JP3020601B2 - イン シチュ ハイブリット形成分析法 - Google Patents
イン シチュ ハイブリット形成分析法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 1.発明の分野 本発明は、１細胞当たり１−５コピー程度の少量のタ
ーゲット核酸を検知するのに効果的なイン シチュ ハ
イブリッド形成分析法の分野に係わる。本発明に基づく
分析法は、これまで公知の他の方法よりも核酸検知の感
度を著しく増加させる方法である。さらに、このハイブ
リッド形成法は、他のイン シチュ定量法によって報告
されているものよりも遥かに迅速に実施できる。本発明
はまた、同一の細胞中の核酸およびプロテインの迅速で
かつ高感度の検知法を付与するものである。
ーゲット核酸を検知するのに効果的なイン シチュ ハ
イブリッド形成分析法の分野に係わる。本発明に基づく
分析法は、これまで公知の他の方法よりも核酸検知の感
度を著しく増加させる方法である。さらに、このハイブ
リッド形成法は、他のイン シチュ定量法によって報告
されているものよりも遥かに迅速に実施できる。本発明
はまた、同一の細胞中の核酸およびプロテインの迅速で
かつ高感度の検知法を付与するものである。
2.従来技術 イン シチュ ハイブリッド形成とは、単細胞レベル
の組織中の核酸（DNAおよびRNA）およびプロテインのよ
うな生体高分子の定性および定量に関する技術を提供す
るものである。このようなハイブリッド形成技術によ
り、前記単細胞レベルの組織中の特定の遺伝子の存否を
検知することができる。イン シチュ ハイブリッド形
成法はまた、単細胞レベルの遺伝子産生物の発現を検知
するためにも使用できる。
の組織中の核酸（DNAおよびRNA）およびプロテインのよ
うな生体高分子の定性および定量に関する技術を提供す
るものである。このようなハイブリッド形成技術によ
り、前記単細胞レベルの組織中の特定の遺伝子の存否を
検知することができる。イン シチュ ハイブリッド形
成法はまた、単細胞レベルの遺伝子産生物の発現を検知
するためにも使用できる。
特定の核酸（DNAおよびRNA）プロープを用いて、感染
および他の病状の遺伝指標を検知することもできる。遺
伝性の疾病によっては、正常な組織には存在しない遺伝
子の存在が特徴付けられることもある。他の病状によっ
ては、正常な細胞中に認められないようなRNAsまたはRN
A翻訳産生物（すなわち、ペプチドまたはプロテイン）
の発現によって特徴付けられる。さらに、病状の中に
は、遺伝子またはプロテインの不存在によって、あるい
は遺伝子産生またはプロテインの不存在または発現の変
更によって特徴づけられるものもある。
および他の病状の遺伝指標を検知することもできる。遺
伝性の疾病によっては、正常な組織には存在しない遺伝
子の存在が特徴付けられることもある。他の病状によっ
ては、正常な細胞中に認められないようなRNAsまたはRN
A翻訳産生物（すなわち、ペプチドまたはプロテイン）
の発現によって特徴付けられる。さらに、病状の中に
は、遺伝子またはプロテインの不存在によって、あるい
は遺伝子産生またはプロテインの不存在または発現の変
更によって特徴づけられるものもある。
これまでの方法は、これらの指標の検知を可能とする
が、比較的長時間を必要とし、感度にも限界があった。
ハイブリッド形成技術は、単一の標準DNAまたはRNAの相
補的な核酸鎖とのペア化（すなわち、ハイブリッド形
成）能力を基とする技術である。このハイブリッド形成
反応によって、特定の遺伝子（DNA）の存在、ポリヌク
レオチド配列またはこれらの遺伝子（mRNA）の転写およ
び発現の同定を可能とする特定のプローブの開発が可能
となる。
が、比較的長時間を必要とし、感度にも限界があった。
ハイブリッド形成技術は、単一の標準DNAまたはRNAの相
補的な核酸鎖とのペア化（すなわち、ハイブリッド形
成）能力を基とする技術である。このハイブリッド形成
反応によって、特定の遺伝子（DNA）の存在、ポリヌク
レオチド配列またはこれらの遺伝子（mRNA）の転写およ
び発現の同定を可能とする特定のプローブの開発が可能
となる。
細胞のハイブリッド形成反応を実施する前に、細胞の
破壊と細胞から核酸を分離を必要とする溶液ハイブリッ
ド形成法は細胞の完全性、空間的解析、検知感度を犠牲
にしている。イン シチュ ハイブリッド形成では、特
別のターゲット遺伝子、核酸またはプロテインが他の細
胞の周囲にある外部RNAおよびDNAによる希釈がなくなる
ため溶液ハイブリッド形成よりも感度が良くなる。ま
た、イン シチュ ハイブリッド形成によって、例えば
個々の細胞内の遺伝子、核酸、またはプロテインのよう
な複数成分の同時検知が可能とされ、細胞性遺伝子また
はウィルス性配列を示す特殊細胞の同定が可能となる。
その上、イン シチュ ハイブリッド形成法は単独細胞
に適用して定量できるので、最少のサンプルおよび試薬
を必要ですむ利点がある。
破壊と細胞から核酸を分離を必要とする溶液ハイブリッ
ド形成法は細胞の完全性、空間的解析、検知感度を犠牲
にしている。イン シチュ ハイブリッド形成では、特
別のターゲット遺伝子、核酸またはプロテインが他の細
胞の周囲にある外部RNAおよびDNAによる希釈がなくなる
ため溶液ハイブリッド形成よりも感度が良くなる。ま
た、イン シチュ ハイブリッド形成によって、例えば
個々の細胞内の遺伝子、核酸、またはプロテインのよう
な複数成分の同時検知が可能とされ、細胞性遺伝子また
はウィルス性配列を示す特殊細胞の同定が可能となる。
その上、イン シチュ ハイブリッド形成法は単独細胞
に適用して定量できるので、最少のサンプルおよび試薬
を必要ですむ利点がある。
本発明の前には、イン シチュ ハイブリッド形成方
法は、１細胞当たり10コピー以上も存在する核酸しか検
知できなかった。しかも、この方法では、実施に少なく
とも８時間〜14日以上の時間を必要とした。このイン
シチュ ハイブリッド形成分析法法の前には、定量法も
多重同時検知の実施も不可能とされていた。
法は、１細胞当たり10コピー以上も存在する核酸しか検
知できなかった。しかも、この方法では、実施に少なく
とも８時間〜14日以上の時間を必要とした。このイン
シチュ ハイブリッド形成分析法法の前には、定量法も
多重同時検知の実施も不可能とされていた。
発明の概要 本発明の目的は、１細胞当たり１−５コピー程度の低
濃度しか存在しない時でも、ポリヌクレオチドが検知可
能なイン シチュ ハイブリッド形成法を提供すること
である。
濃度しか存在しない時でも、ポリヌクレオチドが検知可
能なイン シチュ ハイブリッド形成法を提供すること
である。
本発明の別の目的は、個々の細胞中にある１個以上の
ターゲット分子を検知可能なイン シチュ ハイブリッ
ド形成法を提供することである。
ターゲット分子を検知可能なイン シチュ ハイブリッ
ド形成法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、約２−４時間内に達成可
能なイン シチュ ハイブリッド形成法を提供すること
である。
能なイン シチュ ハイブリッド形成法を提供すること
である。
本発明のまた別の目的は、１細胞当たり１−５分子程
度の少量のターゲット核酸を定量できるイン シチュ
ハイブリッド形成法を提供することである。
度の少量のターゲット核酸を定量できるイン シチュ
ハイブリッド形成法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、多数の生体高分子を同時
に検知することのできるイン シチュ ハイブリッド形
成法を提供することである。
に検知することのできるイン シチュ ハイブリッド形
成法を提供することである。
本発明は、固体支持体上に沈着させた個々の細胞また
は組織部分内の生体高分子を検知する方法を提供する。
本発明の提供する方法の各段階を適確に実施することに
よって、迅速で、感度の良いハイブリッド形成定量が可
能となる。ターゲットの生体高分子は１細胞当たり１−
５分子の少数のレベルが定量することができる。このハ
イブリッド形成定量法は、組織部分または細胞を培養し
た組織中の骨髄および末梢血液のような細胞中のポリヌ
クレオチドのレベルの検知に使用できる。本発明のハイ
ブリッド形成法は、２−４時間という短時間で１細胞当
たり１−５という少数の分子を感知できる感度で単細胞
中のポリヌクレオチドを検知することができる。この方
法はまた個々の細胞中にある１個以上の異なったポリヌ
クレオチド配列を同時に検知することができる。本発明
はまた、同じ細胞中のプロテインおよびポリヌクレオチ
ドの検知をも可能にする。
は組織部分内の生体高分子を検知する方法を提供する。
本発明の提供する方法の各段階を適確に実施することに
よって、迅速で、感度の良いハイブリッド形成定量が可
能となる。ターゲットの生体高分子は１細胞当たり１−
５分子の少数のレベルが定量することができる。このハ
イブリッド形成定量法は、組織部分または細胞を培養し
た組織中の骨髄および末梢血液のような細胞中のポリヌ
クレオチドのレベルの検知に使用できる。本発明のハイ
ブリッド形成法は、２−４時間という短時間で１細胞当
たり１−５という少数の分子を感知できる感度で単細胞
中のポリヌクレオチドを検知することができる。この方
法はまた個々の細胞中にある１個以上の異なったポリヌ
クレオチド配列を同時に検知することができる。本発明
はまた、同じ細胞中のプロテインおよびポリヌクレオチ
ドの検知をも可能にする。
簡単にいうと、単細胞懸濁物としてかあるいは組織ス
ライスとして、細胞をスライドガラスのような固体支持
体上に着床させる。この細胞は、細胞に最良の位置決定
をさせ、最高のハイブリッド形成効率を付与させるよう
な固着剤を選んで着床する。この固着の後、支持体に固
着された細胞は室温で脱水し貯蔵してもよいし、また直
接ハイブリッド形成法を実施してもよい。
ライスとして、細胞をスライドガラスのような固体支持
体上に着床させる。この細胞は、細胞に最良の位置決定
をさせ、最高のハイブリッド形成効率を付与させるよう
な固着剤を選んで着床する。この固着の後、支持体に固
着された細胞は室温で脱水し貯蔵してもよいし、また直
接ハイブリッド形成法を実施してもよい。
この後、50％ホルムアミドのようなカオトロピック
剤、５倍濃度のSSC溶液（１倍＝0.15モルの食塩水と0.0
15モルのシュウ酸ソーダ水との混合液）のようなハイブ
リッド安定剤、0.1モルリン酸ソーダのような緩衝剤（p
H＝7.4）、非特定の結合性を減少させるために約100μg
/mlの低分子量DNA,プローブの細胞中への侵入を可能に
する0.1％トリトンＸ−100および約10〜20ミリモルのバ
ナジル・リポヌクレオシド錯体とを包含する溶液中でハ
イブリッド形成を行う。
剤、５倍濃度のSSC溶液（１倍＝0.15モルの食塩水と0.0
15モルのシュウ酸ソーダ水との混合液）のようなハイブ
リッド安定剤、0.1モルリン酸ソーダのような緩衝剤（p
H＝7.4）、非特定の結合性を減少させるために約100μg
/mlの低分子量DNA,プローブの細胞中への侵入を可能に
する0.1％トリトンＸ−100および約10〜20ミリモルのバ
ナジル・リポヌクレオシド錯体とを包含する溶液中でハ
イブリッド形成を行う。
ターゲットのポリヌクレオチドとハイブリッド形成す
るため、このハイブリッド形成溶液にプローブを加え
る。最も好ましいプローブは、一本鎖RNAプローブで、
長さが約75〜150基である。ターゲット・プロテインま
たは抗原に接合させるために、抗体プローブを用いても
よい。プローブを包含するハイブリッド形成溶液を細胞
が隠れるほど十分な量添加する。次いで、この細胞を少
なくとも30分間55℃で培養する。このプローブに、高濃
度の少なくとも約１μg/mlのハイブリッド形成混合物を
この時間枠で好結果が得られるように添加する。
るため、このハイブリッド形成溶液にプローブを加え
る。最も好ましいプローブは、一本鎖RNAプローブで、
長さが約75〜150基である。ターゲット・プロテインま
たは抗原に接合させるために、抗体プローブを用いても
よい。プローブを包含するハイブリッド形成溶液を細胞
が隠れるほど十分な量添加する。次いで、この細胞を少
なくとも30分間55℃で培養する。このプローブに、高濃
度の少なくとも約１μg/mlのハイブリッド形成混合物を
この時間枠で好結果が得られるように添加する。
このプローブをハイブリッド形成溶液に添加する前に
検知可能なようにラベル化してもよい。逆に、ハイブリ
ッド形成産生物に結合させる検知可能なラベルを選んで
もよい。プローブは、本発明を実施するのに使用するた
めには、どのような検知可能な群のものを選んでラベル
として添加してもよい。このような検知可能な群として
は、検知可能な物理的または化学的性質を持つものであ
れば何でもよい。このような検知可能なラベルとして
は、免疫定量法の分野で十分活用されており、このよう
な方法に対して有効で一般に多様されているラベルを、
本発明に適用してもよい。これらに含まれるものとして
は、酵素（Clin.Chem.,22:1243（1976）参照）、酵素基
質（英国特許第1,548,741号公報参照）、コエンザイム
（補酵素）（英国特許第4,230,797号および第4,238,565
号公報参照）および酵素禁止剤（米国特許第4,134,792
号公報参照）；蛍光体（Clin.Chem.,25:353（1979）参
照）；発色団；光学発光体および生物発光体のような発
光体（Clin.Chem.,25:512（1979）参照）；特別に結合
可能なリガンド；末端反応性の反応対；および3H,35S,
32P,125I,14Cのような放射性同位元素がある。
検知可能なようにラベル化してもよい。逆に、ハイブリ
ッド形成産生物に結合させる検知可能なラベルを選んで
もよい。プローブは、本発明を実施するのに使用するた
めには、どのような検知可能な群のものを選んでラベル
として添加してもよい。このような検知可能な群として
は、検知可能な物理的または化学的性質を持つものであ
れば何でもよい。このような検知可能なラベルとして
は、免疫定量法の分野で十分活用されており、このよう
な方法に対して有効で一般に多様されているラベルを、
本発明に適用してもよい。これらに含まれるものとして
は、酵素（Clin.Chem.,22:1243（1976）参照）、酵素基
質（英国特許第1,548,741号公報参照）、コエンザイム
（補酵素）（英国特許第4,230,797号および第4,238,565
号公報参照）および酵素禁止剤（米国特許第4,134,792
号公報参照）；蛍光体（Clin.Chem.,25:353（1979）参
照）；発色団；光学発光体および生物発光体のような発
光体（Clin.Chem.,25:512（1979）参照）；特別に結合
可能なリガンド；末端反応性の反応対；および3H,35S,
32P,125I,14Cのような放射性同位元素がある。
本発明はプローブの侵入を可能とし、不特定のプロー
ブ結合性および高温（55℃）にホルムアミド・ハイブリ
ッド形成を阻止する適当な固着剤を提供する。このよう
な発明によって、ハイブリッド形成の迅速な動力学およ
び１細胞当たり１−５分子という少数分子の感度でハイ
ブリッド形成分析法が提供される。
ブ結合性および高温（55℃）にホルムアミド・ハイブリ
ッド形成を阻止する適当な固着剤を提供する。このよう
な発明によって、ハイブリッド形成の迅速な動力学およ
び１細胞当たり１−５分子という少数分子の感度でハイ
ブリッド形成分析法が提供される。
本発明の卓越した結果は、mRNA上に細胞の構成要素の
沈着またはその共有結合変性の防止、リボゾームRNAの
サブユニット結合の不安定化、および細胞RNAおよび／
またはDNA中に一本鎖の導入によるハイブリッド形成の
ために完全な長さをもったmRNAの接触を促進することに
よって起こるものと思われる。本発明は、細胞RNAの一
本鎖を起こさせることと極めて高感度の定量法を付与す
るハイブリッド形成の迅速な動力学との間の強力の相関
関係を、発明者が発見したことによってなされた。
沈着またはその共有結合変性の防止、リボゾームRNAの
サブユニット結合の不安定化、および細胞RNAおよび／
またはDNA中に一本鎖の導入によるハイブリッド形成の
ために完全な長さをもったmRNAの接触を促進することに
よって起こるものと思われる。本発明は、細胞RNAの一
本鎖を起こさせることと極めて高感度の定量法を付与す
るハイブリッド形成の迅速な動力学との間の強力の相関
関係を、発明者が発見したことによってなされた。
ある面では、本発明は、適確な固着／プレハイブリッ
ド形成／ハイブリッド形成／各種組織への次記の目的の
ための検知手段を決定する簡単な方法を提供することが
できる。（１）単一分子の検知、（２）細胞形態の保存
および（３）全反応時間の２〜４時間への縮減。
ド形成／ハイブリッド形成／各種組織への次記の目的の
ための検知手段を決定する簡単な方法を提供することが
できる。（１）単一分子の検知、（２）細胞形態の保存
および（３）全反応時間の２〜４時間への縮減。
簡単にいうと、このような迅速でかつ感度のよいハイ
ブリッド形成を実施するための適確な条件を予見するた
めに、懸濁液状またはスライドガラス上に置いたいずれ
かの複数のサンプル中の細胞試料を、まず固着剤に次い
でハイブリッド形成溶液に曝す。
ブリッド形成を実施するための適確な条件を予見するた
めに、懸濁液状またはスライドガラス上に置いたいずれ
かの複数のサンプル中の細胞試料を、まず固着剤に次い
でハイブリッド形成溶液に曝す。
この固着剤は、エタノール95容量％と酢酸５容量％、
エタノール75容量％と酢酸20容量％、メタノール50容量
％とアセトン50容量％、およびホルムアルデヒド10容量
％とメタノール90容量％を包含する群から選ばれる。ま
た他の有効な固着剤としては、選ばれた固着剤が二重鎖
の少なくとも70容量％を一本鎖の細胞ポリヌクレオチド
に移行させるが、細胞の空間条件は保持できるものであ
れば、関連する技術に熟練した当業者に自明なものであ
る。この固着剤への接触時間は１〜180分であるが１〜3
0分が好ましく、さらに20分が最も好ましい。固着化の
温度は−20〜50℃が好ましいが20℃が最も好ましい。試
料をハイブリッド形成前に貯蔵するときはこの後エタノ
ール70容量％と水30容量％の混合液に0.5〜20分間接触
させてもよい。
エタノール75容量％と酢酸20容量％、メタノール50容量
％とアセトン50容量％、およびホルムアルデヒド10容量
％とメタノール90容量％を包含する群から選ばれる。ま
た他の有効な固着剤としては、選ばれた固着剤が二重鎖
の少なくとも70容量％を一本鎖の細胞ポリヌクレオチド
に移行させるが、細胞の空間条件は保持できるものであ
れば、関連する技術に熟練した当業者に自明なものであ
る。この固着剤への接触時間は１〜180分であるが１〜3
0分が好ましく、さらに20分が最も好ましい。固着化の
温度は−20〜50℃が好ましいが20℃が最も好ましい。試
料をハイブリッド形成前に貯蔵するときはこの後エタノ
ール70容量％と水30容量％の混合液に0.5〜20分間接触
させてもよい。
ハイブリッド形成溶液はカオトロピック変性剤、緩衝
剤、孔形成剤、ハイブリッド安定剤、不特定ヌクレオチ
ド、およびターゲット特定プローブを包含する。
剤、孔形成剤、ハイブリッド安定剤、不特定ヌクレオチ
ド、およびターゲット特定プローブを包含する。
カオトロピッコ変性剤（Robinson,D.W.およびGrant,
M.E.（1966）J.Biol.Chem.,241,4030;Hamaguchi,K.およ
びGeiduschesk,E.P.（1962）J.Chem.Soc.,84,1329参
照）はホルムアミド、尿素、チオシアネート、グアニジ
ン、トリクロロアセテート、テトラメチルアミン、過塩
素酸塩、ヨウ化ナトリウムを包含する群から選ばれる。
pHが少なくとも7.0〜8.0を保持するいかなる緩衝剤も使
用できる。
M.E.（1966）J.Biol.Chem.,241,4030;Hamaguchi,K.およ
びGeiduschesk,E.P.（1962）J.Chem.Soc.,84,1329参
照）はホルムアミド、尿素、チオシアネート、グアニジ
ン、トリクロロアセテート、テトラメチルアミン、過塩
素酸塩、ヨウ化ナトリウムを包含する群から選ばれる。
pHが少なくとも7.0〜8.0を保持するいかなる緩衝剤も使
用できる。
孔形成剤としては、たとえばBrij−35,Brij−58,ドデ
シル硫酸ソーダ、CHAPS（登録商標）トリトンＸ−100の
ような薬剤がある。ターゲット生体高分子の位置によっ
て、孔形成剤は原形質または核膜または細胞隔室構造物
を介してプローブの侵入を可能とするように選択する。
例えば、0.05％Brij−35または0.1％トリトンＸ−100は
原形質膜のみならず核膜を通してプローブに侵入を可能
とする。逆にデスオキシコール酸ソーダによってプロー
ブは核膜の透過が可能となる。したがって細胞質生体高
分子ターゲットのハイブリッド形成を限定するためには
核膜孔形成剤の使用を避ける。このような副細胞の位置
選択は、ターゲット生体高分子が細胞質内に位置すると
きは核相補配列へのプローブハイブリッド形成を消失さ
せることにより、この分析の特定性と感度に寄与する。
固着剤のような洗剤以外の薬剤がこの機能を果たすこと
もある。さらに生体高分子プローブも細胞の原形質膜を
透過するほど小さいが、核膜を透過できる程の大きさと
なるように選択してもよい。
シル硫酸ソーダ、CHAPS（登録商標）トリトンＸ−100の
ような薬剤がある。ターゲット生体高分子の位置によっ
て、孔形成剤は原形質または核膜または細胞隔室構造物
を介してプローブの侵入を可能とするように選択する。
例えば、0.05％Brij−35または0.1％トリトンＸ−100は
原形質膜のみならず核膜を通してプローブに侵入を可能
とする。逆にデスオキシコール酸ソーダによってプロー
ブは核膜の透過が可能となる。したがって細胞質生体高
分子ターゲットのハイブリッド形成を限定するためには
核膜孔形成剤の使用を避ける。このような副細胞の位置
選択は、ターゲット生体高分子が細胞質内に位置すると
きは核相補配列へのプローブハイブリッド形成を消失さ
せることにより、この分析の特定性と感度に寄与する。
固着剤のような洗剤以外の薬剤がこの機能を果たすこと
もある。さらに生体高分子プローブも細胞の原形質膜を
透過するほど小さいが、核膜を透過できる程の大きさと
なるように選択してもよい。
１価および２価の陽イオンの塩のようなハイブリッド
安定剤がハイブリッド形成溶液に含まれており、ブロー
プの相補配列とそのターゲット高分子間の水素結合の生
成を促進させる。好ましくは食塩を0.15〜１モルの濃度
で使用する。さらに好ましくは0.6モルの食塩濃度を使
用する。
安定剤がハイブリッド形成溶液に含まれており、ブロー
プの相補配列とそのターゲット高分子間の水素結合の生
成を促進させる。好ましくは食塩を0.15〜１モルの濃度
で使用する。さらに好ましくは0.6モルの食塩濃度を使
用する。
核酸プローブの不特定結合性を抑制するために、ター
ゲット高分子に無関係の核酸をプローブ濃度の100倍の
濃度ハイブリッド形成溶液に添加する。上記の工程のそ
れぞれの後で試料を取り出して細胞形態の観察によって
解析し、位相差顕微鏡で新鮮な未処理の細胞と比較す
る。種々の副細胞構造体の細胞形態および空間的解析を
できるだけ新鮮で未処理の細胞に近づけるための決定条
件が各工程の最適条件として選ばれている。
ゲット高分子に無関係の核酸をプローブ濃度の100倍の
濃度ハイブリッド形成溶液に添加する。上記の工程のそ
れぞれの後で試料を取り出して細胞形態の観察によって
解析し、位相差顕微鏡で新鮮な未処理の細胞と比較す
る。種々の副細胞構造体の細胞形態および空間的解析を
できるだけ新鮮で未処理の細胞に近づけるための決定条
件が各工程の最適条件として選ばれている。
さらに、細胞質核酸を約50μg/mlのヨウ化プロピジュ
ウム染料で染める。この染料は、核酸が一本鎖である時
に特定の特性蛍光を放射（約480nm:緑色）し、核酸が二
重鎖の時には別の波長（約615nm:赤色）の蛍光を放射す
る。使用染料は、特別な分析法のためのターゲット配列
がRNAであるか、DNAであるかによって決められる。もし
この分析法がコピー数の少ないDNAを検知するためのも
のであれば、アクリジンオレンジ、テトラヒドロフラ
ン、メチルグリーン、ピロニンＹ、エイズアＢのような
DNA検知用の染料を使用し、核DNAは一本鎖または二重鎖
の量が分析できる。そうではなくて、コピー数の少ない
RNAの検知のためにこの分析法を使用する時は、アクリ
ジン、アジン、キサンテン、オキサジンおよびチアジン
のようなRNA染料を使用し、細胞質RNAは一本鎖または二
重鎖の量が分析できる。この定量法をRNAまたはDNAのど
ちらかの分析に使用するにせよ、検知する核酸が二重鎖
から一本鎖へ70％移行した時が最適の状態である。核酸
の二次構造が二重鎖から一本鎖への移行が少なくとも70
％に到達し、全量の蛍光体の低下がなくなった時、本発
明に基づいて条件を調節し、単一細胞内にある１−５分
子という少数のターゲット核酸の適確なハイブリッド形
成と検知が可能となる。さなに、この適確なハイブリッ
ド形成に必要な時間は細胞質核酸の少なくとも70％が一
本鎖となるのに必要な時間から決定される。
ウム染料で染める。この染料は、核酸が一本鎖である時
に特定の特性蛍光を放射（約480nm:緑色）し、核酸が二
重鎖の時には別の波長（約615nm:赤色）の蛍光を放射す
る。使用染料は、特別な分析法のためのターゲット配列
がRNAであるか、DNAであるかによって決められる。もし
この分析法がコピー数の少ないDNAを検知するためのも
のであれば、アクリジンオレンジ、テトラヒドロフラ
ン、メチルグリーン、ピロニンＹ、エイズアＢのような
DNA検知用の染料を使用し、核DNAは一本鎖または二重鎖
の量が分析できる。そうではなくて、コピー数の少ない
RNAの検知のためにこの分析法を使用する時は、アクリ
ジン、アジン、キサンテン、オキサジンおよびチアジン
のようなRNA染料を使用し、細胞質RNAは一本鎖または二
重鎖の量が分析できる。この定量法をRNAまたはDNAのど
ちらかの分析に使用するにせよ、検知する核酸が二重鎖
から一本鎖へ70％移行した時が最適の状態である。核酸
の二次構造が二重鎖から一本鎖への移行が少なくとも70
％に到達し、全量の蛍光体の低下がなくなった時、本発
明に基づいて条件を調節し、単一細胞内にある１−５分
子という少数のターゲット核酸の適確なハイブリッド形
成と検知が可能となる。さなに、この適確なハイブリッ
ド形成に必要な時間は細胞質核酸の少なくとも70％が一
本鎖となるのに必要な時間から決定される。
好ましい実施例において、本発明に基づくハイブリッ
ド形成分析法は、本質的に無傷な完全な膜を有する細胞
試料中の生体高分子を分析する方法を提供し、この方法
は次の各工程を包含することを特徴としている。すなわ
ち、１）ターゲット細胞と固体支持体上に沈着させる工
程と、２）細胞を固定させる工程と、３）この細胞を一
本鎖RNAプローブを包含するハイブリッド形成溶液で培
養する工程と、さらに４）ターゲット核酸にハイブリッ
ドされたプローブの量を検知する工程とである。次い
で、試料は洗浄され、ターゲット核酸の量は、蛍光を顕
微鏡を介して画像的にまたはメリダンACAS470ワークス
テーション（Meridian Instruments,Okemos,Michigan）
によるこの蛍光体の直接読取りかのいずれかの方法で定
量的に決定される。
ド形成分析法は、本質的に無傷な完全な膜を有する細胞
試料中の生体高分子を分析する方法を提供し、この方法
は次の各工程を包含することを特徴としている。すなわ
ち、１）ターゲット細胞と固体支持体上に沈着させる工
程と、２）細胞を固定させる工程と、３）この細胞を一
本鎖RNAプローブを包含するハイブリッド形成溶液で培
養する工程と、さらに４）ターゲット核酸にハイブリッ
ドされたプローブの量を検知する工程とである。次い
で、試料は洗浄され、ターゲット核酸の量は、蛍光を顕
微鏡を介して画像的にまたはメリダンACAS470ワークス
テーション（Meridian Instruments,Okemos,Michigan）
によるこの蛍光体の直接読取りかのいずれかの方法で定
量的に決定される。
図面の簡単な説明 第１図は、このイン シチュ ハイブリッド形成法の
最適温度を図示するものである。
最適温度を図示するものである。
第２図は、このイン シチュ ハイブリッド形成反応
の動力学を図示するものである。
の動力学を図示するものである。
第３図は、このイン シチュ ハイブリッド形成反応
の効率の関数として細胞質RNAの二次構造の変化を図示
するものである。
の効率の関数として細胞質RNAの二次構造の変化を図示
するものである。
第４図は、対照細胞ライン、Balb/C3T3を用いたイン
シチュ ハイブリッド形成法の感度を図示したもので
ある。
シチュ ハイブリッド形成法の感度を図示したもので
ある。
第５図は、イン シチュ ハイブリッド形成法による
正常末梢血液、正常骨髄および慢性骨髄性白血病（CM
L）中の腫瘍遺伝子の検知を図示したものである。
正常末梢血液、正常骨髄および慢性骨髄性白血病（CM
L）中の腫瘍遺伝子の検知を図示したものである。
第６図は、イン シチュ ハイブリッド形成法による
固体組織試料中の腫瘍遺伝子の検知を図示したものであ
る。
固体組織試料中の腫瘍遺伝子の検知を図示したものであ
る。
第７図は、イン シチュ ハイブリッド形成法による
陽性および陰性対照したヒト免疫不全ウイルス（HIV）
の検知特性を図示したものである。
陽性および陰性対照したヒト免疫不全ウイルス（HIV）
の検知特性を図示したものである。
第８図は、イン シチュ ハイブリッド形成法による
血管肉腫（KS）またはエイズ（後天性免疫不全症候群）
関連錯体（ARC）中のHIV（ヒト免疫不全ウイルス）の検
知を図示したものである。
血管肉腫（KS）またはエイズ（後天性免疫不全症候群）
関連錯体（ARC）中のHIV（ヒト免疫不全ウイルス）の検
知を図示したものである。
第９図は、イン シチュ ハイブリッド形成法による
エイズ（後天性免疫不全症候群）またはリンパ腫をもっ
た患者のHIV（ヒト免疫不全ウイルス）の検知を図示し
たものである。
エイズ（後天性免疫不全症候群）またはリンパ腫をもっ
た患者のHIV（ヒト免疫不全ウイルス）の検知を図示し
たものである。
第10図は、イン シチュ ハイブリッド形成法による
血清陽性（Ab＋）で、無症候性で、危険度の高い個体中
のHIV（ヒト免疫不全ウイルス）の検知を図示したもの
である。
血清陽性（Ab＋）で、無症候性で、危険度の高い個体中
のHIV（ヒト免疫不全ウイルス）の検知を図示したもの
である。
第11図は、慢性骨髄白血病（CML）の患者の同一末梢
血液細胞内の３種の腫瘍遺伝子のイン シチュ ハイブ
リッド形成法による同時検知を図示したものである。蛍
光および酵素法によるイン シチュ ハイブリッド形成
法検知はこの分析にも使用された。
血液細胞内の３種の腫瘍遺伝子のイン シチュ ハイブ
リッド形成法による同時検知を図示したものである。蛍
光および酵素法によるイン シチュ ハイブリッド形成
法検知はこの分析にも使用された。
第12図は、慢性骨髄性白血病（CML）の患者の同一末
梢血液細胞内の３種の腫瘍遺伝子のイン シチュ ハイ
ブリッド形成法による同時検知を図示した。蛍光および
コロイド金によるイン シチュ ハイブリッド形成法検
知はこの分析にも使用された。
梢血液細胞内の３種の腫瘍遺伝子のイン シチュ ハイ
ブリッド形成法による同時検知を図示した。蛍光および
コロイド金によるイン シチュ ハイブリッド形成法検
知はこの分析にも使用された。
第13図は、イン シチュ ハイブリッド形成法を用い
た同一細胞内の抗原および核酸の同時検知を図示したも
のである。
た同一細胞内の抗原および核酸の同時検知を図示したも
のである。
第14図は、イン シチュ ハイブリッド形成法による
定量分析データを図示したものである。
定量分析データを図示したものである。
第15図は、KS（血管肉腫）、エイズ（後天性免疫不全
症候群）関連錯体（ARC）、エイズ（AIDS:後天性免疫不
全症候群）、リンパ腫患者の巨大細胞ウイルス（CMV）
の検知を図示したものである。
症候群）関連錯体（ARC）、エイズ（AIDS:後天性免疫不
全症候群）、リンパ腫患者の巨大細胞ウイルス（CMV）
の検知を図示したものである。
第16図は、イン シチュ ハイブリッド形成法による
血清陽性（Ab＋）で、無症候性で、危険度の高い個体中
の巨大細胞ウイルス（CMV）の検知を図示したものであ
る。
血清陽性（Ab＋）で、無症候性で、危険度の高い個体中
の巨大細胞ウイルス（CMV）の検知を図示したものであ
る。
第17図は、ウイルス感染の危険はあるが、HIV（ヒト
免疫不全ウイルス）に対して血清陰性の試験結果のヒト
のHIVの４種の異なる部分（GAG,ENV,TAT,LTR）に対す
る、イン シチュ ハイブリッド形成法による検出を図
示したものである。
免疫不全ウイルス）に対して血清陰性の試験結果のヒト
のHIVの４種の異なる部分（GAG,ENV,TAT,LTR）に対す
る、イン シチュ ハイブリッド形成法による検出を図
示したものである。
第18図は、Southern Blot定量法による第17図のイン
シチュ ハイブリッド形成法の確認結果を図示したも
のである。
シチュ ハイブリッド形成法の確認結果を図示したも
のである。
第19図は、イン シチュ ハイブリッド形成法による
患者のα−インターフェロン療法の結果の監視能力を図
示したものである。
患者のα−インターフェロン療法の結果の監視能力を図
示したものである。
第20図は、イン シチュ ハイブリッド形成法による
患者のγ−インターフェロン療法の結果の監視能力を図
示したものである。
患者のγ−インターフェロン療法の結果の監視能力を図
示したものである。
発明の詳細な説明 着用細胞／組織 イン シチュ ハイブリッド形成法の第１段階は、試
料の固体支持体上に置くことである。この試料は細胞と
細胞部分よりなるか、またはこれらを含有するいかなる
ものでも可能である。この細胞は、ターゲット生体高分
子（DNA,RNAまたはプロテイン）が変化せず、破壊され
ず、かつ検知可能なものであれば生、死のいずれであっ
てもよい。この試料としては、本質的に無傷の膜を持つ
細胞よりなるものでなければならない。
料の固体支持体上に置くことである。この試料は細胞と
細胞部分よりなるか、またはこれらを含有するいかなる
ものでも可能である。この細胞は、ターゲット生体高分
子（DNA,RNAまたはプロテイン）が変化せず、破壊され
ず、かつ検知可能なものであれば生、死のいずれであっ
てもよい。この試料としては、本質的に無傷の膜を持つ
細胞よりなるものでなければならない。
細胞構造体のすべての膜が無傷である必要はないが、
これらの膜は十分に保存されていて、下記の事項が実施
できるものでなければならない。：ターゲット生体高分
子の保存、ターゲット生体高分子の位置に検討すべきプ
ローブの導入、およびターゲット膜成分の抗原性の保存
できる。
これらの膜は十分に保存されていて、下記の事項が実施
できるものでなければならない。：ターゲット生体高分
子の保存、ターゲット生体高分子の位置に検討すべきプ
ローブの導入、およびターゲット膜成分の抗原性の保存
できる。
試料を固体支持体上に載置する方法は、細胞または組
織の種類による、例えば組織の標準的細片または塗抹標
本、細胞懸濁液の遠心分離ををした試料を包含する。
織の種類による、例えば組織の標準的細片または塗抹標
本、細胞懸濁液の遠心分離ををした試料を包含する。
本発明の実施に際しては、各種の固体支持体が使用で
きる。使用可能な支持体としては、ガラス、スコッチテ
ープ（3M社製）、ナイロン、Gene Screen Plus（New En
gland Nuclear社製）およびニトロセルロースが包含さ
れるが、これに限定されるものではない。最も好ましい
ものは顕微鏡用のスライドガラスである。これらの支持
体を使用することおよびその上に試料を載置させる方法
は、この技術に熟練した当業者であれば自明である。支
持体材料の選択は、使用する細胞の具体的方法および定
量方法による。濾材の中には厚さが均一でなく、したが
ってイン シチュ ハイブリッド形成法を実施する時に
収縮、膨張が不均一になるものがある。その上、自動蛍
光を発する支持体の中には低レベルの蛍光体の測定を妨
げるものがある。顕微鏡用のスライドガラスは信号／ノ
ズル比が大きく、組織の保存が良好であるので固体支持
体としては最も好ましいものである。
きる。使用可能な支持体としては、ガラス、スコッチテ
ープ（3M社製）、ナイロン、Gene Screen Plus（New En
gland Nuclear社製）およびニトロセルロースが包含さ
れるが、これに限定されるものではない。最も好ましい
ものは顕微鏡用のスライドガラスである。これらの支持
体を使用することおよびその上に試料を載置させる方法
は、この技術に熟練した当業者であれば自明である。支
持体材料の選択は、使用する細胞の具体的方法および定
量方法による。濾材の中には厚さが均一でなく、したが
ってイン シチュ ハイブリッド形成法を実施する時に
収縮、膨張が不均一になるものがある。その上、自動蛍
光を発する支持体の中には低レベルの蛍光体の測定を妨
げるものがある。顕微鏡用のスライドガラスは信号／ノ
ズル比が大きく、組織の保存が良好であるので固体支持
体としては最も好ましいものである。
細胞／組織の固定 細胞またはその部分を固体支持体上に載置させた後、
試料を固着させる。固着剤は単独または混合して使用す
るいかなる沈着剤または架橋剤よりなる群から選ばれて
も、また水性または非水性のいずれであってもよい。こ
の固着剤は、ホルムアルデヒド溶液、アルコール類、塩
溶液、塩化水銀、食塩、硫酸ソーダ、重クロム酸カリウ
ム、リン酸カリウム、臭化アンモニウム、塩化カルシウ
ム、酢酸ソーダ、塩化リチウム、酢酸セシウム、酢酸カ
ルシウムまたはマグネシウム、硝酸カリウム、重クロム
酸カリウム、クロム酸ソーダ、ヨウ化カリウム、ヨウ素
酸カリウム、ヨウ素酸ソーダ、チオ硫酸ソーダ、ピクリ
ン酸、酢酸、パラホルムアルデヒド、苛性ソーダ、アセ
トン、クロロホルム、グリセリン、チモール等よりなる
群から選択してもよい。好ましくは、この固着剤は沈着
作用を介して細胞構成要素を固定させ、下記のような特
徴を有する薬剤よりなるものである。：すなわち、その
効果は可逆性があり、細胞形態を維持し、所望の細胞構
成要素の抗原性を維持し、細胞の適当な位置に核酸が保
持され、その核酸が二重鎖または三重鎖のハイブリッド
を形成できないような方法では変性せず、前記細胞構成
要素は固有のターゲット配列すべてに対して核酸ハイブ
リッド形成工程を阻止するような方法では影響を及ぼす
ことがない。これの固着剤および固着方法の選択によっ
て、細胞構成要素および細胞形態は影響を受ける。すな
わち、このような効果は、組織は特殊化することができ
る。本発明で使用する固着剤として好ましいものは、エ
タノール、エタノール−酢酸、メタノール、およびメタ
ノール−アセトンよりなる群から選ばれ、これらの固着
剤は最高のハイブリッド形成効果と細胞形態の良好な保
存性とを付与することができる。
試料を固着させる。固着剤は単独または混合して使用す
るいかなる沈着剤または架橋剤よりなる群から選ばれて
も、また水性または非水性のいずれであってもよい。こ
の固着剤は、ホルムアルデヒド溶液、アルコール類、塩
溶液、塩化水銀、食塩、硫酸ソーダ、重クロム酸カリウ
ム、リン酸カリウム、臭化アンモニウム、塩化カルシウ
ム、酢酸ソーダ、塩化リチウム、酢酸セシウム、酢酸カ
ルシウムまたはマグネシウム、硝酸カリウム、重クロム
酸カリウム、クロム酸ソーダ、ヨウ化カリウム、ヨウ素
酸カリウム、ヨウ素酸ソーダ、チオ硫酸ソーダ、ピクリ
ン酸、酢酸、パラホルムアルデヒド、苛性ソーダ、アセ
トン、クロロホルム、グリセリン、チモール等よりなる
群から選択してもよい。好ましくは、この固着剤は沈着
作用を介して細胞構成要素を固定させ、下記のような特
徴を有する薬剤よりなるものである。：すなわち、その
効果は可逆性があり、細胞形態を維持し、所望の細胞構
成要素の抗原性を維持し、細胞の適当な位置に核酸が保
持され、その核酸が二重鎖または三重鎖のハイブリッド
を形成できないような方法では変性せず、前記細胞構成
要素は固有のターゲット配列すべてに対して核酸ハイブ
リッド形成工程を阻止するような方法では影響を及ぼす
ことがない。これの固着剤および固着方法の選択によっ
て、細胞構成要素および細胞形態は影響を受ける。すな
わち、このような効果は、組織は特殊化することができ
る。本発明で使用する固着剤として好ましいものは、エ
タノール、エタノール−酢酸、メタノール、およびメタ
ノール−アセトンよりなる群から選ばれ、これらの固着
剤は最高のハイブリッド形成効果と細胞形態の良好な保
存性とを付与することができる。
本発明の実施に当たって最も好ましい固着剤として
は、HL−60および正常な骨髄細胞用にはエタノール95容
量％と酢酸５容量％を含むもの、K562および正常な末梢
血液細胞用にはエタノール75容量％と酢酸20容量％を含
むもの、繊維芽細胞および正常な骨髄細胞用にはメタノ
ール50容量％とアセト50容量％を含むもの、および心臓
筋肉組織用にはホルムアルデヒド10容量％とメタノール
90容量％を含むものがある。これらの固着剤は、細胞形
態の保存、抗原の保存と良好な接近性、および高いハイ
ブリッド形成効率を提供することができる。本発明によ
れば、各組織の種類に対しては、１〜２種の固着剤によ
って、細胞の最良の位置的解決と最適のハイブリッド形
成効率との両方を確実に提供することができる。
は、HL−60および正常な骨髄細胞用にはエタノール95容
量％と酢酸５容量％を含むもの、K562および正常な末梢
血液細胞用にはエタノール75容量％と酢酸20容量％を含
むもの、繊維芽細胞および正常な骨髄細胞用にはメタノ
ール50容量％とアセト50容量％を含むもの、および心臓
筋肉組織用にはホルムアルデヒド10容量％とメタノール
90容量％を含むものがある。これらの固着剤は、細胞形
態の保存、抗原の保存と良好な接近性、および高いハイ
ブリッド形成効率を提供することができる。本発明によ
れば、各組織の種類に対しては、１〜２種の固着剤によ
って、細胞の最良の位置的解決と最適のハイブリッド形
成効率との両方を確実に提供することができる。
同時に、この固着剤はこれらの物質を架橋させて細胞
組成物を固着するような化合物、例えばグルタールアル
デヒドやホルムアルデヒドを包含していてもよい。この
ような架橋剤は沈澱剤として上記の要求事項をすべて満
足していなければならないが、一般には、より「粘着
性」で、細胞と膜組成物を強固の結合させたり、封じ込
めたりし、その結果上記のような特徴を保持するもので
ある。このような架橋剤は実際使用するとすれば、10容
量％以下が好ましい。
組成物を固着するような化合物、例えばグルタールアル
デヒドやホルムアルデヒドを包含していてもよい。この
ような架橋剤は沈澱剤として上記の要求事項をすべて満
足していなければならないが、一般には、より「粘着
性」で、細胞と膜組成物を強固の結合させたり、封じ込
めたりし、その結果上記のような特徴を保持するもので
ある。このような架橋剤は実際使用するとすれば、10容
量％以下が好ましい。
架橋剤は、巨大構造物を保持できるが、ハイブリッド
形成効率を低下させることが多い。架橋剤は核酸と抗原
とを捕捉して、これらをプローブや抗原へ接近不能とす
るような網目を形成する。またその中には、核酸を共有
結合的に変性し、その後のハイブリッド形成を妨害する
ものもある。
形成効率を低下させることが多い。架橋剤は核酸と抗原
とを捕捉して、これらをプローブや抗原へ接近不能とす
るような網目を形成する。またその中には、核酸を共有
結合的に変性し、その後のハイブリッド形成を妨害する
ものもある。
細胞／組織の貯蔵 前記の固定化を行った後、細胞を包含する顕微鏡用ス
ライドガラスを空気中室温下で、３週間以内、低温（４
℃）の70容量％のエタノール水溶液中で６−12カ月、ま
たはパラプラスト中で２年間以内は貯蔵してもよい。も
し試料をRNアーゼを含まない条件下で処理する時は、等
級付きのアルコールで脱水してから室温下で少なくとも
５カ月間貯蔵させてもよい。
ライドガラスを空気中室温下で、３週間以内、低温（４
℃）の70容量％のエタノール水溶液中で６−12カ月、ま
たはパラプラスト中で２年間以内は貯蔵してもよい。も
し試料をRNアーゼを含まない条件下で処理する時は、等
級付きのアルコールで脱水してから室温下で少なくとも
５カ月間貯蔵させてもよい。
プレ・ハイブリッド形成処理 本発明によれば、正式にはプレ・ハイブリッド形成工
程は不必要である。プローブの不特定結合を抑制した
り、プローブを侵入させることはハイブリッド形成溶液
中で実施できる。もしハイブリッド形成処理を短時間
（30分以下）に行う時には、スライドガラスにハイブリ
ッド形成溶液を添加する前にハイブリッド形成温度まで
スライドガラスを余熱しておいてもよい。
程は不必要である。プローブの不特定結合を抑制した
り、プローブを侵入させることはハイブリッド形成溶液
中で実施できる。もしハイブリッド形成処理を短時間
（30分以下）に行う時には、スライドガラスにハイブリ
ッド形成溶液を添加する前にハイブリッド形成温度まで
スライドガラスを余熱しておいてもよい。
ハイブリッド形成 核酸ハイブリッド形成とは、２又はそれ以上の鏡面象
すなわちDNA,RNA,オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチ
ド、またはそれらの各組み合わせたものが互いに認識
し、瞬時の自発的または誘導された、例えば水素結合の
ような化学結合のいずれかを形成することによって相互
に結合する工程である。この結合度は会合する核酸の種
類、会合する正常な核酸によって限定される「正確な」
結合の範囲、および結合および対形成という正常な化学
的法則で限定されるような「正確な」結合の範囲に基づ
いて制御することができる。例えば、二重鎖の結合によ
って鎖長が10の正確な組み合わせ10個中の９個が形成さ
れる時、この結合は90％一致であると呼ばれる。
すなわちDNA,RNA,オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチ
ド、またはそれらの各組み合わせたものが互いに認識
し、瞬時の自発的または誘導された、例えば水素結合の
ような化学結合のいずれかを形成することによって相互
に結合する工程である。この結合度は会合する核酸の種
類、会合する正常な核酸によって限定される「正確な」
結合の範囲、および結合および対形成という正常な化学
的法則で限定されるような「正確な」結合の範囲に基づ
いて制御することができる。例えば、二重鎖の結合によ
って鎖長が10の正確な組み合わせ10個中の９個が形成さ
れる時、この結合は90％一致であると呼ばれる。
細胞核酸配列は、分子ハイブリッド配列工程で検知で
きる。この時プローブはある方法で「ラベル化（標識
化）」して、個々の細胞中に存在する相補型細胞核酸配
列が検知できねばならない。
きる。この時プローブはある方法で「ラベル化（標識
化）」して、個々の細胞中に存在する相補型細胞核酸配
列が検知できねばならない。
本発明においては、「ハイブリッド形成」という用語
は、ターゲット抗原に対する抗体の結合をも意味するも
のである。
は、ターゲット抗原に対する抗体の結合をも意味するも
のである。
プローブの種類 プローブは、遺伝物質としてDNA,RNA,DNAまたはRNAよ
りなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよ
び抗体に限定される。このDNAまたはRANは、アデノシ
ン、ウリジン、チミジン、グアニン、チトシンなどの塩
基またはこれらの天然または人工化学的誘導体よりなる
ものであってもよい。このプローブは、１種以上の化学
結合、通常は水素結合を介して相補型または鏡面対象型
ターゲット細胞遺伝子配列に結合可能とされている。こ
の結合の程度は、結合またはハイブリッド形成工程で認
められたミスマッチの量として示される。；このプロー
ブのターゲット細胞配列に対する相補度として示されて
いる。プローブの大きさは所望のミスマッチレベルで安
定なハイブリッドを形成できる大きさに調整する。；代
表的な例としては、単独塩基ミスマッチの検知には、約
12−50塩基のプローブが必要である。（50〜数万の塩基
よりなる）より大きなプローブは、プローブのターゲッ
ト細胞遺伝子配列との全体の類似率としてミスマッチレ
ベルを測定する時に使用されることが多い。プローブが
種々の領域の遺伝子物質または細胞への侵入または結合
を許容または抑制するためプローブの大きさを変えても
よい。同様にして、プローブの種類（例えばDNA対RNAを
使用するとき）についても前記の目的に対して考慮すれ
ばよい。また、プローブの大きさはプローブの拡散速
度、細胞ターゲット整合体の発見確率、等にも影響す
る。代表的な例としては、二重鎖DNA（dsDNA）一本鎖DN
A（ssDNA）またはRNAプローブは、ヌクレオチド配列が
ターゲットである時ハイブリッド形成反応に使われる。
りなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよ
び抗体に限定される。このDNAまたはRANは、アデノシ
ン、ウリジン、チミジン、グアニン、チトシンなどの塩
基またはこれらの天然または人工化学的誘導体よりなる
ものであってもよい。このプローブは、１種以上の化学
結合、通常は水素結合を介して相補型または鏡面対象型
ターゲット細胞遺伝子配列に結合可能とされている。こ
の結合の程度は、結合またはハイブリッド形成工程で認
められたミスマッチの量として示される。；このプロー
ブのターゲット細胞配列に対する相補度として示されて
いる。プローブの大きさは所望のミスマッチレベルで安
定なハイブリッドを形成できる大きさに調整する。；代
表的な例としては、単独塩基ミスマッチの検知には、約
12−50塩基のプローブが必要である。（50〜数万の塩基
よりなる）より大きなプローブは、プローブのターゲッ
ト細胞遺伝子配列との全体の類似率としてミスマッチレ
ベルを測定する時に使用されることが多い。プローブが
種々の領域の遺伝子物質または細胞への侵入または結合
を許容または抑制するためプローブの大きさを変えても
よい。同様にして、プローブの種類（例えばDNA対RNAを
使用するとき）についても前記の目的に対して考慮すれ
ばよい。また、プローブの大きさはプローブの拡散速
度、細胞ターゲット整合体の発見確率、等にも影響す
る。代表的な例としては、二重鎖DNA（dsDNA）一本鎖DN
A（ssDNA）またはRNAプローブは、ヌクレオチド配列が
ターゲットである時ハイブリッド形成反応に使われる。
核酸プローブは、公知の技術に精通した当業者には公
知の種々の方法により調整できる。精製した二重鎖配列
DNA（dsDNA）は、ニック翻訳工程またはランダムプライ
マー伸長工程により、ラベル化した無傷のものとする。
細胞内に固定された核酸への二重鎖プローブのハイブリ
ッド形成は、細胞核酸をハイブリッド形成する前に溶液
中で互いにハイブリッドする相補鎖の能力で相殺され
る。一本鎖DNA（ssDNA）プローブはこの限定を受けず、
オリゴヌクレオチドの合成、一本鎖ファージM13または
このファージのプラスミド誘導体の使用または精製RNA
鋳型の逆転写によって産生できる。一本鎖DNA（ssDNA）
プローブをハイブリッド形成反応に使用することによっ
て、二重鎖または一本鎖DNAプローブのどちらかを使用
するよりもずっと潜在的に信号／ノイズ比が大きくな
る。dsDNA,ssDNAまたはssRNAプローブのいずれかをハイ
ブリッド形成反応に使用するかにかかわらず、ハイブリ
ッド生成を検知できる手段が幾つかあるに違いない。ハ
イブリッド生成を検知する手段としては、幾つかの種類
の検知可能なラベルでラベル化したプローブを使用す
る。
知の種々の方法により調整できる。精製した二重鎖配列
DNA（dsDNA）は、ニック翻訳工程またはランダムプライ
マー伸長工程により、ラベル化した無傷のものとする。
細胞内に固定された核酸への二重鎖プローブのハイブリ
ッド形成は、細胞核酸をハイブリッド形成する前に溶液
中で互いにハイブリッドする相補鎖の能力で相殺され
る。一本鎖DNA（ssDNA）プローブはこの限定を受けず、
オリゴヌクレオチドの合成、一本鎖ファージM13または
このファージのプラスミド誘導体の使用または精製RNA
鋳型の逆転写によって産生できる。一本鎖DNA（ssDNA）
プローブをハイブリッド形成反応に使用することによっ
て、二重鎖または一本鎖DNAプローブのどちらかを使用
するよりもずっと潜在的に信号／ノイズ比が大きくな
る。dsDNA,ssDNAまたはssRNAプローブのいずれかをハイ
ブリッド形成反応に使用するかにかかわらず、ハイブリ
ッド生成を検知できる手段が幾つかあるに違いない。ハ
イブリッド生成を検知する手段としては、幾つかの種類
の検知可能なラベルでラベル化したプローブを使用す
る。
抗体プローブもこの技術に精通した当業者には公知の
ものである。この「抗体プローブ」という用語はターゲ
ット抗原に特定で、それと結合する抗体を意味してい
る。このようなターゲット抗原は、ペプチド、プロテイ
ン、炭水化物または抗体が結合して特異性を付与するよ
うないかなる他の生体高分子であってもよい。
ものである。この「抗体プローブ」という用語はターゲ
ット抗原に特定で、それと結合する抗体を意味してい
る。このようなターゲット抗原は、ペプチド、プロテイ
ン、炭水化物または抗体が結合して特異性を付与するよ
うないかなる他の生体高分子であってもよい。
検知システム 検知可能なラベルは、検知できるものであればどんな
分子でもよい。普通使用される検知可能なラベルとして
は、32P,14C,125I,3H,35Sのような放射性のラベルがあ
るが、これだけに限定するものではない。ビオチンをラ
ベル化したヌクレオチドは、ニック翻訳法、酵素性のま
たは化学的手段によって、DNAまたはRNAに一体化させて
もよい。ビオチニル化したプローブは、アビディン／ス
トレプトアビディン蛍光体、酵素性またはコロイド状金
結合体を用いてハイブリッド形成した後で検知する。ま
た核酸は、別の蛍光性化合物、免疫検知性蛍光性誘導体
またはビオチン類似物でラベル化してもよい。また核酸
は、プロテインを付着させてラベル化してもよい。放射
性または蛍光性のヒストンH1、酵素（アルカリホスファ
ターゼおよびパーオキシターゼ）または一本鎖の結合
（ssB）プロテイン架橋させた核酸も使用できる。コロ
イド状の金、またはパーオキシターゼ産生物の検知感度
を大きくするために銀溶液を用いるような多数の強化ま
たは増幅方法を講じてもよい。
分子でもよい。普通使用される検知可能なラベルとして
は、32P,14C,125I,3H,35Sのような放射性のラベルがあ
るが、これだけに限定するものではない。ビオチンをラ
ベル化したヌクレオチドは、ニック翻訳法、酵素性のま
たは化学的手段によって、DNAまたはRNAに一体化させて
もよい。ビオチニル化したプローブは、アビディン／ス
トレプトアビディン蛍光体、酵素性またはコロイド状金
結合体を用いてハイブリッド形成した後で検知する。ま
た核酸は、別の蛍光性化合物、免疫検知性蛍光性誘導体
またはビオチン類似物でラベル化してもよい。また核酸
は、プロテインを付着させてラベル化してもよい。放射
性または蛍光性のヒストンH1、酵素（アルカリホスファ
ターゼおよびパーオキシターゼ）または一本鎖の結合
（ssB）プロテイン架橋させた核酸も使用できる。コロ
イド状の金、またはパーオキシターゼ産生物の検知感度
を大きくするために銀溶液を用いるような多数の強化ま
たは増幅方法を講じてもよい。
間接的な蛍光性免疫細菌化学法も使用できる［Rudkin
and Stollar,（1977）Nature:265,472;Van Prooijen,e
t.al.,（1982）Exp.Cell.Res.:141.397］。ポリクロー
ナル抗体は、ポリ（rA）−ポリ（dT）と共に動物に注射
して、RNA−DNAハイブリッドに対し産生させる。DNAプ
ローブは細胞にイン シチュ ハイブリッド化され、こ
のハイブリッドを抗体でRNA−DNAハイブリッドに培養し
て検出する、 本発明によれば、RNAプローブの方がDNAプローブより
も好適である（５〜８倍も効率が良い）。ビオチンの代
わりにフォトビオチン（登録商標）でラベル化したプロ
ーブはこの定量法の感度を２〜３倍も向上させる。
and Stollar,（1977）Nature:265,472;Van Prooijen,e
t.al.,（1982）Exp.Cell.Res.:141.397］。ポリクロー
ナル抗体は、ポリ（rA）−ポリ（dT）と共に動物に注射
して、RNA−DNAハイブリッドに対し産生させる。DNAプ
ローブは細胞にイン シチュ ハイブリッド化され、こ
のハイブリッドを抗体でRNA−DNAハイブリッドに培養し
て検出する、 本発明によれば、RNAプローブの方がDNAプローブより
も好適である（５〜８倍も効率が良い）。ビオチンの代
わりにフォトビオチン（登録商標）でラベル化したプロ
ーブはこの定量法の感度を２〜３倍も向上させる。
プローブの大きさと濃度 プローブの長さは、その拡散速度、ハイブリッド形成
速度およびハイブリッドの安定性に影響する。本発明に
よれば、短いプローブ（50〜150塩基）は最も高感度
で、迅速で安定な系となる。検知すべきターゲット生体
高分子の全長に及ぶこの短いプローブ（50〜150塩基）
の混合物も調製することができる。例えばターゲット生
体高分子が1000塩基の長さであれば、約10〜20種の異な
る50〜100塩基のプローブが、このターゲット生体高分
子の全領域を完全にカバーするのにハイブリッドが溶液
中に使用されている。
速度およびハイブリッドの安定性に影響する。本発明に
よれば、短いプローブ（50〜150塩基）は最も高感度
で、迅速で安定な系となる。検知すべきターゲット生体
高分子の全長に及ぶこの短いプローブ（50〜150塩基）
の混合物も調製することができる。例えばターゲット生
体高分子が1000塩基の長さであれば、約10〜20種の異な
る50〜100塩基のプローブが、このターゲット生体高分
子の全領域を完全にカバーするのにハイブリッドが溶液
中に使用されている。
プローブの濃度はまた、イン シチュ ハイブリッド
形成反応の幾つかのパラメータにも影響する。高濃度を
使用すると、拡散を増加させ、ハイブリッド形成反応時
間を低減させ、妥当な細胞配列を飽和させる。本発明に
よれば、この反応は30分で完了する（第２図参照）。高
い信号／ノイズ比を保持しながら反応速度を早めるに
は、プローブの濃度を2.5〜5.0μg/mlとすることが好ま
しい。またプローブ濃度が2.5μg/mlであることがさら
に好ましい。
形成反応の幾つかのパラメータにも影響する。高濃度を
使用すると、拡散を増加させ、ハイブリッド形成反応時
間を低減させ、妥当な細胞配列を飽和させる。本発明に
よれば、この反応は30分で完了する（第２図参照）。高
い信号／ノイズ比を保持しながら反応速度を早めるに
は、プローブの濃度を2.5〜5.0μg/mlとすることが好ま
しい。またプローブ濃度が2.5μg/mlであることがさら
に好ましい。
ハイブリッド形成溶液と温度 好ましい実施例においては、本発明のハイブリッド形
成溶液は、ホルムアミド50容量％、４×SSC,（１×SSC
＝食塩0.15モルシュウ酸ソーダ0.015モル）、リン酸ソ
ーダ（pH＝7.4）約0.1モル、低分子量DNA約100μg/ml、
トリトンＸ−100 0.1％、およびバナジル・リボヌクレ
オシド錯体約10〜20ミリモルを包含する一本鎖RNAプロ
ーブもこの溶液に加える。このプローブは少なくとも15
−20の塩基よりなり、好ましくは75−150の塩基で、フ
ォトビオチン（登録商標）でラベル化した。第１図に示
すように、ハイブリッド形成の最適温度は50−55℃であ
る。しかし、15から80℃に及ぶ温度を使ってもよい。
成溶液は、ホルムアミド50容量％、４×SSC,（１×SSC
＝食塩0.15モルシュウ酸ソーダ0.015モル）、リン酸ソ
ーダ（pH＝7.4）約0.1モル、低分子量DNA約100μg/ml、
トリトンＸ−100 0.1％、およびバナジル・リボヌクレ
オシド錯体約10〜20ミリモルを包含する一本鎖RNAプロ
ーブもこの溶液に加える。このプローブは少なくとも15
−20の塩基よりなり、好ましくは75−150の塩基で、フ
ォトビオチン（登録商標）でラベル化した。第１図に示
すように、ハイブリッド形成の最適温度は50−55℃であ
る。しかし、15から80℃に及ぶ温度を使ってもよい。
ハイブリッド形成後処理および検知 本発明はハイブリッド検知前に洗浄段階を必要としな
い。その代わりにアビディンまたはストレプトアビディ
ン蛍光体、酵素状またはコロイド状金錯体のハイブリッ
ド形成混合液を包含し、室温で20分間または37℃で10分
間培養したスライドガラスに直接添加してもよい。この
段階は、幾つかの後ハイブリッド形成洗浄段階および不
特定のアビディン／ストレプトアビディン結合サイトに
必要な再抑制を省略することによって節約できる時間に
より従来のハイブリッド形成法よりも著しい利点を得る
ことができる。またその結果信号が低下することも、ノ
イズが増加することもない。
い。その代わりにアビディンまたはストレプトアビディ
ン蛍光体、酵素状またはコロイド状金錯体のハイブリッ
ド形成混合液を包含し、室温で20分間または37℃で10分
間培養したスライドガラスに直接添加してもよい。この
段階は、幾つかの後ハイブリッド形成洗浄段階および不
特定のアビディン／ストレプトアビディン結合サイトに
必要な再抑制を省略することによって節約できる時間に
より従来のハイブリッド形成法よりも著しい利点を得る
ことができる。またその結果信号が低下することも、ノ
イズが増加することもない。
ストレプトアビディン／アビディン検知段階の後、大
量の２×SSC/トリトンＸ−100 0.1％混合液で洗浄す
る。この溶液には、室温下でRNアーゼＡおよびT1を包含
させてもよい。この洗浄は、連続した緩慢な循環または
ストリーム状の大量（約１〜200ml/細胞表面積1cm2当
り）の溶液が細胞上を移動する限り極めて短時間（５分
以下）でよい。この後、さらに厳重に（少なくとも0.1
×SSCのような低塩濃度および／または65℃以上という
高温で）洗浄してもよい。細胞表面を湿らせたまま、支
持体を乾燥し、通常の方法でカバーグラスを付ける。
量の２×SSC/トリトンＸ−100 0.1％混合液で洗浄す
る。この溶液には、室温下でRNアーゼＡおよびT1を包含
させてもよい。この洗浄は、連続した緩慢な循環または
ストリーム状の大量（約１〜200ml/細胞表面積1cm2当
り）の溶液が細胞上を移動する限り極めて短時間（５分
以下）でよい。この後、さらに厳重に（少なくとも0.1
×SSCのような低塩濃度および／または65℃以上という
高温で）洗浄してもよい。細胞表面を湿らせたまま、支
持体を乾燥し、通常の方法でカバーグラスを付ける。
イン シチュ ハイブリッド形成感度および定量の結果
の解析 本発明の方法は、１細胞当りターゲット生体高分子が
１−５分子程度の場合の感度で、測定を完了させるのに
２−４時間を必要とする。このことは少なくとも下記の
３因子の組み合わせによって達成することができる。:
1）細胞構成体が核酸上に非可逆的に沈着するものでは
ない。２）固着は使用される特定組織では最適の状態に
ある。３）反応動力学は高いプローブ濃度および高温下
ではより迅速に進行する。
の解析 本発明の方法は、１細胞当りターゲット生体高分子が
１−５分子程度の場合の感度で、測定を完了させるのに
２−４時間を必要とする。このことは少なくとも下記の
３因子の組み合わせによって達成することができる。:
1）細胞構成体が核酸上に非可逆的に沈着するものでは
ない。２）固着は使用される特定組織では最適の状態に
ある。３）反応動力学は高いプローブ濃度および高温下
ではより迅速に進行する。
１細胞当りのmRNAのコピー数は、放射性プローブを使
用すると細胞上の数から評価できる。蛍光または酵素に
よる検知の場合には、蛍光体または沈着した着色産生物
を相対評価することによってmRNAコピー数が評価でき
る。通常このコピー数の近似は手動式の写真撮影、フィ
ルム処理およびプリント画像の比較よりもずっと容易で
ある。イン シチュ ハイブリッド形成法で得られた放
射または蛍光信号の定量化は、実施例11に示すMaridian
ACAS 470ワークステーションのような画像解析法を使
うと自動化できる。
用すると細胞上の数から評価できる。蛍光または酵素に
よる検知の場合には、蛍光体または沈着した着色産生物
を相対評価することによってmRNAコピー数が評価でき
る。通常このコピー数の近似は手動式の写真撮影、フィ
ルム処理およびプリント画像の比較よりもずっと容易で
ある。イン シチュ ハイブリッド形成法で得られた放
射または蛍光信号の定量化は、実施例11に示すMaridian
ACAS 470ワークステーションのような画像解析法を使
うと自動化できる。
３種のmRNAの同時検知 本発明は、同一細胞内にある異なった物質（mRNAsや
プロテイン）を同時検知することができる。このことは
以下の２方法の中のいずれかで達成できる。第１の方法
は、それぞれが独自のラベル（例えば、蛍光性のタグ
「Ａ」、「Ｂ」および「Ｃ」で、それぞれ異なった検知
可能な波長の光を発光する。）を包含する多種のプロー
ブすべてを前記ハイブリッド形成溶液に添加する。一
方、１種のプローブとラベルに対してハイブリッド形
成、検知反応を実施し、残りの未反応プローブとラベル
をヌクレアーゼなしの条件下で洗浄して、別のハイブリ
ッド形成反応を実施する。実施例９は、同一細胞中に多
種のターゲット生体高分子を有する場合の検知に関する
一実施例を示したものである。
プロテイン）を同時検知することができる。このことは
以下の２方法の中のいずれかで達成できる。第１の方法
は、それぞれが独自のラベル（例えば、蛍光性のタグ
「Ａ」、「Ｂ」および「Ｃ」で、それぞれ異なった検知
可能な波長の光を発光する。）を包含する多種のプロー
ブすべてを前記ハイブリッド形成溶液に添加する。一
方、１種のプローブとラベルに対してハイブリッド形
成、検知反応を実施し、残りの未反応プローブとラベル
をヌクレアーゼなしの条件下で洗浄して、別のハイブリ
ッド形成反応を実施する。実施例９は、同一細胞中に多
種のターゲット生体高分子を有する場合の検知に関する
一実施例を示したものである。
以下に示す実施例は説明のために提示されたもので、
本発明をいかなる方法によっても限定するものではな
い。すべての実施例において、％は固体の場合は重量％
を、液体の場合には容量％を表し、温度はとくに断らな
い限り℃で表されている。
本発明をいかなる方法によっても限定するものではな
い。すべての実施例において、％は固体の場合は重量％
を、液体の場合には容量％を表し、温度はとくに断らな
い限り℃で表されている。
実施例１ プローブの調製 A.概論 本発明で有効なRNAまたはDNAプローブは、当技術に精
通した当業者に公知の方法にしたがって調整するか、ま
たはいかなる市販のソースから入手したものであっても
よい。RNAプローブはGreenら［（1981）Cell:32.681］
の記載する方法で調整してもよい。DNAプローブは、Rig
byら［（1977）J.Mol.Biol.:113.237］の記載するよう
な当技術に精通した当業者に公知の方法で調整してもよ
い。合成オリゴヌクレオチドプローブは、Wallace.ら
［（1979）Nucleic Acids Res.:.63543］の記載するよ
うにして調整してもよい。本発明に有効なプローブは次
の特徴を有している必要がある。
通した当業者に公知の方法にしたがって調整するか、ま
たはいかなる市販のソースから入手したものであっても
よい。RNAプローブはGreenら［（1981）Cell:32.681］
の記載する方法で調整してもよい。DNAプローブは、Rig
byら［（1977）J.Mol.Biol.:113.237］の記載するよう
な当技術に精通した当業者に公知の方法で調整してもよ
い。合成オリゴヌクレオチドプローブは、Wallace.ら
［（1979）Nucleic Acids Res.:.63543］の記載するよ
うにして調整してもよい。本発明に有効なプローブは次
の特徴を有している必要がある。
ターゲット分子のための特異性をもつ。
少なくとも長さが15塩基対、好ましくは75−150塩基
対をもつ。
対をもつ。
B.RNAプローブの調整 ｃ−myc,c−sisまたはｃ−abl遺伝子のサブ染色体断
片をAmersham Inc.社（カタログ番号:RPN.1315X,RPN.13
24XおよびRPN.1325Xに相当）から購入した。本発明の一
実施例では、前記ｃ−myc,c−sisまたはｃ−abl遺伝子
のセンス鎖プローブを使用した。使用したｃ−mycプロ
ーブはｃ−myc遺伝子の３′末端からの1.3kb Cla I/Eco
R Iゲノム・クローン（Della−Faveraら［（1983）Scie
nce:219,963］）である。ｃ−ablプローブは、５′ｃ−
ablハイブリッド化領域のEcoR I/BamH Iフラグメントで
あるヒトｃ−abl遺伝子のサブクローンから誘導した（b
e Kleinら［（1982）Nature:300,765］）。ｃ−sisプロ
ーブは、ｃ−sis遺伝子の３′エンドに相当するクロー
ンL33のBamH I断片（Josephsら［（1983）Science:219,
503］）である。HIVおよびEBVプローブは、Dewhurstら
［（1987）FEBS Lett.:213,133］の記載したものから入
手し、調整した。CMVプローブは、Cronczolら［（198
4）Science:224,159］の記載したものである。これらの
鋳型プラスミドDNAsはCreenら［（1981）Cell:32,681］
の記載する方法で転写した。RNAの大きさおよび量はTho
mas［（1980）Proc.Nat.Acad.Sci.USA:77,5201］の記載
する変性agroseゲルを介して電気泳動法により、またA2
60およびA280による分光分析法により確認した。DNAベ
ーターアクチンプローブは、Celvelandら［（1980）Cel
l:20,95］に記載する方法で調整し、RNAプローブはBres
serとEvinger−Hodges［（1987）Gene Anal.Tech.:.48
9］の記載し、ここで参考試料として引用した方法によ
り、ホトビオチン（登録商標）でラベル化した。
片をAmersham Inc.社（カタログ番号:RPN.1315X,RPN.13
24XおよびRPN.1325Xに相当）から購入した。本発明の一
実施例では、前記ｃ−myc,c−sisまたはｃ−abl遺伝子
のセンス鎖プローブを使用した。使用したｃ−mycプロ
ーブはｃ−myc遺伝子の３′末端からの1.3kb Cla I/Eco
R Iゲノム・クローン（Della−Faveraら［（1983）Scie
nce:219,963］）である。ｃ−ablプローブは、５′ｃ−
ablハイブリッド化領域のEcoR I/BamH Iフラグメントで
あるヒトｃ−abl遺伝子のサブクローンから誘導した（b
e Kleinら［（1982）Nature:300,765］）。ｃ−sisプロ
ーブは、ｃ−sis遺伝子の３′エンドに相当するクロー
ンL33のBamH I断片（Josephsら［（1983）Science:219,
503］）である。HIVおよびEBVプローブは、Dewhurstら
［（1987）FEBS Lett.:213,133］の記載したものから入
手し、調整した。CMVプローブは、Cronczolら［（198
4）Science:224,159］の記載したものである。これらの
鋳型プラスミドDNAsはCreenら［（1981）Cell:32,681］
の記載する方法で転写した。RNAの大きさおよび量はTho
mas［（1980）Proc.Nat.Acad.Sci.USA:77,5201］の記載
する変性agroseゲルを介して電気泳動法により、またA2
60およびA280による分光分析法により確認した。DNAベ
ーターアクチンプローブは、Celvelandら［（1980）Cel
l:20,95］に記載する方法で調整し、RNAプローブはBres
serとEvinger−Hodges［（1987）Gene Anal.Tech.:.48
9］の記載し、ここで参考試料として引用した方法によ
り、ホトビオチン（登録商標）でラベル化した。
プローブの100倍の濃度で低分子量DNAを添加し、ポリ
ヌクレオチド全部を1/3容量の10モル酢酸アンモニウム
および２−1/2容量の95％エタノールを添加して沈着さ
せた。核酸は遠心分離によって回収し、水に再分散させ
て１μg/mlの濃度とし、使用時まで−70℃で貯蔵した。
ヌクレオチド全部を1/3容量の10モル酢酸アンモニウム
および２−1/2容量の95％エタノールを添加して沈着さ
せた。核酸は遠心分離によって回収し、水に再分散させ
て１μg/mlの濃度とし、使用時まで−70℃で貯蔵した。
C.抗体プローブの調製 ウイルスまたはその抗原決定基のような抗原、ペプチ
ドおよび種々のソースから誘導されたペプチド、炭水化
物の一部、多種の生体高分子に特定した抗体プローブ
は、当技術に精通した当業者には公知のものである。こ
れらの抗体の調製方法もまた当技術に精通した当業者に
は公知のものである。
ドおよび種々のソースから誘導されたペプチド、炭水化
物の一部、多種の生体高分子に特定した抗体プローブ
は、当技術に精通した当業者には公知のものである。こ
れらの抗体の調製方法もまた当技術に精通した当業者に
は公知のものである。
簡単にいうと、ポリクローナル抗体は、ある抗原を持
つ動物ホストの免疫化によって調製できる。好ましく
は、この抗原は一週間間隔で皮下に、続いて１ケ月後に
ブースター投与し、さらに最終的には一週間間隔の投与
を行う。その後、血清を摂取し、この血清より抗体を沈
着させ、当技術に精通した当業者には公知の技術により
検知自在なようにラベル化する。
つ動物ホストの免疫化によって調製できる。好ましく
は、この抗原は一週間間隔で皮下に、続いて１ケ月後に
ブースター投与し、さらに最終的には一週間間隔の投与
を行う。その後、血清を摂取し、この血清より抗体を沈
着させ、当技術に精通した当業者には公知の技術により
検知自在なようにラベル化する。
モノクローナル抗原は、当技術に精通した当業者には
公知の技術には公知の方法のいずれかにしたがって調製
してもよい。免疫化されたドナーから骨髄腫細胞と脾臓
細胞間の溶融は、例えば腫瘍やウイルスのようなターゲ
ット抗原に対して大量のモノクローナル抗体を産生でき
る遺伝学的に安定なハイブリドーマ細胞の連続細胞ライ
ンの産生方法として成功したものであることが証明され
ている。たとえばモノクローナル抗体はKoprowskiらに
よる米国特許第4,172,124号公報または同じくKoprowski
らによる米国特許第4,196,265号公報に記載の方法で調
製してもよい。
公知の技術には公知の方法のいずれかにしたがって調製
してもよい。免疫化されたドナーから骨髄腫細胞と脾臓
細胞間の溶融は、例えば腫瘍やウイルスのようなターゲ
ット抗原に対して大量のモノクローナル抗体を産生でき
る遺伝学的に安定なハイブリドーマ細胞の連続細胞ライ
ンの産生方法として成功したものであることが証明され
ている。たとえばモノクローナル抗体はKoprowskiらに
よる米国特許第4,172,124号公報または同じくKoprowski
らによる米国特許第4,196,265号公報に記載の方法で調
製してもよい。
抗体のラベル化法は、当技術に精通した当業者には公
知のものである。
知のものである。
実施例2: ハイブリッド形成に及ぼす温度効果 K562細胞（ATCC ＃CCL 243）を、10％の胎児仔牛血清
を加えたHankの均衡塩溶液で育成させた。分割した細胞
を細胞遠心分離機でスライドガラス上に沈着させた。こ
の細胞をエタノール75％、氷酢酸20％、水５％の混合液
を用い、室温で20分間かけて固着させた。プレハイブリ
ッド形成段階は実施しなかった。ホルムアミド50％、４
×SCC,0.1モルリン酸ソーダ（pH＝7.4）、トリトンＸ−
100 0.1％、低分子量DNA（Sigma Chemical Co.社から入
手した鰊の精液DNAから得たもの）100μg/ml、およびハ
イブリッド形成フォトビオチンでラベル化したｃ−myc,
c−sisまたはｃ−abl型のいずれかのアンチセンスRNAプ
ローブ2.5μg/mlよりなるハイブリッド形成溶液20μｌ
を各試料に添加した。このアンチセンスRNAプローブは
実施例１に記載した方法で調製した。ハイブリッド形成
反応は４〜80℃の間の種々の温度で実施した。所定の温
度で２時間培養させた後、ハイブリッドの出来具合を検
討した。ハイブリッド形成を検知するために、この試料
にメーカーの薦める濃度の２倍のストレプトアビデイン
蛍光体またはローダミン錯体を添加した。室温で30分間
培養した後、試料を、細胞表面積1cm2当たり１〜200ml
の0.1％トリトンＸ−100、２×SSC、１×SSC,0.5×SSC
および0.1×SSCを含む各溶液で順次洗浄した。光増幅管
アタッチメントの付いたNikon蛍光顕微鏡を用いて１細
胞当たり発する蛍光を種々の温度でハイブリッド化した
各スライドについて記録した。１スライド当たり約300
〜800の細胞について分析を行った。各細胞について蛍
光量を表すのに得た数値結果を、ハイブリッド形成の温
度と相対蛍光値で図示した。
を加えたHankの均衡塩溶液で育成させた。分割した細胞
を細胞遠心分離機でスライドガラス上に沈着させた。こ
の細胞をエタノール75％、氷酢酸20％、水５％の混合液
を用い、室温で20分間かけて固着させた。プレハイブリ
ッド形成段階は実施しなかった。ホルムアミド50％、４
×SCC,0.1モルリン酸ソーダ（pH＝7.4）、トリトンＸ−
100 0.1％、低分子量DNA（Sigma Chemical Co.社から入
手した鰊の精液DNAから得たもの）100μg/ml、およびハ
イブリッド形成フォトビオチンでラベル化したｃ−myc,
c−sisまたはｃ−abl型のいずれかのアンチセンスRNAプ
ローブ2.5μg/mlよりなるハイブリッド形成溶液20μｌ
を各試料に添加した。このアンチセンスRNAプローブは
実施例１に記載した方法で調製した。ハイブリッド形成
反応は４〜80℃の間の種々の温度で実施した。所定の温
度で２時間培養させた後、ハイブリッドの出来具合を検
討した。ハイブリッド形成を検知するために、この試料
にメーカーの薦める濃度の２倍のストレプトアビデイン
蛍光体またはローダミン錯体を添加した。室温で30分間
培養した後、試料を、細胞表面積1cm2当たり１〜200ml
の0.1％トリトンＸ−100、２×SSC、１×SSC,0.5×SSC
および0.1×SSCを含む各溶液で順次洗浄した。光増幅管
アタッチメントの付いたNikon蛍光顕微鏡を用いて１細
胞当たり発する蛍光を種々の温度でハイブリッド化した
各スライドについて記録した。１スライド当たり約300
〜800の細胞について分析を行った。各細胞について蛍
光量を表すのに得た数値結果を、ハイブリッド形成の温
度と相対蛍光値で図示した。
第１図に示す結果は、50〜55℃のハイブリッド形成温
度が本発明に基づくハイブリッド形成法で最高のハイブ
リッド形成に相当する最大相対蛍光値を付与することを
示している。
度が本発明に基づくハイブリッド形成法で最高のハイブ
リッド形成に相当する最大相対蛍光値を付与することを
示している。
実施例3: イン シチュ ハイブリッド形成の動力学 第２図は、ハイブリッド形成時間と細胞上に見られる
蛍光信号量との関係を示す。K562細胞（ATCC ＃CCL 24
3）を10％の胎児仔牛血清を加えたHankの均衡塩溶液で
育成させた。分割した細胞を細胞遠心分離機でスライド
ガラス上に沈着させた。細胞はエタノール75％、氷酢酸
20％、水５％よりなる混合液により、室温下で20分間固
着させた。プリハイブリッド形成段階は実施しなかっ
た。ホルムアミド50％、４×SSC,0.1モルリン酸ソーダ
（pH＝7.4）、0.1％トリトンＸ−100,低分子量DNA（Sig
ma Chemical Co.社から入手した鰊の精液DNAから得たも
の）100μg/ml、およびハイブリッド形成フォトビオチ
ンでラベル化したｃ−myc,c−sisまたはｃ−abl型のい
ずれかのアンチセンスRNAプローブ2.5μg/mlからなるハ
イブリッド形成溶液20μｌを各試料に添加した。このア
ンチセンスRNAプローブは実施例１に記載した方法で調
製した。このハイブリッド形成反応は５分から96時間に
およぶ種々の時間で行った。55℃で所定時間培養させた
後、ハイブリッドの出来具合を検討した。ハイブリッド
形成を検知するため、この試料にメーカーの薦める濃度
の２倍のストレプトアビデイン蛍光体またはローダミン
錯体を添加した。室温で30分間培養させた後、試料を細
胞表面積1cm2当たり１〜200mlの0.1×SSC/0.1％トリト
ンＸ−100でゆっくりと洗浄した。100％グリセリン/2×
PBSの50/50（容量cc）を溶液を１滴ずつ各試料に添加し
た。光増幅管アタッチメントの付いたNikon蛍光顕微鏡
を用いて、１細胞当たり発する蛍光を種々の時点でハイ
ブリッド形成した各スライドについて記録した。１スラ
イド当たり約300〜800の細胞について分析を行った。各
細胞について蛍光量を表すのに得た数値結果を、ハイブ
リッド形成の対時間相対蛍光値で図示した。第２図は、
ハイブリッド形成反応が本発明に基づく条件下で30分後
に本質的に完了することを示している。
蛍光信号量との関係を示す。K562細胞（ATCC ＃CCL 24
3）を10％の胎児仔牛血清を加えたHankの均衡塩溶液で
育成させた。分割した細胞を細胞遠心分離機でスライド
ガラス上に沈着させた。細胞はエタノール75％、氷酢酸
20％、水５％よりなる混合液により、室温下で20分間固
着させた。プリハイブリッド形成段階は実施しなかっ
た。ホルムアミド50％、４×SSC,0.1モルリン酸ソーダ
（pH＝7.4）、0.1％トリトンＸ−100,低分子量DNA（Sig
ma Chemical Co.社から入手した鰊の精液DNAから得たも
の）100μg/ml、およびハイブリッド形成フォトビオチ
ンでラベル化したｃ−myc,c−sisまたはｃ−abl型のい
ずれかのアンチセンスRNAプローブ2.5μg/mlからなるハ
イブリッド形成溶液20μｌを各試料に添加した。このア
ンチセンスRNAプローブは実施例１に記載した方法で調
製した。このハイブリッド形成反応は５分から96時間に
およぶ種々の時間で行った。55℃で所定時間培養させた
後、ハイブリッドの出来具合を検討した。ハイブリッド
形成を検知するため、この試料にメーカーの薦める濃度
の２倍のストレプトアビデイン蛍光体またはローダミン
錯体を添加した。室温で30分間培養させた後、試料を細
胞表面積1cm2当たり１〜200mlの0.1×SSC/0.1％トリト
ンＸ−100でゆっくりと洗浄した。100％グリセリン/2×
PBSの50/50（容量cc）を溶液を１滴ずつ各試料に添加し
た。光増幅管アタッチメントの付いたNikon蛍光顕微鏡
を用いて、１細胞当たり発する蛍光を種々の時点でハイ
ブリッド形成した各スライドについて記録した。１スラ
イド当たり約300〜800の細胞について分析を行った。各
細胞について蛍光量を表すのに得た数値結果を、ハイブ
リッド形成の対時間相対蛍光値で図示した。第２図は、
ハイブリッド形成反応が本発明に基づく条件下で30分後
に本質的に完了することを示している。
実施例4: 細胞RNAの２次構造の変化 HL60細胞（ATCC ＃CLL 240）を、10％の胎児仔牛血清
を補足したHankのバランス塩溶液で育成させた。細胞は
回収し、細胞遠心分離機で顕微鏡用スライドガラス上に
沈着させた。この細胞をスライドガラス上で空気乾燥
し、使用時まで室温で貯蔵した。またこの細胞を、この
種の実験ではいくつかの固着剤の一つで固着させた。代
表的な固着剤としてはエタノール70％、エタノール95％
／氷酢酸５％、エタノール75％、氷酢酸20％、エタノー
ル100％、アセトン100％、アセトン50％、メタノール50
％、パラホルムアルデヒド４％、パラホルムアルデヒド
２％、ホルムアルデヒド10％／メタノール90％の溶液が
含まれる。これらの固着剤中で適当な時間、適当な温度
で細胞を固着した後、スライドから固着剤を除去し、標
準実験室法によってWright Giemsaまたはヘマトキシリ
ンおよびエオシンで染色した。細胞形態は、固着した後
の形態の保存度を固着する前の形態と比較することによ
って評価する。視覚形態を有効に保持できない固着剤に
は、任意に＋１と格付けした。細胞形態を有効に保持し
た固着剤は＋１〜＋４の間に任意に格付けされ、細胞形
態の最も有効に形態保持できたものには＋４と格付けし
た。これらの固着剤による細胞有効保存に関する次の評
価は、細胞抗原を検知したい時に実施できる。この場合
細胞は固着剤から取り出して特定のターゲット細胞抗原
に特異的な抗体と共に培養される。再び、細胞組成物の
抗原性を有効に保持する固着剤を任意に＋４と格付けし
たが、細胞保持を有効に実施できない固着剤はずっと低
く評価され、最悪のものは＋１と格付けされる。細胞形
態の保持および／または細胞抗原性の保持に関して＋３
または＋４という格付けの固着剤を次の段階で使用し
た。未処理の細胞を含有する新しいスライドガラスをこ
れらの固着剤で固着し、ホルムアミド50％,4×SSC,リン
酸ソーダ（pH7.4）0.1モル,0.1％トリトンＸ−100、低
分子量DNA（Sigma Chemical Co.社から入手した鰊の精
液DNAから得たもの）100μg/mlを含有するハイブリッド
形成溶液中で培養した。この形成溶液には、生体高分子
プローブは全く含有されていなかった。この細胞を、50
−55℃の温度で、5,10,15,20,30,45,60,90,120分間ハイ
ブリッド形成溶液中で培養した。このハイブリッド形成
段階終了後に細胞試料を細胞表面積1cm2当り１−200ml
の0.1％トリトンＸ−100,2×SCC,1×SCC,0.5×SCC,0.1
×SCCを含有する各形成溶液で静かに洗浄した。この後
細胞試料を前記のようにして、細胞形態の保持および／
または細胞抗原性の保持について評価を行った。この後
さらに、細胞試料50μg/mlのヨウ化プロピジウム液で染
色して評価を行った。このヨウ化プロピジウム液で細胞
内の二重鎖および一本鎖核酸を染色すると、核酸は紫外
線で励起されて別の特徴のある放射スペクトルをもつよ
うになる。またスライドガラス上の未処理の細胞試料も
染色する。放出された蛍光の全量を、光増幅管アタッチ
メントの付いたNikon蛍光顕微鏡を使って、未処理の細
胞試料について測定した。細胞質二重鎖RNA含有量から
放出される全蛍光量に関して、300−1000個の細胞につ
いて記録した。つぎに、この測定結果を、細胞質による
全蛍光のベースラインレベルとした；すなわち細胞質中
の全RNAを表し、かつこのRNAがすべて二重鎖状態にある
ものとした。種々の固着剤とハイブリッド形成方法およ
び時間を介して作成したスライドガラスについて同様の
解析を行った。どの場合にも、細胞の細胞質中に同じ量
の蛍光を保持させるような固着剤、ハイブリッド形成条
件および時間を選択する必要がある。ハイブリッド形成
処理中、細胞の細胞質のRNAから放出される蛍光はヨウ
化プロピジウムの染色によって変化を受ける。すなわ
ち、RNAの二重鎖に関連して発光の度合いが低下する。
同時に、細胞質中の一本鎖RNAの量を反映する波長の発
光が増え始める。RNAによる細胞質の全蛍光量が同一に
とどまり、細胞質中の二重鎖RNAの量による蛍光量が約7
0％まで低下し、一方細胞質内の一本鎖RNAに相当する蛍
光量が同量となるところまで増えると、細胞質内の１−
５分子のRNAを検知可能とする条件が得られるようにな
っている。細胞質中のRNAの二重鎖から一本鎖へのこの
ような移行を達成するのに必要なハイブリッド形成反応
時間は、実際のハイブリッド形成反応でRNAの１細胞当
り１−５分子を検知するのに必要な時間を反映してい
る。
を補足したHankのバランス塩溶液で育成させた。細胞は
回収し、細胞遠心分離機で顕微鏡用スライドガラス上に
沈着させた。この細胞をスライドガラス上で空気乾燥
し、使用時まで室温で貯蔵した。またこの細胞を、この
種の実験ではいくつかの固着剤の一つで固着させた。代
表的な固着剤としてはエタノール70％、エタノール95％
／氷酢酸５％、エタノール75％、氷酢酸20％、エタノー
ル100％、アセトン100％、アセトン50％、メタノール50
％、パラホルムアルデヒド４％、パラホルムアルデヒド
２％、ホルムアルデヒド10％／メタノール90％の溶液が
含まれる。これらの固着剤中で適当な時間、適当な温度
で細胞を固着した後、スライドから固着剤を除去し、標
準実験室法によってWright Giemsaまたはヘマトキシリ
ンおよびエオシンで染色した。細胞形態は、固着した後
の形態の保存度を固着する前の形態と比較することによ
って評価する。視覚形態を有効に保持できない固着剤に
は、任意に＋１と格付けした。細胞形態を有効に保持し
た固着剤は＋１〜＋４の間に任意に格付けされ、細胞形
態の最も有効に形態保持できたものには＋４と格付けし
た。これらの固着剤による細胞有効保存に関する次の評
価は、細胞抗原を検知したい時に実施できる。この場合
細胞は固着剤から取り出して特定のターゲット細胞抗原
に特異的な抗体と共に培養される。再び、細胞組成物の
抗原性を有効に保持する固着剤を任意に＋４と格付けし
たが、細胞保持を有効に実施できない固着剤はずっと低
く評価され、最悪のものは＋１と格付けされる。細胞形
態の保持および／または細胞抗原性の保持に関して＋３
または＋４という格付けの固着剤を次の段階で使用し
た。未処理の細胞を含有する新しいスライドガラスをこ
れらの固着剤で固着し、ホルムアミド50％,4×SSC,リン
酸ソーダ（pH7.4）0.1モル,0.1％トリトンＸ−100、低
分子量DNA（Sigma Chemical Co.社から入手した鰊の精
液DNAから得たもの）100μg/mlを含有するハイブリッド
形成溶液中で培養した。この形成溶液には、生体高分子
プローブは全く含有されていなかった。この細胞を、50
−55℃の温度で、5,10,15,20,30,45,60,90,120分間ハイ
ブリッド形成溶液中で培養した。このハイブリッド形成
段階終了後に細胞試料を細胞表面積1cm2当り１−200ml
の0.1％トリトンＸ−100,2×SCC,1×SCC,0.5×SCC,0.1
×SCCを含有する各形成溶液で静かに洗浄した。この後
細胞試料を前記のようにして、細胞形態の保持および／
または細胞抗原性の保持について評価を行った。この後
さらに、細胞試料50μg/mlのヨウ化プロピジウム液で染
色して評価を行った。このヨウ化プロピジウム液で細胞
内の二重鎖および一本鎖核酸を染色すると、核酸は紫外
線で励起されて別の特徴のある放射スペクトルをもつよ
うになる。またスライドガラス上の未処理の細胞試料も
染色する。放出された蛍光の全量を、光増幅管アタッチ
メントの付いたNikon蛍光顕微鏡を使って、未処理の細
胞試料について測定した。細胞質二重鎖RNA含有量から
放出される全蛍光量に関して、300−1000個の細胞につ
いて記録した。つぎに、この測定結果を、細胞質による
全蛍光のベースラインレベルとした；すなわち細胞質中
の全RNAを表し、かつこのRNAがすべて二重鎖状態にある
ものとした。種々の固着剤とハイブリッド形成方法およ
び時間を介して作成したスライドガラスについて同様の
解析を行った。どの場合にも、細胞の細胞質中に同じ量
の蛍光を保持させるような固着剤、ハイブリッド形成条
件および時間を選択する必要がある。ハイブリッド形成
処理中、細胞の細胞質のRNAから放出される蛍光はヨウ
化プロピジウムの染色によって変化を受ける。すなわ
ち、RNAの二重鎖に関連して発光の度合いが低下する。
同時に、細胞質中の一本鎖RNAの量を反映する波長の発
光が増え始める。RNAによる細胞質の全蛍光量が同一に
とどまり、細胞質中の二重鎖RNAの量による蛍光量が約7
0％まで低下し、一方細胞質内の一本鎖RNAに相当する蛍
光量が同量となるところまで増えると、細胞質内の１−
５分子のRNAを検知可能とする条件が得られるようにな
っている。細胞質中のRNAの二重鎖から一本鎖へのこの
ような移行を達成するのに必要なハイブリッド形成反応
時間は、実際のハイブリッド形成反応でRNAの１細胞当
り１−５分子を検知するのに必要な時間を反映してい
る。
とくに第３図において、二重鎖RNA含有量の相対値が
横軸に図示されている。細胞質中のRNAの二重鎖が多く
なると、曲線はますます右に移行する。細胞質中のRNA
の二重鎖から一本鎖への量の移行が大きくなるにつれ
て、曲線の右から左への移行がますます大きくなる。こ
の縦軸はカウントされた細胞の数を表している。換言す
ると、もし300−1000個の細胞をカウントしたら、その
大部分は二重鎖の特定部分内にある。いくつかの細胞は
二重鎖が多いが中には二重鎖の少ないものもあるので、
この分析はベル型の曲線を示す。図の右半分は種々の処
理を受けたことを示している。未処理の細胞をヨウ化プ
ロピジウムで染色した結果は示されていない。しかし、
HL60細胞を種々の固着剤で処理した後細胞RNAの二重鎖
の量が全く同一のままであった。たとえプロテアーゼ処
理を含有するプレハイブリッド形成処理を行ったとして
も、RNAの二重鎖の量には全く変化はなかったものと思
われる。第３図のプロテアーゼ処理に相当する曲線は、
固定化処理の曲線と同じ位置にある。この曲線は右にも
左にも移行していなかった。しかし、ハイブリッド形成
溶液中で15分間処理した後には、RNA二重鎖の量を示す
曲線は左へ少なくとも70％移行していた。このことは細
胞の細胞質中物質量の少なくとも70％が一本鎖に変化し
たことに相当している。この図を第２図と比較すると、
ハイブリッド形成混合液中で15分後に細胞の細胞質のRN
Aの70％が一本鎖であるだけでなく、第２図にみられる
ようにハイブリッド形成反応の70％が終了していること
がわかる。
横軸に図示されている。細胞質中のRNAの二重鎖が多く
なると、曲線はますます右に移行する。細胞質中のRNA
の二重鎖から一本鎖への量の移行が大きくなるにつれ
て、曲線の右から左への移行がますます大きくなる。こ
の縦軸はカウントされた細胞の数を表している。換言す
ると、もし300−1000個の細胞をカウントしたら、その
大部分は二重鎖の特定部分内にある。いくつかの細胞は
二重鎖が多いが中には二重鎖の少ないものもあるので、
この分析はベル型の曲線を示す。図の右半分は種々の処
理を受けたことを示している。未処理の細胞をヨウ化プ
ロピジウムで染色した結果は示されていない。しかし、
HL60細胞を種々の固着剤で処理した後細胞RNAの二重鎖
の量が全く同一のままであった。たとえプロテアーゼ処
理を含有するプレハイブリッド形成処理を行ったとして
も、RNAの二重鎖の量には全く変化はなかったものと思
われる。第３図のプロテアーゼ処理に相当する曲線は、
固定化処理の曲線と同じ位置にある。この曲線は右にも
左にも移行していなかった。しかし、ハイブリッド形成
溶液中で15分間処理した後には、RNA二重鎖の量を示す
曲線は左へ少なくとも70％移行していた。このことは細
胞の細胞質中物質量の少なくとも70％が一本鎖に変化し
たことに相当している。この図を第２図と比較すると、
ハイブリッド形成混合液中で15分後に細胞の細胞質のRN
Aの70％が一本鎖であるだけでなく、第２図にみられる
ようにハイブリッド形成反応の70％が終了していること
がわかる。
実施例５ Ｃ−myc発ガン遺伝子の検知 Balb/c3T3細胞（ATCC ＃CCL 163）を、８−チャンバ
ー・スライド［Tissue−Tek:Miles Lab社製］上に媒体
中の密集拘束して育成させた。この媒体［10％の胎児仔
牛血清（FCS）を加えたHankの均衡塩形成溶液（BSS）］
を血清を含まない媒体と交換し、細胞血清を一夜飢餓さ
せた。この後多種試料を、Hank BSS中15％FCSの存在下
または不存在下のいずれかで37℃、５分間培養させた。
ー・スライド［Tissue−Tek:Miles Lab社製］上に媒体
中の密集拘束して育成させた。この媒体［10％の胎児仔
牛血清（FCS）を加えたHankの均衡塩形成溶液（BSS）］
を血清を含まない媒体と交換し、細胞血清を一夜飢餓さ
せた。この後多種試料を、Hank BSS中15％FCSの存在下
または不存在下のいずれかで37℃、５分間培養させた。
細胞を、アセトン50％、メタノール50％の混合液で室
温下で20分間固着させた。
温下で20分間固着させた。
プレハイブリッド形成段階は実施しなかった。ホルム
アミド50％,4×SSC、リン酸ソーダ（pH7.4）0.1モル、
0.1％トリトンＸ−100、低分子量DNA（Sigma Chemical
Co.社から入手した鰊の精液DNAから得たもの）100μg/m
lおよびフォトビオチン（登録商標）ラベル化したＣ−m
ycアンチセンスRNAプローブ2.5μg/mlを含有するハイブ
リッド形成溶液20μを各試料に添加した。このＣ−my
cアンチセンスRNAプローブは実施例１に記載した方法に
基づいて調製した。55℃で２時間培養させた後、ハイブ
リッド形成生成を検知した。
アミド50％,4×SSC、リン酸ソーダ（pH7.4）0.1モル、
0.1％トリトンＸ−100、低分子量DNA（Sigma Chemical
Co.社から入手した鰊の精液DNAから得たもの）100μg/m
lおよびフォトビオチン（登録商標）ラベル化したＣ−m
ycアンチセンスRNAプローブ2.5μg/mlを含有するハイブ
リッド形成溶液20μを各試料に添加した。このＣ−my
cアンチセンスRNAプローブは実施例１に記載した方法に
基づいて調製した。55℃で２時間培養させた後、ハイブ
リッド形成生成を検知した。
ハイブリッド形成を検知するため、ストレプトアビデ
ィン蛍光錯体［Guesdon,J.L.ら（1929）J.Histochem.Cy
tochem.,27,1131］はメーカーの薦める（Bethesda Res.
Lab.;カタログ＃9538SA;推薦濃度＝7.5μg/ml）２倍の
濃度を試料に添加した。室温で30分間培養した後、トリ
トンＸ−100 0.1％と２×SSC,1×SSC,0.5×SSCおよび0.
1×SSCを含む各形成溶液で順次試料を、（細胞表面積1c
m2当り１−200mlで）静かに洗浄した。100％グリセロー
ル/2×PBSの50/50（容積比）溶液を１滴ずつ各試料に添
加した。各試料を、Nikon写真顕微鏡を用いて蛍光透過
用標準組み合わせフィルターを使って倍率400倍、高速
度フィルム（Kodak EES135,PS800/1600）ASA160で写真
撮影を行った。
ィン蛍光錯体［Guesdon,J.L.ら（1929）J.Histochem.Cy
tochem.,27,1131］はメーカーの薦める（Bethesda Res.
Lab.;カタログ＃9538SA;推薦濃度＝7.5μg/ml）２倍の
濃度を試料に添加した。室温で30分間培養した後、トリ
トンＸ−100 0.1％と２×SSC,1×SSC,0.5×SSCおよび0.
1×SSCを含む各形成溶液で順次試料を、（細胞表面積1c
m2当り１−200mlで）静かに洗浄した。100％グリセロー
ル/2×PBSの50/50（容積比）溶液を１滴ずつ各試料に添
加した。各試料を、Nikon写真顕微鏡を用いて蛍光透過
用標準組み合わせフィルターを使って倍率400倍、高速
度フィルム（Kodak EES135,PS800/1600）ASA160で写真
撮影を行った。
この写真は通常の方法（mRNAドットブロット、Northe
rnブロットおよびハイブリッド形成溶液）で表示し、Ｃ
−myc発ガン遺伝子は血清飢餓細胞中には認められず、
血清励起細胞中には１細胞当り１−10コピーが誘導され
ていることが認められた（Armelin,ら［（1984）Natur
e:310,656］）。本発明に基づくイン シチュ ハイブ
リッド形成法によってＣ−myc mRNAを表示するため検討
を行った細胞を第4A図と第4B図に示した。血清飢餓Balb
/c3T3細胞中にはＣ−myc mRNAは検知できなかった（第4
A図）が、本発明に基づく方法により血清励起された細
胞中には１−10コピーのＣ−myc mRNAが検知された（第
4B図）。
rnブロットおよびハイブリッド形成溶液）で表示し、Ｃ
−myc発ガン遺伝子は血清飢餓細胞中には認められず、
血清励起細胞中には１細胞当り１−10コピーが誘導され
ていることが認められた（Armelin,ら［（1984）Natur
e:310,656］）。本発明に基づくイン シチュ ハイブ
リッド形成法によってＣ−myc mRNAを表示するため検討
を行った細胞を第4A図と第4B図に示した。血清飢餓Balb
/c3T3細胞中にはＣ−myc mRNAは検知できなかった（第4
A図）が、本発明に基づく方法により血清励起された細
胞中には１−10コピーのＣ−myc mRNAが検知された（第
4B図）。
実施例６ 末梢血液細胞および骨髄細胞中の発ガン遺伝子の検知 ヒトの末梢血液10mlまたはヒトの骨髄細胞2mlを1.2％
のシュウ酸アンモニウム形成溶液（215mOs）中、37℃で
培養し、赤血球を分離した。白血球は臨床遠心分離機で
3000rpmで10分間遠心分離した。次に細胞ペレットを10m
lのPSBで洗浄し、PSB中に再懸濁させた。この細胞を細
胞遠心分離機で、前洗浄したスライドガラス上に載置さ
せ、５分間空気乾燥した。この後細胞をエタノール75％
／酢酸20％混合液で、室温下20分間処理して固着させ
た。
のシュウ酸アンモニウム形成溶液（215mOs）中、37℃で
培養し、赤血球を分離した。白血球は臨床遠心分離機で
3000rpmで10分間遠心分離した。次に細胞ペレットを10m
lのPSBで洗浄し、PSB中に再懸濁させた。この細胞を細
胞遠心分離機で、前洗浄したスライドガラス上に載置さ
せ、５分間空気乾燥した。この後細胞をエタノール75％
／酢酸20％混合液で、室温下20分間処理して固着させ
た。
プレハイブリッド形成段階は実施しなかった。ホルム
アミド50％,4×SSC、リン酸ソーダ（pH7.4）0.1モル、
トリトンＸ−100,0.1％低分子量DNA（Sigma Chemical C
o.社から入手した鰊の精液DNAから得たもの）100μg/m
l、フォトビオチン（登録商標）でラベル化したＣ−my
c,C−sisまたはＣ−ablアンチセンスRNAプローブ2.5μg
/mlを含有するハイブリッド形成溶液20μを各試料に
添加した。このＣ−mycアンチセンスRNAプローブは実施
例１に記載した方法で調製した。55℃で２時間培養した
後、ハイブリッド形成を検知した。
アミド50％,4×SSC、リン酸ソーダ（pH7.4）0.1モル、
トリトンＸ−100,0.1％低分子量DNA（Sigma Chemical C
o.社から入手した鰊の精液DNAから得たもの）100μg/m
l、フォトビオチン（登録商標）でラベル化したＣ−my
c,C−sisまたはＣ−ablアンチセンスRNAプローブ2.5μg
/mlを含有するハイブリッド形成溶液20μを各試料に
添加した。このＣ−mycアンチセンスRNAプローブは実施
例１に記載した方法で調製した。55℃で２時間培養した
後、ハイブリッド形成を検知した。
ハイブリツド形成を検知するため、ストレプトアビデ
ィン蛍光体錯体をメーカーの推薦する濃度の２倍で試料
に添加した。室温で30分間培養した後、トリトンＸ−10
0 0.1％と２×SSC,1×SSC,0.5×SSCおよび0.1×SSCを含
むそれぞれの形成溶液で順次試料を（細胞表面積1cm2当
り１−200mlで）静かに洗浄した。100％グリセロール/2
×PBSの50/50（溶液比）溶液を１滴ずつ各試料に添加し
た。各試料について蛍光を透過する標準フィルターの組
み合わせを用いて、Nikon写真顕微鏡で倍率400倍、高速
度フィルム（Kodak EES135,PS800/1600）ASA1600で20秒
露光による写真撮影を行った。
ィン蛍光体錯体をメーカーの推薦する濃度の２倍で試料
に添加した。室温で30分間培養した後、トリトンＸ−10
0 0.1％と２×SSC,1×SSC,0.5×SSCおよび0.1×SSCを含
むそれぞれの形成溶液で順次試料を（細胞表面積1cm2当
り１−200mlで）静かに洗浄した。100％グリセロール/2
×PBSの50/50（溶液比）溶液を１滴ずつ各試料に添加し
た。各試料について蛍光を透過する標準フィルターの組
み合わせを用いて、Nikon写真顕微鏡で倍率400倍、高速
度フィルム（Kodak EES135,PS800/1600）ASA1600で20秒
露光による写真撮影を行った。
第５図には、正常な骨髄（BM）、正常な末梢血液（P
B）、または慢性骨髄白血病（CML）の患者末症血液中の
３種の異なる発ガン遺伝子の発現に関するイン シチュ
ハイブリッド形成の研究結果を図示したのである。血
液は患者が病気の慢性段階にあるかまたは病気の芽段階
にあるかいずれかの時、これらの患者から採取した。第
５図には、左側にCsis,C−mycおよびＣ−ablと分析され
た３種の異なる発ガン遺伝子が示されている。BMまたは
PBとしてプリントの下方に示した数字は、左側に示した
発ガン遺伝子試料中の細胞％を示すものである（BM,PB,
慢性または芽と記されている）。プリントの各行下部に
は、形成ハイブリッド後に得られた相対蛍光照度が図示
されている。この相対蛍光照度は各細胞内にあるRNA量
を表しており、細胞塩１個当りという単位で記録されて
いる。慢性段階のCMLは、末梢血液中の細胞の５％以下
が芽として生きていることを明示している。事実、我々
は末梢血液中の細胞の５−10％が検討中の３種の遺伝子
を過大に表示していることを知った。これらの遺伝子の
発現はまたこのプリント中および図中のプリントの下部
の両方にみられるように正常のBMまたはPBのいずれかと
比較しても相当高く表されている。芽として末梢血液中
で生きている細胞の35％以上を占めると定義されている
病気の芽段階では、我々細胞の70％以上がＣ−sis,C−m
ycおよびＣ−ablという３種の発ガン遺伝子を典型的に
表示していることを認めた。これらの遺伝子の発現は、
正常な骨髄または正常な末梢血液と比較すると、高くは
なっているが、プリントおよび図中の両方で見られるよ
うにこの病気の慢性段階の単一細胞塩基で示されたと
き、これらの遺伝子の発現よりもかなり低かった。
B）、または慢性骨髄白血病（CML）の患者末症血液中の
３種の異なる発ガン遺伝子の発現に関するイン シチュ
ハイブリッド形成の研究結果を図示したのである。血
液は患者が病気の慢性段階にあるかまたは病気の芽段階
にあるかいずれかの時、これらの患者から採取した。第
５図には、左側にCsis,C−mycおよびＣ−ablと分析され
た３種の異なる発ガン遺伝子が示されている。BMまたは
PBとしてプリントの下方に示した数字は、左側に示した
発ガン遺伝子試料中の細胞％を示すものである（BM,PB,
慢性または芽と記されている）。プリントの各行下部に
は、形成ハイブリッド後に得られた相対蛍光照度が図示
されている。この相対蛍光照度は各細胞内にあるRNA量
を表しており、細胞塩１個当りという単位で記録されて
いる。慢性段階のCMLは、末梢血液中の細胞の５％以下
が芽として生きていることを明示している。事実、我々
は末梢血液中の細胞の５−10％が検討中の３種の遺伝子
を過大に表示していることを知った。これらの遺伝子の
発現はまたこのプリント中および図中のプリントの下部
の両方にみられるように正常のBMまたはPBのいずれかと
比較しても相当高く表されている。芽として末梢血液中
で生きている細胞の35％以上を占めると定義されている
病気の芽段階では、我々細胞の70％以上がＣ−sis,C−m
ycおよびＣ−ablという３種の発ガン遺伝子を典型的に
表示していることを認めた。これらの遺伝子の発現は、
正常な骨髄または正常な末梢血液と比較すると、高くは
なっているが、プリントおよび図中の両方で見られるよ
うにこの病気の慢性段階の単一細胞塩基で示されたと
き、これらの遺伝子の発現よりもかなり低かった。
実施例７ 固体組織中の発ガン遺伝子の検知 外科で切除された生検試料から得られたヒト胸部組織
の厚さ４μｍの冷凍部分を予め洗浄してあるスライドグ
ラス上に乗せ、メタノール50％の混合液で室温で20分間
処理して固着させた。この組織を、ホルムアミド50％,5
×SSC,リン酸ソーダ（pH7.4）0.1モル、バナジル・リボ
ヌクレオシド錯体（New England Biolabs社）20ミリモ
ル、低分子量の変性鰊の精液DNA100μmg/ml、およびト
リメンＸ−100 0.1％を含有するハイブリッド形成混合
液を使って、55℃で培養し、４時間ハイブリッド形成を
行った。フォトビオチンで処理したRNAプローブ（実施
例１に記載した方法で調製）を2.5μg/mlの濃度でハイ
ブリッド形成混合液に添加した。またブランクパネルに
はこのプローブは添加しなかった（第６図参照）。スラ
イドガラス上に直接アビディン／ストレプトアビディン
（A/SA）溶液でラベル化した蛍光剤を添加してハイブリ
ツド形成を検知し、室温で30分間培養を行った。このス
ライドガラスを洗浄し、カバーグラスを乗せて実施例６
に記載した方法で写真撮影した。
の厚さ４μｍの冷凍部分を予め洗浄してあるスライドグ
ラス上に乗せ、メタノール50％の混合液で室温で20分間
処理して固着させた。この組織を、ホルムアミド50％,5
×SSC,リン酸ソーダ（pH7.4）0.1モル、バナジル・リボ
ヌクレオシド錯体（New England Biolabs社）20ミリモ
ル、低分子量の変性鰊の精液DNA100μmg/ml、およびト
リメンＸ−100 0.1％を含有するハイブリッド形成混合
液を使って、55℃で培養し、４時間ハイブリッド形成を
行った。フォトビオチンで処理したRNAプローブ（実施
例１に記載した方法で調製）を2.5μg/mlの濃度でハイ
ブリッド形成混合液に添加した。またブランクパネルに
はこのプローブは添加しなかった（第６図参照）。スラ
イドガラス上に直接アビディン／ストレプトアビディン
（A/SA）溶液でラベル化した蛍光剤を添加してハイブリ
ツド形成を検知し、室温で30分間培養を行った。このス
ライドガラスを洗浄し、カバーグラスを乗せて実施例６
に記載した方法で写真撮影した。
第６図は、イン シチュ ハイブリッド形成法による
mRNAの結果および繊維膿嚢症の上皮成分（第６図、パネ
ル「SIS」参照）および乳酸化腺腫（第６図、パネル「S
IS」参照）中のSIS/PDGF−Ｂ発現の局部化、を図示した
ものである。フォトビオチン化したDNAプローブによる
イン シチュ ハイブリッド形成法はストローマ中はも
ちろん繊維細胞の上皮細胞中のアクチン遺伝子（第６
図、パネル「ACTIN」参照）の発現を顕示している。こ
の図で、下方のパネルは組織の位相差顕微鏡特性が対照
的であることを示している。
mRNAの結果および繊維膿嚢症の上皮成分（第６図、パネ
ル「SIS」参照）および乳酸化腺腫（第６図、パネル「S
IS」参照）中のSIS/PDGF−Ｂ発現の局部化、を図示した
ものである。フォトビオチン化したDNAプローブによる
イン シチュ ハイブリッド形成法はストローマ中はも
ちろん繊維細胞の上皮細胞中のアクチン遺伝子（第６
図、パネル「ACTIN」参照）の発現を顕示している。こ
の図で、下方のパネルは組織の位相差顕微鏡特性が対照
的であることを示している。
実施例８ ヒト末梢血液中のHIVの検知 ヒトの末梢血液10mlまたはヒトの骨髄細胞2mlを1.2％
のシュウ酸アンモニウム溶液中37℃で培養し、赤血球を
分離した。白血球は臨床遠心分離機を用いて3000rpmで1
0分間遠心分離した。次に細胞ペレットを10mlのPBSで洗
浄し、PBS中に再懸濁させた。この細胞を細胞遠心分離
機で前洗浄したスライドガラス上に沈着させ、５分間空
気中で乾燥させた。この後細胞をエタノール75％／酢酸
20％混合液で室温下で20分間固着させた。
のシュウ酸アンモニウム溶液中37℃で培養し、赤血球を
分離した。白血球は臨床遠心分離機を用いて3000rpmで1
0分間遠心分離した。次に細胞ペレットを10mlのPBSで洗
浄し、PBS中に再懸濁させた。この細胞を細胞遠心分離
機で前洗浄したスライドガラス上に沈着させ、５分間空
気中で乾燥させた。この後細胞をエタノール75％／酢酸
20％混合液で室温下で20分間固着させた。
プレハイブリッド形成段階は実施しなかった。ホルム
アミド50％,4×SSC,リン酸ソーダ（pH7.4）0.1モル，ト
リトンＸ−100 0.1％、低分子量DNA（Sigma Chemical C
o.社から入手した鰊の精液DNAから得たもの）100μg/m
l、フォトビオチンでラベル化したHIVアンチセンスRNA
プローブ2.5μg/mlを含有するハイブリッド形成溶液20
μを各試料に添加した。このアンチセンスRNAプロー
ブは実施例１に記載した方法で調製した。55℃で２時間
培養した後、ハイブリッド形成を検知した。
アミド50％,4×SSC,リン酸ソーダ（pH7.4）0.1モル，ト
リトンＸ−100 0.1％、低分子量DNA（Sigma Chemical C
o.社から入手した鰊の精液DNAから得たもの）100μg/m
l、フォトビオチンでラベル化したHIVアンチセンスRNA
プローブ2.5μg/mlを含有するハイブリッド形成溶液20
μを各試料に添加した。このアンチセンスRNAプロー
ブは実施例１に記載した方法で調製した。55℃で２時間
培養した後、ハイブリッド形成を検知した。
ハイブリツド形成を検知するため、ストレプトアビデ
ィン蛍光体錯体を、メーカーの推薦する濃度の２倍で各
試料に添加した。室温で30分間培養した後、試料をトリ
トンＸ−100 0.1％と２×SSC,1×SSC,0.5×SSCおよび0.
1×SSCを含むそれぞれの溶液で試料を（細胞表面積1cm2
当り１−200mlで）静かに洗浄した。100％グリセロール
/2×PBSの50/50（容積比）溶液を１滴ずつ各試料に添加
した。各試料について蛍光透過性の標準フィルターの組
み合わせを用いて、Nikon写真顕微鏡で高速度フィルム
（Kodak EES135,PS800/1600）ASA1600で20秒間露光によ
る写真撮影を行った。
ィン蛍光体錯体を、メーカーの推薦する濃度の２倍で各
試料に添加した。室温で30分間培養した後、試料をトリ
トンＸ−100 0.1％と２×SSC,1×SSC,0.5×SSCおよび0.
1×SSCを含むそれぞれの溶液で試料を（細胞表面積1cm2
当り１−200mlで）静かに洗浄した。100％グリセロール
/2×PBSの50/50（容積比）溶液を１滴ずつ各試料に添加
した。各試料について蛍光透過性の標準フィルターの組
み合わせを用いて、Nikon写真顕微鏡で高速度フィルム
（Kodak EES135,PS800/1600）ASA1600で20秒間露光によ
る写真撮影を行った。
第７図−10図には、エイズ患者または新しい患者の試
料から誘導した細胞コントロールラインに対するHIV同
定により得られた結果が図示されている。第７図で、左
側に（＋）で示したHIVに感染したかあるいは左側に
（−）で示したHTLV Iに感染したかどちらかの細胞コン
トロールラインのものを、下記のような４種の異なるHI
V領域の遺伝子;GAG,ENV,TAT,またはLTRとハイブリッド
化させた。もし他の方法で説明されていなかったなら、
アンチセンスRNAプローブがこのハイブリッド形成法で
使用されていたはずである。最初の４枚のパネルは、こ
れらの遺伝子を感染させたプローブ中のHIVと容易に同
定できることを示していた。GAG,ENV,TAT,センスプロー
ブであるコントロールプローブではHIV配列を検知でき
なかった。これらは間違いなく陰性（ネガティブ）であ
る。HIVを検知するための最初のパネルに使用したアン
チセンスRNAプローブは特定のものであった。これらの
プローブは下の２枚のパネルに示したように、例えばHT
LV Iのような他のウィルス配列とは交差反応しなかっ
た。第８図にはGAGおよびENVプローブをカポジ肉腫（K
S）の患者のHIV検知に使用すると、このウィルスは新し
い末梢血液で容易に同定できることが示されている。こ
の血液について実施したコントロール、これらと同じ遺
伝子用のセンスストランドコントロールおよびブランク
（プローブなし）は、予想した通り陰性であった。これ
らと同じプローブについては、第８図に示したように、
エイズ関連錯体（ARC）の患者のウィルスについても同
定を行った。これらのコントロール、センスストランド
RNA、ブランクも陰性であった。第９図には、これらと
同じアンチセンスRNAプローブについてエイズ患者のHIV
の同定を行った。これらのコントロール、センスストラ
ンドRNA、ブランクも陰性であった。第10図には、これ
らのプローブでは無症候性で血清陽性（Ab＋）の個体中
のHIVの存在が同定できた。その結果、コントロールは
陰性であった。これらのプローブは未感染の正常個体中
のHIVとは交差反応せず、HIVを検知できなかった（第10
図）。
料から誘導した細胞コントロールラインに対するHIV同
定により得られた結果が図示されている。第７図で、左
側に（＋）で示したHIVに感染したかあるいは左側に
（−）で示したHTLV Iに感染したかどちらかの細胞コン
トロールラインのものを、下記のような４種の異なるHI
V領域の遺伝子;GAG,ENV,TAT,またはLTRとハイブリッド
化させた。もし他の方法で説明されていなかったなら、
アンチセンスRNAプローブがこのハイブリッド形成法で
使用されていたはずである。最初の４枚のパネルは、こ
れらの遺伝子を感染させたプローブ中のHIVと容易に同
定できることを示していた。GAG,ENV,TAT,センスプロー
ブであるコントロールプローブではHIV配列を検知でき
なかった。これらは間違いなく陰性（ネガティブ）であ
る。HIVを検知するための最初のパネルに使用したアン
チセンスRNAプローブは特定のものであった。これらの
プローブは下の２枚のパネルに示したように、例えばHT
LV Iのような他のウィルス配列とは交差反応しなかっ
た。第８図にはGAGおよびENVプローブをカポジ肉腫（K
S）の患者のHIV検知に使用すると、このウィルスは新し
い末梢血液で容易に同定できることが示されている。こ
の血液について実施したコントロール、これらと同じ遺
伝子用のセンスストランドコントロールおよびブランク
（プローブなし）は、予想した通り陰性であった。これ
らと同じプローブについては、第８図に示したように、
エイズ関連錯体（ARC）の患者のウィルスについても同
定を行った。これらのコントロール、センスストランド
RNA、ブランクも陰性であった。第９図には、これらと
同じアンチセンスRNAプローブについてエイズ患者のHIV
の同定を行った。これらのコントロール、センスストラ
ンドRNA、ブランクも陰性であった。第10図には、これ
らのプローブでは無症候性で血清陽性（Ab＋）の個体中
のHIVの存在が同定できた。その結果、コントロールは
陰性であった。これらのプローブは未感染の正常個体中
のHIVとは交差反応せず、HIVを検知できなかった（第10
図）。
実施例９ ヒト末梢血液中の３種のmRNAsの同時検知 初期か連期の慢性骨髄白血病患者の新しい末梢血液を
静脈穿刺して採取した。赤血球をシュウ酸アンモニウム
で溶かした。白血球は実施例６に記載した方法で調製
し、スライドガラス上に沈着させた。これを固着した
後、この試料に先の実施例６に記載した方法に下記のよ
うな修正を加えていくつかのハイブリッド形成段階を介
して処理を行った:C−sis遺伝子用プローブを実施例５
に記載したイン シチュ ハイブリッド形成溶液を用い
て１時間スライドガラス上で培養させた。ハイブリッド
形成を検知するためストレプトアビディン／ローダミン
を使用した。この検知の後の洗浄段階では、すべての溶
液はRNアーゼを含まず、Ｄ−ビオチン0.01モルを含んで
いた。ハイブリッド形成はＣ−myc遺伝子用の第２のプ
ローブについて繰り返して行い、１時間後形成されたハ
イブリッドをストレプトアビディン−FITCを用いて検知
した。洗浄は前記と同様に繰り返して行い、最後のハイ
ブリッド形成処理はＣ−abl遺伝子用のプローブについ
て実施した。このプローブに対して形成されたハイブリ
ッドをアルカリホスファターゼと共役したストレプトア
ビディンを用いて検知を行った。この試料は、実施例５
に記載した方法で各洗浄液のそれぞれにRNアーゼA1−10
μg/mlを含有させて洗浄を行った。アルカリホスファタ
ーゼの基質（ニトロブル テトラゾリウムおよび５−ブ
ロモ、４−クロロ、３−インドールリン酸塩）を添加
し、室温下５分間のニトロブル テトラゾリウムの還元
を実施した。
静脈穿刺して採取した。赤血球をシュウ酸アンモニウム
で溶かした。白血球は実施例６に記載した方法で調製
し、スライドガラス上に沈着させた。これを固着した
後、この試料に先の実施例６に記載した方法に下記のよ
うな修正を加えていくつかのハイブリッド形成段階を介
して処理を行った:C−sis遺伝子用プローブを実施例５
に記載したイン シチュ ハイブリッド形成溶液を用い
て１時間スライドガラス上で培養させた。ハイブリッド
形成を検知するためストレプトアビディン／ローダミン
を使用した。この検知の後の洗浄段階では、すべての溶
液はRNアーゼを含まず、Ｄ−ビオチン0.01モルを含んで
いた。ハイブリッド形成はＣ−myc遺伝子用の第２のプ
ローブについて繰り返して行い、１時間後形成されたハ
イブリッドをストレプトアビディン−FITCを用いて検知
した。洗浄は前記と同様に繰り返して行い、最後のハイ
ブリッド形成処理はＣ−abl遺伝子用のプローブについ
て実施した。このプローブに対して形成されたハイブリ
ッドをアルカリホスファターゼと共役したストレプトア
ビディンを用いて検知を行った。この試料は、実施例５
に記載した方法で各洗浄液のそれぞれにRNアーゼA1−10
μg/mlを含有させて洗浄を行った。アルカリホスファタ
ーゼの基質（ニトロブル テトラゾリウムおよび５−ブ
ロモ、４−クロロ、３−インドールリン酸塩）を添加
し、室温下５分間のニトロブル テトラゾリウムの還元
を実施した。
多種の異なったmRNA種に対する同時検知を実施するた
め、このイン シチュ ハイブリッド形成技術を用い
て、慢性骨盤血友病患者の末梢血液中の同じ細胞内でＣ
−sis,C−mycおよびＣ−abl全ての過大表示の発生を認
めた。第11図には、Ｃ−myc発ガン遺伝子mRNA（左側パ
ネルの「MYC」）を含有する細胞がストレプトアビディ
ン蛍光錯体のプローブとターゲット生体高分子配列間で
形成されたハイブリッドとの反応による縁色発光の存在
から検知できた。また同じ細胞がアビディン／ストレプ
トアビディン、ローダミンと反応済みプローブとの反応
の存在によって生じる赤色発光の検知によりＣ−sis発
ガン遺伝子mRNA（中央のパネルの「SIS」）を含有する
ことも認められた。この細胞内にＣ−abl発ガン遺伝子m
RNA（「ABL」）が存在することは、暗青色の、ニトロブ
ル、テトラゾリウム反応沈着物が存在することによって
右側パネルで示されている。
め、このイン シチュ ハイブリッド形成技術を用い
て、慢性骨盤血友病患者の末梢血液中の同じ細胞内でＣ
−sis,C−mycおよびＣ−abl全ての過大表示の発生を認
めた。第11図には、Ｃ−myc発ガン遺伝子mRNA（左側パ
ネルの「MYC」）を含有する細胞がストレプトアビディ
ン蛍光錯体のプローブとターゲット生体高分子配列間で
形成されたハイブリッドとの反応による縁色発光の存在
から検知できた。また同じ細胞がアビディン／ストレプ
トアビディン、ローダミンと反応済みプローブとの反応
の存在によって生じる赤色発光の検知によりＣ−sis発
ガン遺伝子mRNA（中央のパネルの「SIS」）を含有する
ことも認められた。この細胞内にＣ−abl発ガン遺伝子m
RNA（「ABL」）が存在することは、暗青色の、ニトロブ
ル、テトラゾリウム反応沈着物が存在することによって
右側パネルで示されている。
第12図には、第11図と同じ結果ではあるが、別の一患
者の試料を用いてＣ−abl発ガン遺伝子mRNAの存在の同
定に別の検知法を採用したことが示されている。この場
合、アルカリホスファターゼでラベル化したストレプト
アビディンの代わりに、前記の検知段階ではコロイド状
の金でラベル化したストレプトアビディン（Bethesda R
es.Lab.社カタログ＃9532SA;Horisberger,M.［（1981）
Scaning.Electron Microscopy:11,9］）を使用した。こ
れ以上の処理は不必要で、細胞は前記と同じ方法で洗浄
した。明視野または位相差顕微鏡のいずれかの方法を用
いたとき細胞内に見られる黒色析出物またはグレインの
存在、あるいはエピ偏光か暗視野かいずれかの顕微鏡を
用いたとき、光の明白色部分の具消化が、この細胞がプ
ローブ、この場合にはＣ−abl遺伝子に対して本質的に
相補的なターゲット生体高分子mRNA配列を含有すること
を示していた。
者の試料を用いてＣ−abl発ガン遺伝子mRNAの存在の同
定に別の検知法を採用したことが示されている。この場
合、アルカリホスファターゼでラベル化したストレプト
アビディンの代わりに、前記の検知段階ではコロイド状
の金でラベル化したストレプトアビディン（Bethesda R
es.Lab.社カタログ＃9532SA;Horisberger,M.［（1981）
Scaning.Electron Microscopy:11,9］）を使用した。こ
れ以上の処理は不必要で、細胞は前記と同じ方法で洗浄
した。明視野または位相差顕微鏡のいずれかの方法を用
いたとき細胞内に見られる黒色析出物またはグレインの
存在、あるいはエピ偏光か暗視野かいずれかの顕微鏡を
用いたとき、光の明白色部分の具消化が、この細胞がプ
ローブ、この場合にはＣ−abl遺伝子に対して本質的に
相補的なターゲット生体高分子mRNA配列を含有すること
を示していた。
実施例10 末梢血液細胞中の核酸およびプロティンの検知 ヒトの末梢血液10mlを1.2％のシュウ酸アンモニウム
溶液中37℃で培養して赤血球を溶解させた。この白血球
を臨床遠心分離機を用いて3000rpmで10分間処理して遠
心分離させた。この後細胞ペレットを10mlのPBSで洗浄
し、さらにPBS中に再懸濁させた。この細胞を細胞遠心
分離機で前洗浄したスライドガラス上に沈着させ、５分
間空気中で乾燥させた。この後細胞をエタノール75％／
酢酸20％の混合液で室温下で20分間固着させた。
溶液中37℃で培養して赤血球を溶解させた。この白血球
を臨床遠心分離機を用いて3000rpmで10分間処理して遠
心分離させた。この後細胞ペレットを10mlのPBSで洗浄
し、さらにPBS中に再懸濁させた。この細胞を細胞遠心
分離機で前洗浄したスライドガラス上に沈着させ、５分
間空気中で乾燥させた。この後細胞をエタノール75％／
酢酸20％の混合液で室温下で20分間固着させた。
プレハイブリッド形成段階は実施しなかった。ホルム
アミド50％,4×SSC,リン酸ソーダ（pH7.4）,0.1モル，
トリトンＸ−100 0.1％、低分子量DNA（Sigma Chemical
Co.社から入手した鰊の精液DNAから得たもの）100μg/
ml、フォトビオチンでラベル化したＣ−ablアンチセン
スRNAプローブ2.5μg/mlを含有するハイブリッド形成溶
液20μを各試料に添加した。このアンチセンスRNAプ
ローブは実施例１に記載した方法で調製した。55℃で２
時間培養した後、ハイブリッド生成を検知した。
アミド50％,4×SSC,リン酸ソーダ（pH7.4）,0.1モル，
トリトンＸ−100 0.1％、低分子量DNA（Sigma Chemical
Co.社から入手した鰊の精液DNAから得たもの）100μg/
ml、フォトビオチンでラベル化したＣ−ablアンチセン
スRNAプローブ2.5μg/mlを含有するハイブリッド形成溶
液20μを各試料に添加した。このアンチセンスRNAプ
ローブは実施例１に記載した方法で調製した。55℃で２
時間培養した後、ハイブリッド生成を検知した。
ハイブリッドを検知するため、ストレプトアビディン
ローダミン錯体を、メーカーの推薦する濃度の２倍で各
試料に添加した。この培養中、Ｃ−abl遺伝子酸生物（S
mith Kline ＆ French社のDr.Russel Griegから提供を
受けた）に対して発生したラビットポリクローナル抗体
をK562細胞を陽性にラベル化する濃度で試料に添加した
が、蛍光ラベル化アンチラビットIgGを添加するとH60細
胞中には検知可能な信号が認められなかった。
ローダミン錯体を、メーカーの推薦する濃度の２倍で各
試料に添加した。この培養中、Ｃ−abl遺伝子酸生物（S
mith Kline ＆ French社のDr.Russel Griegから提供を
受けた）に対して発生したラビットポリクローナル抗体
をK562細胞を陽性にラベル化する濃度で試料に添加した
が、蛍光ラベル化アンチラビットIgGを添加するとH60細
胞中には検知可能な信号が認められなかった。
室温で30分間培養した後、試料をトリトンＸ−100 0.
1％と２×SSC,1×SSC,0.5×SSCおよび0.1×SSCを含むそ
れぞれの溶液で順次（細胞表面積1cm2当り１−200ml
で）静かに洗浄した。100％グリセリン/2×PBSの50/50
（容積比）溶液を１滴ずつ各試料に添加した。各試料に
ついて蛍光透過性の標準組み合わせフィルターを用い
て、Nikon写真顕微鏡により、高速度フィルム（Kodak E
ES 135,PS800/1600）ASA1600で20秒間露光による写真投
影を行った。
1％と２×SSC,1×SSC,0.5×SSCおよび0.1×SSCを含むそ
れぞれの溶液で順次（細胞表面積1cm2当り１−200ml
で）静かに洗浄した。100％グリセリン/2×PBSの50/50
（容積比）溶液を１滴ずつ各試料に添加した。各試料に
ついて蛍光透過性の標準組み合わせフィルターを用い
て、Nikon写真顕微鏡により、高速度フィルム（Kodak E
ES 135,PS800/1600）ASA1600で20秒間露光による写真投
影を行った。
Ｃ−abl mRNAとプロティンが慢性骨髄白血病（CML）
の患者中の同じ細胞内に過剰生産されていることは公知
である（Stam,ら［n.Enngl.J.Med.:313,1429］;Konopk
a,J.B 4 Witte,0.N.［（1984）Call:37,3116］）。本発
明を採用すれば、CML患者の末梢血液細胞はＣ−abl遺伝
子に相当するmRNAの存在と同時に、前述したように、Ｃ
−ablプロテイン産生物の存在が立証された。第13A図
は、反応済みの抗体からのフルオロレセインによる蛍光
発光によりプロテインが容易に検知できることを示して
いる。同じ細胞について第13B図は、ローダミンによる
蛍光発光に基づくＣ−abl mRNAの存在が検知できること
を示している。
の患者中の同じ細胞内に過剰生産されていることは公知
である（Stam,ら［n.Enngl.J.Med.:313,1429］;Konopk
a,J.B 4 Witte,0.N.［（1984）Call:37,3116］）。本発
明を採用すれば、CML患者の末梢血液細胞はＣ−abl遺伝
子に相当するmRNAの存在と同時に、前述したように、Ｃ
−ablプロテイン産生物の存在が立証された。第13A図
は、反応済みの抗体からのフルオロレセインによる蛍光
発光によりプロテインが容易に検知できることを示して
いる。同じ細胞について第13B図は、ローダミンによる
蛍光発光に基づくＣ−abl mRNAの存在が検知できること
を示している。
実施例11 ターゲット生体高分子数の定量 K562細胞（ATCC ＃CLL 243）を、10％の胎児仔牛血清
を補足したHankのバランス塩溶液で育成させた。この媒
体中における最終変異終了３日後に細胞を新鮮媒体0.3m
l当り約105個の細胞密度になるように分割した。１時間
後、細胞遠心分離機でスライドガラス上に50,000−100,
000個の細胞を沈着させて60個のレプリカスライドガラ
スを作成した。残りの細胞はかき集めて、グアジニウム
セシウムクロライド法（Chirgwinら［（1979）Bioche
m.,18,5294］）によりこの細胞からRNAおよびDNAを抽出
した。
を補足したHankのバランス塩溶液で育成させた。この媒
体中における最終変異終了３日後に細胞を新鮮媒体0.3m
l当り約105個の細胞密度になるように分割した。１時間
後、細胞遠心分離機でスライドガラス上に50,000−100,
000個の細胞を沈着させて60個のレプリカスライドガラ
スを作成した。残りの細胞はかき集めて、グアジニウム
セシウムクロライド法（Chirgwinら［（1979）Bioche
m.,18,5294］）によりこの細胞からRNAおよびDNAを抽出
した。
細胞ラインは比較的均一な個体数であったので、抽出
したRNAを精製し、分析した各RNA種のコピー数評価用に
使用した。すなわち、この技術に知識をもち精通した当
業者には公知の一連のコントロール実験によって各細胞
内に存在する各遺伝子の分子数の評価を行った。１細胞
当りの分子数を評価するためのこれらのコントロール実
験としては下記のものがある;Northernブロット、RRNド
ットブロット、Quick−ブロット、サイトドット、単独
コピー飽和試験、および溶液濃度−時間ハイブリッド形
成試験（ロート1/2分析）（Hames,B.D.4 Higgins,S.V
［（1986）“Nucleic Acid Hybridization:a practical
approach"IRL Press］参照）。
したRNAを精製し、分析した各RNA種のコピー数評価用に
使用した。すなわち、この技術に知識をもち精通した当
業者には公知の一連のコントロール実験によって各細胞
内に存在する各遺伝子の分子数の評価を行った。１細胞
当りの分子数を評価するためのこれらのコントロール実
験としては下記のものがある;Northernブロット、RRNド
ットブロット、Quick−ブロット、サイトドット、単独
コピー飽和試験、および溶液濃度−時間ハイブリッド形
成試験（ロート1/2分析）（Hames,B.D.4 Higgins,S.V
［（1986）“Nucleic Acid Hybridization:a practical
approach"IRL Press］参照）。
スライドガラス上の細胞は、エタノール75％／氷酢酸
20％／水５％の混合液で室温下で20分間固着させた。
20％／水５％の混合液で室温下で20分間固着させた。
プレハイブリッド形成段階は実施しなかった。ホルム
アミド50％,4×SSC、リン酸ソーダ（pH7.4）0.1モル、
トリトンＸ−100、0.1％低分子量DNA（Sigma Chemical
Co.社から入手した鰊の精液DNAから得たもの）100μg/m
l、フォトビオチンでラベル化したアンチセンスRNAプロ
ーブ2.5μg/mlを含有するハイブリッド形成溶液20μ
を各試料に添加した。使用したプローブはセンスまたは
アンチセンスのいずれかのRNAストランドのもので次の
遺伝子型のものであった：すなわちＣ−abl,C−sis,C−
mycまたはEpstein Barrウイルス（EBV）。このプローブ
は実施例１に記載した方法で調製した。55℃で２時間培
養した後、ハイブリッド生成を検知した。
アミド50％,4×SSC、リン酸ソーダ（pH7.4）0.1モル、
トリトンＸ−100、0.1％低分子量DNA（Sigma Chemical
Co.社から入手した鰊の精液DNAから得たもの）100μg/m
l、フォトビオチンでラベル化したアンチセンスRNAプロ
ーブ2.5μg/mlを含有するハイブリッド形成溶液20μ
を各試料に添加した。使用したプローブはセンスまたは
アンチセンスのいずれかのRNAストランドのもので次の
遺伝子型のものであった：すなわちＣ−abl,C−sis,C−
mycまたはEpstein Barrウイルス（EBV）。このプローブ
は実施例１に記載した方法で調製した。55℃で２時間培
養した後、ハイブリッド生成を検知した。
このハイブリッドを検知するため、ストレプトアビデ
ィンフルオレスシン（SA−FITC）、ファイコエリセリン
（SA−PE）、ローダミンＢ（SA−Ｒ）、テキサスレッド
（SA−TR）、ファイコチアニン（SA−PC）、またはアロ
ファイコチアニン（SA−APC）錯体をメーカーの推薦す
る濃度の２倍で各試料に添加した（SA−FITC,SA−TR:Be
thesda Res.Lab.社;SA−R:Southernn Biollogicals社;S
A−PE,SA−PC,SA−APC:Bio Meada社）。37℃で10分間培
養した後、試料をトリトンＸ−100 0.1％を含む0.1×SS
Cの溶液で（細胞表面積1cm2当り１−200mlで）静かに洗
浄した。100％グリセリン/2×PBSの50/50（容積比）溶
液１滴を各試料に添加し、＃１カバーグラスを細胞上に
のせた後、顕微鏡試験を行った。
ィンフルオレスシン（SA−FITC）、ファイコエリセリン
（SA−PE）、ローダミンＢ（SA−Ｒ）、テキサスレッド
（SA−TR）、ファイコチアニン（SA−PC）、またはアロ
ファイコチアニン（SA−APC）錯体をメーカーの推薦す
る濃度の２倍で各試料に添加した（SA−FITC,SA−TR:Be
thesda Res.Lab.社;SA−R:Southernn Biollogicals社;S
A−PE,SA−PC,SA−APC:Bio Meada社）。37℃で10分間培
養した後、試料をトリトンＸ−100 0.1％を含む0.1×SS
Cの溶液で（細胞表面積1cm2当り１−200mlで）静かに洗
浄した。100％グリセリン/2×PBSの50/50（容積比）溶
液１滴を各試料に添加し、＃１カバーグラスを細胞上に
のせた後、顕微鏡試験を行った。
各細胞から放出される蛍光は、プローブと反応したス
トレプトアビディンの分子数を反映している、すなわち
細胞内の反応済みプローブ量は細胞内にあるターゲット
生体高分子数を立証している。各細胞内の蛍光を測定す
るため、Meridian Instruments（Okemos,MI）社製のACA
S470ワークステーションを用いてスライドグラスの分析
を行った。多く画像処理装置に類似した、このMeridian
社の装置は試料中に存在する粉末を励起して、デジタル
またはアナログのいずれかの信号として放出した光を捕
捉した。Meridian社の装置ではこの信号はデジタルとな
る。この信号の量は種々の色によって表すことができ
る。第14図には、上部右側のパネル中、種々の照度の発
光信号に対してこの装置によって照合された色が図示さ
れている。これらの色で１つの細胞を表す（第14図Ａ−
Ｃ図参照）と、細胞１個当りの放出蛍光の相対量が得ら
れる。第14A図には、Ｃ−sis遺伝子の検知が示されてお
り、反応した蛍光体の発光照度が認められる。また第14
B図にはＣ−sisの検知が示されている。第14C図には、
ハイブリッド形成溶液にプローブが含有されていないと
きのバックグラウンド発光信号が示されている。このパ
ネルは陰性コントロールパネルでブランクである。Meri
dian社製の装置では細胞全体からの全蛍光量（すなわち
細胞１個当りの蛍光量）が測定でき、この上方を図的に
表示できる。他の細胞の生成RNAについて行った、前記
コントロール試験の結果、Ｃ−sisおよびＣ−mycの両細
胞ターゲット遺伝子が、細胞１個当り１−10分子だけこ
れらの細胞中に存在することがわかった。したがってこ
の値は第14D図および第14E図の横軸上の目盛りとして記
されている。本発明はこのような適切な装置と協働する
ことによってＣ−sisまたはＣ−mycのいずれかの遺伝子
の単独分子でも含有するものであれば細胞数を同定する
ことが可能とされている。
トレプトアビディンの分子数を反映している、すなわち
細胞内の反応済みプローブ量は細胞内にあるターゲット
生体高分子数を立証している。各細胞内の蛍光を測定す
るため、Meridian Instruments（Okemos,MI）社製のACA
S470ワークステーションを用いてスライドグラスの分析
を行った。多く画像処理装置に類似した、このMeridian
社の装置は試料中に存在する粉末を励起して、デジタル
またはアナログのいずれかの信号として放出した光を捕
捉した。Meridian社の装置ではこの信号はデジタルとな
る。この信号の量は種々の色によって表すことができ
る。第14図には、上部右側のパネル中、種々の照度の発
光信号に対してこの装置によって照合された色が図示さ
れている。これらの色で１つの細胞を表す（第14図Ａ−
Ｃ図参照）と、細胞１個当りの放出蛍光の相対量が得ら
れる。第14A図には、Ｃ−sis遺伝子の検知が示されてお
り、反応した蛍光体の発光照度が認められる。また第14
B図にはＣ−sisの検知が示されている。第14C図には、
ハイブリッド形成溶液にプローブが含有されていないと
きのバックグラウンド発光信号が示されている。このパ
ネルは陰性コントロールパネルでブランクである。Meri
dian社製の装置では細胞全体からの全蛍光量（すなわち
細胞１個当りの蛍光量）が測定でき、この上方を図的に
表示できる。他の細胞の生成RNAについて行った、前記
コントロール試験の結果、Ｃ−sisおよびＣ−mycの両細
胞ターゲット遺伝子が、細胞１個当り１−10分子だけこ
れらの細胞中に存在することがわかった。したがってこ
の値は第14D図および第14E図の横軸上の目盛りとして記
されている。本発明はこのような適切な装置と協働する
ことによってＣ−sisまたはＣ−mycのいずれかの遺伝子
の単独分子でも含有するものであれば細胞数を同定する
ことが可能とされている。
実施例12 イン シチュ ハイブリッド形成装置の誤差率 K562細胞（ATCC ＃CLL 243）を、10％の胎児仔牛血清
を補足したHankのバランス塩溶液で育成させた。媒体中
で最終変異終了３日後に、細胞を新鮮媒体0.3ml当り105
個の細胞密度になるように分割した。１時間後、細胞遠
心分離機でスライドガラス上に50,000−100,000個の細
胞を沈着させて60個のレプリカスライドガラスを作成し
た。残りの細胞はかき集めて、前の実施例11と同様にし
てグアジニウムセシウムクロライド法によりこの細胞か
らRNAおよびDNAを抽出した。
を補足したHankのバランス塩溶液で育成させた。媒体中
で最終変異終了３日後に、細胞を新鮮媒体0.3ml当り105
個の細胞密度になるように分割した。１時間後、細胞遠
心分離機でスライドガラス上に50,000−100,000個の細
胞を沈着させて60個のレプリカスライドガラスを作成し
た。残りの細胞はかき集めて、前の実施例11と同様にし
てグアジニウムセシウムクロライド法によりこの細胞か
らRNAおよびDNAを抽出した。
細胞ラインは比較的均一な個体数となっているので、
抽出したRNAを精製し、分析した各RNA種のコピー数評価
用に使用した。すなわち、この技術に知識をもち精通し
た当業者には公知の一連のコントロール実験によって各
細胞内に存在する各遺伝子の分子数の評価を行うことが
できる。１細胞当りの分子数を測定するこれらのコント
ロール実験としては下記のものがある；すなわちNorthe
rnブロット、RNAドットブロット、Quick−ブロット、サ
イトドット、単独コピー飽和試験、および溶液濃度−時
間ハイブリッド形成試験（ロート1/2分析）（Hames,B.
D.4 ＆ Higgins,S.V［（1986）“Nucleic Acid Hybridi
zation:a practical approach"IRL Press］参照）があ
る。
抽出したRNAを精製し、分析した各RNA種のコピー数評価
用に使用した。すなわち、この技術に知識をもち精通し
た当業者には公知の一連のコントロール実験によって各
細胞内に存在する各遺伝子の分子数の評価を行うことが
できる。１細胞当りの分子数を測定するこれらのコント
ロール実験としては下記のものがある；すなわちNorthe
rnブロット、RNAドットブロット、Quick−ブロット、サ
イトドット、単独コピー飽和試験、および溶液濃度−時
間ハイブリッド形成試験（ロート1/2分析）（Hames,B.
D.4 ＆ Higgins,S.V［（1986）“Nucleic Acid Hybridi
zation:a practical approach"IRL Press］参照）があ
る。
スライドガラス上の細胞は、エタノール75％／氷酢酸
20％／水５％の混合液で室温下で20分間固着させた。
20％／水５％の混合液で室温下で20分間固着させた。
プレハイブリッド形成段階は実施しなかった。ホルム
アミド50％,4×SSC、リン酸ソーダ（pH7.4）0.1モル、
トリトンＸ−100、0.1％低分子量DNA（Sigma Chemical
Co.社から入手した鰊の精液DNAから得たもの）100μg/m
l、フォトビオチンでラベル化したアンチセンスRNAプロ
ーブ2.5μg/mlを含有するハイブリッド形成溶液20μ
を各試料に添加した。使用したプローブはセンスまたは
アンチセンスのいずれかのRNAストランドのものであ
る：すなわちＣ−abl,C−sis,C−mycまたはEpstein Bar
rウイルス（EBV）。これらのプローブは実施例１に記載
した方法で調製した。55℃で２時間培養した後、ハイブ
リッド生成を検知した。
アミド50％,4×SSC、リン酸ソーダ（pH7.4）0.1モル、
トリトンＸ−100、0.1％低分子量DNA（Sigma Chemical
Co.社から入手した鰊の精液DNAから得たもの）100μg/m
l、フォトビオチンでラベル化したアンチセンスRNAプロ
ーブ2.5μg/mlを含有するハイブリッド形成溶液20μ
を各試料に添加した。使用したプローブはセンスまたは
アンチセンスのいずれかのRNAストランドのものであ
る：すなわちＣ−abl,C−sis,C−mycまたはEpstein Bar
rウイルス（EBV）。これらのプローブは実施例１に記載
した方法で調製した。55℃で２時間培養した後、ハイブ
リッド生成を検知した。
このハイブリッドを検知するため、ストレプトアビデ
ィン−フルオレスシン（SA−FITC）、ファイコエリセリ
ン（SA−PE）、ローダミンＢ（SA−Ｒ）、テキサスレッ
ド（登録商標）（SA−TR）、ファイコチアニン（SA−P
C）、またはアロファイコチアニン（SA−APC）錯体をメ
ーカーの推薦する濃度の２倍で各試料に添加した（SA−
FITC,SA−TR:Bethesda Res.Lab.社;SA−R:Southernn Bi
ollogicals社;SA−PE,SA−AP,:Bio Meada社）。37℃で1
0分間培養した後、試料をトリトンＸ−100 0.1％を含む
0.1×SSCの溶液で（細胞表面積1cm2当り１−200mlで）
静かに洗浄した。100％グリセチン/2×PBSの50/50（容
積比）溶液１滴を各試料に添加し、＃カバーグラスを細
胞上にのせた後、顕微鏡試験を行った。
ィン−フルオレスシン（SA−FITC）、ファイコエリセリ
ン（SA−PE）、ローダミンＢ（SA−Ｒ）、テキサスレッ
ド（登録商標）（SA−TR）、ファイコチアニン（SA−P
C）、またはアロファイコチアニン（SA−APC）錯体をメ
ーカーの推薦する濃度の２倍で各試料に添加した（SA−
FITC,SA−TR:Bethesda Res.Lab.社;SA−R:Southernn Bi
ollogicals社;SA−PE,SA−AP,:Bio Meada社）。37℃で1
0分間培養した後、試料をトリトンＸ−100 0.1％を含む
0.1×SSCの溶液で（細胞表面積1cm2当り１−200mlで）
静かに洗浄した。100％グリセチン/2×PBSの50/50（容
積比）溶液１滴を各試料に添加し、＃カバーグラスを細
胞上にのせた後、顕微鏡試験を行った。
各細胞から放出される蛍光は、プローブと反応したス
トレプトアビディンの分子数を反映しており、すなわち
細胞内の反応済みプローブ量は細胞内にあるターゲット
生体高分子数を表していた。各細胞内の蛍光を測定する
ため、Meridian Instruments（Okemos,MI）社製のACAS
470ワークステーションを用いてスライドグラスの分析
を行った。多く画像処理装置と同様に、このMeridian社
の装置は試料中に存在する粉末を励起して、デジタルま
たはアナログのいずれかの信号として放出した光を捕捉
した。Meridian社の装置ではこの信号はデジタルとな
る。実施例11に記載したのと同じ方法で、細胞１個当り
の全蛍光量をACAS 470ワークステーションを用いて測定
を行った。こうして得られた結果をMann−Whitney社製
の試験機で分析して、異なったプローブをこのイン シ
チュ ハイブリツド形成装置で処理したとき得られる蛍
光量の間に十分明確な差異が表れるかどうかを評価し
た。存在するターゲットポリマーRNAが既知のものであ
る細胞ラインで、プローブをターゲットと反応させた；
これによって陽性の細胞内に蛍光信号発生源が導入され
た。「ターゲット」生体高分子RNA細胞には不存在であ
ることがわかっている場合にはターゲットに反応性をも
つプローブを不特定の方法によって細胞を結合させては
ならない。統計学的試験によって、このことが正しいか
どうか「陽性」と「陰性」間の差が正確でバラツキがな
いほどの差異をもっているかどうかを決定することがで
きる。さらにこの統計学的試験によって、陰性の試料を
陽性と、また陽性用性の試料を陰性と誤って同定するこ
の試験の確立を決定することもできる。第１表にはこの
統計学的分析結果が表示されている。陽性用性試料には
正確に同定されている。誤差率は本発明のために準備し
た種々の感度しきい値を用いたとき不正結果を得ること
のある確立を表している。
トレプトアビディンの分子数を反映しており、すなわち
細胞内の反応済みプローブ量は細胞内にあるターゲット
生体高分子数を表していた。各細胞内の蛍光を測定する
ため、Meridian Instruments（Okemos,MI）社製のACAS
470ワークステーションを用いてスライドグラスの分析
を行った。多く画像処理装置と同様に、このMeridian社
の装置は試料中に存在する粉末を励起して、デジタルま
たはアナログのいずれかの信号として放出した光を捕捉
した。Meridian社の装置ではこの信号はデジタルとな
る。実施例11に記載したのと同じ方法で、細胞１個当り
の全蛍光量をACAS 470ワークステーションを用いて測定
を行った。こうして得られた結果をMann−Whitney社製
の試験機で分析して、異なったプローブをこのイン シ
チュ ハイブリツド形成装置で処理したとき得られる蛍
光量の間に十分明確な差異が表れるかどうかを評価し
た。存在するターゲットポリマーRNAが既知のものであ
る細胞ラインで、プローブをターゲットと反応させた；
これによって陽性の細胞内に蛍光信号発生源が導入され
た。「ターゲット」生体高分子RNA細胞には不存在であ
ることがわかっている場合にはターゲットに反応性をも
つプローブを不特定の方法によって細胞を結合させては
ならない。統計学的試験によって、このことが正しいか
どうか「陽性」と「陰性」間の差が正確でバラツキがな
いほどの差異をもっているかどうかを決定することがで
きる。さらにこの統計学的試験によって、陰性の試料を
陽性と、また陽性用性の試料を陰性と誤って同定するこ
の試験の確立を決定することもできる。第１表にはこの
統計学的分析結果が表示されている。陽性用性試料には
正確に同定されている。誤差率は本発明のために準備し
た種々の感度しきい値を用いたとき不正結果を得ること
のある確立を表している。
表 １ イン シチュ ハイブリッド形成法における 間違った陽性、間違った陰性率 検知しきい値 誤 差 率 １−２ 遺伝子／細胞 1.71％ １−５ 遺伝子／細胞 0.65％ ＞10 遺伝子／細胞 ＞0.005％ 実施例13 末梢血液中のサイトメガロウイルスの検定 ヒト末梢血液1mlを実施例８に記載した患者から採取
し、同じ実施例中に記載した方法で処理をした、ハイブ
リッド形成反応は、プローブをサイトメガロウイルス
（CMV）に相補的でフォトビオチンでラベル化したアン
チセンスRNAプローブである以外は実施例４に記載した
と同じハイブリッド形成混合液を用いて思料に対して実
施した。ハイブリッドの検知は、実施例８に記載した方
法で実施した。
し、同じ実施例中に記載した方法で処理をした、ハイブ
リッド形成反応は、プローブをサイトメガロウイルス
（CMV）に相補的でフォトビオチンでラベル化したアン
チセンスRNAプローブである以外は実施例４に記載した
と同じハイブリッド形成混合液を用いて思料に対して実
施した。ハイブリッドの検知は、実施例８に記載した方
法で実施した。
第15図および第16図の顕微鏡写真の左側のカラム（CM
V）は、本発明によって試料内のターゲットウイルス生
体高分子…ここではCMVを検知…が検知できることを示
している。この試料中にCMVの存在することが、細胞内
からの発光で示されている。第15図および第16図の顕微
鏡写真の右側のカラム（BLANK）は発光のないことを示
しており、これらの写真はこのコントロール中には無関
係な信号が発生していないことをも示している。
V）は、本発明によって試料内のターゲットウイルス生
体高分子…ここではCMVを検知…が検知できることを示
している。この試料中にCMVの存在することが、細胞内
からの発光で示されている。第15図および第16図の顕微
鏡写真の右側のカラム（BLANK）は発光のないことを示
しており、これらの写真はこのコントロール中には無関
係な信号が発生していないことをも示している。
実施例14 HIVには血清陰性であるがHIV感染の危険度の高い個体の
末梢血液細胞中のHIVの検知 HIV感染の危険度の高い個体からのヒト末梢血液10ml
を、実施例８に記載した方法で採取し、処理し、ハイブ
リッド化し、さらにハイブリッド検知を行って写真撮影
を行った。第17図には、GAG,ENG,TAT,LTR,EBVと記され
たパネルがそれぞれ対応するアンチセンスRNAプローブ
をハイブリッド溶液に添加した時に得られる結果が示さ
れている。HIVアンチセンスプローブを添加したパネル
は陽性であったが、EBVを添加したものは陰性であっ
た。「ブランク」と記されたパネルは、ハイブリッド溶
液にプローブを添加しないで得た結果を示しており、陰
性であった。下方右のパネル「ブランク」と記されたパ
ネル中の細胞の位相差顕微鏡写真であるHIVがこの個体
の細胞中に存在することを確認するために、HIVに感染
した細胞ラインＨ−９（ATCC ＃CRL 8543）（Ａおよび
Ｃレーン）から、およびこれと同じく血清陰性であるが
危険度の高い個体（ＢおよびＤレーン）からのDNAのSou
thernブロット分析（Southern［（1975）J.Mol.Biol.:9
8,503］参照）を第19図に示した。ＡおよびＢレーンのD
NAはSst Iで消化し、ＣおよびＤレーンのDNAはHind III
で消化させた。このブロットを全長HIVプローブでハイ
ブリッド化し、32Pで放射性ラベル化した結果、この個
体の末梢血液細胞中にHIVハイブリッド化配列のの存在
することが立証された。
末梢血液細胞中のHIVの検知 HIV感染の危険度の高い個体からのヒト末梢血液10ml
を、実施例８に記載した方法で採取し、処理し、ハイブ
リッド化し、さらにハイブリッド検知を行って写真撮影
を行った。第17図には、GAG,ENG,TAT,LTR,EBVと記され
たパネルがそれぞれ対応するアンチセンスRNAプローブ
をハイブリッド溶液に添加した時に得られる結果が示さ
れている。HIVアンチセンスプローブを添加したパネル
は陽性であったが、EBVを添加したものは陰性であっ
た。「ブランク」と記されたパネルは、ハイブリッド溶
液にプローブを添加しないで得た結果を示しており、陰
性であった。下方右のパネル「ブランク」と記されたパ
ネル中の細胞の位相差顕微鏡写真であるHIVがこの個体
の細胞中に存在することを確認するために、HIVに感染
した細胞ラインＨ−９（ATCC ＃CRL 8543）（Ａおよび
Ｃレーン）から、およびこれと同じく血清陰性であるが
危険度の高い個体（ＢおよびＤレーン）からのDNAのSou
thernブロット分析（Southern［（1975）J.Mol.Biol.:9
8,503］参照）を第19図に示した。ＡおよびＢレーンのD
NAはSst Iで消化し、ＣおよびＤレーンのDNAはHind III
で消化させた。このブロットを全長HIVプローブでハイ
ブリッド化し、32Pで放射性ラベル化した結果、この個
体の末梢血液細胞中にHIVハイブリッド化配列のの存在
することが立証された。
実施例15 患者治療の有効性監視用へのイン シチュ ハイブリッ
ド形成の無用性 α−またはγ−インターフェロンのいずれかによる処
理前後から末梢血液を採取した。この血液を実施例６に
記載する方法で処理し、ハイブリッド化し、ハイブリッ
ドの検知を行った。第19図は、α−インターフェロン処
理前（０日）のCML患者ではＣ−myc,C−sisおよびＣ−a
bl発ガン遺伝子ターゲット生体高分子がすべて、細胞か
ら放出される光で示されており、０日の顕微鏡写真に見
られるように、存在が示されている。同じ患者につい
て、α−インターフェロン療法４日後には同じターゲッ
ト細胞遺伝子が産生されていなかった（４日目の細胞中
には信号がほとんど、または全く認められない）。逆
に、γ−インターフェロンを処理したある患者では、Ｃ
−sisおよびＣ−abl発ガン遺伝子を過剰産生している
（第20図のパネルE,F参照）細胞がまだ存在していた。
臨床的に見て、α−インターフェロンで処理を受けた患
者は治療に良い反応があり、回復に向かっていた。しか
しγ−インターフェロンの処理を受けた患者はこの治療
の対応に失敗した。細胞ターゲット生体高分子配列の種
類または量の変化の監視は、治療法の有効性の評価また
は予測に対する重要な手段となるかも知れない。
ド形成の無用性 α−またはγ−インターフェロンのいずれかによる処
理前後から末梢血液を採取した。この血液を実施例６に
記載する方法で処理し、ハイブリッド化し、ハイブリッ
ドの検知を行った。第19図は、α−インターフェロン処
理前（０日）のCML患者ではＣ−myc,C−sisおよびＣ−a
bl発ガン遺伝子ターゲット生体高分子がすべて、細胞か
ら放出される光で示されており、０日の顕微鏡写真に見
られるように、存在が示されている。同じ患者につい
て、α−インターフェロン療法４日後には同じターゲッ
ト細胞遺伝子が産生されていなかった（４日目の細胞中
には信号がほとんど、または全く認められない）。逆
に、γ−インターフェロンを処理したある患者では、Ｃ
−sisおよびＣ−abl発ガン遺伝子を過剰産生している
（第20図のパネルE,F参照）細胞がまだ存在していた。
臨床的に見て、α−インターフェロンで処理を受けた患
者は治療に良い反応があり、回復に向かっていた。しか
しγ−インターフェロンの処理を受けた患者はこの治療
の対応に失敗した。細胞ターゲット生体高分子配列の種
類または量の変化の監視は、治療法の有効性の評価また
は予測に対する重要な手段となるかも知れない。
当技術に精通した当業者は、本発明がここに言及され
た目的および利点を得るために、本来有するものと同様
に十分に適合できることを容易に理解できるものと思わ
れる。ここに記載されている組成物、方法、手段および
技術は、好ましい実施例が現実的に代表しており、模範
を示すことを意図しているが、本発明の範疇を限定する
ことを意図するものではない。それぞれの変化は、発明
の精神の中に含有され、以下に示す特許請求の範囲の概
念に限定を受けるものである。
た目的および利点を得るために、本来有するものと同様
に十分に適合できることを容易に理解できるものと思わ
れる。ここに記載されている組成物、方法、手段および
技術は、好ましい実施例が現実的に代表しており、模範
を示すことを意図しているが、本発明の範疇を限定する
ことを意図するものではない。それぞれの変化は、発明
の精神の中に含有され、以下に示す特許請求の範囲の概
念に限定を受けるものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 G01N 33/53 Ｍｅｄｌｉｎｅ
Claims (57)
- 【請求項１】細胞試料内の標的ポリヌクレオチドを評価
するための方法において、 細胞試料を固定液と接触させて、ほぼ無傷の膜を有する
細胞を内部に有する固定試料をつくりだすステップにお
いて、前記固定液が沈殿剤か架橋剤であり、前記薬剤が
二本鎖細胞性ポリヌクレオチドがハイブリダイジング条
件下で細胞の空間的関係を保持しつつ約70％の一本鎖細
胞性ポリヌクレオチドにシフトできるようにする薬剤で
あり、 前記固定化された試料を、変性剤、ハイブリッド安定化
剤、緩衝剤、膜孔形成剤、及び検出されるべき特定の標
的ヌクレオチド配列と少なくとも基本的に相補的なヌク
レオチド配列を有する少なくとも１つのプローブを含む
ハイブリダイジング溶液で培養するステップで、その培
養が二本鎖ポリヌクレオチドが約70％の一本鎖細胞性ポ
リヌクレオチドにシフトするようなハイブリダイゼイシ
ョン条件下で行われるステップと、そして ほぼ無傷の膜を有する前記細胞内で前記プローブと前記
特定の標的ポリヌクレオチドとの間で形成された二本鎖
を検出するステップ、とで構成され、 接触、培養、及び検出のための前記ステップを実行する
時間が全部で４時間を越えず、 それによって標的ポリヌクレオチドが細胞試料内部で評
価され、 細胞の空間的関係を保持しつつ、ハイブリダイジング条
件下での約70％一本鎖細胞性ポリヌクレオチドへの前記
シフトが、以下の４つのステップを含む方法で決定され
る。 （ａ） 細胞を、その細胞内部のポリヌクレオチドを染
色して、染色された二本鎖及び染色された一本鎖ポリヌ
クレオチドの紫外線励起によって異なった放射スペクト
ルをつくりだすことができる染色剤で染色するステップ
と、 （ｂ） ハイブリダイジング条件下で処理されない細胞
サンプルの放射蛍光の総量を測定するステップと、 （ｃ） 種々の固定化及びハイブリダイゼイション方法
と時間で処理された細胞サンプルの放射蛍光の総量を測
定するステップと、 （ｄ） 二本鎖ポリヌクレオチドの量に対応する蛍光の
量が約70％減少した時間を評価するステップ。 - 【請求項２】検出されるべき特定の標的ヌクレオチド配
列に少なくとも基本的に相補的なポリヌクレオチド配列
を有するプローブがハイブリダイゼイション溶液１ミリ
リットル当り少なくとも1.0マイクログラムの濃度で用
いられ、細胞１個当り前記標的ヌクレオチド配列５コピ
ー程度の少量でも検出できる請求項１の方法。 - 【請求項３】プローブと前記標的ヌクレオチド配列間に
形成される二本鎖の前記検出を定量する追加的ステップ
を含む請求項２の方法。 - 【請求項４】定量法が、前記細胞試料の１つ又は複数の
細胞内に検出される前記プローブと前記標的ヌクレオチ
ド配列との間に形成される前記二本鎖の量を測定するス
テップ、あるいは 前記細胞試料の前記細胞の量を測定するステップを含
み、前記プローブと前記標的ヌクレオチド配列間の前記
二本鎖が検出される請求項３の方法。 - 【請求項５】二本鎖を検出するステップが前記プローブ
に取り付けられる検出可能なラベル手段で達成される請
求項１の方法。 - 【請求項６】二本鎖を検出する前記ステップが前記二本
鎖の形成が完了した後に追加された検出可能なラベル手
段で達成される請求項１の方法。 - 【請求項７】検出可能なラベルが、放射性ラベル、蛍光
剤、化学発光剤、そして酵素ラベルで構成されるグルー
プから選択される請求項１の方法。 - 【請求項８】検出可能なラベルがアビジン又はストレプ
トアビジンから選択される請求項１の方法。 - 【請求項９】沈殿剤が、エタノール、メタノール、アセ
トン、それらの組み合わせ、及び上記のいずれかとホル
ムアルデヒドとの組み合わせで構成される請求項１の方
法。 - 【請求項１０】架橋剤がパラフォルムアルデヒド、ホル
ムアルデヒド、ジメチルスベルイミデート、及びエチル
・ジメチルアミノ−プロピルカルボジイミドで構成され
るグループから選択される請求項１の方法。 - 【請求項１１】変性剤がホルムアミド、尿素、ヨウ化ナ
トリウム、チオシアネート、グアニジン、過塩素酸塩、
トリクロロ酢酸塩及びテトラメチルアミンで構成される
グループから選択される請求項１の方法。 - 【請求項１２】変性剤がホルムアミドである請求項11の
方法。 - 【請求項１３】変性剤が20％〜80％の濃度のホルムアミ
ドである請求項12の方法。 - 【請求項１４】ハイブッド安定化剤が塩化ナトリウム、
塩化リチウム、塩化マグネシウム及び硫酸鉄（III）で
構成されるグループから選択される請求項１の方法。 - 【請求項１５】孔形成剤が選択的孔形成剤である請求項
１の方法。 - 【請求項１６】孔形成剤が、ポリオキシエチレン（23）
ラウリル・エーテル、ポリオキシエチレン（20）セチル
・エーテル、３−（（３−コルアミドプロピル）−ジエ
チルアンモニオ）−１−プロパンスルホネート、オクチ
ルフェノキシポリエトキシエタノール、ナトリウム・デ
オキシコレート、及びナトリウム・ドデシル・スルフェ
ートで構成されるグループから選択される請求項１の方
法。 - 【請求項１７】ハイブリダイゼイションが15℃〜80℃の
温度で実行される請求項１の方法。 - 【請求項１８】温度が50℃〜55℃の範囲である請求項17
の方法。 - 【請求項１９】ホルムアミド濃度が50％でNaCl濃度が0.
75Mである請求項１の方法。 - 【請求項２０】ホルムアミド濃度が50％、NaCl濃度が0.
75M、そしてクエン酸ナトリウム濃度が0.075Mである請
求項１の方法。 - 【請求項２１】方法が細胞１個当り、１個〜５個のRNA
又はDNA分子を検出できる請求項１の方法。 - 【請求項２２】細胞試料内の標的バイオポリマーを評価
する方法において、 細胞試料を、沈殿剤か架橋剤のいずれかである少なくと
も１つの薬剤で構成される固定液と接触させて、内部に
ほぼ無傷の膜を有する細胞を含む固定試料をつくりだす
ステップと、 変性剤、ハイブリド安定剤、緩衝剤、膜孔形成剤及び検
出されるべき異なった標的バイオポリマーにそれぞれ固
有の、そして検出可能なラベルを有する少なくとも２つ
のプローブで構成されるハイブリダイゼイション溶液で
前記固定化試料を培養し、前記培養が前記細胞試料の細
胞性ポリヌクレオチドが約70％の一本鎖にシフトするよ
うに５分以下の時間でハイブリダイジング条件下で行わ
れ、各検出可能なラベルがそれぞれ別の検出可能なラベ
ルから区別することができるように選択され、さらに前
記プローブと各前記ほぼ無傷の膜を有する細胞内の前記
異なった標的バイオポリマーとの間で形成される二本鎖
を前記検出可能なラベルで検出するステップとで構成さ
れ、 少なくとも２つの標的バイオポリマーが前記細胞試料内
の１つの細胞内で同時に評価され、 前記接触、培養、及び検出の各ステップを行うための時
間が約４時間を越えず、 前記標的バイオポリマーが前記細胞試料の細胞内で検出
され、 ハイブリダイジング条件下での、細胞の空間的関係を保
持しつつ、約70％の一本鎖細胞性ポリヌクレオチドへの
シフトが、次の４つのステップで構成されたプロセスで
決定できる方法。 （ａ） 細胞を、その細胞内部のポリヌクレオチドを染
色して、染色された二本鎖及び染色された一本鎖ポリヌ
クレオチドの紫外線励起によって異なった放射スペクト
ルをつくりだすことができる染色剤で染色するステップ
と、 （ｂ） ハイブリダイジング条件下で処理されない細胞
サンプルの放射蛍光の総量を測定するステップと、 （ｃ） 種々の固定化及びハイブリダイゼイション方法
と時間で処理された細胞サンプルの放出蛍光の総量を測
定するステップと、 （ｄ） 二本鎖ポリヌクレオチドの量に対応する蛍光の
量が約70％程度減少した時間を評価するステップ。 - 【請求項２３】標的バイオポリマーが、 標的ヌクレオチド配列と、 ヌクレオチド配列ではない標的バイオポリマー、とで構
成され、検出されるべき異なった標的バイオポリマーに
対して固有で、検出可能なラベルを保有している前記プ
ローブが 検出されるべき固有の標的ヌクレオチド配列に対して少
なくとも基本的に相補的なヌクレオチド配列を有する少
なくとも１つの第一のプローブと、そして、ヌクレオチ
ド配列ではない標的バイオポリマーに対する特殊性を有
する少なくとも１つの第二のプローブで構成され、さら
に、 前記第一のプローブと前記標的ヌクレオチド配列間に形
成される二本鎖と、前記第二のプローブとポリヌクレオ
チドではない前記標的バイオポリマーとの間に形成され
る二本鎖を前記検出可能なラベルで検出するステップを
含み、 標的ヌクレオチド配列とポリヌクレオチドではない標的
バイオポリマーが前記細胞試料のひとつの細胞内で同時
に評価され、前記固定化細胞試料の接触、前記培養及び
前記検出が４時間以内に行われる請求項22の方法。 - 【請求項２４】検出可能なラベルが直接検出可能なラベ
ルである請求項22の方法。 - 【請求項２５】二本鎖を検出する前記ステップが二本鎖
の形成が完了した後で追加される検出可能なラベルによ
って達成される請求項22の方法。 - 【請求項２６】検出可能なラベルが放射性ラベル、蛍光
剤、化学発光剤、及び酵素ラベルで形成されるクループ
から選択される請求項22の方法。 - 【請求項２７】検出可能なラベルの１つがアビジン又は
ストレプトアビジンから選択される請求項22の方法。 - 【請求項２８】沈殿剤がエタノール、メタノール、アセ
トン、それらの組み合わせ、及び上記のもののいずれか
とホルムアルデヒドとの組み合わせによって構成される
グループから選択される請求項22の方法。 - 【請求項２９】架橋剤がパラホルムアルデヒド、ホルム
アルデヒド、ジメチルスベルイミデート、及びエチル−
ジメチルアミノ−プロピルカルボジイミドによって構成
されるグループから選択される請求項22の方法。 - 【請求項３０】変性剤がホルムアルデヒド、尿素、ヨウ
化ナトリウム、チオシアネート、過塩素酸塩、トリクロ
ロ酢酸及びテトラメチルアミンで構成されるグループか
ら選択される請求項22の方法。 - 【請求項３１】変性剤がホルムアミドである、請求項30
の方法。 - 【請求項３２】変性剤が20％〜80％の濃度のホルムアミ
ドである請求項31の方法。 - 【請求項３３】ハイブリッド安定化剤が塩化ナトリウ
ム、塩化リチウム、塩化マグネシウム及び硫酸鉄（II
I）で構成されるグループから選択される請求項22の方
法。 - 【請求項３４】孔形成剤が選択的な孔形成剤である請求
項22の方法。 - 【請求項３５】孔形成剤が、ポリオキシエチレン（23）
ラウリル・エーテル、ポリオキシエチレン（20）セチル
・エーテル、３−（（３−コルアミドプロピル）−ジメ
チルアンモニオ）−１−プロパンスルホネート、オクチ
ルフェノキシポリエトキシエタノール、ナトリウム・デ
オキシコレート、及びナトリウム・ドデシルア・スルフ
ェートで構成されるグループから選択される請求項22の
方法。 - 【請求項３６】ハイブリダイゼイションが15℃〜80℃の
温度で行われる請求項22の方法。 - 【請求項３７】温度が50℃〜55℃の範囲である請求項36
の方法。 - 【請求項３８】ホルムアミド濃度が50％で、NaCl濃度が
0.75Mである請求項22の方法。 - 【請求項３９】ホルムアミド濃度が50％、NaCl濃度が0.
75M、そしてクエン酸ナトリウム濃度が0.075Mである請
求項22の方法。 - 【請求項４０】方法が細胞１個当り第一の標的バイオポ
リマーを１〜５個の分子で、そして細胞１個当り第二の
標的バイオポリマーを１〜５個の分子で検出できる請求
項22の方法。 - 【請求項４１】末梢血液あるい骨髄細胞内の標的ポリヌ
クレオチドを評価する方法において、 血液又は骨髄の試料を固体基板上に置くステップと、 細胞試料を固定培養液と接触させてほぼ無傷の膜を有す
る細胞を含んだ固定化試料をつくりだすステップで、 前記固定培養液が沈殿剤又は架橋剤である少なくとも１
つの薬剤で構成され、その薬剤が二本鎖細胞性ポリヌク
レオチドをハイブリダイジング条件下で、細胞の空間的
構成を保持しつつ約70％の一本鎖細胞性ポリヌクレオチ
ドにシフトさせることができる薬剤であるステップと、 前記固定化試料を約20％〜80％のホルムアルデヒド、約
５倍に濃縮されたSSC、約0.1Mのトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン−HCl,pH7.4、約0.1％のオクチルフ
ェノキシポリエトキシエタノール、及び検出されるべき
特定の標的ヌクレオチド配列と少なくとも基本的に相補
的な75〜150塩基を有するホトビオチニル化一本鎖アン
チセンスRNAプローブで構成されるハイブリダイゼイシ
ョン溶液で培養し、その培養が二本鎖細胞性ポリヌクレ
オチドが約70％の一本鎖細胞性ポリヌクレオチドにシフ
トするようにハイブリダイジング条件下で行われるステ
ップと、そして 検出可能なラベルを含んだアビジン及びストレプトアビ
ジンから選択される薬剤を加えるステップで、前記薬剤
が前記薬剤を少なくとも５分以内に前記ハイブリダイズ
化プローブに結合してプローブ結合薬剤を形成するのに
十分な濃度であるステップと、 前記ラベル化された試料を0.1％オクチルフェノキシポ
リエトキシエタノールを含む溶液で洗浄して結合してい
ない薬剤を除去するステップと、そして ほぼ無傷の膜を有する前記細胞内でプローブと結合した
薬剤を検出するステップとを含み、 細胞の空間的関係を保持しつつのハイブリダイジング条
件下での約70％一本鎖細胞性ポリヌクレオチドへのシフ
トが、次の４つのステップで構成されたプロセスで決定
できる方法。 （ａ） 細胞を、その細胞内部のポリヌクレオチドを染
色して、染色された二本鎖及び染色された一本鎖ポリヌ
クレオチドの紫外線励起によって異なった放射スペクト
ルをつくりだすことができる染色剤で染色するステップ
と、 （ｂ） ハイブリダイジング条件下で処理されない細胞
サンプルの放射蛍光の総量を測定するステップと、 （ｃ） 種々の固定化及びハイブリダイゼイション方法
と時間で処理された細胞サンプルの放射蛍光の総量を測
定するステップと、 （ｄ） 二本鎖ポリヌクレオチドの量に対応する蛍光の
量が約70％減少した時間を評価するステップ。 - 【請求項４２】標的ポリヌクレオチドがオンコジンであ
る請求項41の方法。 - 【請求項４３】標的ポリヌクレオチドがウィルス性遺伝
子である請求項41の方法。 - 【請求項４４】プローブがそれぞれ前記標的ポリヌクレ
オチドの異なった領域に対する異なったプローブの混合
物で構成されている請求項41の方法。 - 【請求項４５】方法が約４時間で達成される請求項41の
方法。 - 【請求項４６】結合した検出可能なラベルが定量的であ
る請求項41の方法。 - 【請求項４７】組織試料内の標的ポリヌクレオチドを評
価する方法において、 組織試料を固体基板上に置くステップと、 前記組織試料を固定液と接触させて、細胞の空間的関係
を保持しつつ、ほぼ無傷の膜を有する細胞を含む固定化
試料をつくりだすステップとで構成され、 前記接触が−20℃〜50℃の温度で少なくとも20分間行わ
れ、前記固定培養液が二本鎖の一本鎖細胞性ポリヌクレ
オチドの約70％シフトを可能にするように、50％メタノ
ール/50％アセトンで構成されており、さらに、 前記固定化試料を約20％〜80％のホルムアルデヒド、約
５倍の濃度のSSC、約0.1Mのリン酸ナトリウム、pH7.4、
約0.1％のオクチルフェノキシポリエトキシエタノー
ル、20mMのバナジル・リボヌクレオシド錯体、検出され
るべき特定の標的ヌクレオシド配列に少なくとも基本的
に相補的な75〜160塩基を有するフォトビオチニル化一
本鎖アンチセンスRNAプローブ、及びプローブ濃度より1
00倍以上の濃度の低分子量変性DNAで構成されるハイブ
リダイゼイション溶液培養するステップで、その培養が
二本鎖ポリヌクレオチドが約70％一本鎖にシフトするよ
うなハイブリダイジング条件下で行われるステップと、 アビジンとストレプトアビジンから選択される検出可能
にラベルされた薬剤を前記プローブと前記標的ポリヌク
レオチド間に形成される二本鎖と少なくとも５分以内に
結合して結合された検出可能にラベルされた薬剤を形成
するのに十分な濃度で加えるステップと、 前記ラベルされた試料を0.1％オクチルフェノキシポリ
エトキシエタノールを含んだ溶液で洗浄して未結合の検
出可能にラベルされた薬剤を除去するステップと、 ほぼ無傷の膜を有する前記細胞内の前記結合した検出可
能にラベルされた薬剤を検出するステップとを含み、 前記細胞の空間関係を保持したままでの約70％の一本鎖
細胞性ポリヌクレオチドへのハイブリダイジング条件下
での前記シフトを、次の４つのステップで構成されたプ
ロセスで測定できる方法。 （ａ） 細胞を、その細胞内部のポリヌクレオチドを染
色して、染色された二本鎖及び染色された一本鎖ポリヌ
クレオチドの紫外線励起によって異なった放射スペクト
ルをつくりだすことができる染色剤で染色するステップ
と、 （ｂ） ハイブリダイジング条件下で処理されない細胞
サンプルの放射蛍光の総量を測定するステップと、 （ｃ） 種々の固定化及びハイブリダイゼイション方法
と時間で処理された細胞サンプルの放射蛍光の総量を測
定するステップと、 （ｄ） 二本鎖ポリヌクレオチドの量に対応する蛍光の
量が約70℃減少した時間を評価するステップ。 - 【請求項４８】標的ポリヌクレオチドがオンコジンであ
る請求項47の方法。 - 【請求項４９】標的ポリヌクレオチドがウィルス性遺伝
子である請求項47の方法。 - 【請求項５０】プローブがそれぞれ前記標的ポリヌクレ
オチドの異なった領域に対する異なったプローブの混合
物で構成される請求項47の方法。 - 【請求項５１】方法が約４時間で達成される請求項47の
方法。 - 【請求項５２】検出可能なラベルが定量的である請求項
47の方法。 - 【請求項５３】方法が細胞１個当り前記標的ヌクレオチ
ド配列１コピーの少なさでも検出できる請求項２の方
法。 - 【請求項５４】細胞試料内で標的ポリヌクレオチドに関
する評価を行うための固定剤及び最適ハイブリダイゼイ
ション条件を決定するための方法において、 （Ａ） 細胞試料を固定液と接触させてほぼ無傷の膜を
有する細胞を含んだ固定試料をつくりだすステップと、
前記固定培養液が沈殿剤又は架橋剤である少なくとも薬
剤で構成され、前記薬剤が細胞の空間的関係を保持しつ
つ二本鎖細胞性ポリヌクレオチドがハイブリダイジング
条件下で約70％の一本鎖細胞性ポリヌクレオチドにシフ
トさせることができる薬剤であるステップと、 （Ｂ） 前記固定化された試料を、変性剤、ハイブリッ
ド安定化剤、緩衝剤、膜孔形成剤、及び検出されるべき
特定の標的ヌクレオチド配列と少なくとも基本的に相補
的なヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのプロー
ブで構成されたハイブリダイゼイション溶液で培養する
ステップで、その培養が二本鎖細胞性ポリヌクレオチド
が約70％一本鎖細胞性ポリヌクレオチドにシフトするよ
うなハイブリダイジング条件下で行われるステップと、
そして、 （Ｃ） ほぼ無傷な膜を有する前記細胞内で前記プロー
ブと前記特定の標的ヌクレオチド配列との間で形成され
る二本鎖を検出するステップとで構成され、 前記方法が細胞１個当りポリヌクレオチド分子５個とい
う少なさでも検出することができ、 固定剤の選択が （ａ） 試料から細胞を取り出すステップと、 （ｂ） 固定剤を適用するステップと、 （ｃ） 前記細胞を前記固定剤で培養するステップと、 （ｄ） 細胞形態保存の程度を、その形態への前後で比
較するステップと、 （ｅ） その固定を視認できる形態の保持に基づいてレ
ーティングするステップと、 （ｆ） 細胞性抗原保存の程度でその固定をレーティン
グするステップと、 （ｇ） 細胞形態の保持及び／又は細胞抗原性保持の面
で満足すべき固定剤を選択するステップと、そして、最
適なハイブリダイゼイション条件の測定が、 （ｈ） 試料からの細胞をステップ（ｇ）で選択された
前記固定剤と接触させるステップと、 （ｉ） 前記固定化された試料を前記ハイブリダイゼイ
ション溶液で培養するステップで、前記接触が15〜80℃
の温度でハイブリダイジング条件下で行われるステップ
と、 （ｊ） ステップ（ｉ）が望ましい温度でいろいろな時
間で行われた前記細胞性ポリヌクレオチドによる二本鎖
から一本鎖へのシフトを決定し、次の４つのステップを
含む方法で、 （Ｉ）細胞を、その細胞内部のポリヌクレオチドを染色
して、染色された二本鎖及び染色された一本鎖ポリヌク
レオチドの紫外線励起によって異なった放射スペクトル
をつくりだすことができる染色剤で染色するステップ
と、 （II）ハイブリダイジング条件下で処理されない細胞サ
ンプルの放射蛍光の総量を決定するステップと、 （III）種々の固定化及びハイブリダイゼイション方法
と時間で処理された細胞サンプルの放射蛍光の総量を決
定するステップと、 （IV）二本鎖ポリヌクレオチドの量に対応する蛍光の量
が約70％減少した時間を評価するステップ。さらに、 （ｋ） 上記評価方法の培養ステップ（Ｂ）の時間を約
70％の前記細胞性ポリヌクレオチドがステップ（ｊ）で
一本鎖にシフトした時間として選定すると同時に、ステ
ップ（Ａ）の固定培養液をステップ（ｇ）で選択された
固定剤として選定するか、又は、約70％の前記細胞性ポ
リヌクレオチドがステップ（ｊ）で望ましい時間の経過
後に一本鎖にシフトしない場合は、ステップ（ｇ）で別
の固定剤を選定してステップ（ｈ）から（ｋ）までを再
度実行するステップを含む方法。 - 【請求項５５】ステップ（ｂ）での固定剤が95％エタノ
ール/5％酢酸、75％エタノール/20％酢酸、50％メタノ
ール・50％アセトン、及び10％ホルムアルデヒド/90％
メタノールで構成されるグループから選択される請求項
54の方法。 - 【請求項５６】ステップ（ｉ）が規定されている範囲内
での複数の温度で行われ、それによってステップ（ｊ）
の望ましい温度が決められる請求項55の方法。 - 【請求項５７】ステップ（ｊ）が５〜120分の時間範囲
で行われる請求項56の方法。
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