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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine gereinigte thermostabile Thermus
aquaticus DNA-Polymerase mit einem Molekulargewicht von 86 000 – 90 000
bestimmt gemäß ihrer
Wanderung in SDS-PAGE, wenn die Markerproteine Phosphorylase B (92
500), Rinderserumalbumin (66 200), Ovalbumin (45 000), Carboanhydrase
(31 000), Sojabohnen-Trypsininhibitor (21 500) und Lysozym (14 400)
sind. Weiterhin betrifft die Erfindung die in den Ansprüchen dargestellten
Ausführungsformen.
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Die
DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung ist nützlich bei einem Verfahren
zur Amplifizierung existierender Nucleinsäuresequenzen, falls sie in
einer Versuchsprobe vorhanden sind, und deren Nachweis, falls sie
vorhanden sind, unter Verwendung einer Sonde. Insbesondere ist sie
nützlich
bei einem Verfahren zur Herstellung einer beliebigen Nucleinsäuresequenz
aus einer bestimmten DNA- oder RNA-Sequenz in großen Mengen,
verglichen mit der ursprünglich
vorhandenen Menge, wodurch der Nachweis der Sequenzen erleichtert
wird, wobei sie die Reaktion katalysiert. Die DNA oder RNA kann
einzel- oder doppelsträngig sein
und kann als relativ reine Art oder als Bestandteil eines Nucleinsäuregemischs
vorliegen. Im erfindungsgemäßen Verfahren
wird eine sich wiederholende Reaktion verwendet, um die Amplifikation
der gewünschten
Nucleinsäuresequenz
zu erreichen.
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Zur
Isolierung von DNA-Polymerasen aus mesophilen Mikroorganismen, wie
z.B. E. coli, sind umfangreiche Forschungsarbeiten durchgeführt worden.
Vgl. beispielsweise Bessman et al., J. Biol. Chem., 233 (1957),171–177, sowie
Buttin und Kornberg, J. Biol. Chem., 241 (1966), 5419–5427.
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Im
Gegensatz dazu sind relativ wenige Untersuchungen zur Isolierung
und Aufreinigung von DNA-Polymerasen aus thermophilen Mikroorganismen,
wie z.B. Thermus aquaticus, durchgeführt worden. Kaledin et al.,
Biokhymiya, 45 (1980), 644-651, offenbaren ein aus sechs Schritten
bestehendes Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung einer DNA-Polymerase
aus Zellen des Stammes T. aquaticus YT1. Diese Schritte umfassen die
Isolierung eines Rohextrakts, DEAE-Cellulose-Chromatographie, Fraktionierung
auf Hydroxyapatit, Fraktionierung auf DEAE-Cellulose und Chromatographie
auf einzelsträngige
DNA-Cellulose. Die Pools aus jeder Stufe wurden dabei nicht auf
Verunreinigung durch Endo- oder Exonuclease(n) untersucht. Das Molekulargewicht
des gereinigten Enzyms ist mit 62 000 Dalton pro Monomer-Einheit
angegeben.
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Ein
zweites Aufreinigungsschema für
eine T. aquaticus-Polymerase ist von A. Chien et al., J. Bacteriol., 127
(1976), 1550–1557
beschrieben. Bei diesem Verfahren wird der Rohextrakt auf eine DEAE-Sephadex-Säule aufgetragen.
Die dialysierten vereinigten Fraktionen werden dann einer Behandlung
auf einer Phosphocellulose-Säule
unterworfen. Die vereinigten Fraktionen werden dialysiert und zur
Verhinderung eines Aktivitätsverlustes
der Polymerase wird Rinderserumalbumin (BSA) zugesetzt. Das resultierende
Gemisch wird auf eine DNA-Cellulose-Säule aufgetragen. Das aus der
Säule gewonnene
vereinigte Material wird dialysiert. Eine Untersuchung mittels Gelfiltration
ergab ein Molekulargewicht von etwa 63 000 Dalton. Mit Hilfe einer
Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation
wurde ein Molekulargewicht von etwa 68 000 Dalton ermittelt.
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Die
Verwendung eines thermostabilen Enzyms zur Amplifizierung existierender
Nucleinsäuresequenzen
in großen
Mengen, verglichen mit der ursprünglich
vorhandenen Menge, ist bereits in der am 10. Dezember 1986 veröffentlichten
EP-200,362 angeregt worden. In dem Verfahren, das Denaturierung,
Synthese von Matrizensträngen
und Hybridisierung umfaßt,
werden Primer, Nucleosidtriphosphate und eine Polymerase verwendet.
Das Verlängerungsprodukt
von jedem Primer wird dann zur Matrize für die weitere Herstellung der
gewünschten
Nucleinsäuresequenz.
Die Anmeldung offenbart, daß die
verwendete Polymerase nicht nach jedem Denaturierungsschritt zugegeben
werden muß,
wenn sie ein thermostabiles Enzym ist, da die Hitze ihre Aktivität nicht
zerstört.
Es werden keine weiteren Vorteile oder Details der Verwendung einer
gereinigten thermostabilen DNA-Polymerase beschrieben. Das Amplifikations-
und Nachweisverfahren ist auch von Saiki et al., Science, 230 (1985),
1350–1354,
und Saiki et al., Bio/Technologie, 3 (1985), 1008–1012, beschrieben.
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Demgemäß besteht
auf dem Fachgebiet der Wunsch nach Herstellung eines gereinigten
stabilen, thermostabilen Enzyms, das zur Verbesserung des vorstehend
beschriebenen diagnostischen Amplifikationsverfahren verwendet werden
kann.
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Entsprechend
stellt die vorliegende Erfindung dieses thermostabile Enzym mit
DNA-Polymerase-Aktivität
bereit, das die Verknüpfung
von Nucleosidtriphosphaten katalysiert, wodurch ein zu einem Nucleinsäure-Matrizenstrang komplementärer Nucleinsäurestrang
gebildet wird, und das ein Molekulargewicht von 86 000 bis 90 000
besitzt, bestimmt gemäß seiner
Wanderung in SDS-PAGE, wenn die Markerproteine Phosphorylase B (92
500), Rinderserumalbumin (66 200), Ovalbumin (45 000), Carboanhydrase
(31 000), Sojabohnen-Trypsininhibitor (21 500) und Lysozym (14 400)
sind. In einer weiteren Ausführungsform
ist das thermostabile Enzym ein rekombinantes Enzym oder eine Modifikation
davon. Die gereinigte Substanz kann in einem Amplifikationsverfahren
unter Verwendung von Temperaturzyklen verwendet werden, wobei aus
einer bestimmten Nucleinsäuresequenz
Nucleinsäuresequenzen
in Mengen produziert werden, die im Vergleich zur ursprünglich vorhandenen
Menge groß sind,
so daß sie
leicht nachweisbar sind.
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Das
Gen, welches das DNA-Polymerase-Enzym von Thermus aguaticus codiert,
ist ebenfalls identifiziert worden und bietet eine weitere Möglichkeit
zur Gewinnung des erfindungsgemäßen thermostabilen
Enzyms. Außer
dem Gen, das das Enzym mit einem Molekulargewicht von 86 000 bis
90 000 Dalton codiert, werden auch Genderivate beschrieben, die
DNA-Polymerase-Aktivität
codieren.
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Die
Erfindung umfaßt
auch ein stabiles Enzymgemisch, umfassend ein vorstehend beschriebenes
gereinigtes thermostabiles Enzym in einem Puffer, der ein oder mehrere
nichtionische polymere Detergenzien enthält.
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Sowohl
das gereinigte Enzym als auch die durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellten
Enzyme sind wesentlich spezifischer als das Klenow-Fragment, das
nicht thermostabil ist. Außerdem
zeigen das gereinigte Enzym und die mittels Rekombinationstechniken
hergestellten Enzyme die entsprechende Aktivität, die man erwartet, wenn dTTP
oder andere Nucleosidtriphosphate im Inkubationsgemisch mit der
DNA-Matrize fehlen. Die erfindungsgemäßen Enzyme besitzen außerdem ein
breiteres pH-Profil als das in der Literatur beschriebene thermostabile
Enzym von Thermus aguaticus, wobei sie bei einem pH-Wert von 7 mehr
als 50% der Aktivität
haben, die bei einem pH-Wert
von 8 gefunden wird. Das vorliegende thermostabile Enzym kann in
einem Puffer mit nichtionischen Detergenzien aufbewahrt werden,
so daß es
stabil ist und es über
eine Zeitspanne seine Aktivität
nicht verliert.
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Die
vorliegende Erfindung besteht in einem Verfahren zur Amplifikation
einer oder mehrerer spezifischer Nucleinsäuresequenzen, die in einer
Nucleinsäure
oder einem Gemisch davon vorhanden sind, wobei Primer und das erfindungsgemäße thermostabile
Enzym verwendet werden. Das Verlängerungsprodukt
eines Primers wird zur Matrize für
die Herstellung der erwünschten
Nucleinsäuresequenz,
wenn es mit einem anderen Primer hybridisiert wird, und umgekehrt.
Das Verfahren wird so oft wiederholt, wie es zur Herstellung der gewünschten
Menge der Sequenz notwendig ist. Das vorliegende Verfahren verbessert
die Spezifität
der Amplifikationsumsetzung und führt zu einem sehr deutlichen
Signal amplifizierter Nucleinsäure.
Außerdem
besteht im vorliegenden Verfahren nicht die Notwendigkeit, nach
jedem Amplifikationszyklus Reagenzien aus einem Umsetzungsgefäß in ein
anderes zu überführen. Die Überführung ist
deshalb nicht notwendig, weil die thermostabilen Enzyme die zur
Denaturierung der Nucleinsäurestränge erforderlichen
hohen Temperaturen vertragen und deshalb nicht ersetzt werden müssen. Außerdem können die
zyklischen Temperaturänderungen automatisiert
werden, wodurch die Zahl der Arbeitskräfte ebenso wie die für die Amplifikationsumsetzung
benötigten
Arbeitsschritte weiter reduziert werden können.
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Insbesondere
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation
von mindestens einer bestimmten Nucleinsäuresequenz bereit, die in einer
Nucleinsäure
oder einem Nucleinsäuregemisch
enthalten ist, wobei die Nucleinsäure, falls sie doppelsträngig ist,
aus zwei getrennten komplementären
Strängen
gleicher oder ungleicher Länge
besteht. Das Verfahren umfaßt:
- (a) Das Inkontaktbringen jedes Nucleinsäurestranges
mit vier verschiedenen Nucleosidtriphosphaten und einem Oligonucleotid-Primer
für jede
der verschiedenen, zu amplifizierenden spezifischen Sequenzen, wobei
jeder Primer so ausgewählt
ist, daß er
zu verschiedenen Strängen
jeder spezifischen Sequenz im wesentlichen komplementär ist, so
daß das
synthetisierte Verlängerungsprodukt
eines Primers als Matrize zur Synthese des Verlängerungsprodukts des anderen
Primers dienen kann, wenn es von seinem komplementären Strang
getrennt ist, und wobei das Inkontaktbringen bei einer Temperatur
stattfindet, die die Hybridisierung jedes Primers mit seinem komplementären Nucleinsäurestrang
fördert;
- (b) Inkontaktbringen jedes Nucleinsäurestranges mit einem erfindungsgemäßen thermostabilen
Enzym gleichzeitig mit Schritt (a) oder danach, wodurch die Verknüpfung der
Nucleosidtriphosphate zur Bildung der Primer-Verlängerungsprodukte
ermöglicht
wird, die zu jedem Strang jeder Nucleinsäure komplementär sind;
- (c) Halten des Gemisches aus Schritt (b) bei einer effektiven
Temperatur und über
eine effektive Zeitspanne zur Aktivierung des Enzyms, sowie zur
Synthetisierung für
jede der verschiedenen, zu amplifizierenden Sequenzen eines Verlängerungsprodukts
von jedem Primer, das zu jedem Nucleinsäure-Matrizenstrang komplementär ist. Die
Temperatur darf dabei nicht zu hoch sein, damit die Verlängerungsprodukte
nicht von ihren komplementären
Matrizensträngen
getrennt werden;
- (d) Erhitzen des Gemisches aus Schritt (c) über eine effektive Zeitspanne
und auf eine effektive Temperatur zur Trennung der Primer-Verlängerungsprodukte
von den Matrizen, an denen sie zur Herstellung einzelsträngiger Moleküle synthetisiert
wurden. Die Temperatur darf dabei nicht zu hoch sein, damit das
Enzym nicht irreversibel denaturiert wird,
- (e) Abkühlen
des Gemisches aus Schritt (d) auf eine effektive Temperatur und über eine
effektive Zeitspanne zur Förderung
der Hybridisierung von jedem Primer mit jedem in Schritt (d) hergestellten
einzelsträngigen
Molekül;
und
- (f) Halten des Gemisches aus Schritt (e) bei einer effektiven
Temperatur und über
eine effektive Zeitspanne zur Förderung
der Enzymaktivität,
sowie zur Synthese für
jede der verschiedenen, zu amplifizierenden Sequenzen eines Verlängerungsprodukts
von jedem Primer, das zu jedem in Schritt (d) hergestellten Nucleinsäure-Matrizenstrang
komplementär
ist. (Die Temperatur) darf dabei nicht zu hoch sein, damit die Verlängerungsprodukte
nicht von ihren komplementären
Matrizensträngen
getrennt werden. Dabei werden die Schritte (e) und (f) gleichzeitig
oder nacheinander durchgeführt.
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Die
Schritte (d), (e) und (f) können
so oft wiederholt werden, bis der gewünschte Grad der Sequenzamplifikation
erreicht ist. Das hier bevorzugte thermostabile Enzym ist eine aus
Thermus aguaticus extrahierte Polymerase (Taq-Polymerase). Besonders
bevorzugt werden in Schritt (a) die Nucleinsäurestränge mit einem Puffer in Kontakt
gebracht, der etwa 1,5 – 2
mM Magnesiumsalz, jeweils 150 – 200 μM der einzelnen
Nucleotide und jeweils 1 μM
jedes Primers umfaßt,
und die Schritte (a), (e) und (f) bei etwa 45–58 °C sowie Schritt (d) bei etwa
90–100 °C durchgeführt, wenn
das Enzym die Taq-Polymerase
ist.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist/sind die Nucleinsäure(n)
doppelsträngig
und die Ausführung von
Schritt (a) erfolgt, indem (i) jede Nucleinsäure über einen wirksamen Zeitraum
und bei einer wirksamen Temperatur zur Denaturierung jeder Nucleinsäure in Gegenwart
der vier verschiedenen Nucleosidtriphosphate und eines Oligonucleotid-Primers
für jede
unterschiedliche zu amplifizierende spezifische Sequenz erhitzt wird,
wobei jeder Primer so ausgewählt
ist, daß er
zu den verschiedenen Strängen
jeder spezifischen Sequenz im Wesentlichen komplementär ist, so
daß das
von einem Primer synthetisierte Verlängerungsprodukt bei Trennung
vom komplementären
Strang als Matrize zur Synthese der Verlängerungsprodukte der anderen
Primer dienen kann; und indem (ii) die denaturierten Nucleinsäuren auf
eine Temperatur abgekühlt
werden, welche die Hybridisierung jedes Primers mit seinem komplementären Nucleinsäurestrang
fördert.
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In
weiteren Ausführungsformen
betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart
oder Abwesenheit von mindestens einer bestimmten Nucleinsäuresequenz
in einer Probe, die eine Nucleinsäure oder ein Nucleinsäuregemisch
enthält,
oder zur Unterscheidung von zwei verschiedenen Sequenzen in der Probe,
von der vermutet wird, daß sie
diese Sequenz(en) enthält,
wobei die Nucleinsäure(n),
falls sie doppelsträngig
ist/sind, aus je zwei getrennten komplementären Strängen gleicher oder ungleicher
Länge bestehen.
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Das
Verfahren umfaßt
die vorstehend genannten Schritte (a) bis (f) und führt zu einer
quantitativen Amplifikation der spezifischen Nucleinsäuresequenz(en),
falls sie vorhanden ist/sind;
- (g) für jede nachzuweisende
Sequenz Zugabe einer markierten Oligonucleotid-Sonde, die mit dieser
Sequenz oder einer Mutation davon hybridisieren kann, zu dem Produkt
aus Schritt (f); und
- (h) Bestimmung, ob die Hybridisierung stattgefunden hat.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart
oder Abwesenheit von mindestens einer Nucleotidsequenzveränderung
in einer oder mehreren Nucleinsäuren,
die in einer Probe enthalten sind, wobei die Nucleinsäure, falls
sie doppelsträngig
ist, aus je zwei getrennten komplementären Strängen gleicher oder ungleicher
Länge besteht.
Das Verfahren umfaßt
die vorstehend erwähnten
Schritte (a) – (f),
wobei die Schritte (d), (e) und (f) hinreichend oft wiederholt werden,
damit sie zu einer nachweisbaren Amplifikation der Nucleinsäure führen, die
die Sequenz enthält,
falls sie vorhanden ist;
- (g) Fixieren des Produktes
aus Schritt (f) an einer Membran.
- (h) Behandlung der Membran unter Hybridisierungsbedingungen
mit einer markierten sequenzspezifischen Oligonucleotid-Sonde, die
nur dann mit der amplifizierten Nucleinsäuresequenz hybridisieren kann,
wenn eine Sondensequenz zu einem Bereich der amplifizierten Sequenz
komplementär
ist;
und
- (i) Nachweis, ob die Sonde mit der amplifizierten Sequenz in
der Nucleinsäureprobe
hybridisiert hat.
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Wenn
die Probe Zellen enthält,
werden diese vorzugsweise vor Schritt (a) erhitzt, damit die in
ihnen enthaltenen Nucleinsäuren
für die
Reagenzien freigelegt werden. Durch diesen Schritt wird eine Nucleinsäure-Extraktion
vor Zugabe der Reagenzien vermieden.
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In
einer Abwandlung dieses Verfahrens werden der/die Primer und/oder
die Nucleosidtriphosphate so markiert, daß die resultierende amplifizierte
Sequenz markiert wird. Der/die markierte(n) Primer und/oder Nucleosidtriphosphat(e)
können
zu Beginn im Umsetzungsgemisch vorhanden sein oder während eines
späteren Zyklus
zugesetzt werden. Das sequenzspezifische (unmarkierte) Oligonucleotid
wird an einer Membran fixiert und unter Hybridisierungsbedingungen
mit dem markierten Amplifikationsprodukt hybridisiert. Eine Hybridisierung
kann nur dann stattfinden, wenn die membrangebundene Sequenz im
Amplifikationsprodukt vorhanden ist.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Clonierung einer
oder mehrerer, in einer Nucleinsäure
oder einem Nucleinsäuregemisch
enthaltenen spezifischen Nucleinsäuresequenzen in einen Clonierungsvektor,
wobei die Nucleinsäure(n)
aus zwei getrennten komplementären
Strängen
besteht (bestehen), falls sie doppelsträngig ist (sind), und wobei
die Nucleinsäure(n)
vor der Clonierung quantitativ amplifiziert wird (werden). Das Verfahren
umfaßt
die vorstehend erwähnten
Schritte (a) – (f),
wobei die Schritte (d), (e) und (f) hinreichend oft wiederholt werden,
damit sie zu einer nachweisbaren Amplifikation der Nucleinsäure(n) führen, die
die Sequenz(en) enthalten;
- (g) Zugabe eines
Restriktionsenzyms zum Produkt aus Schritt (f) für jede dieser Restriktionsstellen,
um Spaltprodukte in einer Restriktionsspaltung zu erhalten; und
- (h) Ligierung der/des Spaltprodukte(s) aus Schritt (g), die/das
die zu clonierende(n) spezifische(n) Sequenz(en) enthalten/enthält, in einen
oder mehrere Clonierungsvektor(en), der/die einen Promotor und einen
selektierbaren Marker enthält/enthalten.
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In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Clonierung
einer oder mehrerer, in einer Nucleinsäure oder einem Nucleinsäuregemisch
enthaltenen Nucleinsäuresequenzen in
einen Clonierungsvektor, wobei die Nucleinsäure(n), falls sie doppelsträngig ist/sind,
aus zwei getrennten komplementären
Strängen
gleicher oder ungleicher Länge
bestehen (besteht) und wobei die Nucleinsäure(n) vor der Clonierung quantitativ
amplifiziert werden (wird). Das Verfahren umfaßt die vorstehend erwähnten Schritte
(a) – (f),
wobei die Schritte (d), (e) und (f) hinreichend oft wiederholt werden,
damit sie zu einer wirksamen Amplifikation der Nucleinsäure(n) führen, welche
die Sequenz(en) zur Ligierung mit glatten Enden in einen oder mehrere
Clonierungsvektoren enthalten; und
- (g) Ligierung
der in Schritt (f) gewonnenen amplifizierten Sequenz(en), die in
einen oder mehrere Clonierungsvektoren in Gegenwart einer Ligase
cloniert werden soll(en), wobei die amplifizierte(n) Sequenz(en) und
der/die Vektor(en) in ausreichender Menge zur Durchführung der
Ligierung vorhanden sind.
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In
einer sich auf ein Produkt beziehenden Ausführungsform stellt die Erfindung
ein Mittel bereit, das sich zur Amplifikation mindestens einer spezifischen,
in einer Nucleinsäure
oder einem Nucleinsäurgemisch enthaltenen
Nucleinsäuresequenz
verwenden läßt, umfassend
vier verschiedene Nucleosidtriphosphate und einen Oligonucleotid-Primer
für jede
der verschiedenen, zu amplifizierenden spezifischen Sequenzen, wobei jeder
Primer so ausgewählt
ist, daß er
zu den verschiedenen Strängen
jeder spezifischen Sequenz im wesentlichen komplementär ist, so
daß bei
Trennung vom komplementären
Strang das synthetisierte Verlängerungsprodukt
jedes Primers als Matrize zur Synthese des Verlängerungsproduktes des anderen
Primers dienen kann.
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In
einer anderen sich auf ein Produkt beziehenden Ausführungsform
stellt die Erfindung eine Probe einer oder mehrerer Nucleinsäuren bereit,
umfassend mehrere Stränge
einer spezifischen Nucleinsäuresequenz,
die in der/den Nucleinsäure(n)
enthalten sind. Die Probe kann etwa 10 – 100 Stränge, etwa 100 – 1000 Stränge oder
mehr als 1000 Stränge
umfassen.
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In
noch einer weiteren sich auf ein Produkt beziehenden Ausführungsform
stellt die Erfindung eine amplifizierte Nucleinsäuresequenz aus einer Nucleinsäure oder
einem Nucleinsäuregemisch
bereit, umfassend mehrere Kopien der Sequenz, die durch die vorliegenden
Amplifikationsverfahren hergestellt wurde.
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1 stellt
eine Restriktionskarte des Plasmids pFC83 dar, das die ~ 4,5 kb
große
HindIII-Insertion aus T. aquaticus-DNA enthält, die in Plasmid BSM13+ subcloniert
wurde.
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2 stellt
eine Restriktionskarte des Plasmids pFC85 dar, das die ~ 2,8 kb
große
HindIII-Asp718-Insertion aus T. aquaticus-DNA enthält, die
in Plasmid BSM13+ subcloniert wurde.
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Die
hier verwendeten Begriffe "Zelle", "Zellinie" und "Zellkultur" sind untereinander
austauschbar, wobei alle Bezeichnungen auch die Nachkommenschaft
umfassen. Die Begriffe "Transformanten" oder "transformierte Zellen" umfassen daher die
zuerst transformierten Zellen und die davon abstammenden Kulturen,
ungeachtet der Anzahl der Zellpassagen. Aufgrund beabsichtigter
oder nichtbeabsichtigter Mutationen ist es selbstverständlich,
daß nicht
alle Nachkommen im DNA-Gehalt absolut identisch sein müssen. Die
Begriffe umfassen auch mutierte Nachkommen mit den gleichen funktionellen
Merkmalen, auf die hin die ursprünglich transformierten
Zellen untersucht wurden.
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Der
Begriff "Kontrollsequenzen" betrifft DNA-Sequenzen,
die benötigt
werden, um eine damit funktionell verbundene codierende Sequenz
in einem bestimmten Wirtsorganismus zu exprimieren. Für Prokaryonten geeignete
Kontrollsequenzen umfassen beispielsweise einen Promotor, gegebenenfalls
eine Operator-Sequenz, eine Ribosomenbindungsstelle und möglicherweise
weitere, bislang wenig aufgeklärte
Sequenzen. Es ist bekannt, daß eukaryontische
Zellen Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer-Elemente
verwenden.
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Der
Begriff "Expressionssystem" betrifft DNA-Sequenzen,
die eine gewünschte
codierende Sequenz in funktioneller Verbindung mit Kontrollsequenzen
enthalten, so daß mit
diesen Sequenzen transformierte Wirte die codierten Proteine produzieren
können.
Zur Durchführung
der Transformation kann das Expressionssystem auf einem Vektor enthalten
sein; die relevante DNA kann jedoch auch in das Wirts-Chromosom
integriert werden.
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Der
hier verwendete Begriff "Gen" betrifft eine DNA-Sequenz,
die ein Polypeptid oder einen Präkursor codiert,
das/der isoliert werden kann und biologische Aktivität besitzt.
Das Polypeptid kann durch eine Gensequenz voller Länge oder
durch einen beliebigen Teil der codierenden Sequenz codiert werden,
sofern die enzymatische Aktivität
erhalten bleibt.
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"Funktionell verbunden" bedeutet, daß zwei Bestandteile
benachbart sind, so daß sie
normal funktionieren können.
Die "funktionelle
Verbindung" einer
codierenden Sequenz mit Kontrollsequenzen betrifft daher eine räumliche
Anordnung der Bestandteile, bei der die Expression der codierenden
Sequenzen von den Kontrollsequenzen gesteuert wird.
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"Nichtionische polymerische
Detergenzien" sind
oberflächenaktive
Mittel, die keine Ionenladung besitzen und für die Zwecke der Erfindung
dadurch charakterisiert sind, daß sie das vorliegende Enzym
in einem pH-Bereich von etwa 3,5 bis etwa 9,5, vorzugsweise von
4 bis 8,5 stabilisieren können.
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Der
hier verwendete Begriff "Oligonucleotid" definiert ein Molekül, das zwei
oder mehrere, vorzugsweise mehr als drei Desoxyribonucleotide oder
Ribonucleotide umfaßt.
Seine genaue Größe hängt von
vielen Faktoren ab, die ihrerseits von der endgültigen Funktion oder Verwendung
des Oligonucleotids abhängen.
Das Oligonucleotid kann synthetisch oder durch Clonierung erhalten
werden.
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Der
hier verwendete Begriff "Primer" betrifft ein Oligonucleotid,
das, gleichgültig,
ob es natürlicherweise
bei einer Restriktionsspaltung vorkommt oder synthetisch hergestellt
wurde, als Startpunkt einer Synthese unter Bedingungen wirken kann,
bei denen die Synthese eines zu einem Nucleinsäurestrang komplementären Primer-Verlängerungsprodukts
eingeleitet wird, d.h. in Gegenwart von vier verschiedenen Nucleosidtriphosphaten
und des thermostabilen Enzyms in einem geeigneten Puffer ("Puffer" umfaßt den pH-Wert,
die Ionenstärke,
Cofaktoren, usw.) bei einer geeigneten Temperatur. Für die Taq-Polymerase enthält der verwendete Puffer
vorzugsweise 1,5 – 2
mM Magnesiumsalz, besonders bevorzugt ist MgCl2,
jeweils 150 – 200 μM der einzelnen
Nucleotide, und jeweils 1 μM
der einzelnen Primer, zusammen mit vorzugsweise 50 mM KCl, 10 mM Tris
-Puffer, pH-Wert 8 – 8,4,
und 100 μg/ml
Gelatine.
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Zur
maximalen Effizienz der Amplifikation ist der Primer vorzugsweise
einzelsträngig,
kann jedoch in einer anderen Ausführungsform doppelsträngig sein.
Falls der Primer doppelsträngig
ist, werden vor seiner Verwendung zur Herstellung von Verlängerungsprodukten
zuerst seine Stränge
getrennt. Vorzugsweise ist der Primer ein Oligodesoxyribonucleotid.
Der Primer muß hinreichend
lang sein, damit es zu einer Synthese des Verlängerungsproduktes in Gegenwart
des thermostabilen Enzyms kommt. Die genaue Länge der Primer hängt von
vielen Faktoren ab, zu denen Temperatur, Herkunft des Primers und
Verwendungszweck des Verfahrens gehören. Der Oligonucleotid-Primer
enthält
typischerweise 15 – 25
Nucleotide, obwohl es auch mehr oder weniger sein können, je
nachdem, wie komplex die Zielsequenz ist. Kurze Primermoleküle benötigen zur Bildung
ausreichend stabiler Hybridkomplexe mit der Matritze im allgemeinen
tiefere Temperaturen.
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Die
hier beschriebenen Primer werden so ausgewählt, daß sie zu den unterschiedlichen
Strängen
jeder zu amplifizierenden spezifischen Sequenz "im wesentlichen" komplementär sind. Das bedeutet, daß die Primer
zur Hybridisierung mit ihren entsprechenden Strängen ausreichend komplementär sein müssen. Die Sequenz
des Primers muß deshalb
nicht die genaue Sequenz der Matritze widerspiegeln. Beispielsweise
kann an das 5'-Ende
des Primers ein nichtkomplementäres
Nucleotidfragment angefügt
werden, wobei die restliche Primersequenz komplementär zum Strang
ist. Alternativ können
nichtkomplementäre
Basen oder längere
Sequenzen über
die Primersequenz hinweg verteilt werden; vorausgesetzt, daß die Primer-Sequenz
zu der amplifizierten Strangsequenz ausreichend komplementär ist, damit
es zu einer Hybridisierung und dadurch zur Bildung einer Matrize
für die
Synthese des Verlängerungsprodukts
vom anderen Primer kommt. Für
Nachweiszwecke, insbesondere unter Verwendung markierter sequenzspezifischer
Sonden, sind die Primer jedoch typischerweise exakt komplementär. Dadurch
werden die besten Ergebnisse erzielt.
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Die
hier verwendeten Begriffe "Restriktionsendonucleasen" und "Restriktionsenzyme" betreffen bakterielle
Enzyme, wobei jedes davon doppelsträngige DNA an einer spezifischen
Nucleotidsequenz oder in der Nähe
davon spaltet.
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Der
hier verwendete Begriff "DNA-Polymorphismus" bezieht sich auf
den Zustand, daß an
einer bestimmten DNA-Stelle zwei oder mehrere verschiedene Nucleotidsequenzen
vorhanden sein können.
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Der
hier verwendete Begriff "Nucleotidveränderung
in der Sequenz" betrifft
jede einzelne oder mehrfache Nucleotid-Substitutionen, -Deletionen
oder – Insertionen.
Diese Nucleotidveränderungen
können
mutierte oder polymorphe Allelvariationen sein. Das vorliegende
Verfahren kann deshalb einzelne Nucleotidveränderungen in Nucleinsäuren nachweisen,
wie sie beispielsweise in durch β-Globin-Veränderungen
hervorgerufenen genetischen Krankheiten auftreten. Diese Krankheiten
werden durch Mutationen, Insertionen oder Deletionen von Einzelbasen
(einige β-Thalassämien, Sichelzellen-Anämie, Hämoglobin-C-Krankheit,
usw.) ebenso verursacht wie durch Veränderungen mehrer Basen, wie
sie z.B. bei der α-Thalassämie oder
einigen β-Thalassämien vorkommen.
Das vorliegende Verfahren kann außerdem Polymorphismen nachweisen,
die nicht notwendigerweise mit einer Krankheit einhergehen, sondern
lediglich einen Zustand darstellen, bei dem zwei oder mehrere verschiedene
Nucleotidsequenzen (unabhängig
davon, ob sie substituierte, deletierte oder inserierte Nucleotid-Basenpaare
aufweisen) in der Population an einer bestimmten Stelle der Nucleinsäure existieren
können,
wie z.B. in den HLA-Bereichen
des menschlichen Genoms, und zufällige
Polymorphismen, beispielsweise in mitochondrialer DNA. Die nachstehend
genauer beschriebenen, polymorphen sequenzspezifischen Oligonucleotid-Sonden
können
zum Nachweis genetischer Marker, die mit Krankheiten, wie z.B. insulinabhängiger Diabetis
mellitus, verbunden sind, oder bei gerichtsmedizinischen Anwendungen
verwendet werden. Wenn die Nucleinsäure doppelsträngig ist,
wird die Nucleotidveränderung
der Sequenz zu einer Basenpaarveränderung der Sequenz.
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Der
Begriff "sequenzspezifische
Oligonucleotide" betrifft
Oligonucleotide, die mit spezifischen Sequenzen hybridisieren, unabhängig davon,
ob diese in Allelen enthalten sind oder nicht, wobei die Sequenzen
der Oligonucleotide die nachzuweisende Basenpaarveränderung
umfassen und für
die nachzuweisende Sequenzveränderung
spezifisch sind. Wie nachstehend beschrieben, können für jede Sequenz ein oder mehrere sequenzspezifische
Oligonucleotide eingesetzt werden, je nachdem, welche Sequenzen
untersucht werden.
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Der
hier verwendete Begriff "Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus" ("RFLP") betrifft zwischen einzelnen
Organismen auftretende Längenunterschiede
von Restriktionsfragmenten, die durch Spaltung mit einer bestimmten
Restriktionsendonuclease gebildet werden.
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Der
hier verwendete Begriff "thermostabiles
Enzym" betrifft
ein Enzym, das gegen Hitze stabil und widerstandsfähig ist
und die Verknüpfung
von Nucleotiden in geeigneter Weise katalysiert (ermöglicht),
wodurch Primer-Verlängerungsprodukte
gebildet werden, die zu jedem Nucleinsäurestrang komplementär sind.
Die Synthese startet im allgemeinen am 3'-Ende eines jeden Primers und wird entlang
des Matrizenstranges in 5'-Richtung
fortgeführt,
bis es unter Bildung von Molekülen
unterschiedlicher Länge
zum Syntheseabbruch kommt. Es kann jedoch ein thermostabiles Enzym
geben, welches die Synthese am 5'-Ende
einleitet und in die andere Richtung fortführt, wobei das vorstehend beschriebene
Verfahren verwendet wird.
-
Damit
es in der Amplifikationsumsetzung wirksam ist, muß das vorliegende
hitzestabile Enzym ein einziges Kriterium erfüllen, es darf nämlich nicht
irreversibel denaturiert (inaktiviert) werden, wenn es während einer
zur Denaturierung doppelsträngiger
Nucleinsäuren
erforderlichen Zeitspanne erhöhten
Temperaturen unterworfen wird. Eine für die vorliegenden Zwecke irreversible
Denaturierung betrifft den endgültigen
und vollständigen
Verlust der Enzymaktivität.
Die zur Denaturierung erforderlichen Wärmebedingungen hängen z.B. von
der Salzkonzentration des Puffers sowie der Länge und Zusammensetzung der
zu denaturierenden Nucleinsäuren
ab. Über
einen Zeitraum, der hauptsächlich
von der Temperatur sowie der Nucleinsäurelänge abhängt und typischerweise etwa
0,5 bis vier Minuten lang ist, liegen die Temperaturen typischerweise
im Bereich von etwa 90 °C
bis etwa 105°C.
Mit zunehmender Salzkonzentration des Puffers und/oder GC-Zusammensetzung
der Nucleinsäure
kann das Enzym höhere
Temperaturen tolerieren. Bei einer Temperatur von etwa 90°C – 100°C wird das
Enzym vorzugsweise nicht irreversibel denaturiert.
-
Das
vorliegende thermostabile Enzym besitzt eine für seine Funktionen optimale
Temperatur, die höher
als etwa 40°C
ist: Bei Temperaturen unter 40°C
wird die Hybridisierung des Primers mit der Matrize gefördert, obwohl
eine Hybridisierung auch bei höheren
Temperaturen (z.B. bei 45°C – 70°C ) stattfinden
kann, je nach (1) den Magnesium- und Salzkonzentrationen und (2)
der Zusammensetzung und Länge
der Primer. Je höher
das Temperaturoptimum für
das Enzym liegt, umso spezifischer und/oder selektiver verläuft die
durch den Primer gesteuerte Verlängerungssynthese.
Bei einer Temperatur unterhalb 40°C,
z.B. bei 37°C,
aktive Enzyme gehören
jedoch auch zum Schutzumfang der Erfindung, vorausgesetzt, daß sie hitzestabil
sind. Vorzugsweise liegt die optimale Temperatur in einem Bereich
von etwa 50°C
bis 90°C,
besonders bevorzugt in einem Bereich von 60°C bis 80°C.
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Das
vorliegende thermostabile Enzym kann aus einer beliebigen Quelle
gewonnen werden und ein natives oder rekombinantes Protein darstellen.
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Das
vorliegende thermostabile Enzym ist eine aus Thermus aquaticus isolierte
DNA-Polymerase. Verschiedene Thermus aquaticus-Stämme sind
von American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, erhältlich und
sind von T. D. Brock, J. Bact., 98 (1969), 289-297, sowie von T.
Oshima, Arch. Microbiol., 117 (1978), 189–196, beschrieben. Ein bevorzugter
Stamm ist der Stamm YT-1.
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Zur
Gewinnung des nativen Proteins werden die Zellen unter Verwendung
eines beliebigen geeigneten Verfahrens gezüchtet. Ein derartiges Verfahren
ist von Kaledin et al., Biokhimiya, (1980), vorstehend, beschrieben.
Kurz zusammengefaßt,
werden die Zellen in einem Liter Medium gezüchtet, das aus Nitrilotriessigsäure (100
mg), Trypton (3 g), Hefe-Extrakt (3 g), Bernsteinsäure (5 g),
Natriumsulfit (50 mg), Riboflavin (1 mg), K2HPO4 (522 mg), MgSO4 (480
mg), CaCl2 (222 mg), NaCl (20 mg) und Spurenelemente
besteht. Der pH-Wert des Mediums wird mit KOH auf 8,0 ± 0,2 eingestellt.
Die Ausbeute wird erhöht,
wenn die Züchtung
der Zellen unter kräftiger
Belüftung
mit bis zu 20 g/Liter bei einer Temperatur von 70°C erfolgt.
Zellen in der späten
logarithmischen Phase (durch Extinktion bei 550 nm ermittelt) werden
mittels Zentrifugation gesammelt, in einem Puffer gewaschen und
bei –20°C in gefrorenem
Zustand aufbewahrt.
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In
einem von Chien et al., J. Bacteriol., (1976), vorstehend, beschriebenen
weiteren Verfahren zur Zellzüchtung
wird ein definiertes Mineralsalz-Medium verwendet, das 0,3% Glutaminsäure enthält und mit
0,1 mg/l Biotin, 0,1 mg/l Thiamin und 0,05 mg/l Nicotinsäure angereichert
ist. Die Salze umfassen Nitrilotriessigsäure, CaSO4 ,
MgSO4, NaCl, KNO3,
NaNO3, ZnSO4, H3BO3, CuSO4, NaMoO4, CoCl2, FeCl3, MnSO4 und Na2HPO4. Der pH-Wert des Mediums wird mit NaOH
auf 8,0 eingestellt.
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Bei
dem Verfahren von Chien et al. werden die Zellen zunächst in
einem Schüttelwasserbad
bei 75°C gezüchtet. Nach
Erreichen einer bestimmten Zelldichte wird ein Liter Zellkultur
in 16 I-Ballonflaschen überführt, die
sich in Heißluft-Brutschränken befinden.
Man läßt sterile
Luft durch die Kulturen strömen
und hält
die Temperatur bei 75°C.
Dann läßt man die
Zellen 20 Stunden wachsen, bevor sie durch Zentrifugation gesammelt werden.
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Nach
der Zellzüchtung
erfolgt die Isolierung und Aufreinigung des Enzyms in sechs Stufen,
wobei jeder Schritt bei einer Temperatur unterhalb Raumtemperatur,
vorzugsweise bei etwa 4°C
durchgeführt
wird.
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Falls
die Zellen gefroren sind, werden sie in der ersten Stufe aufgetaut,
mittels Ultraschallbehandlung zertrümmert, in einen Puffer mit
einem pH-Wert von etwa 7,5 suspendiert und zentrifugiert.
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Im
zweiten Schritt wird der Überstand
gesammelt und dann durch Zugabe eines Salzes, wie z.B. wasserfreies
Ammoniumsulfat, fraktioniert. Die geeignete Fraktion (typischerweise
bei einer Sättigungskonzentration
von 45% – 75%)
wird gesammelt, in einem 0,2 M Kalium-Phosphat-Puffer, vorzugsweise
bei einem pH-Wert
von 6,5, gelöst
und gegen den gleichen Puffer dialysiert.
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Im
dritten Schritt werden Nucleinsäuren
und einige Proteine entfernt. Die im zweiten Schritt erhaltene Fraktion
wird auf eine DEAE-Cellulose-Säule
aufgetragen, die mit dem vorstehend verwendeten Puffer äquilibriert
worden ist. Dann wird die Säule
mit dem gleichen Puffer gewaschen. Die Durchfluß-Fraktionen, die wie durch Extinktion
bei 280 nm bestimmt Proteine enthalten, werden gesammelt und gegen
einen 10 mM Kaliumphosphat-Puffer dialysiert, wobei der Puffer vorzugsweise
die gleichen Bestandteile wie der erste Puffer enthält, aber
einen pH-Wert von 7,5 aufweist.
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Im
vierten Schritt wird die so gewonnene Fraktion auf eine Hydroxyapatit-Säule aufgetragen, die mit dem
Puffer äquilibriert
worden ist, der zur Dialyse im dritten Schritt verwendet wurde.
Die Säule
wird dann gewaschen und das Enzym wird bei einem pH-Wert von 7,5
mit einem linearen Puffergradienten eluiert, wie z.B. 10 mM 2-Mercaptoethanol
und 5% Glycerin enthaltenden Kaliumphosphat-Puffer von 0,01 M bis 0,5 M. Die vereinigten
Fraktionen, die die thermostabile Enzymaktivität (z.B. DNA-Polymerase) enthalten,
werden gegen den gleichen Puffer dialysiert, der zur Dialyse im
dritten Schritt verwendet wurde.
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In
der fünften
Stufe wird die dialysierte Fraktion auf eine DEAE-Cellulose-Säule aufgetragen, die mit dem
zur Dialyse im dritten Schritt verwendeten Puffer äquilibriert
worden ist. Die Säule
wird dann gewaschen und das Enzym mit einem linearen Puffergradienten
eluiert, wie z.B. dem zur Dialyse im dritten Schritt verwendeten
Puffer, enthaltend 0,01 M bis 0,6 M KCl. Fraktionen mit der thermostabilen
Enzymaktivität
werden dann mit Hilfe geeigneter Verfahren auf Verunreinigungen
durch Desoxyribonucleasen (Endo- und Exonucleasen) untersucht. Die
Endonucleaseaktivität
kann beispielsweise elektrophoretisch durch Molekulargewichtsveränderung
von DNA des Phagen λ oder
Superknäuel-Plasmid-DNA nach
Inkubation mit einem Überschuß an DNA-Polymerase
bestimmt werden. Genauso kann die Exonucleaseaktivität anhand
einer Molekulargewichtsveränderung
der DNA elektrophoretisch bestimmt werden, die die DNA nach Behandlung
mit einem Restriktionsenzym, das mehrere Restriktionsstellen spaltet,
erfahren hat.
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Die
Fraktionen, bei denen keine Desoxyribonuclease-Aktivität festgestellt
wurde, werden vereinigt und gegen den gleichen Puffer dialysiert,
der im dritten Schritt verwendet wurde.
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Im
sechsten Schritt werden die vereinigten Fraktionen auf eine Phosphocellulose-Säule mit
einem vorgebenen Bettvolumen gegeben. Die Säule wird gewaschen und das
Enzym bei einem pH-Wert von 7,5 mit einem linearen Puffergradienten,
wie z.B. einem Kaliumphosphat-Puffer von 0,01 M bis 0,4 M KCl, eluiert.
Die vereinigten Fraktionen, die thermostabile Polymerase-Aktivität, aber
keine Desoxyribonuclease-Aktivität
besitzen, werden bei einem pH-Wert von 8,0 gegen einen Puffer dialysiert.
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Das
Molekulargewicht des dialysierten Produkts kann durch beliebige
Verfahren bestimmt werden, z.B. mittels SDS-PAGE unter Verwendung
von Protein-Molekulargewichtsmarkern. Durch das vorstehende Verfahren
ist bestimmt worden, daß das
Molekulargewicht der aus Thermus aquaticus aufgereinigten DNA-Polymerasen,
etwa 86 000 bis 90 000 Dalton beträgt, bestimmt wie in Anspruch
1 genannt.
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Das
erfindungsgemäße thermostabile
Enzym kann auch mit Hilfe von DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt
werden, weil das Gen, das dieses Enzym codiert, aus genomischer
Thermus aquaticus-DNA cloniert wurde. Die vollständige codierende Sequenz für die Thermus
aquaticus-Polymerase (Taq) kann aus dem Bakteriophagen CH35:Taq#4-2
auf einem etwa 3,5 Kilobasen (kb) großen BgIII-Asp718-Restriktionsfragment (partiell)
gewonnen werden, das in einer ~18 kb großen Insertion eines genomischen
DNA-Fragments enthalten ist. Der Bakteriophage wurde am 29. Mai
1987 bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt und
hat die Eingangsnummer 40,336. In einer anderen Ausführungsform
kann das Gen konstruiert werden, indem ein aus dem Plasmid pFC83
(ATCC 67,422, am 29.Mai 1987 hinterlegt) isoliertes, ~750 Basenpaar
(bp) großes
BgIII-HindIII-Restriktionsfragment mit einem aus dem Plasmid pFC85 (ATCC
67,421, am 29.Mai 1987 hinterlegt) isolierten, ~2,8 kb großen HindIII-Asp718-Restriktionsfragment
ligiert wird. Das pFC83-Restriktionsfragment umfaßt das Amino-Ende
des Taq-Polymerase-Gens, während
das pFC85-Restriktionsfragment
das Carboxyl-Ende umfaßt.
Die Ligierung dieser beiden Fragmente in einen entsprechend gespaltenen
Vektor mit geeigneten Kontrollsequenzen führt daher zur Translation einer
Taq-Polymerase voller Länge.
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Es
ist festgestellt worden, daß zur
Gewinnung eines biologisch aktiven Genprodukts mit der gewünschten
Enzymaktivität
nicht die gesamte codierende Sequenz des Taq-Polymerase-Gens erforderlich
ist. Amino-terminale Deletionen, wobei etwa ein Drittel der codierenden
Sequenz fehlt, haben zur Bildung eines Genprodukts geführt, das
in Polymerase-Tests ziemlich aktiv ist.
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Außer den
N-terminalen Deletionen können
einzelne Aminosäurereste
in der Taq-Polymerase-Peptidkette durch Oxydation, Reduktion oder
andere Derivatbildungsverfahren modifiziert werden. Das Protein
kann gespalten werden, wobei Fragmente erhalten werden, die die
Aktivität
beibehalten. Die DNA-Sequenz, die ein Protein mit solchen, die Enzymaktivität nicht
zerstörenenden
Veränderungen
codiert, wird weiterhin als Gen definiert.
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Durch
Deletion, Hinzufügen
oder Änderung
der während
der Translation in die Sequenz eingebauten Aminosäuren kann
die Primärstruktur
modifiziert werden, ohne daß die
Aktivität
des Proteins zerstört
wird. Substitutionen oder andere Änderungen führen zu Proteinen mit einer
Aminosäurensequenz,
die durch eine zum Schutzumfang der vorliegenden Erfindung gehörende DNA
codiert wird.
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Aus
Kaninchen, die mit der gereinigten, 86 000 – 90 000 Dalton großen, erfindungsgemäßen Polymerase
immunisiert worden waren, wurde polyclonales Antiserum gewonnen
und zur Untersuchung einer Expressions-Genbank verwendet, die durch
partielle Spaltung genomischer Thermus aguaticus-DNA konstruiert
worden war, wobei eine geeignete codierende Sequenz erhalten wurde,
wie nachstehend beschrieben. Die clonierte genomische Sequenz kann
als Fusionspolypeptid exprimiert werden. Die Expression kann direkt
unter Verwendung ihrer eigenen Kontrollsequenzen erfolgen oder mit
Hilfe von Konstruktionen, wobei Kontrollsequenzen verwendet werden,
die für
einen bestimmten, zur Enzymexpression verwendeten Wirt geeignet
sind.
-
Die
Verfügbarkeit
der DNA, die diese Sequenzen codiert, schafft natürlich die
Möglichkeit
der Codonsequenzmodifizierung zur Erzeugung von Muteinformen, die
auch DNA-Polymerase-Aktivität
besitzen.
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Mit
Hilfe dieser Werkzeuge kann die vollständige codierende Sequenz der
Taq-DNA-Polymerase bereitgestellt werden. Mit der Sequenz können Expressionsvektoren
konstruiert werden, die in vielen Wirtssystemen verwendbar sind,
wodurch die codierende Sequenz exprimiert werden kann. Aus den vorangegangenen Erläuterungen
wird deutlich, daß sich
Teile der die Taq-Polymerase
codierenden Sequenz als Sonden zur Gewinnung anderer thermostabile
Polymerasen codierender Sequenzen in einer Vielzahl von Arten verwenden lassen.
Teile der genomischen DNA, die mindestens sechs Aminosäuren codieren,
können
dementsprechend in E. coli repliziert werden. Die als Sonden oder
Oligodesoxyribonucleotid-Sonden verwendeten denaturierten Formen,
die mindestens 6 Aminosäuren
codieren, können
synthetisiert werden und zur Gewinnung zusätzlicher DNAs verwendet werden,
die eine thermostabile Polymerase codieren. Da die Thermus aguaticus-Nucleotidsequenz
und die der entsprechenden Teile anderer Arten möglicherweise nicht genau übereinstimmen, braucht
man wahrscheinlich etwa 18 Nucleotide enthaltende Oligomere (die
ein aus sechs Aminosäuren
bestehendes Peptid codieren), um unter ausreichenden Stringenzbedingungen
eine Hybridisierung unter Ausschluß falsch positiver Clone zu
erhalten. Die Information, die in den sechs Aminosäuren codierenden
Sequenzen enthalten ist, reicht für solche Sonden aus.
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Geeignete Wirte, Kontrollsysteme
und Verfahren
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Im
allgemeinen umfaßt
die Herstellung einer rekombinanten Form der Taq-Polymerase folgende Schritte:
Zuerst
wird eine DNA gewonnen, die entweder das reife Enzym (der hier verwendete
Begriff umfaßt
alle Muteine) codiert oder eine Fusion der Taq-Polymerase mit einer zusätzlichen
Sequenz, welche ihre Aktivität
nicht zerstört,
bzw. mit einer zusätzlichen
Sequenz, die unter kontrollierten Bedingungen (wie z.B. Behandlung
mit einer Peptidase) abgespalten werden kann, wodurch ein aktives
Protein erhalten wird. Die Sequenz ist zur Expression in jedem Wirtsorganismus
geeignet, wenn sie nicht durch Introns unterbrochen ist. Diese Sequenz sollte
eine Form aufweisen, in der sie ausgeschnitten und gewonnen werden
kann.
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Die
ausgeschnittene oder gewonnene codierende Sequenz wird dann vorzugsweise
in einem replizierbaren Expressionsvektor mit geeigneten Kontrollsequenzen
funktionell verbunden. Der Vektor wird zur Transformation eines
geeigneten Wirtes verwendet. Der transformierte Wirt wird unter
vorteilhaften Bedingungen gezüchtet,
damit die Produktion der rekombinanten Taq-Polymerase erfolgen kann.
Die Taq-Polymerase wird entweder aus dem Medium oder den Zellen
isoliert; Aufbereitung und Reinigung des Proteins können dann
unterbleiben, wenn die Verunreinigungen in Kauf genommen werden
können.
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Für jeden
vorstehend beschriebenen Schritt gibt es verschiedene Ausführungsformen.
Die gewünschte
codierende Sequenz kann beispielsweise aus genomischen Fragmenten
gewonnen und in geeigneten Wirten direkt verwendet werden. Expressionsvektor-Konstrukte,
die in vielen Wirtssystemen funktionieren, werden unter Verwendung
geeigneter Replikationsstartpunkte und Kontrollsequenzen hergestellt,
wie nachstehend dargelegt. Falls keine geeigneten Restriktionsstellen
normalerweise vorhanden sind, können
diese an die Enden der codierenden Sequenz angefügt werden, damit ein Gen bereitgestellt
werden kann, das sich zur Insertion in die Vektoren ausschneiden
läßt.
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Kontrollsequenzen,
Expressionsvektoren und Transformationsverfahren hängen vom
Typ der Wirtszelle ab, die zur Genexpression verwendet wird. Im
allgemeinen lassen sich derzeit Zellen von Prokaryoten, Hefen, Insekten
oder Säugern
als Wirtszellen verwenden. Im allgemeinen sind prokaryotische Wirte
zur Herstellung rekombinanter Proteine am wirksamsten und geeignetsten.
Deshalb werden sie zur Expression der Taq-Polymerase bevorzugt.
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Im
besonderen Fall der Taq-Polymerase gibt es Anhaltspunkte dafür, daß sowohl
unter rekombinanten als auch nativen Bedingungen eine große Deletion
am N-Terminus der Proteine auftreten kann, daß jedoch die Aktivität des Proteins
trotzdem erhalten bleibt. Es scheint, daß die isolierten nativen Proteine
durch proteolytischen Abbau und nicht durch Translation eines verkürzten Gens
entstehen. Das vom verkürzten
Gen des Plasmids pFC85 produzierte Mutein ist jedoch in DNA-Polymerase-Tests
genauso vollkommen aktiv wie das Protein, das von DNA voller Länge codiert
wird. Da klar ist, daß bestimmte
am N-Terminus verkürzte
Proteinformen aktiv sind, können
die zur Polymerase-Expression verwendeten Gen-Konstrukte auch die
entsprechend verkürzten
Formen der codierenden Sequenz umfassen.
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Kontrollsequenzen und
entsprechende Wirte
-
Als
Prokaryonten werden am häufigsten
verschiedene E. coli-Stämme
verwendet. Andere mikrobielle Stämme,
z.B. Bacillus-Arten wie Bacillus subtilis, verschiedene Pseudomonas-Arten
oder andere Bakterienstämme,
können
jedoch auch verwendet werden. In diesen prokaryontischen Systemen
werden Plasmidvektoren verwendet, die Replikationsstellen und Kontrollsequenzen
enthalten, die aus einer mit dem Wirt verträglichen Art stammen. Z.B. wird
E. coli typischerweise mit Derivaten des Plasmids pBR322 transformiert, das
von Bolivar et al., Gene, 2 (1977), 95, aus einer E. coli-Art isoliert
worden ist. pBR322 enthält
Gene für Ampicillin-
sowie Tetracyclin-Resistenz und stellt daher zusätzliche Marker bereit, die
bei der Konstruktion des gewünschten
Vektors entweder erhalten oder zerstört werden können. Hier werden häufig verwendete
prokaryontische Kontrollsequenzen so definiert, daß sie Promotoren
zur Transkriptionseinleitung, gegebenenfalls eine Operatorsequenz
sowie Sequenzen mit Ribosomenbindungsstellen umfassen. Sie umfassen
häufig
verwendete Promotoren, wie z.B. die Promotorsysteme vom β-Lactamase
(Penicillinase)- und Lactose (lac)-Gen (Chang et al., Nature, 198
(1977), 1056), vom Tryptophan (trp)-Gen (Goeddel al., Nucleic Acids Res.,
8 (1980), 4057) und den vom lambda-Phagen abstammenden PL-Promotor
(Shimatake et al., Nature, 292 (1981), 128) sowie die Ribosomenbindungsstelle
vom N-Gen. Prokaryontische Kontrollsequenzen sind als nützliche übertragbare
Kontrollsequenz-Kassette hergestellt worden, die als erste DNA-Sequenz
den PL-Promotor umfaßt, der mit einer zweiten Sequenz
funktionell verbunden ist, die NRBS entspricht,
wobei sich diese Sequenzen stromaufwärts von einer dritten DNA-Sequenz
mit mindestens einer Restriktionsstelle befinden. Die Restriktionsstelle
gestattet die Spaltung von sechs am 3'-Ende der NRBS-Sequenz
gelegenen Basenpaare. Das Phosphatase A (phoA)-System, das von Chang
et al., in der am 8. Oktober 1986 veröffentlichten und dem gleichen Anmelder übertragenen
EP-196,864 beschrieben ist, läßt sich
ebenfalls verwenden. Es können
jedoch alle verfügbaren
Promotorsysteme verwendet werden, die mit Prokaryonten kompatibel
sind.
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Neben
Bakterien können
einzellige Eukaryonten, wie z.B. Hefen, als Wirte verwendet werden.
Laborstämme
der Bäckerhefe
Saccharomyces cerevisiae werden am häufigsten verwendet, aber auch
eine Anzahl anderer Stämme
ist allgemein verfügbar.
Vektoren, die den 2-Micron-Replikationsstartpunkt enthalten sind,
beschrieben (Broach, J. R., Meth. Enz., 101 (1983), 307), aber auch
andere Plasmidvektoren eignen sich zur Hefe-Expression (vgl. beispielsweise
Stinchcomb et al., Nature, 282 (1979), 39; Tschempe et al., Gene,
10 (1980), 157 und Clarke, L., et al., Meth. Enz., 101 (1983), 300).
Kontrollsequenzen für
Hefevektoren umfassen die Promotoren zur Synthese glycolytischer
Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7 (1968), 149; Holland,
M. J., et al., Biotechnology, 17 (1978), 4900).
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Weitere
auf dem Fachgebiet bekannte Promotoren umfassen den Promotor der
3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255 (1980),
2073) und die Promotoren für
andere glycolytische Enzyme, wie z.B. Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase,
Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase,
3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphat-isomerase, Phosphoglucose-Isomerase
und Glucokinase. Weitere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil besitzen,
daß die
Transkription durch die Wachstumsbedingungen kontrolliert wird,
sind die Promotorbereiche für
die Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, die Saure Phosphatase,
im Zusammenhang mit dem Stickstoff-Metabolismus stehende Abbau-Enzyme
sowie Enzyme, die für
Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind (Holland, vorstehend).
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Terminationssequenzen
am 3'-Ende der codierenden
Sequenzen sind oft erwünscht.
Man findet diese Terminationssequenzen im nicht-translatierten Bereich
im Anschluß an
das 3'-Ende der
codierenden Sequenzen von Genen, die aus Hefen stammen. Viele Beispiele
für Vektoren
enthalten Kontrollsequenzen, die entweder vom Enolase-Gen, das das
Plasmid peno46 enthält
(Holland, M. J., et al., J. Biol. Chem., 256 (1981), 1385), oder
vom LEU2-Gen gewonnen werden, das von YEp 13 abstammt (Broach, J.,
et al., Gene, 8 (1978), 121). Dennoch ist jeder beliebige Vektor
geeignet, der einen Hefe-kompatiblen Promotor, Replikationsstartpunkt
und andere Kontrollsequenzen enthält.
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Es
besteht natürlich
die Möglichkeit,
die Polypeptide codierenden Gene in eukaryontischert Wirtszellkulturen
zu exprimieren, die aus mehrzelligen Organismen abstammen. Vgl.
beispielsweise Tissue Culture, Herausgeber Cruz und Patterson, (1973),
Academic Press. Nützliche
Wirtszellinien umfassen die Maus-Myelomzellinien N51 und VERO, HeLa-Zellen
sowie Ovarialzellen vom Chinesischen Hamster (CHO). Expressionsvektoren
für diese
Zellen umfassen normalerweise Promotoren und Kontrollsequenzen,
die mit Säugerzellen
kompatibel sind, wie z.B. die häufig
verwendeten frühen
und späten
Promotoren vom Affen-Virus 40 (SV 40) (Fiers et al., Nature, 273
(1978), 113) oder weitere virale Promotoren, wie z.B. vom Polyom-Virus,
Adenovirus 2, Rinder-Papillomvirus oder von Vogel-Sarcomviren abstammende
Promotoren, sowie Immunglobulin-Promotoren
und Hitzeschock-Promotoren. Ein DNA-Expressionssystem in Säugersystemen
unter Verwendung von BPV als Vektor ist im US-Patent 4,419,446 offenbart.
Eine modifizierte Variante dieses Systems ist im US-Patent 4,601,978
beschrieben. Allgemeine Ausführungsformen
der Transformation von Säuger-Wirtssystemen
sind von Axel, US-Patent 4,399,216, beschrieben worden. Es hat sich
nun gezeigt, daß zur
Optimierung der Expression auch "Enhancer"-Bereiche wichtig sind. Diese stellen
im allgemeinen Sequenzen dar, die stromaufwärts von Promotorbereichen gefunden
werden. Im Bedarfsfall können
Replikationsstartpunkte aus viralen Quellen gewonnen werden. Die
Integration in das Chromosom erfolgt jedoch in Eukaryonten durch
einen allgemeinen DNA-Replikationsmechanismus.
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Als
Wirte sind jetzt auch pflanzliche Zellen verfügbar. Mit pflanzlichen Zellen
kompatible Kontrollsequenzen, wie z.B. der Promotor der Nopalinsynthase
und Polyadenylierungs-Signalsequenzen (Depicker, A., et al., J.
Mol. Appl. Gen., 1 (1982), 561), sind verfügbar.
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Außerdem sind
vor kurzem Expressionssysteme unter Verwendung von Insektenzellen
beschrieben worden, in denen von Baculovirus-Vektoren stammende
Kontrollsysteme eingesetzt werden (Miller, D. W. et al., in Genetic
Engineering, Herausgeber Setlow, J. K. et al., Hrsg. Bd. 8 (1986),
Seiten 277–297,
Plenum Publishing). Auch diese Systeme können erfolgreich zur Herstellung
der Taq-Polymerase verwendet werden.
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Transformationen
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Je
nachdem, welche Wirtszelle verwendet wird, erfolgt die Transformation
unter Verwendung von Standardverfahren, die für solche Zellen geeignet sind.
Für Prokaryonten
oder andere Zellen, die starke Zellwandbarrieren enthalten, wird
das von Cohen, S. N., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69 (1972), 2110,
beschriebene Calciumchlorid-Behandlungsverfahren verwendet. Für bestimmte
Pflanzenzellen wird eine Infektion mit Agrobacterium tumefaciens
(Shaw, C. H. et al., Gene, 23 (1983), 315) verwendet. Für Säugerzellen
ohne solche Zellwände
wird das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren
von Graham und van der Eb, Virology, 52 (1978), 546, bevorzugt.
Transformationen in Hefezellen werden nach den Verfahren von Van
Solingen, P. et al., J. Bact., 130 (1977), 946, und Hsiao, C. L.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76 (1979), 3829, durchgeführt.
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Konstruktion einer λgt11-Expressionsaenbank
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Die
Strategie, unter Verwendung des Bakteriophagenvektors lambda gt11
DNA zu isolieren, die die gewünschten
Proteine codiert, wie z.B. die Taq-Polymerase codierende DNA, ist wie folgt.
Eine Genbank kann konstruiert werden, indem in die EcoRI-Stelle
im Phagen lambda gt11 durch vollständige Spaltung von Thermus
aguaticus-DNA erzeugte AluI-Fragmente mit flankierenden EcoRI-Enden
inseriert werden (Young und Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA),
80 (1983), 1194–1198).
Da sich die nur einmal vorhandene EcoRI-Stelle in diesem Bakteriophagen
am Carboxyl-Terminus des β-Galactosidase-Gens
befindet, wird die DNA-Insertion (im richtigen Raster und in richtiger
Orientierung) unter der Kontrolle des Promotors/Operators des Lactose-Operons
als Fusionsprotein mit der β-Galactosidase
exprimiert.
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Genomische
Expressionsgenbanken werden dann unter Verwendung des Antikörper-Plaque-Hybridisierungsverfahrens
untersucht. In einer als "Epitop-Selektion" bezeichneten modifizierten
Variante des Verfahrens wird zur Bestätigung der identifizierten
hybridisierten Plaques ein Antiserum gegen die phagencodierte Sequenz
des Fusionsproteins verwendet. Zum Nachweis von Phagen, die die
Antigen-Determinanten dieses Proteins codierende DNA-Abschnitte tragen,
kann die rekombinante Phagen enthaltende Genbank daher mit Antikörpern untersucht
werden, die die 86 000 – 90
000 Dalton große
Taq-Polymerase erkennen.
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Ungefähr 2 × 105 rekombinante Phagen werden untersucht,
indem gegen die Taq-Polymerase gerichtetes Gesamt-Kaninchen-Antiserum
verwendet wird. Bei dieser ersten Untersuchung werden positive Signale nachgewiesen.
Ein oder mehrere der Plaques werden von Kandidaten-Plaques gereinigt,
die mit dem Präimmunserum
nicht, jedoch mit dem Immunserum reagierten, und genauer untersucht.
Zur Untersuchung der von dem rekombinanten Phagen produzierten Fusionsproteine
werden im Wirt Y1089 Lysogene des Phagen hergestellt. Durch Induzierung
der Lysogene und Gelelektrophorese der daraus resultierenden Proteine
kann bei jedem Lysogen die Produktion eines neuen Proteins, das
in anderen Lysogenen nicht gefunden wird, beobachtet werden, oder
doppelte Sequenzen können
daraus hervorgehen. Phagen mit positiven Signalen werden ausgestochen.
Im vorliegenden Fall wurde ein positiver Plaque zur weiteren Identifizierung
ausgestochen und bei geringeren Dichten zur Reinigung der Rekombinanten
erneut ausplattiert. Die gereinigten Clone werden durch Spaltung
mit dem EcoRI-Restriktionsenzym auf Größeklassen hin untersucht. Aus
den isolierten DNA-Insertionssequenzen können Sonden hergestellt, in
geeigneter Weise markiert und dann in üblichen Kolonie- oder Plaque-Hybridisierungsuntersuchungen
verwendet werden, wie in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, (1982), beschrieben.
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Die
markierte Sonde wurde zur Untersuchung einer zweiten genomischen
Genbank verwendet, die mit dem Bakteriophagen Charon-35 konstruiert
worden war (Wilhelmine A. M. et al., Gene, 26 (1983), 171–179). Die
Genbank wurde hergestellt, indem genomische Thermus aguaticus-DNA
mit Sau3A partiell gespalten wurde und aufgrund ihrer Größe fraktionierte
Fragmente (15 – 20
kb) in die BamHI-Stelle des Phagen Charon-35 cloniert wurden. Die
Sonde wurde zur Isolierung von Phagen-DNA verwendet, die die Taq-Polymerase
codiert. Es wurde festgestellt, daß ein daraus resultierender,
als CH35:Taq#4-2 bezeichneter Phage die vollständige Gensequenz enthielt.
Es wurden auch partielle Sequenzen isoliert, die Teile des Proteins
codieren.
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Vektorkonstruktion
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Zur
Konstruktion geeigneter, die gewünschte
codierende Sequenz sowie Kontrollsequenzen enthaltender Vektoren
werden Standardverfahren für
Ligierung und Restriktion eingesetzt, die auf dem Fachgebiet gut
bekannt sind. Isolierte Plasmide, DNA-Sequenzen oder synthetisierte
Oligonucleotide werden gespalten, passend zurechtgeschnitten und
erneut in der gewünschten
Form ligiert.
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Eine
ortsspezifische DNA-Spaltung wird durchgeführt, indem die DNA mit einem
geeigneten Restriktionsenzym (oder -Enzymen) unter Bedingungen gespalten
wird, die auf dem Fachgebiet im allgemeinen bekannt sind, wobei
genaue Einzelheiten von den Herstellern der im Handel erhältlichen
Restriktionsenzyme angegeben sind. Vgl. beispielsweise den Produktkatalog
von New England Biolabs. Im allgemeinen wird etwa 1 μg Plasmid-
oder DNA-Sequenz
mit einer Einheit des Enzyms in etwa 20 μl Pufferlösung gespalten. In den vorliegenden
Beispielen wird typischerweise ein Überschuß an Restriktionsenzym verwendet,
um eine vollständige
Spaltung des DNA-Substrats sicherzustellen. Die Inkubation kann
etwa ein bis zwei Stunden bei etwa 37°C ausgeführt werden, wobei Abweichungen
hingenommen werden können.
Nach jeder Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol/Chloroform
entfernt, der eine Ether-Extraktion folgen kann. Aus den wäßrigen Fraktionen
kann die Nucleinsäure
durch Ethanolpräzipitation
gewonnen werden. Falls gewünscht,
können
die gespaltenen Fragmente mit Hilfe einer Polyacrylamid- oder Agarose-Gelelektrophorese
entsprechend ihrer Größe getrennt
werden, wobei Standardverfahren verwendet werden. Eine allgemeine
Beschreibung der Trennungsverfahren entsprechend der Größe findet
sich in Methods in Enzymology, 65 (1980), 499–560.
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Durch
Restriktionsenzyme gespaltene Fragmente können mit glatten Enden versehen
werden, indem sie mit dem großen
Fragment der DNA-Polymerase I aus E. coli (Klenow-Fragment) in Gegenwart
der vier Desoxynucleosidtriphosphate (dNTPs) mit Inkubationszeiten
von etwa 15 bis 25 Minuten bei 20°C
bis 25°C
in 50 mM Tris, pH-Wert 7,6, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2,
10 mM DTT und 50 –100 μM dNTPs behandelt
werden. Durch das Klenow-Fragment werden überhängende 5'-Enden aufgefüllt, jedoch werden überhängende 3'-Einzelstränge selbst
in Gegenwart der vier dNTPs abgebaut. Auf Wunsch kann eine selektive
Reparatur durchgeführt
werden, indem nur ein, oder ausgewählte dNTPs) zugegeben werden,
innerhalb der Beschränkungen, die
durch die Beschaffenheit der überhängenden
Enden vorgegeben sind. Nach der Behandlung mit dem Klenow-Fragment
wird das Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol
präzipitiert.
Unter geeigneten Bedingungen führt
eine Behandlung mit der S1-Nuclease zur Hydrolyse aller einzelsträngigen Abschnitte.
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Unter
Verwendung des Triester-Verfahrens von Matteucci et al. (J. Am.
Chem. Soc., 103 (1981), 3185–3191)
oder automatisierter Syntheseverfahren können synthetische Oligonucleotide
hergestellt werden. Vor der Anlagerung oder zur Markierung werden
Einzelstränge
mit Kinase behandelt, wobei für
1 nM Substrat ein Überschuß an Polynucleotidkinase,
z.B. etwa 10 Einheiten, in Gegenwart von 50 mM Tris, pH-Wert 7,6,
10 mM MgCl2, 5 mM Dithiothreitol und 1–2 mM ATP
verwendet wird. Falls die Kinasebehandlung zur Sondenmarkierung
erfolgt, enthält
ATP eine hochspezifische γ-32P-Aktivität.
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Ligierungen
werden in einem Volumen von 15–30 μl unter den
folgenden Standardbedingungen und Temperaturen durchgeführt: 20
mM Tris-Cl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl2, 10
mM DTT, 33 μg/ml
BSA, 10 mM – 50
mM NaCl und entweder 40 μM
ATP, 0,01 – 0,02
(Weiss)-Einheiten T4-DNA-Ligase bei 0°C (zur Ligierung überhängender
Enden) oder 1 mM ATP, 0,3 – 0,6
(Weiss)-Einheiten T4-DNA-Ligase
bei 14°C
(zur Ligierung glatter Enden). Intermolekulare Ligierungen überhängender
Enden werden meistens bei Gesamt-DNA-Konzentrationen von 33–100 μg/ml durchgeführt (5 – 100 nM
gesamte Endkonzentration). Intermolekulare Ligierungen von glatten
Enden (meistens unter Verwendung eines 10–30fachen molaren Überschusses
der Linker) werden bei einer Konzentration der gesamten Enden von
1 μM durchgeführt.
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Zur
Vektorkonstruktion unter Verwendung von "Vektorfragmenten" wird das Vektorfragment gewöhnlich mit
der bakteriellen alkalischen Phosphatase (BAP) behandelt, um den
am 5'-Ende befindichen
Phosphatrest zu entfernen und damit die erneute Ligierung des Vektors
zu verhindern. BAP-Spaltungen werden bei einem pH-Wert von 8 in
etwa 150 mM Tris in Gegenwart von Na+- und
Mg+2 etwa eine Stunde bei 60°C durchgeführt, wobei
1 Einheit BAP pro mg Vektor verwendet wird. Zur Gewinnung der Nucleinsäurefragmente
wird die Präparation
mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert.
Alternativ wird in doppelt gespaltenen Vektoren eine erneute Ligierung
durch eine zusätzliche
Restriktionsenzym-Spaltung der nichtgewünschten Fragmente verhindert.
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Modifizierung von DNA-Sequenzen
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Für Teile
von Vektoren, die aus cDNA oder genomischer DNA stammen, die Sequenzmodifikationen benötigen, wird
eine ortsspezifische, durch Primer gesteuerte Mutagenese durchgeführt. Dieses
Verfahren ist jetzt ein Standardverfahren auf dem Fachgebiet und
wird unter Verwendung eines synthetischen Oligonucleotid-Primers
durchgeführt.
Dieser ist zu einer einzelsträngigen,
zu mutagenisierenden Phagen-DNA bis auf eine begrenzte Anzahl von
Fehlpaarungen komplementär,
welche die gewünschte
Mutation darstellen. Kurz zusammengefaßt, wird das synthetische Oligonucleotid
als Primer zur Steuerung der Synthese eines zum Phagen komplementären Stranges
verwendet und die sich daraus ergebende doppelsträngige DNA
wird in ein Wirtsbakterium transformiert, das die Phagenvermehrung
unterstützt.
Kulturen der transformierten Bakterien werden in Topagar ausplattiert,
wodurch bei Phagen enthaltenden Einzelzellen die Plaquebildung ermöglicht wird.
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Theoretisch
enthalten 50% der neu gebildeten Plaques einen Phagen, dessen Einzelstrang
in mutierter Form vorliegt; 50% enthalten die ursprüngliche
Sequenz. Die Plaques werden auf Nitrocellulose-Filter übertragen
und die abgenommenen Filter werden mit einem mit Kinase behandelten
synthetischen Primer bei einer Temperatur hybridisiert, die eine
Hybridisierung bei genauer Paarung gestattet, jedoch bei Fehlpaarungen
mit dem ursprünglichen
Strang eine Hybridisierung verhindert. Mit der Sonde hybridisierende
Plaques werden dann ausgestochen und gezüchtet. Daraus wird dann die
DNA gewonnen.
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Überprüfung der Konstruktion
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Bei
der nachstehend beschriebenen Konstruktion wird die Richtigkeit
der zur Plasmidkonstruktion durchgeführten Ligierungen bestätigt, indem
das Ligierungsgemisch zuerst in den E. coli-Stamm MM294 oder andere
geeignete Wirte transformiert wird. Wie auf dem Fachgebiet bekannt,
werden gelungene Transformanten aufgrund von Resistenzen gegen Ampicillin,
Tetracyclin oder andere Antibiotika bzw. unter Verwendung anderer
Marker je nach Art der Plasmidkonstruktion selektiert. Aus den Transformanten
werden Plasmide nach dem Verfahren von Clewell, D. B. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA), 62 (1969), 1159, hergestellt, gegebenenfalls
nach Amplifikation durch Chloramphenicol (Clewell, D. B., J. Bacteriol.,
110 (1972), 667). Die isolierte DNA wird mit Hilfe von Restriktion
untersucht und/oder mit Hilfe des Didesoxy-Verfahrens von Sanger,
F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 74 (1977), 5463, das von
Messing et al., Nucleic Acids Res., 9 (1981), 309, näher beschrieben
ist, bzw. des Verfahrens von Maxam et al., Methods in Enzymoloay,
65 (1980), 499, sequenziert.
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Beispiele für Wirtsorganismen
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Zur
Clonierung und Expression wurden in der vorliegenden Erfindung die
folgenden Wirtsstämme
verwendet:
Als Wirt zum Clonieren und Sequenzieren sowie zur
Expression unter Kontrolle der meisten bakteriellen Promotoren wurde
der aus dem E. coli Genetic Stock Center erhaltene E. coli-Stamm
MM294 GCSC #6135 verwendet. Zur Expression unter der Kontrolle des
PLNRBS-Promotors
kann der von E. coli K12 abgeleitete Stamm MC1000 lamda lysogen,
N7N53cI857 SusP80, ATCC 39531 verwendet werden. In der vorliegenden
Erfindung wurde der E. coli-Stamm DG116 verwendet, der am 7. April
1987 bei der ATCC hinterlegt worden ist (ATCC 53606).
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Für M13-Phagenrekombinanten
werden mit Phagen infizierbare E. coli-Stämme
verwendet, wie z.B. der von E. coli K12 abgeleitete Stamm DG98.
Der Stamm DG98 ist am 13. Juli 1984 bei ATCC hinterlegt worden und
hat die Hinterlegungsnummer 39768.
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Zur
Expression in Säugerzellen
werden COS-7-, COS-A2-, CV-1- und Maus-Zellen verwendet, während zur Expression in Insektenzellen
Sgodoptera frugipeida verwendet wird.
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Stabilisierung der Enzymaktivität
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Für eine langfristige
Stabilität
muß das
erfindungsgemäße Enzym
in einem Puffer aufbewahrt werden, der ein oder mehrere nichtionische
polymere Detergenzien enthält.
Im allgemeinen handelt es sich dabei um Detergenzien, welche ein
Molekulargewicht im Bereich von etwa 100 bis 250 000 Dalton, vorzugsweise
etwa 4000 bis 200 000 Dalton besitzen, und welche das Enzym in einem
pH-Bereich von etwa 3,5 bis etwa 9,5, vorzugsweise von etwa 4 bis
8,5 stabilisieren. Beispiele für
diese Detergenzien umfassen die Detergenzien, die angeführt sind
in McCutcheon's
Emulsifiers & Detergents,
Ausgabe für
Nordamerika (1983), Seiten 295–298, veröffentlicht
von McCutcheon Division of MC Publishing Co., 175 Rock Road, Glen
Rock, NJ (USA), wobei die gesamte Offenbarung dieser Veröffentlichung
durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen wird. Die
Detergenzien sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus ethoxylierten Fettalkoholethern und Laurylethern, ethoxylierten
Alkylphenolen, Octylphenoxy-polyethoxy-ethanol-Verbindungen, modifizierten
oxy-ethylierten und/oder oxypropylierten geradkettigen Alkoholen, Polyethylenglykol-monooleat-Verbindungen,
Polysorbat-Verbindungen und Phenol-Fettalkoholethern. Tween 20,
von ICI Americas Inc., Wilmington, DE, das polyoxyethylierte (20)
Sorbitanmonolaurat, sowie das ethoxylierte Alkylphenol (nonyl) IconolTM NP-40, von BASF Wyandotte Corp. Parsippany,
NJ, sind besonders bevorzugt.
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Das
erfindungsgemäße thermostabile
Enzym kann für
beliebige Zwecke verwendet werden, für die ein solches Enzym notwendig
oder erwünscht
ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das vorliegende
Enzym in dem nachstehend dargelegten Amplifikationsprotokoll eingesetzt.
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Amplifikationsprotokoll
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Das
Amplifikationsprotokoll, in dem das erfindungsgemäße Enzym
verwendet wird, kann das in dem veröffentlichten EP-Patent Nr.
200,362 beanspruchte und offenbarte Verfahren zur Amplifikation
vorhandener Nucleinsäuresequenzen
sein. Im nachstehend beschriebenen Amplifikationsverfahren wird
jedoch vorzugsweise das erfindungsgemäße Enzym verwendet.
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Im
allgemeinen umfaßt
das Amplifikationsverfahren eine Kettenreaktion zur Herstellung
mindestens einer spezifischen Nucleinsäuresequenz, wobei sich die
erhaltenen Mengen bezogen auf die durchgeführten Umsetzungsschritte exponentiell
erhöhen,
vorausgesetzt, daß (a)
die Enden der erforderlichen Sequenz hinreichend genau bekannt sind,
damit Oligonucleotide synthetisiert werden können, die mit der Sequenz hybridisieren,
und daß (b)
eine kleine Menge der Sequenz zur Initiierung der Kettenreaktion
verfügbar
ist. Das Produkt der Kettenreaktion ist eine diskrete doppelsträngige Nucleinsäure, deren
Termini den Enden der verwendeten spezifischen Primer entsprechen.
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Als
Ausgangsnucleinsäure(n)
kann eine beliebige Nucleinsäuresequenz
in gereinigter oder ungereinigter Form verwendet werden, vorausgesetzt,
sie enthält
die gewünschte
Nucleinsäuresequenz
oder es ist anzunehmen, daß sie
diese enthält.
Daher kann im Verfahren beispielsweise DNA oder RNA einschließlich Boten-RNA
eingesetzt werden, wobei die DNA oder RNA einzelsträngig oder
doppelsträngig
sein können.
Außerdem
kann ein DNA-RNA-Hybrid verwendet werden, das einen DNA- und RNA-Strang
enthält.
Ein Gemisch aus diesen Nucleinsäuren
oder ein Gemisch aus Nucleinsäuren,
die vorher durch die vorliegende Amplifikationsumsetzung hergestellt
wurden, kann ebenfalls eingesetzt werden, wobei gleiche oder unterschiedliche
Primer verwendet werden können.
Die zu amplifizierende spezifische Nucleinsäure kann auch nur einen Teil
eines größeren Moleküls darstellen
oder kann anfangs als diskretes Molekül vorliegen, so daß die spezifische Sequenz
die vollständige
Nucleinsäure
darstellt.
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Die
zu amplifizierende Sequenz muß nicht
notwendigerweise zu Anfang in reiner Form vorliegen; sie kann eine
kleine Fraktion eines komplexen Gemisches sein, wie z.B. der in
menschlicher Gesamt-DNA enthaltene Anteil des β-Globin-Gens (wie in Saiki et al., Science,
230 (1985), 1530-1534, veranschaulicht), oder ein Teil einer Nucleinsäuresequenz
eines bestimmten Mikroorganismus sein, der in einer bestimmten biologischen Probe
selbst nur eine sehr kleine Fraktion darstellt. Die Ausgangsnucleinsäuresequenz
kann mehr als eine gewünschte
spezifische Nucleinsäuresequenz
enthalten, wobei diese Sequenzen gleich oder verschieden sein können. Deshalb
läßt sich
das Amplifikationsverfahren nicht nur zur Herstellung großer Mengen
einer spezifischen Nucleinsäuresequenz
verwenden, sondern auch zur gleichzeitigen Amplifikation von mehreren
verschiedenen spezifischen Nucleinsäuresequenzen, die sich auf
dem gleichen oder auf verschiedenen Nucleinsäuremolekülen befinden können.
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Die
Nucleinsäure(n)
kann/können
aus beliebigen Ausgangsmaterialien gewonnen werden, beispielsweise
aus Plasmiden, wie z.B. pBR322, aus clonierter DNA oder RNA, sowie
aus DNA oder RNA, die aus in der Natur vorkommenden Quellen isoliert
wurde, einschließlich
Bakterien, Hefe, Viren, Organellen und höhere Organismen, wie z.B. Pflanzen
oder Tiere. Aus Blut oder Gewebematerialien, wie z.B. Chorionzotten
oder Amnionzellen, kann DNA oder RNA mit Hilfe vieler Verfahren
extrahiert werden, wie z.B. den von Maniatis et al., vorstehend,
S. 280-281, beschriebenen Verfahren.
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Bei
Verwendung von Sonden, die für
eine zuerst amplifizierte und danach nachgewiesene Sequenz spezifisch
sind, können
die Zellen ohne Nucleinsäure-Extraktion direkt
verwendet werden, indem sie in einem hypotonischen Puffer suspendiert
und dann solange auf etwa 90°C – 100°C erhitzt
werden, bis Zellyse und Auflösung
der intrazellulären
Bestandteile auftreten, was im allgemeinen nach 1 bis 15 Minuten
der Fall ist. Nach dem Hitzebehandlungsschritt können den lysierten Zellen die
Amplifikationsreagenzien direkt zugesetzt werden.
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Durch
das Amplifikationsverfahren kann jede beliebige Nucleinsäuresequenz
hergestellt werden. Es muß nur
eine ausreichende Anzahl von Basen an beiden Enden der Sequenz hinreichend
genau bekannt sein, damit zwei Oligonucleotid-Primer hergestellt werden können, die
mit verschiedenen Strängen
der gewünschten
Sequenz an relevanten Positionen entlang der Sequenz hybridisieren,
derart, daß das
synthetisierte Verlängerungsprodukt
eines Primers nach Trennung von seiner Matrize (Komplement) selbst
als Matrize zur Verlängerung
des anderen Primers dienen kann, wobei eine Nucleinsäuresequenz
definierter Länge
gebildet wird. Je mehr über
die Basen an beiden Enden der Sequenz bekannt ist, umso größer kann
die Spezifität
der Primer für
die Ziel-Nucleinsäuresequenz
sein und umso größer ist
damit die Effizienz des Verfahrens.
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Selbstverständlich kann
der hier verwendete Begriff "Primer" mehr als einen Primer
bedeuten, insbesondere dann, wenn die Information der terminalen
Sequenz(en) des zu amplifizierenden Fragments mehrdeutig ist. Falls
zum Beispiel eine Nucleinsäuresequenz
aus der Proteinsequenzinformation abgeleitet wird, werden für jeden
Strang beispielsweise mehrere Primer mit Sequenzen verwendet, die
alle möglichen
Codonvariationen aufgrund der Degeneration des genetischen Codes
enthalten. Unter diesen verschiedenen Primern ist dann ein Primer
mit dem Ende der zu amplifizierenden gewünschten Sequenz homolog.
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Die
Oligonucleotid-Primer können
mit Hilfe eines beliebigen geeigneten Verfahrens hergestellt werden,
wie z.B. mit den vorstehend beschriebenen Phosphotriester- oder
Phosphodiester-Verfahren oder automatisierten Ausführungsformen
davon. Bei einer dieser automatisierten Ausführungsformen werden Diethylphosphoramidite
als Ausgangsmaterial verwendet, wobei diese wie von Beaucage et
al., Tetrahydron Letters, 22 (1981), 1859–1862, beschrieben, synthetisiert
werden können.
Ein Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden an einem modifizierten
festen Träger
ist im US-Patent Nr. 4,458,066 beschrieben. Es ist auch möglich, einen
Primer zu verwenden, der aus einer biologischen Quelle (wie z.B.
als Produkt einer Endonucleaserestriktionsspaltung) isoliert wurde.
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Die
spezifische Nucleinsäuresequenz
wird unter Verwendung der Nucleinsäure hergestellt, die diese Sequenz
als Matrize enthält.
Der erste Schritt umfaßt
das Inkontaktbringen von jedem Nucleinsäurestrang mit vier Nucleosidtriphosphaten
und einem Oligonucleotid-Primer für jede verschiedene Nucleinsäuresequenz,
die amplifiziert oder nachgewiesen wird. Wenn die Nucleinsäuren, die
amplifiziert oder nachgewiesen werden sollen, DNA sind, sind die
vier Nucleosidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und TTP.
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Die
Nucleinsäurestränge werden
als Matrize zur Synthese weiterer Nucleinsäurestränge verwendet. Die Synthese
kann unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Verfahrens durchgeführt werden.
Die Synthese erfolgt im allgemeinen in einer gepufferten wäßrigen Lösung, vorzugsweise
bei einem pH-Wert
von 7–9, besonders
bevorzugt ist ein pH-Wert von etwa 8. Vorzugsweise wird dem Puffer,
der die getrennten Matrizenstränge
enthält,
ein Molüberschuß der zwei
Oligonucleotid-Primer zugegeben (für eine clonierte Nucleinsäure beträgt das Verhältnis Primer:Matrize
meistens etwa 1000:1, für
eine genomische Nucleinsäure
meistens etwa 106:1). Bei Verwendung des vorliegenden Verfahrens
für diagnostische
Zwecke braucht die Menge des komplementären Stranges selbstverständlich nicht
bekannt sein, weshalb die Menge des Primers relativ zur Menge des
komplementären
Stranges nicht mit Sicherheit bestimmt werden kann. In der Praxis
wird die Menge des zugesetzten Primers gegenüber der Menge des komplementären Stranges
(Matrize) dennoch als Molüberschuß vorliegen,
wenn die zu amplifizierende Sequenz in einem Gemisch komplexer langkettiger
Nucleinsäurestränge enthalten
ist. Zur Erhöhung
der Effizienz des Verfahrens wird ein hoher Molüberschuß bevorzugt.
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Im
Amplifikationspufter liegt die Konzentration der Nucleosidtriphosphate
vorzugsweise bei jeweils 150–200 μM. MgCl2 ist zur Erhöhung der Effektivität und Spezifität der Umsetzung
im Puffer in einer Konzentration von 1,5–2 mM vorhanden.
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Wie
die resultierende Lösung
danach behandelt wird, hängt
davon ab, ob die amplifizierten oder nachgewiesenen Nucleinsäuren doppel-
oder einzelsträngig
sind. Wenn die Nucleinsäuren
einzelsträngig
sind, entfällt
der Denaturierungsschritt und das Umsetzungsgemisch wird bei einer
Temperatur gehalten, die die Hybridisierung des Primers an dessen
komplementäre
Zielsequenz (Matrize) fördert.
Im allgemeinen liegt diese Temperatur im Bereich von etwa 35°C bis 65°C oder mehr,
vorzugsweise zwischen etwa 37°C–60°C, wobei die
wirksame Zeit im allgemeinen eine halbe bis fünf Minute(n), vorzugsweise
ein – drei
Minuten lang ist. Zur Erhöhung
der Spezifität
der Primerhybridisierung werden für die Taq-Polymerase und > 15-mere Primer vorzugsweise
45°C–58°C verwendet.
Kürzere
Primer erfordern tiefere Temperaturen.
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Das
Komplement für
eine ursprünglich
einzelsträngige
Nucleinsäure
kann synthetisiert werden, indem man der Nucleinsäure ein
oder zwei Oligonucleotid-Primer
zusetzt. Bei Zugabe eines einzelnen geeigneten Primers wird in Gegenwart
des Primers, des thermostabilen Enzyms und der Nucleosidtriphosphate
ein Primer-Verlängerungsprodukt
synthetisiert. Das Produkt ist teilweise zur einzelsträngigen Nucleinsäure komplementär und hybridisiert
mit dem Nucleinsäurestrang,
wobei ein doppelsträngiges
Molekül
mit Strängen
unterschiedlicher Länge
gebildet wird, das wie vorstehend beschrieben in Einzelstränge getrennt
werden kann, wodurch zwei einzelne getrennte komplementäre Stränge erhalten
werden. In einer anderen Ausführungsform kann
die Umsetzung durch Zugabe von zwei geeigneten Primern zur einzelsträngigen Nucleinsäure durchgeführt werden.
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Wenn
die Nucleinsäure
zwei Stränge
enthält,
ist die Trennung der Nucleinsäurestränge vor
ihrer Verwendung als Matrize notwendig. Die Strangtrennung wird
durch ein geeignetes Denaturierungsverfahren erreicht, das physikalische,
chemische oder enzymatische Mittel umfaßt. Ein bevorzugtes physikalisches
Verfahren zur Trennung von Nucleinsäuresträngen umfaßt das Erhitzen der Nucleinsäure, bis
diese vollständig (>99%) denaturiert ist.
Eine typische Hitzedenaturierung umfaßt Temperaturen im Bereich
von etwa 90°C
bis 105°C,
wobei die Zeit etwa 0,5 bis 5 Minuten beträgt. Vorzugsweise wird 0,5 bis
3 Minuten bei einer Temperatur von 90°C bis 100°C denaturiert. Eine Strangtrennung
kann auch durch ein Enzym aus der als Helicasen bekannten Enzymklasse
oder durch das Enzym RecA ausgelöst
werden, das Helicase-Aktivität besitzt
und von dem bekannt ist, daß es
DNA in Gegenwart von riboATP denaturiert. Geeignete Umsetzungsbedingungen
zur Trennung von Nucleinsäuresträngen durch
Helicasen sind in Kuhn, B. Abdel-Monem, M. und Hoffmann-Berling,
H., CSH-Quantitative Biology, 43 (1978), 63–67, beschrieben. Ein Überblick über Verfahren
zur Verwendung von RecA findet sich in C. Radding, Ann. Rev. Genetics,
16 (1982), 405-437. Durch die Denaturierung werden zwei getrennte
komplementäre
Stränge
gleicher oder ungleicher Länge
produziert.
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Nach
der Hitze-Denaturierung einer doppelsträngigen Nucleinsäure läßt man das
Umsetzungsgemisch auf eine Temperatur abkühlen, die die Hybridisierung
von jedem vorhandenen Primer mit dessen komplementärer Zielsequenz
(Matrize) fördert.
Abhängig
von den Reagenzien liegt diese Temperatur meistens zwischen etwa
35°C und
65°C oder
darüber,
vorzugsweise bei 37°C – 60°C, wobei
diese Temperatur für
einen bestimmten Zeitraum beibehalten wird, im allgemeinen 0,5 bis
5 Minuten, vorzugsweise 1 – 3
Minuten. In der Praxis wird die Temperatur einfach von etwa 95°C auf 37°C herabgesetzt,
für die
Taq-Polymerase vorzugsweise auf etwa 45°C – 58°C. Bei einer Temperatur in diesem
Bereich findet dann eine Hybridisierung statt.
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Die
Zugabe des thermostabilen Enzyms kann im Denaturierungsschritt erfolgen
oder während
die Temperatur auf einen Bereich gesenkt wird, der die Hybridisierung
fördert,
bzw. sich die Temperatur bereits in diesem befindet, gleichgültig, ob
die Nucleinsäure
einzel- oder doppelsträngig
ist. Das Umsetzungsgemisch wird danach auf eine Temperatur erhitzt,
die die Enzymaktivität
fördert
oder optimiert, d.h. eine Temperatur, die ausreichend ist, um die
Enzymaktivität
zu erhöhen,
daß die
Synthese der Primerverlängerungsprodukte
des hybridisierten Primers und der Matrize möglich ist. Zur Synthese des
zur jeweiligen Nucleinsäurematrize
komplementären
Verlängerungsproduktes
eines jeden Primers muß die
Temperatur ausreichend hoch sein, darf aber auch nicht so hoch sein,
daß jedes
Verlängerungsprodukt
von der komplementären
Matrize abgeschmolzen wird (d.h. die Temperatur liegt im allgemeinen
unter 80°C – 90°C).
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Die
zur Syntheseumsetzung wirksame Temperatur liegt im allgemeinen zwischen
40°C bis
80°C, vorzugsweise
bei 50°C – 75°C, was hauptsächlich davon
abhängt,
welche Enzymtypen und welche(r) Nucleinsäuretyp(en) verwendet wird/werden.
Bei Verwendung einer DNA-Polymerase aus Thermus aguaticus wird insbesondere
ein Temperaturbereich von 65°C – 75°C bevorzugt.
Die zur Synthese benötigte
Zeitspanne kann im Bereich von etwa 0,5 bis 40 Minuten oder mehr
liegen, vorzugsweise im Bereich von ein bis drei Minuten, und hängt hauptsächlich von
der Temperatur, der Länge
der Nucleinsäure,
dem Enzym und der Komplexität des
Nucleinsäuregemisches
ab. Wenn die Nucleinsäure
länger
ist, ist im allgemeinen auch eine längere Zeitspanne erforderlich.
Die Gegenwart von Dimethylsulfoxid (DMSO) ist nicht nötig und
wird auch nicht empfohlen, da festgestellt wurde, daß DMSO die
Aktivität
des Taq-Polymerase-Enzyms
hemmt.
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Der
neu synthetisierte Strang und sein komplementärer Nucleinsäurestrang
bilden ein doppelsträngiges
Molekül,
das in den folgenden Verfahrensschritten verwendet wird. Im nächsten Schritt
werden die Stränge des
doppelsträngigen
Moleküls
durch Hitzedenaturierung bei einer Temperatur getrennt, die die
Denaturierung des Moleküls
bewirkt, die aber nicht so hoch ist, daß das thermostabile Enzym vollständig und
irreversibel denaturiert oder inaktiviert wird. Hauptsächlich in
Abhängigkeit
vom Enzymtyp und der Länge
der Nucleinsäure liegt
diese Temperatur im allgemeinen im Bereich von etwa 90°C bis 105°C, besonders
bevorzugt bei 90°C – 100°C. Hauptsächlich in
Abhängigkeit
von der Temperatur und der Länge
der Nucleinsäure
liegt die Denaturierungszeit typischerweise zwischen 0,5 bis vier
Minuten.
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Danach
wird die Temperatur soweit verringert, daß die Hybridisierung des Primers
mit seinem komplementären
einzelsträngigen
Molekül
(Matrize) gefördert
wird, das im vorherigen Schritt hergestellt wurde. Diese Temperatur
ist vorstehend beschrieben.
-
Nach
diesem Hybridisierungsschritt oder statt des Hybridisierungsschrittes
(oder gleichzeitig damit) wird die Temperatur auf einen Wert eingestellt,
der wirksam ist, um die Aktivität
des thermostabilen Enzyms zu fördern,
wodurch die Synthese eines Primer-Verlängerungsproduktes unter Verwendung
des im vorangegangenen Schrittes neu synthetisierten Stranges als
Matrize ermöglicht
wird. Wiederum darf die Temperatur nicht so hoch sein, daß eine Trennung
(Denaturierung) des Verlängerungsproduktes
von seiner Matrize erfolgt, wie vorstehend beschrieben (meistens
0,5 bis 40 Minuten zwischen 40°C
bis 80°C,
vorzugsweise ein – drei
Minuten bei 50°C
bis 70°C).
Da während
dieses Schrittes eine Hybridisierung erfolgen kann, ist nach Denaturierung keine
Abkühlung
wie im vorherigen Schritt erforderlich. Falls diese verschiedenen
Schritte gleichzeitig ausgeführt
werden, liegt die Temperatur bei 50°C – 70°C.
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Die
Erhitzungs- und Abkühlungsschritte
zur Strangtrennung, Hybridisierung und Synthese des Verlängerungsprodukts
können
so oft wiederholt werden, wie zur Herstellung der gewünschten
Menge der spezifischen Nucleinsäuresequenz
erforderlich ist, je nachdem, wie diese letztendlich verwendet werden
soll. Nur die Menge der vorhandenen Primer, des thermostabilen Enzyms
und der Nucleotidtriphosphate stellt eine Beschränkung dar. Die Schritte werden
vorzugsweise mindestens zweimal wiederholt. Bei Verwendung als Nachweisverfahren
hängt die
Anzahl der Zyklen z.B. von den Eigenschaften der Probe ab. Wenn
die zu amplifizierende Probe in reiner Form vorliegt, werden beispielsweise
weniger Zyklen benötigt.
Wenn die Probe ein komplexes Nucleinsäuregemisch darstellt, werden
mehr Zyklen zur Amplifikation des Signals benötigt, damit dessen Menge zum
Nachweis ausreicht. Für übliche Amplifikationen
und Nachweise wird das Verfahren vorzugsweise mindestens 20mal wiederholt.
-
Bei
der nachstehend beschriebenen Verwendung von markierten sequenzspezifischen
Sonden werden die Schritte bevorzugt mindestens fünfmal wiederholt.
Bei Verwendung dieser Sonden für
menschliche genomische DNA wird das Verfahren zur Sequenzamplifikation
vorzugsweise 15 – 30mal
wiederholt, damit ein deutlich nachweisbares Signal produziert wird,
d.h. damit Hintergrundsignale den Nachweis nicht stören.
-
Wie
nachstehend genauer beschrieben, reichert sich die Menge der produzierten
spezifischen Nucleinsäuresequenz
exponentiell an.
-
Nach
der anfänglichen
Zugabe müssen
Nucleotide, Primer oder thermostabiles Enzym nicht weiter zugesetzt
werden, vorausgesetzt, daß das
Enzym nicht denaturiert oder irreversibel inaktiviert worden ist.
In diesem Fall ist es erforderlich, das Enzym nach jedem Denaturierungsschritt
erneut zuzusetzen. Eine Zugabe dieser Substanzen bei jedem Schritt
beeinflußt
die Umsetzung nicht negativ.
-
Wenn
die Herstellung von mehr als einer spezifischen Nucleinsäuresequenz
aus der ersten Nucleinsäure
oder einem Nucleinsäuregemisch
gewünscht
wird, wird eine geeignete Anzahl verschiedener Oligonucleotid-Primer
verwendet. Wenn zwei verschiedene spezifische Nucleinsäuresequenzen
hergestellt werden sollen, werden beispielsweise vier Primer verwendet.
Zwei der Primer sind spezifisch für eine der spezifischen Nucleinsäuresequenzen,
während
die anderen zwei Primer für
die andere spezifische Nucleinsäuresequenz spezifisch
sind. Auf diese Weise kann jede der beiden verschiedenen spezifischen
Sequenzen mit Hilfe des vorliegenden Verfahrens in exponentiell
zunehmenden Mengen hergestellt werden.
-
Nach
einer Zeitspanne, die zur Herstellung der gewünschten Menge der spezifischen
Nucleinsäuresequenz
hinreichend lang war, wird die Umsetzung beendet, indem das Enzym
auf eine bekannte Art inaktiviert wird (z.B. durch Zugabe von EDTA,
Phenol, SDS oder CHCl3) oder die Bestandteile
der Umsetzung abgetrennt werden.
-
Das
Amplifikationsverfahren kann kontinuierlich durchgeführt werden.
In einer Ausführungsform
eines automatisierten Verfahrens wird das Umsetzungsgemisch programmierten
Temperaturzyklen unterworfen, wobei die Temperatur eine bestimmte
Zeit auf einem bestimmten Wert gehalten wird.
-
Ein
für diesen
Zweck geeignetes Instrument ist ein automatisiertes Gerät zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahrens.
In diesem Instrument wird ein System zur computerunterstützten Flüssigkeitsbeschickung
verwendet, wodurch die bei einer kontrollierten Temperatur in einem
ersten Behälter aufbewahrten
Enzyme in flüssiger
Form in einen zweiten Behälter überführt werden,
dessen Temperatur durch den Computer geregelt und an ein bestimmtes
Inkubationsprofil angepaßt
wird. Im zweiten Behälter
befinden sich die zu amplifizierende(n) Nucleinsäure(n) sowie die Nucleosidtriphosphate
und Primer. Der Computer umfaßt
eine Schnittstelle für
den Benutzer, über
die der Benutzer Verfahrensparameter zur Steuerung der Merkmale
der verschiedenen Sequenzamplifikationschritte eingeben kann, wie
z.B. Zeitdauer und Temperaturen der Inkubation, die Menge des zu überführenden
Enzyms, usw.
-
Ein
bevorzugtes Gerät,
das eingesetzt werden kann, führt
die Temperaturzyklen ohne Flüssigkeitsbeschickungs-System
aus, da das Enzym nicht nach jedem Zyklus zugeführt werden muß. Ein solches
Gerät besteht
aus den folgenden Systemen:
- 1. Einem wärmeleitenden
Behälter
zur Aufnahme einer bestimmten Anzahl von Reaktionsgefäßen, vorzugsweise
50 μl-Röhrchen,
die das Umsetzungsgemisch aus Nucleosidtriphosphaten, Primern, Nucleinsäuresequenzen
und einem Enzym enthalten.
- 2. Einer Vorrichtung, wodurch der wärmeleitende Behälter erhitzt,
gekühlt
und über
oder unter Raumtemperatur gehalten wird, wobei diese Vorrichtung
ein Eingabegerät
besitzt, wodurch ein Kontrollsignal zur Kontrolle darüber empfangen
werden kann, auf welche Temperatur der Behälter erhitzt oder abgekühlt wird bzw.
bei welcher Temperatur der Behälter
gehalten wird. (Das können
Peltier-Wärmepumpen,
erhältlich
von Materials Electronics Products Corporation, Trenton, NJ, oder
ein Wasserwärmeaustauscher
sein.)
- 3. Einem Computerteil (z.B. einer Mikroprozessor-Kontrolleinheit),
das mit dem Eingabegerät
der vorstehend beschriebenen Vorrichtung verbunden ist und mit dem
Signale erzeugt werden können,
welche die Reihenfolge der Amplifikationschritte, Temperaturwerte,
Temperaturanstiege und Zeitdauer automatisch kontrollieren.
-
In
einer anderen Ausführungsform
kann das zur Synthese der Primer-Verlängerungsprodukte
verwendete Enzym an einer Säule
immobilisiert werden. Die anderen Umsetzungsbestandteile werden
mittels einer Pumpe kontinuierlich durch die Säule und eine in Reihe geschaltete
Heizschlange gepumpt. Die hergestellten Nucleinsäuren können daher wiederholt denaturiert
werden, ohne daß das
Enzym inaktiviert wird.
-
Das
Amplifikationsprotokoll ist nachstehend graphisch dargestellt, wobei
als Nucleinsäure
doppelsträngige
DNA verwendet wird, welche die gewünschte Sequenz [S] enthält, die
komplementäre
Stränge
[S+] und [S–]
umfaßt.
Durch die Verlängerung
jedes mit der ursprünglichen
Matrize hybridisierten Primers wird im Verlauf des ersten Zyklus
und aller nachfolgenden Zyklen der Umsetzung ein neues ssDNA-Molekül unbestimmter
Länge erzeugt,
das mit nur einem der Primer endet. Diese nachstehend als "lange Produkte" bezeichneten Produkte
reichern sich linear an; d.h. die nach einer beliebigen Anzahl von
Zyklen vorhandene Menge verhält
sich zur Anzahl der Zyklen proportional.
-
Während der
nachfolgenden Zyklen dienen die so hergestellten langen Produkte
als Matrizen für
einen der beiden Oligonucleotid-Primer und erzeugen Moleküle der gewünschten
Sequenz [S+] oder [S–].
Diese Moleküle
dienen ebenfalls als Matrizen für
einen der beiden Oligonucleotid-Primer, wodurch weitere [S+]- oder [S–]-Moleküle erzeugt
werden. Auf diese Weise wird eine Kettenreaktion aufrechterhalten,
die zu einer auf die Anzahl der Zyklen bezogenen, exponentiellen
Anreicherung von [S] führt.
-
Nebenprodukte,
die durch nicht geplante Oligonucleotid-Hybridisierungen gebildet
werden, sind nicht autokatalytisch (außer in seltenen Fällen) und
reichern sich daher linear an.
-
Die
spezifische zu amplifizierende Sequenz [S] kann wie folgt graphisch
dargestellt werden:
-
-
Geeignete
Oligonucleotid-Primer wären:
so daß, falls eine [S] enthaltende
DNA
in Einzelstränge getrennt
wird und ihre Einzelstränge
mit den Primern 1 und 2 hybridisiert werden, die folgenden Verlängerungsumsetzungen
durch eine thermostabile Polymerase in Gegenwart der vier Nucleosidtriphosphate
katalysiert werden können:
-
-
Nach
Denaturierung der zwei gebildeten doppelsträngigen Moleküle, sind
die Produkte:
-
-
-
Wenn
man diese vier Stränge
erneut mit den Primern 1 und 2 im nächsten Zyklus hybridisieren
läßt, katalysiert
die thermostabile Polymerase die folgenden Umsetzungen:
-
-
Wenn
die Stränge
der vorstehenden vier dopgelsträngigen
Molküle
getrennt werden, werden die folgenden Stränge gefunden:
-
-
-
Es
ist ersichtlich, daß jeder
Strang, der mit der Oligonucleotid-Sequenz eines Primers und der
komplementären
Sequenz des anderen Primers endet, die spezifische Nucleinsäuresequenz
[S] darstellt, deren Herstellung erwünscht ist.
-
Die
Menge der ursprünglichen
Nucleinsäure
bleibt im gesamten Verfahren konstant, da sie nicht repliziert wird.
Die Menge der langen Produkte wächst
mit linearer Geschwindigkeit, da ihre Herstellung nur von der ursprünglichen
Nucleinsäure
aus erfolgt. Die Menge der spezifischen Sequenz wächst exponentiell.
Daher wird die spezifische Sequenz zur vorherrschenden Spezies.
Das wird in der folgenden Tabelle veranschaulicht, welche die nach
n Zyklen theoretisch vorhandenen relativen Mengen der Molekülarten zeigt,
wobei in jedem Zyklus eine 100%-ige Effizienz vorausgesetzt wird:
-
Anzahl
der Doppelstränge
nach 0 bis n Zyklen
-
Bei
Verwendung einer einzelsträngigen
Nucleinsäure
als Matrize wird pro Zyklus nur ein langes Produkt gebildet.
-
Zur
Erzielung einer größeren Spezifität der Umsetzung
kann eine in einer bestimmten Sequenz vorhandene Sequenz nach einer
bestimmten Anzahl von Amplifikationszyklen amplifiziert werden,
indem nach mindestens einem Amplifikationszyklus ein Satz von Primern
zugegeben wird, die zu internen (sich nicht an den Enden befindenden)
Sequenzen der zu amplifizierenden Sequenz komplementär sind.
Diese Primer können
in jeder Stufe zugesetzt werden und bieten die Möglichkeit, ein kürzeres amplifiziertes
Fragment zu erzeugen. In einer anderen Ausführungsform wird ein längeres Fragment
unter Verwendung von Primern hergestellt, deren Enden zu den vorher
in der Amplifikation verwendeten Primern nicht komplementär sind,
die jedoch einige mit diesen Primern überlappende Sequenzen aufweisen.
-
Das
vorliegende Verfahren kann verwendet werden, um eine bestimmte Nucleinsäuresequenz
zur Insertion in einen geeigneten Expressionsvektor zu clonieren.
Der Vektor kann dann zur Transformation eines geeigneten Wirtsorganismus
verwendet werden, um das Genprodukt der Sequenz mit Hilfe von Standard-DNA-Rekombinationstechniken
herzustellen.
-
Das
vorliegende Amplifikationsverfahren kann ein aus der ursprünglichen
Nucleinsäure-Matrize,
den erwarteten amplifizierten Zielprodukten und verschiedenen unspezifischen
Nebenprodukten bestehendes Nucleinsäuregemisch liefern. Das amplifizierte
Produkt kann auch ein Gemisch sein, wenn die ursprüngliche DNA-Matrize
mehrere Zielsequenzen enthält,
wie es z.B. bei einem heterozygoten diploiden Genom der Fall ist
oder wenn es sich um eine Familie verwandter Gene handelt.
-
Die
hier verwendeten Primer können
modifiziert werden, damit eine schnelle und spezifische Clonierung
des durch die Amplifikationsreaktion hergestellten DNA-Gemisches
erfolgen kann. Bei einer derartigen Modifikation enthält jeder
Primer oder die Sequenz, die amplifiziert und cloniert werden soll,
eine Restriktionsstelle. Vorzugsweise werden an den 5'-Enden der Primer
gleiche oder unterschiedliche Restriktionsstellen eingebaut, wobei
Restriktionsstellen an beiden Enden des amplifizierten Produkts
erhalten werden. Nach Spaltung mit geeigneten Restriktionsenzymen
kann das amplifizierte Produkt ohne weiteres in Plasmid- oder Virus-Vektoren
inseriert und cloniert werden. Diese Clonierung ermöglicht die
Analyse oder Expression von einzelnen amplifizierten Produkten,
nicht jedoch von Gemischen.
-
Wenn
die Primer Restriktionsstellen aufweisen, kann die gleiche Restriktionsstelle
für beide
Primer verwendet werden. Die Verwendung verschiedener Restriktionsstellen
ermöglicht
jedoch eine Insertion des Produkts in den Vektor in einer bestimmten
Orientierung. Dadurch werden mehrfache Insertionen ebenso wie Insertionen
unterdrückt,
die sich aus Amplifikationen ergeben, die auf nur einem der zwei
Primer basieren. Eine bestimmte Orientierung ist dann nützlich,
wenn die Clonierung in einzelsträngige
Vektoren zur Sequenzierung erfolgt, wenn einzelsträngige Hybridisierungssonden
verwendet werden oder wenn das clonierte Produkt exprimiert wird.
-
Ein
Verfahren zur Primerherstellung besteht darin, eine Primersequenz
zu wählen,
die sich nur unwesentlich von der Zielsequenz unterscheidet. Bereiche,
an die die jeweiligen Primer hybridisieren sollen, werden auf Homologie
zu Restriktionsstellen hin untersucht, die für den gewünschten Vektor geeignet sind.
Die Zielsequenz "CAGTATCCGA..." unterscheidet sich
beispielsweise nur durch eine Base von einer Sequenz, die die BamHI-Stelle
enthält.
Die Primersequenz wird so ausgewählt,
daß sie
in ihrem 3'-Ende
exakt mit der Zielsequenz übereinstimmt
und die veränderte
Sequenz und damit eine Restriktionsstelle in der Nähe ihres
5'-Endes enthält (beispielsweise "CAGgATCCGA...", wobei der Kleinbuchstabe
eine Basenfehlpaarung mit der Zielsequenz symbolisiert). Diese nur
unwesentlich veränderte
Sequenz stört
die Fähigkeit
des Primers nicht, mit der ursprünglichen
Zielsequenz zu hybridisieren und eine Polymerisation zu initiieren.
Nach dem ersten Amplifikationszyklus ist der Primer kopiert, wird
zum Bestandteil des Zielmoleküls
und stimmt mit neuen Primern exakt überein.
-
Nach
dem Amplifikationsverfahren werden die Produkte mit geeigneten Restriktionsenzymen
gespalten. Aus dem Restriktionsgemisch werden gegebenenfalls Hemmstoffe
der Ligierung abgetrennt, wie z.B. Nucleosidtriphosphate und Salze,
indem man das Gemisch beispielsweise durch eine Säule zum
Entsalzen, eine Säule
zur Molekulargewichtschromatographie oder durch eine Membran hindurchlaufen
läßt. Das/die
Spaltprodukt(e), das/die die amplifizierte, zu clonierende Sequenz
enthält/enthalten,
wird/werden durch Ligierung in einen Clonierungsvektor inseriert,
wie z.B. den Bakteriophagen M13. Im allgemeinen besitzt der Clonierungsvektor
einen selektierbaren Marker und gegebenenfalls auch einen Promotor.
Das Gen kann dann unter Verwendung allgemein bekannter Verfahren
sequenziert und/oder exprimiert werden, falls es ein Protein codiert. Das
Gen kann auch während
des Amplifikationsverfahrens durch Zugabe eines geeigneten Primers
sequenziert werden, wobei der Primer zu dem gewünschten Sequenzteil komplementär ist, der
sequenziert werden soll. Der Primer bildet ein Verlängerungsprodukt,
wobei der Umfang der Amplifikation dieses Verlängerungsproduktes Informationen
zur Sequenz liefert.
-
Ein
weiteres Verfahren zur Primerherstellung umfaßt die Ableitung der Sequenz
des 3'-Primerendes aus
der Zielsequenz und das Anfügen
der gewünschte(n)
Restriktionsstelle(n) an das 5'-Primerende.
Im vorstehenden Fall kann eine HindIII-Stelle angefügt werden,
wodurch die Sequenz "cgaagcttCAGTATCCGA..." hergestellt wird,
in der die Kleinbuchstaben die vorstehend angegebene Bedeutung haben.
Die angefügten
Basen tragen im ersten Amplifikationszyklus nicht zur Hybridisierung
bei, führen
aber in den anschließenden
Zyklen zur Basenpaarung. Die amplifizierten Endprodukte werden dann
mit einem oder mehreren Restriktionsenzym(en) gespalten, cloniert
und exprimiert, wie vorstehend beschrieben. Das amplifizierte Gen
kann beispielsweise das menschliche beta-Hämoglobin-Gen oder die menschlichen
HLA-DQ, DR- oder DP-α-
und β-Gene
sein.
-
In
einem alternativen Clonierungsverfahren, das jedoch weniger bevorzugt
und weniger wirksam ist, wird statt der Ligierung überhängender
Enden (unter Verwendung von Restriktionsenzymen) eine Ligierung glatter
Enden verwendet, wobei das eigentliche Amplifikationsverfahren ohne
Rücksicht
auf Restriktionsstellen in den Primern oder der/den zu clonierenden
Sequenz(en) durchgeführt
werden kann. Die Schritte müssen
jedoch hinreichend oft wiederholt werden, damit die hergestellte(n)
amplifizierte(n) Sequenz(en) für
eine Ligierung ausreichen. Eine Ligierung glatter Enden erfordert
größere Konzentrationen
der s Sequenz(en) und des/der Clonierungs-vektors/Clonierungsvektoren
als die Ligierung überhängender
Enden. Außerdem
muß die
Ligierung in Gegenwart einer Ligase stattfinden, wie z.B. der T4-Ligase
oder E. coli Ligase und Ligase. Wenn das amplifizierte Produkt einmal
gewonnen ist, stellt die Ligierung ein Standardverfahren dar, wobei
dem Fachmann allgemein bekannte Bedingungen verwendet werden.
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Mit
einem Clonierungsverfahren ohne Ligierung glatter Enden kann sowohl
die Orientierung als auch die Häufigkeit
einer Insertion des amplifizierten Produktes in den Clonierungsvektor
kontrolliert werden.
-
Das
vorliegende Verfahren kann außerdem
zur in vitro-Mutagenese verwendet werden. Die Oligonucleotid-Primer
müssen
zu der zu amplifizierenden Nucleinsäuresequenz nicht exakt komplementär sein.
Es ist nur erforderlich, daß sie
mit der Sequenz ausreichend gut hybridisieren können, damit eine Verlängerung durch
das thermostabile Enzym stattfindet. Die Produkte einer Amplifikationsreaktion,
in der die Primer verwendet wurden, sind zur ursprünglichen
Matrize nicht exakt komplementär
und enthalten eher die Primersequenz als die Matrizensequenz, wodurch
eine in vitro-Mutation eingeführt
wird. In weiteren Zyklen wird diese Mutation mit unverminderter
Effizienz amplifiziert, da keine weiteren Primerhybridisierungen
mit Basenfehlpaarungen erfolgen. Die so hergestellte Mutante kann
mit Hilfe von Standardverfahren der Molekularbiologie in einen geeigneten
Vektor inseriert werden und verleiht diesem Vektor Mutanteneigenschaften,
wie z.B. die Fähigkeit
zur Produktion eines veränderten
Proteins.
-
Zur
Herbeiführung
weiterer Sequenzveränderungen
könnte
das vorstehend beschriebene Verfahren zur Herstellung einer veränderten
DNA-Sequenz an der modifizierten DNA unter Verwendung unterschiedlicher
Primer wiederholt werden. Auf diese Weise könnte allmählich eine Reihe mutierter
Sequenzen hergestellt werden, wobei sich jede neue Sequenzveränderung
von der vorherigen nur unwesentlich unterscheidet, jedoch zunehmend
von der ursprünglichen
Ausgangs-DNA-Sequenz. Auf diese Weise kann man am Ende der Amplifikation
Veränderungen
erzielen, die in einem einzigen Schritt nicht erzeugt werden können, da
ein Primer nicht richtig funktionieren kann, wenn seine Sequenz
mit der Matrizensequenz sehr viele Basenfehlpaarungen eingeht.
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Als
Teil seiner Sequenz kann der Primer außerdem eine nichtkomplementäre Sequenz
enthalten, vorausgesetzt, daß ein
ausreichender Teil seiner Sequenz komplementär zum amplifizierten Strang
ist. Eine zur Matrizensequenz nichtkomplementäre Nucleotidsequenz (wie z.B.
ein Promotor, Linker, eine codierende Sequenz, usw.) kann beispielsweise
an das 5'-Ende eines
oder beider Primer angeheftet und dadurch an das Produkt des Amplikationsverfahrens
angehängt
werden. Nach der Zugabe des Verlängerungsprimers
werden ausreichend viele Zyklen durchgeführt, um die gewünschte Menge
der neuen Matrize zu erhalten, die die nichtkomplementäre Nucleotidinsertion
enthält.
Unter Verwendung eines einfachen Verfahrens wird so die Herstellung
großer
Mengen der kombinierten Fragmente in einer relativ kurzen Zeitspanne
ermöglicht
(z.B. zwei Stunden oder weniger).
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Das
vorliegende Verfahren kann auch verwendet werden, um spezifische
Nucleinsäuresequenzen nachzuweisen
und/oder zu charakterisieren, die im Zusammenhang mit infektiösen Krankheiten,
genetischen Störungen
oder zellulären
Erkrankungen, wie z.B. Krebs, stehen, z.B. Oncogene. Eine Amplifikation
läßt sich dann
verwenden, wenn die zur Analyse verfügbare Menge der Nucleinsäure sehr
klein ist, wie z.B. bei der pränatalen
Diagnose der Sichelzellenanämie,
wobei aus foetalen Zellen gewonnene DNA verwendet wird. Eine Amplifikation
ist besonders nützlich,
wenn eine solche Analyse mit einer kleinen Probe mittels nichtradioaktiver Nachweisverfahren
durchgeführt
werden muß,
die von Natur aus nicht sensitiv sind, oder wenn radioaktive Nachweisverfahren
verwendet werden, jedoch ein schneller Nachweis erwünscht ist.
-
Genetische
Krankeiten im Rahmen der vorliegenden Erfindung können spezifische
Deletionen und/oder Mutationen in genomischer DNA aus einem beliebigen
Organismus umfassen, wie z.B. Sichelzellenanämie, α-Thalassämie, β-Thalassämie und dergleichen. Sichelzellenanämie kann
ohne weiteres über
Oligomer-Restriktionsanalyse nachgewiesen werden, wie in dem am
11. Dezember 1985 veröffentlichten
EP-Patent 164,054 beschrieben, oder über eine RFLP-ähnliche
Analyse nach einer Amplifikation der geeigneten DNA-Sequenz mit
Hilfe des vorliegenden Verfahrens. α-Thalassämie kann durch die Abwesenheit
einer Sequenz nachgewiesen werden, während β-Thalassämie durch die Gegenwart einer
polymorphen Restriktionsstelle nachgewiesen werden kann, die mit
einer die Krankheit verursachenden Mutation eng verbunden ist.
-
Alle
diese genetischen Krankheiten können
nachgewiesen werden, indem eine geeignete Sequenz amplifiziert und
durch Southern-Blot-Hybridisierung ohne Verwendung radioaktiver
Sonden analysiert wird. Bei einem solchen Verfahren wird beispielsweise
eine kleine DNA-Probe amplifiziert, die z.B. aus Fruchtwasser stammt
und nur eine sehr kleine Menge der gewünschten Sequenz enthält, dann
mit einem Restriktionsenzym gespalten und über das Southern-Blot-Verfahren
analysiert. Die große
Menge des amplifizierten Signals ermöglicht die Verwendung von nichtradioaktiven
Sonden.
-
In
einer anderen Ausführungsform
kann eine kleine DNA-Probe amplifiziert werden, bis eine zweckmäßige Produktmenge
hergestellt wurde, und danach wird ein weiterer Zyklus der Verlängerungsumsetzung durchgeführt, wobei
leicht nachweisbare Nucleotid-Derivate (wie z.B. 32P-markierte
oder Biotin-markierte Nucleosidtriphosphate) in das DNA-Endprodukt
eingebaut werden, das durch Restriktion, elektrophoretische Trennung
oder ein anderes geeignetes Verfahren analysiert werden kann.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
kann die Nucleinsäure
vor Amplifikation durch eine bestimmte Restriktionsendonuclease
gespalten werden. Da eine gespaltene Sequenz nicht amplifiziert
werden kann, bedeutet das Erscheinen eines amplifizierten Fragments
trotz vorheriger Spaltung der DNA-Probe, daß in der amplifizierten Sequenz
eine Stelle für
die Endonuclease fehlt. Mit Hilfe eines geeigneten Verfahrens kann
die Gegenwart oder Abwesenheit einer amplifizierten Sequenz nachgewiesen
werden.
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Eine
praktische Anwendung dieses Verfahrens wird durch seine Verwendung
zum Nachweis von Sichelzellenanämie
mit Hilfe des Oligomer-Restriktionsverfahrens
veranschaulicht, das in der vorliegenden Erfindung, in EP-164,054, oben, sowie
in Saiki et al., Bio/Technology, 3 (1985), S. 1008–1012, beschrieben
ist. Sichelzellenanämie
ist eine Hämoglobinkrankheit,
die durch einen einzelnen Basenpaar-Austausch im sechsten Codon
des β-Globin-Gens
verursacht wird.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann auch zum direkten Nachweis von einzelnen Basenpaar-Veränderungen
in einer Nucleinsäuresequenz
(wie z.B. genomischer DNA) unter Verwendung sequenzspezifischer
Oligonucleotide eingesetzt werden. Durch das Verfahren wird eine
Sequenzveränderung
direkt nachgewiesen, gleichgültig,
ob sie aus Krebs, einer infektiösen
Krankheit oder einer genetischen Schädigung, z.B. einer genetischen
Veränderung,
resultiert. Dadurch entfällt
die Notwendigkeit von Restriktionsspaltung, Elektrophorese und Genmanipulationen,
die ansonsten erforderlich sind. Die Verwendung sequenzspezifischer
Oligonucleotide in Dot-Blot-Format nach der beschriebenen Amplifikation
führt zu
einer verbesserten Spezifität und
Empfindlichkeit der Sonde. Mit 0,04 μg Probe kann in sechs Stunden
ein auswertbares Signal gewonnen werden. Bei Erhöhung der auf die Membran aufgetropften
Probenmenge auf 0,1 – 0,5 μg können auch
nicht-radioaktiv markierte Oligonucleotide statt der in den früheren Verfahren
verwendeten radioaktiven Sonden eingesetzt werden. Im nachstehend
beschriebenen Verfahren können
außerdem
auch sequenzspezifische Oligonucleotide verwendet werden, die kleiner
als 19-mere sind, und somit die Verwendung von Oligonucleotiden gestatten,
mit denen sich sequenzspezifische Unterschiede besser erfassen lassen.
-
Während RFLP-Analysen
genetischer Krankheiten eine mit der Krankheit im Zusammenhang stehende
polymorphe Restriktionsstelle erfordern, gestatten sequenzspezifische
Oligonucleotide den direkten Nachweis krankhafter genetischer Veränderungen
und sind daher allgemein zur Analyse von Krankheiten, wie Hämoglobin
C-Krankheit, α-1-Antitrypsin-Erkrankung
und β-Thalassämie, besser
geeignet, die durch die Mutation einer einzigen Base hervorgerufen
werden. Die Oligonucleotide können
außerdem
zur Unterscheidung genetischer Varianten, die verschiedene Allele
darstellen (z.B. HLA-Typisierung), verwendet werden. Das zeigt, daß auf der
Basis sequenzspezifischer Oligonucleotide ein Kit zur HLA-Typisierung
hergestellt werden kann, der ein thermostabiles Enzym enthält.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung wird zum Nachweis einer Nucleotidveränderung
in der Sequenz die Probe wie vorstehend beschrieben amplifiziert,
wobei ein Primer für
jede Nucleinsäure
verwendet wird, von der vermutet wird, daß sie die Nucleotidveränderung
enthält.
Die Probe wird dann auf eine Reihe von Membranen aufgetropft und
jede Membran wird mit einer unterschiedlichen, markierten, sequenzspezifischen Oligonucleotid-Sonde
hybridisiert. Ein Verfahren zum Auftropfen der Probe auf eine Membran
ist von Kafotos et al., Nucleic Acids Research, 7 (1979), 1541–1552, beschrieben.
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Kurz
zusammengefaßt,
wird die an der Membran fixierte DNA-Probe vor Zugabe der Sonde
mit einer Vorhybridisierungslösung
vorbehandelt, die Natriumdodecylsulfat, Ficoll, Serumalbumin und
verschiedene Salze enthält.
Einer Hybridisierungslösung
mit ähnlicher
Zusammensetzung wie die Vorhybridisierungslösung wird danach eine markierte
Oligonucleotid-Sonde zugegeben, die für jede nachzuweisende Sequenzveränderung
spezifisch ist. Die Hybridisierungslösung wird auf die Membran aufgetragen
und die Membran Hybridisierungsbedingungen unterworfen, die vom
Sondentyp und der Länge,
der Art und Konzentration der Bestandteile, usw. abhängen. Im
allgemeinen wird die Hybridisierung 0,25 –50 Stunden, vorzugsweise weniger
als drei Stunden, bei etwa 25°C
bis 75°C,
vorzugsweise bei 35°C
bis 65°C
durchgeführt.
Je stringenter die Bedingungen sind, umso hochgradiger müssen Sonde
und Probe zur Hybridisierung miteinander komplementär sein. Wenn
die Hybridisierung des Hintergrunds sehr groß ist, kann die Stringenz entsprechend
erhöht
werden. Stringente Bedingungen können
auch beim Waschen verwendet werden.
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Nach
der Hybridisierung wird die nichthybridisierte Sonde aus der Probe
durch Waschen entfernt, wobei alle geeigneten Maßnahmen eingesetzt werden können, wie
z.B. ein- oder mehrmaliges Waschen mit unterschiedlichen Konzentrationen
von Phosphat und EDTA enthaltenden Standard-Kochsalzlösungen (SSPE) (180 mM NaCl,
10 mM NaHPO4 und 1 mM EDTA, pH 7,4) bei
25°C – 75°C während etwa
10 Minuten bis zu einer Stunde, je nach der Temperatur. Die Markierung
wird dann unter Verwendung eines geeigneten Nachweisverfahrens nachgewiesen.
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Das
hier verwendete sequenzspezifische Oligonucleotid wird im allgemeinen
so hergestellt und ausgewählt,
wie vorstehend zur Herstellung und Auswahl der Primer beschrieben.
Wie vorstehend beschrieben, muß das
sequenzspezifische Oligonucleotid den Sequenzbereich umfassen, der
die nachzuweisende Nucleotidveränderung
enthält,
und muß für die nachzuweisende
Nucleotidveränderung
spezifisch sein. Falls der Nachweis gewünscht wird, ob eine Probe die
zur Sichelzellenanämie
führende
Mutation enthält,
werden beispielsweise ein Oligonucleotid, das die für ein normales
Globin-Gen charakteristische Nucleotidsequenzstelle enthält, und
ein Oligonucleotid hergestellt, das die für das Sichelzellenallel charakteristische
Nucleotidsequenz enthält.
Zum Nachweis, ob die Probe die Mutation enthält, werden Duplikate der gleichen
Probe mit jedem Oligonucleotid hybridisiert.
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Die
polymorphen Bereiche der HLA-Klasse II-Gene befinden sich in bestimmten
Bereichen des ersten Exons und werden durch konservierte Sequenzen
flankiert, so daß Oligonucleotid-Primer
hergestellt werden können,
die zu den Gegensträngen
der konservierten 5'-
und 3'-Enden des
ersten Exons komplementär
sind.
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Die
Anzahl der zum Nachweis von polymorphen Bereichen der HLA-Klasse
II-Gene verwendeten
Oligonucleotide ist unterschiedlich und hängt vom Typ des Gens ab, das
Bereiche mit Basenpaarveränderungen enthält, wobei
diese entweder gruppenweise zusammen oder weit auseinander liegen
können.
Wenn die Bereiche gruppenweise vorliegen, wie im Fall von HLA-DQ-α, wird für jedes
Allel ein Oligonucleotid eingesetzt. Wenn die Bereiche weit auseinander
liegen, wie im Fall von HLA-DQ-β und
HLA-DR-β,
wird für
jedes Allel mehr als eine Sonde verwendet, wobei jede Sonde eine
Allelvariante umfaßt.
Im Fall von HLA-DQ-β und HLA-DR-β werden drei
Sonden für
die drei Bereiche des Locus eingesetzt, in dem Allelveränderungen
auftreten können.
Zum Nachweis des insulinabhängigen
Diabetes mellitus (IDDM) werden vier Sonden für das zweite Exon von HLA-DR-β eingesetzt.
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Aus
einer bei den jeweiligen Familien durchgeführten Segregationsanalyse oder
in einigen Fällen durch
direkte Analyse der einzelnen DNA-Probe können Schlußfolgerungen über Haplotypen
gezogen werden. In heterozygoten Zellen können bestimmte Allel-Kombinationen
(Haplotypen) sequenzspezifischer Oligonucleotid-Reaktivitäten identifiziert
werden, indem die genomische DNA vor Amplifikation mit Restriktionsenzymen
gespalten wird.
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Wenn
man beispielsweise bei DQβ innerhalb
eines einzelnen amplifizierten Bereichs drei hochvariable Subbereiche
A, B und C findet und wenn in jedem Bereich sechs verschiedene Sequenzen
vorhanden sind (A1-6, B1-6, C1-6), dann könnte eine DQβ-Typisierung
einer Person durch die Analyse mit den sequenzspezifischen Oligonucleotiden
A1, A2; B2, B3; C1, C4 erfolgen, wobei die möglichen Haplotyp-Kombinationen:
A1, B2, C1; A1, B2, C4; A2, B2, C1; A2, B2, C4; A1, B3, C1; A1,
B3, C4; A1, B2, C1; und A1, B2, C4 nachgewiesen werden könnten.
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Wenn
die genomische DNA vor Amplifikation mit einem polymorphen Restriktionsenzym
gespalten wird und wenn das Enzym beide Allele zwischen den Primerpositionen
spaltet, erfolgt aufgrund der fehlenden Amplifikation keine Reaktion
mit den sequenzspezifischen Sonden und das Ergebnis stellt keine
brauchbaren Informationen dar. Wenn das Enzym kein Allel spaltet,
sind die mit der Sonde erzielten Ergebnisse für gespaltene und ungespaltene
genomische DNA gleich und das Ergebnis liefert ebenfalls keine Informationen.
Wenn das Enzym nur ein Allel spaltet, können Rückschlüsse auf beide Haplotypen gezogen
werden, indem die mit gespaltener und ungespaltener DNA erzielten
Bandenmuster der Sonde verglichen werden.
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Rückschlüsse auf
die Haplotypen können
durch den Vergleich von Bandenmustern sequenzspezifischer Oligonucleotide
mit ungespaltener genomischer DNA und genomischer DNA gezogen werden,
die durch ein oder mehrere Enzyme) gespalten wurde, von denen bekannt
ist, daß sie
polymorph sind und Stellen zwischen den Primern erkennen.
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Die
Länge der
sequenzspezifischen Oligonucleotide hängt von vielen Faktoren ab,
dazu zählen
das nachzuweisende Zielmolekül,
der Ursprung der Oligonucleotide und die Nucleotidzusammensetzung.
Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung enthält
ein sequenzspezifisches Oligonucleotid typischerweise 15–25 Nucleotide,
es kann aber auch mehr oder weniger Nucleotide enthalten. Zwar können Oligonucleotide,
die mindestens ein 19-mer darstellen, die Spezifität und/oder
Empfindlichkeit der Sonden erhöhen,
jedoch erfolgt durch Sonden, die kleiner als 19-mere sind, z.B.
16-mere, eine bessere sequenzspezifische Diskriminierung, weil vermutlich
in diesem Fall eine einzelne Basenfehlpaarung stärker destabilisierend wirkt.
Weil eine Amplifikation die Spezifität erhöht, so daß eine größere Länge weniger kritisch ist, und
zur Hybridisierung sowie zum Waschen bei gleicher Salzkonzentration
geringere Temperaturen verwendet werden können, wird die Verwendung von
Oligonucleotiden bevorzugt, die kleiner als 19-mere sind.
-
Wenn
die Probe zuerst auf die Membran aufgetragen und dann mit einem
Oligonucleotid nachgewiesen wird, muß das Oligonucleotid mit einer
geeigneten Markierung versehen werden, die durch spektroskopische,
photochemische, biochemische, immunchemische oder chemische Mittel
nachweisbar ist. Immunchemische Mittel umfassen Antikörper, die
mit einem Oligonucleotid unter geeigneten Bedingungen einen Komplex bilden
können.
Biochemische Mittel umfassen Polypeptide oder Lectine, die mit einem
Oligonucleotid unter geeigneten Bedingungen einen Komplex bilden
können.
Beispiele davon umfassen Fluoreszenzfarbstoffe, Reagenzien mit hoher
Elektronendichte, Enzyme, die unlösliche Umsetzungsprodukte abscheiden
können
oder die durch Chromogene nachweisbar sind, wie z.B. Meerrettich-Peroxidase,
alkalische Phosphatase, oder radioaktive Markierungen wie z.B. 32P, oder Biotin. Bei Verwendung von Biotin
kann ein Spacer-Arm zur Anheftung an das Oligonucleotid verwendet
werden. Als Markierung wird vorzugsweise Meerrettich-Peroxidase
verwendet.
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Alternativ
wird in einem "umgekehrten" Dot-Blot-Format
mindestens einer der Primer und/oder mindestens eines der vier Nucleosidtriphosphate
mit einer nachweisbaren Markierung versehen, so daß die resultierende
amplifizierte Sequenz markiert wird. Zur Markierung des Amplifikationsproduktes
können
die markierten Komponenten bereits zu Beginn im Reaktionsgemisch
vorhanden sein oder während
eines späteren
Amplifikationszyklus zugesetzt werden. Ein unmarkiertes sequenzspezifisches
Oligonucleotid, das mit der amplifizierten Nucleinsäuresequenz
hybridisieren kann, wenn die Sequenzveränderung(en) (natürlich entstanden oder
durch Mutation induziert) vorhanden ist/sind, wird danach unter
den vorstehend beschriebenen Vorhybridisierungsbedingungen auf die
Membran aufgetropft (daran fixiert). Dann wird die amplifizierte
Probe unter den vorstehend beschriebenen Hybridisierungsbedingungen
auf die vorbehandelte Membran gegeben. Zum Schluß werden Nachweismittel verwendet,
um zu bestimmen, ob eine Hybridisierung zwischen der amplifizierten
Sequenz in der Nucleinsäureprobe
und dem an die Membran gebundenen Oligonucleotid erfolgt ist. Eine Hybridisierung
findet nur statt, wenn die membrangebundene, die Sequenzveränderung
enthaltende Sequenz im Amplifikationsprodukt vorhanden ist, d.h.
nur dann, wenn eine Sequenz der Sonde zu einem Bereich der amplifizierten
Sequenz komplementär
ist.
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In
einer weiteren Version des "umgekehrten" Dot-Blot-Formats
wird die Amplifikation wie bei dem vorstehend beschriebenen "vorwärts gerichteten" Dot-Blot-Format ohne
Verwendung einer Markierung durchgeführt. Auf die Membran wird unter
den vorstehend beschriebenen Vorhybridisierungsbedingungen eine
markierte sequenzspezifische Oligonucleotid-Sonde aufgetropft (daran
fixiert), die mit der amplifizierten Nucleinsäure hybridisieren kann, welche
die Sequenzveränderung
enthält,
falls diese vorhanden ist. Danach wird die amplifizierte Probe auf
die vorbehandelte Membran unter den vorstehend beschriebenen Hybridisierungsbedingungen
gegeben. Dann wird das markierte Oligonucleotid oder ein Fragment
davon so von der Membran freigesetzt, daß mit einem Nachweismittel
bestimmt werden kann, ob eine amplifizierte Sequenz in der Probe mit
dem markierten Oligonucleotid hybridisiert hat. Die Freisetzung
kann beispielsweise erfolgen, indem man der Membran ein Restriktionsenzym
zusetzt, das in der Sonde eine Restriktionsstelle erkennt. Das als
Oligomer-Restriktion
bekannte Verfahren ist in dem am 11. Dezember 1985 veröffentlichten
EP-Patent
EP 164,054 genauer
beschrieben.
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Genetische
Krankheiten, die sowohl mit dem "vorwärts gerichteten" als auch dem "umgekehrten" Dot-Blot-Verfahren
nachweisbar sind, umfassen Krankheiten, die durch bestimmte Deletionen,
Insertionen und/oder Substitutionen in beliebigen Basenpaarmutationen
oder beliebigen Polymorphismen in Nucleinsäuren, z.B. in genomischer DNA,
aus einem beliebigen Organismus, hervorgerufen werden. Beispiele
für Krankheiten,
bei denen Basenpaarveränderungen
bekannt sind, umfassen Sichelzellenanämie, Hämoglobin-C-Krankheit, α-Thalassämie, β- Thalassämie und
dergleichen. Andere nachweisbare Krankheiten umfassen Krebserkrankungen,
an denen RAS-Oncogene beteiligt sind, z.B. das n-RAS-Oncogen, und Infektionskrankheiten.
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Ein
Dot-Blot-Verfahren kann auch zur HLA-Typisierung für Gewebetransplantation,
Krankheitsempfänglichkeit
und Vaterschaftsbestimmung verwendet werden. Die HLA-Klasse II-Gene,
die aus den α-und β-Genen aus
den HLA-DR-, HLA-DQ- und HLA-DP-Bereichen bestehen, sind hoch polymorph.
Ihre genetische Komplexität
auf der DNA-Stufe ist signifikant größer als der derzeit durch serologische
Typisierung nachgewiesene Polymorphismus. Das vorliegende Verfahren
kann weiterhin zum Nachweis der vier DNA-Sequenzen verwendet werden,
die die HLA-Klasse II-β-Proteine
codieren (z.B. DRβ),
welche im Zusammenhang mit dem insulinabhängigen Diabetes mellitus (IDDM)
stehen. Kurz zusammengefaßt,
werden die vier im Zusammenhang mit IDDM stehenden DNA-Sequenzen
ausgewählt
aus:
- 1) 5'-GAGCTGCGTAAGTCTCAG-3',
- 2) 5'-GAGGAGTTCCTGCGCTTC-3',
- 3) 5'-CCTGTCGCCGATCCTGG-3', und
- 4) 5' -GACATCCTGGAAGAGGAGAA-3' ,
oder
den dazu komplementären
DNA-Strängen.
Es können
sequenzspezifische Sonden hergestellt werden, die mit einer oder
mehreren dieser Sequenzen hybridisieren.
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In
klinischen Proben können
verschiedene Infektionskrankheiten aufgrund der Gegenwart spezifischer DNA-Sequenzen
diagnostiziert werden, die für
den verursachenden Mikroorganismus charakteristisch sind. Die Mikroorganismen
umfassen Bakterien, wie z.B. Salmonella, Chlamydia und Neisseria;
Viren, wie z.B. die Hepatitis-Viren, und Parasiten, wie z.B. das
für Malaria
verantwortliche Plasmodium. Das am 13. Mai 1986 auf Falkow et al.
ausgestellte US-Patent-Reexamination-Certificate
B14,358,535 beschreibt die Verwendung spezifischer DNA-Hybridisierungssonden
zur Diagnose von Infektionskrankeiten. In der klinischen Probe eines
infizierten Patienten ist vielleicht nur eine relativ kleine Zahl
pathogener Organismen vorhanden und die aus diesen Organismen extrahierte
DNA bildet vielleicht nur eine sehr kleine Fraktion der Gesamt-DNA
in dieser Probe. Eine spezifische Amplifikation der verdächtigen
Sequenzen vor Immobilisierung und Hybridisierungsnachweis der DNA-Proben
könnte
die Empfindlichkeit und Spezifität
der üblichen
Verfahren stark verbessern.
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Eine
klinische Routineverwendung von DNA-Sonden zur Diagnose von Infektionskrankheiten
würde beträchtlich
vereinfacht, wenn nicht-radioaktiv markierte Sonden eingesetzt werden
können,
wie von Ward in
EP 63,879 beschrieben.
Bei diesem Verfahren werden Biotin enthaltende DNA-Sonden durch
farbstoffbildende Enzyme nachgewiesen, die an Avidin oder biotinspezifische
Antikörper
gebunden sind. Dieser Nachweistyp ist einfach, aber relativ unempfindlich.
Die Kombination einer spezifischen DNA-Amplifikation durch das vorliegende
Verfahren mit der Verwendung stabil markierter Sonden könnte zweckmäßig sein
und die erforderliche Empfindlichkeit schaffen, damit sich die Verfahren
von Falkow und Ward als klinische Routineverfahren verwenden lassen.
-
Eine
spezifische Verwendung der Amplifikationstechnik zum Nachweis oder
zur Kontrolle des AIDS-Virus ist wie folgt beschrieben. Im Amplifikations-
und Nachweisverfahren werden Primer und Sonden verwendet, die zur
Amplifikation bzw. zum Nachweis von im wesentlichen konservierten
Nucleinsäuresequenzen
in Nucleinsäuren
von AIDS-Viren entworfen wurden, und die für Nucleinsäuren in AIDS-Viren spezifisch sind.
Die nachzuweisende Sequenz muß daher
zu den Nucleinsäuren
in AIDS-Viren ausreichend komplementär sein, damit in Gegenwart
des Enzyms und der Nucleosidtriphosphate eine Polymerisation vorzugsweise
bei Raumtemperatur initiiert wird.
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Die
Sonde kann außerdem
biotinyliert sein, wobei das Biotin an einen Spacer-Arm der Formel:
angeheftet ist, wobei Y O,
NH oder N-CHO darstellt, x eine Zahl von 1 bis 4 ist und y eine
Zahl von 2 bis 4 ist. Der Spacer-Arm ist seinerseits an einen Psoralen-Teil der Formel:
gebunden. Der Psoralen-Teil
interkaliert in eine Sonde mit einer "lückenhaften
Ring"-Struktur und
vernetzt diese, wie von Courage-Tebbe et al., Biochim. Biophys.
Acta, 697 (1982), 1–5,
beschrieben, wobei der einzelsträngige
Hybridisierungsbereich des lückenhaften
Rings den in den Primern enthaltenen Bereich umfaßt. Details
dieses Biotinylierungs- und Dot-Blot-Verfahrens sind in den US-Patenten
4,582,789, veröffentlicht
am 15. April 1986, und 4,617,261, veröffentlicht am 14. Oktober 1986,
beide vom gleichen Rechtsnachfolger, ausführlicher beschrieben.
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Das
Amplifikationsverfahren kann außerdem
zur Herstellung ausreichender DNA-Mengen aus einem als Einzelkopie
vorkommenden menschlichen Gen verwendet werden, so daß ein Nachweis
durch eine einfache unspezifische DNA-Anfärbung,
wie z.B. Ethidiumbromid, zur direkten DNA-Diagnose erfolgen kann.
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Das
Amplifikationsverfahren kann nicht nur zum Nachweis von Infektionskrankheiten
und pathologischen Abnormitäten
im Genom von Organismen sondern auch zum Nachweis von DNA-Polymorphismen
verwendet werden, die nicht mit pathologischen Zuständen im
Zusammenhang stehen.
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Zusammengefaßt ist das
Amplifikationsverfahren ein Verfahren zur Amplifikation einer oder
mehrerer spezifischer Nucleinsäuresequenzen
unter Verwendung einer Kettenreaktion und eines thermostabilen Enzyms,
wobei in dieser Reaktion Primer-Verlängerungsprodukte hergestellt
werden, die anschließend
als Matrizen für
weitere Primerverlängerungsreaktionen
dienen. Das Verfahren läßt sich
insbesondere zum Nachweis von Nucleinsäuresequenzen verwenden, die
anfangs nur in sehr kleinen Mengen vorhanden sind.
-
Die
folgenden Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung und sollen
den Schutzumfang der beanspruchten Erfindung in keinster Weise beschränken. Soweit
nicht anders angegeben, sind in den Beispielen alle Prozentangaben
auf das Gewicht bezogen, sofern es sich um Feststoffe handelt, und
auf das Volumen, sofern es sich um Flüssigkeiten handelt, und alle
Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.
-
BEISPIEL I
-
I. Synthese der Primer
-
Die
folgenden zwei Oligonucleotid-Primer wurden mit Hilfe des nachstehend
beschriebenen Verfahrens hergestellt:
5'-ACACAACTGTGTTCAGTAGC-3' (PC03)
5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3' (PC034)
-
Diese
Primer, beides 20-mere, hybridisieren an entgegengesetzte Stränge der
genomischen DNA, wobei ihre 5'-Enden
einen Abstand von 110 Basenpaaren haben.
- A.
Automatisiertes Syntheseverfahren: Die nach Beaucage und Caruthers
(Tetrahedron Letters, 22 (1981), 1859–1862) synthetisierten Diethylphosphoramidite
wurden nacheinander an einem Glasträger mit kontrolliertem Porendurchmesser
kondensiert, der mit einem Nucleosid derivatisiert ist. Das Verfahren
umfaßte
die Abspaltung der Tritylgruppe mit Trichloressigsäure in Dichlormethan,
Kondensation unter Verwendung von Benzotriazol als aktivierendem
Protonendonor sowie Blockierung (capping) mit Acetanhydrid und Dimethylaminopyridin
in Tetrahydrofuran und Pyridin. Die Zeit für einen Zyklus betrug etwa
30 Minuten. Die Ausbeuten bei jedem Schritt waren im Prinzip quantitativ
und wurden bestimmt, indem der während
der Detritylierung freigesetzte Dimethoxytritylalkohol gesammelt
und spektroskopisch untersucht wurde.
- B. Verfahren zur Schutzgruppenentfernung und Aufreinigung der
Oligodesoxyribonucleotide: Der feste Träger wurde aus der Säule entfernt
und 1 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid vier Stunden bei Raumtemperatur
in einem geschlossenen Röhrchen
ausgesetzt. Der Träger
wurde danach mittels Filtration entfernt und die die teilweise geschützten Oligonucleotide
enthaltende Lösung
wurde fünf
Stunden bei 55°C
gehalten. Ammoniak wurde entfernt und der Rückstand wurde auf ein präparatives
Polyacrylamid-Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde 90 Minuten
bei 30 Volt/cm durchgeführt.
Danach wurde die das Produkt enthaltende Bande mittels UV-Bestrahlung
einer fluoreszierenden Platte nachgewiesen. Die Bande wurde ausgeschnitten
und mit 1 ml destilliertem Wasser über Nacht bei 4°C eluiert.
Die resultierende Lösung
wurde auf eine Umkehrphasen-HPLC-Säule aufgetragen und mit einem
7–13%-igen
Acetonitrilgradienten in 1 %-igem Ammoniumacetat-Puffer bei einem
pH-Wert von 6,0 eluiert. Die Elution wurde durch UV-Extinktion bei
260 nm überwacht.
Die geeignete Fraktion wurde gesammelt, durch UV-Extinktion in einem
bestimmten Volumen quantitativ ausgewertet und in einer Vakuumzentrifuge
bei Raumtemperatur zur Trockene eingedampft.
- C. Charakterisierung der Oligodesoxyribonucleotide: Zur Untersuchung
wurden Aliquots der gereinigten Oligonucleotide mit Polynucleotidkinase
und γ-32P-ATP 32P-markiert. Die markierten Verbindungen
wurden mittels Autoradiographie 14–20%-iger Polyacrylamid-Gele
nach 45-minütiger
Elektrophorese bei 50 Volt/cm untersucht. Durch dieses Verfahren
wird das Molekulargewicht überprüft. Die
Basenzusammensetzung wurde bestimmt, indem die Oligodesoxyribonucleotide
unter Verwendung von Gift-Diesterase und bakterieller Alkalischer
Phosphatase zu Nucleosiden gespalten wurden. Anschließend wurden
die erhaltenen Nucleoside unter Verwendung einer Umkehrphasen-HPLC-Säule und
einer mobilen Phase aus 10% Acetonitril und 1% Ammoniumacetat aufgetrennt
und quantitativ bestimmt.
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II. Isolierung menschlicher
genomischer DNA aus einer Zellinie
-
Aus
der T-Zellinie Molt 4, die für
das normale β-Globin-Gen
homozygot ist und aus Human Genetic Mutant Cell Depository, Camden,
NJ, unter der Nummer GM2219C erhältlich
ist, wurde hochmolekulare genomische DNA isoliert, wobei im wesentlichen
das Verfahren von Maniatis et al., vorstehend, S. 280–281, verwendet
wurde.
-
III. Aufreinigung einer
Polymerase aus Thermus aquaticus
-
Der
Thermus aquaticus-Stamm YT1, der von der American Type Culture Collection,
12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, unter der Nummer ATCC 25,104
uneingeschränkt
erhältlich
ist, wurde in Flaschen in folgendem Medium gezüchtet:
Natriumcitrat | 1
mM |
Kaliumphosphat,
pH 7,9 | 5
mM |
Ammoniumchlorid | 10
mM |
Magnesiumsulfat | 0,2
mM |
Calciumchlorid | 0,1
mM |
Natriumchlorid | 1
g/l |
Hefeextrakt | 1
g/l |
Trypton | 1
g/l |
Glucose | 2
g/l |
Eisensulfat | 0,01
mM |
(Der pH-Wert wurde vor dem Autoklavieren auf 8,0
eingestellt.)
-
Ein
10 I-Fermentor wurde mit einer Anzuchtkultur beimpft, die im vorstehenden
Medium über
Nacht bei 70°C
gezüchtet
worden war. Aus der Anzuchtflasche wurde ein Volumen von insgesamt
600 ml zur Beimpfung von 10 l des gleichen Medium verwendet. Der
pH-Wert wurde mittels Ammoniumhydroxid, 40% gelöstem Sauerstoff, einer Temperatur
von 70°C
und einer Rührgeschwindigkeit
von 400 UpM bei 8,0 gehalten.
-
Nach
der Zellzüchtung
wurden die Zellen gereinigt, wobei in den ersten fünf Schritten
die Vorgehensweise von Kaledin et al., vorstehend, (mit geringfügigen Modifikationen)
und im sechsten Schritt eine unterschiedliche Vorgehensweise angewendet
wurden. Alle sechs Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Die Fraktionierungsrate
an Säulen
betrug 0,5 Säulen/Stunde,
die Gradientenvolumen während
der Elution betrugen 10 Säulenvolumen.
Ein alternatives und bevorzugtes Aufreinigungsprotokoll wird nachstehend
in Beispiel VI bereitgestellt.
-
Kurz
zusammengefaßt,
wurde die vorstehende Kultur der T. aguaticus-Zellen nach neun Stunden Züchtung in
der späten
logarithmischen Phase bei einer Zelldichte von 1,4 g Trockengewicht/l
durch Zentrifugation geerntet. Zwanzig Gramm Zellen wurden in 80
ml Puffer resuspendiert, der aus 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5 und 0,1
mM EDTA bestand. Die Zellen wurden lysiert und das Lysat wurde zwei
Stunden bei 35 000 UpM bei 4°C
in einem Rotor zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt (Fraktion
A). Die Proteinfraktion, die mit Ammoniumsulfat in Sättigungskonzentrationen
von 45% bis 75% präzipitiert
worden war, wurde in einem Puffer gelöst, der aus 0,2 M Kaliumphosphat-Puffer,
pH-Wert 6,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 5% Glycerin bestand, und
zum Schluß gegen
den gleichen Puffer dialysiert, wobei Fraktion B erhalten wurde.
-
Fraktion
B wurde auf eine 2,2 × 30
cm große
DEAE-Cellulose-Säule
aufgetragen, die mit dem vorstehend beschriebenen Puffer äquilibriert
worden war. Die Säule
wurde dann mit dem gleichen Puffer gewaschen und es wurden Fraktionen
gesammelt, die das Protein enthielten (durch Extinktion bei 280
nm bestimmt). Die vereinigte Proteinfraktion wurden gegen einen
zweiten Puffer dialysiert, der 0,01 M Kaliumphosphat-Puffer, pH-Wert
7,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol
und 5% Glycerin enthielt, wobei Fraktion C erhalten wurde.
-
Fraktion
C wurde auf eine 2,6 × 21
cm große
Hydroxyapatit-Säule
aufgetragen, die mit dem zweiten Puffer äquilibriert worden war. Die
Säule wurde
dann gewaschen und das Enzym mit einem linearen Kaliumphosphat-Puffergradienten
in Konzentrationen von 0,01–0,5
M, pH-Wert 7,5, eluiert, der 10 mM 2-Mercaptoethanol und 5% Glycerin
enthielt. Fraktionen, die DNA-Polymerase-Aktivität besaßen (90 – 180 mM
Kaliumphosphat), wurden vereinigt, unter Verwendung einer Amicon-Rührzelle
und einer YM10-Membran vierfach konzentriert und gegen den zweiten
Puffer dialysiert, wobei Fraktion D erhalten wurde.
-
Fraktion
D wurde auf eine 1,6 × 28
cm große
DEAE-Cellulose-Säule
aufgetragen, die vorher mit dem zweiten Puffer äquilibriert worden war. Die
Säule wurde
gewaschen und die Polymerase mit einem linearen Kaliumphosphatgradienten
in Konzentrationen von 0,01 – 0,5
M im zweiten Puffer eluiert. Die Fraktionen wurden auf Endonuclease-
und Exonuclease-Verunreinigung(en)
hin untersucht, indem nach Inkubation mit einem Überschuß an DNA-Polymerase (für Endonucleasen)
und nach Behandlung mit einem Restriktionsenzym, das die DNA in
mehrere Fragmente spaltet (für
Exonucleasen), Molekulargewichtsveränderungen von DNA des Phagen λ elektrophoretisch
nachgewiesen wurden. Nur die DNA-Polymerase-Fraktionen (65 – 95 mM
Kaliumphosphat) wurden vereinigt, die eine geringfügige Nuclease-Verunreinigung besaßen. Den
vereinigten Fraktionen wurde autoklavierte Gelatine in einer Menge
von 250 μg/ml
zugesetzt und eine Dialyse gegen den zweiten Puffer durchgeführt, wobei
Fraktion E erhalten wurde.
-
Fraktion
E wurde auf eine Phosphocellulose-Säule aufgetragen und mit einem
100 ml-Gradienten eluiert (0,01 – 0,4 M KCl-Gradient in 20
mM Kaliumphosphatpufter, pH 7,5). Die Fraktionen wurden wie vorstehend
beschrieben auf Endonuclease- und Exonuclease-Verunreinigung(en)
hin untersucht, ebenso wie auf Polymerase-Aktivität hin (mit
Hilfe des Verfahrens von Kaledin et al.) und dann vereinigt. Die
vereinigten Fraktionen wurden gegen den zweiten Puffer dialysiert
und dann durch Dialyse gegen 50%-iges Glycerin und den zweiten Puffer
konzentriert.
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Mittels
SDS-PAGE wurde das Molekulargewicht der Polymerase bestimmt. Als
Markerproteine dienten Phosphorylase B (92 500), Rinder-Serumalbumin
(66 200), Ovalbumin (45 000), Kohlensäureanhydrase (31 000), Sojabohnen-Trypsininhibitor
(21 500) und Lysozym (14 400).
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Vorläufige Daten
weisen darauf hin, daß die
Polymerase ein Molekulargewicht von etwa 86 000 – 90 000 Dalton besitzt, nicht
62 000 – 63
000 Dalton, wie in der Literatur berichtet (z.B. von Kaledin et
al.).
-
Die
Polymerase wurde in 50 μl
eines Gemisches inkubiert, enthaltend 25 mM Tris-HCl, pH-Wert 6,4 und
pH-Wert 8,0, 0,1 M KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM
2-Mercaptoethanol,
jeweils 10 nmol dGTP, dATP und TTP, 0,5 μCi (3H)-dCTP,
8 μg "aktivierte" Kalbsthymus-DNA
und 0,5 – 5
Einheiten Polymerase. "Aktivierte" DNA ist ein natives
DNA-Präparat,
das mit DNase I teilweise hydrolysiert wird, bis 5% DNA in eine
säurelösliche Fraktion überführt sind.
Die Umsetzung wurde 30 Minuten bei 70°C durchgeführt und durch Zugabe von 50 μl gesättigter
wäßriger Natriumpyrophosphat-Lösung, enthaltend
0,125 M EDTA-Na2, beendet. Die weitere Behandlung
der Proben und die Aktivitätsbestimmung
wurden durchgeführt,
wie von Kaledin et al., vorstehend, beschrieben.
-
Die
Ergebnisse zeigten, daß die
Polymerase bei einem pH-Wert von 6,4 etwas mehr als die Hälfte der Aktivität besitzt,
die bei einem pH-Wert von 8,0 gefunden wird. Im Gegensatz dazu stellten
Kaledin et al. fest, daß das
von ihnen beschriebene Enzym bei einem pH-Wert von etwa 7,0 8% der
Aktivität
besitzt, die bei einem pH-Wert von 8,3 gefunden wird. Das pH-Profil
des vorliegenden thermostabilen Enzyms ist daher breiter als das
pH-Profil des Enzyms von Kaledin et al.
-
Bei
Verwendung des vorliegenden Enzyms wurde schließlich, wenn überhaupt,
nur eine geringe Aktivität
festgestellt, wenn ein oder mehr Nucleosidtriphosphat(e) aus dem
untersuchten DNA-Polymerase-Reaktionsgemisch
entfernt wurden. Die Aktivität
stimmte mit dem erwarteten Wert überein
und zeigte, daß das
Enzym mit großer
Genauigkeit funktioniert. Im Gegensatz dazu stimmt die bei dem Enzym
von Kaledin et al. (vorstehend) beobachtete Aktivität nicht
mit dem erwarteten Wert überein,
was auf einen falschen Einbau der Nucleosidtriphosphat(e) hinweist.
-
IV. Amplifikationsreaktion
-
Ein
Mikrogramm der vorstehend beschriebenen genomischen DNA wurde in
einem wäßrigen Reaktionsgemisch
mit einem Anfangsvolumen von 100 μl
gelöst,
das 25 mM Tris-HCl μl
Puffer (pH 8,0), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2,
5 mM Dithiothreitol, 200 μg/ml
Gelatine, 1 μM
Primer PCO3, 1 μM
Primer PCO4, 1,5 mM dATP, 1,5 mM dCTP, 1,5 mM dGTP und 1,5 mM TTP
enthielt. Zur Denaturierung der genomischen DNA wurde die Probe
10 Minuten auf 98°C
erhitzt und danach auf Raumtemperatur abgekühlt. Vier Mikroliter Thermus
aguaticus-Polymerase wurden dem Umsetzungsgemisch zugesetzt und
dieses dann mit 100 μl
Mineralöl überschichtet.
Die Probe wurde dann in den Aluminiumheizblock des vorstehend beschriebenen,
mit einem Flüssigkeitstransport-
und Heizsystem ausgestatteten Gerätes gegeben, wobei programmierte
Pipetten zur Flüssigkeitsabfüllung und
eine Temperaturkontroll-Vorrichtung zur Erzielung der Temperaturveränderungen
verwendet wurden.
-
Die
DNA-Probe wurde in diesem Apparat 20 Amplifikationszyklen unterzogen,
wobei der folgende programmierte Zyklus wiederholt wurde:
- 1) Erhitzen von 37°C auf 98°C im Heizblock über eine
Zeitspanne von 2,5 Minuten; und
- 2) Abkühlen
von 98°C
auf 37°C über eine
Zeitspanne von drei Minuten zur Hybridisierung der Primer mit der
DNA.
-
Nach
dem letzten Zyklus wurde die Probe zur Beendigung der letzten Verlängerungsreaktion
weitere 10 Minuten bei 55°C
inkubiert.
-
V. Synthese und Phosphorylierung
der Oligodesoxyribonucleotid-Sonden
-
Es
wurde eine als RS24 bezeichnete markierte DNA-Sonde der folgenden
Sequenz hergestellt:
5'-*CCGACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGTCAG-3' (RS24)
wobei
* die Markierung zeigt. Die Sonde hat eine Länge von 40 Basen, enthält das vierte
bis siebzehnte Codon des Gens und ist zu dem normalen β-Globin-Allels (βA)
komplementär.
Eine schematische Darstellung der Primer und der Sonden ist nachstehend
gezeigt:
-
-
Die
Sonde wurde nach den Verfahren synthetisiert, die in Teil I von
Beispiel I beschrieben sind. Die Sonde wurde markiert, indem 20
pmol Sonde mit 4 Einheiten T4-Polynucleotidkinase und etwa 40 pmol γ-32P-ATP (etwa 7000 Ci/mmol) in 40 μl Reaktionsgemisch,
enthaltend 70 mM Tris-Puffer (pH 7,6), 10 mM MgCl2,
1,5 mM Spermin und 10 mM Dithiothreitol, 60 Minuten bei 37°C in Kontakt
gebracht wurden. Das Gesamtvolumen wurde mit 25 mM EDTA auf ein
Volumen von 100 μl
eingestellt. Nach dem Verfahren von Maniatis et al., vorstehend,
S. 466–467,
erfolgte eine Reinigung mit einer 1 ml Dialyse-Säule zum Zentrifugieren, die
mit Tris-EDTA (TE)-Puffer (10 mM Tris-Puffer, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) äquilibriert
worden war. Nach Präzipitation
des Produkts mit TCA betrug die spezifische Aktivität von RS24
4,3 μCi/pmol
und dessen Endkonzentration 0,118 pmol/μl.
-
VI. Dot-Blot-Hybridisierungen
-
Vier
Mikroliter der amplifizierten Probe aus Abschnitt IV und 5,6 μl geeignete
Verdünnungen
einer das β-Globin-Gen
enthaltenden Plasmid-DNA, wobei deren Konzentrationen so berechnet
waren, daß Amplifikationseftizienzen
von 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% und 100% angenommen wurden, wurden
mit 200 μl
0,4 N NaOH, 25 mM EDTA verdünnt
und auf einen Nylonfilter aufgetropft. Dazu wurde der Filter zuerst
mit Wasser befeuchtet und dann in einen Apparat zur Dot-Blot-Herstellung
gegeben, in dem die Filter gehaltert waren, die Proben wurden aufgetragen
und jede Vertiefung wurde gründlich
mit 0,1 ml 20 × SSPE
(3,6 M NaCl, 200 mM NaH2PO4,
20 mM EDTA) gespült,
wie von Reed und Mann, Nucleic Acids Research, 13 (1985), 7202–7221, offenbart.
Danach wurden die Filter entfernt, in 20 × SSPE gespült und 30 Minuten bei 80°C in einem
Vakuumofen mit Hitze behandelt.
-
Nach
dieser Hitzebehandlung wurde jeder Filter mit 16 ml Hybridisierungslösung in
Kontakt gebracht, die aus 3 × SSPE,
5 × DenhardtLösung (1 × = 0,02%
Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Ficoll, 0,02% Rinder-Serumalbumin, 0,2 mM Tris, 0,2 mM EDTA,
pH 8,0), 0,5% SDS und 30% Formamid bestand, und zwei Stunden bei 42°C inkubiert.
Danach wurden 2 pmol RS24-Sonde der Hybridisierungslösung zugesetzt
und der Filter wurde zwei Minuten bei 42°C inkubiert.
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Zum
Schluß wurde
jeder hybridisierte Filter zweimal mit 100 ml 2 × SSPE und 0,1 % SDS 10 Minuten bei
Raumtemperatur gewaschen. Dann wurden die Filter einmal 10 Minuten
bei 60°C
mit 100 ml 2 × SSPE, 0,1%
SDS behandelt.
-
Jeder
Filter wurde danach einer Autoradiographie unterzogen, wobei das
Signal nach zwei Stunden gut sichtbar war.
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VII. Autoradiogramm-Auswertung
-
Das
Autoradiogramm der Dot-Blot-Verfahren wurde nach zwei Stunden analysiert
und wie von Saiki et al., Science, vorstehend, beschrieben, im Hinblick
auf die Intensität
mit einer Standard-Verdünnungsreihe verglichen,
die das β-Globin-Gen enthielt,
das aus Fragmenten einer HaeIII/MaeI-Spaltung von pBR: βA wieder zusammengefügt worden
war, wobei βA das Wildtyp-Allel darstellt. Eine Analyse
des Umsetzungsproduktes ergab, daß die Amplifikationseffizienz
insgesamt etwa 95% betrug, was einer 630 000 fachen Zunahme der β-Globin-Zielsequenz entspricht.
-
BEISPIEL II
-
I. Amplifikationsreaktion
-
Zwei
1 μg genomische
DNA-Proben, die aus der Zellinie Molt 4 wie in Beispiel I beschrieben
extrahiert worden waren, wurden in 100 μl Reaktionsgemisch verdünnt, das
50 mM KCl, 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 10 mM MgCl2,
1 μM PCO3-Primer,
1 μM PCO4-Primer,
200 μg/ml
Gelatine, 10% Dimethylsulfoxid (bezogen auf das Volumen) sowie jeweils
1,5 mM dATP, dCTP, dGTP und TTP enthielt. Nachdem das Gemisch zur
Denaturierung der genomischen DNA 10 Minuten auf 98°C erhitzt
worden war, wurden die Proben auf Raumtemperatur abgekühlt und
4 μl der
in Beispiel I beschriebenen Thermus aguaticus-Polymerase wurden jeder Probe zugesetzt.
Die Proben wurden zur Verhinderung von Kondensation und Verdunstungsverlusten
mit Mineralöl überschichtet.
-
Eine
Probe wurde in den Heizblock des in Beispiel I beschriebenen Gerätes gegeben
und 25 Amplifikationszyklen unterworfen, wobei der folgende programmierte
Zyklus wiederholt wurde:
- (1) Erhitzen von 37°C auf 93°C über eine
Zeitdauer von 2,5 Minuten;
- (2) Abkühlen
von 93°C
auf 37°C über eine
Zeitdauer von drei Minuten zur Hybridisierung der Primer mit der DNA;
und
- (3) Beibehalten der Temperatur von 37°C über zwei Minuten.
-
Nach
dem letzten Zyklus wurde die Probe zur Beendigung der letzten Verlängerungsumsetzung
weitere 10 Minuten bei 60°C
inkubiert.
-
Die
zweite Probe wurde in den wärmeleitenden
Behälter
eines Gerätes
mit zyklischer Temperaturveränderung
(Erhitzen und Abkühlen)
gegeben. In diesem Gerät
ist der wärmeleitende
Behälter
an Peltier-Wärmepumpen,
die die Temperaturen erhöhen
oder senken, und eine Mikroprozessor-Steuereinheit angeschlossen,
wodurch die Reihenfolge der Amplifikationsschritte, die Temperaturwerte,
die Temperaturanstiege und die Zeitdauer der einzelnen Temperaturschritte
kontrolliert werden.
-
Die
zweite Probe wurde 25 Amplifikationszyklen unterworfen, wobei der
folgende programmierte Zyklus wiederholt wurde:
- (1)
Erhitzen von 37°C
auf 95°C über eine
Zeitdauer von drei Minuten;
- (2) Beibehalten der Temperatur von 95°C über 0,5 Minuten zur Denaturierung;
- (3) Einminütiges
Abkühlen
von 95°C
auf 37°C;
und
- (4) Beibehalten der Temperatur von 37°C über eine Minute.
-
II. Analyse
-
Zur
Analyse wurden zwei Tests, ein Dot-Blot und eine Agarose-Gelanalyse,
durchgeführt.
-
Zur
Dot-Blot-Analyse wurde eine als RS18 bezeichnete markierte Sonde
der folgenden Sequenz hergestellt
5'-*CTCCTGAGGAGAAGTCTGC-3' (RS18)
wobei
* die Markierung zeigt. Die Sonde ist 19 Basen lang, enthält das vierte
bis siebzehnte Codon des Gens und ist zum normalen β-Globin-Allels
(βA) komplementär. Die schematische Darstellung
von Primern und Sonden ist nachstehend gezeigt:
-
-
Die
Sonde wurde nach den Verfahren synthetisiert, die in Abschnitt I
von Beispiel I beschrieben sind. Die Sonde wurde markiert, indem
10 pmol davon mit 4 Einheiten T4-Polynucleotidkinase und etwa 40
pmol γ-32P-ATP (etwa 7000 Ci/mmol) in 40 μl Umsetzungsgemisch,
enthaltend 70 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), 10 mM MgCl2,
1,5 mM Spermin und 10 mM Dithiothreitol, 60 Minuten bei 37°C in Kontakt
gebracht wurden. Das Gesamtvolumen wurde dann mit 25 mM EDTA auf
ein Volumen von 100 μl
eingestellt und einer Reinigung gemäß dem Verfahren von Maniatis
et al., vorstehend, S. 466–467,
mit einer 1 ml Dialyse-Säule zum
Zentrifugieren unterworfen, die mit Tris-EDTA (TE)-Puffer (10 mM
Tris-HCl-Puffer,
0,1 mM EDTA, pH 8,0) äquilibriert
worden war. Eine Präzipitation
des Produkts mit TCA ergab, daß die
spezifische Aktivität
von RS18 4,6 μCi/pmol und
dessen Endkonzentration 0,114 pmol/μl betrug.
-
Fünf Mikroliter
der amplifizierten Probe aus Abschnitt I sowie einer Probe, die
wie vorstehend beschrieben amplifiziert worden war, wobei allerdings
statt des thermostabilen Enzyms das Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase
I verwendet worden war, wurden mit 195 μl 0,4 NaOH, 25 mM EDTA verdünnt und
jeweils auf zwei Duplikat-Nylonfilter aufgetropft. Dazu wurden die
Filter zuerst mit Wasser befeuchtet und dann in einen Apparat zur
Dot-Blot-Herstellung gegeben, in dem die Filter gehaltert sind.
Die Proben wurden aufgetragen und jede Vertiefung wurde gründlich mit
0,4 ml 20 × SSPE
(3,6 M NaCl, 200 mM NaH2PO4,
20 mM EDTA) gespült,
wie von Reed und Mann, vorstehend, offenbart: Danach wurden die
Filter entfernt, in 20 × SSPE gespült und 30
Minuten bei 80°C
in einem Vakuumofen mit Hitze behandelt.
-
Nach
der Hitzebehandlung wurde jeder Filter mit 6 ml Hybridisierungslösung in
Kontakt gebracht, die aus 5 × SSPE,
5 × Denhardt-Lösung (1 × = 0,02%
Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Ficoll, 0,02% Rinder-Serumalbumin, 0,2
mM Tris, 0,2 mM EDTA, pH 8,0) und 0,5% SDS bestand, und 60 Minuten
bei 55°C
inkubiert. Danach wurden der Hybridisierungslösung 5 μl RS18-Sonde zugesetzt und der
Filter wurde 60 Minuten bei 55°C
inkubiert.
-
Zum
Schluß wurde
jeder hybridisierte Filter zweimal mit 100 ml 2 × SSPE und 0,1% SDS 10 Minuten bei
Raumtemperatur gewaschen. Dann wurden die Filter noch zweimal mit
100 ml 5 × SSPE,
0,1 % SDS bei 60°C
behandelt, und zwar 1) eine Minute lang und 2) drei Minuten lang.
-
Jeder
Filter wurde danach einer Autoradiographie unterzogen, wobei das
Signal nach 90 Minuten gut sichtbar war.
-
Bei
der Agarose-Gelanalyse wurden 5 μl
jeder Amplifikationsumsetzung auf ein 4%-iges NuSieve/0,5%-iges
Agarosegel in 1 × TBE-Puffer
(0,089 M Tris, 0,089 M Borsäure
und 2 mM EDTA) aufgetragen. Die Elektrophorese wurde 60 Minuten
bei 100 V durchgeführt.
Nach Anfärben
mit Ethidiumbromid wurde die DNA mittels UV-Fluoreszenz sichtbar
gemacht.
-
Die
Ergebnisse zeigten, daß die
in Beispiel I und in diesem Beispiel verwendeten Geräte in der DNA-Amplifikation
gleichermaßen
wirksam waren, wobei sowohl diskrete, deutlich ausgeprägte und
der gewünschten
Sequenz entsprechende 110 bp große Banden gleich hoher Intensität als auch
einige andere diskrete Banden sehr viel geringerer Intensität produziert
wurden. Das Amplifikationsverfahren, das unter Verwendung des Klenow-Fragments
der E. coli-Polymerase I eine Reagenzienüberführung nach jedem Zyklus umfaßte, zeigte
im Gegensatz dazu einen DNA-Schmiereffekt, der sich aus der unspezifischen
Amplifikation vieler nicht verwandter DNA-Sequenzen ergab.
-
Es
ist zu erwarten, daß ähnliche
Verbesserungen in Amplifikation und Nachweis bei der Auswertung der
HLA-DQ-, DR- und DP-Bereiche erreicht werden können.
-
Eine
bessere Spezifität
und Effizienz der Amplifikation kann erreicht werden, wenn der Amplifikations-Reaktionspuffer
in den vorstehenden Experimenten 2 mM MgCl2 statt
10 mM MgCl2 und jeweils 150 – 200 μM der einzelnen
Nucleotide statt jeweils 1,5 mM enthält und wenn außerdem die
Temperatur während
der Amplifikation von 37°C
auf 45°C-58°C angehoben
wird. Es wurde auch festgestellt, daß DMSO zur Amplifikation weder
notwendig noch bevorzugt ist.
-
BEISPIEL III
-
Amplifikation und Clonierung
-
Zur
Amplifikation eines 119 Basenpaar-Fragments auf dem menschlichen β-Globin-Gen wurde
jeweils insgesamt 1 Mikrogramm menschliche genomische DNA, die aus
der Zellinie Molt 4 oder aus der Zellinie GM2064 (die eine homozygote
Deletion des β-
und δ-Hämoglobin-Bereichs
enthält
und von Human Genetic Mutant Depository, Camden, NJ, erhältlich ist)
isoliert worden war, wie vorstehend beschrieben in 100 μl Reaktionsgemisch
amplifiziert, das 50 mM KCl, 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 10 mM
MgCl2, 200 μg/ml Gelatine, 5 mM 2-Mercaptoethanol,
jeweils 1,5 mM dATP, dCTP, TTP und dGTP sowie jeweils 1 μM der folgenden
Primer enthielt:
5'-CTTCTGcagCAACTGTGTTCACTAGC-3' (GH18)
5'-CACaAgCTTCATCCACGTTCACC-3' (GH19)
wobei
Kleinbuchstaben Abweichungen von der Wildtyp-Sequenz bedeuten, wodurch
Restriktionsenzymstellen erzeugt wurden. GH18 ist ein Oligonucleotid
mit 26 Basen, das zum negativen Strang komplementär ist und eine
interne PstI-Restriktionsstelle
enthält.
GH19 ist ein Oligonucleotid mit 29 Basen, das zum Plus-Strang komplementär ist und
eine interne HindIII-Erkennungssequenz enthält. Die Primer wurden ausgewählt, indem zuerst
die Genbereiche auf Homolgie zu PstI- und HindIII-Restriktionsstellen
hin untersucht wurden. Die Primer wurden dann wie in Beispiel I
beschrieben hergestellt.
-
Die
vorstehenden Reaktionsgemische wurden 10 Minuten auf 95°C erhitzt
und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Insgesamt 4 μl der in
Beispiel I beschriebenen Polymerase wurden jedem Reaktionsgemisch zugesetzt.
Danach wurde jedes Gemisch mit Mineralöl überschichtet. Die Reaktionsgemische
wurden 30 Amplifikationszyklen mit dem folgenden Programm unterworfen:
2,5
min Temperaturanstieg von 37°C
auf 98°C
3
min Abkühlen
von 98°C
auf 37°C
2
min Warmhalten bei 37°C.
-
Nach
dem letzten Zyklus wurden die Umsetzungsgemische zur Beendigung
der letzten Verlängerung 20
Minuten bei 65°C
inkubiert. Das Mineralöl
wurde mit Chloroform extrahiert und die Gemische bei –20°C aufbewahrt.
-
Insgesamt
10 μl amplifiziertes
Produkt wurden zusammen mit 0,5 μg
des allgemein erhältlichen
Clonierungsvektors M13mp10 90 Minuten bei 37°C in 50 μl Reaktionsgemisch gespalten,
das 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl2,
20 Einheiten PstI und 26 Einheiten HindIII enthielt. Die Umsetzung
wurde durch Einfrieren bei –20°C beendet.
Das Volumen wurde mit TE-Puffer auf 110 μl eingestellt. 100 μl wurden auf
eine 1 ml-BioGel P-4-Dialysesäule
zum Zentrifugieren aufgetragen. Es wurde eine 0,1 ml-Fraktion gesammelt
und mit Ethanol präzipitiert.
(An
dieser Stelle wurde entdeckt, daß in der GM2064-Probe ein Amplifikationsprodukt
des β-Globin-Gens
enthalten war. Durch nachfolgende Experimente wurde festgestellt,
daß die
Primer, entweder GH18 oder GH19, der Ursprung der Verunreinigung
waren. Da keine andere Primer-Quelle verfügbar war, wurde das Experiment in
der Annahme fortgesetzt, daß einige
clonierte Sequenzen aus der DNA-Verunreinigung der Primer stammten.)
-
Das
Ethanolpellet wurde in 15 μl
Wasser resuspendiert und dann auf ein Volumen von 20 μl eingestellt, das
50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 0,5
mM ATP, 10 mM Dithiothreitol und 400 Einheiten Ligase enthielt.
[Eine Einheit ist die Enzymmenge, die man benötigt, um eine 50%-ige Ligierung
von HindIII-gespaltener λ-DNA in 30
Minuten bei 16°C
in einem Volumen von 20 μl
bei einer Endkonzentration der 5'-Enden
von 0,12 mM zu erzielen (etwa 330 μg/ml)]. Dieses Gemisch wurde
drei Stunden bei 16°C
inkubiert.
-
Zehn
Mikroliter des Molt 4-DNA enthaltenden Ligierungsgemisches wurden
in allgemein erhältliche kompetente
Zellen des E. coli-Stamms JM103 transformiert. Bei der Herstellung
des transformierten Stamms wurde nach dem von Messing, J., Third
Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA, (1981),
143-163, Herausgeber A. Walton, Elsevier, Amsterdam, beschriebenen
Verfahren gearbeitet. Insgesamt wurden 651 farblose Plaques erhalten
(und keine blauen Plaques). Davon besaßen 119 eine Insertion des
(+)-Stranges (18%) und 19 hatten eine Insertion des (–)-Stranges
(3%). Dies stellt eine fast 20fache Steigerung gegenüber dem
Anteil von β-Globin-positiven
Plaques innerhalb der Primer-positiven Plaques dar, der mit dem
Amplifikationsverfahren unter Verwendung des Klenow-Fragments der
E. coli-Polymerase I erzielt wurde. Bei diesem Verfahren wurde die
Umsetzung zwei Minuten bei 25°C
durchgeführt
und danach die einzelnen Schritte, d.h. Erhitzen auf 100°C, Abkühlen, Zugabe
des Klenow-Fragments und Reaktion, neunmal wiederholt. Diese Ergebnisse
zeigen die durch Verwendung des vorliegenden thermostabilen Enzyms
verbesserte Spezifität
des Amplifikationsverfahrens.
-
In
einem späteren
Clonierungsexperiment mit GM2064 und den verunreinigten Primern
besaßen
43 von 510 farblosen Plaques (8%) eine Insertion des (+)-Stranges.
Dies zeigt, daß im
Experiment unter Verwendung von Molt 4 etwa die Hälfte der
119 Clone die Sequenz der Verunreinigung enthalten.
-
Zehn
(+)-Stränge
enthaltende Clone aus Molt 4 wurden sequenziert. Davon besaßen fünf die normale Wildtyp-Sequenz
und fünf
eine Einzelbasenmutation an der dritten Position des zweiten Codons
im Gen, die zu einem Austausch von C durch T führte (CAC wurde zu CAT). Vier
der verunreinigten Clone aus GM2064 wurden sequenziert, wobei alle
vier normal waren.
-
Restriktionsstellen-modifizierte
Primer können
unter Verwendung des vorstehenden Verfahrens auch zur Amplifikation,
Clonierung und teilweisen Sequenzierung des menschlichen N-ras-Oncogens
sowie zur Clonierung von Basenpaarsegmenten der HLA-DQ-α-, DQ-β- und DR-β-Gene verwendet
werden.
-
Die
Spezifität
und Effizienz der Amplifikationsreaktion kann wiederum erhöht werden,
wenn die Konzentrationen von MgCl2 und der
Nucleotide auf 2 mM bzw. 150 – 200 μM verringert
und die tiefste Zyklustemperatur von 37°C auf 45°C – 58°C erhöht wird.
-
BEISPIEL IV
-
Gen-Gewinnung
-
A. IDENTIFIZIERUNG EINER
SONDE FÜR
DIE DNA-SEQUENZ DES TAQ-POLYMERASE-GENS
-
Eine
für die
DNA-Sequenz des Taq-Polymerase-Gens spezifische Sonde wurde nach
einer immunologischen Untersuchung einer λgt11-Expressionsgenbank erhalten. T. aguaticus-DNA
wurde mit AluI vollständig
gespalten, mit EcoRI enthaltenden, 12-mer langen Linkern (CCGGAATTCCGG,
New England Biolabs) ligiert, mit EcoRI gespalten und mit dephosphorylierter,
EcoRI-gespaltener λgt11-DNA
(Promega Biotech) ligiert. Die ligierte DNA wurde verpackt (GigapackPlus,
Stratagene) und in den E. coli K12-Stamm Y1090 transfiziert (von
R. Young bereitgestellt).
-
Die
am Anfang erhaltene Genbank mit 2 × 105 Plaques wurde mit einem
1:2000 verdünnten
polyclonalen Kaninchen-Antiserum untersucht, das zur Reinigung der
Taq-Polymerase hergestellt worden war (vgl. Beispiele I und VI) (Young,
R.A. und R. W. Davis, Science, 222 (1983), 778-782). Plaqueskandidaten
wurden in Grenz-Verdünnung
erneut ausplattiert und dies wurde solange wiederholt, bis sie in
homogener Form vorlagen (~3 Wiederholungen). Aus diesen Plaqueskandidaten,
die mit Prä-Immunserum
nicht, jedoch mit Immunserum reagierten, wurden Phagen isoliert.
-
Diese
Phagenkandidaten wurden zur Lysogenisierung des von E. coli K12
abgeleiteten Stamms Y1089 verwendet (R. Young). Die Lysogene wurden
auf Produktion eines Fusionsproteins (größer als 3-Galactosidase) hin
untersucht, das durch IPTG induzierbar ist und mit dem gegen die
Taq-Polymerase gerichteten Antiserum reagierte. An einem Festträger entsprechend
der Größe fraktionierte
Fusionsproteine wurden zur Affinitätsreinigung epitopspezifischer
Antikörper
aus dem polyclonalen Gesamt-Antiserum verwendet (Goldstein, L. S.
B. et al., J. Cell Biol., 102 (1986), 2076-2087).
-
Die "herausgefischten", Epitop-selektierten
Antikörper
wurden ihrerseits zur Identifizierung von λgt11-Phagenkandidaten mittels
einer Western-Blot-Analyse verwendet, die DNA-Sequenzen codieren,
die für die
Taq-Polymerase eindeutig spezifisch sind. Mit einem als λgt11 bezeichneten λgt11-Phagen
wurden Antikörper
aus dem gegen die Taq-Polymerase gerichteten polyclonalen Kaninchen-Gesamt-Antiserum
spezifisch selektiert, wobei das Antiserum sowohl mit gereinigter
Taq-Polymerase als auch mit Taq-Polymerase enthaltenden Rohextrakt-Fraktionen
eindeutig reagierte. Der Phage λgt:1
wurde weiter untersucht.
-
Das
~115 bp große,
mit EcoRI versehene AluI-Fragment aus Thermus aquaticus-DNA wurde
zur Erzeugung einer Taq-Polymerase-spezifischen Sonde markiert (Maniatis
et al., vorstehend). Die Sonde wurde bei Southern-Blot-Analysen und zur
Untersuchung einer genomischen Zufalls-DNA-Genbank von T. aquaticus verwendet.
-
B. KONSTRUKTION UND SCREENING
EINER GENOMISCHEN ZUFALLSGENBANK VON THERMUS AQUATICUS
-
Ein
lambda-Phage Charon 35 (Wilhelmine, A. M. et al., vorstehend) wurde
einer Annealing-Reaktion unterzogen, über seine überstehenden Enden ligiert
und danach mit BamHI vollständig
gespalten. Die hybridisierten Arme wurden von den "Stuffer"-Fragmenten durch
Kaliumacetat-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation gereinigt (Maniatis
et al., vorstehend). T. aquaticus-DNA wurde mit Sau3A teilweise
gespalten und eine Fraktion mit 15 – 20 kb großen Fragmenten durch Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation
aufgereinigt. Die genomische Zufalls-Genbank wurde durch Ligierung
der Zielfragmente und der Vektor-DNA-Fragmente bei einem Molverhältnis von
1:1 konstruiert. Die DNA wurde verpackt und in die E. coli K12-Stämme LE392 oder
K802 transfiziert. Eine Genbank mit anfangs > 20 000 Phagen, wobei > 99% rekombinante DNA enthielten, wurde
im E. coli K12-Stamm LE392 amplifiziert.
-
Die
genomische Taq-Genbank des CH35-Phagen wurde mit der radioaktiv
markierten EcoRI-Insertion von λgt11:1
untersucht (Maniatis et al., vorstehend). Besonders stark hybridisierende
Phagenplaqueskandidaten wurden gereinigt und weiter untersucht.
Aus einem als Ch35::4-2 bezeichneten Phagen wurden nach HindIII-Spaltung
mehr als vier T. aquaticus-DNA-Fragmente freigesetzt (~8,0 kb, 4,5
kb, 0,8 kb, 0,58 kb).
-
Die
vier HindIII-DNA-Fragmente von T. aquaticus wurden mit dem HindIII-gespaltenen Plasmid BSM13+
(3,2 kb, Vector Cloning Systems, San Diego) ligiert und nach Transformation
des E. coli K12-Stammes DG98 einzeln cloniert.
-
Das
~8,0 kb große
HindIII-DNA-Fragment aus Ch35::4-2 wurde in das Plasmid pFC82 (11,2
kb) isoliert, während
das 4,5 kb große
HindIII-DNA-Fragment
aus Ch35::4-2 in das Plasmid pFC83 (7,7 kb) isoliert wurde.
-
Es
zeigte sich, daß der
das pFC82 enthaltende E. coli-Stamm DG98 eine thermostabile DNA-Polymerase-Aktivität bei hoher
Temperatur hat (Tabelle 1). Außerdem
synthetisieren diese Zellen ein neues Polypeptid mit einem Molekulargewicht
von ~60 kd, das mit der Taq-DNA-Polymerase immunologisch verwandt
ist.
-
Der
Taq-Polymerase codierende Bereich des 8,0 kb großen HindIII-DNA-Fragments wurde auf
dem 2,8 kb HindIII-Asp718-Teil des 8,0 kb großen HindIII-Fragments, das näher zum lac-Promotors liegt,
lokalisiert. Dieser Bereich wurde subcloniert, wobei das Plasmid
pFC85 erhalten wurde (6,0 kb). Nach IPTG-Induktion synthetisieren die das Plasmid
pFC85 enthaltenden E. coli DG98-Zellen bis zu 100mal mehr thermostabile
Aktivität,
die mit der Taq-Polymerase verwandt ist, als der Ausgangs-Elternstamm
(pFC82/DG98) (Tabelle 1). Obwohl pFC85 enthaltende Zellen eine signifikante
Menge einer aktiven thermostabilen DNA-Polymerase-Aktivität synthetisieren, wird nur
ein Teil der Taq-pol-DNA-Sequenz translatiert, wodurch es zu einer
Anreicherung eines ~60 kd großen,
mit der Taq-Polymerase
verwandten Polypeptids kommt.
-
TABELLE
1 Expression
einer thermostabilen DNA-Polymerase-Aktivität in E. coli #
-
- # Die Zellen wurden bis zur späten logarithmischen Phase gezüchtet (+/– IPTG,
10 mM), geerntet, mit Ultraschall behandelt, 20 Minuten auf 75°C erhitzt,
zentrifugiert und der gereinigte Überstand wurde bei 70°C auf DNA-Polymerase-Aktivität hin untersucht.
- * 1 Einheit = 1 nM dCTP in 30 Minuten eingebaut.
-
BEISPIEL V
-
Expression der Taq-Polymerase
-
Das
erfindungsgemäße Gen,
das die thermostabile DNA-Polymerase codiert, kann mit Hilfe irgendeines
aus einer Vielzahl bakterieller Expressionsvektoren, umfassend DG141
(ATCC 39588) und pPLNRBSATG, exprimiert
werden. Diese beiden Wirtsvektoren sind pBR322-Abkömmlinge,
die entweder eine Sequenz besitzen, die einen Tryptophan-Promotor-Operator
und eine Ribosomenbindungsstelle in funktioneller Verbindung mit
dem ATG-Startcodon enthält
(DG141), oder eine Sequenz, die den lambda-PL-Promotor
und die Ribosomenbindungsstelle des N-Gens in funktioneller Verbindung
mit dem ATG-Startcodon
enthält
(pP LNRBSATG).
Zur Konstruktion einer für
eine anschließende
Insertion des Taq-Polymerase-Gens zweckmäßigen Restriktionsstelle kann
jeder der beiden Wirtsvektoren mit SacI gespalten und mit Klenow
oder S1-Nuclease mit glatten Enden versehen werden.
-
Das
Taq-Polymerase-Gen voller Länge
wurde aus den in den Plasmiden pFC83 und pFC85 subclonierten DNA-Insertionsfragmenten
wie folgt konstruiert. Der Vektor BSM13+ (im
Handel erhältlich
von Vector Cloning Systems, San Diego, CA) wurde an der nur einmal
vorhandenen HindIII-Stelle gespalten, mit Klenow und dNTPs aufgefüllt, mit
T4-DNA-Ligase an den BgIII-Octanucleotid- Linker 5'-CAGATCTG-3' ligiert und in den E. coli-Stamm DG98
transformiert. Aus AmpR lacZα+-Transformanten
wurden Plasmide isoliert. Einer der Clone wurde mit den Restriktionsenzymen
BgIII und Asp718 gespalten. Das daraus resultierende große Vektorfragment
wurde durch Gelelektrophorese gereinigt.
-
Im
nächsten
Schritt wurde das Plasmid pFC83 mit BgIII und HindIII gespalten,
danach wurde das 750 Basenpaar große Fragment isoliert. Das Plasmid
pFC85 wurde mit HindIII und Asp718 gespalten, und das ~2,8 kb großes Fragment
isoliert und in einer Drei-Fragmente-Ligierung mit dem 750 Basenpaar
großen
BgIII-HindIII-Fragment
von pFC83 und dem BgIII-Asp718-Vektorfragment von BSM13+ verknüpft. Mit
dem Ligierungsgemisch wurde der E. coli-Stamm DG98 (ATCC 39,768,
am 13. Juli 1984 hinterlegt) transformiert, aus dem AmpR-Kolonien
selektiert wurden und ein ~6,75 Kilobasen großes Plasmid isoliert (pLSG1)
wurde. Durch Isopropyl-β-D-thiogalactosid
(IPTG) induzierte, pLSG1 enthaltende DG98-Zellen synthetisierten eine Taq-DNA-Polymerase,
die vom nativen, aus T. aguaticus isolierten Enzym in der Größe nicht
zu unterscheiden war. Das Plasmid pLSG1 kann dann nach dem von Vector
Cloning Systems empfohlenen Verfahren zur Erzeugung einer einzelsträngiger DNA-Matrize
verwendet werden.
-
Oligonucleotid-gerichtete
Mutagenese (vgl. Zoller und Smith, Nuc. Acids Res., 10 (1982), 6487–6500) kann
danach zur Einführung
einer SphI-Restriktionsstelle als Teil des ATG-Startcodons verwendet
werden (stromaufwärts
von der internen HindIII-Stelle der codierenden Sequenz des Taq-Polymerase-Gens).
Zur Erleichterung der Subclonierung des Taq-Polymerase-Gens in einen
Expressionsvektor kann in ähnlicher
Weise eine BgIII-Stelle hinter dem Carboxyl-Terminus des Gens eingeführt werden
(~0,7 kb stromaufwärts
von der Asp718-Stelle).
Nach Durchführung
der ortsgerichteten Mutagenese kann das Gen aus dem Vektor BSM13+ auf
einem ~3,2 kb großen
SphI-BstEII-Restriktionsfragment isoliert, mit Klenow sowie allen
vier dNTPs behandelt und mit T4-DNA-Ligase (unter Ligierungsbedingungen
für glatte
Enden) in einen der vorstehend erwähnten Expressionsvektoren inseriert
werden, der vorher mit SacI gespalten, mit Klenow sowie dNTPs aufgefüllt und
mit Kalbsdarm-Phosphatase zur Erzeugung dephosphorylierter glatter
Enden behandelt worden war. Mit dem Ligierungsgemisch wird E. coli
DG116 transformiert. Die sich daraus ergebenden Transformanten werden auf
Produktion der Taq-Polymerase hin untersucht. Eine Expression des
Enzyms kann durch Western-Immunblot-Analyse und Aktivitätsuntersuchung
bestätigt
werden.
-
Eine
höhere
Expression des Taq-Polymerase-Gens, das auf dem ~2,8 kb großen HindIII-Asp718-Fragment
von Plasmid pFC85 enthalten ist, kann beispielsweise unter Verwendung
des Plasmids pP LNRBSATG erreicht werden, indem die Amino-terminal
gelegene HindIII-Restriktionsstelle, die das Taq-pol-Gen codiert,
mit einem ATG-Startcodon funktionell verbunden wird. Nach Expression
ergibt dieses Fusionsprodukt eine verkürzte, ~66 000–68 000
Dalton große
Polymerase.
-
Diese
spezifische Konstruktion kann durch Spaltung des Plasmids pFC85
mit HindIII und Behandlung mit Klenow-Fragment in Gegenwart von
dATP, dGTP und dCTP hergestellt werden. Das sich daraus ergebende
Fragment wird zur Entfernung aller einzelsträngigen Überhänge weiter mit S1-Nuclease
behandelt. Die resultierende DNA wird mit Asp718 gespalten und mit
Klenow-Fragment in Gegenwart aller vier dNTPs behandelt. Das gewonnene
Fragment kann unter Verwendung von T4-DNA-Ligase mit dem dephosphorylierten
Plasmid pP LNRBSATG ligiert werden, das vorher mit SacI
gespalten und zur Konstruktion eines ATG enthaltenden glatten Endes
mit Klenow-Fragment in Gegenwart von dGTP behandelt worden war.
Mit dem Ligierungsgemisch wird dann E. coli DG116 transformiert.
Daraus hervorgehende Transformanten werden auf Taq-Polymerase-Produktion
hin untersucht. Eine Expression kann erneut durch Western-Immunblot-Analyse
und eine Aktivitätsuntersuchung
bestätigt
werden.
-
BEISPIEL VI
-
Aufreinigung
-
Die
thermostabile Polymerase kann direkt aus einer Thermus aguaticus-Kultur, wobei nach
dem nachstehend offenbarten Beispiel gearbeitet wird, oder in einer
anderen Ausführungsform
aus einer Bakterienkultur aufgereinigt werden, die das mit Hilfe
rekombinanter Verfahren produzierte Enzym enthält, wobei nur geringfügige Modifikationen
in der Herstellung des Rohextraktes erforderlich sind.
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Nach
Ernte mittels Zentrifugation wurden 60 Gramm Zellen in 75 ml Puffer
resuspendiert, der aus 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, und 1 mM EDTA
bestand. Die Zellen wurden in einer French-Press-Vorrichtung bei 14
000 – 16
000 PSI lysiert. Danach wurden weitere vier Volumina (300 ml) Tris-EDTA-Puffer
zugesetzt. Sodann wurde Puffer A zugesetzt [Endkonzentrationen 5
mM β-Mercaptoethanol
und jeweils 0,5% NP-40 und Tween 20 (Vol./Vol.)] und die Lösung wurde
unter Kühlen
gründlich
mit Ultraschall behandelt. Die resultierende homogene Suspension
wurde mit Puffer A weiter verdünnt,
so daß das
Endvolumen das etwa 7,5 bis 8fache des Ausgangszellgewichts betrug.
Die Lösung
wurde als Fraktion I bezeichnet.
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Die
Aktivität
der Polymerase in Fraktion I und den nachfolgenden Fraktionen wurde
in einem 50 μl-Gemisch
bestimmt, enthaltend 0,025 M TAPS-HCl, pH-Wert 9,4 (20°C), 0,002
M MgCl2, 0,05 M KCl, 1 mM 2-Mercaptoethanol,
jeweils 0,2 mM dGTP, dATP und TTP, 0,1 mM dCTP [α-32P,
0,05 Ci/mM], 12,5 μg "aktivierte" Lachs-Sperma-DNA
und 0,01 – 0,2
Einheiten Polymerase (gelöst
in 10 mM Tris-HCl,
pH 8, 50 mM KCl, 1 mg/ml autoklavierte Gelatine, 0,5% NP-40, 0,5%
Tween 20 und 1 mM 2-Mercaptoethanol). Eine Einheit entspricht 10 nM
Produkt in 30 Minuten. "Aktivierte" DNA ist ein natives
DNA-Präparat
nach teilweiser Hydrolyse mit DNase I, bis 5% der DNA in eine säurelösliche Fraktion überführt sind.
Die Reaktion wurde 10 Minuten bei 74°C durchgeführt. Danach wurden 40 μl in 1,0
ml 50 μg/ml
Träger-DNA
in 2 mM EDTA bei 0°C überführt. Eine
Lösung aus
20% TCA und 2% Natriumpyrophosphat wurde in gleicher Menge (1,0
ml) zugesetzt. Nach 15 – 20
Minuten bei 0°C
wurden die Proben durch Whatman GF/C-Filterscheibchen gefiltert, erst mit
einer kalten Lösung
aus 5% TCA und 1 % Pyrophosphat und dann mit kaltem 95%-igem Ethanol
gründlich
gewaschen, getrocknet und gezählt.
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Fraktion
I wurde zwei Stunden bei 2°C
in einem TI 45-Rotor von Beckman bei 35.000 Upm zentrifugiert. Der
gewonnene Überstand
wurde als Fraktion II bezeichnet.
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Die
Taq-Polymerase-Aktivität
wurde mit Polymin P (BRL, Gaithersburg, MD) (10% Gew./Vol., auf
einen pH von 7,5 eingestellt und autoklaviert) präzipitiert,
nachdem die für
eine 90 – 95%-ige
Aktivitätspräzipitation erforderliche
kleinste Polymin P-Menge bestimmt worden war, wobei festgestellt
wurde, daß diese
Menge im allgemeinen zwischen 0,25% und 0,3% des Endvolumens liegt.
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Fraktion
II wurde bei 0°C
unter Rühren
eine geeignete Polymin P-Menge über
einen Zeitraum von 15 Minuten langsam zugesetzt. Die Lösung wurde
20 Minuten bei 2°C
in einem JA14-Rotor von Beckman bei 13 000 Upm zentrifugiert. Der Überstand
wurde auf Aktivität
hin untersucht. Das Pellet wurde in 1/5 Volumen 0,5 × Puffer
A (mit Wasser 1:2 verdünnt)
resuspendiert. Die Suspension wurde erneut zentrifugiert und das
Pellet wurde in 1/4 Volumen Puffer A, enthaltend 0,4 M KCl, resuspendiert.
Die Suspension wurde gründlich
homogenisiert und über
Nacht bei 4°C
stehengelassen. Das Homogenat wurde wie vorstehend zentrifugiert.
Der gewonnene Überstand
wurde als Fraktion III bezeichnet.
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Die
Proteinfraktion wurde durch "Präzipitation" mit Ammoniumsulfat
in einer Sättigung
von 75% gesammelt, zentrifugiert (bei 27 000 UpM, SW27-Rotor, 30
Minuten) und die aufschwimmende Emulsionsschicht wurde in 50 mM
Tris-Cl, pH-Wert
8, 1 mM EDTA; resuspendiert. Diese Schritte wurden wiederholt. Die
Proteinsuspension wurde gründlich
gegen 80 mM KCl enthaltenden P-Zellpuffer (20 mM KPO4,
pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 5 mM β-Mercaptoethanol,
5% (Gew./Vol.) Glycerin, 0,5% (Vol./Vol.) NP-40 und Tween 20) dialysiert.
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Das
Dialysat wurde in eine Zentrifugenflasche überführt, in die alle erhaltenen
Proteine aus Beuteln, die mit dem 80 mM KCl enthaltendem P-Zellpuffer
gespült
worden waren, zugegeben wurden. Bei 20 000 × g wurde eine Zentrifugation
durchgeführt,
wobei die Zeitdauer auf 15 Minuten beschränkt wurde. Der Überstand wurde
gewonnen. Das restliche Pellet wurde gewaschen, mit P-Zellpufter und 80
mM KCl extrahiert und erneut zentrifugiert. Die Überstände wurden vereinigt, wobei
Fraktion IV gebildet wurde.
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Fraktion
IV wurde auf eine 2,2 × 22
cm Phosphocellulose-Säule
aufgetragen, die mit 80 mM KCl enthaltendem P-Zellpuffer äquibriliert
worden war. Die Säule
wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen (2,5–3 Säulenvolumen) und das Protein
unter Verwendung eines linearen KCl-Gradienten mit Konzentrationen
von 80 mM bis 400 mM in P-Zellpuffer eluiert. DNA-Polymerase-Aktivität enthaltende
Fraktionen (+0,18 – 0,20
M KCl) wurden vereinigt und auf einer Amicon-Rührzelle und einer YM30-Membran
3–4fach
konzentriert. Die Zelle wurde mit P-Zellpuffer ohne KCl gespült und der
konzentrierten Fraktion (Endvolumen auf 0,15 M KCl eingestellt)
zugegeben, wobei Fraktion V gebildet wurde.
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Fraktion
V wurde auf eine 5 ml Heparin-Sepharose-CL-6B-Säule (Pharmacia) aufgetragen,
die mit P-Zellpuffer und 0,15 M KCl äquilibriert worden war. Die
Säule wurde
mit 0,15 M KCl-Puffer (3 – 4
Säulenvolumen)
gewaschen. Das Protein wurde unter Verwendung eines linearen KCl-Gradienten
mit Konzentrationen von 0,15 bis 0,65 M in P-Zellpuffer eluiert.
Zur SDS-PAGE-Analyse
wurde eine 1:10 Verdünnung
mit einem Verdünnungsmittel
ohne Gelatine hergestellt. Zur Verwendung in Enzymtests wurde anschließend eine
1:20 Verdünnung
mit einem 1 mg/ml Gelatine enthaltenden Verdünnungsmittel hergestellt. Die
Aktivität
enthaltenden Fraktionen (die bei ~0,3 M KCl eluieren) wurden an
einer supergeknäulten
DNA-Matrize auf spezifische und nichtspezifische Endonucleasen/Topoisomerase
hin untersucht. Die Untersuchung bestand in dem elektrophoretischen
Nachweis, daß sich
das Molekulargewicht supergeknäulter
Plasmid-DNA nach Inkubation mit einem Überschuß an DNA-Polymerase verändert hatte.
Eine Verunreinigung durch Exonucleasen wurde nach Inkubation mit
kleinen linearen DNA-Fragmenten nachgewiesen. Es wurde festgestellt,
daß in
den Peak-Fraktionen ein Protein von ~88 kd die Hauptbande darstellte.
Der als Fraktion VI bezeichnete Hauptpool besaß die höchste Polymerase-Aktivität bei einer
nur geringen nachweisbaren Endonuclease-Aktivität, wenn sie 30 Minuten bei
55°C mit
~3-5 Polymerase-Einheiten/600
ng DNA untersucht wurden.
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Fraktion
VI wurde gegen 10 mM KPO4, pH-Wert 7,5,
5 mM β-Mercaptoethanol,
5% Glycerin, 0,2% NP-40 und 0,2% Tween 20 (HA-Puffer) dialysiert.
Die dialysierte Probe wurde auf eine 3 ml Hydroxyapatit-Säule aufgetragen.
Das Enzym wurde mit einem linearen KPO4-Gradienten
mit Konzentrationen von 10 mM bis 250 mM, pH-Wert 7,5, in NA-Puffer
eluiert. Die Elution der DNA-Polymerase-Aktivität begann bei 75 mM KPO4, wobei der Peak bei 100 mM KPO4 lag.
Die aktiven Peak-Fraktionen wurden in einer 1:100 bis 1:300 Verdünnung getestet.
Wie im vorangegangenen Chromatographie-Schritt wurde eine 1:10 Verdünnung in
einem Verdünnungsmittel
ohne Gelatine zur SDS-PAGE-Analyse
hergestellt. Nach einem Test bei 55°C mit 5 Polymerase-Einheiten
wurden Fraktionen ohne nennenswerte Endonuclease- oder DNA-Doppelstrangspezifische
Exonuclease-Aktivität
vereinigt und als Fraktion VII bezeichnet.
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Fraktion
VII wurde bei Raumtemperatur gegen eine auf einen pH-Wert von 5
eingestellte Lösung
aus 25 mM Natriumacetat, pH-Wert 5,2, 5% Glycerin, 5 mM β-Mercaptoethanol,
0,1 mM EDTA, 0,1% NP-40 und 0,1% Tween 20 dialysiert. Die dialysierte
Probe wurde auf eine vorher äquilibrierte
2 ml DAE-Tris-Acryl-M-Säule (LKB)
aufgetragen und anschließend
mit dem gleichen Puffer gewaschen. Die Fraktion, die nicht an der
Säule haftende
Polymerase-Aktivität
enthielt, wurden vereinigt und im gleichen Puffer auf 50 mM NaCl
eingestellt, wobei Fraktion VIII erhalten wurde.
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Fraktion
VIII wurde auf eine 2 ml CM-Tris-Acryl M-Säule (LKB) aufgetragen, die
mit dem gleichen Puffer (25 mM Natriumacetat, 50 mM NaCl, 5% Glycerin,
0,1 mM EDTA, 0,1 % NP-40 und 0,1 % Tween 20) äquilibriert worden war. Die
Säule wurde
mit 4 – 5
Säulenvolumen
des gleichen Puffers gewaschen. Das Enzym wurde mit einem linearen
NaCl-Gradienten mit Konzentrationen von 50 mM bis 400 mM in Natriumacetat-Puffer
eluiert. Der Peak der Polymerase-Aktivität wurde mit ~0,15 – 0,20 M
NaCl eluiert. Die Polymerase-Aktivität wurde in einer 1:300 bis
1:500 Verdünnung
getestet, wobei zuerst eine 1:10 Verdünnung mit einem Verdünnungsmittel
ohne Gelatine zur SDS-PAGE-Analyse erfolgte. Der Aktivitäts- Peak wurde an supergeknäulten DNA-Matrizen
allgemein auf spezifische und nichtspezifische Endonuclease/Topoisomerase
hin bei 74°C
unter Verwendung von DNA-Polymerase-Testsalzen (25 mM TAPS-HCl,
pH 9,4, 2,0 mM MgCl2 und 50 mM KCl) getestet
ebenso wie an ss-M13-DNA und pBR322-Fragmenten auf Nucleasen. Aktive
Fraktionen ohne nachweisbare(n) Nuclease(n) wurden vereinigt und
auf einem mit Silber angefärbten
SDS-PAGE-Minigel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Ergebnisse zeigen
eine einzelne ~88 kd Bande mit einer spezifischen Aktivität von 250
000 Einheiten /mg.
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Diese
spezifische Aktivität
liegt um mehr als eine Größenordnung über der
Aktivität,
die der früher
isolierten Taq-Polymerase zugeschrieben wird, und mindestens eine
Größenordnung über der
Aktivität
der E. coli-Polymerase I.
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BEISPIEL VII
-
Es
wurde festgestellt, daß die
Taq-Polymerase, die wie vorstehend in Beispiel VI beschrieben isoliert wurde,
keine Verunreinigungen von Taq-Endonuclease- und Exonuclease-Aktivitäten enthält. Die
Taq-Polymerase wird außerdem
vorzugsweise in einem Aufbewahrungspuffer aufbewahrt, in dem jedes
verwendete nichtionische polymere Detergenz in einer Konzentration
von 0,1% bis 0,5% (Volumen/Volumen) enthalten ist. Besonders bevorzugt
ist ein Aufbewahrungspuffer, der aus 50% (Vol./Vol.) Glycerin, 100
mM KCl, 20 mM Tris-Cl, pH-Wert
8,0, 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1 mM Dithiothreitol,
0,5% (Vol./Vol.) NP-40, 0,5% (Vol./Vol.) Tween 20 und 200 µg/ml Gelatine
besteht. Der Puffer wird besonders bevorzugt bei –20°C aufbewahrt.
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Die
aufbewahrte Taq-Polymerase wurde in einem Puffer verdünnt, der
aus 25 mM Tris-Cl, pH-Wert 8,0, 20 mM KCl, 1 mM β-Mercaptoethanol, 0,5% NP-40,
0,5% Tween 20 und 500μg/ml
Gelatine bestand. Es wurde ein Umsetzungspuffer mit einem Endvolumen
von 100 μl
hergestellt, enthaltend 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl, pH-Wert 8,3, 1,5 mM MgCl2, 0,01% (Gew./Vol.) Gelatine, jeweils 200 μM der einzelnen
dNTPs, jeweils 1 μM der
Primer, mit denen eine 500 Basenpaare große Zielsequenz auf einer Kontrollmatrize
des Bakteriophagen λ bestimmt
werden kann, und 2,0 – 2,5
Einheiten Taq-Polymerase/Test. Dem Umsetzungspuffer wurde Matrizen
zugesetzt in ein 0,5 ml-Polypropylenröhrchen gegeben und mit 100 μl schwerem
Mineralöl überschichtet, um
eine Verdampfung zu verhindern.
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Eine
mindestens 105fache Amplifikation wurde
erzielt, wenn die folgenden Bedingungen für 1 ng Kontrollmatrize (DNA
des Bakteriophagen λ)
verwendet wurden, in der die Zielsequenz etwa 1 % der Ausgangsmasse
darstellte.
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Zuerst
wurde das Matrizengemisch eine Minute und 30 Sekunden bei 94°C denaturiert,
indem das Röhrchen
in ein Warmwasserbad gegeben wurde. Dann wurde das Röhrchen zwei
Minuten in ein Warmwasserbad mit 37°C gegeben. Dann wurde das Röhrchen drei
Minuten in ein Warmwasserbad mit 72°C gegeben und danach eine Minute
in ein Warmwasserbad mit 94°C.
Dieser Zyklus wurde insgesamt 25mal wiederholt. Der Hitzedenaturierungsschritt
bei 94°C
wurde am Ende des 25. Zyklus weggelassen und durch eine Verlängerung
des Inkubationsschrittes bei 72°C
um weitere drei Minuten ersetzt. Nach Beendigung des Tests wurden die
Proben auf Raumtemperatur abgekühlt
und wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben untersucht.
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Die
Matrize kann gegebenenfalls mit einer anderen Konzentration der
dNTPs und einer anderen Taq-Polymerase-Menge amplifiziert werden.
Die Größe der Zielsequenz
in der DNA-Probe hat außerdem
direkte Auswirkungen auf die Mindestzeit, die für eine ordnungsgemäße Verlängerung
erforderlich ist (Inkubationsschritt bei 72°C). Zur Erzielung einer maximalen
Effizienz sollte für
jede einzelne Matrize, die amplifiziert werden soll, eine Optimierung
des Temperaturzyklus-Profils erfolgen.
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Beispiel VIII
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Taq-Polymerase,
die wie vorstehend in Beispiel I beschrieben isoliert worden war,
wurde zur Aufbewahrung wie im vorangegangenen Beispiel beschrieben
zubereitet, jedoch ohne nichtionische polymere Detergenzien. Bei
Untersuchungen auf Aktivität,
wie in diesem Beispiel beschrieben, wurde festgestellt, daß das Enzymaufbewahrungsgemisch
nicht aktiv war. Bei Zugabe von NP-40 und Tween 20 zum Aufbewahrungspuffer
wurde die volle Enzymaktivität
wiederhergestellt. Das zeigt, daß die Gegenwart der nichtionischen
Detergenzien für
die Stabilität
des Enzympräparats
notwendig ist.
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Beispiel IX
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Mehrere
Proben menschlicher genomischer DNA jeweils in einer Menge von 1 μg wurden
20 – 35
der in Beispiel V beschriebenen Amplifikationszyklen unterworfen,
wobei äquivalente
Einheiten des Klenow-Fragments oder der Taq-Polymerase verwendet wurden. Die amplifizierten
Proben wurden mittels Agarose- Gelelektrophorese
und Southern-Blot-Hybridisierung untersucht. Die in diesen Umsetzungen
verwendeten Primer PCO3 und PCO4 steuern die Synthese eines 110
bp großen
Abschnitts des menschlichen beta-Globin-Gens. Die mit der Klenow-Polymerase
durchgeführten
Amplifikationen zeigten den gleichen DNA-Schmiereffekt, der für dieses Enzym typisch ist
und offensichtlich durch unspezifische Hybridisierung und Verlängerung
der Primer an nichtverwandten genomischen Sequenzen unter im wesentlichen
nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen (1 × Klenow-Salze bei 37°C) verursacht
wird. Trotzdem wurde ein 110 bp großes spezifisches beta-Globin-Zielfragment
durch Southern-Blot-Hybridisierung in allen Spuren nachgewiesen.
Bei den mit Taq-Polymerase
durchgeführten
Amplifikationen zeigte sich nach Elektrophorese ein vollkommen anderes
Bandenmuster, wobei eine einzelne Hauptbande die 110 bp große Zielsequenz
darstellte. Diese bemerkenswerte Spezifität war ohne Zweifel auf die
Temperatur während
der Primerverlängerung
zurückzuführen.
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Obwohl
wie bei den Amplifikationen mit dem Klenow-Fragment der Hybridisierungsschritt
bei 37°C durchgeführt wurde,
mußte
die Temperatur der durch Taq katalysierten Umsetzungen auf etwa
70°C erhöht werden,
bevor das Enzym eine signifikante Aktivität zeigte. Während der Temperaturerhöhung von
37°C auf 70°C wurden
Primer-Matrize-Hybride mit wenig übereinstimmenden Sequenzen
(die sich bei 37°C
gebildet hatten) getrennt, so daß zu dem Zeitpunkt, zu dem
die Umsetzung eine enzymaktivierende Temperatur erreicht hatte,
nur ein hochkomplementäres
Substrat verlängert
werden konnte. Diese Spezifität
führt auch
zu einer größeren Ausbeute
der Zielsequenz als mit dem Klenow-Fragment durchgeführte ähnliche
Amplifikationen, da die unspezifischen Verlängerungsprodukte wirksam um
die Polymerase konkurrieren, wodurch die Menge des 110-mers verringert
wird, das durch das Klenow-Fragment hergestellt werden kann.
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BEISPIEL X
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Es
wurde eine Amplifikation mit einer Probe durchgeführt, die
1 μg Molt
4-DNA, 50 mM KCl,
10 mM Tris, pH-Wert 8,3, 10 mM MgCl2, 0,01
% Gelatine, jeweils 1 μM
der folgenden Primer (zur Amplifikation eines 150 bp großen Bereichs):
5'-CATGCCTCTTTGCACCATTC-3'(RS79) und
5'-TGGTAGGTGGATTGTAGGiG-3'(RS80).
jeweils
1,5 mM der einzelen dNTPs und 5,0 Einheiten Taq-Polymerase pro 100 μl Umsetzungsvolumen
enthielt. Drei weitere Proben wurden hergestellt, die 2,5, 1,3 oder
0,6 Einheiten Taq-Polymerase enthielten. Die Amplifikation wurde
in dem vorstehend beschriebenen Gerät zur Durchführung von
Temperaturzyklen durchgeführt,
wobei der folgende Zyklus 30mal wiederholt wurde:
1 Minute
von 70°C
auf 98°C
1
Minute Beibehalten bei 98°C
1
Minute von 98°C
auf 35°C,
45°C oder
55°C
1
Minute Beibehalten bei 35°C,
45°C oder
55°C
1
Minute von 35°C,
45°C oder
55°C auf
70°C
Beibehalten
bei 70°C über 30 Sekunden.
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Bei
einer Hybridisierungstemperatur von 35°C zeigte eine Taq-Enzymverdünnung von
2,5 Einheiten/100 μl
verglichen mit allen anderen Taq-Polymerase-Konzentrationen
das beste Verhältnis
zwischen Signal und Hintergrund, wie durch Agarose-Gelelektrophorese
festgestellt wurde. Bei 45°C
zeigte eine Taq-Enzymverdünnung
von 5 Einheiten/100 μl
verglichen mit anderen Konzentrationen das beste Verhältnis zwischen Signal
und Hintergrund. Bei 55°C
zeigte das Taq-Enzym in einer Konzentration von 5 Einheiten/100 μl verglichen
mit anderen Taq-Polymerase-Konzentrationen und mit der Hybridisierung
bei 45°C
das beste Verhältnis zwischen
Signal und Hintergrund, wobei auch eine erhöhte Ausbeute erhalten wurde.
Bei 55°C
besitzt die Taq-Polymerase eine höhere Spezifität und führt zu einer
erhöhten
Ausbeute.
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In
einem getrennten Experiment wurde Molt 4-DNA in einer Verdünnungsreihe
in 10fachen Verdünnungsschritten
mit DNA der Zellinie GM2064 verdünnt,
die keine β-
oder δ-Globin-Sequenzen
enthält
und von Human Genetic Mutant Cell Depository, Camden, New Jersey,
erhältlich
ist, in verschiedenen Konzentrationen, die verschiedene Kopien pro
Zelle repräsentieren.
Bei Hybridisierungstemperaturen von 35°C und 55°C wurde mit diesen Proben eine
Amplifikation wie in diesem Beispiel beschrieben durchgeführt. Bei
35°C konnte bestenfalls
1 Kopie pro 50 Zellen mittels Agarose-Gelelektrophorese nachgewiesen werden,
bei 55°C
jedoch 1/5000 (eine 100fache Verbesserung gegenüber der niedrigeren Temperatur).
Das zeigt, wie wichtig unter diesen Bedingungen eine erhöhte Hybridisierungstemperatur
für die
Spezifität
der Taq-Polymerase ist.
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In
einem dritten Experiment wurde DNA aus der HIV-positive DNA enthaltenden
Zellinie 368H, die von B. Poiesz, State University of New York,
Syracuse, NY, erhältlich
ist, in ähnlicher
Weise mit DNA aus der Zellinie SC1 (bei ATCC am 19. März 1985
hinterlegt; eine mit dem Epstein-Barr-Virus transformierte β-Zellinie,
die für
das Sichelzellen-Allel homozygot ist und die keine HIV-Sequenzen
enthält)
in unterschiedlichen Konzentrationen verdünnt, die verschiedene Kopiezahlen
pro Zelle bedeuten. Eine Amplifikation wurde bei Hybridisierungstemperaturen
von 35°C
und 55°C
wie in diesem Beispiel beschrieben durchgeführt, wobei die Primer SK38
und SK39 verwendet wurden, durch die ein 115 bp großer Bereich
der HIV-Sequenz amplifiziert wird:
5' -ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT-3' (SK38) und
5'-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC-3'(SK39)
-
Die
Ergebnisse der Agarose-Gelelektrophorese zeigten, daß nur die
unverdünnte
368H-Probe bei einer Hybridisierungstemperatur von 35°C nachweisbar
war, während
bei einer Hybridisierungstemperatur von 55°C zumindest mit einer 10–2-Verdünnung Amplifikation
nachweisbar war, wodurch eine 100fache Verbesserung hinsichtlich
des Nachweises erzielt wurde.
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BEISPIEL XI
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Aus
1 μg Kaninchen-Reticulocyten-mRNA
(Bethesda Research Laboratories) wurde cDNA in einem 100 μl Reaktionsvolumen
hergestellt, das 150 mM KCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,5 mM dATP, 0,5 mM dCTP, 0,5
mM TTP, 0,5 mM dGTP, 0,2 μg
Oligo(dT)12–18
(Pharmacia), 40 Einheiten RNasin (Promega Biotec) und 5 Einheiten
Reverse AMV-Transkriptase (BRL) enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde
30 Minuten bei 42°C
inkubiert. Die Umsetzung wurde durch 10minütiges Erhitzen auf 95°C beendet. Zwei μg RNase A
wurden der Probe zugegeben (2 μl
einer 2mg/ml Lösung
in Wasser) und die Inkubation wurde weitere 10 Minuten bei 37°C fortgeführt.
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Unter
Verwendung verschiedener Primerpaare wurden mit dem Klenow-Fragment drei Amplifikationsreaktionen
durchgeführt.
Durch das Primerpaar PCO3/PCO4 wurde ein 110 bp großes Produkt
bestimmt. Durch das Primerpaar RS45/Oligo(dT)25-30 wurde ein etwa
370 bp großes
Produkt bestimmt und durch das Primerpaar PCO3/Oligo(dT)25–30 ein
etwa 600 bp großes
Produkt. PCO3, PCO4 und RS45 sind zum menschlichen β-Globin-Gen
komplementär
und weisen bezüglich
des entsprechenden Kaninchen-Gens zwei Basenfehlpaarungen auf. PCO3
und PCO4 sind in Beispiel I beschrieben. RS45 besitzt die folgende
Sequenz:
5'-CAAGAAGGTGCTAGGTGCC-3'.
-
Mit
einem Zwanzigstel (5 μl)
der vorstehend beschriebenen cDNA wurden Amplifikationsreaktionen
in 100 μl
Reaktionsgemisch durchgeführt,
das 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2,
200 μg/ml Gelatine,
10% DMSO, 1 μM
PCO3 oder RS45, 1 μM
PCO4 oder Oligo(dT)25–30,
1,5 mM dATP, 1,5 mM dCTP, 1,5 mM TTP und 1,5 mM dGTP enthielt. Die
Proben wurden fünf
Minuten auf 98°C
erhitzt, dann auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 100 μl Mineralöl überschichtet.
-
Die
Proben wurden 10 automatisierten Amplifikationszyklen unter Verwendung
des in Beispiel I beschriebenen Geräts und des folgenden Programms
unterworfen:
- 1) Erhitzen von 37°C auf 98°C in einem
Heizblock über
eine Zeitspanne von 2,5 Minuten (Denaturierung);
- 2) Abkühlen
von 98°C
auf 37°C über eine
Zeitspanne von drei Minuten (Hybridisierung);
- 3) Zugabe einer Einheit Klenow-Fragment; und
- 4) Beibehalten der Temperatur von 37°C über eine Zeitspanne von 20
Minuten (Verlängerung).
-
Das
Endvolumen jeder Probe betrug etwa 140 μl. Ein Zwanzigstel (7 μl) jeder
Probe wurde durch Elektrophorese auf einem 2%-igen Agarosegel untersucht.
Nach Anfärben
mit Ethidiumbromid waren bei den PCO3/PCO4- und RS45/Oligo(dT)-Proben
deutliche Banden zu sehen. Die Bandengröße entsprach den erwarteten
Längen:
110 bp für
die erstere Probe und etwa 370 bp für letztere Probe. Es gab keine
Anzeichen für eine
Amplifikation des etwa 600 bp großen Fragments durch das Primerpaar
PCO3/Oligo(dT).
-
Die
Gelbanden wurden mittels des Southern-Blot-Verfahrens auf eine "Genatran"-Nylonmembran übertragen
und unter Verwendung von Standardverfahren mit der durch Nick-Translation
markierten menschlichen β-Globin-Sonde pBR328:betaA
hybridisiert, die in Saiki et al., Science, vorstehend, beschrieben
ist. Die vorstehend gezogenen Schlußfolgerungen, daß die 110
bp- und etwa 370
bp-Fragmente β-Globin-spezifische Amplifikationsprodukte
darstellen und daß keine
nennenswerte Amplifikation der etwa 600 bp großen Bande nachweisbar ist,
wurden durch das resultierende Autogramm untermauert.
-
Unter
Verwendung der vorstehend beschriebenen Primerpaare wurden drei
weitere Proben mit der vorstehend gewonnenen Taq-Polymerase amplifiziert.
Aliquots mit fünf
Mikrolitern cDNA wurden in 100 μl
Umsetzungsvolumen amplifiziert, die 50 mM KCl, 25 mM Tris-HCl (pH
8,0), 10 mM MgCl2, 200 μg/ml Gelatine, 10% DMSO, 1 μM PCO3 oder
RS45, 1 μM
PCO4 oder Oligo(dT)25–30,
1,5 mM dATP, 1,5 mM dCTP, 1,5 mM TTP und 1,5 mM dGTP enthielten.
Die Proben wurden fünf
Minuten auf 98°C
erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Jeder Probe wurde ein
Mikroliter Taq-Polymerase (1/8 Verdünnung aus Herstellung 2) zugesetzt.
Die Proben wurden anschließend
mit etwa 100 μl
Mineralöl überschichtet.
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Die
Proben wurden 9 Amplifikationszyklen in der im vorstehenden Beispiel
beschriebenen Pettier-Vorrichtung unter Verwendung des folgenden
Programms unterworfen.
- 1) 1 Min. Temperaturerhöhung von
35°C auf
60°C;
- 2) 12 Min. Temperaturerhöhung
von 60°C
auf 70°C
(Verlängerung);
- 3) 1 Min. Temperaturerhöhung
von 70°C
auf 95°C
(Denaturierung);
- 4) Weichen bei 95°C
während
30 Sek.;
- 5) 1 Min. Temperaturerniedrigung von 95°C auf 35°C (Hybridisierung); und
- 6) Weichen bei 35°C
während
30 Sek.
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Zur
Beendigung der letzten Verlängerung
(10. Zyklus) wurden die Proben nach dem letzten Zyklus weitere 10
Minuten bei 70°C
inkubiert. Das Endvolumen jeder Probe betrug jeweils etwa 100 μl.
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Wie
zuvor wurde ein Zwanzigstel (10 μl)
jeder Probe auf einem 2%-igen Agarosegel untersucht. Auf dem Gel
waren Amplifikationsprodukte in allen drei Proben vorhanden: 110
bp bei PCO3/PCO4 etwa 370 bp bei RS45/Oligo(dT) und etwa 600 bp
bei PCO3/Oligo(dT). Die Ergebnisse wurden durch Southern-Übertragung und Hybridisierung
mit der pBR328:betaA-Sonde bestätigt.
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Die
Herstellung des 600 bp-Produkts durch Taq-Polymerase, nicht aber
durch das Klenow-Fragment, ist signifikant und deutet an, daß die Taq-Polymerase
längere
DNA-Sequenzen produzieren kann als das Klenow-Fragment.
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Die
folgenden Bakteriophagen und Bakterienstämme wurden bei der Cetus Master
Culture Collection, 1400 Fifty-Third Street, Emeryville, Kalifornien,
USA (CMCC) und bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn
Drive, Rockville, Maryland, USA (ATCC) hinterlegt. Die Hinterlegungen
erfolgten gemäß den Bedingungen
des Budapester Vertrags über
Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
für die
Zwecke von Patentverfahren und den dazugehörigen Verordnungen (Budapester
Vertrag). Dadurch wird die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur über 30 Jahre
mit Beginn der Hinterlegung gesichert. Gemäß den Bedingungen des Budapester
Vertrags und vorbehaltlich einer Vereinbarung zwischen Anmeldern und
der ATCC, die eine unbeschränkte
Verfügbarkeit
nach Erteilung des relevanten US-Patents sichern, sind die Organismen
von der ATCC erhältlich.
Die Verfügbarkeit
der hinterlegten Stämme
darf nicht als Genehmigung zu einer praktischen Umsetzung der Erfindung
ausgelegt werden, was gegen die Rechte verstößt, die eine Regierung kraft
ihrer Authorität
gemäß ihrer
Patentgesetze verleiht.
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Kurz
zusammengefaßt,
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation
einer oder mehrer spezifischer Nucleinsäuresequenzen unter Verwendung
einer Kettenreaktion mit zyklischen Temperaturveränderungen
und eines thermostabilen Enzyms bereit, wobei in dieser Reaktion
Primer-Verlängerungsprodukte
hergestellt werden, die anschließend als Matrizen für weitere
Primer-Verlängerungsumsetzungen dienen.
Unter Verwendung sequenzspezifischer Oligonucleotide ist das Verfahren
besonders zum Nachweis von Nucleinsäuresequenzen, die am Anfang
nur in sehr kleinen Mengen vorhanden sind, und zum Nachweis von
Nucleotidveränderungen
nützlich.
Das vorliegende Amplifikationsverfahren kann auch zur molekularen Clonierung
verwendet werden.
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Gegenüber den
früher
offenbarten Verfahren führt
das vorliegende Verfahren zu erhöhten
Ausbeuten des amplifizierten Produkts und zu einer höheren Spezifität, wobei
weniger Schritte zur Durchführung
des Amplifikationsverfahrens erforderlich sind.