノムＤＮＡ
に相補的な配列の領域の蛍光強度を対照の蛍光強度と比較する。ゲノムＤＮＡに
相補的な配列の該領域の対照の蛍光強度よりも大きい、ゲノムＤＮＡに相補的な
配列の領域の蛍光強度は目的タンパク質が結合する細胞のゲノムの領域を示す。
【０００６】 細胞のゲノムＤＮＡに結合する目的タンパク質の機能を決定する方法もまた本
発明に包含される。この方法では、細胞のＤＮＡ結合タンパク質を細胞のゲノム
ＤＮＡに架橋する。次いでＤＮＡ結合タンパク質に架橋するゲノムのＤＮＡフラ
グメントを前記するように作製し、目的タンパク質が結合する（１つまたはそれ
以上の）ＤＮＡフラグメントを混合物から除去する。得られたＤＮＡフラグメン
トを次いで目的タンパク質から分離し、増幅する。ＤＮＡフラグメントとゲノム
ＤＮＡに相補的な配列の領域との間でハイブリダイゼーションが起こる条件下で
、ＤＮＡフラグメントを細胞のゲノムＤＮＡに相補的な配列を含んでなるＤＮＡ
と合わせ、ＤＮＡフラグメントがハイブリダイズするゲノムＤＮＡに相補的な配
列の領域を同定する。この同定された領域は目的タンパク質が結合する細胞のゲ
ノムの領域である。同定された領域を特性付けし、同定された領域の特徴は目的
タンパク質の機能を示す（例えば、転写因子、オンコプロテインのような調節タ
ンパク質）。
【０００７】 本発明はまた細胞のゲノムＤＮＡに結合する目的タンパク質が転写因子として
機能するかどうかを決定する方法に関する。１つの態様では、細胞のＤＮＡ結合
タンパク質を細胞のゲノムＤＮＡに架橋する。架橋したゲノムのＤＮＡフラグメ
ントを作製し、目的タンパク質が結合するＤＮＡフラグメントを混合物から除去
する。得られたＤＮＡフラグメントを目的タンパク質から分離し、増幅する。Ｄ
ＮＡフラグメントとゲノムＤＮＡに相補的な配列の領域との間でハイブリダイゼ
ーションが起こる条件下で、ＤＮＡフラグメントを細胞のゲノムＤＮＡに相補的
な配列を含んでなるＤＮＡと合わせる。ＤＮＡフラグメントがハイブリダイズす
るゲノムＤＮＡに相補的な配列の領域が同定される；ここでゲノムの領域は調節
領域であり、そして目的タンパク質は転写因子である。
【０００８】 本明細書に記載する方法はゲノム全体にわたる遺伝子発現の細胞調節ネットワ
ークの解明を促し、遺伝子機能の同定を助ける。
【０００９】 本特許のファイルは少なくとも１枚のカラーで製作された図面を含む。カラー
の（複数の）図面を有する本特許のコピーは、要請し、必要な手数料を支払うと
米国特許庁（Ｐａｔｅｎｔ ａｎｄ Ｔｒａｄｅｍａｒｋ Ｏｆｆｉｃｅ）によ
り提供される。
【００１０】 発明の詳細な説明 インビボでこれらのタンパク質が機能する染色体位置を同定することにより、
どのようにＤＮＡ結合タンパク質が遺伝子発現、染色体複製および細胞増殖全体
を制御するかを理解することが容易になる。本明細書にてＤＮＡ結合タンパク質
に関するゲノム全体位置プロファイリング法（genome-wide location profiling
method ）について記載し、これを用いて遺伝子特異的転写因子および酵母細胞
における一般的な転写器官の成分の結合動態をモニター観察した。ゲノム全体位
置分析法(genome-wide location method) は転写アクチベーターＧａｌ４および
Ｓｔｅ１２の作用の公知の部位を正確に同定し、これらのアクチベーターの予期
しない機能を明らかにした。発現および位置プロファイルの合わせにより、細胞
が細胞外環境の変化に応答する場合に発現が特異的アクチベーターおよび転写器
官の成分の直接の制御下にある遺伝子の全体の組が同定された。ゲノム全体位置
分析により、さらに遺伝子調節ネットワークを解明する強力な手段が提供され、
遺伝子機能が注釈され、ゲノムがどのように複製されるか探求される。
【００１１】 従って、本発明は生物のゲノムのＤＮＡ（例えばゲノム全体またはその一部、
例えば１つまたはそれ以上の染色体または染色体領域）に対するタンパク質の結
合を検討方法を提供する。とりわけ、本発明は目的タンパク質が結合する細胞の
ゲノムＤＮＡの（１つまたはそれ以上の）領域を同定する方法に関する。１つの
態様では、細胞内でＤＮＡに結合するタンパク質は細胞のＤＮＡとに架橋する。
タンパク質が結合したＤＮＡおよびタンパク質が結合していないＤＮＡを含有す
る、得られた混合物を剪断条件に供する。結果的に、ＤＮＡ結合タンパク質に架
橋したゲノムのＤＮＡフラグメントを作製し、目的タンパク質が結合する（１つ
またはそれ以上の）ＤＮＡフラグメントを混合物から除去する。次いで得られた
ＤＮＡフラグメントを目的タンパク質から分離し、公知の方法を用いて増幅する
。次いでＤＮＡフラグメントとゲノムＤＮＡに相補的な配列との間でハイブリダ
イゼーションが起こる条件下で、ＤＮＡフラグメントを細胞のゲノムＤＮＡに相
補的な配列を含んでなるＤＮＡと合わせ；そしてＤＮＡフラグメントがハイブリ
ダイズするゲノムＤＮＡに相補的な配列の領域を同定する。同定された領域は目
的タンパク質が結合する細胞のゲノムの領域である。
【００１２】 細胞のゲノムＤＮＡに結合する目的タンパク質の機能を決定する方法もまた本
発明に包含される。この方法では、細胞のＤＮＡ結合タンパク質を細胞のゲノム
ＤＮＡに架橋する。次いでＤＮＡ結合タンパク質に架橋したゲノムのＤＮＡフラ
グメントを上述したように作製し、目的タンパク質が結合した（１つまたはそれ
以上の）ＤＮＡフラグメントを除去する。次いで得られたＤＮＡフラグメントを
目的タンパク質から分離し、増幅する。次いでＤＮＡフラグメントとゲノムＤＮ
Ａに相補的な配列の領域との間でハイブリダイゼーションが起こる条件下で、Ｄ
ＮＡフラグメントを細胞のゲノムＤＮＡに相補的な配列を含んでなるＤＮＡと合
わせ；そしてＤＮＡフラグメントがハイブリダイズするゲノムＤＮＡに相補的な
配列の領域が同定され、目的タンパク質が結合する細胞のゲノムの領域が同定さ
れる。同定された領域を特性付けし（例えば調節領域）、同定された領域の特徴
が目的タンパク質の機能を示す（例えば転写因子、オンコプロテイン）。
【００１３】 本発明はまた細胞のゲノムＤＮＡに結合する目的タンパク質が転写因子として
機能するかどうかを決定する方法にも関する。１つの態様では、細胞のＤＮＡ結
合タンパク質を細胞のゲノムＤＮＡに架橋し、架橋されたゲノムのＤＮＡフラグ
メントを作製する。目的タンパク質が結合するＤＮＡフラグメントを除去する。
得られたＤＭＡフラグメントを目的タンパク質から分離し、増幅する。ＤＮＡフ
ラグメントとゲノムＤＮＡに相補的な配列との間でハイブリダイゼーションが起
こる条件下で、ＤＮＡフラグメントを細胞のゲノムＤＮＡに相補的な配列を含ん
でなるＤＮＡと合わせる。ＤＮＡフラグメントがハイブリダイズするゲノムＤＮ
Ａに相補的な配列の領域が同定され、ここでゲノムの領域が調節領域である場合
、目的タンパク質は転写因子である。
【００１４】 本発明の方法を用いて真核生物のゲノム全体にわたるタンパク質のＤＮＡ結合
を試験(examine) および／または同定することができる。例えば、酵母、ショウ
ジョウバエおよびヒトのような真核生物のゲノム全体にわたるＤＮＡ結合タンパ
ク質を分析できる。あるいは、これを用いて目的の染色体全体または染色体の組
に対するタンパク質のＤＮＡ結合を試験および／または同定することができる。
【００１５】 ＤＮＡに結合する種々のタンパク質を分析できる。例えば、ＤＮＡ複製に関係
するいずれかのタンパク質、例えば転写因子、またはオンコプロテインを本発明
の方法で試験できる。
【００１６】 細胞のＤＮＡ結合タンパク質を細胞のゲノムに結合するのに用いることができ
る種々の方法がある。例えば、ＵＶ光を用いることができる。特定の態様では、
ホルムアルデヒドを用いてＤＮＡ結合タンパク質を細胞のゲノムＤＮＡに架橋す
る。
【００１７】 本発明の方法では、種々の方法を用いて、目的タンパク質に結合したＤＮＡフ
ラグメントの同定が、目的タンパク質に結合した（複数の）ＤＮＡフラグメント
および目的タンパク質に結合していないＤＮＡフラグメントを含んでなる混合物
から除去できる。例えば、抗体（例えばポリクローナル、モノクローナル）また
は目的タンパク質に（特異的に）結合するその抗原結合フラグメントを使用する
免疫沈降を用いることができる。加えて、例えば抗体エピトープ（例えば赤血球
凝集素（ＨＡ））を用いて目的タンパク質を標識またはタグ化できる。
【００１８】 本明細書に記載した方法におけるＤＮＡフラグメントを例えばライゲーション
媒介ポリメラーゼ連鎖反応（例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編（１９
９１）、その教示は出展明示により本明細書の一部とする）を用いて増幅するこ
とができる。
【００１９】 種々の方法を用いて、細胞のゲノムの相補的な配列を含んでなるＤＮＡを、目
的タンパク質が結合する単離されたＤＮＡフラグメントと合わせることができる
。例えば、相補的な配列をガラススライド上（例えばＣｏｒｎｉｎｇ Ｍｉｃｒ
ｏａｒｒａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＭＴ（商標））ＧＡＰＳ（商標）））
またはマイクロチップ上で固定できる。本発明の方法で用いるハイブリダイゼー
ションの条件には、例えば高ストリンジェント条件および／または穏やかな(mod
erate)ストリンジェント条件などがある。例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙの２．１０．１−２．１０
．１６（とりわけ２．１０．８−１１）頁および６．３．１−６頁を参照。プロ
ーブの長さ、塩基組成、ハイブリダイズする配列間の誤対合パーセント、温度お
よびイオン強度のような因子がハイブリダイゼーションの安定性に影響する。従
って、高度なまたは穏やかなストリンジェント条件を経験的に決定でき、いくら
かは公知の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）および、それに対するハイブリダイゼーショ
ンが評価されるその他の核酸の特性に依存する。
【００２０】 本発明の方法はさらに結果を対照と比較することを含んでよい。例えば、１つ
の態様では、ＤＮＡ結合タンパク質ではない対照タンパク質を用いて本発明の方
法を実施できる。１つの態様ではＨＡまたはＭＹＣエピトープタグに対する抗体
を用いて免疫沈降を実施する。タグを含有する目的タンパク質およびタグを有さ
ない目的タンパク質を免疫沈降した結果を比較する。タグ化していないタンパク
質は免疫沈降されないはずであり、従って陰性対照として機能する。
【００２１】 実施例で記載するように、本発明の特定の態様はクロマチン免疫沈降（ＣｈＩ
Ｐ）およびゲノム全体の発現のモニター観察マイクロアレイの合わせの使用を含
んでなる。クロマチン免疫沈降によりＤＮＡの特定の領域に結合するタンパク質
を検出するのが可能になる。これには４つの工程がある：（１）生存細胞におい
てタンパク質をＤＮＡにホルムアルデヒド架橋すること、（２）細胞を破砕し、
次いで超音波処理して架橋ＤＮＡの小フラグメントを生じること、（３）目的タ
ンパク質に特異的に結合する抗体を用いてタンパク質−ＤＮＡ架橋体を免疫沈降
すること、および（４）架橋を逆戻りさせ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を
用いて目的のＤＮＡ領域を増幅することである。非免疫沈降対照と比較してＰＣ
Ｒ産物を分析することにより、目的タンパク質が試験されるＤＮＡ領域に結合す
るかどうかを決定する。しかしながら、ＤＮＡの各領域は個々にＰＣＲにより試
験されなければならない。従って、ＣｈＩＰ技術は試験対象に選択されたＤＮＡ
領域の小数の組に限定される。
【００２２】 対照的に、本発明の方法は特定のプライマーでＰＣＲを実施することにより個
々のＤＮＡ領域を増幅するという限定はない。むしろライゲーション媒介ＰＣＲ
（ＬＭＰＣＲ）ストラテジーを用いて全ゲノムが増幅される。ＬＭ−ＰＣＲ反応
に蛍光的にタグ化されたヌクレオチドを含めることにより、増幅されたＤＮＡを
蛍光的に標識した。最終的に、標識ＤＮＡをゲノムの全てまたはサブセット（例
えば１つまたは複数の染色体）を表すスポットを含有するＤＮＡマイクロアレイ
にハイブリダイズさせた。非免疫沈降対照に対するマイクロアレイ上の各スポッ
トの蛍光強度はＤＮＡ領域に結合した目的タンパク質がその特定のスポットに位
置するかどうかを示した。従って、本明細書に記載する方法によりゲノム全体に
わたるタンパク質−ＤＮＡ相互作用の検出が可能になる。
【００２３】 とりわけ、大部分の酵母染色体ＩＩＩおよび発現が十分研究されているおよそ
１５個のモデル遺伝子からなるＤＮＡマイクロアレイを構築した。これらのアレ
イをＣｈＩＰ技術と合わせて使用して、転写因子のＤＮＡ結合特性およびゲノム
全体の転写器官を研究した。本明細書に記載する方法により真核細胞における遺
伝子発現のメカニズムおよび調節が洞察される。
【００２４】 本明細書に記載するゲノム全体位置分析法により酵母ゲノム全体にわたりタン
パク質−ＤＮＡ相互作用をモニター観察することが可能になり、これを図１に図
解する。該方法は１つまたは少数の特異的ＤＮＡ部位でインビボタンパク質−Ｄ
ＮＡ相互作用を研究するために以前に使用した修正クロマチン免疫沈降（ＣｈＩ
Ｐ）法をＤＮＡマイクロアレイ分析とを併用する。簡単には、細胞をホルムアル
デヒドで固定し、超音波処理により回収し、目的タンパク質に架橋したＤＮＡフ
ラグメントを特異的抗体を用いる免疫沈降により富化する。架橋を逆戻りさせた
後、富化されたＤＮＡを増幅し、ライゲーション媒介ＰＣＲ（ＬＭ−ＰＣＲ）を
用いて蛍光色素で標識する。免疫沈降により富化されたＤＮＡのサンプルを異な
る蛍光体の存在下ＬＭ−ＰＣＲに供し、標識ＤＮＡのＩＰ富化および非富化の双
方のプールを全酵母遺伝子間配列を含有する単一のＤＮＡマイクロアレイにハイ
ブリダイズさせる。３つの別個の実験から得られた蛍光強度のＩＰ富化／非富化
比率を、加重平均分析法を用い、アレイ上に提示された各配列に対する目的タン
パク質の相対結合を算出できる（図２参照）。
【００２５】 全体位置のプロファイリング法の４つの特徴は一貫して高品質な結果のために
重要であることが見出された。第１に、一貫したスポット品質を有するＤＮＡマ
イクロアレイおよび均一なシグナルバックグラウンドは明白な役割を果たす。本
明細書に記載する技術により作成した画像の例を図５Ａに示す。第２に、本明細
書に記載するＬＭ−ＰＣＲ法を開発して、極少量のＤＮＡの再現性のある増幅が
可能になった；１ｎｇのゲノムＤＮＡの個別のサンプルをＬＭ−ＰＣＲ法で増幅
した場合、遺伝子の９９．９％以上に対するシグナルは、誤差範囲内で本質的に
同一であった（図５Ｂ）。第３に、各実験を３連で実施し、再現性のある結合デ
ータの評価が可能になった。そして第４に、Ｈｕｇｈｓら（２０００）により記
載された単一アレイエラーモデルを、低強度スポットと関係するノイズを扱い、
適当な重量を有する反復実験を平均化するように適用した。
【００２６】 少量のＤＮＡの定量的増幅により低強度スポットに関するいくらかの不確実性
を生じる。その不確実性を追跡し、適当な関連する重量で反復実験を平均化でき
るように、最初にＨｕｇｈｓら（２０００）に記載された、単一アレイエラーモ
デルに適用した。このエラーモデルに従って、スポットでの測定比率の有意性が
統計値Ｘにより定義され、これは式： Ｘ＝（ａ2 −ａ1 ）／［σ1 2＋σ2 2＋ｆ2 （ａ1 2＋ａ2 2）］1/2 （１） ここでａ1,2 は各スポットに関して２つのチャネルで測定した強度であり、σ1, 2 はバックグラウンドを減じるために不定であり、ｆは例えばハイブリダイゼー
ションの非一貫性、色素取り込み効率の変動、スキャナー利得変動等の分別乗法
エラー(fractional multiplicative error) である； の形態をとる。Ｘはほぼ正規である。パラメーターσおよびｆをＸが単位分散を
有するように選択した。次いで大きさ｜ｘ｜の変化の有意性を： ｐ＝２×（１−Ｅｒｆ｜Ｘ｜） （２） として算出する。
【００２７】 本発明をとりわけその好ましい態様を参考に示し記載したが、添付の請求の範
囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、本発明において形態および
詳細の種々の変更を為すことができることは当業者に理解されよう。
【００２８】 実施例 実施例１ 酵母染色体ＩＩＩおよびタンパク質−ＤＮＡ相互作用を特性付けするために選
択される遺伝子モデルアレイの設計 アレイは染色体ＩＩＩの全ての非重複オープン・リーディング・フレーム（Ｏ
ＲＦ）を含む（表を参照）。配列が２つの可能なリーディング・フレームの一部
または全てを含む場合、ＯＲＦとしてより大きな配列を選択した。残りの配列は
いずれも遺伝子間フラグメントに含まれた。
【００２９】 １００塩基対よりも大きな全ての遺伝子間領域を平均５００塩基対のフラグメ
ントにより提示する。領域が７００塩基対よりも大きい場合、３００ないし６０
０塩基対の複数のフラグメントに分ける。各領域のＰＣＲプライマーをスタンフ
ォード大学（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のサッカロミセス・ゲ
ノミック・データベース（ＳＧＤ）「設計プライマー」プログラムを用いて選択
した。染色体ＩＩＩに関する遺伝子間フラグメントの全数は２４１に等しい。
【００３０】 オープン・リーディング・フレームの位置および大きさをサッカロミセス・ゲ
ノミック・データベース（ＳＧＤ）機能的染色体マップから決定した。
【００３１】 さらなる１７個のモデル遺伝子（表を参照）を転写に関する文献における引用
の頻度の高さに基づいて選別した。各遺伝子をコーディング領域の１ないし２キ
ロ塩基対上流および５００塩基対下流も同様に増幅した。
【００３２】 ＣｈＩＰ−マイクロアレイプロトコル 非修飾酵母ＯＲＦ ＤＮＡのＰＣＲ生成 １００μｌでの反応で通常約５ないし６μｇのＤＮＡを生成する。 ＲＸＮミックス： １０×ＰＣＲバッファー １０．０μｌ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ａｍｐｌ
ｉＴａｑ） ２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ８．０μｌ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＡｍｐｌｉＴ
ａｑ） １０×ｄＮＴＰ １０．０μｌ（各々２ｍＭ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ １００ｍＭ
ストック） ＯＲＦ ＤＮＡ １．０ないし２．０μｌ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ，およそ１０ｎｇ） 各汎用プライマー ２．５μｌ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０μ
Ｍ 溶液） 希釈Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ １．６μｌ（水で１：１００に希釈、Ｓｔｒ
ａｔｅｇｅｎｅ、０．０２Ｕ） ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ １．０μｌ（５単位、Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ） ｄｄＨ2 Ｏ ６３．４μｌ
【００３３】 酵母遺伝子間領域のＰＣＲ生成 １００μｌの反応物で通常およそ５ないし６μｇのＤＮＡを生成する。 ＲＸＮミックス： １０×ＰＣＲバッファー １０．０μｌ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ａｍｐｌ
ｉＴａｑ） ２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ８．０μｌ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＡｍｐｌｉＴ
ａｑ） １０×ｄＮＴＰ １０．０μｌ（各々２ｍＭ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ １００ｍＭ
ストック） 酵母ゲノムＤＮＡ １．０μｌ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，およそ
１００ｎｇ） 各プライマー ５．０μｌ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０μＭ
溶液） 希釈Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ １．６μｌ（水で１：１００に希釈、Ｓｔｒ
ａｔｅｇｅｎｅ、０．０２Ｕ） ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ １．０μｌ（５Ｕ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ） ｄｄＨ2 Ｏ ５８．４μｌ
【００３４】 ＯＲＦおよび遺伝子間ＤＮＡのためのサイクル ９５℃３分 ３０サイクルの、 ９４℃３０秒 ６０℃３０秒 ７２℃２分
【００３５】 ＰＣＲクリーンアップ 以下を例外として製造者プロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ
９６ＰＣＲ精製キットにより反応物を清浄した。ＤＮＡをＴ．Ｅ．８．０（１０
ｍｍ Ｔｒｉｓ、１ｍｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）１２０μｌで溶出した。Ｔ．
Ｅ．８．０をＱｉａｇｅｎ膜に負荷し、溶出前に５分間置いた。ＤＮＡをＣｏｒ
ｎｉｎｇポリプロピレン９６ウェルプレートに収集した。
【００３６】 アガロースゲル上で精製ＤＮＡ１μｌを可視化して反応物を定量し、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で切断した既知量のラムダＤＮＡと比較した。
【００３７】 ＤＮＡをプリンティングの直前まで−２０で保存した。次いでＣｏｒｎｉｎｇ
マイクロタイタープレート急速減圧（ｓｐｅｅｄ ｖａｃ）によりＤＮＡを５μ
ｌ未満まで乾燥した。
【００３８】 プリンティング ＰＣＲ反応物を３×ＳＳＣ中およそ０．５ｍｇ／ｍｌに懸濁した。ＳＳＣを２
０倍ストック（３Ｍ ＮａＣｌ，０．３Ｍ クエン酸Ｎａ3 ・２Ｈ2 Ｏ、ＨＣｌ
でｐＨを７．０に）として作製し、Ｈ2 Ｏで望ましい濃度に希釈した。
【００３９】 １０ないし１５μｌのＤＮＡをＣｏｒｎｉｎｇ９６または３８４ウェルプレー
トに置き、Ｃａｒｔｅｓｓｉａｎ Ｒｏｂｏｔを用いてＧＡＰＳ被覆スライドを
プリントした。ＰＣＲ産物は２５０ｐｂ以上であるべきである。
【００４０】 スライド処理 １．高温ｄｄＨ2 Ｏの皿にスライドを載せることによりアレイを再水和（約１０
秒）。 ２．１００℃高温プレート上約３秒間、各アレイを急速(snap)乾燥（ＤＮＡ側を
上にする）。 ３．６０ミリジュールにセットしたＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒを用いてガラスに
ＤＮＡをＵＶ Ｘ−結合。 ４．ｎ−メチルピリリジノン(pyrrilidinone) ３１５ｍｌ中無水コハク酸（Ａｌ
ｄｒｉｃｈ）５ｇを溶解。 ５．これに０．２Ｍ ホウ酸Ｎａ（ｐＨ８．０）３５ｍＬを添加、溶解するまで
攪拌（ＮａＯＨでホウ酸ｐＨ決定）。 ６．この溶液中に、１５分間振盪してアレイを浸漬。 ７．アレイを９５℃水浴に２分間移す。 ８．アレイを９５％ ＥｔＯＨに１分間、迅速に移す。 ９．アレイ側をわずかな角度で上向け（垂直に近づける）、スライドを風乾。
【００４１】 スライドの予備ハイブリダイゼーション １．３．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）
中、Ｃｏｐｌｉｎジャーで５０℃で２０分間、スライドをインキュベート（Ｃｏ
ｐｌｉｎジャーを水浴中に置く）。 ２．スライドを水、次いでイソプロパノールに浸して洗浄。 ３．アレイ側をわずかな角度で上向け（垂直に近づける）、風乾。
【００４２】 プローブ調製 １．小型のカバーガラス（２５ｍｍ2 ）にはプローブ容量を２０ないし３０μｌ
に、大型のカバーガラス（２４( ６０ｍｍ）にはプローブ容量を４０ないし６０
μｌにすべきである。 ２．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔＲＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）１０μｇを含む３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でプローブ（ｃＤＮＡまたは
ＰＣＲ用）を最終ハイブリダイゼーション容量にする。 ３．加熱ブロックで３ないし５分間沸騰。 ４．氷上で急速冷却。そして回転。
【００４３】 ハイブリダイゼーション １．プローブをスライドにピペッティング。気泡形成しないようにして液体にカ
バーガラスを落とす。 ２．ハイブリダイゼーションチャンバー中５０℃の水浴上に組み込む。クランプ
で閉じる。 ３．５０℃の水浴に一晩浸漬。
【００４４】 スキャニング １．ハイブリダイゼーション表面(right) 側を上にして取り外す。 ２．指またはピンセットを用いてカバーガラスを除去。 ３．０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中室温で５ないし１０分間置く。 ４．スライドを０．１×ＳＳＣに２．５分間、そして再度２．５分間移す。 ５．吹き付け乾燥し、スライドをスキャン。
【００４５】 データ分析 スキャニングにより得られたデータをＩｍａＧｅｎｅソフトウェアを用いて分
析した。
【００４６】
【００４７】
【００４８】
【００４９】
【００５０】
【００５１】
【００５２】
【００５３】
【００５４】 実施例２ ＤＮＡ結合タンパク質のゲノム全体の位置および機能 Ｇａｌ４結合部位の包括的分析 ゲノム全体位置分析法の精度を調べるために、該分析を用いて酵母ゲノムの転
写アクチベーターＧａｌ４による結合部位を同定した。とりわけ最もよく特性付
けされた転写アクチベーターであり、ガラクトース代謝に必要な１０個の遺伝子
の誘導に寄与することが知られているためにＧａｌ４を選択し、ＧＡＬ遺伝子の
プロモーターのＧＡｌ４のコンセンサスＤＮＡ結合配列（ＵＡＳG ）を同定した
。細胞をグルコース中で成長させた場合（抑制状態）、極わずかなＧａｌ４しか
ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーターのＵＡＳG に結合しないが、ガラクトー
ス中では比較的高レベルのＧａｌ４が結合する。
【００５５】 以下により詳細に記載する３つの独立した実験で、グルコースおよびガラクト
ースの双方の培地中でエピトープタグ化Ｇａｌ４ｐのゲノム全体位置を試験した
。位置分析実験により、以前にＧａｌ４により調節されると報告された７個の遺
伝子および単独の炭素源としてガラクトースを利用する細胞に生理学的に関連す
る活性をコードするさらに３つの遺伝子を同定したが、これらは、以前にはこの
アクチベーターにより調節されることは知られていなかった（図６Ａ）。
【００５６】 本明細書に記載する分析基準（ｐ値＜０．００００１）によりプロモーター領
域にＧａｌ４が結合している可能性が最も高い２４個の遺伝子の組を図６Ａに列
挙する。しかしながら、Ｇａｌ４が結合する遺伝子間領域を共有する遺伝子のサ
ブセットのみがこのアクチベーターにより調節されるので（図６Ｂ）、Ｇａｌ４
はこれらの遺伝子全てを機能的に活性化しない。Ｇａｌ４が結合し、かつガラク
トースで活性化される遺伝子を同定するために、ゲノム全体発現分析を実施した
。図６Ａの上側パネルはガラクトース中で発現が誘導される遺伝子を示し、一方
下側パネルは発現がガラクトースに依存しない遺伝子を示す。以前にＧａｌ４（
ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ３、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ８０およびＧＣ
Ｙ１）に調節されると報告された７個の遺伝子はＧａｌ４に結合し、ガラクトー
ス中で活性化された。以前には発現がＧａｌ４アクチベーターとは関連づけられ
ていなかった３個の遺伝子、ＭＴＨ、ＰＣＬ１０およびＦＵＲ４にもまたＧａｌ
４が結合し、ガラクトース中で活性化されることが見出された。実質的には、予
想どおりグルコース中での方が成長した細胞のこれらのプロモーターの各々と結
合するＧａｌ４は少ない。Ｇａｌ４ｐは、以前Ｇａｌ４により調節されると考え
られていた遺伝子であるＧＡＬ４およびＰＧＭ２のプロモーターに結合しなかっ
たが、これらのプロモーターに対するＧａｌ４結合の直接的な証拠は示されてい
なかった。これらの結果の各々は慣用的なＣｈＩＰ分析により確認され（図６Ｃ
）、マイクロアレイの結果が、現在まで個々の結合部位を研究するために用いら
れてきた慣用的なアプローチにより得られた結果を正確に反映することを示す。
【００５７】 Ｇａｌ４により結合および調節の双方がなされる１０個の遺伝子を選別し、Ａ
ｌｉｇｎＡｃｅプログラムを用いてこのアクチベーターのコンセンサス結合部位
を同定した（図６Ｄ）。この結合部位配列は以前にＧａｌ４に関して決定された
配列に類似するが、精製（refine）されている。Ｇａｌ４結合が検出されない酵
母ゲノムのおよそ５０の部位でＧａｌ４結合配列を生じ、これはＧａｌ４結合に
は単にこの配列の存在では十分ではないことを示している。
【００５８】 以前には発現がＧａｌ４アクチベーターとは関連づけられていなかった３個の
遺伝子、ＭＴＨ、ＰＣＬ１０およびＦＵＲ４にもまたＧａｌ４が結合し、ガラク
トース中で活性化されることが見出された。これらの３個の遺伝子は以下の３つ
の特徴を十分確立されたＧａｌ４−依存性ＧＡＬ遺伝子と共有するので、これら
の３つの遺伝子は本物の（genuine ）Ｇａｌ４ｐ標的である可能性がある。ＭＴ
Ｈ、ＰＣＬ１０およびＦＵＲ４はガラクトース誘導される（図６Ａ）。ガラクト
ース誘導はＧａｌ４に依存する（図６Ｃ）。細胞がグルコース中ではなくて、ガ
ラクトース中で成長した場合、ＭＴＨ、ＰＣＬ１０およびＦＵＲ４プロモーター
にＧａｌ４が結合する（図６Ａ）。Ｇａｌ４ｐのＭＴＨ、ＰＣＬ１０およびＦＵ
Ｒ４プロモーターへの結合は慣用されるＣｈＩＰ分析により確認された（図６Ｃ
）。
【００５９】 ＭＴＨ１およびＭＴＨ、ＰＣＬ１０およびＦＵＲ４をＧａｌ４調節遺伝子であ
ると同定することにより、いくつかの異なる代謝経路の調節がどのように相互に
関連しているかがわかる（図６Ｆ）。ＭＴＨ１は細胞がガラクトースを単一の炭
素源として利用する場合に必要とされる代謝経路に関与する多くの遺伝子の転写
レプレッサーをコードする。中でも最も興味深い標的はヘキソース輸送に関与す
るＨＴＸ遺伝子のサブセットである。膜でＧａｌ４依存的様式でそのヘキソース
トランスポーターの濃度を変調することにより細胞がガラクトースに応答するこ
と；Ｇａｌ４がガラクトーストランスポーター遺伝子ＧＡＬ２を活性化し、ＭＴ
Ｈ１レプレッサーの活性化によりグルコーストランスポーターの発現レベル低下
を引き起こすことが本明細書に記載される結果により示される。Ｐｃ１１０サイ
クリンはＰｈｏ８５ｐと結合し、グリコーゲンの形成を抑制するようである。Ｐ
ＣＬ１０がＧａｌ４活性化されるという観察により、グリコーゲン生成の低減が
ガラクトース代謝から得られるエネルギーを最大化することが示される。ＦＵＲ
４はウラシルペンネアーゼ（pennease）をコードし、Ｇａｌ４によるその誘導は
ウラシルの細胞内プールを増加させる必要性を反映し、Ｇａｌ７により触媒され
るＵＤＰのガラクトースへの付加を効率よく行わせる。
【００６０】 前記の実験は、細胞がガラクトース以外の炭素供給源上で成長する場合、グル
コースが存在しない限り、Ｇａｌ４が少なくともいくつかのＧＡＬ遺伝子プロモ
ーターと結合することを示している。ラフィノース上で成長した細胞のＧａｌ４
のゲノム全体位置分析を繰り返し、結果は細胞をガラクトース上で成長させた場
合に得られる結果と本質的に同一であることが示された。これらの結果により、
Ｇａｌ４がそのゲノム結合部位で同一の結合挙動を呈することが示され、ゲノム
全体位置法が高度に再現性があることが示される。
【００６１】 Ｓｔｅ１２結合部位の全体分析 ＤＮＡ結合転写アクチベーターＳｔｅ１２のゲノム全体の結合プロファイルも
また研究した。Ｓｔｅ１２は明確な細胞での役割を有する（接合フェロモンに対
する１倍体酵母の応答に重要である）ので興味深いが、Ｓｔｅ１２により調節さ
れる遺伝子は極わずかしか同定されていない。フェロモン応答経路の活性化によ
り細胞サイクル停止および１００個を超える遺伝子の転写活性化が引き起こされ
る。ｓｔｅ１２変異細胞を用いる発現分析によりＳｔｅ１２がこれらの遺伝子全
てのフェロモン誘導に必要であることが示された。しかしながら、Ｓｔｅ１２が
フェロモンに応答してこれらの遺伝子の転写を活性化するメカニズムは解明され
ていない。
【００６２】 ３つの独立した実験で、フェロモン処置の前および後でエピトープタグ化Ｓｔ
ｅ１２ｐのゲノム全体位置を研究した。本明細書に記載する分析基準（ｐ値＜０
．００５）により、プロモーター領域がＳｔｅ１２に結合する可能性が最も高い
遺伝子の組を図７に列挙する；上側パネルは発現がアルファ因子により誘導され
る遺伝子を示し、一方下側パネルは発現がアルファ因子により有意に誘導されな
い遺伝子を示す。アルファ因子により誘導され、Ｓｔｅ１２が結合する３６個の
遺伝子のうち、１２個は接合過程の種々の工程に参加することが知られている（
ＦＩＧ２、ＡＦＲ１、ＧＩＣ２、ＳＴＥ１２、ＣＨＳ１、ＫＡＲ５、ＦＵＳ１、
ＡＧＡ１、ＦＵＳ３、ＣＩＫ１、ＦＡＲ１、ＦＩＧ１）。
【００６３】 Ｓｔｅ１２はフェロモンシグナル発生の非存在下でいくつかのプロモーターに
結合するが、たいていの遺伝子に対するその結合はアルファ遺伝子により増強さ
れる。興味深いことに、Ｓｔｅ１２はフェロモン処置の前および後の双方でその
自己プロモーターに結合する。それと共に、結合および発現データーはＳＴＥ１
２の調節が陽性フィードバックループに関与することを立証している。ＳＴＥ１
２発現はフェロモン処置の直後に増加し、これは結合しているが不活性なＳｔｅ
１２アクチベーターが迅速に活性形態に変換することを示している。ＳＴＥ１２
遺伝子の発現増加によりＳｔｅ１２がさらに生成され、今度はこれがその遺伝子
を活性化する。
【００６４】 その発現が以前はＳｔｅ１２および接合過程に関連づけられていなかった２４
個の遺伝子にＳｔｅ１２が結合し、アルファ因子により活性化されることが見出
された。そのフェロモン誘導がｓｔｅ１２変異細胞で削除されていることを鑑み
、これらの２４個の遺伝子もまた本物のＳｔｅ１２標的である可能性がある。こ
れらの遺伝子の同定により接合過程の種々の工程について興味深い詳細が示され
る。例えば、あるＳｔｅ１２標的遺伝子、ＰＣＬ２はサイクリン依存性キナーゼ
（ｃｄｋ）Ｐｈｏ８５との複合体を形成するＧ１サイクリンをコードする。Ｐｃ
１２−Ｐｈｏ８５およびＰＣ１１−Ｐｈｏ８５複合体はＣｌｎ１−Ｃｄｃ２８お
よびＣｌｎ−２−Ｃｄｃ２８サイクリン依存性キナーゼ複合体と協働して作用し
、Ｇ１細胞サイクル進行を促進する（Ｍｅａｓｄａｙら、１９９４）。Ｐｃ１２
−Ｐｈｏ８５キナーゼ複合体はＣｌｎ１−Ｃｄｃ２８およびＣｌｎ２−Ｃｄｃ２
８と重複するが異なる基質特異性を有する。接合過程において、１倍体酵母細胞
は、別のＳｔｅ１２標的遺伝子によりコードされるＦａｒ１によるＣｌｎ１−Ｃ
ｄｃ２８およびＣｌｎ２−Ｃｄｃ２８活性阻害のために、後期Ｇ１期の開始が停
止される。フェロモン処置後のＳｔｅ１２によるＰＬＣ２活性化は、Ｐｈｏ８５
複合体活性の増加がＣｄｃ２８活性の喪失を補填するのに必要である可能性があ
ることを示している。
【００６５】 フェロモン誘導中のＳｔｅ１２のゲノム位置および発現プロファイルの分析に
より同定されるたいていのＳｔｅ１２標的遺伝子は、接合応答の種々の工程に関
係するタンパク質をコードする。中でも１１個は以前に特性付けされていない。
従って、ＹＮＬ２７９Ｗ、ＹＯＲ１２９Ｃ、ＹＯＲ３４３Ｃ、ＹＰＬ１２９Ｃ、
ＹＥＲ０１９Ｗ、ＹＩＬ０８３Ｃ、ＹＩＬ０３７Ｃ、ＹＩＬ１６９Ｃ、ＹＮＬ１
０５Ｗ、ＹＯＬ１５５ＣおよびＹＮＲ０６４Ｃなどのこれらの遺伝子の細胞での
役割は接合に最も関係している可能性がある。
【００６６】 Ｓｔｅ１２は別の細胞でのプロセスにも密接に関係している。Ｔｅｃ１と共に
、Ｓｔｅ１２は２倍体細胞のフィラメント形成（filmamentation）を調節し、１
倍体の侵襲性の（invasive）成長を調節する。２個の遺伝子、ＴＥＣ１およびＦ
ＬＯ１１はパルプ状生育経路におけるＳｔｅ１２標的として同定された。アルフ
ァ因子の存在下または非存在下のいずれかでのこれらの遺伝子に対するＳｔｅ１
２の結合は検出されなかった。これらのプロモーターに対するＳｔｅ１２ｐの結
合は異なる生理学的条件により調節される可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は本明細書に記載するタンパク質−ＤＮＡ相互作用のゲノム全体のモニタ
ー観察の説明である。
【図２】 図２はどのようにアレイ上に示される各配列に対する目的タンパク質の相対結
合を加重平均分析を用いて算出したかを示す。
【図３】 図３はタンパク質−ＤＮＡ相互作用のゲノム全体のモニター観察の倍数変化対
染色体位置のグラフである。
【図４】 図４は酵母染色体ＩＩＩに対するＯＲＣ１の結合に関する非タグ化に対するタ
グ化の比率対染色体位置のグラフである。
【図５】 図５Ａはスキャンした像の例である。富化していないおよびＩＰ富化したＤＮ
Ａは各々緑色蛍光および赤色蛍光を生じる。クローズアップした像は赤色の強度
が提示した以上であるスポットを例示し、これらのＤＮＡ配列に対して標的化さ
れたタンパク質の結合を示している。 図５Ｂは少量のＤＮＡを定量的に増幅し、Ｃｙ３およびＣｙ５蛍光体で標識で
きることを示している。参考書（text）に記載されているＬＭ−ＰＣＲ法を用い
て酵母ゲノムＤＮＡ１ｎｇからＣｙ３およびＣｙ５標識ＤＮＡを調製した。得ら
れたＤＮＡサンプルを混合し、酵母遺伝子内ＤＮＡマイクロアレイにハイブリダ
イズした。恐らくバックグラウンドのノイズのために、低強度スポットは高強度
スポットよりも大きな変動（variation ）を有する。
【図６】 図６Ａは本明細書に記載する分析基準により、プロモーター領域がＧａｌ４に
結合する可能性が最も高い２４個の遺伝子の組を示す。 図６ＢはＧａｌ４結合遺伝子間領域の概略図である。 図６Ｃは慣用的なＣｈＩＰ分析の結果を示す。 図６ＤはＧａｌ４アクチベーターのコンセンサス結合部位を同定するために用
いられるＡｌｉｇｎＡｃｅプログラムの結果を示す。 図６ＥはＰＬＣ１０およびＭＴＨ１の相対発現を示す棒グラフである。 図６ＦはＭＴＨ１およびＭＴＨ、ＰＬＣ１０およびＦＵＲ４をＧａｌ４調節遺
伝子として同定することにより、どのようにいくつかの異なる代謝経路が相互に
関連しているかを示す方法を説明する概略図である。
【図７】 図７は本明細書に記載する分析基準により、プロモーター領域がＳｔｅ１１２
に結合する可能性が最も高い遺伝子の組を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヤング，リチャード，エイ． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02193 ウェストン，ハイランド ストリ ート 216 (72)発明者 レン，ビング アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02143 サマヴィル，スプリングフィール ド ストリート 39 (72)発明者 ロバート，フランソワ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02116 ボストン，ナンバー１エフ，ビー コン ストリート 395 Ｆターム(参考） 2G045 BA20 BB50 DA13 FB02 4B024 AA11 AA20 CA01 HA14 4B063 QA11 QA18 QQ05 QQ42 QR32 QR41 QR56 QR82 QS11 QS12 QS25 QX02

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ） 細胞内のＤＮＡ結合タンパク質を該細胞のゲノムＤＮ
    Ａに架橋し、それにより、ゲノムＤＮＡに架橋したＤＮＡ結合タンパク質を作製
    する工程、 ｂ） ａ）のＤＮＡ結合タンパク質に架橋したゲノムＤＮＡのＤＮＡフラグメン
    トを作製し、それにより、ＤＮＡ結合タンパク質が結合したＤＮＡフラグメント
    を含有する混合物を作製する工程、 ｃ） 目的タンパク質が結合したＤＮＡフラグメントを、ｂ）で作製した混合物
    から取り出す工程、 ｄ） ｃ）で同定したＤＮＡフラグメントを目的タンパク質から分離する工程、
    ｅ） ｄ）のＤＮＡフラグメントを増幅する工程、 ｆ） ｅ）のＤＮＡフラグメントを、該細胞のゲノムＤＮＡに相補的な配列を含
    有するＤＮＡと、該ＤＮＡフラグメントと該ゲノムＤＮＡに相補的な配列の領域
    との間でハイブリダイゼーションが起こる条件下で合わせる工程、ならびに ｇ） 該ＤＮＡフラグメントがハイブリダイズする、ｆ）のゲノムＤＮＡに相補
    的な配列の領域を同定する工程 を含み、ここで、ｇ）で同定された領域が、目的タンパク質が結合する細胞のゲ
    ノム内の領域である、目的タンパク質が結合する細胞のゲノム内の領域を同定す
    る方法。
  2. 【請求項２】 該細胞が真核細胞である請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 目的タンパク質が、転写因子および癌遺伝子からなる群より
    選ばれる請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 該細胞のＤＮＡ結合タンパク質をホルムアルデヒドを用いて
    該細胞のゲノムに架橋する請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 目的タンパク質が結合したｃ）のＤＮＡフラグメントを、目
    的タンパク質に結合する抗体を用いて同定する請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 ｅ）のＤＮＡフラグメントをライゲーション媒介ポリメラー
    ゼ連鎖反応を用いて増幅する請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 ｆ）のゲノムの相補的な配列がＤＮＡマイクロアレイである
    請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 ｈ） ｇ）で同定した領域を対照と比較する工程をさらに含
    む請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 ａ） 細胞内のＤＮＡ結合タンパク質を該細胞のゲノムＤＮ
    Ａにホルムアルデヒド架橋し、それにより、ゲノムＤＮＡに架橋したＤＮＡ結合
    タンパク質を作製する工程、 ｂ） ａ）のＤＮＡ結合タンパク質に架橋したゲノムＤＮＡのＤＮＡフラグメン
    トを作製し、それにより、ＤＮＡ結合タンパク質が結合したＤＮＡフラグメント
    を作製する工程、 ｃ） ｂ）で作製した、目的タンパク質が結合したＤＮＡフラグメントを、目的
    タンパク質に特異的に結合する抗体を用いて免疫沈降させる工程、 ｄ） ｃ）で同定したＤＮＡフラグメントを目的タンパク質から分離する工程、 ｅ） ｄ）のＤＮＡフラグメントを、ライゲーション媒介ポリメラーゼ連鎖反応
    を用いて増幅する工程、 ｆ） ｅ）のＤＮＡフラグメントを蛍光標識する工程、 ｇ） ｅ）の標識ＤＮＡフラグメントを、該細胞のゲノムＤＮＡに相補的な配列
    を含有するＤＮＡマイクロアレイと、該ＤＮＡフラグメントと該ゲノムＤＮＡに
    相補的な配列の領域との間でハイブリダイゼーションが起こる条件下で合わせる
    工程、 ｈ） 該ＤＮＡフラグメントがハイブリダイズするゲノムＤＮＡに相補的な配列
    の領域を、蛍光強度を測定することにより同定する工程、ならびに ｉ） ｈ）で測定した蛍光強度を対照の蛍光強度と比較する工程 を含み、ここで、該ゲノムの領域における蛍光強度が該領域の対照の蛍光強度よ
    り高いことが、目的タンパク質が結合する細胞のゲノム内の領域を示す、目的タ
    ンパク質が結合する細胞のゲノム内の領域を同定する方法。
  10. 【請求項１０】 ａ） 細胞内のＤＮＡ結合タンパク質を該細胞のゲノムＤ
    ＮＡに架橋し、それにより、ゲノムＤＮＡに架橋したＤＮＡ結合タンパク質を作
    製する工程、 ｂ） ａ）のＤＮＡ結合タンパク質に架橋したゲノムＤＮＡのＤＮＡフラグメン
    トを作製し、それにより、ＤＮＡ結合タンパク質が結合したＤＮＡフラグメント
    を含有する混合物を作製する工程、 ｃ） 目的タンパク質が結合したＤＮＡフラグメントを、ｂ）で作製した混合物
    から取り出す工程、 ｄ） ｃ）で同定したＤＮＡフラグメントを目的タンパク質から分離する工程、 ｅ） ｄ）のＤＮＡフラグメントを増幅する工程、 ｆ） ｅ）のＤＮＡフラグメントを、該細胞のゲノムＤＮＡに相補的な配列を含
    有するＤＮＡと、該ＤＮＡフラグメントと該ゲノムＤＮＡに相補的な配列の領域
    との間でハイブリダイゼーションが起こる条件下で合わせる工程、 ｇ） 該ＤＮＡフラグメントがハイブリダイズする、ｆ）のゲノムＤＮＡに相補
    的な配列の領域を同定する工程、ならびに ｈ） ｇ）で同定した領域の特性付けを行なう工程 を含み、ここで、ｈ）の領域の特性が、該細胞のゲノムに結合する目的タンパク
    質の機能を示す、細胞のゲノムに結合する目的タンパク質の機能の決定方法。
  11. 【請求項１１】 ａ） 細胞内のＤＮＡ結合タンパク質を該細胞のゲノムＤ
    ＮＡに架橋し、それにより、ゲノムＤＮＡに架橋したＤＮＡ結合タンパク質を作
    製する工程、 ｂ） ａ）のＤＮＡ結合タンパク質に架橋したゲノムＤＮＡのＤＮＡフラグメン
    トを作製し、それにより、ＤＮＡ結合タンパク質が結合したＤＮＡフラグメント
    を含有する混合物を作製する工程、 ｃ） 目的タンパク質が結合したＤＮＡフラグメントを、ｂ）で作製した混合物
    から取り出す工程、 ｄ） ｃ）で同定したＤＮＡフラグメントを目的タンパク質から分離する工程、 ｅ） ｄ）のＤＮＡフラグメントを増幅する工程、 ｆ） ｅ）のＤＮＡフラグメントを、該細胞のゲノムＤＮＡに相補的な配列を含
    有するＤＮＡと、該ＤＮＡフラグメントと該ゲノムＤＮＡに相補的な配列の領域
    との間でハイブリダイゼーションが起こる条件下で合わせる工程、ならびに ｇ） 該ＤＮＡフラグメントがハイブリダイズする、ｆ）のゲノムＤＮＡに相補
    的な配列の領域を同定する工程 を含み、ここで、ｇ）のゲノムＤＮＡに相補的な配列の領域が調節領域であれば
    、目的タンパク質が転写因子である、細胞のゲノムに結合する目的タンパク質が
    転写因子として機能するか否かを決定する方法。
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