DD301731A9 - T7 dna polymerase - Google Patents

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Charles C Richardson
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Abstract

Die Erfindung betrifft T 7-DNA-Polymerasen und Methoden für ihre Verwendung.

Description

Hierzu 18 Seiten Abbildungen
Die DNA-Sequenzierung schließt die Erzeugung von vier Populationen von einzelsträngigen DNA-Fragmenten mit einem definierten Terminus und einem variablen Terminus ein. Der variable Terminus endet immer an einer spezifischen gegebenen Nuclootidbase (entweder Guanin [GJ, Adenin [A), Thy min [TJ oder Cytosin [CJ). Die vier verschiedenen Gruppen von Fragmenten werden jeweils auf der Basis ihrer Länge auf einem Polyacrylamidgel hoher Auflösung getrennt; jede Bande auf dem Gel entspricht kolinear einem spezifischen Nucleotid in der DNA-Sequenz, wodurch die Positionen in der Sequenz der gegebenen Nucleotidbase identifiziert werden.
Im allgemeinen gibt es zwei Methoden der DNA-Sequenzierung. E:ne Methode (Maxam- und Gilbert-Sequenzierung) beinhaltet die chemische Degradation isolierter DNA-Fragmente, wovon jedes an seinem definierten Terminus mit einer einzelnen radioaktiven Markierung versehen ist und jede Reaktion eine begrenzte Spaltung spezifisch an einer oder mehr der vier Basen (G, A, T oder C) ergibt. Die andere Methode (Didesoxysequenzierung) beinhaltet die enzymatischo Synthese eines DNA-Stranges. Es werden vier separate Synthesen durchgeführt, wobei jede Reaktion mittels Einbaus des entsprechenden Kettenabbruchdidesoxynucleotids bei einer spezifischen Base (G, A, T oder C) zur Termination gebracht wird. Die letztgenannte Methode wird bevorzugt, weil die DNA-Fragmente gleichmäßig markiert (anstatt endmarkiert) sind und so die größeren DNA-Fragmente zunehmend mehr Radioaktivität enthalten. Außerdem können 35S-markierte Nucleotide anstelle von "P-markierten Nucleotiden verwendet werden, was eine schärfere Definition zur Folge hat; und die Reaktionsprodukte lassen sich leicht interpretieren, weil jede Spur nur G, A, T oder C entspricht. Das für die Didesoxysequenzierung am häufigsten verwendete Enzym ist das große DNA-Polymerase-I-Fragment („Klenow") von Escherlchla coil. Eine andere verwendete Polymerase ist die AMV Reverse Transkriptase.
Die Erfindung betrifft eine Methode zur Behandlung prozessiver DNA-Polymerase mit Exonucleaseaktivität, die dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Lösung der Polymerase in Kontakt mit Sauerstoff, einem Reduktionsmittel und einem Salz eines Übergangsmetalls inkubiert wird, um die Exonucleaseaktivität zu verringern.
Die Erfindung liefert eine DNA-Polymerase, die prozessiv und nichtdiskriminierend ist und kurzo Primer verwenden kann. Außerdem besitzt die Polymeraso wenig oder keine assoziierte Exonucleaseaktivität. Das sind ideale Eigenschaften für die oben beschriebenen Methoden und insbesondere für die DNA-Sequenzierungsreaktionen, da der Hintergrundwert der Radioaktivität in den Polyacylamidgelen vernachlässigbar ist, wenige oder keine Artefaktbande existieren und die Bande scharf sind -wodurch die DNA-Sequenz leicht lesbar ist.
Forner gestattet eine derartige Polymerase neuartige Methoden der Sequenzierung langer DNA-Fragmente, wie es nachstehend ausführlich beschrieben wird.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele und durch die Patentansprüche näher veranschaulicht.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele
Es folgt eine kurze Beschreibung der Zeichnungen. In den Zeichnungen zeigen
Fig. 1-3: schematische Darstellung derVektorenpTrx-2, mGP 1-1 bzw. pGP5-5
Fig. 4: eine grafische Darstellung der selektiven Oxidation von T7-DNA-Polymerase
Fig. 5: eine grafische Darstellung der Fähigkeit modifizierter T7-Polymerase zur Synthetisierung
von DNA in Anwesenheit von Etheno-dATP Fig. 6: eine schematische Darstellung der enzymatischen Amplifizierung von genomischer DNA unter Verwendung
von modifizierter T7-DNA-Polymerase Fig. 7,8 und 9: die Nucleotidsequenzen von pTrx-2, einem Teil von pGP5-5 bzw. mGP 1 -2.
DNA-Polymerase
Die erfindungsgemäße DNA-Polymerase ist im allgemeinen prozessiv, besitzt wenig oder keine assoziierte Exonucleaseaktivität, diskriminiert nicht den Nucleotidanalogoneinbau und kann kleine Oligonucleotide (wie z. B. Tetramere, Hexamere und Octamere) als spezifische Primer verwenden. Diese Eigenschaften sollen nun im einzelnen diskutiert werden.
ProzesslvltSt
Unter Prozessivität ist zu verstehen, daß die DNA-Polymerase in der Lage ist, unter Verwendung der gleichen Primermatrize ohne Dissoziation von der Matrize viele Nucleotide kontinuierlich einzubauen. Der Grad der Prozessivität variiert mit unterschiedlichen Polymerasen; einige inkorporieren nur wenige Basen vor der Dissoziation (z. B. Klenow, T4-DNA-Polymerase und Reverse Transkriptase), während andere, wie die der vorliegenden Erfindung, unter geeigneten Umgebungsbedingungen für mindestens 500 Basen und vorzugsweise mindestens 1000 Basen gebunden bleiben. Solche Umgebungsbedingungen schließen adäquate Vorräte aller vier Desoxynucleosidtriphosphate und eine inkubationstemperatur von 1O0C bis 5O0C ein. Die Prozessivität wird in Anwesenheit von E.Coll-Einzelstrangbindungsprotein (ssb) stark erhöht. Mit prozessiven Enzymen erfolgt die Termination einer Sequenzierungsreaktion nur bei solchen Basen, bei denen ein Kettenabbruchagens eingebaut ist, wie z. B. ein Didesoxynucleotid. Ist die DNA-Polymerase nichtprozessiv, dann entstehen während der Sequenzierungsreaktionen Artefaktbande, und zwar an Positionen, die dem N'jclootid entsprechen, wo die Polymerasedissoziation stattfand. Häufige Dissoziation schafft einen Hintergrund von Banden an inkorrekten Positionen und verschleiert die richtige DNA-Sequenz. Dieses Problem wird zum Teil korrigiert, indem das Reaktionsgemisch über einen langen Zeitraum (30 bis 60 Minuten) bei einer hohen Konzentration von Substraten inkubiert wird, wodurch die Artefaktbande in einen Bereich hoher relativer Molekülmasso oben im Gel, weg von der Region, wo die DNA-Sequenz gelesen wird, „gejagt" werden. Das ist keine ideale Lösung, weil eine nichtprozessive DNA-Polymerase eine hohe Wahrscheinlichkeit der Dissoziation von der Matrize in Regionen kompakter Sekundärstruktur oder Haarnadeln aufweist. Reinitiierung der Primerelongation an diesen Stellen ist nicht effizient, und das übliche Resultat ist die Bildung von Banden in der gleichen Position für alle vier Nucleotide, wodurch die DNA-Sequenz undeutlich wird.
Analogondiskrimlnatlon
Die erfindungsgemäßen DNA-Polymerasen unterscheiden nicht signifikant zwischen Didesoxynucleotidanaloga und normalen Nucleodiden. Das heißt, die Möglichkeit des Einbaus eines Analogons ist ungefähr ebenso groß wie die des Einbaus eines normalen Nucleotide. Die erfindungsgemäßen Polymerasen diskriminieren auch nicht signifikant irgendwelche anderen Analoga. Das ist wichtig, weil Sequenzierungsreaktionen zusätzlich zu den vier normalen Desoxynucleosidtriphosphaten (dGTP, dATP, dTTP und dCTP) die Inkorporation anderer Arten von Nucleotidderivaten wie z. B. von radioaktiv- oder fluoreszenzmarkierten Nucleosidtriphosphaten, üblicherweise zur Markierung der synthetisierten Stränge mit 3SS, 32P, oder andere chemische Agenzien erfordern. Wenn eine DNA-Polymerase keine Analoga diskriminiert, besteht für den Einbau eines Analogons die gleiche Wahrscheinlichkeit wie für den Einbau eines normalen Nucleotids. Das ist für markierte Nucleosidtriphosphate wichtig, um die synthetisierten DNA-Stränge mit einem Minimum an Radioaktivität effizient zu markieren. Ferner sind mit solchen Enzymen niedrigere Analogawerte erforderlich, wodurch die Sequenzierungsreaktion billiger wird als mit einem diskriminierenden Enzym.
Diskriminierende Polymerasen zeigen einen anderen Diskriminierungsgrad bei prozessiver Polymerisation, als bei Verzögerung, wenn sie danach streben, die Synthese über ein Sekundärstrukturhindernis durchzuführen. Bei solchen Hindernissen tritt eine Variabilität in der Intensität unterschiedlicher radioaktiver Bande auf dem Gel auf, was die Sequenz verschleiern kann.
Exonucleaseaktivitfit
Die erfindungsgemäße DNA-Polymerase hat weniger als 50%, vorzugsweise weniger als 1 % und am besten weniger als 0,1 % des normalen oder natürlich assoziierten Grades an Exonucleaseaktivität (Ausmaß der Aktivität pro Polymerasemolekül). Unter dem normalen oder natürlich assoziierten Grad ist die Exonucleaseaktivität unmodifizierter T7-Polymerase zu verstehen. Normalerweise beträgt die assoziierte Aktivität etwa 5000 Einheiten Exonucleaseaktivität pro mg Polymerase, wobei die Messung, wie nachstehend beschrieben, durch eine Modifikation des Verfahrens von Chase et al. (249 J. Biol. Chem. 4 545,1974) erfolgt. Exonucleasen erhöhen die Genauigkeit der DNA-Synthese durch Exzision irgendwelcher neu synthetisierter Basen, die inkorrekte Basenpaarung zur Matrize aufweisen. Solche assoziierten Exonucleaseaktivitäten sind nachteilig für die Qualität der DNA-Sequenzierungsreaktionen. Sie steigern die erforderliche Minimalkonzentration von Nucleotidpräkursoren, die der Reaktion zugesetzt werden müssen, weil sich die Polymeraseaktivität, wenn die Nucleotidkonzentration absinkt, auf einen Wert verlangsamt, der keine Netto-DNA-Synthese oder sogar Abbau der synthetisierten DNA zur Folge hat. Noch wichtiger ist, daß assoziierte Exonucleaseaktivität eine DNA-Polymerase in Regionen in der Matrize mit Sekundärstrukturhindernissen zum Stillstand bringt. Wenn sich eine Polymerase einer solchen Struktur nähert, ve η :ngert sich ihre Synthesegeschwindigkeit, da sie bestrebt ist zu passieren. Eine assoziierte Exonuclease wird die neu synthetisier te DNA ausscheiden, wenn die Polymerase stehenbleibt. Infolgedessen laufen zahlreiche Synthese- und Exzisionszyklen ab. Das kann zur Folgo haben, daß die Polymerase möglicherweise über die Haarnadel hinaus synthetisiert (ohne Nachteil für die Qualität der Sequenzierungsreaktion); oder die Polymerase kann von dem synthetisierten Strang dissoziieren (was eine Artefaktbande in der gleichen Position bei allen vier Sequenzierungsreaktionen zur Folge hat); oder ein Kettenabbruchagens kann mit einer hohen Frequenz inkorporiert werden und eine breite Variabilität der Intensität verschiedener Fragmente in einem Sequenzierungsgel erzeugen. Das geschieht, weil sich die Einbaufrequenz eines Kettenabbruchagens an irgendeiner gegebenen Stelle mit der Anzahl der Möglichkeiten erhöht, die die Polymerase zum Einbau eines Kettenabbruchnucleotids hat, und so wird die DNA-Polymerase ein Kettenabbruchagens an Stillstandsstellen mit einer viel höheren Frequenz einbauen als an anderen Stellen. Eine ideale Sequenzierungsreaktion erzeugt Bande gleichmäßiger Intensität im gesamten Gel. Das ist wesentlich für die Erzielung der optimalen Exposition des Röntgenfilms für jedes radioaktive Fragment. Besteht eine variable Intensität radioaktiver Bande, dann besteht die Möglichkeit, daß schwächere Bande unentdeckt bleiben. Zur Erzielung gleichmäßiger radioaktiver Intensität eller Fragmente sollte die DNA-Polymerase in jeder Position auf der DNA den gleichen Zeitraum zubringen, ohne eine Bevorzugung weder für den Zusatz noch die Entfernung von Nucleotiden an einer gegebenen Stelle zu zeigen. Das geschieht, wenn der DNA-Polymerase jegliche assoziierte Exonuclease fehlt, so daß sie nur eine Möglichkeit hat, ein Kettenabbruchnucleotid in jeder Position entlang der Matrize einzubauen.
Kurze Primer
Die erfindungsgemäße DNA-Polymerase ist in der Lage, Primer aus 10 Basen oder weniger sowie längere Primer, am besten aus 4 bis 20 Bason, zu verwenden. Die Möglichkeit des Einsatzes kurzer Primer bietet eine Reihe bedeutender Vorteile für die DNA-Sequenzierung. Die kürzeren Primer sind billiger zu kaufen und leichter zu synthetisieren als die üblici ien 15-20-mer-Primer. Sie hybridisieren (anneal) auch schneller an komplementären Stellen auf einer DNA-Matrize, wodurch die Sequenzierungsreaktion beschleunigt wird. Außerdom gestattet die Möglichkeit des Einsatzes kleiner (z. B. 6 oder 7 Basen) Oligonucleotidprimer für die DNA-Sequenzierung die Anwendung von Strategien, die andernfalls für die Sequenzierung langer DNA-Fragmente nicht anwendbar sind. Zum Beispiel könnte ein 80 Zufallshexamere enthaltender Kit generiert werden, von denen keines mit anderen Stellen im Klonierungsvektor komplementär ist. Statistisch betrachtet, tritt eine dor 80 Hexamersequenzen durchschnittlich aller 50 Basen entlang dem zu sequenzierenden DNA-Fragment auf. Die Bestimmung einer Sequenz von 3000 Basen würde nur fünf Sequenzierungszyklen orfordern. Zuerst würde ein „Universal'-Primer (ζ. B. Biolabs # 1211, Sequenz 5' GTAAAACGACGGCCAGT 3') zur Sequenziarung von etwa 600 Basen an einem Ende des Inserts verwendet werden. Unter Verwendung der Resultate aus dieser Sequenzierungsreaktion würde ein neuer Primer aus dem Kit herausgegriffen werden, der homolog zu einer Region nahe dem Ende der bestimmten Sequenz ist. Im zweiten Zyklus würde did Sequenz der nächsten 600 Basen unter Verwendung dieses Primers bestimmt werden. Die fünfmalige Wiederholung dieses Prozesses würde die komplette Sequenz der 3000 Basen bestimmen, ohne irgendein Subklonieren zu erfordern und ohne die chemische Synthese irgendwelcher neuen Oligonucleotidprimer. Der Einsatz solcher kurzen Primer wird durch den Einschluß von Gen-2,5- und -4-Protein von 17 in die Sequenzierungsreaktion verstaut.
Erfindungsgemäße DNA-Polymerasen (d. h. mit den obigen Eigenschaften) umfassen modifizierte T7-Polymerasen. Das heißt, die DNA-Polymerase benötigt Wirtsthioredoxin als Untereinheit, und sie sind im wesentlichen identisch mit einer modifizierten T7-DNA-Polymerase oder mit von vorwandtemPhage wie T3,11,111, H, W31,gh-1, Y, A1122 unri Sp6 isolierten äquivalenten Enzymen. Jedes dieser Enzyme kann so modifiziert werden, daß os Eigenschaften besitzt, die denen des modifizierten T7-Enzyms ähnlich sind. Es ist möglich, das Enzym aus Phage-infizierten Zellen direkt zu isolieren, aber vorzugsweise wird das Enzym von Zellen isoliert, die eine Überproduktion davon aufweisen. Unter „im wesentlichen identisch" ist zu verstehen, daß das Enzym Aminosäuresubstitutionen aufweisen kann, die die Gesamteigenschaften des Enzyms nicht nachteilig beeinflussen. Ein Beispiel für eine besonders erwünschte Aminosäuresubstitution ist eine solche, bei der das natürliche Enzym modifiziert wird, um jegliche Exonucleaseaktivität zu beseitigen. Diese Modifikation kann auf dem genetischen oder chemischen Weg erfolgen (siehe unten).
Klonierung von T7-Polymerase
Als erfindungsgemäßes Beispiel sollen nun Klonierung, Überproduktion, Reinigung, Modifikation und Verwendung von T7-DNA-Polymerase beschrieben werden. Dieses Enzym besteht aus zwei Polypeptiden, die im stöchiometrischen Verhältnis von 1:1 einen dichten Komplex bilden. Eines ist das Phage-T7-codierte Gen-5-Protein von 84000 Dalton (Modrich et al. 15° J. Biol. Chem. 5515,1975), das andere das E.coli-codierteThioredoxin von 12000 Dalton (Tabor et al., 82 Proc. Nail. Acad. Sei. 104,1985). Das Thioredoxin ist ein nkzessorisches Protein und heftet das Gen-5-Protein (die tatsächliche DNA-Polymerase) an die Primermatrize. Die natürliche DNA-Polymerase hat eine mit ihr assoziierte sehr aktive 3'-5'-Exonuclease. Diese Aktivität macht die Polymerase unbrauchbar für die DNA-Sequenzierung und muß inaktiviert oder modifiziert werden, bevor die Polymerase verwendet werden kann. Das ist, wie nachstehend beschrieben, leicht auszuführen, und zwar entweder chemisch, durch lokale Oxidati >n der Exonucleasedomäne, oder genetisch, durch Modifizierung der Codierungsregion des diese Aktivität codierenden Polyr leasegens.
pTrx-2
Zur Klonierung des trxA-(Thioredoxin)-Gens von E. coil wurde Wildtyp-E. coll-DNA mit Sau3 A teilweise gespalten und die Fragmente an BsmHI-gespaltene T7-DNA ligiert, die vom Stamm T7 ST9 isoliert wurde (Tabor et al., in Thioredoxin and Glutaredoxln Systems: Structure and Function [Holmgren et al.. Hrsg.] S. 285-300, Raven Press, NY; und Tabor et al., siehe oben). Die ligierte DNA wurde in E. coil TrxA-Zellen transfiziert, das Gemisch wurde auf trxA~-Zellen plattiert, und die entstehenden T7-Plaques wurden gesammelt. Da T7 nicht ohne ein aktives E. coli-trxA-Gen wachsen kann, konnten nur die das trxA-Gen enthaltenden Phagen Plaques bilden. Die Monierten trxA-Gene wurden auf ein 470-Basenpaar-Hlncll-Fragment gebracht. Um eine Überproduktion von Thioredoxin zu erzielen, wurde ein Plasmid, pTrx-2, konstruiert. Kurz gesagt, wurde das das trxA-Gen enthaltende 470-Basenpaar-Hlncll-Fragment durch Standardverfahren (Maniatis et al., Cloning: A Laboratory Manual [Klonierung: Ein Laborhandbuch], Cold Spring Harbor Labs., Cold Spring Harbor, N.Y.) isoliert und an ein Derivat von pBR3X2, das einen Pta--Promotor (ptac-12, Amann et al., 25 Gen 167,1983) enthielt, ligiert. Mit Bezug auf Fig. 2 ist festzustellen, daß ptac-12, das ß-Lactamase und einen Col-El-Ursprung aufweist, mit Pvull geschnitten wurde, um ein Fragment von 2290 Basenpaaren zu gewinnen, das dann unter Verwendung von im Handel erhältlichen Linkern (Smal-BamHI-Polylinker) an zwei Tandem-Kopien von trxA (Hincll-Fragment) ligiert wurde, um pTrx-2 zu bilden. Die komplette Nucleotid-Sequenz von pTrx-2 ist in Figur 7 dargestellt. Die Thioredoxinproduktion läuft nun unter der Kontrolle des tac-Promotors abundkannso spezifisch, z. B. durch IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactosid), induziert werden.
pGP5-5undmGP1-2
Einige Genprodukte von T7 sind bei Expression in E.coil letal. Es wurde ein Expressionssystem entwickelt, um Klonierung und Expression von letalen Genen, auf der Basis der induzierbaren Expression von T7-RNA-Polymerase, zu erleichtern. Gen-5-Protein ist in einigen E.coll-Stämmen letal, und ein Beispiel für ein solches System wird von Tabor et al., 82 Proc. Nat. Acad. Sei.
1074 (1985) beschrieben, wo T7-Gen-5 unter die Kontrolle des 110-Promotors gestellt wurde und nur exprimiert wird, wenn T7-RNA-Polymerase in der Zelle vorhanden ist.
Kurz gesagt, wurde pGP5-5 (Fig. 3) durch Standardverfahrensweisen konstruiert, wobei synthetische BamHII-Linker verwendet wurden, um T7-Fragment von 14 306 (Ndel) bis 16869 (Ahalll) mit Gen-5-Gehalt mit dem 560-Basenpaar-Fragment von T7 von 5667 (Hincll) bis 6166 (Fnu4 H1), das sowohl die 11,1 A-Promotoren als auch die 11,1 B-Promotoren
enthält, die durch T7-RNA-Polymerase erkannt werden, und dem S-Kilobasenpaar-BamHI-Hlncll-Fragment von pACYC 177 zu verbinden (Chang et al., 134 J. Bactoriol 1141,1978). Die Nucleotidsequenz der T7-Inserts und Linker wird in Fig. 8 gezeigt. In diesem Plasmid wird Gen 5 nur exprimiert, wenn T7-RNA-Polymerase in der Zelle vorhanden ist.
Unter Bezugnahme auf Fig. 3 ist zu sagon, daß T7-RNA-Polymerase auf Phago-Vektor mGP 1 -2 zur Verfugung steht. Dieser ähnelt pGP 1-2 (Tabor ot al., ebenda.), mit dem Unterschied, daß das Fragment von T7 von 3133 (Haelil) bis 5840 (Hlnfl), das T7-RNA-Polymerase enthält, unter Verwendung von Linkern (BgIII) bzw. (Sail) an BamHI-Sall-geschnittenes M 13 mp8 ligiert wurde, wodurch das Polymerasegen unter dio Kontrolle des lac-Promotors gestellt wurde. Die komplette Nucleotidsequenz von mGP 1 -2 wird in Fig.9 dargestellt.
Da pGP5-5 und pTrx-2 unterschiedliche Replikationsursprünge haben (bzw. oinon P15A- und einen CoIE 1-Ursprung), können sie gleichzeitig in eine Zelle transformiert werden. pTrx-2 exprimiert große Mengen Thioredoxin in Anwesenheit von IPTG. mGP 1 -2 kann in der gleichen Zelle koexistieren wie diese beiden Plasmide und kann zur Regulierung der Expression von T7-DNA-Polymerase aus pGP5-5 verwendet werden, indem einfach die Produktion von T7-RNA-Polymerase durch Induktion des lac-Promotors mit beispielsweise IPTG herbeigeführt wird.
Überproduktion von T7-DNA-Polymerase
Es gibt mehrere potentielle Strategien für die Überproduktion und Rekonstituierung der beiden Genprodukte trxA und Gen 5. Für alle Strategien können die gleichen Zellstämme und Plasmido eingesetzt werden. Bei der bevorzugton Strategie werden die beiden Gene in der gleichen Zelle gemeinsam überexprimiert. (Und zwar, weil Gen 5 gegenüber Proteasen empfindlich ist, bis Thioredoxin daran gebunden ist.) Wie nachstehend detailliert beschrieben, besteht eine Verfahrensweise darin, die beiden Gene separat auf je zwei kompatiblen Plasmiden in der gleichen Zelle zu placieren. Wahlweise könnten die beiden Gene „in Tandem" auf dem gleichen Plasmid placiert werden. Es ist wichtig, daß das T7-Gen-5 unter die Kontrolle ernes „non-leaky" (nicht durchlässigen) induzierbaren Promotors wie ζ. Β.Φ1.1A, Φ1.1 B und Φ10 von T7 gestellt wird, da die Synthese selbst kleiner Mengen der beiden Polypeptide zusammen in den meisten E.coll-Zellen toxisch ist. Unter „non-leaky" ist zu verstehen, daß weniger als 500 Moleküle des Genproduktes pro Zellengenerationszeit aus dem Gen produziert werden, wenn der die Expression des Gens kontrollierende Promotor nicht aktiviert wird. Vorzugsweise wird das T7-RNA-Polymerase-Expressionssystem verwendet, obwohl andere Expressionssysteme, die induzierbare Promotoren ausnutzen, ebenfalls eingesetzt werden könnten. Ein „leaky" (durchlässiger) Promotor, z. B. plax, gestattet, daß mehr als 500 Proteinmoleküle synthetisiert werden, selbst wenn keine Induktion erfolgt, wodurch Zellen, die letale Gene enthalten, unter der Kontrolle eines solchen Promotors schlecht wachsen und für diese Erfindung nicht geeignet sind. Es ist natürlich möglich, diese Produkte in Zellen zu produzieren, wo sie nicht letal sind, beispielsweise ist der place-Promotor in solchen Zellen geeignet.
Bei einer zweiten Strategie kann jedes Gen kloniert und separat überexprimiert werden. Wird diese Strategie angewendet, so werden die Zellen, die die individuell überproduzierten Polypeptide enthalten, vor der Herstellung der Extrakte kombiniert, zu welchem Zeitpunkt die beiden Polypeptide eine aktive T7-DNA-Polymorase bilden.
Beispiel 1:
Produktion von T7-DNA-Polymerase
E.coll-Stamm JM103 (Messing et al., 9 Nuc. Acid Res. 309,1981) wird zur Herstellung von Vorräten an mGP1-2 verwendet. JM103 wird bei -800C in 50% Glycerol aufbewahrt und auf einer Standard-Minimalmedien-Agarplatte ausgestrichen. Über Nacht wird in 25ml Standard-M3-Medien bei 370C eine Einzelkolonie gezüchtet, und eine oinzelne Plaque von mGP 1-2 wird gowonnen, indem der Vorrat mit frisch hergestellten JM 103-Zellen titriert wird. Die Plaque wird verwendet, um 10ml 2X LB (2% Bacto-Trypton, 1 % Hefeextrakt, 0,5% NaCI, 8mM NaOH) mit JM 103-Gehalt, das auf einen Wert von A590 = 0,5 gezüchtet wurde, zu inokulieren. Diese Kultur liefert den Phagenvorrat für die Herstellung einer großen Kultur von mGP 1-2. Nach 3 bis 12 Stunden wird die 10-ml-Kultur zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wird verwendet, um die große Kultur (2I) zu infizieren. Für die große Kultur werden 4x 500ml 2X LB mit 4x 5ml in M9 gezüchteten 71.18-Zellen geimpft und bei 370C geschüttelt. Wenn die große Zellkultur auf einen Wert von Am0 = 1,0 (etwa drei Stunden) gewachst ι ist, wird sie mif 10rnl überstehender Flüssigkeit, die das Starterlysat von mGP 1 -2 enthält, geimpft. Die infizierten Zellen werden dann über Nacht bei 370C gezüchtet. Am nächsten Tag werden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, und die überstehende Flüssigkeit ist bereit zur Verwendung für dia Induktion von K38/pGP5-5/pTrx-2 (siehe unten). Die überstehende Flüssigkeit kann etwa 6 Monate bei 40C bei einem Titer von ~5 x 1 θ" l/ml gelagert werden. Bei diesem Titer infiziert 11 Phage 12I Zellen bei einem Wert von A690 = 5 mit einer Infektionsmultiplizität von 15. Ist der Titer niedrig, kann der mGP 1 -2-Phage aus der überstehenden Flüssigkeit konzentriert werden, indem NaCI (60g/l) und PEG-6000 (65g/l) in der überstehenden Flüssigkeit gelöst werden, gestattet wird, daß sich das Gemisch im Vorlaufe von 1 bis 72 Stunden bei O0C absetzt, und dann zentrifugiert wird (7000U/Min., 20 Minuten lang). Das Präzipitat, das den mGP 1 -2-Phagen enthält, wird in etwa einem Zwanzigstel des ursprünglichen Volumens der M9-Medien resuspendiert.
K38/pGP5-5/pTrx-2 ist der E.coli-Stamm (Genotyp HfrC (λ)), der die beiden kompatiblen Plasmide pGP5-5 und pTrx-2 enthält. Plasmid pGP5-5 hat einen P15A-Replikationsursprung und exprimiert das Kanamycin (Km)-Rosistenzgen. pTrx-2 hat einen CoIEI-Replikationsursprung und exprimiert das Ampicillin (Ap)-Resistenzgen. Die Plasmide werden durch Standardverfahren in K38 eingeführt, wobei Km" bzw. Ap" ausgewählt werden. Die Zellen K38/pGP5-5/pTrx-2 werden in 50% Glycerol bei -800C aufbewahrt. Vor der Verwendung werden sie auf einer Platte ausgestrichen, die 50pg/ml Ampicillin und Kanamycin enthält, über Nacht bei 370C gezüchtet, und eine einzelne Kolonie wird 4 bis 6 Stunden bei 370C in 10ml LB-Medien mit einem Gehalt von 50MgAnI Ampicillin und Kanamycin gezüchtet. Die 10-ml-Zellkultur wird verwendet, um 500ml LB-Medien mit einem Gehalt von 50pg/ml Ampicillin und Kanamycin zu impfen, und wird über Nacht bei 37°C geschüttelt. Am folgenden Tag wird die 500-ml-Kultur verwendet, um 1212X LB-KPGyMedien (2% Bacto-Trypton, 1 % Hefeextrakt, 0,5% NaCI, 2OmM KPO4,0,2% Dextrose und 0,2% Casaminosäuren, pH 7,4) zu impfen, und wird unter Belüftung bei 370C in einem Fermentor gezüchtet. Wenn die Zellen einen Wert von A690 = 5,0 erreichen (d.h. Zellen der logarithmischen und der stationären Wachstumsphase), werden sie mit mGP1-2 bei einer Infektionsmultiplizität von 10 infiziert, und IPTG wird zugesetzt (Endkonzentration 0,5mM). IPTG induziert die Produktion von Thioredoxin und die T7-RNA-Polymerase in mGP 1 -2 und induziert folglich die Produktion der Monierten DNA-Polymerase. Die Zellen werden weitere 2,5 Stunden unter Rühren und Belüftung gezüchtet und dann geerntet. Das Zellenpellet wird in 1,51 von 10% Sucrose/20mM Tris-HCI, pH 8,0/ 25mM EDTA resuspendiert und erneut geschleudert („re-spun"). Schließlich wird das Zellenpellet in 200ml von 10% Sucrose/20mM Tris-HCI, pH 8/1,OmM EDTA resuspendiert und in flüssigem N2 gefroren. Aus 121 induzierten Zellen werden 70g Zellpaste gewonnen, die etwa 700mg Gen-5-Protein und 100mg Thioredoxin enthalten.
K38/pTrx-2 (K38, das nur pTrx-2 enthält) liefert eine Überproduktion von Thioredoxin, und es wird als „Booste " zu Extrakten von K38/pGP 5-5/pTrx-2 hinzugegeben, um zu sichern, daß Thioredoxin Im Überschuß gegenüber Gen-5-Protem am Anfang der Reinigung vorhanden ist. Die K38/pTrx-2-Zellen werden bei -80°C in 50% Glycerol aufbewahrt. Vor der Verwendung werden sie auf einer 50pg/ml Ampicillin enthaltenden Platte ausgestrichen, 24 Stunden bei 27°C gezüchtet, und eine einzelne Kolonie wird über Nacht bei 370C in 25ml LB-Modien mit einem Gehalt von 50pg/ml Ampicillin gozüchtet. Die 25-ml-Kultur wird verwendet, um 2I 2X LB-Medien zu impfen, und bei 370C geschüttelt. Wenn die Zellen einen Wert von A60O = 3,0 erreichen, werden der ptac-Promotor und somit die Thioredoxinproduktion durch den Zusatz von IPTG (Endkonzentration 0,5mM) induziert. Die Zellen werden umer Schütteln weitere 12 bis 16 Stunden bei 37°C gezüchtet, geerntet, in 600ml von 10% Sucrose/20mM Tris-HCI, pH 8,0/25mM EDTA resuspendiert und erneut geschleudert. Schließlich werden die Zellen in 40ml von 10% Sucrose/20mM Tris-HCI, pH 8/0,5mM EDTA resuspendiert und in flüssigem N2 gefroren. Aus 21 Zellen werden 16g Zellpaste mit einem Gehalt von 150mg Thioredoxin gewonnen.
Analysen auf die Polymerase umfassen die Verwendung von einzelsträngiger Kalbsthymus-DNA (6mM) als Substrat. Dieses wird unmittelbar vor der Verwendung durch Denaturierung von doppelsträngiger Kalbsthymus-DNA mit 5OmM NaOH bei 20°C über einen Zeitraum von 15 Minuten, woran sich Neutralisierung mit HCI anschließt, hergestellt. Jede gereinigte DNA kann als Matrize für die Polymeraseannlyse verwendet werden, wenngleich sie vorzugsweise eine Länge von mehr als 1000 Basen haben sollte.
Die angewendete Standard-T7-DNA-Polymerase-Analyse ist eine Modifikation des von Grippo et al. (246J. Biol. Chem. 6867, 1971) beschriebenen Verfahrens. Das Standardreaktionsgemisch (200μΙ Endvolumen) enthält 4OmM Tris-HCI pH 7,5,1OmM MgCI2,5mM Dithiothreitol, lOOnmol Alkali-denaturierte Kalbsthymus-DNA, 0,3mM dGTP, dATP, dCTP und /3HAdTTP (20cpm/ pm), 50pg/ml BSA und variierende Mengen T7-DNA-Polymerase. Die Inkubation erfolgt bei 370C (10°C-45°C) über einen Zeitraum von 30 Minuten (5 Minuten-60 Minuten). Die Reaktion wird durch den Zusatz von 3 ml kaltem (0°C) 1 N HCI-0.1M Pyrophosphat gestoppt. Säureunlösliche Radioaktivität wird durch das Verfahren von Hinkle et al. (250 J. Biol. Chem. 5523,1974) bestimmt. Die DNA wird 15 Minuten (5 Minuten-12 Stunden) auf Eis, dann durch Filtration auf Glasfaserfiltern präzipitiert. Die Filter werden fünfmal mit 4 ml kaltem (O0C) 0,1 M HCI-0,1 M Pyrophosphat und zweimal mit kaltem (O0C) 90%igem Ethanol gewaschen. Nach dem Trocknen wird die Radioaktivität auf den Filtern unter Verwendung von nichtwäßrigem Szintillationsfluor gezählt.
Eine Einheit Polymeraseaktivität katalysiert bei 370C im Verlaufe von 30 Minuten den Einbau von lOnmol Gesamtnucleotid in eine säurelösliche Form, und zwar unter den oben angegebenen Bedingungen. Native T7-DNA-Polymerase und modifizierte T7-DNA-Polymerase (siehe nachstehend) haben die gleiche spezifische Polymeraseaktivität ±20%, die, je nach Herstellung, bei Anwendung der oben angegebenen Standard-Analysebedingungen zwischen 5000 und 8000 Einheiten/mg liegt. T7-DNA-Polymerase wird aus den obigen Extrakten durch Präzipitation und chromatografische Verfahrensweisen gereinigt. Es folgt ein Beispiel für eine solche Reinigung.
Ein Extrakt gefrorener Zellen (200ml K38/pG5-5/pTrx-2 und 40ml K38/pTrx-2) wird über Nacht aufgetaut. Die Zellen werden zusammengenommen, und 5ml Lysozym (15mg/ml) und 1OmINaCI (5M) werden zugesetzt. Nach 45 Minuten bei O0C werden die Zellen in ein Wasserbad von 370C gelegt, bis ihre Temperatur 20°C erreicht ist. Dann werden die Zellen in flüssigem N2 gefroren. Weitere 50 ml NaCI (5 M) werden zugesetzt, und die Zellen werden in einem Wasserbad von 370C aufgetaut. Nach dem Auftauen werden die Zellen bei O0C 60 Minuten lang sanft gemischt. Das Lysat wird eine Stunde lang in einem Beckman-45Ti-Rotor bei 35000 U/Min, zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit (250ml) ist Fraktion I. Sie enthält ungefähr 700mg Gen-5-Protein und 250mg Thioredoxin (in einem Verhältnis von Thioredoxin zu Gen-5-Protein von 2:1).
90g Ammoniumsulfat werden in Fraktion I (250 ml) gelöst und 60 Minuten lang gerührt. Man läßt die Suspension sich 60 Minuten lang absetzen, und das entstehende Präzipitat wird durch 60minütiges Zentrifugieren bei 8000 U/Min, gesammelt. Das Präzipitat wird in 300ml von 2OmM Tris-HCI pH 7,5/5mM2-Mercaptoethanol/0,1 mMEDTA/10% Glycerol (Puffer A) wieder aufgelöst. Das ist Fraktion II.
Es wird eine Whatman-DE52-DEAE-Säule (12,6 cmzx 18cm) hergestellt und mit Puffer A gewaschen. Fraktion Il wird über Nacht anhand von zwei Wechseln von je 11 Puffer A dialysiert (Puffer mit einer Endleitfähigkeit, die gleich der von Puffer A mit Gehalt von 10OmM NaCI ist). Die dialysierte Fraktion Il wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 100ml/h auf die Säule gebracht und mit 400ml Puffer A mit Gehalt von 10OmM NaCI gewaschen. Proteine worden mit einem 3,5-l-Gradienten von 100 bis 40OmM NaCI in Puffer A mit einer Fließgeschwindigkeit von 60ml/h eluiert, Fraktionen mit Gehalt von T7-DMA-Polymerase, die bei 20OmM eluiert werden, werden „gepoolt". Das ist Fraktion III (190ml).
Es wird eine Säule von Whatman P11 Phosphocellulose (12,6cm2 x 12cm) hergestellt und mit 2OmM KPO4, pH 7,4/5mM 2-Mercaptoethanol/0,1 mM EDTA/10% Glycerol (Puffer B) gewaschen. Fraktion III wird zweifach (380ml) mit Puffer B verdünnt, dann mit einer Fließgeschwindigkeit von 60ml/h auf die Säule gebracht und mit 200ml Puffer B mit Gehalt an 10OmM KCI gewaschen. Proteine werden mit einem 1,8-l-Gradienten von 100 bis 40OmM KCI in Puffer B mit einer Fließgeschwindigkeit von 60ml/h eluiert. Fraktionen mit Gehalt an T7-DNA-Polymerase, die bei 30OmM KCI eluiert, werden „gopoolt". Das ist Fraktion IV (370ml).
Es wird eine Säule von DEAE-Sephadex A-50 (4,9cm2 χ 15cm) hergestellt und mit 2OmM Tris-HCI 7,0/1 mM Dithiothreitol/ 0,1 mM EDTA/10% Glycerol (Puffer C) gewaschen. Fraktion IV wird anhand von zwei Wechseln von 11 Puffer C bis zu einer Endleitfähigkeit, die gleich der von Puffer C mit Gehalt von 10OmM NaCI ist, dialysiert. Die dialysierte Fraktion IV wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 40ml/h auf die Säule gebracht und mit 150ml Puffer C mit Gehalt von 10OmM NaCI gewaschen. Proteine werden mit einem 1-l-Gradienten von 100 bis 30OmM NaCI in Puffer C bei einer Fließgeschwindiokeit von 40ml/h eluiert. Fraktionen mit Gehalt von T7-DNA-Polymerase, die bei 21OmM NaCI eluiert, werden „gepoolt". Das ist Fraktion V (120ml).
Eine Säule von BioRad HTP Hydroxylapatit (4,9cm2 χ 15cm) wird hergestellt und mit 2OmM KPO4, pH 7,4/1OmM 2-Mercaptoethanol/2 mM Na-Citrat/10% Glycerol (Puffer D) gewaschen. Fraktion V wird anhand von zwei Wechseln von je 500 ml Puffer D dialysiert. Die dialysierte Fraktion V wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 30ml/h auf die Säule gebracht und mit Puffer D gewaschen. Proteine werden mit einem 900-ml-Gradienten von 0 bis 18OmM KPO4, pH 7,4 in Puffer D mit einer Fließgeschwindigkeit von 30ml/h eluiert. Fraktionen mit Gehalt von T7-DNA-Polymerase, die bei 5OmM KPO4 eluiert, werden „gepoolt". Das ist Fraktion Vl (130ml). Sie enthält 270mg homogene T7-DNA-Polymerase.
Fraktion Vl wird mittels 2OmM KPO4, pH 7,4/0,1 mM Dithiothreitol/0,1 mM EDTA/50% Glycerol dialysiert. Das ist konzentrierte Fraktion Vl (~65ml, 4mg/ml), die bei -2O0C aufbewahrt wird.
Die isolierte T7-Polymerase weist - verbunden damit - Exonucleaseaktivität auf. Wie oben festgestellt wurde, muß diese inaktiviert werden. Es folgt ein Beispiel für Inaktivierung durch chemische Modifikation.
Konzentrierte Fraktion Vl wird über Nacht mittels 2OmM KPO4, pH 7,4/0,1 mM Dithiothreitol/10% Glyoerol dialysiert, um das in dem Vorratspuffer vorhandene EDTA zu entfernen. Nach der Dialyse wird die Konzentration mit 2OmM KPO4, pH 7,4/0,1 mM Dithiothreitol/10% Glycerol auf 2mg/ml eingestellt und 30-ml-(2mg/ml)-Aliquoten werden in 50-ml-Polypropylenröhrchen gegeben. (Die Molkonzentration von T7-DNA-Polymerase beträgt bei 2mg/ml 22μΜ.) Dithiothreitol (DTT) und Ferroammonsulfat (Fe(NH4)2(SO4)26 H2O) werden unmittelbar vor der Verwendung frisch hergestellt und zu einer 30-ml-Aliquote von T7-DNA-Polymerase bis zu Konzentrationen von 5mM DTT (ON 6ml eines 250-mM-Vorrates) und 20μΜ Fe(NH4)2(SO4)26H2O (0,6ml eines 1-mM-Vorrates) hinzugegeben.
Während der Modifikation betragen die Molkonzentrationen von T7-DNA-Polymerase und Eisen jeweils ungefähr 20μΜ, während DTT in einem 250fachen Molüberschuß vorliegt.
Die Modifikation erfolgt bei O0C unter einer gesättigten Sauerstoffatmosphäre wie folgt. Das Reaktionsgemisch wird in einem Exsikkator auf Eis gogeben, der Exsikkator wird durch Evakuieren entlüftet und anschließend mit 100% Sauerstoff gefüllt. Dieser Zyklus wird dreimal wiederholt. Die Reaktion kann in Luft (20% Sauerstoff) ausgeführt werden, verläuft aber mit einem Drittel der Geschwindigkeit.
Der zeitliche Verlauf des Abbaus der Exonucleaseaktivität wird in Fig. 4 dargestellt. 3H-markierte doppelsträngige DNA (6cpm/ pmol) wurde, wie von Richardson beschrieben (15J. Molec. Biol. 49,1966), aus Bacteriophage T7 hergestellt. 3H-markierte einzelsträngige T7-DNA wurde unmittelbar vor der Verwendung durch Denaturierung von doppelsträngiger 3H-markierter T7-DNA mit 5OmM NaOH bei20°Cim Verlaufe von 15 Minuten hergestellt, woran sich Neutralisierung mit HCI anschloß. Die angewendete Standard-Exonucleaseanalyse ist eine Modifikation des von Chase et al. (siehe oben) beschriebenen Verfahrens. Das Standard-Reaktionsgemisch (100μΙ Endvolumen) enthielt 4OmM Tris-HCI pH 7,5,1OmM MgCI2,1OmM Dithiothreitol, 60nmol 3H-markierte einzelsträngige T7-DNA (6cpm/pm) und variierenden Mengen T7-DNA-Polymerase. 3H-markierte doppelsträngige T7-DNA kann auch als Substrat verwendet werden. Ebenso kann jede gleichförmig radioaktive markierte DNA, ob einzel- oder doppelsträngig, für die Analyse eingesetzt werden. Auch 3'-endmarkierte einzel- oder doppelsträngige DNA kann für die Analyse verwendet werden. Nach Inkubation über einen Zeitraum von 15 Minuten bei 370C wird die Reaktion durch den Zusatz von 30μΙ BSA (10mg/ml) und 25μΙ TCA (100% Ma.-Vol.) gestoppt. Die Analyse kann bei 10°C-45°C über einen Zeitraum von 1-60 Minuten durchgeführt werden. Die DNA wird im Verlaufe von 15 Minuten (1 Minute-12 Stunden) auf Eis präzipitiert, dann bei 12000g 30 Minuten (5 Minuten-3 Stunden) lang zentrifugiert. ΙΟΟμΙ der überstehenden Flüssigkeit werden zur Bestimmung der säurelöslichen Radioaktivität vorwendet, indem sie zu 400μΙ Wasser und 5ml wäßrigem Szintillationscocktail hinzugegeben werden.
Eine Einheit Exonucleaseaktivität katalysiert die Säuresolubilisierung von lOnmol Gesamtnucleotid unter den Bedingungen der Analyse im Verlaufe von 30 Minuten. Native T7-DNA-Polymerase hat bei Anwendung der oben angegebenen Standardanalysebedingungen eine spezifische Exonucleaseaktivität von 5000 Einheiten/mg. Die spezifische Exonucleaseaktivität der modifizierten T7-DNA-Polymerase ist vom Ausmaß der chemischen Modifikation abhängig, ist aber idealerweise mindestens 10- bis lOOfach niedriger als die der nativen T7-DNA-Polymerase bzw. beträgt bei Anwendung der oben angegebenen Standardanalysebedingungen 500 bis 50 oder weniger Einheiten/mg.
Unter den aufgezeigten Bedingungen zerfällt die Exonucleaseaktivität exponentiell mit einer Halbwertszeit des Zerfalls von acht Stunden. Einmal täglich wird das Reaktionsgemisch im Reaktionsgefäß gemischt, um den löslichen Sauerstoff zu verteilen, andernfalls verläuft die Reaktion an der Oberfläche, wo die Sauerstoffkonzentration höher ist, schneller. Einmal pro Tag werden 2,5mM DTT (0,3ml eines frischen 250-mM-Vorrates zu einer 30-ml-Reaktion) zugesetzt, um das oxidierte DTT zu ergänzen. Nach acht Stunden ist die Exonucleaseaktivität von T7-DNA-Polymerase bei einem vernachlässigbaren Verlust an Polymeraseaktivität um 50% reduziert worden. Der 50%ige Rückgang ist eher das Resultat der kompletten Inaktivierung der Exonucleaseaktivität der Hälfte der Polymerasemoleküle als einer generellen Reduzierung der Rate der Exonucleaseaktivität bei allen Molekülen. So haben nach einer achtstündigen Reaktion alle Moleküle eine normale Polymeraseaktivität, die Hälfte der Moleküle hat eine normale Exonucleaseaktivität, während die andere Hälfte weniger als 0,01 % ihrer ursprünglichen Exonucleaseaktivität aufweist.
Wenn 50% der Moleküle modifiziert werden (achtstündige Reaktion), ist das Enzym, wenn auch suboptimal, für die DNA-Sequenzierung geeignet. Für eine optimalere Qualität der DNA-Sequenzierung läßt man die Reaktion bis zu einer mehr als 99%igen Modifikation (weniger als 50 Einheiten Exonucleaseaktivität) verlaufen, was 4 Tage in Anspruch nimmt. Nach vier Tagen wird das Reaktionsgemisch anhand von zwei Wechseln von 250 ml von 20 mM KPO4 pH 7,4/0,1 mM Dithiothreitol/0,1 mM EDTA/50% Glycerol dialysiert, um das Eisen zu entfernen. Die modifizierte T7-DNA-Polymerase (~4mg/ml) wird bei -2O0C aufbewahrt.
Der Reaktionsmechanismus für die chemische Modifizierung von T7-DNA-Polymerase ist von reaktiven Sauerstoffarten abhängig, die durch die Anwesenheit von reduzierten Übergangsmetallen wie Fe2* und Sauerstoff erzeugt werden. Im folgenden wird ein möglicher Reaktionsmechanisrnus für die Erzeugung von Hydroxylradikalen dargestellt:
Fe^ + O2->Fe3* + o; (1)
2 O2" + 2 H* -> H2O2 + O2 (2)
Fe'* + H2O2^Fe1'+ OH'+ OH' (3)
In Gleichung 1 ergibt die Oxidation des reduzierten Metallions Superoxidradikal O2". Das Superoxidradikal kann eine Dismutationsreaktion erfahren, wobei Wasserstoffperoxid (Gleichung 2) erzeugt wird. Schließlich kann Wasserstoffperoxid mit reduzierten Metallionen reagieren, um Hydroxylradikale, OH' (Fentonreaktion, Gleichung 3) zu bilden. Das oxidierte Metallion wird durch Reduktionsmittel wie Dithiothreitol (DTT) zu der reduzierten Form zurückgeführt.
Diese reaktiven Sauerstoffarten inaktivieren wahrscheinlich Proteine, indem sie spezifische Aminosäurereste chemisch irreversibel verändern. Eine solche Schädigung wird bei SDS-PAGE von durch CNBr oder Trypsin erzeugten Fragmenten von Gon 5 beobachtet. Einige Fragmente verschwinden, es erfolgt Vernetzung hoher relativer Molekülmassen, und einige Fragmente werden in kleinere Fragmente zerbrochen.
Wie vorstehend erwähnt wurde, sind Sauerstoff, ein Reduktionsmittel (z. B. DTT, 2-Mercaptoethanol) und ein Übergangsmetall
(z. B. Eisen) wesentliche Elemente dar Modifizierungsreaktion. Die Reaktion erfolgt in Luft, wird aber durch Verwendung von 100% Sauerstoff dreifach stimuliert. Die Reaktion verläuft in Abwesenheit von zugesetzten Übergangsmetallen aufgrund der Anwesenheit von Übergangsmetallspuron (1-2μΜ) in den meisten Pufferpräparaten langsam.
Wie erwartet, sind z. B. anaerobe Bedingungen (z. B. N2) und Metallchelatoren (z. B. EDTA, Citrat, Nitrilotriacetat) Inhibitoren der Modifizierungsreaktion. Außerdem inhibieren die Enzyme Catalase und Superoxiddismutase, übereinstimmend mit der wesentlichen Rolle reaktiver Sauerstoffarten bei der Erzeugung modifizierter T7-DNA-Polymerase, die Reaktion.
DNA-Sequenzierung unter Verwendung von modifizierter T7-DNA-Polymerase
DNA-Synthesereaktionen unier Verwendung von modifizierter T7-DNA-Polymerase resultieren in Kettenabbruchfragmenten gleichförmiger radioaktiver Intensität im gesamten Bereich von einigen Basen bis zu Tausenden Basen Länge. Es besteht praktisch kein Hintergrund aufgrund von Abbruchen an Stellen, die unabhängig vom Einbau von Kettenabbruchagenzien sind (d.h. „Pause"-Stellen oder Sekundärstrukturhindernisse).
Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung von modifizierterT7-DNA-Polymerase bestehen aus „pulse" und „chase". Unter „pulse" ist zu verstehen, daß ein kurzes markiertes DNA-Fragment synthetisiert wird; unter „chase" ist zu verstehen, daß das kurze Fragment verlängert wird, bis ein Kettenabbruchagens eingebaut wird. Das Prinzip für jeden Schritt unterscheidet sich von konventionellen DNA-Sequenzierungsreaktionen. Btim „pulse" wird die Reaktion bei 0°C-37°C über einon Zeitraum von 0,5 bis 4 Minuten in Anwesenheit hoher Werte von drei Nucleotidtriphosphaten (z. B. dGTP, dCTP und dTTP) und von Grenzwerten eines anderen markierten, trägerfreien Nucleotidtriphosphats, z. B. /35S/dATP, inkubiert. Unter diesen Bedingungen kann die modifizierte Polymerase ihren prozessiven Charakter nicht zeigen, und eine Population radioaktiver Fragmente, deren Größe von einigen wenigen Basen bis zu mehreren hundert Basen reicht, wird synthetisiert. Der Zweck des „pulse" besteht darin, jeden Primer radioaktiv zu markieren, wobei maximale Radioaktivität unter Einsatz minimaler Mengen radioaktiver Nucleotide eingebaut wird. Bei diesem Beispiel vorhindern zwei Bedingungen in der „pulse"-Reaktion (niedrige Temperaturen, z. B. O0C bis 2O0C, und Grenzwerte von DATP, z.B. 0,1 μΜ bis 1 μΜ), daß die modifizierte T7-DNA-Polymerase ihren prozessiven Charakter entfaltet. Andere wesentliche Umgebungskomponenten des Gemisches haben ähnliche Effekte, z. B. die Limitierung von mehr als einem Nucleotidtriphosphat. Ist der Primer bereits markiert (z. B. durch Kinasierung), ist kein „pulse"-Schritt erforderlich.
Beim „chase"-Schritt wird die Reaktion bei 45°C über einen Zeitraum von 1 bis 30 Minuten in Anwesenheit hoher Werte (50 bis 500μΜ) aller vier Desoxynucleosidtriphosphate und von Grenzwerten (1 bis 50μΜ) von einem der vier Kettenabbruchagenzien, z. B. Didesoxynucleosidtriphosphaten, inkubiert, so daß die DNA-Synthese nach durchschnittlich 50 bis 600 Basen abgebrochen wird. Der Zweck von „chase" besteht darin, jeden radioaktiv markierten Primer unter Bedingungen prozessiver DNA-Synthese zu verlängern, wobei jede Extension ausschließlich an korrekten Stellen in vier separaten Reaktionen unter Einsatz jedes der vier Didesoxynucleosidtriphosphate terminiert wird. Zwei Bedingungen von „chase" (hohe Temperatur [z. B. 30-5O0Cl und hohe Werte [über 50μΜ] aller vier Desoxynucleosidtriphosphate) gestatten es, daß die modifizierte T7-DNA-Polymerase ihren prozessiven Charakter für Zehntausende Basen entfaltet; so synthetisiert das gleiche Polymerasemolekül aus der Primermatrize, bis ein Didesoxynucleotid eingebaut ist.
Bei einer „chase"-Temperatur von 450C erfolgt die Synthese mit > 700 Nucleotiden/Sekunde. Somit ist der „chase"-Schritt für Sequenzierungsreaktionen in weniger als einer Sekunde komplett, ssb erhöht die Prozessivität, beispielsweise, wenn dlTP verwendet wird oder wenn niedrige Temperaturen oder niedrige Triphosphatwerte über die gesamte Sequenzierungsreaktior, angewendet werden.
Bei den DNA-Sequenzierungsreaktionen mit modifizierter T7-DNA-Polymerase können entweder /ct35S/dATP, /o.32P/dATP oder fluoreszenzmarkierte Nucleotide verwendet werden. Ist ein Analogon fluoreszierend, dann werden entmarkierte Primer verwendet, und es ist kein Sondenschritt erforderlich.
Zwei Komponenten bestimmen die durchschnittlichen Extensionen der Synthesereaktionen. Die erste Komponente ist die Zeitdauer der „pulse"-Reak(ion. Da der „pulse" in Abwesenheit von Kettenabbruchagenzien ausgeführt wird, gilt: Je langer die „pulse"-Reaktionszeit, desto länger die Primerextensionen. Bei O0C betragen die Polymeraseextensionen im Durchschnitt 10 Nucleotide/Sekunde. Die zweite Komponente ist das Verhältnis der Desoxynucleosidtriphosphate zu den Kettenabbruchagenzien in der „chase"-Reaktion. Eine modifizierte T7-DNA-Polymerase wendet sich nicht gegen den Einbau dieser Analoga, so beträgt die durchschnittliche Länge der Extension bei „chase" viermal des Verhältnisses der Desoxynucleosidtriphosphatkonzentration zur Konzentration des Kettenabbruchagens bei der „chase'-Reaktioii. So wird, um die durchschnittliche Größe der Extensionen abzukürzen, die „pulse"-Zeit verkürzt, z. B. auf 30 Sekunden, und das Verhältnis des Kettenabbruchagens zur Desoxynucleosidtriphosphatkonzentration wird bei der „chase"-rteaktion erhöht. Das kann bewirkt werden, indem entweder die Konzentration des Kettenabbruchagens erhöht wird oder die Konzentration von Desoxynucleosidtriphosphat gesenkt wird. Zur Erhöhung der durchschnittlichen Länge der Extensionen wird die „pulse"-Zeit erhöht, z. B. auf 3 bis 4 Minuten, und die Konzentration des Kettenabbruchagens bei der „chase"-Reaktion wird gesenkt (z. B. von 20MMauf2pM).
Beispiel 2: DNA-Sequenzierung unter Verwendung von modifizierter T7-DNA-Polymerase
Es folgt ein Beispiel für ein Sequenzierungsprotokoll unter Einsatz von Didesoxynucleotiden als Abbruchagenzien. 9 μΙ einzelsträngige M13-DNA (mGP 1 -2, hergestellt nach Standardverfahren) mit einer Konzentration von 0,7 mM werden mit 1 μΙ komplementärem Sequenzierungsprimer(Standard-Universal-17-mer,0,5pmol-Primer/pl) und2,5pl 5X „annealing"-Puffer (Hybridisierungspuffer) (20OmM Tris-HCI, pH 7,5,5OmM MgCI2), der auf 65°C erhitzt ist, 3 Minuten lang gemischt und langsam im Verlaufe von 30 Minuten auf Raumtemperatur abgekühlt. Bei der „pulse"-Reaktion wurden 12,5μΙ des obigen hybridisierten
(„annealed") Gemisches mit 1 μΙ Dithiothreitol 0,1 M, 2 μΙ 3dNTP, (dQTP, dCTP, dTTP) von je 3 mM (P. L. Biochemical, in TE), 2,5μΙ /o.36S/dATP, (1 500Ci/mmol, New England Nuclear) und 1 μΙ der in Beispiel 1 beschriebenen modifizierten T7-DNA-Polymerase (0,4 mg/ml, 2 500 Einheiten/ml, d. h. 0,4 μρ, 2,5 einer Mikrozentrifuge für die Dauer von 1 Sekunde, bei O0C 2 Minuten lang inkubiert. Die Inkubationszeit kann zwischen 30 Sekunden und 20 Minuten variieren, und die Temperatur kann zwischen O0C und 37 0C liegen. Längero Zeiten werden für die Sequenzierung von Sequenzen verwendet, die weiter vom Primer entfernt liegen. 4,5-pl-Aliquoten der obigen „pulse"-Reaktion werden in jedes der vier Röhrchen gegeben, die die auf 450C vorgewärmten „chase"-Gemische enthalten. Die vier mit G, A, T, C markierten Röhrchen enthalten jeweils Spuren von Didesoxy (dd) G, A, T oder C (P-L Biochemical). Die spezifischen „chase"-Lösungen sind nachstehend angegeben. Jedes Röhrchen enthält 1,5μΙ cJATP
1 mM, Ο,δμΙ 5X „annealing"-Puffer (20OmM Tris-HCI, pH 7,5,5OmM MgCI2) und 1,0μΙ ddNTP 100μΜ (wobei ddNTP ddG, A, T oder C in den betreffenden Röhrchen entspricht). Jede „chase"-Reaktion wird 10 Minuten bei 45°C (oder 3O0C-SO0C) inkubiert, und dann werden 6μΙ Stopplösung (90% Formamid, 10mm EDTA, 0,1% Xylen-Cyanol) in jedes Röhrchen gegeben, und das Röhrchen wird auf Eis gestellt. Die „chase"-Zeiten können von 1 bis 30 Minuten variieren.
Die Sequenzierungsreaktionen werden 6 Stunden bei 30 Watt auf Standard-6-%-Polyacrylamid-Sequenzierungsgel in 7 M Harnstoff durchgeführt. Bevor die Reaktionen auf einem Gel ablaufen, wird 2 Minuten auf 750C erhitzt. Das Gel wird in 10% Essigsäure, 10% Methanol fixiert, auf einem Geltrockner getrocknet und über Nacht einem Kodak-OM1-Hochkontrast-Autoradiographiefilm ausgesetzt.
Beispiel 3: DNA-Sequenzierung unter Verwendung von Grenzkonzentrationen von dNTPt
Bei diesem Beispiel wird die DNA-Sequenzanalyse von mGP 1-2-DNA unter Verwendung von Grenzwerten aller vier Desoxyribonucleosidtriphosphate in der „pulse'-Reaktion ausgeführt. Diese Methode weist eine Reihe von Vorteilen gegenüber dem Protokoll von Beispiel 2 auf. Erstens verläuft die „pulse"-Reaktion bis zum Abschluß, während es bei dem vorherigen Protokoll notwendig war, einen Zeitablauf zu unterbrechen. Folglich lassen sich die Reaktionen leicnter durchführen. Zweitens ist es bei dieser Methode leichter, das Ausmaß der Elongationen beim „pulse" zu kontrollieren, und so wird die Effizienz der Markierung von Sequenzen in der Nähe des Primers (die ersten 50 Basen) auf etwa das Zehnfache erhöht.
7μΙ 0,75 mM einzelsträngige M13-DNA (mGP 1-2) wurden mit 1 μΙ komplementärem Sequenzierungsprimer (17-mer, 0,5pmol Primer/μΙ) und 2μΙ 5X „annealing"-Puffer (20OmM Tris-HCI pH 7,5, 5OmM MgCI2,25OmM NaCI) gemischt, 2 Minuten lang auf 650C gehalten und langsam im Verlaufe von 30 Minuten auf Raumtemperatur abgekühlt. Bei der „pulse"-Reaktion wurden 10μΙ des obigen hybridisierten Gemisches mit 1 μΙ Dithiothreitol 0,1 M, 2μΙ 3dNTPs (dGTP, dCTp, dTTP) je 1,5μΜ, 0,5 pl/o.36S/dATP, (1 öOOCi/mmol, New England Nuclear) und 2μΙ modifizierter T7-DNA-Polymerase (0,1 mg/ml, 2000 Einheiten/ml, d.h. 0,2|jg,
2 Einheiten) gemischt und 5 Minuten bei 370C inkubiert. (Inkubationstemperatur und -zeit können von 20°C-45°C bzw. von 1 bis 60 Minuten variieren.)
Es wurden 3,5^I-Aliquoten der obigen „pulse'-Reaktion in jedes von vier Röhrchen gegeben, welche die „chase"-Gemische, die auf 370C vorgewärmt waren, enthielten. Dia vier mit G, A, T, C markierten Röhrchen enthalten jeweils Spuren von Didesoxy-G-A, -T, -C. Die spezifischen „chase"-Lösungen sind nachstehend angegeben. Jedes Röhrchen enthält 0,5μΙ GX „annealing"-Puffer (20OmM Tris-HCI pH 7,5, 5OmM MgCI2, 25OmM NaCI), 1 μΙ 4dNTPs (dGTP, dATP, dTTP, dCTP), jeweils 200μΜ, und 1,0μΙ ddNTP 20μΜ. Jede „chase"-Reaktion wird 5 Minuten bei 370C (1 bis 60 Minuten bei 20°C-45°C) inkubiert, und dann werden 4μΙ einer Stopplösung (95% Formamid, 2OmM EDTA, 0,05% Xylen-Cyanol) in jedes Röhrchen gegeben, und das Röhrchen wird auf Eis gestellt.
Beispiel 4: Ersatz von dGTP durch dITP zur DNA-Sequenzierung
Zur Sequenzierung durch Kompressionsregionen in DNA, d.h. Regionen mit kompakter Sekundärstruktur, hindurch, ist es üblich, dITP oder Deazaguanosintriphosphat (Deaza-GTP, Mizusawa et al., 14 Nuc. Acid Res. 1319,1986, und Mills et al., 76 Proc.
Natl. Acad. Sei. 2232,1979) als Ersatz für dGTP zu verwenden. Es wurde festgestellt, daß beide Analoga gut mit T7-DNA-Polymerasen, insbesondere mit dITP in Anwesenheit von ssb wirken. Diese Reaktionen werden vorzugsweise mit der oben beschriebenen genetisch modifizierten T7-DNA-Polymerase durchgeführt, oder die „chase"-Reaktion erfolgt 1 bis 2 Minuten und/oder bei 200C, um die Exonucleasedegradation zu reduzieren.
Modifizierte T7-DNA-Polymerase nutzt effizient dITP oder Deaza-GTP anstelle von dGTP. dITP wird für dGTP sowohl in den „pulse"- als auch „chase"-Gemischen in einer Konzentration verwendet, die dem Zwei- bis Fünffachen derjenigen entspricht, bei der dGTP eingesetzt wird. In dem ddG-„chase"-Gemisch wird noch ddGTP (nicht ddITP) verwendet.
Die „chase"-Reaktionen unter Verwendung von dITP sind empfindlich gegenüber niedrigen Restwerten (etwa 0,5 Einheiten) von Exonucleaseaktivität.
Um dieses Problem auszuschalten, sollten bei Verwendung von dl ΓΡ die „chase"-Reaktionszeiten 5 Minuten nicht überschreiten.
Es wird empfohlen, die vier dITP-Reaktionen in Verbindung mit, nicht unter Ausschluß der vier Reaktionen unter Verwendung von dGTP durchzuführen. Werden sowohl dGTP als auch dITP routinemäßig eingesetzt, kann die Anzahl der erforderlichen Gemische minimiert werden durch: (1) Auslassen von dGTP und dITP aus den „chase"-Gemischen, was bedeutet, daß die vier „chase"-Gemische sowohl für dGTP- als auch dlTP-„chase"-Reaktionen verwendet werden; (2) Zusetzen einer hohen Konzentration dGTP oder dITP (2μΙ bei 0,5mM bzw. 1-2,5mM) zu dem entsprechenden „pulse"-Gemisch. Die beiden „pulse"-Gemische enthalten dann jeweils eine niedrige Konzentration an dCTP, dTTP und /a36S/dATP und eine hohe Konzentration an dGTP oder dlTP. Diese Modifizierung beeinflußt die Qualität der Sequenzierungsreaktionen nicht nachteilig und verringert die erforderliche Anzahl der „pulse"- und „chase '-Gemische zur Durchführung von Reaktionen unter Einsatz von sowohl dGTP als auch dITP auf sechs.
Die Sequenzierungsreaktion ist wie in Beispiel 3, mit dem Unterschied, daß zwei der „pulse"-Gemische enthalten a) 3dNTP-MischungfürdGTP:1,5uMdCTP,dTTPund 1mM dGTP und b)3dNTP-Mischung für dITP: 1,5 μΜασΓΡ,αΤΤΡυηα2ίτ^ΙΤΡ. Bei der „chase"-Reaktion wird dGTP aus den „chase"-Gemischen entfernt (d.h., die „chase"-Mischungen enthalten 30μΜ dATP, dTTP und dCTP und einen der vier Didesoxynucleotide bei 8μΜ), und die „chase"-Zeit überschreitet bei Verwendung von dITP nicht 5 Minuten.
Hinterlegungen
Diö Stämme K38/pGP5-o/pTrx-2, K38/pTrx-2 und M13 mGP 1-2 wurden beim ATCC deponiert und erhielten die Nummern:
Die Patontanmelder und ihre Zessionäre bekunden ihre Verantwortung dafür, daß diese Kulturen ersetzt werden, sollten sie vor Ablauf der Patenterteilungsfrist hierfür, von 5 Jahren nach der letzten Anforderung einer Kultur oder von 30 Jahren sterben, wobei jeweils der längste Zeitraum gilt, sowie ihre Verantwortung dafür, die Hinterlegungsstelle über die Erteilung eines solchen Patentes zu informieren, zu welchem Zeitpunkt die deponierten Materialien der Öffentlichkeit zugänglich gemacht werden. Bis zu diesem Zeitpunkt sind die deponierten Materialien nach den Bestimmungen von 27CFR, Abschnitt 1-14, und 35USC, Abschnitt 112, dem Leiter des Patentamtes zugänglich.
Andere Ausführungsbeispiele
innerhalb der Patentansprüche sind weitere Ausführungsbeispiele einbegriffen.
Zu anderen Anwendungen der erfindungsgemäßen modifizierten DNA-Polymerasen, bei denen ihre Prozessivität und das Fehlen der Exonucleaseaktivität genutzt werden, gehört die direkte enzymatische Amplifikation genomischer DNA-Sequenzen. Das wurde für andere Polymerasen von Saiki et al., 230 Science 1350,1985, und Scharf, 233 Science 1076,1986, beschrieben. Es wird nun auf Fig. 6 Bezug genommen. Die enzymatische Amplifikation einer spezifischen DNA-Region beinhaltet die Verwendung von zwei Primern, die gegenüberliegende Stränge einer doppelsträngigen DNA-Sequenz in der interessierenden Region hybridisieren („anneal"), wobei die 3'-Enden gegeneinander gerichtet sind (siehe dunkle Pfeile). Das eigentliche Verfahren umfaßt multiple (1CM0, vorzugsweise 16-20) Zyklen von Denaturierung, Hybridisierung („annealing") und DNA-Synthese. Bei Anwendung dieses Verfahrens ist es möglich, eine spezifische Region menschlicher genomischer DNA mehr als 200000fach zu amplifizieren. Als Folge davon stellt das spezifische Genfragment etwa einen Teil in fünf statt des anfänglichen einen Teils in einer Million dar. Das erleichtert sowohl das Klonieren als auch die direkte Analyse genomischer DNA in starkem Maße. Für Diagnosezwecke kann dadurch die Analyse von mehreren Wochen auf 1 bis 2 Tage vorkürzt werden. Im Gegensatz zum Klenow-Fragment, bei dem der Amplifikationsprozeß auf Fragmente mit einer Länge von weniger als 200 Basen begrenzt ist, sollten modifizierte T 7-DNA-Polymerasen (vorzugsweise in Verbindung mit E.coll-DNA-Bindungsprotein oder ssb zur Verhinderung von „Zurückschnapp'-Bildung von doppelsträngiger DNA) die Amplifikation von DNA-Fragmenten mit einer Länge von Tausenden Fragmenten ermöglichen.
Die modifizierten T7-DNA-Polymerasen sind auch in Standardreaktionsgemischen goeignet: a) zum Füllen der 5' vorstehenden Termini von DNA-Fragmenten, die durch Restriktionsenzymspaltung erzeugt wurden; um beispielsweise stumpfendige doppelsträngige DNA aus einem linearen DNA-Molekül mit einer einzelsträngigen Region ohne 3' vorstehende Termini zu erzeugen; b) zum Markieren der 3'-Tormini von Restriktionsfragmenten, zum Kartieren von mRNA-Startstellen oder Sequenzieren von DNA unter Anwendung des chemischen Modifizierungsverfahrens von Maxam und Gilbert; und c) für die In-vitro-Mutagenese von klonierten DNA-Fragmenten. Zum Beispiel wird ein chemisch synthetisierter Primer, der spezifische „mismatched" (nicht übereinstimmende) Basen enthält, an eine DNA-Matrize hybridisiert und dann durch die modifizierte T7-DNA-Polymerase verlängert. Auf diese Weise wird die Mutation permanent in den synthetisierten Strang eingebaut. Es ist für die Polymerase vorteilhaft, wenn die Synthetisierung vom Primer über die gesamte Länge der DNA verläuft. Das geschieht am wirksamsten unter Verwendung einer prozessiven DNA-Polymerase. Alternativ erfolgt die Mutagenese durch Fehleinbau während der DNA-Synthese (siehe oben). Diese Anwendung dient der Mutagenisierung spezifischer Regionen klonierter DNA-Fragmente. Es ist wichtig, daß das verwendete Enzym keine Exonucleaseaktivität aufweist. Unter Standardreaktionsgemisch ist eine gepufferte Lösung, die die Polymerase und alle notwendigen Desoxynucleotide oder anderen Verbindungen enthält, zu verstehen.

Claims (4)

1. Methode zur Behandlung prozessier DNA-Polymerase, die Exonucleaseaktivität aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung der Polymerase in Kontakt mit Sauerstoff, einem Reduktionsmittel und einem Salz eines Übergangsmetalls inkubiert wird, um die Exonucleaseaktivität zu verringern.
2. Methode nach Anspruch 1, des weiteren dadurch gekennzeichnet, daß der Sauerstoff in Form von Luft oder in Form von reinem Sauerstoff vorliegt.
3. Methode nach Anspruch 1 oder 2, dos weiteren dadurch gekennzeichnet, daß das Übergangsmetall Eisen ist.
4. Methode nach einem der vorstehenden Ansprüche, des weiteren dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase eine T7-Polymerase ist.
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