<Desc/Clms Page number 1>
Werkwijze voor het opsporen van een virus in celmateriaal van een afschraapsel of lichaamsvocht. De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het opsporen van een virus in celmateriaal van een afschraapsel of lichaamsvocht door middel van in situ hybridisatie.
De in situ hybridisatietechniek is een nuttige techniek voor het opsporen van de aanwezigheid van virussen en wordt thans routinematig toegepast op biopsiemateriaal. De toepassing van deze techniek op afschraapsels daarentegen kent weinig succes gezien de problemen die ontstaan. Bij de bekende toepassing op afschraapsels strijkt men deze afschraapsels rechtstreeks uit op een objektglaasje waarna men de in situ hybridisatie toepast. Er is evenwel een gebrek aan goede hechting van het afschraapsel aan het objektplaatje. Daarenboven is de hoeveelheid cytologisch materiaal zeer beperkt terwijl daarentegen een grote hoeveelheid kostbaar testmateriaal nodig is om het
<Desc/Clms Page number 2>
objektglaasje te bedekken, waardoor deze werkwijze zeer duur is.
Nochtans zou een betere en goedkopere werkwijze met toepassing van de in situ hybridisatietechniek zeer nuttig kunnen zijn voor onder meer het opsporen van het papillomavirus (HPV) in cervikale cellen aangezien dit nuttig kan zijn voor het daarna stellen van een diagnose. Het genoom van dit virus werd immers gevonden in cervikale neoplasmen en een oorzakelijk verband wordt vermoed tussen de aanwezigheid van dit virus en cervikale neoplasie. Thans wordt de aanwezigheid van het HPV virus in afschraapsels van de baarmoederhals met andere technieken zoals polymerase kettingreaktie opgespoord. Deze technieken zijn, evenals de bekende werkwijze met de in situ hybridisatie van afschraapsels, niet geschikt om op grote schaal het vrouwelijk deel van de bevolking cp de aanwezigheid van het papillomavirus te onderzoeken.
De uitvinding heeft tot doel voornoemde nadelen te verhelpen en een werkwijze voor het opsporen van een virus in celmateriaal van een afschraapsel of lichaamsvocht te verschaffen waarbij op een economische manier en zonder problemen zowel wat betreft hoeveelheid celmateriaal als hechting aan cbjektglaasjes de in situ hybridisatie kan toegepast worden.
<Desc/Clms Page number 3>
Tot dit doel vervaardigt men eerst een cellenkoncentraat uit een suspensie van het afschraapsel in een vloeibaar medium, welke suspensie men in geval van een afschraapsel eerst bereidt, of uit het lichaamsvocht, fixeert men het cellenkoncentraat en bedt men het gefixeerde koncentraat door middel van de gekende histologische inbeddingstechniek in paraffine of soortgelijk materiaal in, waarna men gedeelten van het verkregen blok volgens de gekende, bij weefselsneden gebruikte in situ hybridisatie techniek aan de in situ hybridisatie onderwerpt.
De aanvraagster heeft verrassenderwijze vastgesteld dat, door de in situ hybridisatie niet rechtstreeks op een uitstrijkje van afschraapsel uit te voeren maar op cellen die gesuspendeerd, gekoncentreerd, gefixeerd en in paraffine ingebed zijn, de in situ hybridisatie op dezelfde manier als bij weefselsneden zonder problemen kan toegepast worden waarbij de opsporing van een virus in cellen van een afschraapsel, of van een lichaamsvocht zoals bloed, in welk geval het suspenderen uiteraard overbodig is, op een relatief gemakkelijke en goedkope weg met een minimum aan afschraapsel of lichaamsvocht kan plaatsvinden.
In het geval van een afschraapsel, vervaardigt men bij voorkeur de suspensie met een met fosfaat gebufferde zoutoplossing bij een fysiologische pH.
<Desc/Clms Page number 4>
In een bijzondere uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding vervaardigt men het cellenkoncentraat door centrifugeren, en men het verkregen sediment vorder behandelt.
In een doelmatige uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding, bedt men, vooraleer het paraffineblok te vormen, het cellenkoncentraat eerst in in een medium tot vorming van een voorafgaand celblok en verwerkt men later dit celblok tot een paraffineblok.
Dit vergemakkelijkt de verdere handelingen en verzekert een groot aantal cellen in het paraffineblok.
Voor de hybridisatie brengt men bij voorkeur sneden van het paraffineblok aan op objektglaasjes voorbehandeld met kleefstof.
Bij de in situ hybridisatie techniek zoals toegepast op weefselsneden en die ook volgens de uitvinding op paraffineblokdelen toegepast wordt is het gebruikelijk dat men de paraffineblokdelen eerst deparaffineert, men ze vervolgens aan een enzymatische voorbehandelin ? onderwerpt, men denatureert, en men ze tenslotte aan de eigenlijke in situ hybridisatie onderwerpt, waarna men de delen wast en het virus door middel van testmateriaaal opspoort.
<Desc/Clms Page number 5>
Hierbij kan men gebruik maken van in de handel beschikbare test kits bestemd voor het opsporen van een virus zoals het papillomavirus in weefsel.
Andere bijzonderheden en voordelen van de uitvinding zullen blijken uit de hier volgende beschrijving van een werkwijze voor het opsporen van een virus in celmateriaal van een afschraapsel of lichaamsvocht volgens de uitvinding. Deze beschrijving wordt enkel als voorbeeld gegeven en beperkt de uitvinding niet.
Voor het bepalen van het papillomavirus in celmateriaal dat aanwezig is in een afschraapsel van de baarmoederhals, brengt men dit afschraapsel in suspensie in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing bij een fysiologische pH. Deze suspensie kan tijdelijk in een koelkast gestockeerd worden.
Men vervaardigt vervolgens een cellenkoncentraat door centrifugeren van de suspensie op kamertemperatuur en men mengt het verkregen koncentraat, namelijk het sediment, met een viskeus, slecht in water oplosbaar medium zoals een agar oplossing in gedestilleerd water bij 60 graden Celsius.
Het gestolde celblok dat men na afkoelen op kamertemperatuur verkrijgt brengt men in neutraal
<Desc/Clms Page number 6>
gebufferde formaldehyde-oplossing (formol) voor het fixeren van het celmateriaal.
Van dit celblok vervaardigt men met behulp van een gekende techniek die bij weefselsneden gebruikt wordt, een paraffineblok. Men dehydrateert daarbij eerst het celblok door middel van alcohol die men daarna door middel van een oplosmiddel verwijdert. Men substitueert vervolgens dit oplosmiddel in het celblok door gesmolten paraffine die men vervolgens door afkoelen laat stollen.
Van het paraffineblok snijdt men dunne sneden, met een dikte van bij voorbeeld 5 micrometer, en men brengt deze sneden op objektglaasjes aan die met een kleefmiddel zoals 3-aminopropyltriethoxysilaan, voorbehandeld zijn. Tussenin kan men de sneden laten vlotten op een proteinevrij waterbad. Na drogen van de sneden, houdt men ze gedurende 12 uur op een temperatuur van 58 tot 60 graden Celsius, waarbij de paraffine smelt en een goede hechting op de objektglaasjes verkregen wordt, waarna men ze voor de gewenste tijd stofvrij bewaart.
De eigenlijke opsporing van het papillomavirus gebeurt volgens de gekende in situ hybridisatietechniek, waarbij men de paraffinesneden op dezelfde manier behandelt als
<Desc/Clms Page number 7>
weefselsneden die men routinematig reeds volgens deze techniek behandelt.
Daarbij maakt men gebruik van testkits die normaal voor het opsporen van het papillomavirus in weefselsneden in de handel gebracht zijn.
Voorafgaand deparaffineert men een aantal sneden door middel van een oplosmiddel zoals xyleen, waarna men ze spoelt met een alcohol en droogt aan de lucht.
Vervolgens onderwerpt men deze sneden aan een enzymatische behandeling met Proteinase K om het DNA van de cellen in de sneden vrij te maken.
Voor elke opsporing heeft men drie testmaterialen of sondes nodig waarvan men een druppel op respektievelijk drie verschillende sneden aanbrengt. Een eerste testmateriaal bevat gemerkte papillomavirus DNA sequenties. Een tweede, zogenoemd positief DNA controle testmateriaal, is specifiek voor menselijke genoom DNA sequenties en genereert een hybridisatiesignaal in menselijke cellen. Het derde testmateriaal, het zogenoemde negatieve DNA testmateriaal, is specifiek voor een plasmide vektor en produceert normaal geen hybridisatiesignalen. Een vektorsequentie aanwezig in
<Desc/Clms Page number 8>
dit laatste testmateriaal hybridiseert niet met het DNA in menselijke cellen.
Het te testen DNA moet gedenatureerd worden, hetgeen gebeurt door de snede gedurende vijf tot tien minuten op 100 graden Celsius te houden. Indien het DNA in de testmaterialen één enkele streng bevat kan deze denaturatie plaats vinden vooraleer het testmateriaal toegevoegd is. Is het DNA in de testmaterialen dubbel strengig, hetgeen meestal het geval is, dan voert men de denaturisatie uit na het toevoegen van het testmateriaal.
De hybridisatie wordt uitgevoerd gedurende 18 tot 24 uur bij 37 graden Celsius in een vochtige inkubatiekamer.
Daarna wordt de overmaat van testmateriaal van de sneden weggewassen.
Voor de eigenlijke detektie van het virus, brengt men op elke snede een druppel detektiereagens aan. Na inkubatie op 37 graden Celsius brengt men een substraatoplossing aan en, na wassen, een oplossing voor het kleuren. Na opnieuw wassen en deshydrateren in alkohol monteert men de snede in een montagemedium.
De uitvinding zal hierna verduidelijkt worden aan de hand van het volgende voorbeeld :
<Desc/Clms Page number 9>
Bij vijf vrouwen werd door colposcopie de aanwezigheid van condylomen vastgesteld en PAP uitstrijkjes toonden de aanwezigheid van koilocyten aan, hetgeen een infektie met het papillomavirus deed veronderstellen. De aanwezigheid van deze virus werd via polymerase kettingreaktie bevestigd.
De werkwijze volgens de uitvinding werd vervolgens toegepast op afschraapsels van de exo- en endocervix van deze vrouwen, welke afschraapsels afzonderlijk opgelost werden in tien milliliter van een fosfaat gebufferde zoutoplossing bij een pH van 7, 4.
Elke suspensie werd in een kunststofbuisje van 50 milliliter gebracht en gecentrifugeerd bij 1000 toeren per minuut gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Het sediment werd gemengd in een recipiënt met 0, 1 milliliter van een 3% agaroplossing (bacteriologische agar, GIBCO, U. K.) in gedestilleerd water bij 60 graden Celsius Na koeling werd het celblok uit het recipiënt verwijderd en overgebracht in een kunststof inbeddingskassette (Lancer, USA). Fixatie werd uitgevoerd gedurende twee uur in neutraal gebufferde formol bij kamertemperatuur.
Het celblok werd vervolgens verwerkt tot een paraffineblok door middel van de gebruikelijke histologische
<Desc/Clms Page number 10>
paraffineinbeddingstechnieken met behulp van een Tissue-Tek II histokinette (Labtek, USA).
Van het paraffineblok werden sneden van vijf micrometer afgesneden die men liet vlotten op een proteinevrij waterbad. Deze sneden werden dan gekleefd op objektplaatjes voorbehandeld met 3-aminopropyltriethoxysilaan (Digene, USA). Na drogen bij 37 graden Celsius werden de sneden verwarmd tot 60 graden Celsius en een nacht op deze temperatuur gehouden.
De enzymatische behandeling met proteinase K en de hybridisatie werden uitgevoerd volgens de instrukties van de fabrikant door middel van de zogenoemde"Viratype in situ HPV tissue hybridisation kit"in kombinatie met de zogenoemde"Viratype in situ HPV cmniprobe set", beide van Digene, U. S. A.. De omniprobe set bevatte drie DNA testmaterialen of sondes namelijk een met biotine gemerkt DNA testmateriaaal voor het papillomavirus HPV 6,11, 16, 18,31, 33,35, 42,43, 44,45, 51,52 en 56, een positief kontrolemateriaal specifiek voor veelvuldig herhaalde sequenties in het menselijk genoom en een negatief kontroletestmateriaal bestaande uit pBR 322 plasmide.
<Desc/Clms Page number 11>
Voorafgaand werd elke snede gedeparaffineerd in twee beurten met xyleen, in ethylalkohol van 95 graden gebracht en gedroogd aan de lucht.
De proteinase K verteringsoplossing uit de voornoemde kit werd op de sneden gebracht en de sneden werden gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius geinkubeerd.
Na wassen met een buffer, dehydrateren in alcohol en drogen aan de lucht werden 3 sneden bedekt met 40 microliter van respektievelijk een van drie voornoemde testmaterialen en afgedekt door een dekplaatje. Vervolgens werden het DNA van het testmateriaal en het te onderzoeken DNA van het te onderzoeken celmateriaal van elke snede gedenatureerd bij 100 graden Celsius gedurende 10 minuten door middel van een "Präziterm"verwarmingsplaat (Gestigkeit, BRD).
De hybridisatie werd uitgevoerd in een vochtige inkubatiekamer gedurende 18 uur bij 37 graden Celsius. De dekplaatjes werden verwijderd en de overmaat aan testmateriaal werd weggespoeld met een buffer.
Gebonden testmateriaal werd gedekteerd door middel van een detektiereagens gebonden met alkalische fosfatase. Na wassen met een buffer en inkubatie in een substraatoplossing van 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfaat
<Desc/Clms Page number 12>
en nitroblauw tetrazolium bij 37 graden Celsius gedurende 60 minuten en opnieuw wassen met gedestilleerd water werden de sneden behandeld met een kleurende oplossing (kernecht rood) gedurende 30 sekonden. Na wassen met gedestilleerd water, dehydratatie in 95 graden ethanol en spoelen in xyleen werden de sneden gemonteerd in een montagemedium Pertex (Histolab, Zweden).
Sneden geinkubeerd met het HPV testmateriaal dat HPV serotypes 6,11, 16,18, 31,33, 35,42, 43,44, 45,51, 52 en 56 detekteert vertoonden een fijn purper-blauwachtig korrelig signaal in sommige kernen van exocervikale cellen, meestal afgeplatte cellen vermoedelijk afkomstig van de buitenste lagen van het exocervikaal epitheel. Sommige van deze cellen bezaten morfologische eigenschappen van koilocyten bij hematoxyline/eosine kleuring. De meerderheid van de kernen vertoonde geen reaktiviteit en waren lichtjes rozerood. Negatieve kontrolesneden geinkubeerd met pBR 322 plasmiden vertoonden geen reaktiviteit, hetgeen de niet specifieke binding van het testmateriaal uitsloot.
Positieve kontrolesneden vertoonden in meer dan 90 % van de kernen een positief signaal bestaande uit een purper-blauwachtig fijn granulair patroon.
De hiervoor beschreven werkwijze is zeer betrouwbaar en snel. Ze vereist slechts een kleine hoeveelheid
<Desc/Clms Page number 13>
testmateriaal, namelijk slechts 40 microliter om een snede met de cellen te bedekken, waardoor de werkwijze ook relatief goedkoop is Een ander groot voordeel bestaat erin dat uit één paraffineblok afkomstig van één afschraapsel een zeer groot aantal sneden verkregen worden terwijl er slechts drie sneden voor een test nodig zijn. Dit laat toe indien nodig de test te herhalen of op het overblijvende gedeelte van het paraffineblok andere werkwijzen voor het bepalen van het virus uit te voeren zoals polymerase kettingreaktie om de test te bevestigen. Verder is het mogelijk desgewenst het papillomavirus te subtyperen of uit overblijvend materiaal van het paraffineblok het DNA te isoleren.
Doordat de werkwijze relatief goedkoop is en slechts weinig celmateriaal vereist wordt het mogelijk populatie-screening toe te passen.
De uitvinding is geenszins beperkt tot de hiervoor beschreven uitvoeringsvorm, en binnen het raam van de oktrooiaanvragen kunnen aan de beschreven uitvoeringsvorm vele veranderingen aangebracht worden.
In het bijzonder is de werkwijze niet beperkt tot het opsporen van het papillomavirus in celmateriaal. Andere
<Desc/Clms Page number 14>
virussen zoals he Epstein-Barrvirus of het cytomegalovirus kunnen volgens de werkwijze opgespoord worden.
Ook is de werkwijze niet beperkt tot het testen van afschraapsels. Ze kan ook toegepast worden op lichaamsvochten zoals bloed of een broncho-alveolaire spoeling.