CN103328981B - 用于自动化可重复使用的平行生物反应的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

一种方法，包括以磁性方式将携带生物材料（例如核酸，它可以呈DNA片段或扩增的DNA的形式）的一个珠粒保持在一个基质的一个特定的位置中，并且向该珠粒施加一个局部电场以分离该生物材料或者该生物材料的反应的多种产物或副产物。例如，将该珠粒与具有缔合的生物材料的其他珠粒分离。在不同的实施例中，该电场将用于一个扩增或测序反应的多种试剂集中，和/或将多种可检测的反应副产物集中并且分离。例如，通过分离在多个单独的珠粒周围的多个核酸，该电场可以允许进行克隆扩增，作为乳液PCR的一种替代方案。在其他实施例中，该电场分离出接近该珠粒的一个纳米传感器，以有助于检测以下各项中的至少一项：局部pH值变化、局部导电性变化、局部电荷浓度变化以及局部热量。这些珠粒可以呈一系列局部化磁场区域的形式被捕获。

Description

用于自动化可重复使用的平行生物反应的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求以下美国临时申请的优先权和权益，即：2010年10月4日提交的题为“用于多核苷酸提取、扩增以及测序的整合系统和方法(Integrated System and Methodsfor Polynucleotide Extraction,Amplification and Sequencing)”的序列号61/389,490；2010年10月4日提交的题为“用于无乳液多核苷酸扩增和测序的磁性阵列(MagneticArrays for Emulsion-Free Polynucleotide Amplification and Sequencing)”的序列号61/389,484；2011年2月15日提交的题为“无腔室基因电子测序技术(Chamber-Free GeneElectronic Sequencing Technologies)”的序列号61/443,167；以及2011年5月27日提交的题为“用于核酸测序的方法和系统(Methods and Systems for Nucleic AcidSequencing)”的序列号61/491,081，各案通过引用以其全文结合在此。
有关联邦政府资助的研究和开发的声明
本发明是借助由IRS所授予的治疗开发补助金(Qualifying TherapeuticDiscovery Grant)在政府支持下与美国卫生和公众服务部(Department of Health andHuman Services)协力完成。美国政府在本发明中享有某些权利。
背景
用于快速并且成本有效地进行DNA测序(例如以高通量)的方法仍然是不断进步的个性化药物和诊断测试的一个重要方面。用于DNA测序的一些已知的系统需要将DNA样品在不同的子系统之间(例如在核酸分离子系统与扩增子系统之间)转移，从而造成低效率和潜在的污染。用于DNA测序的一些已知的方法采用了光学检测，这可能是繁琐、昂贵的，并且会限制通量。其他系统利用了一些电子传感形式，但是传感器和测序流槽是一次性使用的抛弃式物品，这基本上增加了使用者的成本，并且限制了可能成本有效地制造的该传感器的复杂性，因为它将在单次使用之后被扔掉。一些系统利用了在同一个流槽内进行的扩增方法，在该流槽中进行测序，将扩增物直接结合到该流槽，从而阻止了重复使用。其他系统利用了乳液PCR，其中在利用低浓度情况下，将珠粒与样品混合成小乳液。由于泊松分布，故大部分珠粒与样品不会集合成一种具有单个珠粒和单个样品的乳液，并且因此造成损失。这些珠粒的成本占到了测序成本中的一个相当大的部分，而且该成本的大部分被浪费掉了，而未曾产生任何有用的数据。当前的系统能够利用实际上所有的样品并且能够重复使用这些珠粒，从而降低了使用者的成本。
当前的多种DNA测序系统典型地需要进行全基因组扩增，以便具有足够的样品，因为该样品的利用效率非常低。此类全基因组扩增方法在对该基因组的不同部分进行扩增时典型地引入了相当大量的偏差，并且需要更高的覆盖水平来克服所述偏差。用于将样品和试剂局限于可能发生所希望的反应或结合的一种体积中的多种方法是针对该系统所构想的另一个方面，这可以消除或降低对于全基因组扩增的需要，并且由此降低所需的覆盖率。
因此，对于用于进行多核苷酸提取、扩增以及测序的改进的系统和方法存在一种需要。
概述
在此描述的多个实施例涉及用于对多核苷酸进行提取、扩增以及测序的多种系统和方法。在一些实施例中，这些系统和方法可以包括一种完全自动化的经过整合的平台，由此降低成本，提高通量和/或简化使用方法。
在一个方面，本发明提供了一种用于分离一个反应(例如核酸扩增或测序反应)的生物材料、反应物和/或反应副产物的方法。该方法包括将一个携带生物材料(例如核酸，它可以呈DNA片段或扩增的DNA的形式)的珠粒以磁性方式保持在一个基质的一个特定位置中，并且对该珠粒施加一个局部电场以分离该生物材料或者该生物材料的反应产物或副产物。例如，将该珠粒与具有相关生物材料的其他珠粒分离。在不同的实施例中，该电场将用于一个扩增或测序反应的多种试剂集中，和/或将多种可检测的反应副产物集中并且分离。例如，通过分离在多个单独的珠粒周围的多个核酸，该电场可以允许进行克隆扩增，作为乳液PCR的一个替代方案。在其他实施例中，该电场分离出接近该珠粒的一个纳米传感器，以有助于检测以下各项中的至少一项：局部pH值变化、局部导电性变化、局部电荷浓度变化以及局部热量。这些珠粒可以呈一系列局部化磁场区域的形式被捕获。
在另一个方面，本发明提供了一种用于进行核酸扩增和/或测序的方法。该方法包括施加一个电场用于将一种生物材料限制于一个环境中，并且对该生物材料进行核酸扩增和/或核酸测序。经由该电场从外界环境对该环境进行限制具有将该生物材料分离到多个区域中的作用。该限制产生了一个虚拟孔，有助于进行扩增和/或检测，并且防止多个虚拟孔之间发生污染。在不同的实施例中，将该生物材料与多个珠粒缔合，并且通过一个局部化磁场将这些珠粒在合适的位置保持在该多个区域中的每一个中。在某些实施例中，在这些虚拟孔内进行扩增会产生与这些珠粒中的每一个缔合或在一个传感器的表面上的一个克隆DNA群。
在另一个方面，本发明提供了用于将一个携带扩增的核酸的珠粒群与一个不携带扩增的核酸的珠粒群分离的一种自动化方法。该方法包括基于与这些珠粒缔合的电荷来分离这些珠粒群。该分离可以用电泳来实施。该珠粒分离可以是基于一种流过式机制，并且这些珠粒可以在随后的扩增反应中重复使用，例如通过对这些珠粒进行处理以去除任何扩增的产物和/或引物。
在又其他方面，本发明提供了一种用于从生物材料中纯化出DNA片段的方法。该方法包括在一个流体环境中施加一个电场，所述流体环境至少部分地包含一种过滤介质。在这个方面，该电场被适配用来在将一种生物材料输送穿过该过滤介质时从该生物材料中分离出一个DNA片段。在不同的实施例中，该过滤介质是一种多孔膜或与该生物材料的其余部分相比，提供这些DNA片段的不同的迁移率的一种介质。一旦纯化，这些DNA片段就可以被用于例如使用在此描述的多种方法和系统进行的DNA文库构建、DNA扩增、DNA富集和/或DNA测序。
在仍另一个方面，本发明提供了一种用于对从生物材料中分离的DNA进行剪切的方法。该方法包括将多个粒子安置在包含一群DNA分子的一个流体环境中，并且使这些粒子在该流体环境中流动以在这些DNA分子上产生一个剪切力，以便产生多个DNA片段。在此类实施例中，该剪切力产生了多个钝端以帮助随后的文库构建。
在另一个方面，本发明提供了一种用于核酸扩增和/或测序的系统。该系统包括一个基本上呈平面的基质，该基质与用于使一种核酸结合于该基质的一个部分连接；和用于从该基质分离该核酸使得该系统可重复用于核酸扩增和核酸测序中的至少一项的一个工具。在扩增期间，该系统在该基质的表面上产生多个核酸克隆。扩增可能涉及加热循环亦或通过等温扩增。在不同的实施例中，该系统另外包括用于检测一种核苷酸在一个测序反应中的合并的一种仪器。该检测可以是基于以下各项中的至少一项：局部pH值变化、局部热检测、局部电容变化以及局部电荷浓度和局部导电性变化。
在一些方面，本发明提供了一种用于检测生物材料或者生物反应产物或副产物的系统。该系统包括一个基本上呈平面的传感器阵列，该传感器阵列包括用于捕获与该阵列中的每一纳米传感器邻近的一个珠粒的一个工具。该纳米传感器能够检测生物材料或者一种生物反应产物或副产物。该系统另外包括用于例如通过磁性、化学、酶促手段释放一个珠粒以有助于该阵列的重复使用的一个工具。
在此描述的这些方法和系统的一些实施例中，一种设备包括一个基质、一个多孔构件以及一个电极。该基质限定了一个被配置为容纳一个样品的微流体通道。该多孔构件被至少部分地安置在该微流体通道内。该电极被配置为产生一个电场，并且与该微流体通道连接，这样使得该多孔构件的至少一部分可以被安置在该电场内。该多孔构件与该电场可以协作地配置，使得在将该样品输送穿过该多孔构件时可以从该样品中分离出一种核酸。
在一些实施例中，一种设备包括一个基质、多个粒子以及一个流动机构。该基质可以限定一个微流体通道，该微流体通道被配置为接受包含多个DNA分子的一个样品。在其他实施例中，该设备可以被用作一种探针并且插入到一个孔或其他流体环境中。该多个粒子可以被配置为安置在该微流体通道内。该用于产生流动的机构可以被配置为在该微流体通道内产生该样品和该多个粒子的流动，以使得该多个粒子在该多个DNA分子上产生剪切力，从而产生多个DNA片段。在一些实施例中，由具有正交控制和流动通道的多个流体门制成的一种芯片上蠕动泵(阀门科技公司(Valve Technology))，或外部压力可以在该通道中产生所需的流动。
本发明提供了多种磁性阵列以及使用这些磁性阵列进行多核苷酸扩增和序列分析，由此提供快速、便利和/或低成本DNA测序的方法。
附图简要说明
图1A示出了多个珠粒和可以用于捕获这些珠粒的具有多个传感器的一个磁性阵列。
图1B示出了在该磁性阵列上所捕获的与这些传感器一一对应的珠粒。
图1C示出了在已洗掉珠粒之后准备用于下一样品的传感器阵列。
图1D示出了与一组非球形磁性粒子一起使用的一个传感器阵列的示意图。
图2A-图2B示出了加载有多个珠粒的根据一个实施例的一个磁性阵列的显微照片
图3和图4是将多个核苷酸合并到一个不断生长的DNA链中所涉及的反应的示意性图解，示出了焦磷酸盐的释放以及伴随的pH值增大和热释放。
图5A示出了与该测序系统的微流体通道电连通的一系列纳米传感器的示意性图解。
图5B描绘了一个图表，示出了经由一个测序设备进行的测序操作的输出。
图6示出了一个电子传感器阵列，这些电子传感器具有一组电极，用于将多个带电荷部分集中或限制在这些传感器上方。
图7示出了将其保持在位用于在一个传感器上测序的一个克隆珠粒的磁性或电或电磁保持作用。
图8A描绘了包括纳米传感器在内的一部分测序系统的图像。
图8B示出了一个纳米传感器以及与该测序系统的微流体通道电连通的一系列纳米传感器的示意性图解。
图9示出了在测序系统内的一个纳米传感器阵列的示意性图解。芯片上扩增是任选的。
图10描绘了一种示例性测序芯片的多个部件。
图11示出了由模拟得到的电力、一个示意性实施例以及一个浓度图。
图12示出了由模拟得到的处于电极上方的水平交叉线处的流线型电场和电位。
图13示出了在通过一个磁性阵列保持的多个珠粒上的DNA的荧光显微照片。
图14示出了一个传感器，该传感器具有多个电极以用于产生电泳集中/限制场来吸引一个样品分子并且限制扩增反应，以及该传感器在扩增反应中的用途。
图15示出了一个一一对应的电限制电极与传感器的阵列。
图16A示出了一组附接有克隆DNA的珠粒以及一个传感器和磁性阵列。
图16B示出了被捕获的该组珠粒，其中每个被捕获的覆盖有DNA的珠粒在传感器上保持在位。
图16C示出了第二组珠粒以及部分地填充有多个珠粒的一个传感器和磁性限制阵列。
图16D示出了通过图16C的一个传感器和磁性限制阵列捕获的两组珠粒。
图17示出了一个传感器，该传感器具有多个电极以用于产生用于扩增和测序反应的电泳集中/限制场
图18A-图18B图示了一种珠粒分离系统的一个实施例的不同视图
图19是根据一个实施例的用于对多核苷酸进行提取、扩增以及测序的一种整合的平台的示意性图解。
图20-图24示出了用于对多核苷酸进行提取、扩增以及测序的整合的平台的微流体部分的多个实施例。
详细描述
如在此使用，“珠粒捕获特征”可以意指这样一些特征，该等特征可以将单个珠粒相对于传感器暂时地保持在一个固定位置，并且可以包括在基质上的局部磁性结构，即，可以利用一个外磁体、局部磁性结构、范德瓦尔斯力或重力作为固定一个珠粒的位置的力的凹陷。任选地，可以使用共价或非共价结合将珠粒结合在位。
如在此使用，“克隆”可以意指基本上所有的珠粒或粒子群都具有相同的核酸序列。在一些实施例中，可以存在两个与单个样品DNA片段有关的群体，如“末端配对法(matepair)”、“配对末端法(paired ends)”或其他类似的方法所希望的；这些群体可以按大致类似的数目存在于珠粒或粒子上，并且可以随机地分布于珠粒或粒子上。
如在此使用，“限制”可以意指在一个珠粒或粒子上产生的一个分子(例如DNA)保持与同一珠粒或粒子缔合，从而基本上维持这些珠粒或粒子的克隆性质的情况。
如在此使用，“分离”可以意指根据需要防止从一个虚拟孔迁移、扩散、流动或通过其他运动到另一个虚拟孔，以维持这些珠粒或粒子的克隆性质。
如在此使用，“局部化磁性特征”可以意指在一个基本上呈平面的基质上产生的用以将单独的珠粒保持在所述基本上呈平面的基质上的一种磁性特征。
如在此使用，“局部化磁场”可以意指基本上存在于一个第一磁性区域的北极与一个第二磁性区域的南极之间的体积中或基本上存在于单个磁性区域的北极与南极之间的体积中的磁场。
如在此使用，“局部化电场”可以意指基本上存在于至少两个电极之间的体积中的电场。
如在此使用，“纳米传感器”可以意指被设计用于检测小于以下各尺寸中的一种的多个珠粒或粒子(如关于非球形珠粒或粒子的直径或长轴所测量)的一种传感器：0.1、1、5、10或20微米。可替代地，该传感器可能对与所述珠粒或粒子或与反应产物或副产物(其中该反应包括与所述珠粒或粒子缔合的一个部分)缔合的多个部分敏感。所述部分可以包括DNA片段、氢离子，或作为平衡离子并且因此与所述珠粒或粒子或者跟所述珠粒或粒子结合或缔合的多个部分缔合的其他离子。
纳米传感器可以包括"NanoBridge、"NanoNeedle、ISFET、ChemFET、纳米热量计或基于悬臂的pH值传感器，或其组合。
如在此使用，“粒子”可以意指非球形部分，例如分子、分子的聚集体、结合于固体粒子的分子，或粒子，以及本领域中已知的其他形式。
如在此使用，“单相液体”是一种整体具有相对均一的物理特性(包括如密度、折射率、比重等特性)的液体，并且可以包括水溶液、可混溶的水溶液以及有机混合物，但不包括不可混溶的液体，例如油和水。在被认为不会潜在地使一种液体被视作不是单相液体的物理特性中包括有pH值、电荷密度以及离子浓度或温度的局部变化。
如在此使用，“基本上呈平面”应当允许小基座、凸起段、孔洞、凹陷，或相对于器件的局部平面不超过50μm的不平度。因翘曲、扭转、深拉或其他平面变形所致的变化不被视为构成所允许的偏差的一部分。对于在此描述的多种用途并非是必要的，但超过50μm的突起或凹陷不会妨碍到将一种器件视作是基本上呈平面的。具有大于50μm尺寸的流体通道和或用以产生所述流体通道的结构也不会妨碍到将一种器件视作是基本上呈平面的。
如在此使用，“虚拟孔”指的是局部电场或局部磁场限制区，其中感兴趣的种类或种类组，典型地为DNA或珠粒，在所希望的反应或相互作用必需的一段时间期间基本上不会迁移到相邻的“虚拟孔”中。
在本发明的一些实施例中，本发明提供了用于进行测序化学的一种自动化的可重复使用的系统。在一些实施例中，由该系统进行的化学方法可以包括通过合成进行测序，这在图3中示意性地示出，其中dNTP结合于一种复合物，该复合物可以包括一群DNA、互补引物以及聚合酶。该聚合酶将该dNTP合并到不断生长的延伸的引物中，并且产生所述合并氢离子、焦磷酸盐以及热量作为副产物，这些副产物可以通过电子传感器来检测。通过确定是否发生了一个碱基合并，或是否发生了多处合并，并且了解在进行此种合并之前递送了哪些试剂，可以确定DNA的序列
磁性阵列
本发明提供了多种磁性阵列以及使用这些磁性阵列进行多核苷酸扩增和序列分析，由此提供快速、便利和/或低成本DNA测序的方法。该磁性阵列可以包括一个基质，该基质在其上面具有多个磁性区域，从而形成该阵列，这些局部化磁场足以捕获如在此描述的磁性珠粒。这些局部化磁性特征可以是由一种永磁材料(例如铁磁性的)形成，或可以是非永久性的并且通过电场而被磁化(并消磁)。
该阵列可以是由任何已知的基质材料形成，如例如美国专利号7,682,837中所描述，该专利通过引用结合在此。在某些实施例中，该基质材料可以包括以下各项中的至少一项：硅、基于硅的材料、玻璃、改性或官能化的玻璃、塑料、金属、陶瓷塑料或其组合。该基质总体上是一种非磁性材料。
这些局部化磁性特征可以是用永磁材料(例如铁磁性的)产生的，或可以是非永久性的(例如电磁感应区域)。在某些实施例中，该多个局部化磁性特征可以是由一种磁性材料形成，并且每个区域可以是基本上均一的大小和形状，以由此形成一个阵列(例如网格样图案)，并且因此可以形成多个或一系列局部化磁性特征。在其他实施例中，这些磁性特征可以是不均一的。在多个示例性实施例中，这些磁性特征可以是磁棒，它们可以至少部分地由一种磁性材料形成，该磁性材料包括例如铝、钴、钐、钕、硼、铜、锆、铂、铬、锰、锶、铁和/或镍，并且包括其合金，并且这些磁棒可以包括其他材料和元素。在一个实施例中，这些磁性特征可以至少部分地由镍与铂(例如约50％-50％)的合金或钴与铂(80％Co，20％Pt)的合金或钴、铬与铂的合金形成。这些局部化磁场可以被包含在基质上的多个孔内，或可替代地，该基质不包含孔，从而允许多种扩增或测序试剂在基质表面上自由地流动，由此简化了多种试剂的连续添加和控制(例如连续添加NTP用于进行测序)，这可以直接改进长读长测序的移相和信噪比。
在另一个实施例中，孔结构、凹陷、突起，或限制一个珠粒或粒子的移动的其他手段可以与局部化磁场组合利用以将珠粒或粒子保持在一个固定位置上，从而形成一个珠粒捕获特征。
可以使用不同的制造方法来产生这些局部化磁性特征(例如磁棒)。在某些实施例中，这些局部化磁性特征或棒具有尖锐的边缘，它们可以通过对磁层进行光刻并且接着进行溅镀来制造。在其他实施例中，这些局部化磁性特征(例如棒)可以是通过对磁层进行溅镀/涂布，随后进行光刻，并且接着进行离子研磨以蚀刻掉过量材料并且产生尖锐的或呈特定角度的边缘来制造。在一些实施例中，该制造可以利用多层抗蚀剂刻蚀法。
这些局部化磁性特征可以被配置为处于一种单域状态。这些局部化磁性特征可被制造成具有多个层，在一种铁磁性材料与由另一种材料(例如铬)制成的中间层之间交替变化，以便改进该多层磁性结构的矫顽磁性。除这些交替层之外，还可能存在由例如钽、MgO或如本领域中已知的其他适当材料等材料制成的一个种子层和一个保护层。可以存在多个交替层，例如2到40层，例如2到4层、5到10层、10到16层，或16到30层，或32层或更多层。晶粒取向可以与这些局部化磁性特征上的长轴平行。对于每一层来说，这些层的厚度可以在5nm到15nm或更多内变化。
在一些实施例中，这些局部化磁性特征可以是矩形棱柱，具有约20微米的长度，具有一到2微米的宽度，并且当该珠粒的直径是4.5微米时，用于保持一个珠粒或粒子的间距可以是2到3.5微米。这些长度、宽度以及间距都可以针对更大或更小的珠粒或粒子而酌情按比例增大或减小。例如，对于一个2.8微米的珠粒，这些局部化磁性特征可以具有10微米的长度、1到2微米的宽度以及从1.25到2.5微米的用于保持所述珠粒或粒子的间距。
该阵列可以是一个高密度或低密度阵列。这些阵列总体上包含至少100个磁性区域/mm2，并且在某些实施例中，包含至少1,000个局部化磁性特征/mm2，并且在某些实施例中包含至少100,000个局部化磁性特征/mm2。该阵列可以包含至少1,000、2,000、4,000、5,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000或100,000,000个或更多个局部化磁性特征。
这些局部化磁场可以足以捕获(通过磁力)具有50μm或更小的大小的磁性粒子。在某些实施例中，这些局部化磁场可以足以捕获具有20μm或更小、5μm或更小、500nm或更小，或50nm或更小的大小的磁性粒子。在某些实施例中，这些珠粒具有从约3μm到约5μm的直径，并且在其他实施例中，这些珠粒具有从约0.5μm到3μm的直径。这些磁性粒子可以具有铁磁性、顺磁性或超顺磁性，并且合适的材料是熟知的，如美国专利号7,682,837中所描述。这些珠粒可以通过(例如)经由一个具有从约5μm到50μm(例如约15μm)的高度的通道流动而移动到该阵列中。该通道的宽度可以变化，但是在一些实施例中可以是从约500μm到1mm，例如约800μm。在其他实施例中，该通道宽度可以是从1mm到20mm或更多。在一些实施例中，该通道可以具有多个支撑柱或肋材以更好地控制高度。在其他实施例中，可以利用平行通道，或用以向单个样品提供更多的阵列位置，或用以容纳多个样品。
在其中利用了多个磁性珠粒或粒子而未使用磁性阵列的本发明的一些实施例中，所述磁性珠粒可以按均一的间隔自组装成一个单层。在其他实施例中，这些自组装的珠粒或粒子可以是无磁性的。在一些实施例中，与传感器相关联的凹陷可以有助于一一对应并且可以使这些珠粒与这些传感器之间更好地对准，从而允许更好地进行检测。在使条件适合于结合之后，缓慢地平移或移动这些珠粒可能是适当的，以便使这些珠粒能够与这些传感器对准。此种平移或移动可以在多个维度(这些维度可以包括x、y、θ)上进行，并且可以具有在时间和距离方面不同的移动以适应这些传感器的间隔和这些珠粒的大小。在其他实施例中，可以使用一种环形流体移动以确保高珠粒装载率。
在具有多个深孔的设计中，珠粒或粒子可能无法充分地接近流体流。在一些实施例中，这些珠粒或粒子更易接近流体流，因为它们可以在器件的表面上方突出。作为结果，这些珠粒可以更快地对多种试剂的引入起反应，从而允许更好、更快并且更高效地进行洗涤和反应。
图1A示意性地图示了向磁性阵列104A中添加珠粒102。图1B示意性地图示了所述珠粒与阵列104B上的多个保持区域一一对应的定位。图1C示出了在已洗掉这些珠粒之后准备用于下一样品的传感器阵列。
图1D图示了本发明的不同的实施例，其中磁性、顺磁性、非磁性粒子或其组合可以具有除球形以外的形状以用于具有磁性保持作用的传感器阵列104C、未示出的具有电限制作用的传感器阵列亦或具有自组装的粒子的传感器阵列104D。在一个实施例中，所述粒子可以是基本上呈平面的。这些基本上呈平面的粒子可以呈圆形、矩形106A、星形、六角形106B或呈另一种形状。在其他实施例中，该粒子可以呈树枝状，包括由一种自组装的3D DNA网状结构形成的一种树枝状结构，从而扩大了所述粒子的表面积。所述树枝状粒子可以总体上呈球形、基本上呈平面、椭圆形或任何其他形状。在一些实施例中，引物可以附接所述树枝状粒子。在其他实施例中，DNA纳米球可以附接到树枝状粒子或其他类型的粒子或珠粒。在仍其他实施例中，所述粒子可以是多孔或部分地多孔的；如果所述粒子是多孔或部分地多孔的，那么孔径可以是足够的大小以允许DNA、聚合酶、dNTP以及其他部分自由移动，而这是引物延伸测序或其他适当的应用所必需的在利用了术语珠粒的所有地方，可以假定的是，它可以具有在此描述的任何形状。
图2A和图2B是如在此不同的实施例中所描述的填充有多个磁性珠粒的多个局部化磁性阵列的显微照片，图示了可达到的常规地高占有率水平并且图示了本发明的另一个实施例，其中单个磁性或顺磁性珠粒可以在合适的位置保持在磁性阵列中的单个位置。所述珠粒可以调节尺寸以使得在每个传感器上可以有足够的空间仅供一个珠粒用，从而提供阵列位置与珠粒之间的一一对应。虽然在每个传感器上的空间仅可以供一个珠粒用，但当这些珠粒可以接近于传感器进行对准时，珠粒之间可以存在一段额外的距离，从而减少了传感器之间的串扰。例如，一组珠粒可以是10微米的直径，位于可以是8微米宽的多个传感器上，并且这些传感器可以相距15微米，从而使这些珠粒之间有5微米的间隔。这些传感器的大小可以大于这些珠粒，只要在该传感器上方的空间不足以保持两个珠粒即可。这些珠粒、传感器以及间隔的大小可以变化。在其他实施例中，珠粒的大小可以大于10微米，例如15微米、20微米、25微米或更大。在另外的实施例中，这些珠粒可以小于10微米，例如5微米、3微米、2微米、1微米或小于一微米。这些传感器可以调节尺寸以与这些珠粒的大小对准，并且因此其大小可以大于或小于8微米宽，潜在地在小于一微米到1、2、3、5、10、15、20微米或更宽的范围内。这些传感器之间的间隔也可以大于15微米，或可以小于15微米；传感器之间的传感器间隔可以在小于一微米到1、2、3、5、10、15、20、25微米或更大的范围内。这些传感器可以被安排成一个正方形、矩形、六角形或其他2-D图案。虽然在此主要地针对DNA应用(包括扩增、实时PCR、测序、数字PCR、DNA杂交探针阵列)进行了描述，但是这些磁性阵列可以被用于其他应用，例如利用和或检测抗体或其他蛋白质的多种应用或方法。
在用4.5μm直径的磁性珠粒的一些实施例中，0.07mm/sec-0.14mm/sec的流速可能是进行珠粒装载以允许通过局部化磁场捕获所希望的。1.4mm/sec-4.2mm/sec的流速可能是进行试剂递送以防止这些磁性珠粒移出所希望的。流速>5.6mm/sec可能是进行珠粒去除所希望的。在其他实施例中，可以利用气泡的使用来去除这些珠粒。在更高和更低的流速下可以使用更大和更小的珠粒，不过关系可能不呈线性。
其他重复使用方法
在完成了一组测序循环之后，可以去除并且替换引物。可以改变缓冲条件以削弱生物素抗生物素蛋白链菌素键，例如低pH值的高浓度GuHCl；作为替代方案，可以升高温度到超过70C，以使生物素抗生物素蛋白链菌素键断裂。还可以将更低温度与低离子强度缓冲液(例如具有微摩尔浓度的盐浓度的缓冲液)一起使用。也可以利用以上各项的组合，例如更高的温度和低离子强度缓冲液。在高温下同样可以使硫醇键断裂。因为已经完成了测序反应，所以对聚合酶和DNA造成的损害可能不再重要，因此可以利用强力的手段。在一个实施例中，可以利用多种有机试剂来破坏延伸的引物与表面之间的结合，例如共价结合。在去除了延伸的引物之后，可以使新引物流入在传感器上方的体积中，从而使该器件能够再次用于对另一组DNA样品进行另一组测序循环。所述新引物可以在一种单相液体中进行结合。所述新引物还可以具有额外的试剂被包括在包含所述引物的流体中，这些试剂协助这些引物结合或缔合于传感器。这些新引物可以用于扩增反应中以产生一个新的克隆群用于随后的序列分析，如在此描述。所述扩增可以是PCR或等温扩增。
在另外一个实施例中，一个扩增或测序阵列可以通过去除珠粒而被重复使用。所述去除可以例如通过施加一个外部磁场来实现，该外部磁场可以由永磁体的移动或电磁体的活化来产生，以将珠粒或粒子从所述扩增或测序阵列中保持它们的位置上牵拉、移动或移出。
在所述珠粒或粒子是用生物素抗生物素蛋白链菌素结合、硫醇结合、DNA、LNA、PNA或其他核酸类似物杂交等保持在位的一个替代实施例中，可以通过使接近该珠粒或粒子的温度和或流体环境改变，从而可逆地破坏该结合来实现所述结合的释放，由此新的珠粒或粒子随后可以结合或缔合于该扩增或测序阵列中。
测序
图3和图4是在将多个核苷酸合并到一个不断增长的DNA链中所涉及的反应的示意性图解，示出了焦磷酸盐的释放以及伴随的pH值的增加。如在此描述，整合的测序平台可以包括一个电子传感子系统，该子系统被配置为以电子方式检测pH值或电荷浓度或迁移率的变化以对DNA进行“电学测序”。在其他实施例中，一个电子传感子系统可以被配置为以电子方式检测由这一反应所引起的温度变化以对DNA进行“电学测序”。
图5A描绘了两组珠粒，一组结合或附接有多组克隆DNA，并且一组未结合或附接多组克隆DNA。这一系统允许利用未结合或缔合有克隆DNA的多个珠粒以用作一种参考物，从而去除偏差、核苷酸和其他试剂电荷、温度、流体流动和压力、缓冲液浓度变化以及有待去除的其他系统变量。如图5A中所示，在示意性系统510中，系统变量的所述去除可以至少在硬件中，使用一种模拟减法来进行。在其他实施例中，系统变量的去除可以在软件和或外部硬件中去除。在仍其他实施例中，可以利用本地硬件与软件和或外部硬件的组合。图5B描绘了所得到的数据，其中大部分假定的合并反应产生的信号水平指示反应没有发生，而一些假定的合并反应产生的信号水平指示出单个合并事件，并且其他假定的合并反应产生的信号水平指示在克隆DNA的均聚物区域中发生了多次合并事件。
在另外一个实施例中，一种电子传感子系统可以检测在本体溶液中、横跨该传感器的表面(来自结合于该传感器的多个部分或来自在该传感器表面的德拜长度内的多个部分)、横跨珠粒或粒子的表面(来自结合于该珠粒或粒子的多个部分或来自在该珠粒或粒子的表面的德拜长度内的多个部分)或其组合的导电性的变化。在又另一个实施例中，一种电子传感子系统可以检测在该传感器的表面附近或之上、在珠粒或粒子表面附近或之上的电荷变化。例如，该电子传感子系统可以检测在该传感器的表面，或者珠粒或粒子，或结合于该表面或者珠粒或粒子的多个部分的德拜长度内的电荷变化。
图6包括一个纳米传感器604以及与测序系统电连通的与微流体通道关联的一系列纳米传感器610的示意性图解。这些纳米传感器可以具有与其直接结合或缔合的克隆DNA602，并且可以具有与每个纳米传感器关联的电极或磁性元件608。在其他实施例中，该传感器可以检测在珠粒上的克隆DNA的电荷变化、与所述克隆DNA缔合的平衡离子的变化，或由合并产生的副产物。该纳米传感器604可以另外包括一个用于芯片上信号放大的信号放大器606。这些纳米传感器604可以另外包括任何已知的绝缘体材料，例如SiO2、Al2O3(Al203)、SiN以及TaO2在某些实施例中，这些纳米传感器可以包括由绝缘体层分隔的多个共轴和/或平行导电层。这些导电层可以由任何合适的材料形成，例如金、铂、铝、碳或多晶硅。
可以将多个(磁性)珠粒和DNA片段输送到测序系统中。如图7中所示，该测序系统可以包括与该测序系统内所限定的多个微流体通道连通的一系列纳米传感器708。珠粒或粒子702可以通过磁性或电极元件710而定位在所述传感器708上，这些磁性或电极元件在一些实施例中可以形成局部化磁场并且在其他实施例中可以形成局部化电场，其中传感器708和磁性元件可以被配置为与基质712相联。这些珠粒或粒子702可以具有与其结合或缔合的克隆DNA 704。然后可以提供多种试剂以引发测序反应，这些试剂可以包括多种核苷酸、引物、镁以及聚合酶706。在其他实施例中，当磁性或电极元件710是磁性元件时，它们可以是永磁性元件或电磁元件。
在其他方面，本发明提供了使用一种磁性阵列，形成如在此描述的一系列局部化磁性特征来对多核苷酸进行测序的一种方法。该方法包括使该磁性阵列与多个磁性珠粒接触，这些磁性珠粒各自附接有以克隆方式扩增的DNA区段，该DNA区段可以是单链的、部分地双链的或双链的。模板DNA无论是单链、部分地双链还是双链的，都可以通过变性而转化成单链DNA，并且可以将一个测序引物与该单链DNA杂交以准备进行测序。
在碱基读出(base-calling)之后，可以组装在该阵列上的每一位置处所记录的序列。例如，通过使用鸟枪法测序方法，其中在该阵列每一位置处的片段的身份可能是未知的，或可以基于一个参考序列(例如一个野生型序列)来组装一个多核苷酸序列。
这些克隆DNA序列可以各自具有一个单链区，充当用于核苷酸合并的一个模板。该单链区可以是至少10个碱基的长度，或在一些实施例中，可以是至少300个碱基的长度，或在其他实施例中是至少1kb的长度。本发明由此提供较长、准确并且有成本效率的读取。在一个如在此所定义的克隆群中可能存在超过一个扩增的多核苷酸群，其中不同的扩增的多核苷酸群可能具有不同的引物，由此可以针对单个克隆群内的每一扩增的群体进行独立的测序反应。
在另一个方面，该磁性阵列包括一个用于测定微环境的pH值变化的邻近的纳米传感器，该微环境包括在由局部化磁场所保持的珠粒附近的环境。在这个方面，该微阵列可以对DNA的电子测序有用。通过检测pH值的变化来进行测序的多种方法总体上描述于美国专利公开号2008/0166727中，该案通过引用以其全文结合在此。检测多核苷酸合并的多种替代方法都可以使用，包括热测序(例如，如美国专利公开号2008/0166727中所描述)、检测电荷浓度、带电物质和副产物的迁移率、以及多种已知的光学检测方法。
该磁性阵列包括一个基质，该基质在其上具有多个局部化磁性特征以形成该阵列，这些局部化磁场足以捕获在此描述的磁性珠粒。这些局部化磁性特征可以是由永磁材料(例如铁磁性)形成的，或可以是非永久性的并且通过电场而被磁化(并消磁)。
在其他实施例中，可以使用一个电场将一个珠粒或粒子保持或保留在一个位置，如在此随后将描述的。
检测器
一个磁性或顺磁性珠粒或粒子可以通过一个磁性阵列，形成局部化磁场阵列，而在合适的位置保持在一个传感区域上或接近一个传感区域。所保持的磁性或顺磁性珠粒可以具有单克隆DNA群。所述珠粒可以调节尺寸以使得每个传感器上可以有足够的空间仅供一个珠粒用，从而提供传感器与珠粒之间的一一对应。虽然在每个传感器上的空间仅可以供一个珠粒用，但当这些珠粒可以在这些传感器上对准时，珠粒之间可以存在一段额外的距离，从而减少了传感器之间的串扰。
该磁性测序阵列包括多个纳米传感器，其中至少有一个或两个纳米传感器在每个局部化磁场的附近(微环境)。这些纳米传感器具有高灵敏度以用于检测每个微环境(例如每个局部化磁场的附近)中pH值或电荷浓度的微小变化。例如，一个阵列可以包括1000个纳米传感器或更多、2000个纳米传感器或更多、4000个纳米传感器或更多、10,000个纳米传感器或更多、100,000个纳米传感器或更多、1,000,000个纳米传感器或更多、10,000,000个纳米传感器或更多，或100,000,000个纳米传感器或更多。这些纳米传感器可以包括具有两个端子的多个测量电极，足以测定相应微环境中的离子(H+)浓度增加或与DNA缔合的平衡离子增加，或者聚合反应的发生。
这些纳米传感器可以包括至少一对具有正极端子和负极端子的测量电极，这些测量电极被充分地间隔开(例如，间隔介于20nm与30nm之间)并且被构建成检测相应微环境的离子浓度变化。在其他实施例中，这些电极之间的间隔可以是100nm到500nm或者1000nm到5000nm。更具体地说，该纳米传感器可以检测微环境内由相应微环境的离子浓度改变所引起的流体的阻抗改变，该离子浓度改变是因珠粒上的生物材料与另一种材料的合并事件或化学反应的结果。在一个替代实施例中，该传感器可以是一种电阻式半导体元件，如题为“生物传感器件、系统以及其方法(Biosensor Devices,Systems and MethodsTherefore)”的美国临时专利申请号61/389,590中所描述。在又另一个实施例中，该纳米传感器可以是ChemFET或ISFET，如以下各案中所描述：美国专利号7,695,907，“基因检测场效器件和用其分析基因多态性的方法(Gene detection field-effect device and methodof analyzing gene polymorphism therewith)”；题为“使用大规模FET阵列测量分析物的方法和设备(Methods and Apparatus for Measuring Analytes Using Large Scale FETArrays)”的美国专利号7,948,015；题为“用于对DNA进行测序的pH值测量法(pHMeasurement for Sequencing of DNA)”的美国专利申请号2011/0171655；以及题为“纳米传感器阵列(Nano-Sensor Array)”的美国专利申请号13/118,044，各案通过引用以其全文结合在此。当在此利用术语纳米传感器时，它可以被认为是如上所述的一组电极，或可以是一个电阻式半导体元件，或可以是一个ISFET或ChemFET，或上述传感器的组合。
在本发明的一些实施例中，可以利用不同传感方法的组合，例如，一个NanoNeedle与一个NanoBridge，或一个ISFET与一个NanoNeedle。在一些实施例中，不同的传感器可以对与目标部分有关的不同特性进行感测。例如，NanoNeedle可以检测与目标部分结合或缔合的部分的导电性，而NanoBridge可以检测与目标部分结合或缔合的电荷。
图8A示出了一个纳米传感器阵列的显微照片，和单个纳米传感器802的放大视图。此种纳米传感器可以使用阻抗测量法以用于检测合并的核苷酸。该阻抗测量法检测由聚合反应所引起的焦磷酸盐H+离子的释放或局部电荷变化。总体而言，可以针对在反应期间的阻抗相对于在反应开始时的阻抗的最大变化来选择操作频率。例如，对于一些几何形状，该频率可以是约0.1KHz到9KHz。在多种替代的几何形状中，该频率可以是10KHz或更大。在一些实施例中，该纳米传感器可以用单对电极，用或不用pH值敏感性材料(例如氧化还原反应敏感性材料)构建，以检测反应的H+离子释放或pH值变化。可以例如通过在从-A到+A伏特扫描或反向扫描的同时用周期性子信号测定电流来获得阻抗测量结果。可以应用幅度小于A并且频率为约25Hz或更大的脉冲波。在电压扫描期间对电流进行测量可以指示在接近纳米传感器的溶液中的pH值变化。图8B示出了所述纳米传感器802阵列的示意性图解，其中一个芯片上放大器804可以与每个纳米传感器关联。
图9是在测序系统内的一个纳米传感器902阵列的示意性图解。该纳米传感器可以包括由电介质906分隔的两个电极904。虽然在图9中显示为包括一个纳米传感器阵列，但是在其他实施例中，测量可以用单个电极对进行，通过进行阻抗、电荷或电流测量来检测离子构成或pH值的变化。
该系统可以如下针对序列分析对进行校准。为了减少来自不同的环境来源的常见噪声和信号(例如热噪声、混合或流体噪声，或核苷酸电荷或其他试剂的影响)，可以将不具有DNA的一个或多个珠粒放到与涂有DNA的珠粒类似的环境中。由两个传感器(对涂有DNA的珠粒和不具有DNA的珠粒或不具有珠粒的传感器的微环境进行检测)所记录的信号之间的差示测量值显著地减少了噪声，并且使检测期间的信噪比得到改进。在一些实施例中，可以组合多个局部参考传感器以产生局部平均参考。在其他实施例中，可以使磁性特征停止，从而产生不具有珠粒的传感器位置。在一些实施例中，可以通过将一个循环中没有发生反应的一个相邻DNA珠粒与同一循环的所关注的珠粒相比较来进行差示测量。在其他实施例中，用于进行差示测量的相邻珠粒可以选自基本上同时接受流体流动的区域，或者不具有DNA或具有DNA而在该循环中没有发生反应的珠粒。在其他实施例中，可以使用对在超过单个循环内的背景信号取平均值。对该传感器与被屏蔽而不能与流体或目标部分接触或相互作用的另一个传感器进行差示测量。
在一些实施例中，与当前使用已知的系统和方法可能实现的相比，整合的测序平台可以产生更好的信噪比，降低在测序检测中由质子(H+离子)和OH-影响所引起的噪声水平和/或在虚拟孔中产生更好地分离。更具体地说，在一些实施例中，多种系统和方法可以采用一种被配置用以改进性能的缓冲介质，如上所陈述。该缓冲剂中H+(质子)离子的迁移率和扩散系数可以不同于在水中的这些系数。该缓冲剂对于H+和OH-的这些系数还可以具有不同的变化。在一些实施例中，缓冲介质可以是与水非常类似但H+的迁移率不同的一种物质，例如氧化氘(D2O或重水)或具有此官能团的任何常见物质。迁移率的差异可以减缓在聚合反应中所释放的H+离子的移动。在另一个方面，该缓冲介质可以包括对于H+离子和/或不同材料(例如DNA、核苷酸、引物或其他部分)具有不同的迁移率的材料，并且可以是一种凝胶型材料。凝胶型材料将使在该凝胶型材料内所释放的H+离子的迁移率和扩散不同，并且有助于更容易地进行检测，从而产生更好的信噪比。
为了校准系统以用于测序，并且为了确保由单独的传感器所记录的信号可以是适当并且正确的，可以将一个共同的核苷酸序列嵌入到正在进行测序的所有模板DNA链中。这个共同序列可以在扩增阶段期间通过扩增引物的设计而引入。例如，序列AATCGA可以合并到所有序列的前端处，并且可以用于对系统进行校准，从而允许每一核苷酸合并的已知读出，还允许与两个或更多个碱基的合并相对比，对单个碱基的合并进行校准。可以利用任何碱基组合，这些碱基组合可以利用全部四种碱基、三种碱基、两种碱基或单个碱基，并且可以包括单个碱基合并、两个碱基合并，或至多并且包括八个碱基在内的任何数目的碱基的合并或更多。还可以使用不同的引物作为用于编码不同样品的一种手段。
电限制和保持
在一个实施例中，一个磁性阵列可以包括多个电极，这些电极被定位成在每个局部化磁场周围产生电场，以由此将模板DNA、多核苷酸以及dNTP集中在这些局部化磁场周围(例如通过电渗力、电泳力或介电电泳力)，由此增强多核苷酸扩增或聚合反应。这些电场在PCR或测序过程期间可以在该阵列的多个区域之间产生分离作用，引导DNA链和/或核苷酸或其他带电分子朝向用于克隆PCR的珠粒，和/或引导核苷酸朝向用于进行测序的涂有DNA的珠粒。例如，多个电极可以被定位在珠粒捕获位置下方并且在围绕珠粒捕获区域的若干位置上，例如呈环形或正方形安排，由此增强聚合反应。可以在如所描述的非磁性基质上产生用于进行测序分析的磁性阵列。可以在该基质上方构建读出电路和芯片上放大器，这些读出电路和芯片上放大器可以处于像素化结构中。随后，可以制造单独的纳米传感器，它们可以与反应的微环境直接或间接地接触，如图10中所示。磁棒阵列1006产生局部化磁场以使珠粒在传感器1008的附近缔合。如图10中所示，可以在传感器层上方或下方制造任选的关联的放大器1004作为整合的器件1002的一部分。多个微流体通道可以被嵌入到该结构中。芯片可以与一个数据采集单元可操作地连接。在其他实施例中，可以利用一个局部化电场将珠粒保持在珠粒捕获特征中。在某个实施例中，这些珠粒或粒子可以是无磁性的。仍另外的实施例可以包括多个电极，这些电极被定位成在每个珠粒捕获特征、传感器或其他希望的位置周围产生电场，以由此集中模板DNA、多核苷酸以及dNTP(例如通过电渗力、电泳力或介电电泳力)，由此增强多核苷酸扩增或聚合反应。这些电场在PCR或测序过程期间可以在该阵列的多个区域之间产生分离作用，引导DNA链和/或核苷酸或其他带电分子朝向用于克隆PCR的珠粒，和/或引导核苷酸朝向用于进行测序的涂有DNA的珠粒。
图11示意性地图示了组合作用以将具有更低扩散常数的带电部分局限在所希望的体积中的一些力，包括电泳流，该电泳流可以是由外加的电场、摩擦力、静电力以及电泳力产生。示意图1108示出了电压源1118，该电压源产生了外加于电极1106上的电压，从而产生局部化电场。
该局部化电场可以包含AC和或DC分量，并且可以利用非正弦波形。所述非正弦波形可以包含三角波、方波或任何形状的波。所述非正弦波形可以在例如正弦波形的峰中包含一个“盲点”，以便使杂交结合、酶促结合、其他结合以及酶促活性在不存在潜在地干扰性电场的情况下发生。其他“盲点”可以用于例如一个方波中，其中电压可以升高到A伏特的水平，持续一段时间，并且接着降低到零伏特，持续一段时间。然后可以将电压再次升高到A伏特，继而是负A伏特的幅度。“盲点”无需是零伏特，但可以足够地降低，以使得受电场影响的不同部分之间可以发生所希望的相互作用。局部化电场对带电分子的浓度1109所产生的结果显示出相当大的梯度，该梯度由该电场所引起并且可以提供相当大的分离作用。
虽然在此主要地针对DNA应用进行描述，但是如上所述的电限制可以被用于其他应用，例如利用和或检测抗体或其他蛋白质或化学代谢物的多种应用或方法。在一些实施例中，可以在一组虚拟孔中进行除测序或扩增以外的其他反应。对于在此种应用中的实际用法，需要被分离的部分需要带电荷或与其他带电荷的部分缔合。
图12示出了由模拟1208得到的在电极上方的水平交叉线1209处由施加于电极1206的电场所产生的电位。由DC电压所产生的流线型电场1202和电位可以用于捕获靠近珠粒的多个带电荷的部分(包括DNA扩增子)并且防止其朝向下一个珠粒迁移。这一模拟是针对dNTP迁移进行。
扩增
在本发明的一个实施例中，磁棒和电极阵列提供一种无乳液方法，该方法通过用磁场和或电场分离该阵列的多个区域，在磁性珠粒上对DNA片段进行克隆地扩增。在珠粒上进行的克隆扩增已总体上描述于美国专利号7,323,305中，该专利通过引用以其全文结合在此。本发明可以采用桥式扩增法，这种方法在扩增期间将DNA链固定在珠粒、粒子或传感器的表面上，由此进一步防止DNA链扩散到其他珠粒、粒子或传感器。
在用于扩增DNA片段的一种示例性方法中，可以将磁性珠粒注射到磁棒阵列上，该磁棒阵列具有形成电场的多个电极。可以将DNA链模板(双链或单链)注射到腔室中，使其以达到每个珠粒分布所希望的DNA链的目的的浓度经过这些珠粒，由此允许克隆扩增进行。在某些实施例中，为了确保不会产生多克隆区域，输入DNA的浓度需要足够低以使得大部分传感器区域具有一个或零个样品DNA分子。然后可以将dNTP和DNA聚合酶注射到腔室中，并且它们可以借助于如所描述的电场而集中在珠粒的周围。用于扩增的DNA引物可以在任何步骤提供，例如在添加dNTP和/或聚合酶时，或与DNA模板一起提供。固定在珠粒上的DNA片段可以通过PCR或等温扩增进行扩增。在双链DNA是起始物质的情况下，该扩增过程的第一个步骤通过使双链片段“熔融”，随后进行引物退火和延伸步骤，并且进行重复的加热冷却循环来产生单链模板(如果利用PCR)，或通过持续受控的温度来产生单链模板(对于等温扩增来说)。图13示出了被保持在如在此描述的阵列中的具有双链DNA的多个克隆珠粒的荧光显微照片。
在扩增过程期间，介电电泳力也可以通过保持扩增子来帮助防止经历扩增的不同传感器区域之间发生交叉污染。在图15中所图示的实施例中，额外的电极被显示为具有与传感器的电压水平相同的电压。在如图14中所示的一个替代实施例中，在传感器任一侧上的电极可以相对于彼此具有异号或同号但不同值的电压。
另外，凝胶型材料可以在用磁性阵列进行扩增或测序的期间充当不同区域中和或之间的隔离材料。使用此种凝胶型缓冲介质可以使DNA链最小限度地从一个局部化磁场扩散到相邻(或邻近)的局部化磁场，因为核苷酸(dNTP)、Mg2+以及其他材料可以在周期性注射期间被引入并且可以被运送通过该凝胶型或海绵状介质。该凝胶型材料可以是任何合适的材料，例如琼脂糖或丙烯酰胺或其他交联材料，在这些材料中交联可以通过物理或化学触发事件引发。此类触发事件的一个实例是温度变化(作为一种物理触发事件)或添加一种物质(以使该材料发生一种化学变化，从而使该介质变成凝胶型相)。
“凝胶样”或“海绵状”材料还可以协助将DNA链限制在珠粒附近的体积中，或协助将DNA链限制在局部化磁场中或附近和/或减少多核苷酸的扩散。在此类实施例中，可以允许核苷酸和其他材料更容易地扩散，但是DNA链，特别是样品或扩增子片段将被阻止自由地扩散。
在一些实施例中，这种方法可以减少DNA在该系统的扩增部分中扩散。
图14描绘了一个替代实施例，其中一个克隆群体可以在传感器阵列中的区域中或单独的传感器1402上产生。这些传感器可以是NanoNeedle或NanoBridge或其他传感器以检测聚合事件。在一个实施例中，引物1404可以优先地与这些传感器的表面结合、缔合或附接。所述引物1404可能是由于材料方面的差异而优先地附接，其中该传感器的材料可能比(then)该传感器阵列的传感器之间的区域更有利于附接。在一个替代实施例中，可以将一个遮罩施加于该传感器阵列的传感器之间的区域，并且然后可以进行表面改性。随后，该遮罩可以被去除；留下传感器阵列的传感器之间的没有进行过表面改性的区域。该表面改性可以包括附接生物素、施加一层金以及本领域中已知的不同的其他方法。
然后可以将引物1404优先地施加到在传感器阵列中传感器1402表面上的区域。在一个实施例中，这些引物可以由于生物素抗生物素蛋白链菌素结合而附接，其中该生物素或抗生物素蛋白链菌素可以附接到这些引物的5’端上。在另一个实施例中，可以将一个硫醇基附接到这些引物的5’端上，然后可以使其结合于先前施加于传感器上方的金层，从而形成Au-S键。如果希望进行PCR反应，那么可以用DTPA对这些引物进行修饰，这样可以形成两个硫醇金键，从而防止否则可能会因在PCR中常规使用的从60C到95C的温度而发生的溶解。可以通过由电极1408A和1408B产生的电场1406将目标DNA 1406集中在引物1404的区域中。可以引入引物、dNTP 1410以及聚合酶1408并且任选地通过由电极1408A和1408B产生的电场使其集中。
在一些实施例中，扩增可以是一种固相扩增，其中一种引物可以在珠粒的表面上，而一种第二引物可以在溶液中。在其他实施例中，该扩增可以是固相扩增，其中所有引物都在珠粒上，或可以进行该扩增，其中两种引物都存在于溶液中，并且一种引物或两种引物也可以存在于珠粒上。在另外一个实施例中，可以进行该扩增，其中一种引物存在于溶液中，并且一种引物或两种引物也存在于珠粒上。
电极配置可以采取各种不同的形式，包括在流槽的一个或两个主平面上的基本上呈平面的电极，或电极可以存在于与珠粒相对的表面上，以及一组更小的电极与每个传感器或珠粒捕获区域关联。图15示意性地图示了一个实施例，其中一组传感器1502可以定位成与电极结构1504和1506关联，其中该电极结构可以具有经过定位而与珠粒捕获特征直接相邻的一个电极1504，并且一个更大的电极结构1506可以环绕该珠粒捕获特征和更小的电极1504。在该实施例用于进行测序或检测时，该珠粒捕获特征可以接近于传感器作用区。虽然更大的电极被图示为圆形，但是它可以呈(me)正方形、矩形、椭圆形或其他的形状，并且未必完全地环绕更小的电极1504。
基本上呈平面的结构可以包括用于更好地进行对准或场聚焦的多个凹陷或孔，或用于更好的流体流动特征的多个基座。
在一些实施例中，在扩增之前，可以将珠粒与单个DNA片段缔合，以便产生单克隆珠粒。典型地，可以测定DNA浓度，并且然后可以将DNA以较稀的形式引入珠粒，以使得平均不到1个片段可以结合于每个珠粒。许多珠粒具有零个DNA片段，很少数具有单个片段，并且少数具有2个或更多个片段。用于定量所需的步骤经常需要一个独立的仪器和独立的处理。时常，可以利用实时PCR，或对在260nm下的吸光度进行测定来实现定量。
如果利用了三个或更多个电极，那么可以将不同的电压用于任一组电极。
聚合物可以与AC场结合使用，该AC场具有电压更高并且持续时间更短的单相，以便提供目标分子的定向迁移。
在一个实施例中，可以使样品变得非常稀和/或可以在珠粒上利用并且装载小体积的样品试剂。DNA将结合于一些珠粒，并且然后在虚拟孔中扩增，从而产生具有DNA的珠粒。可以使测序引物比连接到样品DNA的互补序列更短。因为该序列是已知的，所以可以添加正确的dNTP并进行检测。在一个实施例中，可以同时添加多个dNPT。例如，如果添加了所有的dNTP，那么聚合酶将会延伸到片段的末端，从而产生一个大信号。所述大信号可以作为该扩增过程的一部分而产生。这将允许对具有DNA的珠粒进行检测并且对其数目进行计数，即使这些珠粒具有最少的扩增。了解有多少珠粒具有信号将允许对产生理想数目的单克隆珠粒的适当稀释度进行计算。该信号可以是电信号、光学信号或本领域中已知的任何其他类型的检测信号。
在一些实施例中，对扩增子、聚合酶或其他部分的电限制作用可以与不具有任何物理孔结构的器件一起利用。在其他实施例中，该器件可以是一个基本上呈平面的表面，其中存在多个凹陷或突起。在仍其他实施例中，该器件可以具有孔结构。
电集中作用
如图6和图12中所图示，传感器阵列可以配备额外的一系列电极，这些电极可以用来进行介电电泳集中。最初可以进行介电电泳集中以将样品DNA 1206、dNTP 1210、引物以及聚合酶1208吸引到每个传感器或扩增区域，从而允许更低的有待利用的每一所述部分的浓度。然后可以在每个传感器上样品DNA分子所处的区域中开始扩增。产生虚拟孔的电场可以防止扩增子离开一个虚拟孔并行进到另一个虚拟孔，从而产生交叉污染。以一种类似的方式，用于对扩增子进行定位的场也可以将扩增子、引物以及聚合酶集中到传感器区域或扩增区域中。
在另一个实施例中，可以使用无乳液纳米孔的现有电极将样品集中在扩增区域中。在一个实施例中，可以在单个平面上建立多个电极。在另一个实施例中，可以将多个电极添加到与虚拟孔的平面平行的一个第二平面。在其他实施例中，预期AC和或DC电压输入的混合物。
在另一个实施例中，可以使用介电电泳来使DNA集中。在集中期间或之后，可以测量电流以测定DNA的浓度。在另一个实施例中，可以通过使用如下文所描述的多种插入染料来对集中的DNA进行定量。
也可以利用多个分离场电极来进行集中。在一些实施例中，可以利用相同的电极和场。在其他实施例中，相对于用于产生分离场的那些，可以利用更少或更多的电极来产生集中场。
集中作用可以用于使样品的利用率达到最大，例如，将DNA样品导引或牵拉到多个虚拟孔中用于随后的扩增。集中作用也可以用于将聚合酶导引或牵拉到一个虚拟孔中用于扩增，或导引或牵拉到可以与一个珠粒或传感器缔合的一组克隆DNA，并且所述聚合酶可以被用于测序反应中。以一种类似方式，可以将其他部分，例如dNTP、引物、其他酶以及其他生物部分或其他带电荷的部分集中以用于反应中，或用于随后的反应中。
经常会对样品DNA进行大量扩增以确保有足够的DNA样品以足够高的浓度用于所希望的方案。这种扩增可能会引入偏差并且可能花费额外的时间和资源成本。可能希望能够减少或消除对样品进行扩增的需要。在一个实施例中，可以将有待装载的珠粒封入一个填充床中并且样品可以跨越该填充床进行泵送。在一些实施例中，可以将样品泵送穿过具有珠粒的区域多次，从而为样品结合提供额外的机会。高的表面积与体积比应允许使用最少的样品。随后可以使这些珠粒移动到流槽中，由此它们可以通过磁性阵列而保持在位，并且可以通过PCR或等温扩增在这些珠粒上产生局部的群落。
多种样品
因为许多方案不要求对芯片进行完全使用，所以可能希望的是将多种样品装载到单个芯片中。在一个实施例中，可以使用已整合到芯片组件中的多个阀门将样品导引到由芯片上的多个壁分隔的独立区域中。此类阀门可以是已整合到流体路径中的聚二甲基硅氧烷PDMS阀门。在另一个实施例中，可以使用与芯片组件分开的多个阀门将样品导引到由芯片上的多个壁分隔的独立区域中，其中在该芯片组件上有多个输入。在另一个实施例中，可能存在具有独立的输入和输出的多个独立的区域。在另一个实施例中，可以使用局部电场将样品导引到芯片或流槽上的独立区域中。可以施加正电场以将DNA或涂有DNA的珠粒吸引到所希望的区域，同时可以施加负电场以将DNA或涂有DNA的珠粒从不希望的区域中逐出。在另一个实施例中，可以使用电磁体分离磁性或顺磁性珠粒，来将样品导引到独立的区域中。在另一个实施例中，可以使用自密封端口将样品递送到单独的泳道中。自密封端口可以包括橡胶隔片和针。
在另一个实施例中，样品可以在不同的时间点注射并且可以由来自先前空的珠粒位置的信号来对新的珠粒加以区别。
在本发明的一些实施例中，作为样品制备过程的一部分，可以将“条形码”与每个样品关联。在这一过程中，将短寡核苷酸添加到引物中，其中每个不同的样品除引物之外还利用了不同的寡核苷酸。将引物和条形码连接到每个样品，作为文库产生过程的一部分。因此，在与产生每个群落有关的扩增过程期间，引物和短寡核苷酸也得到了扩增。因为进行了条形码的关联作为文库制备过程的一部分，所以在产生克隆群体时有可能利用多于一个文库，并且因此利用多于一个样品，从而允许通过对短寡核苷酸以及样品序列进行测序来确定哪个珠粒和群落源自于哪个样品。
样品分离方法可以与样品标识符结合使用。例如，一个芯片可以具有4个独立的通道并且使用4个不同的条形码以允许同时运行16个不同的样品。这允许使用更短的条形码，同时仍然提供明确的样品鉴定。
在如图16A-图16D中所示的一个替代实施例中，样品可以放入一个系统中，该系统可以具有一个磁性阵列和关联的传感器阵列。可替代地，该系统可以具有一个组合的扩增和检测阵列，其中该阵列的每个元件可以具有一个传感器和被配置为产生一个虚拟孔的一组电极。可以将被配置为仅占据所述阵列1602A的一部分的一个DNA样品组1604A引入所述阵列1602A中，使得一部分可用区域具有缔合的样品。然后可以通过与每个虚拟孔关联的传感器检测此类样品，从而产生如图16B中所示的阵列1602B，或可以将此类样品扩增，然后进行检测。图16B还示出了一个部分地填充的磁性阵列的显微照片。图16C示出了另一个样品组1604B，该样品组则可以被引入磁性和传感器阵列1602B中，从而产生如图16D中所示的一个更完全地填充的阵列1602C。
组合的电限制和测序
图17图示了在传感器阵列中的传感器上方的扩增的区域的使用，该传感器阵列可以用于测序反应中。DNA样品1702可以被放入阵列系统1710中，其中该阵列可以被配置为具有预先定位的珠粒，或具有可以与传感器区域1710附接、结合或缔合的引物1708。聚合酶1704、dNTP 1706以及额外的引物可以同时、之前或随后引入到该阵列中。在完成了扩增反应1712之后，可以对该传感器阵列上方的体积进行洗涤，从而去除扩增子、聚合酶以及dNTP，产生与阵列位置缔合的局部结合、缔合或附接的克隆组。然后可以使聚合酶1718、引物1714以及单独的dNTP 1706流入在该传感器阵列上方的体积中，允许进行结合、合并以及合并事件的检测，从而对不同的扩增的样品DNA分子的序列进行确定。用于测序反应的聚合酶1718可以是与用于扩增反应的聚合酶1704相同的类型，或可以是不同类型的聚合酶。
分离克隆珠粒
图19的一部分示出了一个系统的示意性图解，该系统可以将具有克隆DNA的磁性或顺磁性珠粒与未缔合有扩增产物和/或具有不完全扩增和/或短克隆的磁性或顺磁性珠粒分离。然后可以分离这些磁性珠粒1934，这样使得结合有克隆地扩增的DNA区段的磁性或顺磁性珠粒1934可以被输送到测序系统中，并且基本上缺乏扩增的DNA的磁性或顺磁性珠粒1934可以被输送到废料室中和/或保留在PCR和富集系统内。该分离或“富集”作用可以通过跨该PCR和富集系统的一部分施加电场以诱生电泳流来产生。因此，可以将具有带高电荷的扩增的DNA的磁性或顺磁性珠粒1934与主要缺乏扩增的DNA的那些磁性或顺磁性珠粒1934高效地分离。以此方式，被递送到该测序系统的样品可以基本上仅包括那些具有扩增的DNA的珠粒，该扩增的DNA具有测序所希望的长度的DNA链。类似地说，被递送到该测序系统的样品可以包括接近100％的克隆珠粒百分比。克隆珠粒的分离物可以是非磁性珠粒或任何其他类型的珠粒，其表面涂有或未涂有带电荷的分子。
在产生克隆珠粒时，大百分比的珠粒可能不具有DNA模板。此外，其他可能具有不良的扩增作用。这些珠粒不能提供有用的测序，所以可能希望的是去除这些珠粒以达到更好的效率。在本发明的一些实施例中，可以使用一种富集模块，该富集模块使用一个电场来分离不具有或具有最少量模板的珠粒。
完全地装载有模板的珠粒具有更高的电荷，并且因此在电场中可以比仅具有引物或少量模板的珠粒移动得更远。在如图18A-图18B中所示的一个实施例中，这种分离可以在一个流过式模块1800中进行。一个第一流体输入1811A允许注射混合的珠粒。一个第二入口1812A允许注射不含珠粒的缓冲溶液。一个第一出口1811B可以在该第一入口1811A的下游。一个第二出口1812B可以在该第二入口1812A的下游。流体可以通过端口1809进入或离开该模块。该流体系统可以具有一个基质1802，和在一层PDMS 1808、玻璃或其他材料中形成的一个通道1810。
流体的流速可以根据流体阻力或泵送速度来设定，以使得更多的液体流入该第二入口中。在一个实施例中，可以改变入口和出口的宽度以产生不同的流体阻力，但是调节流体阻力的其他方法(例如不同的长度、高度)也是预期的。类似地，第一出口1811B和第二出口的流体阻力可以经过调节，以使得更多的液体流出该第一出口1811B。在此种设置中，不具有较小的垂直于流动的速度的珠粒可能会离开第一出口端1811B。可以添加额外的输出通道以有助于对具有中等水平的模板的珠粒进行分离。
可以提供一对电极1813，这些电极能够产生垂直于流体流动的电场，以使得装载有模板的珠粒离开流动路径朝向第二出口1812B迁移。流体端口1809允许与系统管道连接。
这些电极可以是由与电泳相容的任何电极材料制成。在一些实施例中，可以使用离散的金属导线，但是金属迹线也是预期的。预期使用多种金属，例如铂、铂/铱、金以及其他贵金属或合金，以及耐腐蚀材料，例如不锈钢。还预期使用非金属电极，例如碳。
流过式富集模块腔室可以由非导电材料构建，例如模制的塑料、玻璃、陶瓷或可模制的聚合物(例如PDMS)。可以将流体部件熔合或粘合以产生一个流动腔室。
万一珠粒粘住电极，如果必要的话，可以定期地将施加到这些电极的电压降低或甚至是反向。所用的电压应该大于电解所需要的电压(在25C下在pH 7下是1.23V)。更高的电压和更窄的间距对这些珠粒提供更高的场强度和更大的力。该系统上的电压可以通过以下方式进行校准，即，使不带有模板或带有限模板的珠粒流动并且调整电压或流速以使得这些珠粒不能移动得远到足以进入第二出口，同时可以将带有模板的珠粒导引到第二出口中。
也预期非流过式富集模块，但这些模块可能不如流过式系统一般容易进行自动化。在一个实施例中，可以将多个珠粒引入一个腔室中，并且磁场或重力会向下牵拉这些珠粒。可以建立一个将具有模板的珠粒向上牵拉的电场。在一些实施例中，可以在正电极前面加上一个捕获膜或过滤器以有助于对珠粒进行集中。
在一些实施例中，不具有扩增的DNA的珠粒或粒子(克隆珠粒)，和或具有不充分地扩增的DNA的珠粒或粒子，或具有过短的扩增DNA片段的珠粒和或珠粒或粒子可以再循环，并且重复用于随后的扩增反应，以便产生良好扩增的克隆珠粒或粒子。也可以在利用了珠粒或粒子进行测序之后对所述珠粒或粒子进行再循环。所述珠粒或粒子可以在单个系统内自动地再循环。
在一些实施例中，不具有扩增的DNA的珠粒或粒子可以直接重复使用或再循环，而不对这些珠粒或粒子进行进一步处理以防止发生样品间的污染。这可能是有利的，例如当利用单个样品进行若干扩增反应时，会使得与任何交叉污染无关，因为样品实际上是相同的。在其他实施例中，可能引起的交叉污染的量可能会被认为是无关紧要的，因为该交叉污染量足够低。
在其他实施例中，这些珠粒可以进行处理以防止交叉污染。所述处理可以例如包括从所述珠粒或粒子中去除并且置换所有引物，其中所述引物可以使用例如抗生物素蛋白链菌素结合、硫醇结合等缔合或结合于这些珠粒或粒子，其中该结合可以被破坏并且另一个部分被结合。结合于这些珠粒或粒子的引物可以是与先前所利用相同的引物，或可以是一种不同的引物，例如包括有一个不同的条形码作为引物的一部分。
在其他实施例中，可以通过利用具有一个不常见的切刻位点的引物来防止交叉污染，其中可以对该引物进行切刻、洗涤、提供一种夹板寡核苷酸(splint oligo)并且通过连接一种寡核苷酸来使引物复原，其中使该寡核苷酸的原始序列或另一个所希望的序列再生或产生。
整合的系统
图19是整合的测序平台的示意性图解。该整合的测序平台可以包括一个DNA提取系统、一个文库构建系统、一个扩增系统、一个富集系统以及一个测序系统(该系统可以包括在此描述的电检测系统或“传感单元”)。虽然被示意性地显示为独立的系统，但该整合的测序平台可以在单个微流体/微电子器件(或“芯片”)内包括所有这些系统。这些系统各自更详细地描述于下文中。
该DNA提取系统包括一个入口腔室1910，用于接受有待分析的生物样品(例如血液)。该入口腔室可以包括一种用以促进该生物样品内所包含的细胞溶解的溶液。此类溶液是本领域中所熟知的并且典型地被称为溶解缓冲液。在一些实施例中，可以将该溶解溶液注射到该入口腔室中并且与生物样品混合。可以经由一个芯片上提取元件1920从生物样品中提取DNA。该提取元件1920可以被安置在微流体器件的一个流动通道内，并且包括由一个多孔构件构建的一种过滤介质。该提取元件1920还可以包括一个或多个电极，这一个或多个电极被配置为产生一个跨越该过滤介质的电场。因此，该过滤介质与电场的组合使带高电荷的DNA(通过参考特征DNA来鉴定)与生物样品的其他部分分离。此外，该提取元件1920可以被配置为将DNA 1912与其他核酸(即RNA)分离。
在一些实施例中，这些电极可以经过控制以对该电场的多种特征进行定制，从而对该提取元件的分离特征进行优化。例如，可以控制这些电极以调整该电场的强度、极性、空间变化性和/或瞬态特征。在一些实施例中，该提取元件1920可以包括两个电极：被安置在该多孔过滤介质下方的第一电极，以及被安置在该第一电极上方并且与其呈对角的第二电极。
如图19中所示，该文库构建系统可以包括一个DNA片段化和/或大小选择元件1916。该片段化和/或大小选择元件1916可以被配置为经由下文所描述的元件和方法产生具有钝端的双链DNA片段。片段化元件1920包括一个或多个微流体通道1922，在这一个或多个微流体通道内可以安置分离的DNA；以及一组片段化珠粒1924。更具体地说，由该DNA提取系统产生的分离的DNA可以通过任何合适的机制(例如加压注射、电泳移动、重力给料、热诱导的移动、超声波移动和/或类似的机制)输送或“注射”到该DNA片段化和/或大小选择元件1916中。类似地，可以通过任何合适的机制将片段化珠粒1924输送到该DNA片段化和/或大小选择元件1916中。
该片段化和/或大小选择元件1916可以包括一个泵1926，用以使DNA与片段化珠粒1924的溶液在微流体通道1922内移动。该泵1926可以是例如一种蠕动泵。在一些实施例中，该泵1926可以包括一个或多个微流体元件，这一个或多个微流体元件与微流体通道1922流体连通，并且具有一个柔性侧壁，该柔性侧壁在发生变形时在该微流体通道1922内产生流动。然而，在其他实施例中，可以使用任何合适的机制使DNA与片段化珠粒1924的溶液在该微流体通道1922内移动(例如经由对该溶液进行选择性加热和冷却、对该微流体通道进行气动加压、电泳运动等)。
片段化珠粒1924可以由适合于将该DNA分离、切割和/或以另外的方式分成多个DNA片段(通过参考特征DNA-SEG来鉴定)的任何材料构建。在一些实施例中，这些片段化珠粒1924可以由玻璃、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、陶瓷等构建。此外，这些片段化珠粒1924可以具有任何合适的大小和/或几何形状，使得片段化元件1920产生具有所希望的特征(例如长度、链特征等)的多个DNA片段。此外，可以对该微流体通道1922的大小和/或几何形状(例如截面形状、纵横比等)进行选择，使得DNA在微流体通道1922内的移动以及与片段化珠粒1924的接触产生该DNA的所希望的剪切作用。例如，在一些实施例中，这些片段化珠粒1924可以基本上呈球形并且可以具有50μm或更小的直径。在其他实施例中，这些片段化珠粒1924可以具有500nm或更小的直径，或在50μm与500nm之间的任何直径。在一些实施例中，该微流体通道1922的水力直径可以在1μm到500μm的范围内(即，如图24中所示，该微流体通道1922的截面区域可以基本上呈矩形，因此该大小可以表示为水力直径)。在其他实施例中，该微流体通道1922的水力直径可以在10μm到200μm的范围内。在仍其他实施例中，该微流体通道1922的水力直径可以在500nm或更小的范围内。此外，虽然在图24中被显示为基本上呈矩形，但在其他实施例中，该微流体通道可以具有任何合适的形状，例如半圆形、椭圆形、锥形等。在一些实施例中，可以对经过剪切的DNA末端进行酶促抛光以确保这些末端是钝端。
在其他实施例中，可以将一种酶溶液输送到该微流体通道1922中以至少部分地产生DNA的酶促片段化作用。
在完成片段化后，可以将DNA片段与片段化珠粒1924分离。这些DNA片段可以通过任何合适的机制，例如像，通过一个过滤器、通过重力(或向心力)分离、通过一个电场等与这些片段化珠粒1924分离。在一些实施例中，例如，可以通过对一个或多个控制线或控制通道进行致动来将这些DNA片段与这些片段化珠粒1924分离，如下文参照图20所描述。具体来说，这些控制通道可以是与该微流体通道1922流体分离，但邻近于并且通常垂直于该微流体通道的通道。这些控制通道可以例如由一个侧壁限定，该侧壁也对该微流体通道的一部分进行限定。以此方式，当可能使该控制通道内流体的压力增加时，该共同的侧壁可以发生变形，由此使该微流体通道1922的一部分的流动面积发生改变。为了将这些DNA片段与这些片段化珠粒1924分离，可以对该控制通道选择性地施加一个压力，以使得该微流体通道的流动面积可以小到足以保持这些片段化珠粒，但大到足以允许这些DNA片段穿过它。换句话说，在一些实施例中，可以将该通道中的阀门部分地关闭，从而产生渗漏的“筛选阀门”以将这些DNA片段与这些片段化珠粒1924分离。
在一些实施例中，该片段化和/或大小选择元件可以包括一个电泳器件，该电泳器件可以另外包括嵌入到一个微流体通道中的一组电极，并且可以另外包括用于引入所涉及的聚合物、缓冲剂以及洗涤溶液的一个工具。
如在图19中另外示出的，然后可以将这些DNA片段输送到扩增和富集系统中。这些扩增和富集系统可以被配置为由片段化的DNA产生克隆地扩增的DNA，该片段化的DNA可以如下文所描述进行测序。该PCR和富集系统可以包括一系列微流体通道1932，在这些微流体通道内，这些DNA片段可以与一系列磁性珠粒1934缔合。这些DNA片段和磁性或顺磁性珠粒1934可以经由一个相应的磁性阵列而定位在这些微流体通道内。以此方式，可以将这些DNA片段和磁性或顺磁性珠粒1934维持在所希望的位置以促进准确并且高效的样品扩增。例如，可以将这些DNA片段和磁性或顺磁性珠粒1934维持在“流过式”微流体通道1932内的所希望的位置，并且所希望的试剂可以在该微流体通道1932内输送并且与这些DNA片段接触，以促进这些DNA片段的扩增。
在对珠粒上的目标DNA进行扩增之后，可以如先前所描述在一个电泳分选仪1938中对这些珠粒进行分选，并且具有适量的扩增的产物的多个珠粒1940可以被移动到一个测序模块1936中。
如上所述，该整合的测序平台可以在单个微流体/微电子器件(或“芯片”)内包括在此描述的所有系统或可以是呈单系统形式的模块化器件。图20-图24示出了用于对多核苷酸进行提取、扩增以及测序的整合的平台的微流体部分的多个实施例。
如在图20中，一个微流体器件2000可以具有一个或多个输入或输出端口2006。流体可以经由所述端口2006引入流体通道2004中。控制线2002可以通过启动阀门2008来控制流体的流动。对控制线2002加压，会使这些控制线2002与这些流体通道2004之间的一个壁发生变形，从而夹断该流体通道并且关闭阀门2008。图21示出了流体学系统的另一个实施例，该系统具有类似的控制线2102、流体通道2104以及阀门2108，但具有额外的跨接线2110，其中该控制线变得过于狭窄而不能完全地变形至其中密封流体通道2102的点，防止该跨接线2110充当阀门2108。图22示出了具有扩大的流体通道2204的器件2200A和2200B的一部分的显微照片，从而允许控制线2202的启动可视化。在(If)器件2200A的视图中，该控制线没有被启动，并且可以看到阀门2208是打开的。在该控制线2202启动之后，可以在器件2200B中看到阀门2208B已经变形并且密封了流体通道2204。图23示出了一个PDMS阀控器件2302的若干视图，包括在一个通道中的多个顺磁性珠粒2304的显微照片，和其中流动正在发生的视图，以及其中阀门已经启动而不发生流动的视图。该微流体器件可以通过一系列控制线来控制在此描述的珠粒、试剂和/或样品的“注射”或流动，这些控制线与在此描述的微流体通道相交和/或阻碍了这些微流体通道。如图24中所示以及上文所描述，这些控制线可以扩大以将溶液和/或珠粒保持在该器件的一个预定部分内。
为了将皮升量的扩增或测序试剂注射到流体系统中，例如为了将多个dNTP合并到珠粒固定的DNA引物上，该磁性阵列可以利用一个微流体学系统。例如，该微流体平台可以包含用于将反应物注射/递送到局部化磁场的多个管线。对于多个测序实施例，该微流体系统控制了三磷酸核苷酸向基质或向局部化磁场的连续注射。这些微流体通道的直径可以在1μm到100μm的范围内，或在某些实施例中，直径在10μm到20μm的范围内。用于制造该微流体学系统的多种材料和方法是已知的。例如，该微流体学系统可以用聚二甲基硅氧烷(PDMS)、模制或机械加工的塑料或玻璃来制造。
因此，在某些方面，本发明提供了如在此描述的一种磁性阵列，该阵列具有在多个局部化磁性特征处通过磁力捕获的磁性珠粒或粒子，每个磁性珠粒或粒子具有与其结合的一个克隆地扩增的DNA区段用于序列分析。该DNA区段可以例如使用任选地具有电场的磁性阵列进行克隆地扩增，如在此描述。
这些扩增和测序阵列可以按连续的次序放入一个整合的平台中。例如，在磁性阵列上进行扩增之后，可以基于DNA电泳力对珠粒进行富集。确切地，具有扩增的DNA并且该扩增的DNA具有适当长度的珠粒可以具有要被牵拉到与DNA测序仪整合的一个出口所需的最少量电荷。空珠粒以及具有不完全扩增或过短DNA扩增子的珠粒可以通过另一个出口分离。
因为许多方案不需要芯片的全容量，所以可能希望的是在单个芯片中处理多种样品。其他方案可能具有将超过芯片容量的单个样品。在一些实施例中，可以在单独的试管、排管、96孔板、384孔板等中将一种或多种样品引入到仪器中。在一些实施例中，可以密封样品孔以延长在该仪器上的寿命。在其他实施例中，可以将这些板冷却以增加样品寿命。在其他实施例中，可以通过机械臂移液器以一种软件可选择的方式存取样品。如果样品太大，该系统可以将其分到多个流体通道或芯片上，或如果样品是可组合，则对其进行组合(例如使用序列带有条形码的样品)。在一些实施例中，样品可以在不同时间装载于同一个测序器件中的不同通道中，从而使能够在样品变得可用时运行。在一些实施例中，提供到仪器的样品将准备好进行测序。在其他实施例中，样品可以通过该仪器进行处理以产生准备好进行测序的样品。
在一个实施例中，可以通过一种基于杂交的拉出作用产生目标浓度。可以用受控数目的结合位点对固体支撑物(例如拉出珠粒)进行功能化。在一些实施例中，这些可以是DNA引物互补序列(compliments)。未扩增的样品可以具有在每一端上连接的已知引物。在一些实施例中，这些引物将与这些拉出珠粒上的DNA杂交。在这些位点被耗尽之后，将残留的DNA洗掉，并且随后使结合于这些珠粒的DNA变性，从而释放已知量的DNA。
在另一个实施例中，连接到每个DNA片段的引物可以结合于引物互补序列并且使用插入染料的荧光检测来进行检测。因为这些引物可以具有已知的长度，所以信号水平可以与片段的数目成比例。在另一个实施例中，可以引入聚合酶和相关的dNTP，从而产生全长的双链DNA。在与来自引物信号的信息组合时，全长插入染料的信号水平则将允许对平均片段长度进行确定。
虽然不同的实施例已经被描述为具有具体特征和/或部件组合，但具有如上文所论述的任何实施例中的任何特征和/或部件的组合的其他实施例是可能的。
虽然上文已描述了不同的实施例，但应了解的是，这些实施例是仅借助于实例来呈现，并且不具有限制性。在上文所描述的方法和/或示意图指示了以某种次序出现的某些事件和/或流动型式的情况下，可以对某些事件和/或流动型式的排序修改。虽然已具体地显示并且描述了这些实施例，但是应了解的是，可以对形式和细节作出不同的变化。虽然已经针对核酸检测或DNA测序具体地显示并且描述了这些实施例，但是应了解的是，该系统可以被配置用于或用于不同的其他生物化学反应以及其检测。

Claims (20)

1.一种方法，包括将携带生物材料的珠粒以磁性方式保持在基质的特定的位置中，向该珠粒施加局部电场，以分离该生物材料或者该生物材料的多种反应的多种产物或副产物，其中使用电子传感子系统检测横跨所述珠粒的表面的导电性的变化，或在所述珠粒表面附近或之上的电荷变化，其中(i)所述电子传感子系统是用来检测来自在该珠粒的表面的德拜长度内的多个部分的导电性的变化，或在该珠粒的德拜长度内的电荷变化，以及(ii)所述电子传感子系统包括纳米传感器，所述纳米传感器包括至少一对包括正极端子和负极端子的暴露的测量电极，其中所述纳米传感器检测微环境内由相应微环境的离子浓度改变所引起的流体的阻抗改变，该离子浓度改变是因珠粒上的生物材料与另一种材料的化学反应或合并事件的结果。
2.如权利要求1所述的方法，其中该电场被适配用来将多个模板DNA片段、多种引物、聚合酶以及多种dNTP中的一项或多项集中在所述位置周围。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中该电场具有DC和AC分量。
4.如权利要求2所述的方法，其中该电场有助于DNA扩增和DNA测序中的至少一项。
5.如权利要求3所述的方法，其中该电场有助于DNA扩增和DNA测序中的至少一项。
6.如权利要求1所述的方法，其中该电场有助于与该珠粒结合或缔合的DNA的克隆扩增。
7.如权利要求4所述的方法，另外包括通过测量局部pH值变化、局部导电性变化、局部电荷浓度变化以及局部热量中的至少一项来检测核苷酸在经引发用于测序的DNA链中的合并，所述DNA链与所述珠粒缔合。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述纳米传感器位于所述特定的位置处并测量以下各项中的至少一项：局部pH值变化、局部导电性变化、局部电荷浓度变化以及局部热量。
9.如权利要求1所述的方法，其中多个或一系列局部化磁场区域保持多个珠粒。
10.如权利要求9所述的方法，其中这些珠粒被保持成与这些局部化磁场区域大致一一对应。
11.如权利要求5所述的方法，另外使用桥式扩增法。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述纳米传感器测量阻抗用于检测合并的核苷酸。
13.如权利要求9所述的方法，其中珠粒的数目超过与这些珠粒缔合的DNA片段的数目。
14.如权利要求2所述的方法，另外包括将缓冲介质引入该基质和所述特定的位置，该缓冲介质中多种离子具有的迁移率和扩散不同于这些离子在水中将具有的迁移率和扩散。
15.一个系统，包括
基本上呈平面的传感器阵列，该阵列与用于捕获与纳米传感器邻近的珠粒的工具连接，该纳米传感器能够检测生物材料或者生物反应产物或副产物，并包括至少一对包括正极端子和负极端子的暴露的测量电极；和用于释放珠粒以有助于该阵列的重复使用的工具，其中该珠粒包含在单相流体环境中的生物材料的克隆群，和
电子传感子系统，所述电子传感子系统检测横跨所述珠粒的表面的导电性的变化，或在所述珠粒表面附近或之上的电荷变化，其中所述电子传感子系统检测来自在该珠粒的表面的德拜长度内的多个部分的导电性的变化，或在该珠粒的德拜长度内的电荷变化，
其中所述纳米传感器检测微环境内由相应微环境的离子浓度改变所引起的流体的阻抗改变，该离子浓度改变是因珠粒上的生物材料与另一种材料的化学反应或合并事件的结果。
16.如权利要求15所述的系统，其中该生物材料是多种核酸或类似物、多种蛋白质以及多种DNA片段之一。
17.如权利要求16所述的系统，其中这些DNA片段直接地结合于该珠粒或通过连接子或载体间接地结合于该珠粒。
18.如权利要求15所述的系统，其中该纳米传感器能够检测以下各项中的至少一项：局部pH值变化、局部导电性变化、局部电荷浓度变化以及局部热量。
19.如权利要求15所述的系统，其中用于捕获珠粒的该工具和用于释放该珠粒的工具是磁体。
20.如权利要求15所述的系统，其中用于捕获该珠粒的工具是用于产生非共价键的部分，并且用于释放该珠粒的工具是以化学和/或热方式使所述非共价键断裂的部件。
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