JP2005503762A - 低分子量デキストラン硫酸を使用するハイブリダイゼーション緩衝液およびそれらの使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、より低分子量のデキストラン硫酸がハイブリダイゼーション反応の有効な容量排除剤であることを立証する。本発明のハイブリダイゼーション緩衝液は、デキストラン硫酸のより小さいポリマーを利用し、そして従って、容量排除剤としてより高分子量のデキストラン硫酸ポリマーを使用する慣習的ハイブリダイゼーション緩衝液より低粘度のものである。これらの低分子量デキストラン硫酸ポリマー緩衝液のより低粘度は、それらを、分注、自動化流動、およびスライドガラス上での混合におけるような自動化ハイブリダイゼーション過程に有用にする。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、とりわけ自動化試験環境における、ポリヌクレオチドプローブとそれらの標的ポリヌクレオチドとの間のインシトゥハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を高めるための容量排除剤（ｖｏｌｕｍｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ａｇｅｎｔ）の使用方法に関する。一局面において、本発明はとりわけ、ＤＮＡおよびＲＮＡ配列、とりわけヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫グロブリン転鎖ｍＲＮＡ（κおよびλ配列）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子、マウスＰＳ２ ｍＲＮＡならびにＤＮＡマイクロアレイオリゴヌクレオチドの検出のためのアッセイおよび診断手順を助長するための、容量排除剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイブリダイゼーションは、デオキシリボ核酸（以下、「ＤＮＡ」）分子、リボ核酸（以下、「ＲＮＡ」）分子、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの組合せの相補鎖を一本鎖に分離し、そしてその後、塩基対形成された二重らせんに復元もしくは再アニーリングさせる、一般的技術である。少なくとも３つの主要な分類のハイブリダイゼーション、すなわち、ハイブリダイゼーションに先立ち個々の細胞を破壊しかつ内的核酸を溶液中に抽出する液体ハイブリダイゼーション；抽出されたＤＮＡ（もしくはＲＮＡ）フラグメントを、放射活性ＤＮＡ（もしくはＲＮＡ）とのその後のハイブリダイゼーション、およびその後ラジオオートグラフィーもしくはフルオログラフィーによるハイブリダイゼーションの検出のため、アガロースゲルからニトロセルロースもしくはナイロンのようなフィルターもしくはブロッターに転写する、フィルターもしくはブロットハイブリダイゼーション；ならびに、細胞からの核酸の抽出が望ましくない、構造的に無傷の細胞もしくは細胞成分内の特定の核酸もしくはポリヌクレオチド配列の検出および位置推定を直接可能にするインシトゥハイブリダイゼーション（「ＩＳＨ」）、が、慣習的に既知かつ使用されている。これらのそれぞれのハイブリダイゼーション技術のそれぞれは、しばしば共通に細胞、組織およびある種の試薬を使用するとは言え、各技術は、当該技術分野内で相互に異なりかつ完全に識別可能と一般にみられかつ受け入れられている。
【０００３】
インシトゥハイブリダイゼーションは、無傷の個々の細胞および細胞部分についての分子的および形態学的双方の情報を生じる技術である。異種細胞集団からＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡを苦労して抽出することを研究者に要求するよりむしろ、該技術は、細胞の組織内でＤＮＡおよびＲＮＡのその場所での検出を可能にし、かつ、研究者が、目的の特定のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列を含有する特定の細胞もしくは細胞部分を同定することを可能にする。この技術はまた、これらの細胞の生化学的および／もしくは形態学的特徴を同時に決定することも可能にする。この理由から、インシトゥハイブリダイゼーションの方法論は、発生生物学、細胞生物学、遺伝学、臨床診断および病理学的評価を包含する生物医学および臨床研究の多くの領域への直接の応用を有する。
【０００４】
分子分析技術としてのインシトゥハイブリダイゼーションの潜在能力にもかかわらず、効果的なプロトコールおよび手順の開発は、主として偶然かつ一貫性を欠いていた。非特許文献１；非特許文献２により１９６９年に最初に記述されて以来、インシトゥハイブリダイゼーションのアプローチは、２つの異なる形態学的状況、すなわち、細胞の細胞質中の目的の特定の核酸配列の位置推定；ならびに細胞の核および／もしくは染色体内の特定の核酸の同定に向けられてきた。
【０００５】
アッセイおよび診断の目的上の、標的とプローブのポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションに関する研究の多くは、ハイブリダイゼーションの速度を至適化することに向けられてきた。インシトゥハイブリダイゼーションは、それらの標的ポリヌクレオチドが位置する核もしくは細胞質中にプローブが容易に進入することの不可能性により、とりわけ問題がある。この問題を解決するために、研究者らは、とりわけ、細胞質もしくは核へのプローブの進入を助長するようにプローブの大きさを減少させかつ細胞固定手順を変えることを試みた。一般に、非特許文献３および非特許文献４。非特許文献５を参照されたい。最も普遍的に使用される排除剤、デキストラン硫酸の効果が、プローブが２５０ヌクレオチドを越えた混合相ハイブリダイゼーションで最も顕著であったことが報告されている。さらに、プローブの大きさが減少するにつれ、ハイブリダイゼーションの速度に対するデキストラン硫酸の促進効果も減少することができ、１４塩基のオリゴヌクレオチドについて効果が観察されなかったことが報告されている。非特許文献６、２６８にて。インシトゥハイブリダイゼーションを高めるための容量排除の使用もまた報告されている。４００ヌクレオチドの平均長さが、デキストラン硫酸の存在下のインシトゥでのハイブリダイゼーションに最適であることが報告された。非特許文献４、２０５にて。
【０００６】
容量排除剤としてのデキストラン硫酸の使用を開示する初期の参考文献は、非特許文献７；および非特許文献８を包含する。
【０００７】
デキストラン硫酸の存在下で長いビオチニル化プローブを使用するＨＰＶのＤＮＡのインシトゥの位置推定もまた、非特許文献９；非特許文献１０；および非特許文献１１によっても報告されている。
【０００８】
特許文献１は、ＩＳＨのための、ホルムアミド（脱イオン化）；デキストラン硫酸（１０％）；ヒトＤＮＡもしくはサケ精子ＤＮＡ（１００μｇ／ｍｌ）；ヒトｔＲＮＡ（１００μｇ／ｍｌ）；および硫酸バナジル（１０μＭ）を含有するデキストラン硫酸ハイブリダイゼーション緩衝液の使用を立証する。デキストラン硫酸の分子量は開示されず、そして、５００，０００の平均分子量が得られたことが推定される。
【０００９】
特許文献２は、ＩＳＨを実施するためのハイブリダイゼーション溶液を開示し、該溶液は、本質的に、８〜１２％のデキストラン硫酸、１０〜３０％のホルムアミドおよび塩よりなる。デキストラン硫酸の供給源もしくは分子量は明記されない。
【００１０】
特許文献３は、ハイブリダイゼーション反応を加速するための有用な容量排除剤として陰イオン性ヘテロ多糖（例えばコンドロイチンＡ硫酸）を含有するハイブリダイゼーション緩衝液を開示する。コンドロイチンＡ硫酸ハイブリダイゼーション緩衝液は低粘度のものであり、それは、キャピラリーギャップスライドガラス（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｇａｐ ｓｌｉｄｅｓ）、およびインシトゥハイブリダイゼーション反応の自動化処理におけるそれらの使用に有用な特性であった。Ｂｒｉｇａｔｔｉは、この緩衝液の低粘度は陰イオン性のヘテロ多糖構造を有する容量排除剤によることを教示し；これはデキストラン硫酸のような陰イオン性多糖に匹敵した。Ｂｒｉｇａｔｔｉは、さらに、デキストラン硫酸ポリマーのような陰イオン性のホモ多糖が、それらの単量体の構造に基づいて実質的により大きい粘性の緩衝液を生じさせることを開示する。この高粘度は、こうしたハイブリダイゼーション緩衝液をキャピラリーギャップ技術について非理想的にする。高粘度は、標的中におよび標的からプローブが拡散すること、ならびに洗浄段階の間に過剰のプローブを洗い流すことの双方を阻害するからである。Ｂｒｉｇａｔｔｉはさらに、デキストラン硫酸の濃度を増大させることもまた粘度を増大させ、そして従ってハイブリダイゼーション過程を阻害することを教示する。
【００１１】
特許文献４は、ＩＳＨの容量排除剤としての使用のためのデキストラン硫酸ナトリウム塩の使用を記述する。平均分子量は記述されないが、しかし、供給源（シグマ ケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、プロダクツ フォー ライフ サイエンシーズ（Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ミズーリ州セントルイス）への言及により、それは５００，０００の平均分子量を有する。Ｓｃｈｗａｒｔｚらはまた、デキストラン硫酸が、典型的には約５〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度で使用されることも開示する。
【００１２】
特許文献５は、インビトロブロットハイブリダイゼーションに使用されるハイブリダイゼーション緩衝液のためのデキストラン硫酸ポリマーの使用を記述する。この特許において、しかしながら、好ましいハイブリダイゼーション緩衝液は、５００，０００ＭＷのデキストラン硫酸を含有した。低分子量デキストラン硫酸を使用した実施例は提示されず、インシトゥ反応も提示もしくは特許請求されなかった。
【００１３】
核酸ハイブリダイゼーションの分野において、核酸の正確かつ再現可能な検出のための迅速なアッセイ試験に対する必要性は、長年にわたる問題であった。典型的に複数時間の長さの過程を加速する傾向を立証するいかなる手順も、とりわけ臨床検査室により実施されるべきハイブリダイゼーションアッセイにとって価値あるものである。
【特許文献１】
米国特許第５，９８５，５４９号明細書（Ｓｉｎｇｅｒら）
【特許文献２】
米国特許第５，７５０，３４０号明細書（Ｋｉｍ，Ｉ．ら）
【特許文献３】
米国特許第５，１１６，７２７号明細書（Ｂｒｉｇａｔｔｉ）
【特許文献４】
米国特許第４，８８６，７４１号明細書（Ｓｃｈｗａｒｔｚら）
【特許文献５】
米国特許第４，３０２，２０４号明細書（Ｗａｈｌ，Ｇ．ら）
【非特許文献１】
Ｇａｌｌら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，６３：３７８−３８３（１９６９）
【非特許文献２】
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３８：３７０−３８０（１９７１）
【非特許文献３】
Ｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｈ．ら、“Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｉｓｏｔｏｐｉｃ ａｎｄ Ｎｏｎ−Ｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（３）：２３０−２５０，１９８６
【非特許文献４】
Ｈａａｓｅ，Ａ．，ら、“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｂｙ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．ＶＩＩ，ｐｐ．１８９−２２６，（１９８４）
【非特許文献５】
Ａｍａｓｉｎｏ，Ｒ．Ｍ．，“Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒａｔｅ ｂｙ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ，”Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５２：３０４−３０７（１９８６）
【非特許文献６】
Ｍｅｉｎｋｏｔｈ Ｊ．とＷａｈｌ Ｊ．，“Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ”（総説）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：２６７−２８４（１９８４）
【非特許文献７】
Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ら、“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｌａｒｇｅ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌｓ ｔｏ ｄｉａｚｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｐａｐｅｒ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ，”ＰＮＡＳ ７６：３６８３（１９７９）
【非特許文献８】
Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ，Ｌ．Ｌ．ら、“Ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｏ ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｉｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ，”Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１７（１）：１５８−１６３（１９８１）
【非特許文献９】
Ｂｅｃｋｍａｎｎ，Ｐ．Ｍ．ら；“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｉｔａｌ Ｃｏｎｄｙｌｏｍａｓ ｂｙ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｐｒｏｂｅｓ，”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，１６：２６５−２７３（１９８５）
【非特許文献１０】
Ｍｉｌｄｅ Ｋ．，Ｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｉｎ Ｏｒａｌ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＨＰＶ １６ ｐｒｏｂｅｓ，”Ｊ．Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ．，１５：２９２−２９６（１９８６）
【非特許文献１１】
ＭｃＤｏｕｇａｌｌ，Ｊ．Ｋ．ら、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，”ｉｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ワイリー（Ｗｉｌｅｙ）、チチェスター（チバ財団シンポジウム（ＣＩＢＡ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）１２０）、ｐｐ．８６−１３０（１９８６）
【発明の開示】
【００１４】
本発明は、より低分子量のデキストラン硫酸がハイブリダイゼーション反応のための有効な容量排除剤でもあることを立証する。本発明のハイブリダイゼーション緩衝液はデキストラン硫酸のより小さいポリマーを利用し、そして従って、容量排除剤としてより高分子量のデキストラン硫酸ポリマーを使用する慣習的ハイブリダイゼーション緩衝液より低粘度のものである。これらの低分子量デキストラン硫酸ポリマー緩衝液のより低粘度は、それらを、分注、自動化流動およびスライドガラス上での混合におけるような自動化ハイブリダイゼーション過程に有用にする。
【００１５】
本発明はまた、検査されるべき組織の切片もしくは細胞を調製すること；低分子量デキストラン硫酸の存在下で核酸プローブ組成物と組織切片もしくは細胞の調製物をハイブリダイズさせること（ここで、前記プローブ組成物は標的のコーディング領域に相補的な最低１配列を含有する）；ハイブリダイズされないプローブを前記組織切片もしくは細胞の調製物から除去すること；およびハイブリダイズされたプローブ−標的の組合せを検出すること、の段階を含んで成る、標的への核酸プローブの自動的ハイブリダイズ方法にも向けられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
発明者らは、およそ１０，０００ＭＷ（分子量）の低分子量デキストラン硫酸ポリマーが、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡおよびＲＮＡ：ＲＮＡの間のハイブリダイゼーション反応のための有効な容量排除剤であることを本明細書で立証した。１０，０００ＭＷの範囲内のデキストラン硫酸を含んで成る緩衝液は、ニックトランスレーションされた標識プローブ、オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブ、ｃＤＮＡプローブおよびインビトロ転写された標識ＲＮＡプローブの双方に良好に機能した。核酸の標的の型は、染色体（間期細胞）、核ＲＮＡ（ＥＢＥＲ）、ｍＲＮＡ標的およびＤＮＡマイクロアレイオリゴヌクレオチドであった。比色的ＩＳＨおよびＦＩＳＨ双方のプローブを、これらの緩衝液を用いて試験した。該緩衝液は、パラフィンに埋込まれたホルマリン固定された組織および細胞系、切片、サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）細胞調製物、およびシンプレップ［ＴｈｉｎＰｒｅｐ］（商標）（液体に基づく調製）細胞調製物で作用した。驚くべきことに、これらの緩衝液は、標準的な５００，０００ＭＷのデキストラン硫酸ポリマーを使用して作成された匹敵する緩衝液と同じくらい良好にもしくはより良好に挙動した。
【００１７】
一般に、容量排除剤は、相補ＤＮＡの再会合を加速するためにハイブリダイゼーション緩衝液に添加される。慣習的デキストラン硫酸ポリマー（５００，０００ないし２，０００，０００ＭＷ）と会合される再会合の動力学の増大は、この容量排除剤を欠く緩衝液に比較した場合に８ないし１５倍の範囲にある（Ｗｅｔｍｕｒ，Ｊ．Ｇ．，１９７５，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ １４：２５１７−２５２４；ＷａｈｌとＳｔａｒｋ，米国特許第４，３０２，２０４号明細書）。デキストラン硫酸ポリマー（５００，０００〜２，０００，０００ＭＷ）に好ましい濃度（重量対容量）は５％ないし１０％の間である。容量排除としてデキストラン硫酸ポリマーの加速効果を記述するための重要な研究は、Ｗｅｔｍｕｒ，上記であった。開示されたデキストラン硫酸の相対的分子量は５００，０００および２，０００，０００ＭＷであった。容量排除剤としてでの低分子量デキストラン硫酸ポリマーの有効性は試験されなかった。
【００１８】
発明者らは、彼らが、これらの低粘度ＩＳＨハイブリダイゼーション緩衝液を開発することに着手した場合に：
−低分子量（８，０００ないし１５，０００）範囲のポリマーデキストラン硫酸は、ハイブリダイゼーション緩衝液のための有効な容量排除剤であることができたかどうか；
−これらのより小さいポリマーを含む緩衝液が、ヴェンタナ メディカル システムズ インク（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｉｎｃ．）のカバーガラス（ｃｏｖｅｒｓｌｉｐ）技術を使用する自動化インシトゥハイブリダイゼーション反応で有効であることができたかどうか；
−より高粘度は、ハイブリダイゼーションに有効であるべきデキストラン硫酸緩衝液に必要な特性であったかどうか；
−これらのより低分子量のポリマーは、オリゴヌクレオチドプローブとともに機能することができたかどうか。Ｓｃｈｗａｒｔｚ（米国特許第４８８６７４１号明細書）の実施例は高分子量デキストラン硫酸ポリマーを含む緩衝液のものであったからである。より小さいポリマーは有効でないかもしれないという推論；
−これらの緩衝液はスライドガラス上で他の溶液と混合して有効なハイブリダイゼーション溶液を形成したかどうか；
−容量排除剤のより小さな大きさおよびより大きな溶解性が、ハイブリダイゼーション後の洗浄の間のプローブおよびハイブリダイゼーション緩衝液の除去におけるすすぎ性能に影響を与え、これゆえにサンプル組織上での異常なシグナルを低下させるかどうか；ならびに
−緩衝液中のホルムアミドが不適合性であることができたかどうか
のような、いくつかの基礎的な問題を取り扱った。ハイブリダイゼーションの加速におけるホルムアミドの効果は十分に理解されていない。大部分の研究は、ホルムアミドは、２５容量％より大きい濃度でハイブリダイゼーション反応を実際に低下させる（Ｊ．Ｒ．Ｈｕｔｔｏｎ，“Ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｏｒｍａｍｉｄｅ ａｎｄ ｕｒｅａ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．４（１０）：３５３７−３５５５、１９９７年１０月）ことを示唆する。容量排除剤としてのより高分子量のデキストラン硫酸ポリマーの特性は、増大された粘度の特性によったのかもしれないか、または、そのより高分子量が、ホルムアミドもしくはアルジトールとの相乗的な結果であったかもしれない。Ｂｒｉｇａｔｔｉ（米国特許第５１１６７２７号明細書、上記）により記述されるポリマーは、デキストラン硫酸５００，０００より１０倍より小さかったとは言え、これらはデキストラン硫酸と異なることが教示された。それらはヘテロ多糖ポリマー（コンドロイチンＡ硫酸容量排除剤に独特の特性）であったからである。従って、より小さいデキストラン硫酸ポリマーが有効な容量排除剤であったかどうかは、これらの研究の開始時には定義も理解もされなかった。
【００１９】
自動化過程のためには、低粘度のハイブリダイゼーション緩衝液がハイブリダイゼーション反応に望ましい。ヴェンタナ メディカル システムズ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のディスカバリー［ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ］（商標）、ネクセス［ＮｅｘＥＳ］^(R)もしくはベンチマーク［ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ］（商標）機器を使用する自動化インシトゥハイブリダイゼーションは、反応の間の試薬の蒸発の喪失を予防するためにリキッド カバースリップ［ＬＩＱＵＩＤ ＣＯＶＥＲＳＬＩＰ］（商標）を利用する。ヴェンタナ（Ｖｅｎｔａｎａ）の液体カバーガラス系との、低分子量デキストラン硫酸を含むハイブリダイゼーション緩衝液の適合性は未知であった。緩衝液、およびヴェンタナ（Ｖｅｎｔａｎａ）のスライドガラス染色系上の広範なプローブ型の適合性は、これらの研究の前に未知のものであった。これらの緩衝液は、合成オリゴヌクレオチドプローブ、プラスミドもしくはコスミド起源からのニックトランスレーションされたＤＮＡプローブ、およびインビトロ合成されたＲＮＡで有用と見出されている。
【００２０】
ヴェンタナ（Ｖｅｎｔａｎａ）のディスカバリー［ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ］（商標）自動化ＩＳＨ染色装置上での自動化スライドガラス処理が、これらの緩衝液とともに使用された試験系であった。この染色系は、スライドガラス上の試薬の混合およびスライドガラスの表面全体の試薬の完全な分布を刺激するため、高速気流（ａｉｒ ｊｅｔｓ）でのリキッド カバースリップ（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｏｖｅｒｓｌｉｐ）の対回転（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｒｏｔａｔｉｏｎ）による混合に頼る。ヴェンタナ（Ｖｅｎｔａｎａ）の方法は、試薬が水と類似のもしくはそれ未満の粘度のものである場合に、最良に働く。高粘度の試薬はディスカバリー（ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ）系に容易に適応されない。デキストラン硫酸の高分子量の陰イオン性ホモポリマーを使用する慣習的なハイブリダイゼーション緩衝液の多くが、この染色系に有効でない。
【００２１】
発明者の知る限りでは、低分子量ポリマーの利用性は、核酸の再会合の駆動におけるそれらの有効性に関して、ハイブリダイゼーションの文献中で完全に探究されていない。核酸の再会合の駆動において有効と立証されたデキストラン硫酸のポリマーの大きさは、５００，０００ないし２，０００，０００ＭＷの範囲にある。しかしながら、発明者らは、より低粘度を有するずっとより低いＭＷのデキストランを、低分子量の低粘度のデキストラン硫酸に基づくハイブリダイゼーション緩衝液を自動化機器の小容量環境で使用することができるという付加的な結果を伴い、使用することができることを見出した。これは、少なくともひとりの注釈者が、デキストラン硫酸のようなホモポリマーが容量排除剤として高い平均分子量で最も有効であることができることを観察していた（上記で論考されるＢｒｉｇａｔｔｉ，米国特許第５，５１６，７２７号明細書を参照されたい）ため、驚くべき結果であった。溶液中の（所定の濃度の）いかなるポリマーの粘度および溶解性の特徴も、そのストローク半径、もしくは該ポリマーの分子容積の関数である。従って、より大きなポリマーはより小さい溶解性を有し、そして同一の単量体単位のいずれか２種のポリマーについて、より大きな粘度の溶液を誘導する。
【００２２】
より小さい平均分子量のデキストラン硫酸ポリマーのより大きな溶解性は、５％から８０％までの範囲にわたるホルムアミド濃度の存在下に、１０％に等しいかもしくはそれより大きい濃度のデキストラン硫酸ポリマーを含むハイブリダイゼーション緩衝液の処方を可能にする。これは、溶液が２×ストック溶液で処方されることを可能にする。２×ストック溶液からの混合ハイブリダイゼーション緩衝液は、水性溶液とスライドガラス上で混合して、全部の構成要素について至適の濃度をもつハイブリダイゼーション緩衝液を作成することができる。
低分子量デキストラン硫酸ポリマーを含むハイブリダイゼーション緩衝液の組成
緩衝液Ａ：
２０％ ｗｔ／ｖｏｌの、１０Ｋの平均分子量のデキストラン硫酸
５０％ ｖｏｌ／ｖｏｌのホルムアミド
１０ｍＭトリス（１５：８５のトリス−ＨＣｌ：トリス−ＯＨ）
５ｍＭ ＥＤＴＡ
３００ｍＭ ＮａＣｌ
３０ｍＭクエン酸三ナトリウム（Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７）
０．０５％ブリッジ（Ｂｒｉｊ）−３５
ｐＨ＝７．３
緩衝液Ａは、ＩＳＨのための人的に適用されるプロトコールを使用して、自動化された形式でさらなる希釈を伴わずに直接使用することができる。この溶液はまた、およそ２倍濃縮された溶液として自動化されたプロトコールを介しても使用することができ、それは、大部分の自動化過程について、等しい容量の２×ＳＳＣ−トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ１００に分注される。１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ；０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウムを含んで成る。結果として生じるスライドガラス上の（ｏｎ−ｓｌｉｄｅ）ハイブリダイゼーション溶液は、同一のまま留まるＮａＣｌおよびクエン酸三ナトリウムの濃度を除いて、緩衝液Ａの濃度の５０％である。
【００２３】
ｐＨの濃度は６から８の範囲にわたることができるが、しかしながら７．３が最も好ましい。
【００２４】
基礎の低分子量緩衝液に対する改変は、特定の応用、例えばｍＲＮＡへのＤＮＡもしくはＲＮＡプローブのハイブリダイゼーションにおいて有用である（緩衝液Ｂ）：
２０％ ｗｔ／ｖｏｌの、１０Ｋの平均分子量のデキストラン硫酸
８０％ ｖｏｌ／ｖｏｌのホルムアミド
２×ＳＳＰＥ
０．０５％ブリッジ（Ｂｒｉｊ）−３５
１×ＳＳＰＥは、水中に以下、すなわち１５０ｍＭ ＮａＣｌ、８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡを含んで成るストック溶液である。緩衝液Ｂは、およそ２倍の濃度の溶液として自動化されたプロトコールを介して使用することができ、それは、大部分の自動化過程について、等しい容量の２×ＳＳＰＥ、０．０２５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ１００および０．０２５％ブリッジ（Ｂｒｉｊ）−３５に分注される。結果として生じるハイブリダイゼーション溶液は：１０％ ｗｔ／ｖｏｌの、１０Ｋ平均分子量のデキストラン硫酸、４０％ ｖｏｌ／ｖｏｌのホルムアミド、２×ＳＳＰＥおよび０．０２５％ブリッジ（Ｂｒｉｊ）−３５であることができる。ホルムアミドの濃度の好ましい範囲は約２０％から約８０％までであり、より好ましい濃度は約４０％から８０％までであり、そして最も好ましい濃度は８０％である（スライドガラス上で４０％）。ＳＳＰＥの濃度の好ましい範囲は約２〜４×である一方、最も好ましい濃度は２×ＳＳＰＥである。
【００２５】
緩衝液Ａの低分子量デキストラン硫酸ハイブリダイゼーション緩衝液の別の変形は、インサイト（Ｉｎｃｙｔｅ）およびクロンテック（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）のような会社により典型的に販売される、ガラス製顕微鏡スライドガラス上に構築された自動的にハイブリダイズする「ＤＮＡチップ」に好ましく使用される。該緩衝液（緩衝液Ｃ）の組成は：６×ＳＳＰＥ、２０％デキストラン硫酸（１０Ｋ ＭＷ）および１０％ホルムアミドである。緩衝液Ｃは、典型的には、２×ＳＳＰＥ、０．０１２５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ１００および０．０２５％ブリッジ（Ｂｒｉｊ）−３５との１：１希釈物中で機器上で流される。緩衝液Ｃの大きな利点の１つは、それがスライドガラスの表面上での緩衝液の拡大可能性を最大化して、従って利用可能なプローブアレイの全部を覆うよう処方されることである。ＳＳＰＥの好ましい濃度は２から８×の範囲にわたる一方、３〜７×がより好ましく、そして６×が最も好ましい。ホルムアミドの好ましい濃度範囲は０〜２０％であり、５から１５％がより好ましく、そして１０％が最も好ましい。
【００２６】
本明細書で使用される低分子量デキストラン硫酸は、シグマ ケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から入手した。それはおよそ１０，０００の平均分子量を有するとしてシグマ（Ｓｉｇｍａ）により販売される。しかしながら、３ロットのシグマ（Ｓｉｇｍａ）製品のデキストラン硫酸（カタログ番号Ｄ−６９２４）についての平均分子量（デキストラン硫酸ポリマーの総集団の最低７５％の分子量の分析による）は、ロット番号４９Ｈ０５３０、１００Ｋ１３７９、および０７０Ｋ０８４８について、それぞれ１２，７５０ＭＷ、１３，３６０ＭＷおよび１３，３６０ＭＷであった。この物質についての分子量の範囲は２標準偏差（８，０００ないし１６，０００ＭＷ）内にある。そのために、「低分子量デキストラン硫酸」という用語は、それに関連する若干の変動性を有する。それはその平均の大きさに関して十分に制御されないポリマーであるからである。
【００２７】
本発明はまた、検査されるべき組織の切片もしくは細胞を調製すること；低分子量デキストラン硫酸の存在下で、組織切片もしくは細胞の調製物を核酸プローブ組成物とハイブリダイズさせること（ここで、前記プローブ組成物は標的のコーディング領域に相補的な最低１配列を含有する）；ハイブリダイズされないプローブを前記組織切片もしくは細胞の調製物から除去すること；およびハイブリダイズされたプローブ−標的の組合せを検出すること、の段階を含んで成る、標的への核酸プローブの自動的ハイブリダイズ方法にも向けられる。
【００２８】
自動ハイブリダイゼーションは、ヴェンタナ メディカル システムズ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により販売されるもののような自動化機器による標的へのプローブのハイブリダイゼーションを記述するのに使用される用語である。これらは、モデルＥＳ^(R)、ネクセス［ＮｅｘＥＳ］^(R)、ディスカバリー［ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ］（商標）およびベンチマーク［ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ］（商標）を包含する。組織もしくは細胞サンプルの調製は、系上へのスライドガラスの負荷がそうであるように、人的である。ハイブリダイゼーション過程は、自動化染色装置での使用にとりわけ適応されている、プログラムされたプロトコールを使用する機器により実施する。当業者は、機器の詳細について訓練されれば、自動化染色機器を操作して自動化ハイブリダイゼーション反応を実施することが完全に可能である。同様に、核酸プローブ組成物は当該技術分野で公知であり、そして、ヴェンタナ（Ｖｅｎｔａｎａ）、ノボカストラ（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）、ザイメッド（Ｚｙｍｅｄ）、ヴァイシス（Ｖｙｓｉｓ）およびエンゾ（Ｅｎｚｏ）を包含する多数の供給源から商業的に入手可能である。ハイブリダイズされないプローブのサンプルからの除去は、プロトコールの一部である予めプログラムされた洗浄機能により、自動化染色装置機器により実施する。検出機能は同様にプロトコールの一部である。その機器のプラットフォーム上での使用のためヴェンタナ（Ｖｅｎｔａｎａ）により販売されるところの標準的検出試薬を使用する。ハイブリダイズされたプローブを検出するのに使用される標識の範疇は、蛍光発色団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）、ハプテンおよび発色剤（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）を包含する。当業者は、特定の標識、ならびに特定の検出の設定におけるそれらの強みおよび弱みを知っている。プローブを直接標識し、そしてフルオレセインもしくはテキサスレッド（モレキュラー プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、オレゴン州ユージーンから入手可能）のような蛍光発色団で可視化する一次検出スキームを使用してよいか、または、抗体に媒介される二次検出スキームを使用してよい。
【００２９】
本発明は、ミクロトームを使用してパラフィンに埋込まれた組織ブロックから切片にされた組織サンプルのような組織サンプル調製物、もしくは、サイティック インク（Ｃｙｔｙｃ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州ボックスボロから入手可能なシン プレップ［Ｔｈｉｎ Ｐｒｅｐ］（商標）のような液体に基づく調製物（ｐｒｅｐ）から作成される細胞組成物のいずれかとともに使用してよい。液体に基づく調製物は、単純に、その表面上に均一に広げられた細胞の単層を有する顕微鏡スライドガラスである。細胞を収集バイアルに収集し、そして後の分析のためそれらを保存する媒体に懸濁する。懸濁物のアリコートを、フィルターを通して濾過し、そしてその後、該フィルターをスライドガラス上に刻印づけ（ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ）、細胞の薄層をスライドガラスのガラス表面に接着させる。
【００３０】
ブロッキングＤＮＡは、染色体ＤＮＡをプロービングしている場合はいつでも、固有のバックグラウンドシグナルを低下させるために核酸プローブとともに使用してよい。米国特許第５，５４４７，８４１号明細書（Ｇｒａｙ，Ｊ．ら）は該方法を一般的に記述し、これにより引用することにより組み込まれる。
【００３１】
本発明のハイブリダイゼーション緩衝液の好ましい態様は、以下の実施例に言及することにより最良に理解される。後に続く実施例は本発明の特定の態様およびそれらの多様な用途を具体的に説明する。それらは説明の目的上のみ示され、そして本発明を制限するとして解釈されるべきでない。
実施例
Ａ．一般的方法
ＩＳＨ分析のためのサンプルを、ホルマリン固定されかつパラフィンに埋込まれた細胞もしくは組織サンプルを４μｍ切片に切断すること、および該切片を標準的な顕微鏡スライドガラス上に置くことにより調製した。サンプルのその後の処理およびＩＳＨを、共通に譲渡されかつ同時係属中の米国特許出願第６０／０７６，１９８号および同第０９／２５９，２４０号明細書（双方は引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述される、ディスカバリー［ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ］（商標）自動化ＩＳＨ／ＩＨＣ染色装置（ヴェンタナ メディカル システムズ インク（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、アリゾナ州トゥーソン）のような自動化装置で実施した。サンプルからパラフィンを除去するために、スライドガラスを水性溶液中に浸積し、およそ２０分間加熱し、そしてその後すすいだ。自動化脱パラフィン手順は米国特許出願第６０／０９９，０１８号および同第０９／２５９，２４０号明細書（双方は引用することにより本明細書に組み込まれる）に、より完全に記述される。その後、サンプルをプロテアーゼ１で処理し、そしてスライドガラスを８５℃（ＲＮＡ標的遺伝子へのハイブリダイゼーションのため）もしくは９０〜９５℃（ＤＮＡ標的遺伝子へのハイブリダイゼーションのため）に４ないし１０分間加熱した。
【００３２】
ハイブリダイゼーション反応は、典型的には、１：１の比の２×ＳＳＣ−トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ１００、および２５ないし１２５ｎｇ／ｍＬの間の各個々のプローブ分子中へ、緩衝液Ａの希釈物よりなるハイブリダイゼーション緩衝液中で実施した。ＩＳＨ反応は、３７℃ないし５４℃の間で実施した。２０００年９月１５日出願の米国仮出願第６０／２３３，１７７号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおりオリゴヌクレオチドプローブを使用するＩＳＨについて、ハイブリダイゼーション反応は４７℃で１時間実施した（ポリｄ（Ｔ）プローブを除く、ここではハイブリダイゼーション反応は３７℃で１時間至適に実施した）。
【００３３】
サンプル中の特定の標的遺伝子へのフルオレセイン標識プローブのハイブリダイゼーションを、連続的な一連の結合タンパク質を使用することにより検出した（すなわち二次抗体検出）。しかしながら、結合されたプローブを可視化する場合は直接検出を使用することが等しく可能である。二次検出において、最初に、プローブ分子に結合されたフルオレセインハプテンに対し向けられた抗フルオレセインマウスモノクローナル抗体を、サンプルに添加した。次に、マウス抗体に対し向けられたビオチン標識ポリクローナルヤギ抗体をサンプルに添加した。最後に、ハイブリダイゼーション反応を、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＰ）基質を使用して比色的に検出した。「二次抗体検出」と命名されるこの技術は当業者に慣例である。一次および二次抗体は、ヴェンタナ メディカル システムズ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、アリゾナ州トゥーソンを包含する多数の供給元から入手可能であり、それらはヴェンタナ（Ｖｅｎｔａｎａ）の自動染色系（ＥＳ^(R)、ネクセス［ＮｅｘＥＳ］^(R)、ディスカバリー［ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ］（商標）およびベンチマーク［ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ］（商標））での使用に至適化されている。
Ｂ．実施例
実施例１．標準的デキストラン硫酸緩衝液と比較した、緩衝液Ａを使用するインシトゥハイブリダイゼーション。
【００３４】
Ａｌｕヒト反復配列に相補的な２種のプローブのカクテルを使用して、ハイブリダイゼーション反応のための実現可能な容量排除剤としてのより低分子量のデキストラン硫酸の有効性を評価した。低分子量デキストラン硫酸を含有するハイブリダイゼーション緩衝液を比較するための実験に使用された２種のＡｌｕプローブは、２種のオリゴヌクレオチドのカクテルであり、それぞれはプローブあたり３個のフルオレセインハプテンが結合された。これらのプローブを５００ｎｇ／ｍＬの組み合わせられた濃度で溶解した。２種のハイブリダイゼーション緩衝液は、緩衝液Ａ、および、７．３の最終ｐＨの１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）デキストラン硫酸、５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド、２×ＳＳＣおよび０．０５％ブリッジ（Ｂｒｉｊ）−３５の標準的デキストラン硫酸緩衝液（５００，０００分子量）の緩衝液である。
【００３５】
ハイブリダイゼーションは、プローブおよび全部の他の試薬について自動化された分注プロトコールを使用して、ディスカバリー［ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ］（商標）機器を用いて実施した。サンプルは、ヴェンタナ メディカル システムズ インク（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、アリゾナ州トゥーソンから入手可能な、パラフィンに埋込まれた細胞系、オンコール（Ｏｎｃｏｒ）インフォーム［ＩＮＦＯＲＭ］（商標）Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ対照スライドガラス、カタログ番号Ｓ８１００、レベル１であった。全部のスライドガラスを、自動化水性脱パラフィン方法（同時係属中の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２０３５３号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）によりパラフィンを除去すること、次いで、ヴェンタナ（Ｖｅｎｔａｎａ）のＡＰＫ緩衝液での１：２．７の希釈での５０度Ｃで８分間のヴェンタナ（Ｖｅｎｔａｎａ）プロテアーゼ１での処理により処理した。その後、サンプル細胞を２×ＳＳＣ（ヴェンタナ（Ｖｅｎｔａｎａ）の２×ＳＳＣ）で平衡化し、その後すすいでスライドガラス上のおよそ１００μＬの残余の容量のほかは除去した。２倍濃度のプローブおよびハイブリダイゼーション緩衝液をスライドガラス上に分注し（１００μｌ）、そして高速気流混合を使用して残余の容量の２×ＳＳＣと混合した。混合した後に、スライドガラスを１０分の段階内で８５Ｃに加熱し、その後、１時間のハイブリダイゼーション反応の間３７Ｃに冷却した。ハイブリダイゼーションに次いで、過剰のプローブおよびＤＮＡに非特異的に結合されたプローブを除去するため、標準的な２×ＳＳＣの３７Ｃでの洗浄を行った。Ａｌｕ配列へのハイブリダイズされたプローブの検出は、プローブに結合されたフルオレセインハプテンへの抗フルオレセインマウス抗体の結合を介する二次抗体検出、次いで、ヴェンタナ（Ｖｅｎｔａｎａ）増強（Ｅｎｈａｎｃｅｄ）アルカリホスファターゼブルー検出（ヴェンタナ（Ｖｅｎｔａｎａ）カタログ番号７６０−０６１）化学により実施した。別の方法で示されない限り、全部の試薬はヴェンタナ メディカル システムズ インク（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、アリゾナ州トゥーソンから得、また、スライドガラス上でのこれらの反応の全部は、処理の間の水の蒸発の喪失を予防するために、リキッド カバースリップ［ＬＩＱＵＩＤ ＣＯＶＥＲＳＬＩＰ］（商標）の薄膜下で実施した。
【００３６】
結果（比色的に観察された）は、低分子量の２０％濃度のデキストラン硫酸を含有するハイブリダイゼーション緩衝液が、ヴェンタナ メディカル システムズ インク（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）染色自動制御においてより効果的かつより効率的であったことであった。低分子量デキストラン硫酸を含有する緩衝液に基づく反応は、組織切片全体の大部分の核について強い強度のシグナルを生じた（Ａｌｕサテライト配列に対するプローブの期待された結果）。５００，０００分子量のデキストラン硫酸を含むハイブリダイゼーション緩衝液を含有する反応は、同じような強いシグナルを生じず、また、強度は各細胞核について同一でなかった。これらの反応について、組織切片の領域が非常に乏しく染色した若干のスライドガラス、および全く染色しなかった他の領域が存在した。５００，０００ｍｗのデキストラン硫酸緩衝液でハイブリダイズされた１０枚のスライドガラスのうち、それらのスライドガラスの８枚が、弱い核シグナルを有した領域およびシグナルを全く有しなかった若干の領域を組織切片中に有した。逆に、本発明の低分子量デキストラン硫酸緩衝液を用いてハイブリダイズされた１０枚のスライドガラスのなかで、それらのスライドガラスのただ１枚のみが、乏しい染色を表した組織切片の一領域を有した。乏しい染色のこの観察結果は、組織切片全体のハイブリダイゼーション緩衝液の不均一な広がりおよび／もしくは混合によると推定された。この実験について、その現象は、５００，０００ｍｗのデキストラン硫酸緩衝液に基づく反応のあいだでより普遍的であった。
【００３７】
低分子量デキストラン硫酸を用いて作成されたカクテルを用いるハイブリダイゼーション反応は、５００，０００ｍｗのデキストラン硫酸緩衝液を用いる反応に比較して、Ａｌｕサテライト配列プローブと、より強度のシグナルを慣例に生じた。この観察結果は、（１）低分子量デキストラン硫酸がハイブリダイゼーション反応のための有効な容量排除剤であること、および（２）こうした緩衝液は、自動化ハイブリダイゼーションプロトコールのために、５００，０００ｍｗのデキストラン硫酸を用いて作成された対応する緩衝液より効率的であること、を示唆する。
実施例２．ヒト脾サンプルでのＩＳＨ。
【００３８】
図１Ａ−１Ｂは、ＥＢＶ初期ＲＮＡ転写物、ＥＢＥＲ １および２に相補的である標識オリゴヌクレオチドよりなるプローブ集合物を使用するヒト脾組織のＩＳＨ分析について得られた結果を具体的に説明する。この実験は、１０，０００ＭＷを使用するデキストラン硫酸ハイブリダイゼーション緩衝液が、ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブとＲＮＡ標的（この場合は核ＲＮＡ）との間の特異的ハイブリダイゼーションを支援することを立証する。これら２種のウイルス転写物は核ＲＮＡである。標的特異性は、インシトゥハイブリダイゼーションに先立ちリボヌクレアーゼＡで処理されない組織サンプル（Ａ）に対する、ハイブリダイゼーションに先立ちＲＮアーゼで処理された組織（Ｂ）でのシグナルの喪失により立証される。（Ｂ）における検出可能なシグナルの減少は、このプローブがＥＢＶ ＲＮＡ転写物、ＥＢＥＲ １およびＥＢＥＲ ２に特異的にハイブリダイズすることを示す。
実施例３．リンパ腫組織サンプルでのＩＳＨ。
【００３９】
図２および３は、それぞれ２種のヒト免疫グロブリンＬ鎖遺伝子κおよびλのｍＲＮＡにそれぞれ特異的な２種のプローブ集合物の比較により、低分子量デキストラン硫酸を含むハイブリダイゼーション緩衝液が、特異的ハイブリダイゼーション反応を支援することを具体的に説明する。使用された組織は、それぞれ一方もしくは他方のＬ鎖ｍＲＮＡについて起源が単クローン性である形質球様細胞リンパ腫組織であった。図２Ａにおいて、腫瘍は、異常に高頻度のκ発現細胞により示されるとおりκ単クローン性であった一方、図２Ｂ中の組織はλ遺伝子発現について単クローン性の組織であり、従って低レベルのκ発現細胞が見出された。逆は、図３中の組織で見出された。λプローブを使用し、この単クローン性が、図３Ａおよび３Ｂで具体的に説明されるとおり識別された。図３Ａ中の組織は、λＬ鎖ｍＲＮＡを過剰発現している細胞の高頻度を示し；図３Ｂ中の組織はλ発現細胞の低頻度を有した。従って、関連遺伝子からのプローブについて、低分子量デキストラン硫酸緩衝液は特異的ハイブリダイゼーションを支援することができる。
実施例４．緩衝液Ｂを使用するＩＳＨ。
【００４０】
図４は、緩衝液Ｂで希釈されたマウスｐＳ２アンチセンスリボプローブを使用するマウス胃中でのマウスｐＳ２遺伝子発現のスライドガラスに基づくインシトゥハイブリダイゼーション像のカラー写真である。正常胃上皮で発現されることが見出された（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，Ｏ．，Ｗｏｌｆ，Ｃ．，Ｋｅｄｉｎｇｅｒ，Ｍ．，Ｃｈｅｎａｒｄ，Ｍ．Ｐ．，Ｔｏｍａｓｅｔｔｏ，Ｃ．，Ｃｈａｍｂｏｎ，Ｐ．，Ｒｉｏ，Ｍ．Ｃ．，“Ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｏｎｅ Ｐ−Ｄｏｍａｉｎ（ｐＳ２）ａｎｄ ｔｗｏ Ｐ−Ｄｏｍａｉｎ（ｍＳＰ） ｇｅｎｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２２：１９１−１９８（１９９３））マウスｍＰＳ２遺伝子を、緩衝液Ｂハイブリダイゼーション緩衝液の使用を研究するためのモデルとして使用した。ｍＰＳ２ ｃＤＮＡは、インビトロ転写に適しかつ直鎖状にされた、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン）中にサブクローニングされて提供された。
【００４１】
アンチセンスおよびセンスＤＩＧ標識リボプローブは、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）ＲＮＡ ＤＩＧ標識キット（ロシュ モレキュラー（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）カタログ番号１ １７５ ０２５）を使用して合成し、そして２００μｌのＨ２Ｏの最終容量に可溶化した（ストック溶液）。緩衝液Ｂ緩衝液へのｍＰＳ２リボプローブの１０００倍希釈が作業希釈物を提供した。
【００４２】
ホルマリン固定されたパラフィンに埋込まれたマウス胃切片（５μｍ）を、作業中の（ｏｎ−ｌｉｎｅ）脱パラフィンおよび消化段階後に、ディスカバリー（ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ）機器のプラットフォーム上でハイブリダイズさせた。プローブおよびスライドガラスを７０℃で６分間共変性させ、そして６０℃で３分間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションに次いで、０．１×ＳＳＣを６５℃で使用するそれぞれ６分の３回のストリンジェンシー洗浄を行った。
【００４３】
プローブは、ビオチニル化抗Ｄｉｇ抗体（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、２００倍）、次いでストレプトアビジン−アルカリホスファターゼおよびＮＢＴ／ＢＣＩＰ比色検出（ヴェンタナ（Ｖｅｎｔａｎａ）増強青色検出キット）を使用する免疫組織化学により検出した。
【００４４】
シグナルは、アンチセンスプローブを使用してヒト胃の上皮細胞中で見出された一方、シグナルはセンスプローブを使用して検出されなかった。シグナルの位置推定は、以前に発表された放射活性ＩＳＨの結果（Ｌｅｆｅｂｖｒｅら、１９９３）と比較することにより、適切であることが見出された。
実施例５．パラフィンに埋込まれた組織中でのＨＰＶ対照細胞系でのＩＳＨ。
【００４５】
ＨＰＶの高危険度もしくは低危険度系統（共通に譲渡された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５１０９号明細書に記述される）のクローン化されたＤＮＡのカクテルとしてＨＰＶプローブを使用するＩＳＨのため、ハイブリダイゼーション反応を、パラフィンに埋込まれた組織のＨＰＶの高危険度と低危険度の系統の間の識別を可能にしたストリンジェンシーで実施した。ハイブリダイゼーション反応は、５７度Ｃで２時間実施し、次いで７６℃で２×ＳＳＣ洗浄した。ハイブリダイゼーション緩衝液の成分の最終濃度は、２５％ホルムアミド（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、２×ＳＳＣ、５ｍＭトリス、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２５％ブリッジ（Ｂｒｉｊ）−３５、０．２５％ ｗｔ ｖｏｌの０．２５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００であった。サンプルは、（ａ）Ｃａｓｋｉ（およそ５００コピーのＨＰＶ １６）（図９）および（ｂ）ＨＰＶ １８を含むＨｅＬａ細胞（細胞あたり２０ないし５０の範囲内のコピー数）（図１０）のパラフィンに埋込まれた細胞系であった。疾患に罹った組織は、ＨＰＶに感染したパラフィンに埋込まれた子宮頚部組織であった。
【００４６】
結果は以下のとおりであった。図９は、Ｃａｓｋｉのパラフィンに埋込まれた細胞系が、核で低いバックグラウンドないしバックグラウンドなしを伴い、期待された核パターンの十分なシグナルを有することを示す。図１０は、ＨｅＬａの埋込まれた細胞が、低いバックグラウンドないしバックグラウンドなしを伴い、より低いコピー数から期待されるとおり、より小さい核シグナルスポットを有することを示す。
【００４７】
占有のＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子（ｃ−ｅｒｂＢ２）ＤＮＡプローブを、容量排除剤として緩衝液Ａを使用して試験した。該プローブを、パラフィンに埋込まれた細胞系のスライドガラス（ヴェンタナ メディカル システムズ インク（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）カタログ番号Ｓ８１００）および乳癌組織を使用して、この緩衝液中で試験した。埋込まれた細胞系キットは、異なるコピー数のＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子を有する細胞系をそれぞれ有するスライドガラスよりなり、すなわち、レベル１スライドガラス（オンコール（Ｏｎｃｏｒ）カタログ番号ｓ８１００−１）は正常コピー数のＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子（３もしくはそれ未満）をもつ細胞を有し；レベル２スライドガラス（オンコール（Ｏｎｃｏｒ）カタログ番号ｓ８１００−２）は低い増幅されたレベルのＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子（４コピー）をもつ細胞を有し；レベル３スライドガラス（オンコール（Ｏｎｃｏｒ）カタログ番号ｓ８１００−３）の細胞は高度に増幅された数のＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子（１０コピーもしくはそれ以上）を有する。スライドガラスをディスカバリー（ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ）機器上で処理した。スライドガラスを作業中に脱パラフィンし、９０Ｃで洗剤溶液で前処理し、その後、ヴェンタナ（Ｖｅｎｔａｎａ）プロテアーゼ１（カタログ番号７６０−２１０８）で、埋込まれた細胞について３７℃で４分間、および埋込まれた組織について５０℃で１０分間、さらに処理した。変性は９０℃で１０分間実施し、そしてハイブリダイゼーションは５０℃で１２時間であった。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、２×ＳＳＣ中５０℃で６分、次いで２×ＳＳＣ中６０℃で６分であった。ハイブリッドを、ＦＩＴＣ標識抗ビオチン抗体、次いでＦＩＴＣ標識抗マウス抗体を結合することによる間接的蛍光検出により検出した。スライドガラスをヨウ化プロピジウムで対染色し、そして自動化処理の終了後にカバーガラスで覆った。
【００４８】
結果は以下のとおりであった。図６〜８を参照すれば、埋込まれた細胞系は、核で低いバックグラウンドないしバックグラウンドなしを伴い、期待されたパターンの強いシグナルを有する。組織は、低レベルのバックグラウンドを伴い、腫瘍細胞上にシグナルを有する。従って、１０，０００ＭＷの１０％デキストラン硫酸を含むハイブリダイゼーション緩衝液は、対照細胞系および患者組織試料双方で、リキッド カバースリップ［ＬＩＱＵＩＤ ＣＯＶＥＲＳＬＩＰ］（商標）下で実施される１２時間のハイブリダイゼーションを使用して、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕプローブを用いての制御されたハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび良好な結果を可能にする。図６は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子の高増幅（細胞あたり１０コピー以上）についてからのシグナルを具体的に説明する。図７は、ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子の低増幅（細胞あたり４コピー）からのシグナルを具体的に説明する。図８は、二倍体コピー数のＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子からのシグナルを具体的に説明する。
実施例６．緩衝液Ｃを使用するマイクロアレイハイブリダイゼーション
図５は、胎盤ＲＮＡからのＣｙ３標識された増幅されたｃＤＮＡプローブ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、テキサス州オースチン、カタログ番号７９５０）を使用してプロービングされたクロンテック（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）のヒトアトラス（Ａｔｌａｓ）ＤＮＡマイクロアレイ（クロンテック インク（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州パロアルト）のカラー写真である。プローブは、Ｚｈａｏ，Ｒ．，Ｇｉｓｈ，Ｋ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．，Ｙｉｎ，Ｙ．，Ｎｏｔｔｅｒｍａｎ，Ｄ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｗ．Ｈ．，Ｔｏｍ，Ｅ．，Ｍａｃｋ，Ｄ．Ｈ．とＬｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｊ．，“Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐ５３−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｕｓｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙｓ，”Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４：９８１−９８３（２０００）の方法に従って標識した。ハイブリダイゼーション緩衝液Ｃを使用して、標準的な機器のプロトコールを使用してＤＮＡマイクロアレイオリゴヌクレオチドにプローブをハイブリダイズさせた。
【００４９】
前述の開示は本発明のある種の特定の態様を強調すること、および、それに同等な全部の改変もしくは代替物は、以下の付属として付けられる請求の範囲に示されるところの本発明の技術思想および範囲内にあることが理解されるべきである。本明細書で引用される全部の特許、特許出願および参考文献は、引用することにより組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１Ａ−１Ｂ】発明にかかる、ＥＢＶ ＥＢＥＲ １および２の核ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを所有するプローブよりなるＤＮＡプローブ集合物とハイブリダイズされたヒト脾組織サンプルのカラー写真であり、ここで、組織サンプルはインシトゥハイブリダイゼーションに先立ちリボヌクレアーゼＡで処理しなかった（Ａ）か、もしくはインシトゥハイブリダイゼーションに先立ちリボヌクレアーゼＡで処理した（Ｂ）。
【図２Ａ−２Ｂ】発明にかかる、ヒト免疫グロブリンκＬ鎖ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを所有するプローブよりなるプローブ集合物を使用するリンパ腫組織のカラー写真である。図２Ａ中のリンパ腫組織はκＬ鎖を過剰発現し、また、図２Ｂ中の組織はλＬ鎖を過剰発現する。
【図３Ａ−３Ｂ】発明にかかる、ヒト免疫グロブリンλＬ鎖ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを所有するプローブよりなるプローブ集合物を使用するヒトリンパ腫組織のカラー写真である。図３Ａ中の組織はλＬ鎖を過剰発現し、また、図３Ｂ中の組織はκＬ鎖を過剰発現する。
【図４】発明にかかる、緩衝液Ｂで希釈されたマウスｐＳ２アンチセンスリボプローブを使用するマウス胃中でのマウスｐＳ２遺伝子発現のスライドガラスに基づくインシトゥハイブリダイゼーション像のカラー写真である。
【図５】発明にかかる、胎盤ＲＮＡからのＣｙ３標識された増幅されたｃＤＮＡプローブでプロービングされたクロンテック（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）のヒトアトラス（Ａｔｌａｓ）ＤＮＡマイクロアレイの走査されたカラー写真である。
【図６】発明にかかる、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＤＮＡプローブにハイブリダイズされた、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ高増幅対照細胞系（ヴェンタナ（Ｖｅｎｔａｎａ）カタログ番号Ｓ１００３）を有するスライドガラスのカラー写真である。
【図７】発明にかかる、同一のＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＤＮＡプローブにハイブリダイズされた、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ低増幅対照細胞系（ヴェンタナ（Ｖｅｎｔａｎａ）カタログ番号Ｓ１００２）を有するスライドガラスのカラー写真である。
【図８】発明にかかる、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＤＮＡプローブにハイブリダイズされた、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕが増幅されない対照細胞系（ヴェンタナ（Ｖｅｎｔａｎａ）カタログ番号Ｓ１００１）を有するスライドガラスのカラー写真である。
【図９】発明にかかる、細胞核に組込まれたおよそ５００コピーのＨＰＶ １６を有するＣａｓｋｉ細胞のパラフィンに埋込まれた細胞系のカラー写真である。
【図１０】発明にかかる、細胞核に組込まれたおよそ２０〜５０コピーのＨＰＶ １８を有するＨｅＬａ細胞のパラフィンに埋込まれた対照細胞系のカラー写真である。

Claims (18)

1. 低分子量デキストラン硫酸を含んで成る自動化インシトゥハイブリダイゼーションのためのポリヌクレオチドハイブリダイゼーション緩衝液。
2. 前記デキストラン硫酸が約１３，０００の平均分子量を有する、請求項１記載のポリヌクレオチドハイブリダイゼーション緩衝液。
3. 前記低分子量デキストラン硫酸が、約８，０００から約１６，０００ＭＷまでの範囲にわたる、請求項１記載のポリヌクレオチドハイブリダイゼーション緩衝液。
4. 低分子量デキストラン硫酸の前記濃度が、ｗｔ．／ｖｏｌ．で約５％から約２５％までの範囲にわたる、請求項１記載のポリヌクレオチドハイブリダイゼーション緩衝液。
5. 前記緩衝液が、ｗｔ．／ｖｏｌ．で約５％から約８０％までの濃度を有するホルムアミドを場合によっては含有する、請求項１記載のポリヌクレオチドハイブリダイゼーション緩衝液。
6. 約ｐＨ７．３に調節された、
   ａ）ｗｔ／ｖｏｌで約５％から約２５％までのデキストラン硫酸（ＭＷ １３，０００）；
   ｂ）ｖｏｌ／ｖｏｌで約２０％から約５０％までのホルムアミド；
   ｃ）約５ｎＭから約１０ｍＭまでのトリス（１５：８５のトリス−ＨＣｌ：トリス−ＯＨ）；
   ｄ）約１ｍＭから約５ｍＭまでのＥＤＴＡ；
   ｅ）約３００ｍＭまでのＮａＣｌ；
   ｆ）約３０ｍＭのクエン酸三ナトリウム；
   ｇ）約０．０２５％から約０．０５％までのブリッジ（Ｂｒｉｊ）−３５
   を含んで成る、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション緩衝液。
7. ａ）ｗｔ／ｖｏｌで約１０％から約２０％までのデキストラン硫酸（ＭＷ １３，０００）；
   ｂ）ｖｏｌ／ｖｏｌで約４０％から約８０％までのホルムアミド；
   ｃ）約２×ＳＳＰＥ；および
   ｄ）約０．０５％のブリッジ（Ｂｒｉｊ）−３５
   を含んで成る、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション緩衝液。
8. ａ）ｗｔ／ｖｏｌで約１０％から約２０％までのデキストラン硫酸（ＭＷ １３，０００）；
   ｂ）約６×ＳＳＰＥ；および
   ｃ）約１０％のホルムアミド
   を含んで成る、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション緩衝液。
9. ａ）検査されるべき組織の切片もしくは細胞を調製すること；
   ｂ）低分子量デキストラン硫酸の存在下で、組織切片もしくは細胞の調製物をポリヌクレオチドプローブ組成物とハイブリダイズさせること（ここで、前記プローブ組成物は、標的のコーディング領域に相補的な最低１配列を含有する）；
   ｃ）ハイブリダイズされないプローブを、前記組織切片もしくは細胞の調製物から除去すること；および
   ｄ）ハイブリダイズされたプローブ−標的の組合せを検出すること
   の段階を含んで成る、標的へのポリヌクレオチドプローブの自動的ハイブリダイズ方法。
10. 前記ポリヌクレオチドプローブ組成物が、ＤＮＡプローブおよびＲＮＡプローブよりなる群から選択される、請求項９記載の方法。
11. 前記組織切片がパラフィンに埋込まれた組織切片である、請求項９記載の方法。
12. 前記組織切片が新鮮凍結された組織切片である、請求項９記載の方法。
13. 前記ポリヌクレオチドプローブ組成物が、検出可能な標識で標識される、請求項９記載の方法。
14. 前記標識が、蛍光発色団、ハプテンおよび発色剤より本質的になる群から選択される、請求項９記載の方法。
15. 検査されるべき組織の切片もしくは細胞を調製する段階が、液体に基づく調製段階を含んで成る、請求項９記載の方法。
16. 検査されるべき組織の切片もしくは細胞を調製する段階が、バックグラウンドの交差反応性シグナルを抑制するためのブロッキングＤＮＡと標的ＲＮＡもしくはＤＮＡを接触させることを含んで成る、請求項９記載の方法。
17. 前記ハイブリダイゼーション、除去および検出段階が自動化組織染色機器により実施される、請求項９記載の方法。
18. 前記プローブ組成物が固体支持体上に整列される、請求項９記載の方法。

Images