JPH04502553A - イン シチュ ハイブリット形成分析法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 手動イン　シチュ　ハイブリッド形成分析法発明の背景 １．１王立立互 本発明は、１細胞当たり１−５コピ一程度の少量のターゲット核酸を検知するの に効果的なイン　シチュ　ハイブリッド形成分析法の分野に係わる１本発明に基 づく分析法は、これまで公知の他の方法よりも核酸検知の感度を著しく増加させ る方法である。さらに、このハイブリッド形成法は、他のイン　シチュ定量法に よって報告されているものよりも遥かに迅速に実施できる。本発明はまた、同一 の細胞中の核酸およびプロティンの迅速でかつ高感度の検知法を付与するもので ある。

２・盗見ユ亙 イン　シチュ　ハイブリッド形成とは、単細胞レベルの組織中の核酸（ＤＮＡお よびＲＮＡ）およびプロティンのような生体高分子の定性および定量に関する技 術を提供するものである。このようなハイブリッド形成技術により、前記単細胞 レベルの組織中の特定の遺伝子の存否を検知することができる。イン　シチュ　 ハイブリッド形成法はまた、単細胞レベルの遺伝子産生物の発現を検知するため にも使用できる。

特定の核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）プローブを用いて、感染および他の病状の遺 伝指標を検知することもできる。

遺伝性の疾病によっては、正常な組織には存在しない遺伝子の存在が特徴付けら れることもある。他の病状によっては、正常な細胞中に認められないようなＲＮ Ａ５またはＲＮＡ翻訳産生物（すなわち、ペプチドまたはプロティン）の発現に よって特徴付けられる。さらに、病状の中には、遺伝子またはプロティンの不存 在によって、あるいは遺伝子産生またはプロティンの不存在または発現の変更に よって特徴づけられるものもある。

これまでの方法は、これらの指標の検知を可能とするが、比較的長時間を必要と し、感度にも限界があった。ハイブリッド形成技術は、単一の標準ＤＮＡまたは ＲＮＡの相補的な核酸鎖とのベア化（すなわち、ハイブリッド形成）能力を基と する技術である。このハイブリッド形成反応によって、特定の遺伝子（ＤＮＡ） の存在、ポリヌクレオチド配列またはこれらの遺伝子（ｍＲＮＡ）の転写および 発現の同定を特徴とする特定のプローブの開発が可能となる。

細胞のハイブリッド形成反応を実施する前に、細胞の破壊と細胞から核酸を分離 を必要とする溶液ハイブリッド形成法は細胞の完全性、空間的解析、検知感度を 犠牲にしている。イン　シチュ　ハイブリッド形成では、特別のターゲット遺伝 子、核酸またはプロティンが他の細胞の周囲にある外部ＲＮＡおよびＤＮＡによ る希釈がなくなるため溶液ハイブリッド形成よりも感度が良くなる。また、イン シチュ　ハイブリッド形成によって、例えば個々の細胞内の遺伝子、核酸、また はプロティンのような複数成分の同時検知が可能とされ、細胞性遺伝子またはウ ィルス性配列を示す特殊細胞の同定が可能となる。その上、イン　シチュハイブ リッド形成性は単独細胞に適用して定量できるので、最少のサンプルおよび試薬 を必要ですむ利点がある。

本発明の前には、イン　シチュ　ハイブリッド形成方法は、１細胞当たりｌＯコ ピー以上も存在する核酸しが検知できなかった。しかも、この方法では、実施に 少なくとも８時間〜１４日以上の時間を必要とした。このイン　シチュハイブリ ッド形成分析法法の前には、定量法も多重同時検知の実施も不可能とされていた 。

発明の概要 本発明の目的は、１細胞当たり１−５コピ一程度の低濃度しか存在しない時でも 、ポリヌクレオチドが検知可能なイン　シチュ　ハイブリッド形成法を提供する ことである。

本発明の別の目的は、個々の細胞中にある１個以上のターゲット分子を検知可能 なイン　シチュ　ハイブリッド形成法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、約２−４時間内に達成可能なイン　シチュ　ハイブ リッド形成法を提供することである。

本発明のまた別の目的：＝、１細胞当たり１−５分子程度の少量のターゲット核 酸を定量できるイン　シチュ　ハイブリッド形成法を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、多数の生体高分子を同時に検知することのできるイ ン　シチュ　ハイブリッド形成法を提供することである。

本発明は、固体支持体上に沈着させた個々の細胞または組織部分内の生体高分子 を検知する方法を提供する６本発明の提供する方法の各段階を適確に実施するこ とによって、迅速で、感度の良いハイブリッド形成定量が可能となる。

ターゲットの生体高分子はｌ細胞当たりｌ−５分子の少数のレベルで定量するこ とができる。このハイブリッド形成定量法は、組織部分または細胞を培養した組 織中の骨髄および末梢血液のような細胞中のポリヌクレオチドのレベルの検知に 使用できる。本発明のハイブリッド形成法は、２−４時間という短時間で１細胞 当たり１−５という少数の分子をＳ＠できる感度で単細胞中のポリヌクレオチド を検知することができる。この方法はまた個々の細胞中にある１個以上の異なっ たポリヌクレオチド配列を同時に検知することができる０本発明はまた、同じ細 胞中のプロティンおよびポリヌクレオチドの検知をも可能にする。

簡単にいうと、単細胞懸濁物としてかあるいは組織スライスとして、細胞をスラ イドガラスのような固体支持体上に着床させる。この細胞は、細胞に最良の位置 決定をさせ、最高のハイブリッド形成効率を付与させるような固着剤を選んで着 床する。この固着の後、支持体に固着された細胞は室温で脱水し貯蔵してもよい し、また直接ハイブリッド形成法を実施してもよい。

この後、５０％ホルムアミドのようなカオトロピック剤、５倍濃度のＳＳＣ溶液 （１倍−０，１５モルの食塩水と０．０１５モルのシュウ酸ソーダ水との混合液 ）のようなハイブリッド安定剤、０．１モルリン酸ソーダのような緩衝剤（ｐＨ ＝７．４）、非特定の結合性を減少させるために約１００μｓ／ｍ１２の低分子 量ＤＮＡ、プローブの細胞中への侵入を可能にする０、１％トリトンＸ−１００ および約ｌＯ〜２０ミリモルのバナジル・リボヌクレオシド錯体とを包含する溶 液中でハイブリッド形成を行う。

ターゲットのポリヌクレオチドとハイブリッド形成するため、このハイブリッド 形成溶液にプローブを加える。最も好ましいプローブは、−木調ＲＮＡプローブ で、長さが約７５〜１５０基である。ターゲット・プロティンまたは抗原に結合 させるために、抗体プローブを用いてもよい。プローブを包含するハイブリッド 形成溶液を細胞が隠れるほど十分な量添加する。次いで、この細胞を少なくとも ３０分間５５℃で培養する。このプローブに、高濃度の少なくとも約１μｇｌ威 のハイブリッド形成混合物をこの時間枠で好結果が得られるように添加する。

このプローブをハイブリッド形成溶液に添加する前に検知可能なようにラベル化 してもよい、逆に、ハイブリッド形成産生物に結合させる検知可能なラベルを選 んでもよい。

プローブは、本発明を実施するのに使用するためには、どのような検知可能な群 のものを選んでラベルとして添加してもよい。このような検知可能な群としては 、検知可能な物理的または化学的性質を持つものであれば何でもよい。

このような検知可能なラベルとしては、免疫定量法の分野で十分活用されており 、このような方法に対して有効で一般に多様されているラベルを、本発明に適用 してもよい。

これらに含まれるものとしては、酵素（Ｃ１ｉｎ　Ｃｈｅｍ工、旦：１２４３　 （１９７６）参照）、酵素基質（英国特許第１，５４８，７４１号公報参照）、 コエンザイム（補酵素）（英国特許第４．２３０．７９７号および第４．２３８ ．５６５号公報参照）および酵素禁止剤（米国特註第４．１３４．７９２号公報 参照）；蛍光体（シューエ加Ｊ工、旦：３５３（１９７９）参照）−発色団；光 学発光体および生物発光体のような発光体くΩＬ」工旦担」−１旦：　５１２（ １９７９）参照）；特別に結合可能なリガンド；末端反応性の反応対；および” Ｈ９“Ｉ　Ｓ　、　ａｍ　ｐ、”Ｉｓ　ｌ　、　＋４Ｃのような放射性同位元素 がある。

本発明はプローブの侵入を可能とし、不特定のプローブ結合性および高温（５５ ℃）にホルムアミド・ハイブリッド形成を阻止する適当な固着剤を提供する。こ のような発明によって、ハイブリッド形成の迅速な動力学および１細胞当たり１ −５分子という少数分子の感度でハイブリッド形成分析法が提供される。

本発明の卓越した結果は、ｍＲＮＡ上に細胞の構成要素の沈着またはその共有結 合変性の防止、リボゾームＲＮＡのサブユニット結合の不安定化、および細胞Ｒ ＮＡおよび／またはＤＮＡ中に一本鎖の導入によるハイブリッド形成のために完 全な長さをもったｍＲＮＡの接触を促進することによって起こるものと、Ｂねれ る０本発明は、細胞ＲＮＡの一本鎖を起こさせることと極めて高感度の定量法を 付与するハイブリッド形成の迅速な動力学との間の強力な相関関係を、発明者が 発見したことによってなされた。

ある面では、本発明は、適確な固着／ブレハイブリッド形成／ハイブリッド形成 ／各種組織への次記の目的のための検知手段を決定する簡単な方法を提供するこ とができる。

（１）単一分子の検知、（２）細胞形態の保存および（３）全反応時間の２〜４ 時間への縮減。

簡単にいうと、このような迅速でかつ感度のよいハイブリッド形成を実施するた めの適確な条件を予見するために、懸濁液状またはスライドガラス上に置いたい ずれかの複数のサンプル中の細胞試料を、まず固着剤に次いでハイブリッド形成 溶液に曝す。

この固着剤は、エタノール９５容量％と酢酸５容量％、エタノール７５容量％と 酢酸２０容量％、メタノール５０容量％とアセトン５０容量％、およびホルムア ルデヒド１０容量％とメタノール９０容量％を包含する群から選ばれる。また他 の有効な固着剤としては、選ばれた固着剤が二重鎖の少なくとも７０容量％を一 本鎖の細胞ポリヌクレオチドに移行させるが、細胞の空間条件は保持できるもの であれば、関連する技術に熟練した当業者に自明なものである。この固着剤への 接触時間は１〜１８０分であるが１〜３０分が好ましく、さらに２０分が最も好 ましい、固着化の温度は一２０〜５０℃が好ましいが２０℃が最も好ましい。試 料をハイブリッド形成前に貯蔵するときはこの後エタノール７０容量％と水３０ 容量％の混合液に００５〜２０分間接触させてもよい。

ハイブリッド形成溶液はカオトロピック変性剤、緩衝剤、孔形成剤、ハイブリッ ド安定剤、不特定ヌクレオチド、およびターゲット特定プローブを包含する。

カオトロピック変性剤（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、　Ｄ、　Ｗ、およびＧｒａｎｔ。

Ｍ、　Ｅ、　（１９６６）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２４１．４０３ ０　；　Ｈａｎ＋ａｇｕｃｈｉ。

Ｋ、およびＧｅ１ｄｕｓｃｈｅｓｋ、　Ｅ、　Ｐ、　（１９６２）　Ｊ　Ｃｈｅ ｍ　Ｓｏｃ、、　８４゜１３２９参照）はホルムアミド、尿素、チオシアネート 、グアニジン、トリクロロアセテート、テトラメチルアミン、過塩素酸塩、ヨウ 化ナトリウムを包含する群から選ばれる。

ｐＨが夕なくとも７．０〜８．０を保持するいかなる緩衝剤も使用できる。

孔形成剤としては、たとえばＢｒ１ｊ−３５，Ｂｒ１ｊ−５８，ドデシル硫酸ソ ーダ、ＣＨＡＰＳ　（登録商標）トリトンＸ−１００のような薬剤があるやター ゲット生体高分子の位置によって、孔形成剤は原形質または核層または細胞隔室 構造物を介してプローブの侵入を可能とするように選択する０例えば、０．０５ ％Ｂｒ１ｊ−３５または０．１％トリトンＸ−１００は原形質膜のみならず核膜 を通してプローブに侵入を可能とする。逆にデスオキシフール酸ソーダによって プローブは核層の透過が可能となる。したがって細胞質生体高分子ターゲットの ハイブリッド形成を限定するためには核層孔形成剤の使用を避ける。このような 副細胞の位置選択は、ターゲット生体高分子が細胞質内に位置するときは核相補 配列へのプローブハイブリッド形成を消失させることにより、この分析の特定性 と感度に寄与する。固着剤のような洗剤以外の薬剤が二の機能を果たすこともあ る。さらに生体高分子プローブし細胞の原形質層を透過゛するほど小さいが、核 層を透過できる程の大きさとなるように選択しでもよい、１何ｉおよび２価の陽 イオンの壇のようなバイブ１１ツド安定剤がハイブリッド形成溶液に含まれてお り、プローブの相補配列とその夕・〜ゲット高分子間の水素結合の生成を促進さ せる。好ましくは要項を０．１５−＝・１モルの濃度で使用する。さらに好まし くは０．６モルの食塩濃度を使用する。

核酸プローブの不特定結合性を抑制するブーめに、ターグツｌ−高分子に無関係 の核酸をプローブ濃度の１００倍の濃度ノ＼イブリッド形成溶液に添加する。上 記のＴｒ、程のそ、１′１．ｔ！れの後で試料を取り出して細胞形態５の観察に よって解析し、位相差顕ｍ鏡で新鮮な未処理の細胞と比較する０種々の副細胞構 造体の細胞形態および空間的解析をできるだけ新鮮で未処理の細胞に近づけるた めの決定条件が各工程の最適条件として選ばれている。

さらに、細胞質核酸を約５０μｇ／−のヨウ化プロピジュウム染料で染める。こ の染料は、核酸が一本鎖である時に特定の特性蛍光を放射（約４８０ｎｒｎ　： 緑色）し、核酸が二重鎖の詩には別の波長（約６１５ｎｍ　：赤色）の蛍光を放 射する。

使用染料は、特別な分析法のためのターゲット配列がＲＮＡであるか、ＤＮＡで あるかによって決められる。もしこの分析法がコピー・数の少ないＤ　Ｎ　Ａを 検知するためのものであれば、アクリジンオレンジ、テトラヒドロフラン、メチ ルグリーン、ビロニンＹ１エイズアＢのようなりＮＡ検知用の染料を使用し、核 ＤＮＡは一本鎖または二重鎖の量力τ分析できる。そうではなくて、コピー数の 少ないＲＮＡの検知のためにこの分析法を使用する時は、アクリジン、７ジン、 キサンチン、オキサジンおよびチアジンのようなＲＮ　Ａ染料を使用し、細胞質 ＲＮＡは一本鎖または二重鎖の量が分析できる。この定量法をＲ，Ｎ　Ａまたは ＤＮＡのどちらかの分析に使用するにせよ、検知する核酸が二重鎖がら一本鎖へ ７０％移行し、た時が最適の状態である。核酸の二次構造が二重鎖から一本鎖へ の移行が少なくとも７０％に到達し、全量の蛍光体の低下がなくなった時、本発 明に基づいて条件を調節し、単一細胞内にある１−５分子という少数のターゲッ ト核酸の適確なハイブリッド形成と検知が可能となる。さらに、この適確なハイ ブリッド形成に必要な時間は細胞質核酸の少なくとも７０％が一本鎖となるのに 必要な時間から決定される。

好ましい実施例において、本発明に基づくハイブリッド形成分析法は、本質的に 無傷な完全な腹を有する細胞試料中の生体高分子を分析する方法を提供し、この 方法は次の各工程を包含することを特徴としている。すなわち、１）ターゲット 細胞と固体支持体上に沈着させる工程と、２）細胞を固定させる工程と、３）こ の細胞を一本鎖ＲＮＡプローブを包含するハイブリッド形成溶液で培養する工程 と、さらに４）ターゲット核酸にハイブリッドされたプローブの量を検知する工 程とである０次いで、試料は洗浄さｎ、ターゲット核酸の量は、蛍光を顕微鏡を 介して画像的にまたはメリダンＡＣＡＳ４７０ワークステーション（Ｍｅｒｉｄ ｉａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ。

Ｏｋｅｍｏｓ、　Ｍｉｃｈｉｇａｎ）によるこの蛍光体の直接読取りかのいずれ かの方法で定量的に決定される。

図面の簡単な説明 第１図は、このイン　シチュ　ハイブリッド形成法の最適温度を図示するもので ある。

第２図は、このイ〕ノ　シチュ　ハイブリッド形成反応の動力学を図示するもの であるや 第３図は、このイン　シチュ　ハイブリッド形成反応の効率の関数として細胞質 ＲＮＡの二次構造の変化を図示するものである。

１３４図は、対照細胞ライン、Ｂａ１ｂ／Ｃ３Ｔ３を用いたイン　シチュ　ハイ ブリッド形成法の感度を図示したものである。

第５図は、イン　シチュ　ハイブリッド形成法による正常末梢血液、正常骨髄お よび慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）中の腫瘍遺伝子の検知を図示したものである。

第６図は、イン　シチュ　ハイブリッド形成法による固体＃ｆｌ織試料中の腫瘍 遺伝子の検知を図示したものである。

第７図は、イン　シチュ　ハイブリッド形成法による陽性および陰性対照したヒ ト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の検知特性を図示したものである。

第８図は、イン　シチュ　ハイブリッド形成法による血管肉腫（Ｋ、Ｓ）または エイズ（後天性免疫不全症候群）関連錯体（ＡＲＣ）中のＨＩＶ　（ヒト免疫不 全ウィルス）の検知を図示したものである。

篤９図は、イン　シチュ　ハイブリッド形成法によるエイズ（後天性免疫不全症 候群）またはリンパ腫をもった患者のＨＩＶ　（ヒト免疫不全ウィルス）の検知 を図示したものである。

第１０図は、イン　シチュ　ハイブリッド形成法による血清陽性（Ａｂ＋）で、 無症候性で、危険度の高い個体中のＨＩＶ（ヒト免疫不全ウィルス）の検知を図 示したものであるわ 第】１図は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の患者の同一末梢血＃１ｍ胞内Ｏ３種 の腫瘍遺伝子のイン　シチュ　ハイブリッド形成法による同時検知を図示したも のである。蛍光および酵素法によるイン　シチュ　ハイブリッド形成法検知はこ の分析にも使用された。

第１２図は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の患者の同一末梢血液細胞内の３種の 腫瘍遺伝子のイン　シチュ　ハイブリッド形成法による同時検知を図示した。蛍 光およびコロイド金によるイン　シチュ　ハイブリッド形成性検知はこの分析に も使用された。

第１３図は、イン　シチュ　ハイブリッド形成法を用いた同一細胞内の抗原およ び核酸の同時検知を図示したものである。

第１４図は、イン　シチュ　ハイブリッド形成法による定量分析データを図示し たものである。

第１５図は、ＫＳ　（血管肉１１）、エイズ（後天性免疫不全症候群）関連錯体 （ＡＲＣ）、エイズ（ＡＩＤＳ：後天性免疫不全症候群）、リンパ腫患者の巨大 細胞ウィルス（ＣＭＶ）の検知を図示したものである。

第１６図は、イン　シチュ　ハイブリッド形成法による血清陽性（Ａｂ＋）で、 無症候性で、危険度の高い個体中の巨大細胞ウィルス（ＣＭ　Ｖ　）の検知を図 示したものである。

第１７図は、ウィルス感染の危険はあるが、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウィルス）に 対して血清陰性の試験結果のヒトのＨＩ　Ｖ（７）４種の異ナル部分（ＧＡＧ、 ＥＮＶ、ＴＡＴ、ＬＴＲ）に対する、イン　シチュ　ハイブリッド形成法による 検出を図示したものである。

第１８図は、５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔ定量法による第１７図のインシチュ　 ハイブリッド形成法の確認結果を図示したものである。

第１９図は、イン　シチュ　ハイブリッド形成法による患者のα−インターフェ ロン療法の結果の監視能力を図示したものである。

第２０図は、イン　シチュ　ハイブリッド形成法による患者のγ−インターフェ ロン療法の結果の監視能力を図示したものである。

発明の詳細な説明 １亙且ｍｌ亙員 イン　シチュ　ハイブリッド形成法の第１段階は、試料の固体支持体上に置くこ とである。この試料は細胞と細胞部分よりなるか、またはこれらを含有するいか なるものでも可能である。この細胞は、ターゲット生体高分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ またはプロティン）が変化せず、破壊されず、かつ検知可能なものであれば生、 死のいずれであってもよい、この試料としては、本質的に無傷の膜を持つ細胞よ りなるものでなければならない。

細胞構造体のすべての膜が無傷である必要はないが、これらの膜は十分に保存さ れていて、下記の事項が実施できるものでなければならない、：ターゲット生体 高分子の保存、ターゲット生体高分子の位置に検討すべきプローブの導入、およ びターゲット膜成分の抗ぶ性の保存である。

試料を固体支持体上に載置する方法は、細胞または組織の種類による、例えば組 織の標準的細片または塗抹標本、細胞懸濁液の遠心分離ををした試料を包含する 。

本発明の実施に際しては、各種の固体支持体が使用できる。使用可能な支持体と しては、ガラス、スコッチテープ（３Ｍ社製）、ナイロン、Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅ ｅｎ　Ｐｌｕｓ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ］、ａｎｄＮｕｃｌｅａｒ社製）およびニト ロセルロースが包含されるが、これに限定されるものではない、最も好ましいも のは顕微鏡用のスライドガラスである。これらの支持体を使用することおよびそ の上に試料を載置させる方法は、この技術に熟練した当業者であれば自明である 。支持体材料の選択は、使用する細胞の具体的方法および定量方法による。濾材 の中には厚さが均一でなく、したがってイン　シチュ　ハイブリッド形成法を実 施する時に収縮、膨張が不均一になるものがある。その上、自動蛍光を発する支 持体の中には低レベルの蛍光体の測定を妨げるものがある。顕微鏡用のスライド ガラスは信号／ノズル比が大きく、組織の保存が良好であるので固体支持体とし ては最も好ましいものである。

里１１亙！二里足 細胞またはその部分を固体支持体上に載置させた後、試料を固着させる。固着剤 は単独または混合して使用するいかなる沈着剤または架橋剤よりなる群から選ば れても、また水性または非水性のいずれであってもよい。この固着剤は、ホルム アルデヒド溶液、アルコール類、塩溶液、塩化水銀、食塩、硫酸ソーダ、重クロ ム酸カリウム、リン酸カリウム、臭化アンモニウム、塩化カルシウム、酢酸ソー ダ、塩化リチウム、酢酸セシウム、酢酸カルシウムまたはマグネシウム、硝酸カ リウム、重クロム酸カリウム、クロム酸ソーダ、ヨウ化カリウム、ヨウ素酸カリ ウム、ヨウ素酸ソーダ、千オ硫酸ソーダ、ピクリン酸、酢酸、バラホルムアルデ ヒド、苛性ソーダ、アセトン、クロロホルム、グリセリン、チモール等よりなる 群から選択してもよい、好ましくは、この固着剤は沈着作用を介して細胞構成要 素を固定させ、下記のような特徴を有する薬剤よりなるものである。

：すなわち、その効果は可逆性があり、細胞形態を維持し、所望の細胞構成要素 の抗原性を維持し、細胞の適当な位置に核酸が保持され、その核酸が二重鎖また は二重鎖のハイブリッドを形成できないような方法では変性せず、前記細胞構成 要素は固有のターゲット配列すべてに対して核酸ハイブリッド形成工程を阻止す るような方法では影響を及ぼすことがない。これらの固着剤および固着方法の選 択によって、細胞構成要素および細胞形態は影響を受ける。すなわち、このよう な効果は、組織を特殊化することができる。

本発明で使用する固着剤として好ましいものは、エタノール、エタノール−酢酸 、メタノール、およびメタノール−アセトンよりなる群から選ばれ、これらの固 着剤は最高のハイブリッド形成効果と細胞形態の良好な保存性とを付与すること ができる。

本発明の実施に当たって最も好ましい固着剤としては、ＨＬ−６０および正常な 骨髄細胞用にはエタノール９５容量％と酢酸５容量％を含むもの、Ｋ５６２およ び正常な末梢血液細胞用にはエタノール７５容量％と酢酸２０容量％を含むもの 、繊維芽細胞および正常な骨髄細胞用にはメタノール５０容量％とアセトン５０ 容量％を含むもの、および心臓筋肉組織用にはホルムアルデヒドｌＯ容量％とメ タノール９０容量％を含むものがある。これらの固着剤は、細胞形態の保存、抗 原の保存と良好な接近性、および高いハイブリッド形成効率を提供することがで きる０本発明によれば、各組織の種類に対しては、１〜２種の固着剤によって、 細胞の最良の位置的解決と最適のハイブリッド形成効率との両方を確実に提供す ることができる。

同時に、この固着剤はこれらの物質を架橋させて細胞組成物を固着するような化 合物、例えばゲルタールアルデヒドやホルムアルデヒドを包含していてもよい、 このような架橋剤は沈澱剤として上記の要求事項をすべて満足していなければな らないが、一般には、より［粘着性ｊで、細胞と膜組成物を強固の結合させたり 、封じ込めたりし、その結果上記のような特徴を保持するものである。このよう な架橋剤は実際使用するとすれば、］０容０容量下が好ましい。

架橋剤は、巨大構造物を保持できるが、ハイブリッド形成効率を低下させること が多い、架橋剤は核酸と抗原とを捕捉して、これらをプローブや抗原へ接近不能 とするような網目を形成する。またその中には、核酸を共有結合的に変性し、そ の後のハイブリッド形成を妨害するものもある。

鳳鳳Ｚ皿監Ω立ｌ 前記の固定化を行った後、細胞を包含する顕微鏡用スライドガラスを空気中室温 下で、３週間以内、低＠（４℃）の７０容量％のエタノール水溶液中で６−１２ 力月、またはバラブラスト中で２年間以内は貯蔵してもよい、もし試料をＲＮア ーゼを含まない条件下で処理する時は、等縁付きのアルコールで脱水してから室 温下で少なくとも５力月間貯蔵させてもよい。

ブレ・ハ　ブト・　１ノ 本発明によれば、正式にはプレ・ハイブリッド形成工程は不必要である。プロー ブの不特定結合を抑制したり、プローブを侵入させることはハイブリッド形成溶 液中で実施できる。もしハイブリッド形成処理を短時間（３０分以下）に行う時 には、スライドガラスにハイブリッド形成溶液を添加する前にハイブリッド形成 温度までスライドガラスを余熱しておいてもよい。

ム工ヱ旦ユヱ五虱 核酸ハイブリッド形成とは、２又はそれ以上の鏡面象すなわちＤＮＡ、ＲＮＡ、 オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはそれらの各組み合わせたものが 互いに認識し、瞬時の自発的または誘導された、例えば水素結合のような化学結 合のいずれかを形成することによって相互に結合する工程である。この結合度は 会合する核酸の種類、会合する正常な核酸によって限定される「正確な」結合の 範囲、および結合および対形成という正常な化学的法則で限定されるような「正 確な」結合の範囲に基づいて制御することができる。例えば、二重鎖の結合によ って鎖長が１０の正確な組み合わせ１０（ｉｔ中の９個が形成される時、この結 合は９０％一致であると呼ばれる。

細胞核酸配列は、分子ハイブリッド配列工程で検知できる。この時プローブはあ る方法で「ラベル化（標識化）」して、個々の細胞中に存在する相補型細胞核酸 配列が検知できねばならない。

本発明においては、「ハイブリッド形成」という用語は、ターゲット抗原に対す る抗体の結合をも意味するものである。

２］し二１１日り版 プローブは、遺伝物質としてＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡよりなるオリ ゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよび抗体に限定される。このＤＮＡま たはＲＮＡは、アデノシン、ウリジン、チミジン、グアニン、チトシンなどの塩 基またはこれらの天然または人工化学的誘導体よりなるものであってもよい、こ のプローブは、１種以上の化学結合、通常は水素結合を介して相補型または鏡面 対象型ターゲット細胞遺伝子配列に結合可能とされている。

この結合の程度は、結合またはハイブリッド形成工程で認められたミスマツチの 量として示される。；このプローブのターゲット細胞配列に対する相補度として 示されている。

プローブの大きさは所望のミスマツチレベルで安定なハイブリッドを形成できる 大きさに調整する。；代表的な例としては、単独塩基ミスマツチの検知には、約 １２−５０塩基のプローブが必要である。（５０〜数万の塩基よりなる）より大 きなプローブは、プローブのターゲット細胞遺伝子配列との全体の類似率として ミスマツチレベルを測定する時に使用されることが多い。プローブが種々の領域 の遺伝子物質または細胞への侵入または結合を軒容または抑制するためプローブ の大きさを変えてもよい。同様にして、プローブの種類（例えばＤＮＡ対ＲＮＡ を使用するとき）についても前記の目的に対して考慮すればよい、また、プロー ブの大きさはプローブの拡散速度、細胞ターゲット整合体の発見確率、等にも影 響する。代表的な例としては、二重鎖ＤＮＡ　（ｄ　５ＤＮＡ）−重鎖ＤＮＡ　 （ｓ　５ＤＮＡ）またはＲＮＡプローブは、ヌクレオチド配列がターゲットであ る時ハイブリッド形成反応に使われる。

核酸プローブは、公知の技術に精通した当業者には公知の種々の方法により調整 できる。精製した二重鎖配列ＤＮＡ　（ｄｓＤＮＡ）は、ニック翻訳工程または ランダムプライマー伸長工程により、ラベル化した無傷のものとする。細胞内に 固定された核酸への二重鎖プローブのハイブリッド形成は、細胞核酸をハイブリ ッド形成する前に溶液中で互いにハイブリッドする相補鎖の能力で相殺される。

−重鎖ＤＮＡ　（ｓ　５ＤＮＡ）プローブはこの限定を受けず、オリゴヌクレオ チドの合成、−木調ファージＭ１３またはこのファージのプラスミド誘導体の使 用または精製ＲＮＡ鋳型の逆転写によって産生できる。−重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮ Ａ）プローブをハイブリッド形成反応に使用することによって、二重鎖または一 重鎖ＤＮＡプローブのどちらかを使用するよりもずっと潜在的に信号／ノイズ比 が大きくなる。

ｄ　５ＤＮＡ、ｓ　５ＤＮＡまたはｓ　５ＲＮＡプローブのいずれかをハイブリ ッド形成反応に使用するかにかかわらず、ハイブリッド生成を検知できる手段が 幾つかあるに違いない、ハイブリッド生成を検知する手段としては、幾つかの種 類の検知可能なラベルでラベル化したプローブを使用する。

抗体プローブもこの技術に精通した当業者には公知のものである。この「抗体プ ローブ」という用語はターゲット抗原に特定で、それと結合する抗体を意味して いる。このようなターゲット抗原は、ペプチド、プロティン、炭水化物または抗 体が結合して特異性を付与するようないかなる他の生体高分子であってもよい。

呈旦之λヱＡ 検知可能なラベルは、検知できるものであればどんな分子でもよい、普通使用さ れる検知可能なラベルとしては、“Ｉ　Ｐ、　ｌｌＩｃ、　Ｉｎ６　Ｉ、”Ｈ， ”Ｓのような放射性のラベルがあるが、これだけに限定するものではない、ビオ チンをラベル化したヌクレオチドは、ニック翻訳法、酵素性のまたは化学的手段 によって、ＤＮＡまたはＲＮＡに一体化させてもよい、ビオチニル化したプロー ブは、アビディン／ストレプトアビディン蛍光体、酵素性またはコロイド状金結 合体を用いてハイブリッド形成した後で検知する。また核酸は、別の蛍光性化合 物、免疫検知性蛍光性誘導体またはビオチン類似物でラベル化してもよい、また 核酸は、プロティンを付着させてラベル化してもよい、放射性または蛍光性のヒ ストンＨ１、酵素（アルカリホスファターゼおよびパーオキシターゼ）または− 重鎖の結合（ｓ　ｓ　Ｂ）プロティン架橋させた核酸も使用できる。コロイド状 の金、またはバーオキシターゼ産生物の検知感度を大きくするために銀溶液を用 いるような多数の強化または増幅方法を講じてもよい。

間接的な蛍光性免疫細菌化学法も使用できる［Ｒｕｄｋｉｎａｎｄ　５ｔｏｌｌ ａｒ、　（１９７７）　Ｎａｔｕｒｅ　：　２６５．４７２　；　Ｖａｎ　Ｐｒ ｏｏｉｊｅｎ。

ｅｔ、　ａｌ、、　（１９８２）　Ｅｘ　、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、＋　１４１． ３９７）　、ポリクローナル抗体は、ポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）と共に動物に 注射して、ＲＮ　Ａ−Ｄ　Ｎ　Ａハイブリッドに対し産生させる。ＤＮＡプロー ブは細胞にイン　シチュ　ハイブリッド化され、このハイブリッドを抗体でＲＮ Ａ−ＤＮＡハイブリッドに培養して検出する。

本発明によれば、ＲＮＡプローブの方がＤＮＡプローブよりも好適である（５〜 ８倍も効率が良い）。ビオチンの代わりにフォトビオチン（登録商標）でラベル 化したプローブはこの定量法の感度を２〜３倍も向上させる。

プローブの　さと プローブの長さは、その拡散速度、ハイブリッド形成速度およびハイブリッドの 安定性に影響する。本発明によれば、短いプローブ（５０〜１５０塩基）は最も 高感度で、迅速で安定な系となる。検知すべきターゲット生体高分子の全長に及 ぶこの短いプローブ（５０〜１５０塩基）の混合物も調製することができる８例 えばターゲット生体高分子が１０００塩基の長さであれば、約１０〜２０種の興 なる５０〜１００塩基のプローブが、このターゲット生体高分子の全領域を完全 にカバーするのにハイブリッドが溶液中に使用されている。

プローブの濃度はまた、イン　シチュ　ハイブリッド形成反応の幾つかのパラメ ータにも影響する。高濃度を使用すると、拡散を増加させ、ハイブリッド形成反 応時間を低減させ、妥当な細胞配列を飽和させる。本発明によれば、この反応は ３０分で完了する（第２図参照）。高い信号／ノイズ比を保持しながら反応速度 を早めるには、プローブの濃度を２．５〜５．０μｇ／ｍＱとすることが好まし い。またプローブ濃度が２．５μｇ／ｍＱであることがさらに好ましい。

ハ　ブト・　ノ　と゛ 好ましい実施例においては１本発明のハイブリッド形成溶液は、ホルムアミド５ ０容量％、４ＸＳＳＣ，（ｌｘｓｓＣ＝食塩０．１５モル＋シュウ酸ソーダ０． ０１５モル）、リン酸ソーダ（ｐＨ＝７．４）約０．１モル、低分子量ＤＮＡ約 １００μｇ／ｍＱ、トリトンＸ−１０００，１％、およびバナジル・リボヌクレ オシド錯体約１０〜２０ミリモルを包含する一重鎖ＲＮＡプローブもこの溶液に 加える。このプローブは少なくとも１５−２０の塩基よりなり、好ましくは７５ −１５０の塩基で、フォトビオチン（登録商標）でラベル化した。第１図に示す ように、ハイブリッド形成の最適温度は５０−５５℃である。しかし、１５から ８０”Ｃに及ぶ温度を使ってもよい。

ハ　ブト・トノ　几　゛ 本発明はハイブリッド検知前に洗浄段階を必要としない。

その代わりにアビディンまたはストレプトアビディン蛍光体、酵素状またはコロ イド状金錯体のハイブリッド形成混合液を包含し、室温で２０分間または３７℃ で１０分間培養したスライドガラスに直接添加してもよい。この段階は、幾つか の後ハイブリッド形成洗浄段階および不特定のアビディン／ストレプトアビディ ン結合サイトに必要な再抑制を省略することによって節約できる時間により従来 のハイブリッド形成法よりも著しい利点を得ることができる。またその結果信号 が低下することも、ノイズが増加することもない。

ストレプトアビディン／アビディン検知段階の後、大量の２ＸＳＳＣ／トリトン Ｘ−１０００，１％混合液で洗浄する。

この溶液には、室温下でＲＮアーゼＡおよびＴ１を包含させてもよい、この洗浄 は、連続した緩慢な循環またはストリ−ム状の大量（約１〜２００ｎＱ／細胞表 面積１ｄ当り）の溶液が細胞上を移動する限り極めて短時間（５分以下）でよい 、この後、さらに厳重に（少なくとも０．ｌＸ５ＳＣのような低塩濃度および／ または６５℃以上という高温で）洗浄してもよい、細胞表面を湿らせたまま、支 持体を乾燥し、通常の方法でカバーグラスを付ける。

ン　シ　ュ　ハ　ブ１　・・　゛　ノ　ゝよ　の　の３０足 本発明の方法は、１細胞当りターゲット生体高分子が１−５分子程度の場合の感 度で、測定を完了させるのに２−４時間を必要とする。このことは少なくとも下 記の３因子の組み合わせによって達成することができる。＝１）細胞構成体が核 酸上に非可逆的に沈着するものではない、２）固着は使用される特定組織では最 適の状態にある。３）反応動力学は高いプローブ濃度および高温下ではより迅速 に進行する。

１細胞当りのｍＲＮＡのコピー数は、放射性プローブを使用すると細胞上の数か ら評価できる。蛍光または酵素による検知の場合には、蛍光体または沈着した着 色産生物を相対評価することによってｍ　ＲＮ　Ａコピー数が評価できる。

通常このコピー数の近似は手動式の写真撮影、フィルム処理およびプリント画像 の比較よりもずっと容易である。イン　シチュ　ハイブリッド形成法で得られた 放射または蛍光信号の定量化は、実施例１１に示すＭａｒｉｄｉａｎ　ＡＣＡＳ 　４７０ワークステーシヨンのような画像解析法を使うと自動化できる。

３　のｍＲＮＡの口 本発明は、同一細胞内にある異なった物質（ｍＲＮＡｓやプロティン）を同時検 知することができる。このことは以下の２方法の中のいずれかで達成できる。第 １の方法は、それぞれが独自のラベル（例えば、蛍光性のタグ「Ａ」、ｒ１３Ｊ および「Ｃ」で、それぞれ異なった検知可能な波長の光を発光する。）を包含す る多種のプローブすべてを前記ハイブリッド形成溶液に添加する。一方、１種の プローブとラベルに対してハイブリッド形成、検知反応を実施し、残りの未反応 プローブとラベルをヌクレアーゼなしの条件下で洗浄して、別のハイブリッド形 成反応を実施する。実施例９は、同一細胞中に多種のターゲット生体高分子を有 する場合の検知に関する一実施例を示したものである。

以下に示す実施例は説明のために提示されたもので、本発明をいかなる方法によ っても限定するものではない、すべての実施例において、％は固体の場合は重量 ％を、液体の場合には容量％を表し、温度はとくに断らない限り℃で表されてい る。

遺】Ｕｉ上 ２コ辷二ｍ に精通した当業者に公知の方法にしたがって調整するか、またはいかなる市販の ソースから入手したものであってもよい、ＲＮＡプローブはＧｒｅｅｎら［（＋ ９８１）　Ｃｅ１ｌ　：　３２．６８１］の記載する方法で調整してもよい、Ｄ ＮＡプローブは、Ｒｉｇｂｙら［（１９７７）　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　：月３ ．２３７］の記載するような当技術に精通した当業者に公知の方法で調整しても よい０合成オリゴヌクレオチドプローブは、Ｗａｌｌａｃｅ、ら［（１９７９） 座圧１栢工、江１史Ｌシ巨工：　６　３５４３］の記載するようにして調整して もよい１本発明に有効なプローブは次の特徴を有している必要がある。

■ターゲット分子のための特異性をもつ。

■少なくとも長さが１５塩基対、好ましくは７５−１５０塩基対をもつ。

Ｂ　ＲＮＡプローブの Ｃ−ｍＶｃ、　Ｃ−心上または（−ａｔ旦遺伝子のサブ染色体断片をＡｍｅｒｓ ｈａｍ　Ｔｎｃ、社（カタログ番号：　ＲＰＮ、　１３１５Ｘ、　ＲＰＮ。

１３２４ＸおよびＲＰＮ、　１３２５Ｘに相当）から購入した。本発明の一実施 例では、前記ｃ−１，ｃ−幻１またはｃ−ａｂｌ遺伝子のセンス鎖プローブを使 用した。使用したｃ−９ニブローブはｃ−ｚ遺伝子の３′末端からの１．３　ｋ ｂ　Ｃ１ａＴ／ＥｃｏＲＩゲノム・クローン（Ｄｅｌｌａ−Ｆａｖｅｒａら［（ １９８３）　５ｃｉｅｎｃｅ　：　２］９．９６３］　）である、　ｃ−ａｂｌ プローブは、５’ｃ−ａｂｌハイブリッド化領域のＥｃｏＲＩ／Ｂａｇ　Ｈｌフ ラグメントであるヒトｃ−ａｂｌ遺伝子のサブクローンから誘導した（ｂｅ　Ｋ ｌｅｉｎら［（１９８２）　Ｎａｔｕｒｅ　：３００、７６５］　）　、　ｃ− ｓｉｓプローブは、ｃ−ｓｉｓ遺伝子の３′エンドに相当するクローンＬ３３の Ｂａｎ　ＨＩ断片（Ｊｏｓｅｐｈｓら［（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　：　２１ ９．５０３］　）である、ＨＩＶおよびＥＢＶプローブは、Ｄｅｗｈｕｒｓｔら ［（１９８７）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　：　２１３．１３３コの記載したものか ら入手し、調整した。ＣＭＶプローブは、Ｃｒｏｎｃｚｏｌら［（１９８４）　 ５ｃｉｅｎｃｅ　：　２２４．１５９］の記載したものである。これらの鋳型プ ラスミドＤＮＡ５はＣｒｅｅｎら［（１９８１）　Ｃｅ１ｌ　：　３２．６８１ コの記載する方法で転写した。

ＲＮＡの大きさおよび量はＴｈｏｍａｓ　［（１９８０）　Ｐｒｏｃ　ＮａｔＡ ｃａｄ　Ｓｃｉ　ｔｌｓＡニア７、５２０１］の記載する変性ａｇｒｏｓｅゲル を介して電気泳動法により、またＡ２６０およびＡ　２８０による分光分析法に より確認した。ＤＮＡベーター、ｚＪコＬ２プローブは、Ｃｅ１ｖｅｌａｎｄら ［（１９８０）　Ｃｅ１ｌ　：　２０．９５］に記載する方法で調整し、ＲＮＡ プローブはＢｒｅｓｓｅｒとＥｖｉｎｇｅｒ−Ｈｏｄｇｅｓ［（１９８７）　Ｇ ｅｎｅ　Ａｎａｌ、Ｔｅｃｈ、：　４　８９’］の記載し、ここで参考試料とし て引用した方法により、ホトビオチン（登録商標）でラベル化した。

プローブの１００倍の濃度で低分子量ＤＮＡを添加し、ポリヌクレオチド全部を ｌ／３容量の１０モル酢酸アンモニウムおよび２−１７２容量の９５％エタノー ルを添加して沈着させた。核酸は遠心分離によって回収し、水に再分散させて１ μｇ／ｍＱの濃度とし、使用時まで一７０℃で貯蔵した。

Ｃプローブ ウィルスまたはその抗原決定基のような抗！、ペプチドおよび種々のソースから 誘導されたペプチド、炭水化物の一部、多種の生体高分子に特定した抗体プロー ブは、当技術に精通した当業者には公知のものである。これらの抗体の調製方法 もまた当技術に精通した当業者には公知のものである。

簡単にいうと、ポリクローナル抗体は、ある抗原を持つ動物ホストの免疫化によ って調製できる。好ましくは、この抗原は一週間間隔で皮下に、続いて１ケ月後 にブースター投与し、さらに最終的には一週間間隔の投与を行う。その後、血清 を摂取し、この血清より抗体を沈着させ、当技術に精通した当業者には公知の技 術により検知自在なようにラベル化する。

モノクローナル抗原は、当技術に精通した当業者には公知の技術には公知の方法 のいずれかにしたがって調製してもよい、免疫化されたドナーから骨髄腫細胞と 膵臓細胞間の溶融は、例えば腫瘍やウィルスのようなターゲット抗原に対して大 量のモノクローナル抗体を産生できる遺伝学的に安定なハイブリドーマ細胞の連 続細胞ラインの産生方法として成功したものであることが証明されている。たと えばモノクローナル抗体はＫｏｐｒｏｉｖｓｋｉ　らによる米国特許第４、１７ ２．１２４号公報または同じ＜　Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ　らによる米国特許第４， １９６，２６５号公報に記載の方法で調製してもよい。

抗体のラベル化法は、当技術に精通した当業者には公知のものである。

ス［２： ハ　ブト・トノ　に　６ に５６２細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ　２４３）を、１０％の胎児仔牛血清を加えた Ｈａｎｋの均衡塩溶液で育成させた０分割した細胞を細胞遠心分離機でスライド ガラス上に沈着させた。

この細胞をエタノール７５％、氷酢酸２０％、水５％の混合液を用い、室温で２ ０分間かけて固着させた。プレハイブリッド形成段階は実施しなかった。ホルム アミド５０％、４ＸＳＣＣ１０，１モルリン酸ソーダ（ｐＨ＝７．４）、トリト ：／Ｘ−１０００，１％、低分子量ＤＮＡ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　 Ｃｏ、社から入車した鯨の精液ＤＮＡから得たもの）１００μｇ／ｍＱ、および ハイブリッド形成フォトビオチンでラベル化したＣ−ｆｎＶｃ。

ｃ−ｓｉｓまたはｃ−ａｂｌ型のいずれかのアンチセンスＲＮＡプローブ２．５ μｇ／ｍＱよりなるハイブリッド形成溶液２０μｍを各試料に添加した。このア ンチセンスＲＮＡプローブは実施例１に記載した方法で調製した。ハイブリッド 形成反応は４〜８０℃の間の種々の温度で実施した。所定の温度で２時間培養さ せた後、ハイブリッドの出来具合を検討した。ハイブリッド形成を検知するため に、この試料にメーカーの薦める濃度の２倍のストレプトアビディン蛍光体また はローダミン錯体を添加した。室温で３０分間培養させた後、試料を、細胞表面 積１−当たり１〜２００＋ｎＱの０．１％トリトンＸ−１００，２ＸＳＳＣ，１ ｘＳＳＣ，ｏ、５ｘｓｓｃおよび０．１×ＳＳＣを含む各溶液で順次洗浄した。

光増幅管アタッチメントの付いたＮ１ｋｏｎ蛍光顕微鏡を用いて１細胞当たり発 する蛍光を種々の温度でハイブリッド化した各スライドについて記録した。１ス ライド当たり約３００〜８００の細胞について分析を行った。各細胞について蛍 光量を表すのに得た数値結果を、ハイブリッド形成の温度と相対蛍光値で図示し た。

第１図に示す結果は、５０〜５５℃のハイブリッド形成温度が本発明に基づくハ イブリッド形成法で最高のハイブリッド形成に相当する最大相対蛍光値を付与す ることを示している。

ＸｊＭＪＬ３Ｌ＝ ン　シ　ュ　バイブ１　ζ−ド　ヅ　の　μ第２図は、ハイブリッド形成時間と 細胞上に見られる蛍光信号量との関係を示す。Ｋ５６２細胞（Ａ　Ｔ　ＣＣ：　 ＣＣＬ２４３）を１０％の胎児仔牛血清を加えたＨａｎｋの均衡塩溶液で育成さ せた。分割した細胞を細胞遠心分離機でスライドガラス上に沈着させた。細胞は エタノール７５％、氷酢酸２０％、水５％よりなる混合液により、室温下で２０ 分間固着させた。プレハイブリッド形成段階は実施しなかった。ホルムアミド５ ０％、４ＸＳＳＣ，０，１モルリン酸ソーダ（ｐＨ＝７．４）　、０．１％トリ トンＸ−１００，低分子量Ｄ　Ｎ　Ａ　（ＳｉｇｍａＣｈｅ＋＋＋１ｃａｌ　Ｃ ｏ、社から入手した鯉の精液ＤＮＡから得たもの）１００μｇ／ＴＩＱ、および ハイブリッド形成フォトビオチンでラベル化したｃ−１ＬＬ−ｃ−ｓｉｓまたは ｃ−ａｂｌ型のいずれかのアンチセンスＲＮＡプローブ２．５μｇ／ｍＱからな るハイブリッド形成溶液２０μｌを各試料に添加した。このアンチセンスＲＮＡ プローブは実施例１に記載した方法で調製した。

このハイブリッド形成反応は５分から９６時間におよぶ種々の時間で行った。５ ５℃で所定時間培養させた後、ハイブリッドの出来具合を検討した。ハイブリッ ド形成を検知するため、この試料にメーカーの薦める濃度の２倍のストレプトア ビディン蛍光体またはローダミン錯体を添加した。室温で３０分間培養させた後 、試料を細胞表面積１ａＩＩ当たり１〜２００ｍ１の０．ＩＸ　Ｓ　Ｓ　Ｃ１０ ，１％トリトンＸ−１００でゆっくりと洗浄した。１００％グリセリン／２ｘＰ ＢＳの５０１５０　（容量ＣＣ）を溶液を１滴ずつ各試料に添加した。光増幅管 アタッチメントの付いたＮ１ｋｏｎ蛍光顕微鏡を用いて、１細胞当たり発する蛍 光を種々の時点でハイブリッド形成した各スライドについて記録した。１スライ ド当たり約３００〜８００の細胞について分析を行った。各細胞について蛍光量 を表すのに得た数値結果を、ハイブリッド形成の対時間相対蛍光値で図示した。

第２図は、ハイブリッド形成反応が本発明に基づく条件下で３０分後に本質的に 完了することを示している。

１１目１先： 細胞ＲＮＡの２次構造の変化 ＨＬ６０細胞（ＡＴＣＣ３ＣＬＬ　２４０）を、１０％の胎児仔牛血清を補足し たＨａｎｋのバランス塩溶液で育成させた。

細胞は回収し、細胞遠心分離機で顕微鏡用スライドガラス上に沈着させた。この 細胞をスライドガラス上で空気乾燥し、使用時まで室温で貯蔵した。またこの細 胞を、この種の実験ではいくつかの固着剤の一つで固着させた。代表的な固着剤 としてはエタノール７０％、エタノール９５％／氷酢酸５％、エタノール７５％ 、氷酢酸２０％、メタノール１００％、アセトン１００％、アセトン５０％、メ タノール５０％、パラホルムアルデヒド４％、パラホルムアルデヒド２％、ホル ムアルデヒド１０偽／メタノール９０％の溶液が含まれる。これらの固着剤中で 適当な時間、適当な温度で細胞を固着した後、スライドから固着剤を除去し、標 準実験室法によってＷｒｉｇｈｔ　Ｇｉｅｍｓａまたはヘマトキシリンおよびエ オシンで染色した。細胞形態は、固着した後の形態の保存度を固着する前の形態 と比較することによって評価する。視覚形態を有効に保持できない固着剤には、 任意に＋１と格付けした。

細胞形態を有効に保持した固着剤は＋１〜＋４の間に任意に格付けされ、細胞形 態の最も有効に形態保持できたものには＋４と格付けした。これらの固着剤によ る細胞有効保存に関する次の評価は、細胞抗原を検知したい時に実施できる。こ の場合細胞は固着剤から取り出して特定のターゲット細胞抗原に特異的な抗体と 共に培養される。再び、細胞組成物の抗原性を有効に保持する固着剤を任意に＋ ４と格付けしたが、細胞保持を有効に実施できない固着剤はずっと低く評価され 、最悪のものは＋１と格付けされる。細胞形態の保持および／または細胞抗原性 の保持に関して＋３または＋４という格付けの固着剤を次の段階で使用した。

未処理の細胞を含有する新しいスライドガラスをこれらの固着剤で固着し、ホル ムアミド５０％、４ＸＳＳＣ，リン酸ソーダ（ｐＨ７，４）　０，１モル、　０ ．１％トリトンＸ−１００、低分子量ＤＮＡ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｏ０社から入手した鯨の精液ＤＮＡから得たもの）１００μｓ／ｄを含有す るハイブリッド形成溶液中で培養した。この形成溶液には、生体高分子プローブ は全く含有されていなかった。この細胞を、５０−５５℃の温度で、５　、１０ ．１５．２０．３０．４５．６０．９０．１２０分間ハイブリッド形成溶液中で 培養した。このハイブリッド形成段階終了後に細胞試料を細胞表面積ＩＣＩＩ！ 当り１−２００ｍ１の０．１％トリトンＸ−１ｏＯ，２ｘＳＣＣ，１ｘＳＣＣ， ０，５ｘＳＣＣ，０，１ｘ　ＳＣＣを含有する各形成溶液で静かに洗浄した。こ の後細胞試料を前記のようにして、細胞形態の保持および／または細胞抗原性の 保持について評価を行った。この後さらに、細胞試料５０μｇＩｔｘＡのヨウ化 プロビジウム液で染色して評価を行った。このヨウ化プロビジウム液で細胞内の 二重鎖および一本鎖核酸を染色すると、核酸は紫外線で励起されて別の特徴のあ る放射スペクトルをもつようになる。またスライドガラス上の未処理の細胞試料 も染色する。放出された蛍光の全量を、光増幅管アタッチメントの付いたＮ１ｋ ｏｎ蛍光顕微鏡を使って、未処理の細胞試料について測定した。

細胞質二重鎖ＲＮ　Ａ含有量から放出される全蛍光量に関して、３００−１００ ０個の細胞について記録した。つぎに、この測定結果を、細胞質による全蛍光の ベースラインレベルとした；すなわち細胞質中の全ＲＮＡを表し、かつこのＲＮ Ａがすべて二重鎖状態にあるものとした。種々の固着剤とハイブリッド形成方法 および時間を介して作成したスライドガラスについて同様の解析を行った。どの 場合にも、細胞の細胞質中に同じ量の蛍光を保持させるような固着剤、ハイブリ ッド形成条件および時間を選択する必要がある。

ハイブリッド形成処理中、細胞の細胞質のＲＮＡから放出される蛍光はヨウ化プ ロピジウムの染色によって変化を受ける。すなわち、ＲＮＡの二重鎖に関連して 発光の度合いが低下する。同時に、細胞質中の一本鎖ＲＮＡの量を反映する波長 の発光が増え始める。ＲＮＡによる細胞質の全蛍光量が同一にとどまり、細胞質 中の二重鎖ＲＮＡの量による蛍光量が約７０％まで低下し、一方細胞質内の一本 鎖ＲＮＡに相当する蛍光量が同量となるところまで増えると、細胞質内の１−５ 分子のＲＮＡを検知可能とする条件が得られるようになっている。細胞質中のＲ ＮＡの二重鎖から一本鎖へのこのような移行を達成するのに必要なハイブリッド 形成反応時間は、実際のハイブリッド形成反応でＲＮＡの１細胞当り１−５分子 を検知するのに必要な時間を反映している。

とくに第３図において、二重鎖ＲＮＡ含有量の相対値がなると、曲線はますます 右に移行する。細胞質中のＲＮＡの二重鎖から一本鎖への量の移行が大きくなる につれて、曲線の右から左への移行がますます大きくなる。この縦軸はカウント された細胞の数を表している。換言すると、もし３００−１０００１の細胞をカ ウントしたら、その大部分は二重鎖の特定部分内にある。いくつかの細胞は二重 鎖が多いが中には二重鎖の少ないものもあるので、この分析はベル型の曲線を示 す。図の右半分は種々の処理を受けたことを示している。未処理の細胞をヨウ化 プロビジウムで染色した結果は示されていない。しかし、ＨＬ６０細胞を種々の 固着剤で処理した後細胞ＲＮＡの二重鎖の量が全く同一のままであった。たとえ プロテアーゼ処理を含有するプレハイブリッド形成処理を行ったとしても、ＲＮ Ａの二重鎖の量には全く変化はなかったものと思われる。第３図のプロテアーゼ 処理に相当する曲線は、固定化処理の曲線と同じ位置にある。この曲線は右にも 左にも移行していなかった。しかし、ハイブリッド形成溶液中で１５分間処理し た後には、ＲＮＡ二重鎖の量を示す曲線は左へ少なくとも７０％移行していた。

このことは細胞の細胞質中物質量の少なくとも７０％が一本鎖に変化したことに 相当している。この図を第２図と比較すると、ハイブリッド形成混合液中で１５ 分後に細胞の細胞質のＲＮＡの７０％が一本鎖であるだけでなく、第２図にみら れるようにハイブリッド形成反応の７０％が終了していることがわかる。

ス】ｕｌｉ Ｃ１ｃ　ン　の Ｂａ１ｂ／ｃ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ　１６３）を、８−チャンバー・ス ライド［Ｔｉ５ｓｕｅ−Ｔｅｋ　：　Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂ社製コ上に媒体中の密 集拘束して育成させた。この媒体［１０％の胎児仔牛血清（ＦＣＳ）を加えたＨ ａｎｋの均衡塩形成溶液（ＢＳＳ）］を血清を含まない媒体と交換し、細胞血清 を一夜飢餓させた。この後多種試料を、Ｈａｎｋ　ＢＳＳ中１５％ＦＣ３の存在 下または不存在下のいずれかで３７℃、４５分間培養させた。

細胞を、アセトン５０％、メタノール５０％の混合液で室温下で２０分間固着さ せた。

プレハイブリッド形成段階は実施しながった。ホルムアミド５０％、４ｘｓｓｃ 、リン酸ソーダ（ｐＨ７，４）　０．１モル、０．１％トリトンＸ−１００、低 分子量ＤＮＡ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ。

社から入手した鯨の精液ＤＮＡから得たもの）　１００！、Ｌｇ＃ａＱおよびフ ォトビオチン（登録商標）ラベル化したｃ−ＬエアフチセンスＲＮＡプローブ２ ．５μｇ／−を含有するハイブリッド形成溶液２０μＱを各試料に添加した。こ のｃ−シニアンチャンスＲＮＡプローブは実施例１に記載した方法に基づいて調 製した。５５℃で２時間培養させた後、ハイブリッド形成生成を検知した。

ハイブリッド形成を検知するため、ストレプトアビディン蛍光錯体［Ｇｕｅｓｄ ｏｎ、　Ｊ、　Ｌ、ら（１９２９）　Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅ＋＋＋。

Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、　２７．１１３１コはメーカーの薦める（Ｂｅｔｈｅｓｄ ａＲｅｓ、　Ｌａｂ、；カタログ＃９５３８ＳＡ　；推薦濃度＝７．５μｇ／ｄ ）　２倍の濃度を試料に添加した。室温で３０分間培養した後、トリトンＸ−１ ０００，１％と２　Ｘ５ＳＣ，１ｘＳＳＣ，０，５ｘＳＳＣおよび０、ｌ　Ｘ　 ＳＳＣを含む各形成溶液で順次試料を、（細胞表面積１ｄ当りｌ−２００ｍで） 静かに洗浄した。１００％グリセロール／２ｘＰＢＳの５０１５０　（容積比） 溶液を１滴ずつ各試料に添加した。各試料を、Ｎ１ｋｏｎ写真顕微鏡を用いて蛍 光透過用標準組み合わせフィルターを使って倍率４００倍、高速度フィルム（Ｋ ｏｄａｋ　ＥＥＳ１３５．　ＰＳ８００／１６００）　ＡＳＡ１６０で写真撮影 を行った。

この写真は通常の方法（ｍＲＮＡドツトプロット、Ｎｏｒｔｈｅｒｎプロットお よびハイブリッド形成溶液）で表示し、Ｃ−ｍ２Ｈ発ガン遺伝子は血清飢餓細胞 中には認められず、血清励起細胞中には１細胞当り１−１０コピーが誘導されて いることが認められた（Ａｒｍｅｌｉｎ、ら［（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　： ３１０、６５６］　）。本発明に基づくイン　シチュ　ハイブリッド形成法によ ってＣ−工ｍ　ＲＮ　Ａを表示するため検討を行った細胞を第４Ａ図と第４Ｂ図 に示した。血清飢餓Ｂａ１ｂ／ｃ３Ｔ３細胞中にはＣ−９二ｍ　ＲＮ　Ａは検知 できなかった（第４Ａ図）が、本発明に基づく方法により血清励起された細胞中 には１−１０コピーのＣ−ｍ２５　ｍ　ＲＮ　Ａ　が検知された（第４Ｂ図）。

３１目１１ 血　の　ン゛　の ヒトの末梢血液１０ｄまたはヒトの骨髄細胞２−を１．２％のシュウ酸アンモニ ウム形成溶液（２１５ｍＯｓ）中、３７℃で培養し、赤血球を分離した。白血球 は臨床遠心分離機で３００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離した。次に細胞ペレット をｌＯ−のＰＳＥで洗浄し、ＰＳＢ中に再懸濁させた。この細胞を細胞遠心分離 機で、前洗浄したスライドガラス上に載置させ、５分間空気乾燥した。この後細 胞をエタノ−シフ５％／酢酸２０％混合液で、室温下で２０分間処理して固着さ せた。

プレハイブリッド形成段階は実施しなかった。ホルムアミド５０％、４ＸＳＳＣ ，リン酸ソーダ（ｐＨ７，４）　０．１モル、トリトンＸ−１００，０，１％低 分子量ＤＮＡ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ。

社から入手した鯨の精液ＤＮＡから得たもの）１００μｇ／ｍＱ、フォトビオチ ン（登録商標）でラベル化したＣ−ｒｇ５．　Ｃ−５ｉｓまたはＣ−ａｂｌアン チセンスＲＮ　Ａプローブ２．５μｇ／ｄを含有するハイブリッド形成溶液２０ μＱを各試料に添加した。

このＧ−ｍｘｓアンチセンスＲＮＡプローブは実施例］に記載した方法で調製し た。５５℃で２時間培養した後、ハイブリッド形成を検知した。

ハイブリッド形成を検知するため、ストレプトアビディン蛍光体錯体をメーカー の推薦する濃度の２倍で試料に添加した。室温で３０分間培養した後、トリトン Ｘ−１０００，１％と２　Ｘ５ＳＣ，Ｉ　Ｘ５ＳＣ，０，５ＸＳＳＣおよび０、 ｌ　Ｘ　ＳＳＣを含むそれぞれの形成溶液で順次試料を（細胞表面積１ｄ当り１ −２００威で）静かに洗浄した。１００％グリセロール／２ｘＰＢＳの５０１５ ０　（溶液比）溶液を１滴ずつ各試料に添加した。各試料について蛍光を透過す る標準フィルターの組み合わせを用いて、Ｎ１ｋｏｎ写真顕微鏡で倍率４００倍 、高速度フィルム（Ｋｏｄａｋ　ＥＥＳ１３５．　ＰＳ８００／＋６００）　Ａ ＳＡ１６００で２０秒露光による写真撮影を行った。

第５図には、正常な骨髄（ＢＭ）　、正常な末梢血液（ＰＢ）、または慢性骨髄 白血病（ＣＭＬ）の患者来庁血液中の３種の異なる発ガン遺伝子の発現に関する イン　シチュハイブリッド形成の研究結果を図示したものである。血液は患者が 病気の慢性段階にあるかまたは病気の芽段階にあるかいずれかの時、これらの患 者から採取した。第５図には、左側にＣ−５ｉｓ、　Ｃ−チェおよびＣ−ａｂｌ と分析された３種の異なる発ガン遺伝子が示されている。ＢＭまたはＰＢとして プリントの下方に示した数字は、左側に示した発ガン遺伝子試料中の細胞％を示 すものである（ＢＭ、ＰＢ、慢性または芽と記されている）。プリントの各行下 部には、形成ハイブリッド後に得られた相対蛍光照度が図示されている。この相 対蛍光照度は各細胞内にあるＲＮＡ量を表しており、細胞塩１個当りという単位 で記録されている。慢性段階のＣＭＬは、末梢血液中の細胞の５％以下が芽とし て生きていることを明示している。事実、我々は末梢血液中の細胞の５−ｌＯ％ が検討中の３種の遺伝子を過大に表示していることを知った。これらの遺伝子の 発現はまたこのプリント中および図中のプリントの下部の両方にみられるように 正常のＢＭまたはＰＢのいずれかと比較しても相当高く表されている。芽として 末梢血液中で生きている細胞の３５％以上を占めると定義されている病気の芽段 階では、我々は細胞の７０％以上がＣ−５ｉｓ、　Ｃ−ジ泣およびＣ−ａｂｌと いう３種の発ガン遺伝子を典型的に表示していることを認めた。これらの遺伝子 の発現は、正常な骨髄または正常な末梢血液と比較すると、高くはなっているが 、プリントおよび図中の両方で見られるようにこの病気の慢性段階の単一細胞塩 基で示されたとき、これらの遺伝子の発現よりもかなり低かった。

ス上■工 の　ン゛　の 外科で切除された生検試料から得られたヒト胸部組織の厚さ４μｍの冷凍部分を 予め洗浄しであるスライドグラス上に乗せ、メタノール５０％の混合液で室温で ２０分間処理して固着させた。この組織を、ホルムアミド５０％、５ＸＳＳＣ。

リン酸ソーダ（ｐＨ７，４）　０．１モル、バナジル・リボヌクレオシド錯体（ Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）２０ミリモル、低分子量の変性鯨 の精液ＤＮＡ１００μｇ／ｄ、およびトリトンＸ−１０００，１％を含有するハ イブリッド形成混合液を使って、５５℃で培養し、４時間ハイブリッド形成を行 った。フォトビオチンで処理したＲＮＡプローブ（実施例１に記載した方法で調 製）を２．５μｓ／ｎｉｌの濃度でハイブリッド形成混合液に添加した。またブ ランクパネルにはこのプローブは添加しなかった（第６図参照）、スライドガラ ス上に直接アビディン／ストレプトアビディン（Ａ／ＳＡ）溶液でラベル化した 蛍光剤を添加してハイブリッド形成を検知し、室温で３０分間培養を行った。こ のスライドガラスを洗浄し、カバーグラスを乗せて実施例６に記載した方法で写 真撮影した。

第６図は、イン　シチュ　ハイブリッド形成法によるｍＲＮＡの結果および繊維 膿嚢症の上皮成分（第６図、パネルｒＳ　Ｉ　ＳＪ参照）および乳酸化腺腫（第 ６図、パネルｒＳ　Ｉ　ＳＪ参照）中のＳＩＳ／ＰＤＧＦ−Ｂ発現の局部化、を 図示したものである。フォトビオチン化したＩ）ＮＡプローブによるイン　シチ ュ　ハイブリッド形成法はストローマ中はもちろん繊維細胞の上皮細胞中のアク チン遺伝子（第６図、パネルｒＡＣＴＩＮＪ参照）の発現を顕示している。この 図で、下方のパネルは組織の位相差顕微鏡特性が対照的であることを示している 。

１１皿エ ビ　血　のＨＩＶの ヒトの末梢血液１０ｍ１またはヒトの骨髄細胞２−を１．２％のシュウ酸アンモ ニウム溶液中３７℃で培養し、赤血球を分離した。白血球は臨床遠心分離機を用 いて３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次に細胞ペレットを１０７２のＰ ＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁させた。この細胞を細胞遠心分離機で前洗浄し たスライドガラス上に沈着させ、５分間空気中で乾燥させた。この後細胞をエタ ノール７５％／酢酸２０％混合液で室温下で２０分間固着させた。

プレハイブリッド形成段階は実施しなかった。ホルムアミド５０％、４ＸＳＳＣ ，リン酸ソーダ（ｐＨ７，４）　０．１モル、トリトンＸ−１０００，１％、低 分子量Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ。

社から入手した鯨の精液ＤＮＡから得たもの）１００μｇ／ｍＱ、フォトビオチ ンでラベル化したＨＩＶアンチセンスＲＮＡプローブ２．５μｇ／ａｄを含有す るハイブリッド形成溶液２０μＱを各試料に添加した。このアンチセンスＲＮＡ プローブは実施例１に記載した方法で調製した。５５℃で２時間培養した後、ハ イブリッド形、成を検知した。

ハイブリッド形成を検知するため、ストレプトアビディン蛍光体錯体を、メーカ ーの推薦する濃度の２倍で各試料に添加した６室温で３０分間培養した後、試料 をトリトンＸ−１０００，１％と２　Ｘ５ＳＣ，Ｉ　Ｘ５ＳＣ，０，５ＸＳＳＣ および０．ｌＸ５ＳＣを含むそれぞれの溶液で試料を（細胞表面積１ｄ当り１− ２００ｄで）静かに洗浄した。１００％グリセロール／２ＸＰＢＳの５０／　５ ０　（容積比）溶液を１滴ずつ各試料に添加した。各試料について蛍光透過性の 標準フィルターの組み合わせを用いて、Ｎ１ｋｏｎ写真顕微鏡で高速度フィルム （Ｋｏｄａｋ　ＥＥＳ１３５、　ＰＳ８００／１６００）　ＡＳＡ１６００で２ ０秒間露光による写真撮影を行った。

第７図−１Ｏ図には、エイズ患者または新しい患者の試料から誘導した細胞コン トロールラインに対するＨｒＶ同定により得られた結果が図示されている。第７ 図で、左側に（＋）で示したＨＩＶに感染したかあるいは左側に（＝）で示した ＨＴＬＶ　Ｉに感染したかどちらかの細胞コントロールラインのものを、下記の ような４種の異なるＨＩＶ領域の遺伝子；旦工旦、旦ΣＶエエ］」二または１エ Ｒとハイブリッド化させた。もし他の方法で説明されていなかったなら、アンチ センスＲＮＡプローブがこのハイブリッド形成法で使用されていたはずである。

最初の４枚のパネルは、これらの遺伝子を感染させたプローブ中のＨＩＶと容易 に同定できることを示していた。ＧＡ旦、エエニ　エ込」ニセンスプローブであ るコントロールプローブではＨＴＶ配列を検知できなかった。これらは間違いな く陰性（ネガティブ）である。ＨＩＶを検知するための最初のパネルに使用した アンチセンスＲＮＡプローブは特定のものであった。これらのプローブは下の２ 枚のパネルに示したように、例えばＨＴＬＶ　Ｉのような他のウィルス配列とは 交差反応しなかった。第８図にはＧＡＧおよびＥＮＶプローブをカボジ肉腫（Ｋ Ｓ）の患者のＨＩＶ検知に使用すると、このウィルスは新しい末梢血液で容易に 同定できることが示されている。この血液について実施したコントロール、これ らと同じ遺伝子用のセンスストランドコントロールおよびブランク（プローブな し）は、予想した通り陰性であった。これらと同じプローブについては、第８図 に示したように、エイズ関連錯体（ＡＲＣ）の患者のウィルスについても同定を 行った。これらのコントロール、センスストランドＲＮＡ、ブランクも陰性であ った。第９図には、これらと同じアンチセンスＲＮＡプローブについてエイズ患 者のＨＩＶの同定を行った。これらのコントロール、センスストランドＲＮＡ、 ブランクも陰性であった。

第１０図には、これらのプローブでは無症候性で血清陽性（Ａｂ＋）の個体中の ＨＩＶの存在が同定できた。その結果、コントロールは陰性であった。これらの プローブは未感染の正常個体中のＨＩＶとは交差反応せず、ＨＩＶを検知できな かった（第１０図）。

１ム且旦 ヒ　血　の３　のｍＲＮＡ５の口 初期か連期の慢性骨髄白血病患者の新しい末梢血液を静脈穿刺して採取した。赤 血球をシュウ酸アンモニウムで溶かした。白血球は実施例６に記載した方法で調 製し、スライドガラス上に沈着させた。これを固着した後、この試料に先の実施 例６に記載した方法に下記のような修正を加えていくつかのハイブリッド形成段 階を介して処理を行った：Ｃ−５ｉｓ遺伝子用プローブを実施例５に記載したイ ン　シチュ　ハイブリッド形成溶液を用いて１時間スライドガラス上で培養させ た。ハイブリッド形成を検知するためストレプトアビディン／ローダミンを使用 した。この検知の後の洗浄段階では、すべての溶液はＲＮアーゼを含まず、Ｄ− ビオチン０．０１モルを含んでいた。ハイブリッド形成はＣ−Ｈ匹遺伝子用の第 ２のプローブについて繰り返して行い、１時間後形成されたハイブリッドをスト レプトアビディン−ＦＩＴＣを用いて検知した。洗浄は前記と同様に繰り返して 行い、最後のハイブリッド形成処理はＣ−ａｂｌ遺伝子用のプローブについて実 施した。このプローブに対して形成されたハイブリッドをアルカリホスファター ゼと共役したストレプトアビディンを用いて検知を行った。この試料は、実施例 ５に記載した方法で各洗浄液のそれぞれにＲＮアーゼＡｌ−１０μｇ／ｄを含有 させて洗浄を行った。アルカリホスファターゼの基質にトロプル　テトラゾリウ ムおよび５−ブロモ、４−クロロ、３−インドールリン酸塩）を添加し、室温下 ５分間のニトロプル　テトラゾリウムの還元を実施した。

多種の異なったｍＲＮＡ種に対する同時検知を実施するため、このイン　シチュ 　ハイブリッド形成技術を用いて、慢性骨髄血友病患者の末梢血液中の同じ細胞 内でＣ−５ｉｓ。

Ｃ−工およびＣ−ａｂｌ全ての過大表示の発生を認めた。第１１図には、Ｃ−ｍ ｙｃ発ガン遺伝子ｍＲＮＡ　（左側パネルの「ＭＹＣＪ）を含有する細胞がスト レプトアビディン蛍光錯体のプローブとターゲット生体高分子配列間で形成され たハイブリッドとの反応による緑色発光の存在から検知できた。

また同じ細胞がアビディン／ストレプトアビディン、ローダミンと反応済みプロ ーブとの反応の存在によって生じる赤色発光の検知によりＣ−５ｉｓ発ガン遺伝 子ｍＲＮＡ　（中央のパネルのｒｓ　Ｉ　ＳＪ　’Ｉを含有することも認められ た。この細胞内にＣ−ａｔ江発ガン遺伝子ｍＲＮＡ　（ｒＡＢＬＪ　）が存在す ることは、暗青色の、ニトロプル　テトラゾリウム反応沈着物が存在することに よって右側パネルで示されている。

第１２図には、第１１図と同じ結果ではあるが、別の一息者の試料を用いてＣ− ａｂｌ　発ガン遺伝子ｍＲＮＡの存在の同定に別の検知法を採用したことが示さ れている。この場合、アルカリホスファターゼでラベル化したストレプトアビデ ィンの代わりに、前記の検知段階ではコロイド状の金でラベル化したストレプト アビディン（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓ、Ｌａｂ。

社カタログ＃９５３２ＳＡ　；　Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ、　Ｍ、　［（１９８ １）　菫工庄坦。

Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　肚江匹並反：　１１．９］　）を使用した。これ以上の処理 は不必要で、細胞は前記と同じ方法で洗浄した。明視野または位相差顕微鏡のい ずれかの方法を用いたとき細胞内に見られる黒色析出物またはグレインの存在、 あるいははエビ偏光か暗視野かいずれかの顕微鏡を用いたとき、光の明白色部分 の真情化が、この細胞がプローブ、この場合にはＣ−ａｂｌ遺伝子に対して本質 的に相補的なターゲット生体高分子ｍＲＮＡ配列を含有することを示していた。

ス】Ｕ１胆 血　の　ブローインの ヒトの末梢血液１０ｍＱを１．２％のシュウ酸アンモニウム溶液中３７℃で培養 して赤血球を溶解させた。この白血球を臨床遠心分離機を用いて３０００ｒｐｍ で１０分間処理して遠心分離させた。この後細胞ペレットを１０威のＰＢＳで洗 浄し、さらにＰＢ≦中に再懸濁させた。この細胞を細胞遠心分離機で前洗浄した スライドガラス上に沈着させ、５分間空気中で乾燥させた。この後細胞をエタノ −シフ５％／酢酸２０％の混合液で室温下で２０分間固着させた。

プレハイブリッド形成段階は実施しなかった。ホルムアミド５０％、４ＸＳＳＣ ，リン酸ソーダ（ｐＨ７，４）　、　０．１モル。

トリトンＸ−１０００，１％、低分子量ＤＮＡ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌＣｏ、社から入手した鯨の精液ＤＮＡから得たもの）１００μｓ／ｍＱ、フォ トビオチンでラベル化したＣ−ａｂｌアンチセンスＲＮＡプローブ２．５μｇ／ ｄを含有するハイブリッド形成溶液２０μＱを各試料に添加した。このアンチセ ンスＲＮＡプローブは実施例１に記載した方法で調製した。５５℃で２時間培養 した後、ハイブリッド生成を検知した。

ハイブリッドを検知するため、ストレプトアビディンローダミン錯体を、メーカ ーの推薦する濃度の２倍で各試料に添加した。この培養中、Ｃ−ａｂｌ遺伝遺伝 土酸生物ｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　＆　Ｆｒｅｎｃｈ社のＤｒ、Ｒｕ５ｓｅｌ　Ｇｒ ｉｅｇから提供を受けた）に対して発生したラビットポリクローナル抗体をに５ ６２細胞を陽性にラベル化する濃度で試料に添加したが、蛍光ラベル化アンチラ ビットＩｇＧを添加するとＨ６０細胞中には検知可能な信号が認められなかった 。

室温で３０分間培養した後、試料をトリトンＸ−１０００，１％と２　Ｘ５ＳＣ ，Ｉ　Ｘ５ＳＣ，０，５ＸＳＳＣおよび０．Ｉ　Ｘ　ＳＳＣを含むそれぞれの溶 液で順次（細胞表面積１−当り１−１−２Ｏ０で）静かに洗浄した。１００％グ リセリン／　２　ＸＰＢＳ（７）５０１５０　（容積比）溶液を１滴ずつ各試料 に添加した。各試料について蛍光透過性の標準組み合わせフィルターを用いて、 Ｎ１ｋｏｎ写真顕微鏡により、高速度フィルム（Ｋｏｄａｋ　ＥＥＳ　１３５． 　ｐｓｓｏ。

／１６００）　ＡＳＡ１６００で２０秒間露光による写真撮影を行った。

Ｃ−ａｂｌ　ｍ　ＲＮ　Ａとプロティンが慢性骨髄白血病（ＣＭＬ）の患者中の 同じ細胞内に過剰生産されていることは公知である（Ｓｔａｎ、ら［Ｎ、　Ｅｎ ｎｇｌ、ＪｌＭｅｄ、　：　３１３．１４２９コ　；Ｋｏｎｏｐｋａ、Ｊ、Ｂ　 ４　Ｗｉｔｔｅ、Ｏ，Ｎ、［（１９８４）　Ｃａ１ｌ　：　３７．　３１１６］ 　）　。

本発明を採用すれば、ＣＭＬ患者の末梢血液細胞はＣ−ａｂｌ遺伝子に相当する ｍＲＮＡの存在と同時に、前述したように、Ｃ−凪プロチイン産生物の存在が立 証された。第１３Ａ図は、反応済みの抗体からのフルオロレセインによる蛍光発 光によりプロティンが容易に検知できることを示している。同じ細胞について第 １３Ｂ図は、ローダミンによる蛍光発光に基づ＜Ｃ−ａｂｌｍＲＮＡの存在が検 知できることを示している。

遺ＪＬｆ凱■ 一′の に５６２細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＬＬ　２４３）を、１０％の胎児仔牛血清を補足し たＨａｎｋのバランス塩溶液で育成させた。この媒体中における最終変異終了３ 日後に細胞を新鮮媒体０．３ｄ当り約１０°個の細胞密度になるように分割した 。１時間後、細胞遠心分離機でスライドガラス上に５０．０００−１００．００ ０個の細胞を沈着させて６０個のレプリカスライドガラスを作成した。残りの細 胞はかき集めて、グアジニウムセシウムクロライド法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら［（ １９７９）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、卦。

５２９４］　）によりこの細胞がらＲＮＡおよびＤＮＡを抽出した。

細胞ラインは比較的均一な個体数であったので、抽出したＲＮＡを精製し、分析 した各ＲＮＡ種のコピー数評価用に使用した。すなわち、この技術に知識をもち 精通した当業者には公知の一連のコントロール実験によって各細胞内に存在する 各遺伝子の分子数の評価を行った。１細胞当りの分子数を評価するためのこれら のコントロール実験としては下記のものがある；　Ｎｏｒｔｈｅｒｎプロット、 ＲＲＮドツトプロット、　Ｑｕｉｃｋ−プロット、サイトドツト、単独コピー飽 和試験、および溶液濃度一時間ハイブリッド形成試験（ロート１７２分析）　（ Ｈａｍｅｓ、　Ｂ、　Ｄ、４　Ｈ４ｇｇｉｎｓ、　Ｓ、　Ｖ［（１９８６）　” Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　二　ａ　ｐｒａｃｔ ｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ″ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ］参照）。

スライドガラス上の細胞は、エタノ−カフ５％／氷酢酸２０％／水５％の混合液 で室温下で２０分間固着させた。

プレハイブリッド形成段階は実施しなかった。ホルムアミド５０％、４ＸＳＣＣ 、リン酸ソーダ（ｐＨ７，４）　０．１モル、トリトンＸ−１００，０，１％低 分子量ＤＮＡ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ。

社から入手した鯨の精液ＤＮＡから得たもの）　１００μｇ／ｄ、フォトビオチ ンでラベル化したアンチセンスＲＮＡプローブ２．５μｇ／−を含有するハイブ リッド形成溶液２０μ意を各試料に添加した。使用したプローブはセンスまたは アンチセンスのいずれかのＲＮＡストランドのもので次の遺伝子型のものであっ た：すなわちＣ−ａｂｌ、　Ｃ−５ｉｓ、　Ｃ−ｍｚｇまたはＥｐｓｔｅｉｎ　 Ｂａｒｒウィルス（ＥＢＶ）、このプローブは実施例１に記載した方法で調製し た。５５℃で２時間培養した後、ハイブリッド生成を検知した。

このハイブリッドを検知するため、ストレプトアビディンフルオレスシン（ＳＡ −ＦＩＴＣ）　、ファイコエリセリン（ＳＡ−ＰＥ）　、ローダミンＢ　（ＳＡ −Ｒ）　、テキサスレッド（ＳＡ−ＴＲ）、ファイコチアニン（ＳＡ−ＰＣ）　 、またはアロファイコチアニン（ＳＡ−ＡＰＣ）錯体をメーカーの推薦する濃度 の２倍で各試料に添加した（ＳＡ−ＦＩＴＣ，５Ａ−ＴＲ：　Ｂｅｔｈｅｓｄａ 　Ｒｅｓ、　Ｌａｂ０社；５Ａ−Ｒ：　５ｏｕｔｈｅｒｎｎ　Ｂｉｏｌｌｏｇｉ ｃａｌｓ社；　５Ａ−ＰＥ、　５Ａ−ＰＣ，５Ａ−ＡＰＣ：　Ｂｉｏ　Ｍｅａｄ ａ社）。３７℃で１０分間培養した後、試料をトリトンＸ、−１０００，］％を 含む０．Ｉ　Ｘ　ＳＳＣの溶液で（細胞表面積ｌａｄ当り１−２００−で）静か に洗浄した。１００％グリセリン／２ＸＰＢＳの５０１５０　（容積比）溶液１ 滴を各試料に添加し、＃１カバーグラスを細胞上にのせた後、顕微鏡試験を行っ た。

各細胞から放出される蛍光は、プローブと反応したストレプトアビディンの分子 数を反映している、すなわち細胞内の反応済みプローブ量は細胞内にあるターゲ ット生体高分子数を立証している。各細胞内の蛍光を測定するため、Ｍｅｒｉｄ ｉａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　（Ｏｋｅｍｏｓ、　ＭＩ）社製のＡＣＡＳ　 ４７ｏワークステーシヨンを用いてスライドグラスの分析を行った。

多く画像処理装置に類似した、このＭｅｒｉｄｉａｎ社の装置は試料中に存在す る粉末を励起して、デジタルまたはアナログのいずれかの信号として放出した光 を捕捉した。

Ｍｅｒｉｄｉａｎ社の装置ではこの信号はデジタルとなる。この信号の量は種々 の色によって表すことができる。第１４図には、上部右側のパネル中、種々の照 度の発光信号に対してこの装置によって照合された色が図示されている。これら の色で１つの細胞を表すＣ第１４図Ａ−Ｃ図参照）と、細胞１＠当りの放出蛍光 の相対量が得られる。第１４Ａ図には、Ｃ−５ｉｓ遺伝子の検知が示されており 、反応した蛍光体の発光照度が認められる。また第１４Ｂ図にはＣ−５ｉｓの検 知が示されている。第１４Ｃ，図には、ハイブリッド形成溶液にプローブが含有 されていないときのバックグラウンド発光信号が示されている。このパネルは陰 性コントロールパネルでブランクである。Ｍｅｒｉｄｉａｎ社製の装置では細胞 全体からの全蛍光量（すなわち細胞１個当りの蛍光量）が測定でき、この上方を 図的に表示できる。他の細胞の生成ＲＮＡについて行った、前記コントロール試 験の結果、Ｃ−５ｉｓおよびＣ−ＨＨの両細胞ターゲット遺伝子が、細胞１個当 り１−１０分子だけこれらの細胞中に存在することがわかった。したがってこの 値は第１４Ｄ図および第１４Ｅ図の横軸上の目盛りとして記されている。本発明 はこのような適切な装置と協働することによってＣ−５ｉｓまたはｃ−も工のい ずれかの遺伝子の単独分子でも含有するものであれば細胞数を同定することが可 能とされている。

１鳳五Ｈ ン　ゝ　ユ　ハイブリ・・ド、　の に５６２細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＬＬ　２４３）を、１０％の胎児仔牛血清を補足し たＨａｎｋのバランス塩溶液で育成させた。媒体中で最終変異終了３日後に、細 胞を新鮮媒体０．３ｎ＋Ｑ当り約１０’個の細胞密度になるように分割した。１ 時間後、細胞遠心分離機でスライドガラス上に５０，０００−１００，０００個 の細胞を洗清させて６０個のレプリカスライドガラスを作成した。残りの細胞は かき集めて、前の実施例１１と同様にしてグアジニウムセシウムクロライド法に よりこの細胞からＲＮＡおよびＤＮＡを抽出した。

細胞ラインは比較的均一な個体数となっているので、抽出したＲＮＡを精製し、 分析した各ＲＮＡ種のコピー数評価用に使用した。すなわち、この技術に知識を もち精通した当業者には公知の一連のコントロール実験によって各細胞内に存在 する各遺伝子の分子数の評価を行うことができる。１細胞当りの分子数を測定す るこれらのコントロール実験としては下記のものがある；すなわちＮｏｒｔｈｅ ｒｎプロット、ＲＮＡドツトプロット、Ｑｕｉｃｋ−プロット、サイトドツト、 単独コピー飽和試験、および溶液濃度一時間ハイブリッド形成試験（ロート１７ ２分析）　（Ｈａｚｅｓ、　Ｂ、　Ｄ、　４＆　Ｈｉｇｇｉｎｓ、　Ｓ、　Ｖ　 ［（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　：ａ 　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ　”ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ］参照）があ る。

スライドガラス上の細胞は、エタノ−シフ５％／氷酢酸２０％／水５％の混合液 で室温下で２０分間固着させた。

プレハイブリッド形成段階は実施しなかった。ホルムアミド５０％、４ＸＳＣＣ ，リン酸ソーダ（ｐＨ７，４）　ｏ、１モル、トリトンＸ−１００％０．２％低 分子量ＤＮＡ　（Ｓｉｇｎ＋ａ　Ｃｂｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ。

社から入手した鯨の精液ＤＮＡから得たもの）１００μｇ／ｄ。

フォトビオチンでラベル化したアンチセンスＲＮＡプローブ２．５μｇ／−を含 有するハイブリッド形成溶液２０μ氾を各試料に添加した。使用したプローブは センスまたはアンチセンスのいずれかのＲＮＡストランドのものである：すなわ ちＣ−ａｂｌ、　Ｃ−５ｉｓ、　Ｃ−シ泣またはＥｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒウィ ルス（ＥＢＶ）。これらのプローブは実施例１に記載した方法で調製した。５５ ℃で２時間培養した後、ハイブリッド生成を検知した。

このハイブリッドを検知するため、ストレプトアビディンーフルオレスシン（Ｓ Ａ−ＦＩＴＣ）　、ファイコエリセリン（ＳＡ−ＰＥ）　、ローダミンＢ　（Ｓ ＡＪ＋）　、テキサスレッド（登録商標）　（ＳＡ−ＴＲ）　、ファイコチアニ ン（ＳＡ−ＰＣ）　、またはアロファイコチアニン（ＳＡ−ＡＰＣ）錯体をメー カーの推薦する濃度の２倍で各試料に添加した（ＳＡ−ＦＩＴＣ，５Ａ−ＴＲ： 　ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓ、Ｌａｂ。社；　５Ａ−Ｒ：　５ｏｕｔｈｅｒｎｎ　 Ｂｉｏｌｌｏｇｉｃａｌｓ社；　５Ａ−ＰＥ、　５Ａ−ＡＰ、：　Ｂｉｏ　Ｍｅ ａｄａ社）。３７℃で１ｏ分間培養した後、試料をトリトンＸ−１０００，１％ を含むＯｏｌ　Ｘ　ＳＳＣの溶液で（細胞表面積１ｃｎ！当り１−２００ｍで） 静かに洗浄した。　１００％グリセリン／２ＸＰＢＳの５０１５０　（容積比） 溶液１滴を各試料に添加し、＃１カバーグラスを細胞上にのせた後、顕微鏡試験 を行った。

各細胞から放出される蛍光は、プローブと反応したストレプトアビディンの分子 数を反映しており、すなわち細胞内の反応済みプローブ量は細胞内にあるターゲ ット生体高分子数を表していた。各細胞内の蛍光を測定するため、Ｍｅｒｉｄｉ ａｎ　Ｉｎ５ｔｒｕｎ＋ｅｎｔｓ　（Ｏｋｅｍｏｓ、　Ｍｌ）社製のＡＣＡＳ　 ４７０ワークステーシヨンを月いてスライドグラスの分析を行った。多く画像処 理装置と同様に、このＭｅｒｉｄｉａｎ社の装置は試料中に存在する粉末を励起 して、デジタルまたはアナログのいずれかの信号として放出した光を捕捉した。

Ｍｅｒｉｄｉａｎ社の装置ではこの信号はデジタルとなる。実施例１１に記載し たのと同じ方法で、細胞１個当りの全蛍光量をＡＣＡＳ　４７０ワークステーシ ヨンを用いて測定を行った。こうして得られた結果をＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ 社製の試験機で分析して、異なったプローブをこのイン　シチュ　ハイブリッド 形成装置で処理したとき得られる蛍光量の間に十分明確な差異が表れるかどうか を評価した。存在するターゲットポリマーＲＮＡが既知のものである細胞ライン で、プローブをターゲットと反応させた；これによって陽性の細胞内に蛍光信号 発生源が導入された。「ターゲット」生体高分子ＲＮＡ細胞には不存在であるこ とがわかっている場合にはターゲットに反応性をもつプローブを不特定の方法に よって細胞を結合させてはならない。統計学的試験によって、このことが正しい かどうか「陽性」と「陰性１間の差が正確でバラツキがないほどの差異をもって いるかどうかを決定することができる。さらにこの統計学的試験によって、陰性 の試料を陽性と、また陽性用性の試料を陰性と誤って同定するこの試験の確立を 決定することもできる。第１表にはこの統計学的分析結果が表示されている。陽 性層性試料には正確に同定されている。誤差率は本発明のために準備した種々の 感度しきい値を用いたとき不正結果を得ることのある確立を表している。

以下余白 表　１ 検知しきい値　誤　差　率 １−２　遺伝子／細胞　１．７１％ １−５　遺伝子／細胞　０．６５％ ）１０　遺伝子／細胞　）０．００５％ｌ亙五Ｕ 血゛　のサ　ガロウ　ルスの ヒト末梢血液１ｍｌを実施例８に記載した患者から採取し、同じ実施例中に記載 した方法で処理をした、ハイブリッド形成反応は、プローブをサイトメガロウィ ルス（ＣＭＶ）に相補的でフォトビオチンでラベル化したアンチセンスＲＮＡプ ローブである以外は実施例４に記載したと同じハイブリッド形成混合液を用いて 思料に対して実施した。ハイブリッドの検知は、実施例８に記載した方法で実施 した。

第１５図および第１６図の顕微鏡写真の左側のカラム（ＣＭＶ）は、本発明によ って試料内のターゲットウィルス生体高分子・・・ここではＣＭＶを検知・・・ が検知できることを示している。この試料中にＣＭＶの存在することが、細胞内 からの発光で示されている。第１５図および第１６図の顕微鏡写真の右側のカラ ム（ＢＬＡＮＫ）は発光のないことを示しており、これらの写真はこのコントロ ール中には無関係な信号が発生していないことをも示している。

１息五Ｈ ＨＩＶに番　゛　・　＜ＨＩＶ　の　の　いの　血　のＨＩＶの ＨＩＶ感染の危険度の高い個体からのヒト末梢血液１０−を、実施例８に記載し た方法で採取し、処理し、ハイブリッド化し、さらにハイブリッド検知を行って 写真撮影を行った。第１７図には、ＧＡＧ、ＥＮＧ、ＴＡＴ、ＬＴＲ，ＥＢＶと 記されたパネルがそれぞれ対応するアンチセンスＲＮＡプローブをハイブリッド 溶液に添加した時に得られる結果が示されている。ＨＩＶアンチセンスプローブ を添加したパネルは陽性であったが、ＥＢＶを添加したものは陰性であった。「 ブランク」と記されたパネルは、ハイブリッド溶液にプローブを添加しないで得 た結果を示しており、陰性であった。下方右のパネルはＦプランクツと記された パネル中の細胞の位相差顕微鏡写真であるＨＩＶがこの個体の細胞中に存在する ことを確認するために、ＨＩＶに感染した細胞ラインＨ−９（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ 　８５４３）　（ＡおよびＣレーン）から、およびこれと同じく血清陰性である が危険度の高い個体（ＢおよびＤレーン）からのＤＮＡの５ｏｕｔ、ｈｅｒｎプ ロット分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　［（１９７５）　Ｊ　ＭｏムＢｔｏ１．　：　 ９８＋５０３コ参照）を第１９図に示した。ＡおよびＢレーンのＤＮＡはＳｓｔ 　Ｉで消化し、ＣおよびＤレーンのＤＮＡは）ｆｉｎｄ　ＩＩＩで消化させた。

このプロットを全長ＨＩＶプローブでハイブリッド化し、ＩＩＰで放射性ラベル 化した結果、この個体の末梢血液細胞中にＨＩＶハイブリッド化配列配列存在す ることが立証された。

ｌ五亘且 患　の　七　への　ン　シチュ　バイブ１ツ゛及虱立塁亙立 α−またはγ−インターフェロンのいずれかによる処理前後から末梢血液を採取 した。この血液を実施例６に記載する方法で処理し、ハイブリッド化し、ハイブ リッドの検知を斤った。第１９図は、α−インターフェロン処理前（０日）のＣ ，ＭＬ患者ではＣ−ジｒｃ、　Ｃ−５ｉｓおよびＣ−ａｂ１発ガン遺伝子ターゲ ット生体高分子がすべて、細胞から放出される光で示されており、０日の顕微鏡 写真に見られるように、存在が示されている。同じ患者について、α−インター フェロン療法４日後には同じターゲット細胞遺伝子が産生されていなかった（４ 日目の細胞中には信号がほとんど、または全（認められない）、逆に、γ−イン ターフェロンを処理したある患者では、　Ｃ−５ｉｓおよびＣ−ａｂ１発ガン遺 伝子を過剰産生している（第２０図のパネルＥ、Ｆ参照）細胞がまだ存在してい た。臨床的に見て、α−インターフェロンで処理を受けた患者は治療に良い反応 があり、回復に向かっていた。しかしγ−インターフェロンの処理を受けた患者 はこの治療の対応に失敗した。細胞ターゲット生体高分子配列の種類または量の 変化の監視は、治療法の有効性の評価または予測に対する重要な手段となるかも 知れない。

当技術に精通した当業者は、本発明がここに言及された目的および利点を得るた めに、本来有するものと同様に十分に適合できることを容易に理解できるものと 思われる。

ここに記載されている組成物、方法、手段および技術は、好ましい実施例が現実 的に代表しており、模範を示すことを意図しているが、本発明の範晴を限定する ことを意図するものではない。それぞれの変化は、発明の精神の中に含有され、 以下に示す特許請求の範囲の概念に限定を受けるものである。

イン　シチュ　ハイブリッド形成に及ぼす温度の影響＠一度（’Ｃ） イン　シチュ　ハイブリッド形成の動力学ハイブリッド形成時間 ＪＧ２ 細胞数　（直線目盛） ＦＩＧ、６ ＦＩｏ　７ ＦＩＧ、８ ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、ｌ○ ＦＩＧ　＋５ ＦＩＧ、１６ ＦＩＧ、＋８ ＦＩＧ、２０ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成３年２月２７日

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．本質的に無傷の膜を有する試料中にある生体高分子を分析する方法であって 、この方法が、 前記試料を、沈着剤と架橋剤とを含有する群から選ばれた少なくとも１つの薬剤 を含有する固着剤と接触させる工程と、 前記固着化した試料を、変成剤、ハイプリッド安定剤、緩衝剤、選択膜孔形成剤 および検知すべきターゲットヌクレオチド配列に対して少なくとも本質的に相補 的なヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのプローブとを含有するハイプリ ッド形成溶液と接触させ、この接触が１５−８０℃の温度下、約２０−１２０分 間ハイプリッド化条件下にある工程と、 前記試料を、少なくとも１種の検知可能なラベルの存在下で前記固着剤により培 養する工程と、さらに前記ラベルにより複数の生成物を検知する工程と、を含有 し、この方法が１細胞当り１−５個程度の少数の生体高分子を検知可能とするこ とを特徴とするインドテコハイブリッド形成定量法。
2. ２．特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、前記ラベルが、前記プローブ に接合されている方法。
3. ３．特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、前記ラベルが、前記複数の生 成物の形成が完了した後に付加される方法。
4. ４．特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、前記ラベルが、放射性ラベル 、蛍光体、化学ルミネッセンス体、酵素ラバルおよび放射線ラベルからなる群か ら選ばれる方法。
5. ５．特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、前記らべるがアビゲインおよ びストレプトアビデインよりなる群から選ばれる方法。
6. ６．特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、前記沈着剤がエタノール、メ タノール、アセトン、ホルムアルデヒドおよびそれらの混合物からなる群から選 ばれる方法。
7. ７．特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、前記架橋剤がパラホルムアル デヒド、ホルムアルデヒド、ジメチルシリセルイミデートおよびエチルジメチル アミノプロピルボジイミドからなる群から選ばれる方法。
8. ８．特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、前記変性剤がホルムアミド、 尿素、ヨウ化ナトリウム、チオシアネート、グアニジン、過塩素酸塩、トリクロ ロアセテートおよびテトラメチルアニリンからなる群から選ばれる方法。
9. ９．特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、前記ハイプリッド安定剤が食 塩、塩化リチウム、塩化マグネシウムおよび硫酸第２鉄からなる群から選ばれる 方法。
10. １０．特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、前記孔形成剤がＢｒｉｊ− ３５，Ｂｒｉｊ−５８，トリトンＸ−１００，ＣＨＡＲＳ（登録商標）、デスオ キシコール酸塩および硫酸ドデシルからなる群から選ばれる方法。
11. １１．特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、前記生体高分子がＲＮＡで ある方法。
12. １２．特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、前記生体高分子がＤＮＡで ある方法。
13. １３．特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、前記生体高分子が抗原であ る方法。
14. １４．特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、同一試料中の少なくとも２ 種の生体高分子が同時に分析できる方法。
15. １５．特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、少なくとも１種の生体高分 子がポリヌクレオチドであり、第２の生体帯分子が抗原である方法。
16. １６．特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、前記温度が１５−８０℃で ある方法。
17. １７．特許請求の範囲第１６項に記載の方法であって、前記温度が５０−５５℃ である方法。
18. １８．特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、前記の方法が約４時間以内 に完了する方法。
19. １９．特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、前記生体高分子がＲＮＡ， ＤＮＡウイルス性遺伝子、発ガン遺伝子および抗原よりなる群から選ばれる方法 。
20. ２０．本質的に無傷の膜を有する末梢血液および骨髄細胞中にある生体高分子を 分析する方法であって、この方法が、前記試料を、固体支持体上に沈着させる工 程と、前記試料を、エタノール７５％／氷酢酸２０％／水を含有する固着剤と、 −２０−５０℃の温度範囲で少なくとも１０分間接触させる工程と、 前記固着された試料を、ホルムアミド約２０−８０％、約５倍の濃度のＳＳＣ、 リン酸ナトリウム約０．１モル、ｐＨ＝７．４、トリトンＸ−１００約０．１％ および検知すべき特定のターゲットヌクレオチド配列に対し少なくとも実質上相 補的な塩基を７５−１５０有するフォトビチオン処理した一本鎖アンチセンスＲ ＮＡプローブとを含有する前記ハイプリッド形成溶液と、約５０−５５℃の温度 で、少なくとも５分間接触させる工程と、 アビゲインおよびストレプトアビデインを含有する群から選ばれた検知可能なラ ベル化剤を、前記ハイプリッド化したプローブに、少なくとも５分以内に結合さ せるのに十分な濃度で添加する工程と、 前記ラベル化した試料を、トリトンＸ−１００約０．１％含有する０．１倍濃度 のＳＳＣで洗浄して、結合していないラベル化剤を除去する工程と、さらに 前記結合したラベル化を検知する工程と、を含有することを特徴とするインシチ ュハイプリッド形成定量法。
21. ２１．特許請求の範囲第２０項に記載の方法であって、前記生体高分子が発ガン 遺伝子である方法。
22. ２２．特許請求の範囲第２０項に記載の方法であって、前記生体高分子がウイル スである方法。
23. ２３．本質的に無傷の膜を有する組織試料中にある生体高分子を分析する方法で あって、この方法が、前記組織試料を、固体支持体上に沈着させる工程と、前記 試料を、メタノール５０％／アセトン５０％を含有する固着剤と、−２０〜５０ ℃の温度範囲で少なくとも２０分間接触させる工程と、 前記固着された試料を、ホルムアミド約２０〜８０％、約５倍の濃度のＳＳＣ、 リン酸ナトリウム約０．１モル、ｐＨ＝７．４、トリトンＸ−１００約０．１％ 、バナジルリボヌクレオシド錯体２０ミリモル、プローブ濃度よりも１００倍以 上も大きい濃度の低分子量変性ＤＮＡおよび検知すべき特定のターゲットヌクレ オチド配列に対し少なくとも実質上相補的なベースを７５〜１５０有するフオト ビオチン処理した一本鎖アンチセンスＲＮＡプローブとを含有する前記ハイプリ ッド形成溶液と、約５０〜５５℃の温度で、少なくとも５分間接触させる工程と 、 アビデインおよびストレプトアビディンを含有する群から選ばれた検知可能なラ ベル化剤を、前記ハイプリッド化したプローブに、少なくとも５分以内に結合さ せるのに十分な濃度で添加する工程と、 前記ラベル化した試料を、トリトンＸ−１００を０．１％含有する０．１倍の濃 度のＳＳＣで洗浄して、結合していないラベル化剤を除去する工程と、さらに 前記結合したラベル化を検知する工程と、よりなることを特徴とするインシチュ ハイプリッド形成分析法。