JP2005221511A - 生物学的試料からの包埋媒体の除去および自動化された染色装置における細胞コンディショニング - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本方法は、熱を使用または使用しないで、また流体を使用または使用しないで生物学的試料スライドを加熱プラットフォームと接触させ、生物学的試料から包埋媒体の除去またはエッチィングを促進することを含んでなる。本発明は、また生物学的試料の細胞コンディショニングのための自動化された方法も提供し、その際、細胞は組織化学的または細胞化学的染色方法のために試薬分子により接近されるために予備処理される。本方法は、熱を使用または使用しないで、また流体を使用または使用しないで生物学的試料を加熱プラットフォームと接触させ、生物学的試料内の組織または細胞成分への分子の接近を促進することを含んでなる。
Description
本発明の方法に使用される加熱エレメントは、生物学的試料が置かれた表面と加熱エレメントとの間の十分な接触が維持されることを要求する。
パラフィン中に包埋されている胸CHTN33、胃149G、脳、扁桃および腎臓を含む生物学的試料を、下記の手順に従って暴露した。上記の生物学的試料を含むスライドを自動化された装置〔ヴェンタナ・メディカル・システムズ社(Ventana Medical Systems,Inc.,Tuscon,AZ)〕に置き、下記の暴露プロトコールで処理した。一般に、パラフィン包埋された試料を含むスライドを65℃に6分間乾燥加熱し、次いで1xクエン酸緩衝液、脱イオン水、10mMリン酸緩衝液(pH=6.3)、または10mMトリス−HCl緩衝液(pH=7.4)、いずれも0.1%トリトンを含むもの、を用いてリンスした。
暴露プロトコール1
1.2分間インキュベーションする。
2.スライドをリンスする。
3.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップ(liquid coverslip)TMを適用する。
4.6分間インキュベーションする。
5.スライドをリンスする。
6.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
7.65.0℃に温度を上げる。
8.スライドをリンスする。
9.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
10.4分間インキュベーションする。
11.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
12.4分間インキュベーションする。
13.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
14.4分間インキュベーションする。
15.スライドをリンスする。
16.温度を42.0℃に下げる。
17.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
18.4分間インキュベーションする。
19.スライドをリンスする。
20.温度を42.0℃に下げる。
21.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
22.4分間インキュベーションする。
23.スライドをリンスする。
ホルマリン固定され、そしてパラフィン中に包埋されている腎臓Q−10および扁桃T998Dの生物学的試料を実施例1に記載したプロトコールに従って暴露した。自動化した暴露の後、生物学的試料を免疫組織化学的染色に用いられるDABパラフィンプロトコールで処理した。DAB染色のためのプロトコールは下記である。
1.2分間インキュベーションする。
2.スライドをリンスする。
3.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
4.スライドをリンスする。
5.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
6.スライドをリンスする。
7.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
8.インヒビター一滴を適用する。
9.4分間インキュベーションする。
10.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
11.一次抗体一滴を適用する。
12.32分間インキュベーションする。
13.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
14.ビオチン化Ig(Biotinylated Ig)一滴を適用する。
15.8分間インキュベーションする。
16.スライドをリンスする。
17.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
18.アビジン−HRPO一滴を適用する。
19.8分間インキュベーションする。
20.スライドをリンスする。
21.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
22.DAB一滴およびDAB H2 O2 一滴を適用する。
23.8分間インキュベーションする。
24.スライドをリンスする。
25.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
26.カッパー(Copper)一滴を適用する。
27.4分間インキュベーションする。
28.スライドをリンスする。
ラフィン中に保存し、ホルムアルデヒドを用いて処理した扁桃T998D、扁桃Ki67、E68、E7、E33、E8、E29、E15およびE68の生物学的試料を下記のプロトコールにより処理した。
暴露および細胞コンディショニング
1.2分間インキュベーションする。
2.サーモフォイル(thermofoil)温度を65.0℃に上げる。
3.6分間インキュベーションする。
4.スライドをリンスしカバースリップを適用する。
5.6分間インキュベーションする。
6.スライドをリンスしカバースリップを適用する。
7.サーモフォイル温度を100.0℃に上げる。
8.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
9.スライドをリンスする。
10.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
11.4分間インキュベーションする。
12.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
13.4分間インキュベーションする。
14.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
15.4分間インキュベーションする。
16.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
17.4分間インキュベーションする。
18.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
19.4分間インキュベーションする。
20.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
21.4分間インキュベーションする。
22.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
23.4分間インキュベーションする。
24.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
25.4分間インキュベーションする。
26.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
27.4分間インキュベーションする。
28.スライドをリンスする。
29.温度を42.0℃に下げる。
30.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
31.4分間インキュベーションする。
32.スライドをリンスする。
33.温度を20.0℃に下げる。
34.スライド体積を調整し、リキッド・カバースリップTMを適用する。
35.4分間インキュベーションする。
36.スライドをリンスする。
シティク標本溶液(Cytyk preparation solution)(ロット#01139Q)中に保存してあったHela(ロット#980427H)、Caski(ロット#980416C)およびSiha(ロット#980416S)細胞株をシティク2000装置を用いて顕微鏡スライド上に沈着させた。沈着の後、スライドをアルコール内に置き、ディスカバリー(Discovery(R))インシトゥ染色モジュール(ヴェンタナ・メディカル・システムズ社(Tuscon,AZ))で使用するまで湿潤状態の保持した。スライドを装置内に配置し、20X SSC(ヴェンタナP/N650−012)から調製した2X SSCを用いて湿潤化した。最近はDepar30と呼ばれる細胞コンディショニングプロトコールでスライドを処理し、これでは、スライドを2X SSCを用いてリンスし、スライドの温度を95℃に約30分間上げる。次いでスライドを37℃に冷却し、APKウオッシュ(R)を用いてリンスし、次いでインシトゥ染色処理する。
湿潤負荷スライド
1.適用をスキップし、そして2分間インキュベーションする。
2.スライドをリンスする(2X SSC緩衝液)(スライドを65℃に加温する)
3.スライド体積を調整し、カバースリップを適用する。
4.適用をスキップし、そして6分間インキュベーションする。
5.スライドをリンスする(2X SSC緩衝液)(スライドを95℃に加温する)。
6.スライド体積を調整し、次いでカバースリップを適用する。
7.スライドをリンスする。
8.スライド体積を調整し、次いでカバースリップを適用する。
9.適用をスキップし、そして4分間インキュベーションする。
10.スライド体積を調整し、次いでカバースリップを適用する。
11.適用をスキップし、そして4分間インキュベーションする。
12.スライド体積を調整し、次いでカバースリップを適用する。
13.適用をスキップし、そして4分間インキュベーションする。
14.スライド体積を調整し、次いでカバースリップを適用する。
15.適用をスキップし、そして4分間インキュベーションする。
16.スライド体積を調整し、次いでカバースリップを適用する。
17.適用をスキップし、そして4分間インキュベーションする。
18.スライド体積を調整し、次いでカバースリップを適用する。
19.適用をスキップし、そして4分間インキュベーションする。
20.スライド体積を調整し、次いでカバースリップを適用する。
21.適用をスキップし、そして4分間インキュベーションする。
22.スライドをリンスする(2X SSC緩衝液)(スライドを37℃に加温する)。
23.スライド体積を調整し、次いでカバースリップを適用する。
24.適用をスキップし、そして4分間インキュベーションする。
25.スライドをリンスする(APKウオッシュ)。
26.スライド体積を調整し、次いでカバースリップを適用する。
ホルマリン固定しパラフィン包埋された細胞株Caski(R96−1050A)およびSiha(R96−96−C2)を含むスライドをヴェンタナ標的スライド上で染色した。スライドを装置上に乾燥負荷し、スライド温度を65℃に上げた。Depar30プロトコールで処理し、これによると、スライドを65℃で2x SSC緩衝液を用いてリンスし、次いで95℃に40分間加熱した。次いでスライドを37℃に冷却し、APKウオッシュを用いてリンスした。この時点で下記のインシトゥプロトコールを実施した。
インシトゥプロトコール: Tubbs1
(ダコ(Dako)TBST#3360を非−プローブ 段階の間のヴェンタナAPKウオッシュに置換した)
プロテアーゼ消化: プロテアーゼ2、4分間、37℃
インヒビター段階: DABキットからのヴェンタナインヒビター、32分 間、37℃
プローブ: エンゾHPVバイオ・プローブ16/18
対照プローブ: エンゾHPVバイオ・プローブ6/11
変性: 95℃、8分間
ハイブリダイゼーション: 37℃、64分間
二回ストリンジェント洗浄: 2XSSC、60℃、それぞれ8分間
第三回目ストリンジェント洗浄:2XSSC、37℃、4分間
プローブ検出: ストレプタヴィジンHPRO
(ダコ・ジーンポイント(GenPo int)#K 0620)
増幅: ビオチン化チラミド(Biotinyl
Tyramide)
(ダコ・ジーンポイント#K0620)
検出: ストレプタヴィジンHPRO
(ダコ・ジーンポイント#K0620)
または
ストレプタヴィジン・アルク・フォス
(ベクター#SA5100)
色原体: DAB(ダコ・ジーンポイント#K0620)
または
ヴェンタナNBT/BCIP(キットP/N)
または
ヴェンタナ・ナフトール/ファスト・レッド
(キットP/N)
実施例2中に記載したDAB染色のためのプロトコールをこの実施例で使用した。
冷凍扁桃ブロック297Cおよび297Dは、各ブロックから切片6個を切り取り、試料を顕微鏡スライド上において調製した。各ブロックからのスライド4枚をディスカバリーTMインシトゥ・モジュール上に配置し、プロトコールDepar10で処理した。
Claims (12)
- 細胞コンディショニングを与える間に、生物学的試料から包埋媒体を同時除去する自動化された方法において、
生物学的試料に脱パラフィン化および細胞コンディショニング試薬を適用し、そして
熱を生物学的試料にかけて包埋媒体を効果的に溶融して分離し、ここで包埋媒体は脱パラフィン化および細胞コンディショニング試薬に不混和性であり、後に検出するエピトープおよび/または標的を十分に暴露する
段階を含んでなる自動化された方法。 - 熱をかける段階が約37℃〜約100℃の範囲内の温度に生物学的試料を加熱することを含む請求項1記載の自動化された方法。
- 脱パラフィン化および細胞コンディショニング試薬が、脱イオン水、クエン酸緩衝液(pH6.0〜8.0)、トリス−HCl緩衝液(pH6〜10)、リン酸緩衝液(pH6.0〜8.0)、SSC緩衝液、APKウォッシュ(Wash)TM,酸性緩衝液または溶液(pH1〜6.9)、塩基性緩衝液または溶液(pH7.1〜14)、鉱油、ノルパール(Norpal)、カノーラ油、およびPAG油からなる群より選ばれる、請求項1記載の自動化された方法。
- 脱パラフィン化および細胞コンディショニング試薬が、トリトン(Triton)X−100、トゥイーン(Tween)、ブリジ(Brij)、ドデシル硫酸ナトリウムおよびサポニンからなる群より選ばれるイオン性または非イオン性界面活性剤を含む、請求項1記載の自動化された方法。
- 不混和性脱パラフィン化および細胞コンディショニング試薬の適用に先立って、包埋媒体を含有する生物学的試料を包埋媒体の融点またはそれ以上の温度に加熱し、
液化された包埋媒体と生物学的試料から分離するために生物学的試料に、液化された包埋媒体の密度より大きい密度の脱パラフィン化および細胞コンディショニング試薬を適用し、そしてその後、
生物学的試料から液化された包埋媒体を洗い流す
段階を含んでなる請求項1記載の自動化された方法。 - 包埋媒体がパラフィンである請求項5記載の方法。
- 不混和性液体が水を含む請求項5記載の方法。
- 不混和性液体が洗浄剤を含む請求項5記載の方法。
- 洗浄剤がイオン性または非イオン性界面活性剤を含む請求項8記載の方法。
- イオン性または非イオン性界面活性剤が、トリトン(Triton)X−100、トゥイーン(Tween)、ブリジ(Brij)、ドデシル硫酸ナトリウムおよびサポニンからなる群より選ばれる請求項9記載の自動化された方法。
- 脱パラフィン化および細胞コンディショニング試薬が、脱イオン水、クエン酸緩衝液(pH6.0〜8.0)、トリス−HCl緩衝液(pH6〜10)、リン酸緩衝液(pH6.0〜8.0)、SSC緩衝液、APKウォッシュ(Wash)TM,酸性緩衝液または溶液(pH1〜6.9)、塩基性緩衝液または溶液(pH7.1〜14)、鉱油、ノルパール(Norpal)、カノーラ油、およびPAG油からなる群より選ばれる、請求項8記載の方法。
- 熱をかける段階が、約37℃〜約100℃の範囲の温度に生物学的試料を加熱することを含む請求項5記載の方法。
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