NO305488B1 - Termostabil DNA-polymerase, DNA-sekvens som koder for denne, vektor omfattende DNA-sekvensen, mikroorganisme transformert med DNA-sekvensen samt preparat inneholdende den termostabile DNA-polymerase - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en termostabil DNA-polymerase fra en Thermus specie.

Oppfinnelsen angår videre en DNA-sekvens som koder for en slik termostabil DNA-polymerase.

Oppfinnelsen angår videre en vektor som omfatter DNA-sekvensen, en mikroorganisme som er transformert med DNA-sekvensen samt et preparat som omfatter en termostabil DNA-polymerase .

DNA eller RNA kan være enkelt- eller dobbeltstrenget og kan være relative rene arter eller en komponent av en blanding av nukleinsyrer. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen benytter en repetitiv reaksjon for å fullføre forsterkningen av den ønskede nukleinsyresekvens.

Utstrakt forskning er gjennomført med henblikk på isolering av DNA-polymeraser fra mesofile mikroorganismer slik som E. coli, se for eksempel Bessman et al., "J. Biol. Chem." (1957) 233:171-177 og Buttin og Kornberg (1966) "J. Biol. Chem." 241:5419-5427.

I motsetning til dette, er det undersøkt lite når det gjelder isolering og rensing av DNA polymeraser fra termofiler som Thermus aquaticus. Kaledin et al., "Biokhymiya" (1980) .45:644-651 beskriver en sekstrinns isolerings- og rense-prosedyre av DNA-polymerase fra celler av T. aquaticus YT1-stammen. Disse trinn involverer isolering av råekstraktet, DEAE-cellulosekromatografi, fraksjonering av hydroksyapatitt, fraksjonering på DEAE-cellulose og kromatografi på enkeltstrenget DNA-cellulose. De sammenslåtte mengder av hvert trinn ble ikke avsøkt med henblikk på kontaminerende endo- og eksonuklease(r). Molekylvekten for det rensede enzym er angitt til 62000 dalton pr. monomerenhet.

Et andre renseskjema for en polymerase fra T. aquaticus er beskrevet av A. Chlen et al., "J. Bacetrlol." (1976) 127: 1550-1557. I denne prosess blir råekstrakten bragt på en DEAE-Sephadex-kolonne. De dialyserte sammenslåtte fraksjoner underkastes så behandling på en fosfocellulosekolonne. De sammenslåtte fraksjoner dialyseres og bovinserumalbumin, BSA, tilsettes for å forhindre tap av polymeraseaktivitet. Den resulterende blanding fylles på en DNA-cellulosekolonne. Det sammenslåtte materialet fra kolonnen dialyseres og analyseres ved gelfiltrering til å ha en molekylvekt på ca. 63000 dalton og, ved sukrosegradientsentrifugering, på ca. 68000 dalton.

Bruken av et termostabilt enzym for å forsterke eksisterende nukleinsyresekvenser i mengder som er store sammenlignet med mengden som til å begynne med er tilstede, er foreslått i EP Pub. 0 200 362. Primere, nukleotidtrifosfater og en polymerase benyttes i prosessen som omfatter denaturering, syntese av sjablonstrenger og hybridisering. Ekstensjonsproduktet av hver primer blir en sjablon for fremstilling av den ønskede nukleinsyresekvens. Søknaden beskriver at hvis polymerasen som benyttes er et termostabilt enzym, behøver dette ikke å tilsettes efter hvert denatureringstrinn fordi varmen ikke vil ødelegge aktiviteten. Ingen andre fordeler eller detaljer er tilveiebragt når det gjelder bruken av en renset termostabil DNA-polymerase. Forsterkning og detektering er også beskrevet av Saiki et al., "Science", 230:1350-1354 (1985) og av Saiki et al., "Bio/Technology", 3:1008-1012 (1985).

I henhold til dette er det et behov i den kjente teknikk for å fremstille et renset, stabilt og termostabilt enzym som kan benyttes for å forbedre den ovenfor beskrevne diagnostiske forsterkningsprosess.

I henhold til dette tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en termostabil DNA-polymerase fra en termus specie som katalyserer dannelsen av en nukleinstreng som er komplementær til en nukleinsyretemplatstreng som benytter en polynukleo- tid- eller oligonukleotid primer annelert til templatet, og oppfinnelsen karakteriseres ved at polymerasen har en molekylvekt på 86 000 til 90 000 Dalton, bestemt ved SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese ved som molekylstandard å benytte fosforylase B (92 500 Dalton), bovinserumalbumin (66 200 Dalton) og ovalbumin (45 000 Dalton), forutsatt at hvis molekylvekten for fosforylase B er 97 400 er molekylvekten for den termostabile DNA-polymerase 90 000 til 94 000, og at polymerasen i det vesentlige er fri for kontaminerende, termostabil deoksyribonuklease-aktivitet.

Genet som koder enzymet fra DNA-polymerase fra Thermus aquaticus er også identifisert og tilveiebringer ytterligere en mulighet for å komme frem til det termostabile enzym ifølge oppfinnelsen. I tillegg til genet som koder det ca. 86000-90000 dalton enzym, tilveiebringes det også gen-derivater som koder DNA-polymeraseaktivitet.

Som nevnt innledningsvis angår oppfinnelsen også en DNA-sekvens som koder for en termostabil DNA-polymerase som beskrevet ovenfor og denne sekvens karakteriseres ved at den omfatter en DNA-del som er tilstede i et ca. 3,5 kb Bglll-Asp718 (partielt) restriksjonsfragment av [enten genomet av Thermus aquaticus eller] DNA av bakteriofag CH35:Taq#4-2 (ATCC nr. 40336).

Oppfinnelsen angår videre en vektor som karakteriseres ved at den omfatter en DNA-sekvens som beskrevet ovenfor, flankert av signal- og reguleringssekvenser. Fortrinnsvis er vektoren plasmid pFC85 (ATCC 67422), plasmid pFC83 (ATCC 67421) eller et plasmid omfattende et innskudd bestående av det ca. 750 bp BglII/HindiII-fragment av pFC83 (ATCC 67421) og det ca. 2,8 kb HindIII-Asp718 DNA innskudd av pFC85 (ATCC nr. 67422), eller bakteriofagen CH35:Taq#4-2 (ATCC nr. 40336).

Oppfinnelsen angår som nevnt også en mikroorganisme som karakteriseres ved at den er transformert med en DNA-sekvens som angitt ovenfor eller med en vektor som angitt ovenfor, og i stand til å uttrykke proteinet.

Fortrinnsvis er mikroorganismen en stamme av E.coli.

Til slutt angår oppfinnelsen et preparat som omfatter en termostabil DNA-polymerase som angitt ovenfor og en buffer og som karakteriseres ved at det videre omfatter en eller flere ikke-ioniske, polymere detergenser.

Det rensede enzym så vel som enzymene som fremstilles ved rekombinante DNA-teknikker tilveiebringer meget mer spesifisitet enn Klenow-fragmentet som ikke er termostabilt. I tillegg viser det rensede enzym og de rekombinantfremstilte enzymer de riktige aktiviteter som forventes når dTTP eller andre nukleotidtrifosfåter ikke er tilstede i inkuberings-blandingen med DNA-sjablonen. Videre har enzymene som her nevnes en bredere pH-profil enn den til det termostabile enzym fra Thermus aquaticus som beskrevet i litteraturen, idet mer enn 5056 av aktiviteten er ved pH 7 som ved pH 8. I tillegg kan det termostabile system som her beskrives lagres i en buffer med ikke-ioniske detergenter slik at det er stabilt og ikke mister aktiviteten i løpet av tiden.

Oppfinnelsens teknologi kan benyttes ved en fremgangsmåte for å forsterke en eller flere spesifikke nukleinsyresekvenser som er tilstede i en nukleinsyre eller en blanding derav ved bruk av primere og et termostabilt enzym. Ekstensjonsproduktet av en primer når den hybridiseres med andre blir en sjablon for fremstilling av den ønskede spesifikke nukleinsyresekvens og vice versa, og fremgangsmåten repeteres så ofte det er nødvendig for å fremstille den ønskede sekvens-mengde. Metoden som her beskrives forbedrer spesifisiteten av forsterkningsreaksjonen, resulterer i et meget distinkt signal av forsterket nukleinsyre. I tillegg eliminerer metoden behovet foroverføring av reagens fra en beholder til en annen etter hver forsterkningscyklus. Slik overføring er ikke nødvendig fordi det termostabile enzym vil motstå de høye temperaturer som er nødvendige for å denaturere nukleinsyrestrengene og trenger derfor ikke erstatning. Temperaturen ved sirkuleringen kan i tillegg automatiseres for ytterligere reduksjon i arbeidsinnsats og nødvendige trinn som er nødvendig for gjennomføring av forsterkningsreaksjonen.

Mer spesielt kan man benytte en fremgangsmåte for å forsterke minst en spesifikk nukleinsyresekvens inneholdt i en nukleinsyre eller en blanding av slike, hvori, hvis nukleinsyren er dobbeltstrenget, den består av to separate komplementære strenger av tilsvarende eller ikke tilsvarende lengde, idet denne fremgangsmåte omfatter: (a) å bringe hver nukleinsyrestreng i kontakt med fire forskjellige nukleotidtrifosfater og en oligonukleotidprimer for hver forskjellig spesifikke sekvens som forsterkes, idet hver primer er valgt til å være i det vesentlige komplementær til forskjellige strenger av hver spesifikke sekvens, slik at ekstensjonsproduktet som syntetiseres fra en primer, når denne separeres fra sitt komplementære produkt, kan tjene som sjablon for syntese av ekstensjonsproduktet av den andre primer, idet kontakten skjer ved en temperatur som fremmer hybridisering av hver primer mot dens komplementære nukleinsyrestreng; (b) å bringe hver nukleinsyrestreng samtidig med eller efter trinn (a) i kontakt med et termostabilt enzym som muliggjør kombinasjon av at nukleotidtrifosfåtene kan danne primerekstensjonsprodukter som er komplementære til hver streng av hver nukleinsyre; (c) å holde blandingen fra trinn (b) ved en effektiv temperatur i et effektivt tidsrom for å aktivere enzymet og å syntetisere, for hver forskjellig sekvens som forsterkes,

et ekstensjonsprodukt av hver primer som er komplementær til hver nukleinsyrestrengsjablon, men ikke så høy (temperatur) som separerer hvert ekstensjonsprodukt fra sin komplementære strengsjablon; (d) oppvarming av blandingen fra trinn (c) i et tidsrom og til en effektiv temperatur som separerer primerekstensjonsproduktene fra sjablonene på hvilke de ble syntetisert for derved å gi enkeltstrengede molekyler, men ikke så høyt (temperatur) til irreversibelt å denaturere systemet; (e) å avkjøle blandingen fra trinn (d) ved en effektiv temperatur i et tidsrom tilstrekkelig til å fremme hybridisering av hver primer til hvert av de enkeltstrengede molekylene som fremstilles i trinn (d); og (f) å holde blandingen fra trinn (e) ved en effektiv temperatur i et tilstrekkelig tidsrom til å fremme aktiviteten av enzymet og for å syntetisere, for hver forskjellig sekvens som forsterkes, et ekstensjonsprodukt av hver primer som er komplementært med hver nukleinsyrestrengsjablon som fremstilles i trinn (d), men ikke så høy (en temperatur) til å separere ekstensjonsproduktene fra den komplementære strengsjablon, idet trinnene (e) og (f) gjennomføres samtidig eller sekvensielt.

Trinnene (d), (e) og (f) kan gjentas inntil det ønskede nivå av sekvensforsterkning er oppnådd. Det foretrukne termostabile enzym er en polymerase som ekstraheres fra Thermus aquaticus (Taq-polymerase). Hvis, mer spesielt, enzymet er Taq-polymerase, blir i trinn (a) nukleinsyrestrengene bragt i kontakt med en buffer inneholdende ca. 1,5-2 mM av et magnesiumsalt, 150-200 >iM hver av nukleotidene og 1 jjM av hver primer, hvorved trinnene (a), (e) og (f) gjennomføres ved ca. 45-58°C, og trinn (d) gjennomføres ved ca. 90-100°C. I en foretrukket utførelsesform er nukleinsyren eller -syrene dobbeltstrenget og trinn (a) gjennomføres ved (i) å oppvarme hver nukleinsyre i nærvær av fire forskjellige nukleotidtrifosfater og en oligonukleotidprimer pr. forskjellig spesifikk sekvens som forsterket i et tidsrom og ved en temperatur som denaturerer hver nukleinsyre, hvorved hver primer velges til å være i det vesentlige komplementær til forskjellige strenger av hver spesifikke sekvens slik at ekstensjonsproduktet som syntetiseres fra en primer, når det separeres fra sin komplementær, kan tjene som sjablon for syntese av ekstensjonsproduktet av den andre primer; og (ii) avkjøling av de denaturerte nukleinsyrer til en temperatur som fremmer hybridisering av hver primer til den komplementære nukleinsyrestreng.

Oppfinnelsens teknologi finner anvendelse ved en fremgangsmåte for detektering av nærværet eller fraværet av minst en spesifikk nukleinsyresekvens i en prøve inneholdende en nukleinsyre eller en blanding av slike, eller å skille mellom to forskjellige sekvenser i prøven, hvorved prøven mistenkes for å inneholde sekvensen eller sekvensene, og hvori, hvis nukleinsyren(e) er dobbeltstrenget, hver består av to separerte komplementære strenger av lik eller ulik lengde, hvilken prosess omfatter trinnene (a) til (f) nevnt ovenfor som resulterer i en forsterkning i mengden av spesifikk nukleinsyresekvens(er), hvis disse er tilstede; (g) til produktet fra trinn (f) å sette en merket oligonukleotidprobe, for hver sekvens som detekteres, i stand til å hybridisere til nevnte sekvens eller til en mutant derav; og

(h) å bestemme hvorvidt hybridisering er skjedd.

Videre kan man benytte oppfinnelsens teknologi i en fremgangsmåte for detektering av nærværet eller fraværet av minst en nukleotidvariasjon i nærvær av en eller flere nukleinsyrer inneholdt i en prøve som, hvis nukleinsyren er dobbeltstrenget, består av to separate komplementære strenger av nesten lik lengde, hvilken prosess omfatter trinnene (a)-(f) nevnt ovenfor, idet trinnene (d), (e) og (f) gjentas et tilstrekkelig antall ganger til å resultere i påvisbar forsterkning av nukleinsyren som inneholder sekvensen hvis denne er tilstede; (g) å fiksere produktet fra trinn (f) på et membran; (h) behandling av membranet under hybridiseringsbetingelser med en merket sekvens-spesifisert oligonukleotidprobe i stand til å hybridisere med den forsterkede nukleinsyresekvens kun hvis en sekvens av proben er komplementær med et område av den ikke-forsterkede sekvens; og

(i) detektering hvorvidt proben hadde hybridisert til en

forsterket sekvens i nukleinsyreprøven.

Hvis prøven omfatter celler, blir de fortrinnsvis oppvarmet før trinn (a) for å eksponere nukleinsyrene deri mot reagen-sene. Dette trinn ungår ekstrahering av nukleinsyrene før reagenstilsetning.

I en variant av denne prosess blir primeren(e) og/eller nukleotidtrifosfater merket slik at den resulterende forsterkede sekvens er merket. Den eller de merkede primere og/eller nukleotidtrifosfater kan være tilstede i reaksjonsblandingen til å begynne med eller tilsettes under den senere cyklus. Det sekvens-spesifikke oligonukleotid (ikke merket) festes til et membran og merkes under hybridiseringsbetingelser med det merkede forsterkningsprodukt slik at hybridisering inntrer kun hvis den membran-bundne sekvens er tilstede i forsterkningsproduktet.

Videre kan man benytte oppfinnelsens teknologi i en fremgangsmåte for kloning inn i en kloningsvektor av en eller flere spesifikke nukleinsyresekvenser inneholdt i en nukleinsyre eller en blanding av nukleinsyrer, hvilken eller hvilke syrer, når de er dobbeltstrenget, består av to separerte komplementære strenger, og hvilke syrer forsterkes i mengde før kloning, idet denne prosess omfatter trinn (a) - (f) som nevnt ovenfor, der trinnene (d), (e) og (f) gjentas et tilstrekkelig antall ganger til å resultere i detekterbar forsterkning av nukleinsyren eller -syrene som inneholder sekvensen(e); (g) til produktet fra trinn (f) å sette et restriksjonsenzym for hvert restriksjonssete for å oppnå spaltnings-produkter i en restriksjonsnedbrytning; og (h) å ligere det eller de spaltede produkter fra trinn (g) inneholdende den eller de spesifikke sekvenser som skal klones inn i en eller flere kloningsvektorer inneholdende en promoter og en selekterbar markør. Til slutt kan man benytte oppfinnelsens teknologi i en fremgangsmåte for kloning inn i en kloningsvektor av en eller flere spesifikke nukleinsyresekvenser inneholdt i en nukleinsyre eller en blanding av slike, idet nukleinsyren eller -syrene, når de er dobbeltstrenget, består av to separerte komplementære strenger av lik eller ulik lengde hvilke syrer forsterkes i mengde før kloning, idet prosessen omfatter trinnene (a) - (f) som nevnt ovenfor, idet trinnene (d), (e) og (f) gjentas et tilstrekkelig antall ganger for derved å gi effektiv forsterkning av nukleinsyren eller-syrene som inneholder sekvensen(e) for stumpendet ligering inn i en eller flere kloningsvektor; og (g) ligering av den eller de forsterkede spesifikke sekvenser som skal klones oppnådd fra trinn (f), inn i en eller flere av de nevnte kloningsvektorer i nærvær av en ligase, hvorved forsterkede sekvenser og vektorer er tilstede i tilstrekkelige mengder til å bevirke ligering.

Man kan også tilveiebringe en stoffblanding som er brukbar ved forsterkning av minst en spesifikk nukleinsyresekvens inneholdt i en nukleinsyre eller en blanding av slike og omfattende fire forskjellige nukleotidtrifosfater og en oligonukleotidprimer for hver forskjellig spesifikk sekvens som forsterkes, hvorved hver primer er valgt til å være i det vesentlige komplementær til forskjellige strenger av hver spesifikke sekvens, slik at ekstensjonsproduktet som syntetiseres fra en primer når det separeres fra sitt komplement, kan tjene som en sjablon for syntese av ekstensjonsproduktet av den andre primer.

Videre kan man tilveiebringe en prøve av en eller flere nukleinsyrer omfattende multiple strenger av en spesifikk nukleinsyresekvens inneholdt i nukleinsyren eller -syrene. Prøven kan omfatte ca. 10-100 av strengene, ca. 100-1000 av strengene eller over 1000 av strengene.

Til slutt kan man tilveiebringe en forsterket nukleinsyresekvens fra en nukleinsyre eller en blanding av slike omfattende multiple kopier av sekvensen produsert ved den her beskrevne forsterkningsprosess. Figur 1 er et restriksjonssetekart av plasmid pFC83 som inneholder~4,5 kb Hindlll T. aquaticus DNA-innskuddet subklonet inn i plasmid BSM13+. Figur 2 er et restriksjonssetekart av plasmid pFC85 som inneholder~2,8 kb Hindlll til Asp718 T. aquaticus DNA-innskuddet subklonet inn i plasmid BSM13+.

Som her benyttet kan uttrykkene "celle", "cellelinje" og "cellekultur" benyttes avvekslende og alle slike angivelser inkluderer avkommet. Således inkluderer ordene "transformanter" eller "transformerte celler" de primære subjektceller og kulturer avledet derfra uten henblikk på antallet trans- formasjoner. Det skal også forstås at alt avkom ikke kan være nøyaktig identiske når det gjelder DNA-innhold, på grunn av tilsiktet eller utilsiktet mutasjon. Mutantavkom som har den samme funksjonalitet som påvist i de opprinnelige transformerte celler er inkludert.

Uttrykket "kontrollsekvenser" henviser til DNA-sekvenser som er nødvendige for eksprimering av en opererhart forbundet kodingssekvens i en spesiell vertsorganisme. Kontrollsekven-sene som er egnet for prokaryoter inkluderer for eksempel en promoter eventuelt en operatorsekvens, et ribosombindingssete og eventuelt andre ennå ikke helt ut forståtte sekvenser. Eukaryotiske celler er kjent å benytte promotere, polyadeny-leringssignaler og forbedrere.

Uttrykket "eksprimeringssystem" henviser til DNA-sekvenser som inneholder en ønsket kodingssekvens og kontrollsekvenser i opererbar binding, slik at verter transformert med disse sekvenser er i stand til å produsere de kodede proteiner. For å bevirke transformering kan eksprimeringssystemet være inkludert på en vektor, imidlertid kan det relevante DNA så også være integrert i vertskromosomet.

Uttrykket "gen" slik det her benyttes, henviser til en DNA-sekvens som koder et gjenvinnbart bioaktivt polypeptid eller en forløper. Polypeptidet kan kodes av en full-lengdegen-sekvens eller av en hvilken som helst del av kodingssekvensen så lenge den enzymatiske aktivitet bibeholdes.

"Opererbart forbundet" henviser til en posisjonering slik at den normale funksjon av komponentene kan gjennomføres. Således henviser en kodingssekvens "opererbart forbundet" til kontrollsekvenser, til en konfigurasjon der kodingssekvensene kan eksprimeres under kontroll av sekvensene.

"Ikke ioniske polymere detergenter" henviser til overflate-aktive midler som ikke har noen ioneladning og som for

oppfinnelsens formål karakteriseres ved sin evne til å stabilisere enzymet ved et pH-område fra ca. 3,5 til ca. 9,5 og fortrinnsvis fra 4 til 8,5.

Uttrykket "oligonukleotid" slik det her benyttes, defineres som et molekyl bestående to eller flere deoksyribonukleotider eller ribonukleotider, fortrinnsvis mer enn tre. Den eksakte størrelse vil avhenge av mange faktorer som i sin tur avhenger av den ultimate funksjon eller bruken av oligonukleotidet. Oligonukleotidet kan avledes syntetisk eller ved kloning.

Uttrykket "primer" slik det her benyttes henviser til et oligonukleotid, enten naturlig forekommende som i et renset restriksjonsnedbrytningsprodukt eller det kan være fremstilt syntetisk, som er i stand til å virke som et initieringspunkt for syntese når det bringes under betingelser hvori syntesen av et primerekstensjonsprodukt som er komplementært til en nukleinsyrestreng, induseres, det vil si i nærvær av fire forskjellige nukleotidtrifosfater og termostabilt enzym i en egnet buffer ("buffer" inkluderer pH-verdi, ionestyrke, kofaktorer, og så videre) og ved en egnet temperatur. For Taq-polymerase inneholder den angjeldende buffer fortrinnsvis 1,5-2 mM magnesiumsalt, fortrinnsvis MgCl2, 150-220 jjM av hvert nukleotid og 1 >jM av hver primer sammen med 550 mM KC1, 10 mM Tris-buffer, pH 8-8,4 og 100 ug/ml gelatin.

Primeren er fortrinnsvis enkeltstrenget for maksimal effektivitet ved forsterkning, men kan alternativt være dobbeltstrenget. Hvis den er dobbeltstrenget, blir primeren først behandlet for å separere strengene før de benyttes for å fremstille ekstensjonsproduktene. Fortrinnsvis er primeren et oligodeoksyribonukleotid. Primeren må være tilstrekkelig lang for å kunne gi syntese av ekstensjonsproduktene i nærvær av det termostabile enzym. De nøyaktige lengder av primerne vil avhenge av mange faktorer inkludert temperatur, primerkilde og måten metoden gjennomføres på. Avhengig av kompleksiteten av målsekvensen inneholder for eksempel oligonukleotid-primeren karakteristisk 15-25 nukleotider, selv om den kan inneholde flere eller færre slike. Korte primermolekyler krever generelt lavere temperaturer for å gi tilstrekkelige stabile hybridkomplekser med sjablon.

De heri angitte primere er valgt til å være "i det vesentlige" komplementære til de forskjellige strenger av hver spesifikk sekvens som skal forsterkes. Dette betyr at primerne må være tilstrekkelig komplementære til å hybridisere med sine respektive strenger. Derfor behøver primersekvensen ikke å reflektere den nøyaktige sekvens av sjablonen. For eksempel kan et ikke-komplementært nukleotid-fragment bindes til 5'-enden av primeren, mens resten av primersekvensen er komplementær til strengen. Alternativt kan ikke-komplementære baser eller lengre sekvenser bringes inn i primeren, forutsatt at primersekvensen har tilstrekkelig komplementaritet med sekvensen av strengen til å kunne forsterkes for å hybridisere med denne og derved danne en sjablon for syntese av ekstensjonsproduktet av den andre primer. For detekteringsformål, spesielt ved bruk av merkede sekvens-spesifikke prober, har primerne karakteristisk eksakt komplementaritet for å oppnå de beste resultater.

Som heri brukt henviser uttrykkene "restriksjonsendo-nukleaser" og "restriksjonsenzymer" til bakterielle enzymer, hvert av hvilke kutter dobbeltstrenget DNA ved eller nær en spesifikk nukleotidsekvens.

Som heri brukt betyr uttrykket "DNA polymorfi" den tilstand der to eller flere forskjelligenukleotidsekvenser kan eksistere ved et spesielt sete i DNA.

Som heri brukt betyr uttrykket "nukleotidvariasjon i sekvens" hvilke som helst enkle eller multiple nukleotidsubstitu-sjoner, utelatelser eller innskudd. Disse nukleotidvariasjoner kan være mutante eller polymorfe variasjoner. Derfor kan den heri beskrevne prosess detektere enkle nukleotid-endringer i nukleinsyrer slik de opptrer i p<->globingenetiske sykdommer forårsaket av enkeltbase mutasjoner, tilsetninger eller utelatelser (viss 3-talassemier, sigdcelleanemi, hemoglobin C mangler og så videre) så vel som multippel-base variasjoner slik de er involvert med cx-talassemi og visse p-talassemier. I tillegg kan de heri angitte prosesser detektere polymorfier som ikke nødvendigvis er forbundet med en sykdom, men heller en tilstand der to eller flere forskjellige nukleotidsekvenser (uansett som de har substi-tuerte, utelatte eller innskutte nukleotidbasepar) kan eksistere ved et spesielt sete i nukleinsyren i populasjonen, som med HLA-regioner av humangenomet og tilfeldige polymorfier slik som mitokondrial DNA. De polymorfe sekvens-spesifikke oligonukleotidprober som beskrives i detalj nedenfor kan benyttes for å detektere genetiske markører forbundet med en sykdom slik som insulin-avhengig diabetis mellitt eller i forensiske applikasjoner. Hvis nukleinsyren er dobbeltstrenget, blir nukleotidvariasjonen i sekvensen en baseparvariasjon i sekvens.

Uttrykket "sekvens-spesifikke oligonukleotider" henviser til oligonukleotider som vil hybridisere til spesifikke sekvenser uansett om de inneholdes på arveanlegg, hvilke sekvenser oversender baseparvariasjonen som detekteres og er spesifikk for sekvensvariasjonen som detekteres. Avhengig av sekvensene som analyseres, kan et eller flere sekvens-spesifikke nukleotider benyttes for hver sekvens slik det beskrives i større detalj nedenfor.

Som her benyttet, henviser uttrykket "restriksjonsfragment-lengde polymorfi", RFLP, til differanser mellom individer i lengden av restriksjonsfragmentene som dannes ved nedbrytning med en spesiell restriksjonsendonuklease.

Som her benyttet henviser uttrykket "termostabilt enzym" til et enzym som er stabilt mot varme og som er varmeresistent og katalyserer (letter) kombinasjonen av nukleotider på egnet måte for å danne primerekstensjonsproduktene som er komplementære til hver nukleinsyrestreng. Generelt vil syntesen initieres ved 3'-enden av hver primer og vil skride frem i 5'-retningen langs sjablonstrengen inntil syntesen avsluttes og derved gi molekyler med forskjellig lengde. Det kan imidlertid være et termostabilt enzym som initierer syntesen ved 5'-enden og går frem i den andre retning ved å bruke den samme prosessen som beskrevet ovenfor.

Det termostabile enzym må tilfredsstille et enkelt kriterium for å være effektivt for forsterkningsreaksjonen, det vil si at enzymet ikke irreversibelt må denatureres (inaktiveres) når det underkastes de forhøyede temperaturer i den tid som er nødvendig for å bevirke denaturering av dobbeltstrenget nukleinsyrer. Irreversibel denaturering for det heri angitte formål henviser til permanent og totalt tap av enzymatisk aktivitet. Oppvarmingsbetingelsene som er nødvendig for denaturering vil for eksempel avhenge av buffersaltkonsentra-sjonen og lengden og nukleotidsammensetningen av nukleinsyrene som denatureres, men ligger karakteristisk i området 90 til ca. 105" C i et tidsrom som hovedsakelig avhenger av temperaturen og nukleinsyrelengden, karakteristisk ca. 0,5 til 4 minutter. Høyere temperaturer kan tolereres efter hvert som buffersalt-konsentrasjonen og/eller GC-sammensetningen av nukleinsyren økes. Fortrinnsvis vil enzymet ikke bli irreversibelt denaturert ved ca. 90-100°C.

Det termostabile enzym som her beskrives har fortrinnsvis en optimal temperatur ved hvilken det virker som er høyere enn ca. 40°C, som er den temperatur under hvilken hybridisering av primeren til sjablon fremmes, selv om, avhengig av (1) magnesium- og saltkonsentrasjoner og (2) sammensetning og lengde av primeren, hybridisering kan skje ved høyere temperaturer, for eksempel 45-70°C. Jo høyere temperatur-optimum er for enzymet, jo høyere er spesifisiteten og/eller selektiviteten for den primerrettede ekstensjonsprosess. Imidlertid ligger enzymer som er aktive under 40°C, for eksempel ved 37°C, også innenfor rammen av oppfinnelsen forutsatt at de er varmestabile. Fortrinnsvis ligger de optimale temperaturområder fra ca. 50-90°C, og helst fra 60-80°C.

Det heri angitte termostabile enzym oppnås fra en Thermus-specie og er fortrinnsvis en DNA-polymerase som isoleres fra Thermus aquaticus. Forskjellige stammer derav er tilgjengelige fra ATCC og er beskrevet av T.D. Brock, "J. Bact."

(1969) 98:289-297, og av T. Oshima, "Arch. Microbiol." (1978) 117: 189-196. En av disse foretrukne stammer er YT-1.

For gjenvinning av det native protein dyrkes cellene ved bruk av en hvilken som helst egnet teknikk. En slik teknikk er beskrevet av Kaledin et al., "Biokhimiya" (1980), supra. Kort sagt blir cellene dyrket på et medium i 1 liter nitriloeddiksyre (100 mg), trypton (3 g), gjærekstrakt (3 g), ravsyre (5 g), natriumsulfitt (50 mg), riboflavin (1 mg), K2HP04(522 mg), MgS04(480 mg), CaCl2(222 mg), NaCl (20 mg) og spor-elementer. pH-verdien i mediet justeres til 8,0 ± 0,2 med KOH. Utbyttet økes hvis det dyrkes med heftig beluftning opptil 20 g/l celler ved en temperatur av 70°C. Celler i det sene logaritmiske trinn (bestemt ved absorbans ved 550 nm) samles ved sentrifugering, vaskes med en buffer og lagres frosne ved -20°C.

I en annen metode for dyrking av cellene som beskrevet av Chien et al., "J. Bacteriol." (1976), supra, blir det benyttet et definert mineralsaltmedium inneholdende 0,3$ glutaminsyre supplert med 0,1 mg/l biotin, 0,1 mg/l tiamin og 0,05 mg/l nikotinsyre. Saltene inkluderer nitriloeddiksyre, CaS04, MgS04, NaCl, KN03, NaN03, ZnS04, H3B03, CuS04, NaMo04, C0CI2, FeCl3, MnS04og Na2HP04. pH-verdien for dette medium justeres til 8,0 med NaOH.

I henhold til Chien et al. blir cellene til å begynne med dyrket ved 75 "C i en vannbadryster. Når man har nådd en viss densitet, blir 1 liter av disse celler overført til 16-liters beholdere som anbringes i varmluft-inkubatorer. Steril luft bobles gjennom kulturene og temperaturen holdes ved 75°C. Cellene tillates å vokse i 20 timer før de samles ved sentrifugering.

Ef ter cellevekst, skjer isolasjon og rensing av enzymet i seks trinn, hvert av hvilket gjennomføres ved en temperatur under romtemperatur og fortrinnsvis ca. 4°C.

I det første trinn blir cellene hvis de er frosne tint opp, desintegrert ved hjelp av ultralyd, suspendert i en buffer ved ca. pH 7,5 og sentrifugert.

I det andre trinn blir supernatanten samlet og så fraksjonert ved tilsetning av et salt slik som tørt ammoniumsulfat. Den egnede fraksjon (karakteristisk 45-75$ metning) samles, oppløses i en 0,2 kaliumfosfatbuffer fortrinnsvis ved pH 6,5, og dialyseres så mot den samme buffer.

Det tredje trinn fjerner nukleinsyrer og noe protein. Fraksjonen fra det andre trinn tilføres til en DEAE-cellulosekolonne som er ekvilibrert med den samme buffer som benyttet ovenfor. Kolonnen vaskes med den samme buffer og gjennomløpsproteinholdige fraksjoner, bestemt ved absorbans ved 280 nm, samles og dialyseres mot en 10 mM kaliumfosfatbuffer, fortrinnsvis med de samme bestanddeler som den første buffer, men ved en pH-verdi på 7,5.

I det fjerde trinnet blir den således samlede fraksjon bragt på en hydroksyapatittkolonne som er ekvilibrert med bufferen som benyttes for dialyse i det tredje trinn. Kolonnen vaskes så og enzymet elueres med en lineær gradient av en buffer slik som 0,01 til 0,5 M kaliumfosfat ved pH 7,5 inneholdende 10 mM 2-merkaptoetanol og 5$ glyserin. De sammenslåtte fraksjoner som inneholder termostabil enzym(for eksempel DNA-polymerase )aktivitet dialyseres mot den samme buffer som benyttes for dialysen i det tredje trinn.

I det femte trinn blir den dialyserte fraksjon bragt på en DEAE-cellulosekolonne, ekvilibrert med bufferen som benyttes for dialyse i det tredje trinn. Kolonnen blir så vasket og enzymet eluert med en lineær gradient av en buffer som 0,01 til 0,6 M KC1 i buffere som benyttes for dialyse i det tredje trinn. Fraksjoner med termostabil enzymaktivitet blir så prøvet for forurensende deoksyribonukleaser (endo- og eksonukleaser) ved bruk av en hvilken som helst egnet prosedyre. For eksempel kan endonuklease-aktiviteten bestemmes elektroforetisk fra en endring i molekylvekten av fag-X-DNA eller superviklet plasmid-DNA efter inkubering med et overskudd av DNA-polymerase. På tilsvarende måte kan eksonuklease-aktiviteten bestemmes elektroforetisk fra endringen i molekylvekt av DNA efter behandling med et restriksjonsenzym som spalter ved flere seter.

Fraksjonene som bestemmes til ikke å ha noen deoksyribonuklease-aktivitet slås sammen og dialyseres mot den samme buffer som benyttes i det tredje trinn.

I det sjette trinn blir de sammenslåtte fraksjoner anbragt på en fosforcellulosekolonne med et gitt sjiktvolum. Kolonnen vaskes og enzymet elueres med en lineær gradient av en buffer slik at 0,01 til 0,4 M KC1 foreligger i en kaliumfosfatbuffer ved pH 7,5. De sammenslåtte fraksjoner har termostabil polymerase-aktivitet og ingen deoksyribonuklease-aktivitet dialyseres mot en buffer ved pH 8,0.

Molekylvekten for det dialyserte produkt kan bestemmes på en hvilken som helst kjent teknikk, for eksempel ved SDS PAGE ved bruk av proteinmolekylvektmarkører. Molekylvekten for noen av de foretrukne enzymer, det DNA-polymerase som renses fra Thermus aquaticus, bestemmes ved den ovenfor angitte metode til ca. 86000-90000 dalton.

Det termostabile enzym ifølge oppfinnelsen kan også fremstilles ved en rekombinant DNA-teknikk, da genet som koder dette enzym er klonet fra Thermus aquaticus genom DNA. Den totale kodingssekvens for Thermus aquaticus (Taq)-polymerase kan avledes fra bakteriofagen CH35:Taq#4-2 på et egnet 3,5 kilobase (kb) BglII-Asp718 (partielt) restriksjonsfragment inneholdt i et~18 kb genom DNA-innskuddsfragment. Denne bakteriof ag er deponert ved ATCC 29. mai 1987 under nr. 40.336. Alternativt kan genet konstrueres ved å ligere et ca. 750 basepar, bp, Bglll-Hindlll-restriksjonsfragment isolert fra plasmid pFC83 (ATCC 67.422 deponert 29. mai 1987) til et~2,8 kb HindIII-Asp718-restriksjonsfragment som er isolert fra plasmid pFC85 (ATCC 67.421 deponert 29. mai 1987). pFC83-restriksjonsfragmentet omfatter aminoterminus av Taq-polymerasegenet, mens restriksjonsfragmentet fra pFC85 omfatter karboksylterminus. Således vil ligering av disse to fragmenter til en tilsvarende nedbrutt vektor med egnede kontrollsekvenser resultere i translatering av en full-lengde Taq-polymerase .

Det er også funnet at hele kodesekvensen til Taq-polymerasegenet ikke er nødvendig for å gjenvinne et biologisk aktivt genprodukt med den ønskede enzymatiske aktivitet. Amino-terminal-utelatelser der omtrent en tredjedel av den kodende sekvens er fraværende, har resultert i fremstilling av et genprodukt som er heller aktivt i polymeraseanalyser.

I tillegg til N-terminalutelatelsene kan individuelle aminosyrerester i peptidkjeden som omfatter Taq-polymerase modifiseres ved oksydasjon, reduksjon eller andre derivati-seringer, og proteinet kan spaltes for å oppnå fragmenter som bibeholder aktiviteten. Slike endringer som ikke ødelegger aktiviteten fjerner ikke den DNA-sekvens som koder et slikt protein fra genets definisjon.

Således kan modifikasjoner til den primære struktur i seg selv ved utelatelse, tilsetninger eller endringer av amino-syrene som innarbeides i sekvensen under translasjonen, gjennomføres uten å ødelegge proteinets aktivitet. Slike substitusjoner eller endringer resulterer i proteiner med en aminosyresekvens som kodes av DNA som ligger innenfor oppfinnelsens tilsiktede område.

Polyklonalt antiserum fra kaniner som er immunisert med renset 86000-90000 dalton polymerase ifølge oppfinnelsen, ble brukt for å avsøke et Thermus aquaticus partielt genom eksprimeringsbibliotek for å oppnå den egnede kodesekvens som beskrevet nedenfor. Den klonede genomsekvens kan eksprimeres som et fusjonspolypeptid, eksprimert direkte ved bruk av sine egne kontrollsekvenser, eller eksprimert ved konstruksjoner ved bruk av kontrollsekvenser som er egnet for den spesielle vert som benyttes for eksprimering av enzymet.

Selvfølgelig gir tilgjengeligheten av DNA-koding av disse sekvenser muligheten til å modifisere kodonsekvensen slik at man oppnår muteine former som også har DNA-polymerase-aktivitet.

Således kan disse verktøy gi den totale kodingssekvens for Taq-DNA-polymerase hvorfra eksprimeringsvektorer som kan benyttes på et antall vertssystemer, kan konstrueres, og kodingssekvensen eksprimeres.

Det er også klart fra det foregående at deler av den Taq-polymerasekodende sekvens er brukbare som prober for å spore opp andre termostabile polymerasekodende sekvenser i et antall arter. I henhold til dette kan deler av det genome DNA som koder minst seks aminosyre replikeres i E. coli og de denaturerte former benyttes som prober eller oligodeoksy-ribonukleotidprober kan syntetiseres som koder minst seks aminosyrer og benyttes for å oppspore ytterligere DNA'er som koder en termostabil polymerase. Fordi det ikke kan være en helt eksakt tilpasning mellom nukleotidsekvensen i Thermus aquaticus-formen og den i den tilsvarende del i andre arter, er oligomerer inneholdende ca. 18 nukleotider (som koder de seks aminosyrestrek) sannsynligvis nødvendig for å oppnå hybridisering under betingelser med tilstrekkelig stringens til å eliminere falske positiver. Sekvensene som koder seks aminosyrer vil gi informasjon tilstrekkelig for slike prober.

Generelt involverer fremstilling av en rekombinant form av Taq-polymerase karakteristisk følgende: For det første oppnås det et DNA som koder det mature (her benyttet til å inkludere alle muteiner) enzym eller en fusjon av Taq-polymerasen til en ytterligere sekvens som ikke ødelegger dets aktivitet eller til en ytterligere sekvens som er spaltbar under kontrollerte betingelser (slik som behandling med peptidase) for derved å gi et aktivt protein. Hvis sekvensen er uavbrutt av introner, er den egnet for eksprimering i en hvilken som helst vert. Denne sekvens bør foreligge i oppskjærbar og gjenvinnbar form.

Den oppskårede og gjenvunnede kodingssekvens blir så fortrinnsvis anbragt i en opererbar forbinding med egnede kontrollsekvenser i en replikerbar eksprimeringsvektor. Denne benyttes for å transformere en egnet vert og den transformerte vert dyrket under gunstige betingelser for å bevirke fremstilling av den rekombinante Taq-polymerase. Eventuelt blir Taq-polymerasen isolert fra mediet eller fra cellene, gjenvinning og rensing av proteinet behøver ikke nødvendigvis skje i enkelte tilfeller der man kan tolerere noen urenheter.

Hvert av de foregående trinn kan skje på et antall måter. For eksempel kan den ønskede kodingssekvens oppnås fra genome fragmenter og benyttes direkte i egnede verter. Konstruk-sjonene for eksprimeringsvektorene som er opererbare i et antall verter fremstilles ved bruk av egnede replikoner og kontrollsekvenser som angitt nedenfor. Egnede restriksjonsseter kan, hvis ikke vanligvis tilgjengelige, settes til endene av kodingssekvensene for å gi et utskjærbart gen for innskyting i disse vektorer.

Kontrollsekvenser, eksprimeringsvektorer og transformerings-metodene er avhengige av vertscellen som benyttes for å eksprimere genet. Generelt kan prokaryotiske, gjær-, insekt-ener pattedyrceller være nyttige som verter. Prokaryotiske verter er generelt de mest effektive og hensiktsmessige for fremstilling av rekombinante proteiner og er derfor foretrukket for eksprimering av Taq-polymerase.

I det spesielle tilfellet som gjelder Taq-polymerase antyder funn at betydelig utelatelse av N-terminus av proteinet kan skje under både rekombinante og native betingelser, og at aktiviteten av proteinet fremdeles bibeholdes. Det synes som om de native proteiner som isoleres kan være resultatet av proteolytisk nedbrytning og ikke translasjon av et avstumpet gen. Muteinet som fremstilles fra det avstumpede gen av plasmid pFC85 er imidlertid helt ut aktivt i analyser for DNA-polymerase slik det er som fremstilles fra DNA som koder full-lengdesekvensen. Fordi det er klart at visse N-terminal-avkortede former er aktive, kan genkonstruktene benyttes eller eksprimering av polymerasen også inkludere den tilsvarende avkortede form av den kodende sekvens.

Prokaryoter representeres hyppigst ved forskjellige stammer av E. coli. Imidlertid kan andre mikrobielle stammer også benyttes som basiller, for eksempel Bacillus subtilis, for-skjelliger arter av Pseudomonas, eller andre bakterie-stammer. I slike prokaryotiske systemer, benyttes plasmidvektorer som inneholder replikeringsseter og kontrollsekvenser avledet fra en art som er kompatibel med verten. For eksempel blir E. coli karakteristisk transformert ved bruk av derivater av pBR322, et plasmid avledet fra en E. coli art av Bolivar et al., "Gene" (1977) 2:95. pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetracyklin-resistens og gir således ytteligere markører som enten kan bibeholdes eller ødelegges ved konstruering av den ønskede vektor. Generelt brukte prokaryotiske kontrollsekvenser som her er definert til å inkludere promotere for transkripsjonsinitiering, spesielt med en operator, sammen med ribosom-bindingssetesekvenser, inneholder slike generelt benyttede promotere som ø-laktamase (penicillinase)- og laktose (lac)-promotersystemene (Chang, et al., "Nature" (1977) 198:1056). tryptofan (trp)-promotersystem Goeddel et al., "Nucleic Acids Res." (1980) 8:4057) og X-avledet PL-promoter (Shimatake, et al., "Nature" (1981) 292:128) og N-gene ribosombindingssete, som er gjort brukbar som en bærbar kontrollkassett, som omfatter en første DNA-sekvens som er P^-promoteren, opererbart forbundet med en andre DNA-sekvens som tilsvarer NRB<g><opp>strøms en tredje DNA-sekvens med minst et restriksjonssete som tillater spalting innen seks bp 3'fra N^gg-sekvensen. Også brukbar er fosfatase A (phoA)-systemet som beskrives av Chang et al., i EP publ. 0 196 864, idet ethvert tilgjengelig promotersystem som er kompatibelt med prokaryoter kan anvendes.

I tillegg til bakterier kan eukaryotiske mikrober som gjær også benyttes som verter. Laboratoriestammer av Saccharomyces cerevisiae, bakegjær, er hyppigst benyttet selv om et antall andre stammer er generelt tilgjengelige. Mens vektorer som benytter 2 pm opprinnelsen av relikonet er vist (Broach, J.R., "Meth. Enz." (1983) 101:307), er det kjent andre plasmidvektorer som egnes for gjæreksprimering (se for eksempel Stinchcomb et al., "Nature" (1979) 282:39. Tschempe et al., "Gene" (1980) 10:157 og Clarke, L. et al., "Meth. Enz." (1983) 101:300). Kontrollsekvenser for gjær-vektorer inkluderer promotere for syntesen av glycolytiske enzymer (Hess et al., "J. Adv. Enzyme Reg." (1968) 7:149; Holland et al., "Biotechnology" (1978) 17:4900).

Ytterligere promotere som er kjent i denne teknikk inkluderer promoteren for 3-fosfoglyseratkinase (Hitzeman et al., "J. Biol. Chem. (1980) 255:2073), og de for andre glycolytiske enzymer slik som glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase, heksokinase, pyruvat-dekarboksylase, fosfofruktokinase, glucose-6-fosfatisomerase, 3-fosforglyseratmutase, pyruvat-kinase, triosefosfatisomerase, fosfoglucoseisomerase og glucokinase. Andre promotere som har den ytterligere fordel ved transkripsjon kontrollert ved vekstbetingelsene er promoterregionene for alkohol-dehydrogenase 2, isocytokrom C, sur fosfatase, degradative enzymer forbundet med nitrogen-metabolisme, og enzymer som er ansvarlige for mal tose- og galktose-utnyttelse (Holland, supra).

Det antas også at terminatorsekvenser er ønskelige i 3'-eden av kodingssekvensene. Slike terminatorer finnes i den 3'-ikke-translaterte region som følger kodingssekvensene i gjæravledede gener. Mange av vektorene som illustreres inneholder kontrollsekvenser avledet fra enolasegenet som inneholder plasmid peno46 (Holland, M.J., et al., "J. Biol. Chem." (1981) 256:1385) eller LEU2-genet oppnådd fra YEpl3 (Broach, J., et al., "Gene" (1978) 8:121); imidlertid er enhver vektor inneholdende en gjærkompatibel promoter som er replikeringsopprinnelse, og andre kontrollsekvenser, egnet.

Det er også selvfølgelig mulig å eksprimere gener som koder polypeptider i eukaryotiske vertscellekulturer avledet fra multicellulære organismer, se for eksempel "Tissue Culture", Academic Press, Cruz og Patterson, utg. (1973). Brukbare vertscellelinjer inkluderer murinmyelomer N51-, VERO- og HeLa-celler, og CHO-celler. Eksprimeringsvektorer for slike celler inkluderer vanligvis promotere og kontrollsekvenser som er kompatible med pattedyrceller som for eksempel de generelt brukte tidlige og sene promotere fra Simian Virus 40 (SV 40) (Fiers et al., "Nature" (1978) 273:113) eller andre virale promotere slik som de som er avledet fra polyom, adenovirus 2, bovinpapilomvirus eller aviansarkomvirus, eller immunoglobulin-promotere og varmesjokkpromotere. Et system for eksprimering av DNA i pattedyrsystemer ved bruk av BPV som vektor er beskrevet i US 4.419.446, mens en modifikasjon er beskrevet i US 4.601.978. Generelle aspekter for pattedyr-cellevertssystemtransformering er beskrevet av Axel i US 4.399.216. Det synes nå også som om "forbedrer"-området er viktig ved optimalisering av eksprimering; disse er generelt sekvenser som finnes oppstrøms promoterregionen. Replika-sjonsoppfinnelse kan oppnås hvis nødvendig fra virale kilder. Imidlertid er integreringen i kromosomet en vanlig mekanisme for DNA-replikering i eukaryoter.

Planteceller er også nå tilgjengelige som verter og kontrollsekvenser som er kompatible med planteceller som nopalin-syntasepromoteren og polyadenyleringssignalsekvensen (Depicker, A., et al., "J. Mol. Appl. Gen." (1982) 1:561) er tilgjengelige.

I tillegg er det i den senere tid beskrevet eksprimerings-systemer som benytter insektceller under anvendelse av kontrollsystemene som tilveiebringes av bakulovirus-vektorer som beskrevet av Miller et al., i "Genetic Engineering"

(1986) Setlow, J.K. et al., utg., Plenum Publishing, vol. 8, s. 277-297). Disse systemer er også brukbare ved fremstilling av Taq-polymerase.

Avhengig av den benyttede vertscelle skjer transformeringer ved bruk av standardteknikker som er egnet for slike celler. Kalsiumbehandlingen benytter kalsiumklorid som beskrevet av Cchen, S.N., "Proe. Nati. Acad. Sei. (USA)" (1972) 69:2110 for prokaryoter eller andre celler som inneholder vesentlige celleveggbarrierer. Infeksjon med Agrobacterium tumefaciens (Shaw, C.H. et al., "Gene" (1983) 23:315) benyttes for visse planteceller. For pattedyrceller uten slike cellevegger foretrekkes kalsiumfosfatprecipiteringsmetoden i henhold til Graham og van der Eb, "Virology" (1978) 52:546. Transformeringer til gjær gjennomføres i henhold til Van Solingen, P., et al., "J. Bact." (1977) 130:946 og Hsiao, C.L., et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. (USA)" (1979) 76:3829.

Strategien for isolering av DNA som koder ønskede proteiner som Taq-polymerase som koder DNA ved bruk av den bakteriofage vektoren X gtll som følger. Et bibliotek kan konstrueres av EcoRI-flankerte Alul-fragmenter, generert ved total nedbrytning av Thermus aquaticus DNA, innskutt ved EcoRI-seter i X gtll fagen (Young og Davis, "Proe. Nati. Acad. Sei USA"

(1983) 80:1194-1198). Fordi det unike EcoRI-setet i denne bakteriofag befinner seg i karboksyl-terminus av p<->galakto-sidasegenet, blir innskutt DNA (i egnet ramme og orientering) eksprimert som protein sammenføyet med p<->galaktosidase under kontroll av laktoseoperon-promoter/operator.

Genomeksprimeringsbiblioteker blir så avsøkt ved bruk av antistoff-plaque-hybridiseringsprosedyren. En modifisering av denne prosedyre, kalt "det epitope utvalg", benytter antiserum mot fusjonsproteinsekvensen som koder fagen for å bekrefte identifisering av de hybridiserte plaquer. Således kan dette bibliotek av rekombinante fager avsøkes med antistoffer som erkjenner 86000-90000 dalton Taq-polymerasen for å identifisere fagen som bærer DNA-segmentene som koder de antigenetiske determinanter av dette protein.

Ca. 2 x 10^ rekombinante fager avsøkes ved bruk av total kanin-Taq-polymerase antiserum. Ved denne primæravsøkning blir positive signaler detektert og en eller flere av disse plaquer renses fra kandidatplaquer som ikke lykkedes å reagere med preimmunserum og reagerte med immunserum og som ble analysert i en viss detalj. For å undersøke fusjons-proteinene som fremstilles av den rekombinante fag ble det fremstilt lysogener av fagen i verten Y1089. Ved induksjon av lysogenene og gelelektroforese av de resulterende proteiner kan hvert lysogen observeres til å fremstille et nytt protein, ikke funnet i de andre lysogener, eller det kan oppstå duplikatsekvenser. Fag innholdende positive signaler plukkes ut; i dette tilfellet ble en positiv plaque plukket ut for ytterligere identifisering og replatert ved lavere densiteter for å rense rekombinanter og de rensede kloner ble analysert på grunn av størrelsesklasse via nedbrytning med EcoRI-restriksjonsenzym. Prober kan så fremstilles fra de isolerte DNA-inskuddssekvenser og merkes på hensiktsmessig måte og disse prober kan benyttes i konvensjonell koloni-ener plaquehybridiseringsanalyse som beskrevet av Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982).

Den merkede probe ble benyttet for å avsøke et andre genombibliotek som er konstruert i en Charon 35 bakteriofag (Wilhelmine, A.M. et al., "Gene" (1983) 26:171-179). Dette bibliotek ble fremstilt fra Sau3A partiell nedbrytning av den genomiske Thermus aquaticus DNA og størrelsesfraksjonerte fragmenter på 15-20 kb ble klonet inn i BamHI-setet av Charon 35-fagen. Proben ble benyttet for å isolere fagholdig DNA som koder Taq-polymerasen. Et av de resulterende fager, kalt CH35:Taq#4-2, ble funnet å inneholde hele gensekvensen. Partielle sekvenser som kodet deler av genet ble også isolert.

Konstruksjon av egnede vektorer inneholdende de ønskede kodings- og kontrollsekvenser benytter standard ligerings- og restriksjonsteknikker som er godt kjente. Isolerte plasmider, DNA-sekvenser eller syntetiserte oligonukleotider spaltes, syes sammen og religeres i ønsket form.

Sete-spesifikk DNA-spalting gjennomføres ved behandling med et eller flere egnede restriksjonsenzymer under betingelser som generelt er forstått i denne teknikk, detaljer oppnås fra leverandøren av enzymene. Generelt blir ca. 1 jjg plasmid eller DNA-sekvens spaltet av en enhet enzym i ca. 20 pl bufferoppløsning; i de heri gitte eksempler benyttes karakteristisk et overskudd av restriksjonsenzym for å sikre total nedbrytning av DNA-substratet. Inkuberingstider på ca. 1 til 2 timer ved ca. 37° C kan benyttes, selv om variasjoner kan tolereres. Efter hver inkubering blir proteinet fjernet ved ekstrahering med fenol/kloroform og kan følges av eterekstra- hering, og nukleinsyren fjernes fra vandige fraksjoner ved precipitering med etanol. Hvis ønskelig kan størrelses-separering av de spaltede fragmenter gjennomføres ved polyakrylamidgel- eller agarosegelelektroforese ved bruk av standardteknikker. En generell beskrivelse av størrelses-separering finnes i "Methods in Enzymology" (1980) 65:499-560.

Eestriksjonsspaltede fragmenter kan være stumpendede ved behandling med det store fragment av E. coli DNA polymerase I (Klenow) i nærvær av de fire deoksynukleotidfosfater, dNTP'er, ved bruk av inkuberingstider på ca. 15-25 minutter ved 20-25°C i 50 mM Tris, pH 7,6, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT og 50-100 jjM dNTP'er. Klenow-fragmentene fyller inn på de 5'-klebrige ender, men tygger tilbake fremragende 3'-enkeltstrenger, selv om de fire dNTP'er er tilstede. Hvis ønskelig kan selektiv reparering gjennomføres ved å supplere kun en av de, eller en utvalgt, dNTP, innenfor de begrens-ninger som dikteres av arten av de klebrige strenger. Efter behandling med Klenow, blir blandingen ekstrahert med fenol/- kloroform og etanol precipitert. Behandling under egnede betingelser med Sl-nuklease resulterer i hydrolyse av et hvilket som helst enkeltstrenget protein.

Syntetiske oligonukleotider kan fremstilles ved bruk av triestermetoden i henhold til Matteucci, et al., ("J. Am. Chem. Soc." (1981) 103: 3185-3191) eller ved bruk av automatiserte syntesemetoder. Kinasering av enkeltstrengene før sammenføyning eller for merking oppnås ved bruk av et overskudd, for eksempel ca. 10 enheter polynukleotidkinase til 1 nM substrat i nærvær av 50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 1-2 mM ATP. Hvis kinasen skal merke proben, vil ATP inneholde en høy spesifikk aktivitet"v-<32>p.

Liger inger gjennomføres i 15-30 jil volumer under de følgende standardbetingelser og temperaturer: 20 mM Tris-Cl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 33 >Jg/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl og enten 40 jjM ATP, 0,01-0,02 (Weiss) enheter T4 DNA-ligase ved 0°C (for "klebrig ende"-ligering) eller 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss) enheter T4-DNA-ligase ved 14° C (for "stump-endet" ligering). Intermolekylar "klebrig ende"-ligeringer er vanligvis foretrukket ved 33-100 pg/ml total DNA-konsentrasjoner (5-100 nM total ende-konsentrasjon). Intermolekylar stump-ende-ligering (vanligvis under anvendelse av 10-30 gangers molart overskudd av forbindere) gjennomføres ved 1 >jM total ende-konsentrasj on.

Ved vektorkonstruering ved bruk av "vektorfragmenter", blir vektorfragmentet vanligvis behandlet med bakteriell alkalisk fosfatase, BAP, for å fjerne 5'-fosfatet og forhindre religering av vektoren. BAP-nedbrytning gjennomføres ved pH 8 i ca. 150 mM Tris i nærvær av Na<+>og Mg<+>^ ved bruk av ca. 1 enhet BAP pr. mg vektor ved 60°C i ca. 1 time. For å gjenvinne nukleinsyrefragmentene blir preparatet ekstrahert med fenolrkloroform og etanol precipitert. Alternativt kan religering gjennomføres i vektorer som er dobbelt nedbrutt ved ytterligere restriksjonsenzymnedbrytning av de ikke-ønskede fragmenter.

For andeler av vektorer som avledes fra cDNA eller genom-DNA som kan kreve sekvensmodifisering, benyttes sete-spesifikke primer-rettet mutagenese. Denne teknikk er nå standard og gjennomføres ved bruk av et primersyntetisk oligonukleotid som er komplementært med en enkeltstrenget fag-DNA til å kunne mutageniseres bortsett fra begrenset mistilpasning, som representerer den ønskede mutasjon. Kort sagt blir det syntetiske oligonukleotid benyttet som en primer for å rette syntese av en streng, komplementær til fagen, og den resulterende dobbeltstrengede DNA transformeres til en fag-inneholdende vertsbakterie. Kulturer av den transformerte bakterie plateres i toppagar, tillates plaquedannelse fra enkelte celler som inneholder fagen.

Teoretisk vil 50$ av de nye plaquer inneholde fagen med som enkeltstreng den muterte form; 50$ vil ha den opprinnelige sekvens. Plaquene overføres til nitrocellulosefiltre og "liftene" hybridiseres med kinasert syntetisk primer ved en temperatur som tillater hybridisering av en eksakt tilpasning, men ved hvilken en mistilpasning med den opprinnelige streng er tilstrekkelig til å forhindre hybridisering. Plaquer som hybridiserer med proben heves så ut og dyrkes og dette DNA gjenvinnes.

Ved konstruksjonen som angis nedenfor, blir korrekt ligering for plasmidkonstruksjonen bekreftet ved først å transformere E. coli stamme MM294, eller en annen vert, med ligerings-blandingen. Vellykkede transformanter velges ved hjelp av ampicillin-, tetracyklin eller annen antibiotisk resistens eller ved bruk av andre markører, avhengig av måten for plasmidkonstruksjoner slik man vet i denne teknikk. Plasmider fra transformantene fremstilles så i henhold til Clewell, D. B., et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. (USA)", (1969) 62:3.159, eventuelt efter kloramfenikol-forsterkning (Clewell, D.B., "J. Baceteriol.", (1972) 110:667). Den isolerte DNA analyseres ved restriksjon og/eller sekvenseres ved dideoksy-metoden ifølge Sanger, F., et al., "Proe. Nati. Acad. Sei.

(USA)", (1977), 74:5463, som videre beskrevet av Messing, et al., "Nucleic Acids Res.", (1981) 9:309, eller ved metoden ifølge Maxam, et al., "Methods in Enzymology" (1980) 65:499.

Vertsstammene som benyttes ved kloning og eksprimering er som følger: For kloning og sekvensering og for eksprimering av konstruk-ter under kontroll av de fleste bakterielle promotere, blir E. coli stamme MM294 oppnådd fra E. coli Genetic Stock Center GCSC #6135, benyttet som vert. For eksprimering under kontroll av<P>i<N>rbs Promo"ter» E. coli stamme K12 MC1000 X lysogen, kan N7<N>53cl857 Sus<P>80, ATCC 39531 benyttes. Her er det benyttet E. coli DG116 som ble deponert ved ATCC 7. april 1987, ATCC 53606.

For M13-fagrekombinantene benyttes E. coli stammer som er følsomme overfor faginfeksjon som E. coli K12 stamme DG98. DG98-stammen er deponert ved ATCC 13. juli 1984 under nummeret 39768.

Pattedyreksprimering kan gjennomføres i C0S-7, C0S-A2, CV-1 og murinceller, og insektcelle-basert eksprimering i Spodoptera frugipeida.

For langtidsstabilitet må det heri nevnte enzym lagres i en buffer som inneholder en eller flere ikke-ioniske polymere detergenter. Slike er generelt de som har en molekylvekt innen området ca. 100 til 250000 og fortrinnsvis ca. 4000 til 200000 dalton og stabiliserer enzymet ved en pH-verdi fra ca. 3,5 til 9,5 og fortrinnsvis 4 til 8,5. Eksempler på slike detergenter inkluderer de som er spesifisert på sidene 295-298 i MuCutcheons "Emulsifiers & Detergents", North American utgave (1983) utgitt av the McCutcheon Division of MC Publishing Co., 175 Rock Road, Glen Rock, NJ (USA). Fortrinnsvis velges detergentene fra gruppen som omfatter etoksylerte fettalkoholetere og lauryletere, etoksylerte alkylfenoler, oktylfenoksypolyetoksyetanolforbindelser, modifiserte oksyetylerte og/eller oksypropylerte rettkjedede alkoholer, polyetylenglykolmonooleatforbindelser, polysorbat-forbindelser, og fenoliske fettalkoholetere. Mer spesielt foretrukket er "Tween 20", et 20 polyoksyetylert sorbitan-monolaurat og "Iconol" NP-40, et etoksylert alkylfenol-(nonyl).

Det termostabile enzym ifølge oppfinnelsen kan benyttes for et hvilket som helst formål, der et slikt enzym er nødvendig eller ønskelig. I en spesielt foretrukket utførelsesform benyttes det heri angitte enzym i den nedenfor angitte forsterkningsprotokoll.

Forsterkningssprotokollen som benytter enzymet ifølge oppfinnelsen kan være en prosess for forsterkning av eksisterende nukleinsyresekvenser som beskrevet i EP 0 200 362. Fortrinnsvis blir imidlertid det heri benyttede enzym benyttet i forsterkningsprosessen som angitt nedenfor.

Generelt medfører denne en kjedereaksjon for fremstilling av, i eksponentielle mengder i forhold til antallet reaktive trinn involvert, minst en spesifikk nukleinsyresekvens forutsatt at (a) endene av de krevde sekvenser er kjente i tilstrekkelig detalj til at oligonukleotider kan syntetiseres som hybridiserer til dem, og (b) at en liten mengde av sekvensene er tilgjengelige for å initiere kjedereaksjonen. Produktet av kjedereaksjonen vil være en diskret nukleinsyre-dupleks med termini som tilsvarer endene av de spesifikke benyttede primere.

Enhver nukleinsyresekvens i renset eller ikke-renset form kan benyttes som utgangssyre, forutsatt at den inneholder eller er antatt å inneholde den ønskede spesifikke nukleinsyresekvens. Således kan prosessen for eksempel benytte DNA eller RNA inkludert meddeler-RNA, hvilket DNA eller RNA kan være enkeltstrenget eller dobbeltstrenget. I tillegg kan det benyttes et DNA-RNA-hybrid som inneholder en streng av hver. En blanding av et hvilket som helst av disse nukleinsyrer kan også benyttes, eller nukleinsyrene som fremstilles fra en tidligere forsterkningsreaksjon ved bruk av den samme eller en annen primer kan også benyttes. Den spesifikke nukleinsyresekvens som skal forsterkes kan være kun en fraksjon av et større molekyl eller kan være tilstede initielt som et diskret molekyl, slik at den spesifikke sekvens utgjør hele nukleinsyren.

Det er ikke nødvendig at sekvensen som skal forsterkes er tilstede til å begynne med i ren form, den kan være en mindre fraksjon av en total blanding slik som en andel av p<->globin genet inneholdt i full-human-DNA (som eksemplifisert i Saiki et al., "Science", 230»1530-1534 (1985)) eller en andel av en nukleinsyresekvens på grunn av en spesiell mikroorganisme, hvilken organisme kan utgjøre kun en adskillig mindre andel av en spesiell biologisk prøve. Utgangsnukleinsyresekvensen kan inneholde mer enn en ønsket spesifikk nukleinsyresekvens som kan være like eller forskjellige. Derfor er forsterkningsprosessen brukbar ikke bare for å fremstille store mengder av en spesifikk nukleinsyresekvens, men også for å forsterke samtidig mer enn en annen spesifikk nukleinsyresekvens som er lokalisert på de samme eller andre nuklein-syremolekyler.

Nukleinsyren eller -syrene kan oppnås fra en hvilken som helst kilde, for eksempel fra plasmider slik som pBR322, fra klonet DNA eller RNA, eller fra naturlig DNA eller RNA fra enhver kilde inkludert bakterier, gjær, viruser, organeller og høyere organismer som planter eller dyr. DNA eller RNA kan ekstraheres fra blod, vevmateriale som korioniske villi, eller aminotiske celler ved varierende teknikker slik som beskrevet av Maniatis et al. som nevnt ovenfor på sidene 280-281.

Hvis prober benyttes som er spesifikke til en sekvens som forsterkes og derefter detekteres, kan cellene direkte benyttes uten ekstrahering av nukleinsyre hvis de suspenderes i hypotonisk buffer og oppvarmes til ca. 90-100"C inntil cellelysering og dispergering av intracellulære komponenter inntrer, generelt efter 1 til 15 minutter. Efter oppvarmings-trinnet kan forsterkningsreagensene settes direkte til de lyserte celler.

Enhver spesifikk nukleinsyresekvens kan fremstilles ved forsterkningsprosessen. Det er kun nødvendig at et tilstrekkelig antall baser i begge ender av sekvensen er kjent i tilstrekkelig detalj til at to oligonukleotidprimere kan fremstilles som hybridiserer til forskjellige strenger av den ønskede sekvens og i relative posisjoner langs sekvensen slik at et ekstensjonsprodukt som syntetiserer fra en primer, når denne separeres fra sin sjablon (komplementær), kan tjene som sjablon for ekstensjon av den andre primer til en nukleinsyresekvens av definert lengde. Jo større kjennskapen er til disse baser ved begge ender av sekvensen, jo større kan spesifisiteten være for primerne for målnukleinsyresekvensen og jo større vil prosessens effektivitet være.

Det skal være klart at uttrykket "primer" slik det her brukes kan henvise til mer enn en primer, spesielt i det tilfellet der det er en viss usikkerhet i informasjonen hva angår terminalsekvensen eller -sekvensene av fragmentet som skal forsterkes. Når for eksempel der en nukleinsyresekvens involveres fra proteinsekvensinformasjon vil en samling av primere inneholdende sekvenser som representerer alle mulige kodonvariasjoner basert på degenerering av den genetiske kode, benyttes for hver streng. En primer fra denne samling vil være homolog med enden av den ønskede sekvens som skal forsterkes.

Oligonukleotidprimerne kan fremstilles ved bruk av enhver egnet metode slik som fosfotriester- og fosfodiestermetodene som beskrevet ovenfor, eller automatiserte utførelsesformer derav. I en slik automatisert utførelsesform blir dietyl-fosforamiditter benyttet som utgangsstoffer og kan syntetiseres som beskrevet av Beacage et al., "Tetrahedron Letters"

(1981), 22:1859-1862. En metode for å syntetisere oligonukleotider på en modifisert fast bærer er beskrevet i US-PS 4.458.066. Det er også mulig å benytte en primer som er isolert fra en biologisk kilde (slik som et restriksjonsendonuklease-nedbrytningsprodukt).

Den spesifikke nukleinsyresekvens fremstilles ved bruk av nukleinsyre inneholdende sekvensen som sjablon. Det første trinn involverer å bringe hver nukleinsyrestreng i kontakt med fire forskjellige nukleosidtrifosfåter og en oligo nukleotidprimer for hver forskjellig nukleinsyresekvens som forsterkes eller detekteres. Hvis nukleinsyrene som skal forsterkes eller detekteres er DNA, er nukleotidtrifosfåtene dATP, dCTP, dGTP og TTP.

Nukleotidsyrestrengene benyttes som en sjablon for syntesen av ytterligere nukleinsyrestrenger. Denne syntese kan gjennomføres ved bruk av en hvilken som helst egnet metode. Generelt skjer den i en bufret vandig oppløsning, fortrinnsvis ved en pH-verdi på 7-9 og aller helst ca. 8. Fortrinnsvis blir et molart overskudd (for klonet nukleinsyre, vanligvis ca. 1000:1 primer:sjablon, og for genomisk nukleinsyre, vanligvis ca. 10^:1 primer:sjablon) av de to oligonukleotidprimere, satt til bufferen som inneholder de separerte sjablonstrenger. Det skal imidlertid være klart at mengden komplementær streng ikke behøver å være kjent, hvis den heri beskrevne prosess benyttes for diagnostisk anvendelse slik at mengden primer i forhold til mengden komplementær streng ikke kan bedømmes med sikkerhet. I praksis vil imidlertid mengden primer som tilsettes generelt være i molart overskudd i forhold til mengden komplementær streng (sjablon) når sekvensen som skal forsterkes er inneholdt i en blanding av kompliserte langkjedede nukleinsyrestrenger. Stort molart overskudd er foretrukket for å forbedre prosessens effektivitet .

Fortrinnsvis er konsentrasjonen av nukleotidtrifosfater 150-200 jjM hver i bufferen for forsterkning, og MgCl2er tilstede i bufferen i en mengde av 1,5-2 mM for å øke effektiviteten og spesifisere reaksjonen.

Den resulterende oppløsning blir så behandlet i henhold til hvorvidt nukleinsyrene som forsterkes eller detekteres er dobbelt- eller enkeltstrenget. Hvis nukleinsyrene er enkeltstrenget, behøver det ikke benyttes noe denatureringstrinn, og reaksjonsblandingen holdes ved en temperatur som fremmer hybridisering av primeren til dennes kompiementærmål

(sjablon)-sekvens. En slik temperatur ligger vanligvis fra ca. 35-65°C eller mer og fortrinnsvis fra ca. 37-60°C i et effektivt tidsrom, vanligvis tø-5 minutter og fortrinnsvis 1-3 minutter. Fortrinnsvis blir temperaturer på 45-58°C benyttet for Taq-polymerase og >15-mer primere for å øke spesifisiteten for primerhybridiseringen. Kortere primere trenger lavere temperaturer.

Komplementet til den opprinnelige enkeltstrengede nukleinsyre kan syntetiseres ved tilsetning av en eller to oligonukleotidprimere. Hvis en egnet enkeltprimer tilsettes, blir primerekstensjonsproduktet syntetisert i nærvær av primeren, det termostabile enzym og nukleotidtrifosfatene. Produktet vil være partielt komplementært til den enkeltstrengede nukleinsyre og vil hybridisere med nukleinsyrestrengen for derved å danne en dupleks av strenger av ulik lengde som så separeres i enkeltstrenger som beskrevet ovenfor for derved å fremstille to enkle separerte komplementærstrenger. Alternativt kan de egnede primere settes til den enkeltstrengede nukleinsyre og reaksjonen så gjennomføres.

Hvis nukleinsyren så inneholder to strenger, er det nødvendig å separere strengene i nukleinsyren før den kan benyttes som sjablon. Denne strengseparering kan gjennomføres på en hvilken som helst egnet denatureringsmåte inkludert bruk av fysikalske, kjemiske eller enzymatiske hjelpemidler. En foretrukket fysikalsk metode for separering av strengene av nukleinsyren omfatter å oppvarme denne inntil den totalt (det vil si mer enn 99$) er denaturert. Typisk varmedenaturering involverer temperaturer som ligger innen området 90-105°C i tidsrom som generelt ligger innen området ca. 0,5-5 minutter. Fortrinnsvis er den effektive denaturerings-temperatur 90-100°C i 0,5-3 minutter. Strengseparering kan også induseres ved hjelp av et enzym fra den klasse enzymer som er kjent som halikaser eller enzymet RecA som har helikaseaktivitet, og i nærvær av riboATP som er kjent for denaturering av DNA. Reaksjonsbetingelser egnet for sepa rering av strengene av nukleinsyrer med helikaser er beskrevet av Kunn Hoffmann-Berling, "CSH-Quantitative Biology", 43:63 (1978) og teknikker for bruk av RecA er beskrevet av C. Radding, "Ann. Rev. Genetics", 16:405-437

(1982). Denatureringen gir to separerte komplementære strenger av lik eller ulik lengde.

Hvis den dobbeltstrengede nukleinsyre skal denatureres ved hjelp av varme, tillater man at reaksjonsblandingen avkjøles til en temperatur som gir hybridisering av hver primer som er tilstede til sine komplementære mål (sjablon)-sekvens. Denne temperatur ligger vanligvis fra ca. 35-65°C eller mer, avhengig av reagenser, fortrinnsvis ved 37-60°C, holdt i et effektivt tidsrom, generelt 0,5-5 minutter, og fortrinnsvis 1-3 minutter. Uttrykt i praksis blir temperaturen ganske enkelt redusert fra ca. 95°C helt ned til 37°C, fortrinnsvis til ca. 45-58°C for Taq-polymerase, og hybridiseringen skjer ved en temperatur innen dette området.

Uansett om nukleinsyren er enkelt- eller dobbeltstrenget kan det termostabile enzym settes til denatureringstrinnet eller når temperaturen reduseres til eller ligger innen området for å fremme hybridisering. Reaksjonsblandingen oppvarmes så til en temperatur ved hvilken aktiviteten for enzymet fremmes eller optimaliseres, det vil si en temperatur tilstrekkelig til å øke aktiviteten i enzymet ved å lette syntese av primerekstensjonsproduktene fra hybridisert primer og sjablon. Temperaturen må i virkeligheten være tilstrekkelig til å syntetisere et ekstensjonsprodukt av hver primer som er komplementær til hvert nukleinsyretemplat, men må ikke være så høy at den denaturerer hvert ekstensjonsprodukt fra sin komplementære sjablon (det vil si at temperaturen generelt er mindre enn ca. 80-90°C).

Hovedsakelig avhengig av typen enzym og nukleinsyre eller

-syrer som benyttes, ligger den typiske temperatur for gjennomføring av denne syntesereaksjon generelt fra ca. 40-

80°C og helst 50-75°C. Temperaturen ligger aller helst innen området 65-75°C når det benyttes en polymerase fra Thermus aquaticus. Tidsrommet som kreves for denne syntese kan ligge fra ca. 0,5 til 40 minutter eller mer, hovedsakelig avhengig av temperaturen, lengden av nukleinsyren, enzymet og kompleksiteten av nukleinsyreblandingen, fortrinnsvis 1-3 minutter. Hvis nukleinsyren er lenger, kreves det generelt et lengre tidsrom. Nærværet av dimetylsulfoksyd, DMSO, er ikke nødvendig eller anbefalt fordi DMSO er funnet å inhibere Taq-polymeraseenzymaktivitet.

Den nettopp syntetiserte streng og dens komplementære nukleinsyrestreng danner et dobbeltstrenget molekyl som benyttes i de efterfølgende trinn i prosessen. I dette neste trinn blir strengene fra det dobbeltstrengede molekyl separert ved varmedenaturering ved en temperatur som bevirker denaturering av molekylet, men som ikke er så høy at det termostabile enzym helt og irreversibelt denatureres eller sågar inaktiveres. Hovedsakelig avhengig av typen enzym og lengden nukleinsyre ligger dette området generelt innen 90-105°C og aller helst 90-100°C, og tiden for denaturering ligger karakteristisk innen området Vt til 4 minutter, hovedsakelig avhengig av temperatur og nukleinsyrelengde.

Efter denne tid blir temperaturen senket til et nivå som fremmer hybridisering av primeren til sitt komplementære enkeltstrengede molekyl (sjablon) som fremstilles i det foregående trinn. Slike temperaturer er beskrevet ovenfor.

Efter dette hybridiseringstrinn eller i lys av (eller samtidig med) hybridiseringstrinnet blir temperaturen justert til en temperatur som er effektiv for å bevirke aktivitet av det termostabile enzym for å sikre syntese av et primerekstensjonsprodukt som benytter som sjablon den nysynteti-serte streng fra det foregående trinn. Temperaturen må heller ikke her være så høy at den bevirker separering (denaturering) av ekstensjonsproduktet fra sjablonen, slik som tidligere beskrevet (fortrinnsvis fra 40-80°C i V4-40 minutter og fortrinnsvis ved 50-70°C i 1-3 minutter). Hybridisering kan skje i løpet av dette trinn slik at det foregående trinn med avkjøling efter denaturering ikke er nødvendig. I et slikt tilfelle og ved bruk av samtidige trinn er den foretrukne temperatur 50-70°C.

Oppvarmings- og avkjølingstrinnene av strengseparering, hybridisering og ekstensjonsproduktsyntese kan gjentas så ofte dette er nødvendig for å oppnå den ønskede kvalitet for den spesielle nukleinsyresekvens, avhengig av den tilsiktede bruk.

Den eneste begrensning er mengden av primere, termostabilt enzym og tilstedeværende nukleotidtrifosfater. Fortrinnsvis gjentas trinnene minst to ganger. For bruk ved detektering vil antallet cykler være for eksempel avhengig av prøvens art. For eksempel er det ikke nødvendig med så mange cykler hvis prøven som forsterkes er ren. Hvis prøven er en kompleks blanding av nukleinsyrer, vil flere cykler være nødvendige for å forsterke signalet tilstrekkelig for detektering. For generell forsterkning og detektering gjentas fortrinnsvis prosessen minst 20 ganger.

Når merkede sekvens-spesifikke prober benyttes som beskrevet ovenfor, blir trinnene fortrinnsvis gjentatt minst 5 ganger. Når humangenom-DNA benyttes med slike prober, blir prosessen fortrinnsvis gjentatt 15-30 ganger for å forsterke sekvensen tilstrekkelig til at det produseres et detekterbart signal, for eksempel slik at bakgrunnsstøyen ikke påvirker detekteringen .

Som det skal beskrives i større detalj nedenfor, vil mengden spesifikk nukleinsyresekvens som fremstilles akkumuleres på eksponentiell måte.

Ingen ytterligere nukleotider, primere eller termostabile enzymer behøver å tilsettes efter den første tilsetning, forutsatt at enzymet ikke er blitt denaturert eller irreversibelt inaktivert, i hvilket tilfelle det er nødvendig å oppfriske enzymet efter hvert denatureringstrinn. Tilsetning av slike stoffer ved hvert trinn vil imidlertid ikke ugunstig påvirke reaksjonen.

Når det er ønskelig å fremstille mer enn en spesifikk nukleinsyresekvens fra den første nukleinsyre eller den første blanding av slike, benyttes en egnet andel forskjellige oligonukleotidprimere. Hvis for eksempel to forskjellige spesifikke nukleinsyresekvenser skal fremstilles, benyttes fire primere. To av primerne er spesifikke for en av de spesifikke nukleinsyresekvenser og de to andre for den andre. På denne måte kan hver av de to forskjellige spesifikke sekvenser fremstilles eksponentielt i henhold til foreliggende fremgangsmåte.

På egnet tidspunkt kan reaksjonen stanses ved å inaktivere enzymet på en hvilken som helst kjent måte (for eksempel ved tilsetning av EDTA, fenol, SDS eller CHC13) eller ved å skille reaksjonskomponentene.

Forsterkningsprosessen kan gjennomføres kontinuerlig. Ved en utførelsesform i en automatisert prosess, kan reaksjonsblandingen temperatursirkuleres slik at temperaturen program-meres til å ligge på et visst nivå i en viss tid.

Et slikt instrument for dette formål er en automatisert maskin for behandling av forsterkningsreaksjonen. Dette instrument benytter et vaeskebehandlingssystem under data-kontroll for å muliggjøre væskeoverføring av enzym som er lagret ved en kontrollert temperatur i en første beholder til en andre beholder hvis temperatur styres av datamaskinen for å være tilpasset en viss inkuberingsprofil. Den andre beholder lagrer nukleinsyresekvensen eller -sekvensene som skal forsterkes pluss nukleotidtrifosfåtene og primerne. Dataanlegget inkluderer en brukergrenseflate gjennom hvilken en bruker kan komme inn til prosessparametrene som styrer de forskjellige karakteristiska for de forskjellige trinn i forsterkningssekvensen slik som inkuberingstid og -temperatur, tiden for enzymoverføring og så videre.

En foretrukket apparatur som kan benyttes utnytter en temperatursirkulering uten et væskebehandlingssystem på grunn av at enzymet ikke nødvendigvis må overføres ved hver cyklus. En slik maskin består av følgende systemer: 1. En varmeledende beholder for å holde et gitt antall rør, fortrinnsvis 500 pl rør, som inneholder reaksjonsblandingen av nukleotidtrifosfåter, primere, nukleinsyresekvenser og enzym; 2. Et middel for å oppvarme, avkjøle og å holde den varmeledende beholder over og under romtemperatur, noe som betyr at den har en inngang for å motta et kontrollsignal for temperaturen ved eller i henhold til hvilket behol-deren oppvarmes, avkjøles eller holdes på samme temperatur. (Dette kan for eksempel være Peltier-varmepumper eller vannvarmevekslere.) 3. Datamaksinhjelpemidler (for eksempel en mikroprosessor-kontroll), koblet til inngangen på disse innretninger, for å gi de signaler som automatisk kontrollere forsterkningssekvensen, temperaturnivåene samt temperaturregulering og tidsstyring.

I en annen utførelsesform kan enzymet som benyttes for syntesen av primerekstensjonsproduktet immobiliseres i en kolonne. De andre reaksjonskomponenter kan kontinuerlig sirkuleres ved hjelp av en pumpe gjennom kolonnen og en varmevikling i serie. Således kan nukleinsyrene som frem stilles gjentatte ganger denatureres uten inaktivering av enzymet.

Forsterkningsprotokollen demonstreres skjematisk nedenfor der dobbeltstrenget DNA inneholdende den ønskede sekvens S bestående av komplementærstrengene S<+>og S~ benyttes som nukleinsyre. Under den første og hver efterfølgende reak-sjonscyklus vil ekstensjonen av hver oligonukleotidprimer på den opprinnelige sjablon gi et nytt ssDNA-molekylprodukt av ikke-definert lengde som avsluttes med kun en av de disse primere. Disse produkter, herefter kalt "lange produkter", vil akkumulere på lineær måte, det vil si at mengden som er tilstede efter et hvilket som helst antall cykler, vil være proporsjonal med antallet cykler.

De lange produkter som således oppnås vil virke som sjabloner for en eller en annen oligonukleotidprimer under efter-følgende cykler og vil gi molekyler av de ønskede sekvenser S<+>eller S~. Disse molekyler vil også virke som sjabloner for en eller en annen av oligonukleotidprimerne og derved produsere ytterligere S<+>og S~, og således kan en kjedereaksjon opprettholdes som vil resultere i akkumulering av S i eksponentiell hastighet i forhold til antall cykler.

Biprodukter som dannes ved oligonukleotidhybridiseringer forskjellige fra de som er tilsiktet, er ikke selvkatalyser-ende (bortsett fra i spesielle tilfeller) og akkumuleres således lineært.

Den spesifikke sekvens som skal forsterkes, S, kan angis skjematisk som:

Den egnede oligonukleotidprimer vil være:

slik at hvis DNA inneholdende S separeres til enkeltstrenger og disse hybridiseres til primerne 1 og 2, kan de følgende ekstensjonsreaksjoner katalyseres ved hjelp av en termostabil polymerase i nærvær av de fire nukleotidtrifosfåter:

Ved denaturering av de to duplekser som dannes, er produktene:

Hvis disse fire strenger tillates rehybridisering med primer 1 og 2 i den neste cyklus, vil den termostabile polymerase katalysere følgende reaksjoner:

Hvis strengene av de fire duplekser separeres, finnes de følgende strenger:

Man ser at hver streng som slutter med oligonukleotid-sekvensen av en primer og den komplementære sekvens av den andre er, er den spesifikke nukleinsyresekvens S man ønsker å fremstille.

Mengden opprinnelig nukleinsyre forblir konstant i hele prosessen på grunn av at den ikke replikeres. Mengden av lange produkter økes lineært på grunn av at de fremstilles kun fra den opprinnelige nukleinsyre. Mengden av spesifikke sekvenser øker eksponentielt. Således vil den spesifikke sekvens bli den predominante art. Dette illustreres i den følgende tabell som indikerer de relative mengder av de arter som teoretisk er tilstede efter n cykler, idet man antar 100$ effektivitet i hver cyklus:

Når en enkeltstrenget nukleinsyre benyttes som sjablon, dannes det kun et langt produkt pr. cyklus.

En sekvens innen en gitt sekvens kan forsterkes efter et gitt antall forsterkninger for å oppnå større spesifisitet for reaksjonen ved efter minst en forsterkningscyklus å sette et sett av primere som er komplementære til de interne sekvenser (ikke ved endene) av sekvensen som skal forsterkes. Slike primere kan tilsettes på et hvilket som helst trinn og vil gi et kortere forsterket fragment. Alternativt kan et lengre fragment fremstilles ved å benytte primere med ikke-komplementære ender med en viss overlapping der primerne på forhånd benyttes ved forsterkningen.

Den heri angitte metode kan benyttes for å klone en spesiell nukleinsyresekvens for innskyting i en egnet eksprimeringsvektor. Vektoren kan så benyttes for å transformere en egnet vertsorganisme til å produsere genproduktet av sekvensen ved standardmetoder i henhold til kjent rekombinant DNA-teknologi.

Forsterkningsprosessen som her beskrives kan gi en blanding av nukleinsyre som stammer fra den opprinnelige sjablon-nukleinsyre, det tilsiktede målforsterkede produkt og forskjellige bakgrunns-ikke-målprodukter. Det forsterkede produkt kan også være en blanding hvis den opprinnelige sjablon-DNA inneholder et antall målsekvenser, slik tilfellet er i et heterozygøst diploidgenom eller der det er en familie av relaterte gener.

De her beskrevne primere kan modifiseres for å understøtte hurtig og spesifikk kloning av blandingen av diverse former for DNA som fremstilles ved forsterkningsreaksjonen. I en slik modifikasjon inneholdes et restriksjonssete i hver av disse primere eller i sekvensen som skal forsterkes og klones. Fortrinnsvis er de samme eller forskjellige restriksjonsseter innarbeidet i 5'-endene av disse primere for derved å gi restriksjonsseter ved to ender av det forsterkede produkt. Skåret til med de riktige enzymer kan det forsterkede produkt så lett skytes inn i plasmid- eller vial-vektorer og klones. Denne kloning tillater analyse eller eksprimering av individuelle forsterkede produkter, ikke en blanding.

Hvis disse primere har innarbeidede restriksjonsseter, kan det samme restriksjonssete benyttes i begge primere. Bruken av forskjellige seter tillater imidlertid innskyting av produktet i vektoren med en spesifikk orientering og under-trykker multippelinnskyting så vel som innskyting som stammer fra forsterkning basert på kun en av de to primere. Den spesifikke orientering er brukbar ved kloning til enkeltstrengede sekvenserende vektorer når enkeltstrenghybridi-seringsprober benyttes, eller når det klonede produkt eksprimeres.

En fremgangsmåte for fremstilling av disse primere er å velge en sekvens som skiller seg minimalt fra målsekvensen. Områder hvori hver av disse primere skal lokaliseres avsøkes med henblikk på homologi til restriksjonsseter egnet for den ønskede vektor. For eksempel skiller målsekvensen "CAGTATCCGA..." seg kun i en base fra en som innholder BamHI-setet. En primersekvens velges for å passe til målsekvensen eksakt til 3'-enden og å inneholde den endrede sekvens, og restriksjonssetet nær 5'-enden (for eksempel "CAGgATCCGA...", der den lille bokstav symboliserer en mistilpasning med målsekvensen). Denne minimalt endrede sekvens vil ikke påvirke evnen til primeren til å hybridisere ti den originale målsekvens og å initiere polymerisering. Efter den første forsterkningscyklus er primeren kopiert, blir et mål, og passer nøyaktig til nye primere.

Efter forsterkningsprosessen blir produktene spaltet med de egnede restriksjonsenzymer, restriksjonsnedbrytningsproduktet blir eventuelt separert fra ligeringsinhibitorer som nukleotidtrifosfater og salter, for eksempel ved å føre produktene over en avsaltningskolonne, eller en molekylvekts-kromatografikolonne, eller gjennom et membran, og ned-brytningsproduktene inneholdende forsterket sekvens som skal klones skytes inn ved ligering inn i en kloningsvektor som bakteriofag M13. Kloningsvektoren har generelt en selekterbar markør og kan eventuelt også ha en promoter. Genet kan så sekvenseres og/eller eksprimeres, hvis det kodes for et protein, ved bruk av velkjente teknikker. Genet kan også sekvenseres ved tilsetning av en egnet primer under forsterkningsprosessen, hvilken primer er komplementær til det ønskede produkt som skal sekvenseres. Primeren vil gi et ekstensjonsprodukt og graden av forsterkning med et slikt ekstensjonsprodukt vil gi sekvensinformasjon.

En annen fremgangsmåte for fremstilling av primere involverer å ta 3'-enden av primerne fra målsekvensen og føye disse til det eller de ønskede restriksjonsseter til 5'-enden av primeren. For det ovenfor angitte formål skulle et Hindlll-sete tilsettes for å opprette sekvensen "cgaagcttCAGTATCCGA...", der de små bokstaver er som be skrevet ovenfor. De .tilsatte baser vil ikke bidra til hybridisering i den første forsterkningscyklus, men ville passe i efterfølgende cykler. De endelige forsterkede produkter skjæres så opp med restriksjonsenzymer og klones og eksprimeres som angitt ovenfor. Genet som forsterkes kan for eksempel være human P-hemoglobin eller human-HLA-DQ-, -DR-eller -DP-cx- og -p-gener.

Som et alternativ, men dog mindre foretrukket og mindre effektivt, benyttes en kloningsmetode der stumpe-ende-ligering anvendes i stedet for klebrig-ende-ligering (ved bruk av restriksjonsenzymer), den prinsipielle forsterknings-prosedyre benyttes uten henblikk på restriksjonsenzymene i primerne og den eller de sekvenser som skal klones. Trinnene må gjentas i tilstrekkelig antall ganger til å kunne gi tilstrekkelige forsterkede sekvenser til å bevirke ligering. Stump-ende-ligering krever større konsentrasjoner av sekvenser og kloningsvektorer enn klebrig-ende-ligering. I tillegg må liger ingen skje i nærvær av en ligase slik som for eksempel T4-ligase, E. coli ligase og ligase. Når det forsterkede produkt er oppnådd, er ligeringsprosedyren en standardprosedyre som benytter betingelser som er velkjente for fagmannen.

Kloningsmetoden som ikke medfører stump-ende-ligering kontrollerer orienteringen eller multiplisiteten av inn-skytingen av det forsterkede produkt i kloningsvektoren.

I tillegg kan den her beskrevne prosess benyttes for in vitro mutagenese. De oligonukleotidprimere behøver ikke være nøyaktig komplementære til nukleinsyresekvensen som forsterkes. Det er kun nødvendig at de er i stand til å hybridisere til sekvensen i tilstrekkelig grad til å kunne forlenges av det termostabile enzym. Produktet av en forsterkningsreaksjon der det benyttes en primer som ikke nøyaktig er komplementær til den opprinnelig sjablon, vil inneholde primersekvensen i stedet for sjablonen og derved innføre en in vitro-mutasjon. I ytterligere cykler vil denne mutasjon forsterkes med uminsket kraft, fordi ingen ytterligere ikke-parede primere er nødvendige. Den således fremstille mutant kan skytes inn i en egnet vektor ved standard molekylær-biologiske teknikker og kan overføre mutanteegenskaper på denne vektor som potensiale for produksjon av et endret protein.

Fremgangsmåten for fremstilling av en endret DNA-sekvens som beskrevet ovenfor kan gjentas på det endrede DNA ved bruk av forskjellige primere for å indusere ytterligere sekvens-forandringer. På denne måte kan en serie muterte sekvenser gradvis fremstilles der hver nye tilsetning til serien kan skille seg fra den forrige på nesten ubetydelig måte, men fra den opprinnelige DNA-kildesekvens på stadig økende måte. På denne måte kan man ultimat gjennomføre forandringer som man ikke kunne tenke seg i et enkelt trinn på grunn av den manglende evne for en enkelt alvorlig mistilpasset primer.

I tillegg kan primeren som en del av sin sekvens inneholde en ikke-komplementaer sekvens, forutsatt at en tilstrekkelig mengde av primeren inneholder en sekvens som er komplementær til strengen som skal forsterkes. For eksempel kan en nukleotidsekvens som ikke er komplementær til sjablon-sekvensen (for eksempel som en promoter, forbinder, kodingssekvens, og så videre) forbindes til 5'-enden av en eller begge primere, og derved føyes til produktet i forsterkningsprosessen. Efter ekstensjonen blir primeren tilsatt, tilstrekkelige cykler kjørt for å oppnå den ønskede mengde ny sjablon inneholdende det ikke-komplementære nukleotide innskudd. Dette tillater fremstilling av store mengder av de kombinerte fragmenter i løpet av relativt kort tid, for eksempel 2 timer eller mindre, ved bruk av en ganske enkel teknikk.

Metoden kan også benyttes for å muliggjøre detektering og/eller karakterisering av spesifikke nukleinsyresekvenser forbundet med infektiøse sykdommer, genetiske mangler eller cellulære mangler slik som kreft, for eksempel onkogener. Forsterkning er brukbar når mengden nukleinsyre som er tilgjengelig for analyse er meget liten, for eksempel ved prenatal diagnose av sigdcelleanemi ved bruk av DNA oppnådd fra fetalceller. Forsterkningen er spesielt brukbar hvis en slik analyse kan skje på en liten prøve ved bruk av ikke-radioaktiv detekteringsteknikker som kan være inherente lnsensitive, eller der radioaktive teknikker benyttes, men der hurtig detektering er ønskelig.

For oppfinnelsens formål kan genetiske sykdommer inkludere spesifikke detekteringer og/eller mutasjoner i genom-DNA fra enhver organisme som for eksempel sigdcelleanemi, a-talassemi, P-talassemi og lignende. Sigdcelleanemi kan lett detekteres via oligoerrestriksjonsanalyse som beskrevet i EP 0 164 054 eller via RFLP-lignende analyse fulgt av forsterkning av den egnede DNA-sekvens via foreliggende metode, a-talassemi kan detekteres i fravær av en sekvens og P-talassemi kan detekteres ved nærværet av et polymorft restriksjonssete forbundet med en mutasjon som forårsaker mangelen.

Alle disse genetiske sykdommer kan detekteres ved forsterkning av den egnede sekvens og å analysere denne ved Southern-blott uten å benytte radioaktive prober. I en slik prosess blir for eksempel en liten prøve av DNA fra for eksempel amniotisk fluid inneholdende et meget lavt nivå av den ønskede sekvens forsterket, skåret ned med et restriksjonsenzym og analysert via en Southern-blott-teknikk. Bruken av ikke-radioaktive prober lettes ved det høye nivå av det forsterkede signal.

1 en annen utførelsesform kan en liten prøve av DNA forsterkes til et hensiktsmessig nivå og derefter kan en ytterligere cyklus av ekstensjonsreaksjonene gjennomføres der nukleotidderivater som lett kan detekteres (slik som<32p_>merkede eller biotin-merkede nukleotidtrifosfater) innarbeides direkte i det ferdige DNÅ-produkt som kan analyseres ved restriksjons- og elektroforetisk separering eller enhver annen egnet metode.

I en ytterligere utførelsesform kan nukleinsyren eksponeres til en spesiell restriksjonsendonuklease før forsterkning. Fordi en sekvens som er skåret ut ikke kan forsterkes, medfører opptredenen av et forsterket fragment på tross av tidligere restriksjon av DNA-prøven, fraværet av et sete for endonuklease i den forsterkede sekvens. Nærværet eller fraværet av en forsterket sekvens kan detekeres på egnet måte.

Den praktiske anvendelse av denne teknikk kan illustreres ved dens bruk ved å lette detektering av sigdcelleanemi via oligomerrestriksjonsteknikken som her er beskrevet og i EP 0 164 054 samt Saiki et al., "Bio/Technology", 3, s. 1008-1012 (1985). Sigdcelleanemi er en hemoglobinsykdom som forårsakes av en enkelt basepar-endring i det sjette kodon av p<->globingenet.

Fremgangsmåten som her beskrevet kan også benyttes for direkte å detektere enkelt-basepar-variasjoner av nukleinsyresekvenser (slik som genom-DNA) ved bruk av sekvens-spesif ikke oligonukleotider. Ved denne metode blir sekvensvariasjonen, uansett om den skyldes cancer, infektiøs sykdom eller en genetisk sykdom, for eksempel en genetisk lesjon, direkte detektert, noe som eliminerer behovet for restriksjonsnedbrytning, elektroforese og gelmanipuleringer som ellers ville vært nødvendig. Bruken av sekvens-spesifikke oligonukleotider i det dot-blott-format efter forsterkning slik det her beskrives, gir forbedret spesifisitet og sensitivitet i proben, et tolkbart signal kan oppnås med en 0,04 jig prøve i løpet av 6 timer. Hvis videre mengden av prøve som spores på et membran økes til 0,1-0,5 pg, kan ikke isotop-merkede oligonukleotider benyttes i stedet for de radioaktive prober som benyttes i de tidligere metoder. Videre kan de nedenfor beskrevne prosesser anvendes for bruk av sekvens-spesifikke oligonukleotider som er mindre i størrelse enn 19-mer, noe som tillater bruk av mer diskrimi-nerende sekvens-spesifikke oligonukleotider.

Uansett genetisk mangel og mens RFLP krever et polymorft restriksjonssete for å kunne forbindes med mangelen, detek-terer de sekvens-spesifikke oligonukleotider direkte den genetiske mangel og er generelt mer brukbare for analyse av slike sykdommer som hemoglobin C-mange1, a-l-antitrypsin og p-talassemi, noe som resulterer fra enkelbase-mutasjoner. I tillegg kan oligonukleotidene benyttes for å skille mellom genetiske varianter som representerer forskjellige typer (for eksempel HLA-typing), noe som antyder brukbarheten av et sekvens-spesifikt oligonukleotid-basert HLA-typingssett som inkluderer et termostabilt enzym.

I en utførelsesform der en nukleotidvariant i sekvens skal detekeres, blir prøven, forsterket som beskrevet ovenfor ved bruk av en primer pr. streng for hver nukleinsyre man mistenker å inneholde nukleotidvariasjonen, oppsporet direkte på en serie membraner og hvert membran hybridisert med en forskjellig merket sekvens-spesifikk oligonukleotidprobe. En prosedyre for oppsporing av prøven på et membran er beskrevet av Kafotos et al., "Nucleic Acids Research", 7:1541-1552 (1979).

Kort sagt kan DNA-prøven som festes til membranet forbe-handles med en prehybridiseringsoppløsning inneholdende natriumdodecylsulfat, Ficoll, serumalbumin og forskjellige salter før proben tilsettes. Derefter kan en merket oligonukleotidprobe som er spesifikk for hver sekvensvariasjon som skal detekteres settes til en hybridiseringsoppløsning tilsvarende forhybridiseringsoppløsningen. Hybridiseringsopp-løsningen bringes på membranet og membranet underkastes hybridiseringstilstander som avhenger av probetype og lengde, type og konsentrasjon av bestanddeler, og så videre. Generelt blir hybridiseringen gjennomført ved ca. 25-75°C og fortrinnsvis 35-55°C i 15 minutter til 50 timer, men fortrinnsvis mindre enn 3 timer. Jo større betingelsesstringensen er, jo større er den krevede komplementaritet for hybridisering mellom probe og prøve. Hvis bakgrunnsnivået er høyt, kan stringensen økes i tilsvarende grad. De stringente betingelser kan også innarbeides i vaskevannet.

Efter hybridisering blir prøven vaskes fri for ikke-hybridisert probe ved bruk av et hvilket som helst egnet hjelpe-middel som vasking en eller flere ganger med forskjellige konsentrasjoner av standardsalt fosfat EDTA (SSPE) (180 mM NaCl, 10 mM NaHP04og 1 M EDTA, pH 7,4) oppløsninger ved 25-75°C i ca. 10 minutter til 1 time, avhengig av temperaturen. Merkelappen detekteres så ved bruk av en hvilken som helst detekteringsteknikk.

Det her benyttede sekvens-spesifikke oligonukleotid er et som generelt fremstilles og selekteres som beskrevet ovenfor for fremstilling av selektering av primerne. Som beskrevet ovenfor må det sekvens-spesifikke oligonukleotid omfatte området for sekvensen som overspenner nukleotidvariasjonen som detekteres og må være spesifikt for den detekterte nukleotidvariasjon. Hvis det for eksempel er ønskelig å detektere hvorvidt en prøve inneholder mutasjonen for sigdcelleanemi, vil et oligonukleotid fremstilles som inneholder nukleotidsekvenssetet som er karakteristisk for det normale e-globingenet og et oligonukleotid fremstilles som inneholder nukleotidsekvensen som er karakteristisk for sigdcelle-arveanlegget. Hvert oligonukleotid vil hybridiseres til duplikering av den samme prøve for å bestemme hvorvidt prøven inneholder mutasjonen.

De polymorfe områder av HLA-klasse-II-gener er lokalisert til spesifikke områder av den første exon og flankeres av bevarte sekvenser slik at oligonukleotidprimere komplementære til motsatte strenger av de bevarte 5'- og 3'-ender av den første exon kan fremstilles.

Antallet oligonukleotider som benyttes for detektering av de polymorfe arealer av HLA-klasse-II-genene vil variere avhengig av typen gen som har områder av basepar-variasjon som kan clustres eller spres. Evis regionene er clustret slik som tilfellet er i HLA-DQ-a, blir et oligonukleotid benyttet for hvert arveanlegg. Hvis områdene er spredd, slik som tilfellet er ved HLA-DQ-P og HLA-DR-P, vil mer enn en probe, hver omfattende en arveanleggsvariant, benyttes for hvert av disse. Når det gjelder HLA-DQ-p og HLA-DR-e, blir disse prober benyttet for de tre regioner av den locus der arve-anleggsvariasjonene kan opptre. For detektering av insulin-avhengig diabetes mellitt, IDDM, benyttes fire prober for HLA-DR-p andre exon.

Haplotyper kan oppnås fra segregeringsanalyse i familier eller i enkelte tilfeller ved direkte analyse av den individuelle DNA-prøve. Spesifikke arveanleggskombinasjoner, haplotyper, av sekvens-spesifikke oligonukleotid-reaktivi-teter kan identifisere heterozygøse celler ved å bruke restriksjonsenzym-nedbrytning av de genome DNA før forsterkning.

Hvis man for eksempel i DQ-P finner tre sterkt variable sub-områder A, B og C i et enkelt forsterket området, og hvis det er seks forskjellige sekvenser ved hver region (Al-6, Bl-6, Cl-6) kan et individ types i DQ-B locus ved sekvens-spesifikk oligonukleotidprobeanalyse til inneholdende Al, A2, B2, B3, Cl, C4 med de mulige haplotypekombinasjoner av Al, B2, Cl; Al, B2, C4; A2, B2, Cl; A2, B2, C4; Al, B3, Cl; Al, B3, C4; Al, B2, Cl og Al, B2, C4.

Hvis det genome DNA brytes ned med et polymorft restriksjonsenzym for forsterkning og hvis enzymet skjærer begge arveanlegg mellom primerne er det ingen reaktivitet med de sekvens-spesifikke prober på grunn av mangelen på forsterkning, og resultatet er ikke informativt. Hvis enzymet Ikke skjærer arveanlegg, resulterer det hele i nedbrutt og ikke-nedbrutt genom-DNA av samme type og resultatet er ikke informativt. Hvis enzymet kun skjærer et arveanlegg, kan man imidlertid analysere begge haplotyper ved å sammenligne proberaktivitetmønstrene på nedbrutt og ikke-nedbrutt DNA.

Haplotypene kan deduseres ved å sammenligne sekvens-spesifikke oligonukleotidreaktiviteter med ikke-skåret genom-DNA og genom-DNA som er skåret med ett eller flere enzymer som er kjente å være polymorfe og erkjenne seter mellom primerne.

Lengden av det sekvens-spesifikke oligonukleotid vil avhenge av mange faktorer inkludert det spesielle målmolekyl som detekeres, oligonukleotidkilden og nukleotidsammnsetningen. For oppfinnelsens formål inneholder det sekvens-spesifikke oligonukleotid karakteristisk 15-25 nukleotider, selv om det kan inneholde flere eller færre slike. Mens oligonukleotidene som er av en lengde på minst 19-merer kan forbedre spesifisitet og/eller sensitivitet, kan prober som er mindre enn 19-merer, for eksempel 16-mer-prober, viser mer sekvens-spesifikk diskriminering, antagelig på grunn av at en enkelt mistilpasning er mer destabiliserende. Fordi forsterkningen øker spesifisiteten, slik at en større lengde er mindre kritisk, og hybridisering- og vasketemperaturer kan være lavere for den samme saltkonsentrasjon, er det foretrukket å benytte oligonukleotider som er kortere enn 19-merer.

Der prøven først plasseres på membranet og så detekteres med oligonukleotidet, må dette merkes med en egnet merkedel som kan detekteres på spektroskopisk, fotokjemisk, biokjemisk, immunokjemisk eller kjemisk måte. Immunokjemisk måte inkluderer antistoffer som er i stand til å danne et kompleks med oligonukleotidet under egnede betingelser og biokjemiske midler inkluderer polypeptider eller lectiner som er i stand til å danne et kompleks med oligonukleotidet under de riktige betingelser. Eksempler inkluderer fluorescente farvestoffer, elektron-tette reagenser, enzymer som kan avsette uoppløse-lige reaksjonsprodukter eller detekteres kromogent, som pepperrotperoksydase, alkalisk fosfatase, en radioaktiv merkelapp som ^2p f eller biotin. Hvis biotin benyttes, kan en manøvreringsarm benyttes for å feste den til oligonukleotidet. Fortrinnsvis er merkelappdelen pepperrotperoksydase.

Alternativt blir i et "reverse" dot-blott-format minst en av primerne og minst et av de fire nukleotidtrifosfater merket med en detekterbar merkelapp slik at den resulterende forsterkede sekvens merkes. Disse merkede deler kan være tilstede til å begynne med i reaksjonsblandingen eller tilsettes under en senere cyklus av forsterkningen for å innføre merkelappen på forsterkningsproduktet. Derefter blir et ikke-merket sekvens-spesifikt oligonukleotid som er i stand til hybridisering med den forsterkede nukleinsyresekvens, hvis sekvensvariasjonene eller -variasjonene (uansett normalt eller mutant) er tilstede, spottet på eller festet til membranet under prehybridiseringsbetingelser som beskrevet ovenfor. Den forsterkede prøve blir så satt til det på forhånd behandlede membran under hybridiseringsbetingelser som beskrevet ovenfor. Til slutt benyttes detekteringsmidler for å bestemme hvorvidt en forsterket sekvens i nukleinsyreprøven har hybridisert til oligonukleotidet som er festet til membranet. Hybridisering vil skje kun hvis den membran-bundne sekvens som inneholder variasjonen er tilstede i f orsterkningsproduktet, det vil si kun hvis en sekvens av proben er komplementær til et område av den forsterkede sekvens.

I en annen versjon av det "reverse" dot-blott-format, gjennomføres forsterkningen uten å anvende en merkelapp som med det "rett frem" dot-blott-format som beskrevet ovenfor, og en merket sekvens-spesifikk oligonukleotidprobe som er i stand til hybridisering med den forsterkede nukleinsyresekvens inneholdende variasjonen, hvis den er tilstede, festes til membranen under prehybidiseringsbetingelser som beskrevet ovenfor. Den forsterkede prøve settes så til det på forhånd behandlede membran under hybridiseringsbetingelser som beskrevet ovenfor. Derefter kan det merkede oligonukleotid eller et fragment derav frigis fra membranet på en slik måte at detekteringsmidler kan benyttes for å bestemme om en forsterket sekvens i prøven hybridiserte til det merkede oligonukleotid. Frigjøringen kan skje for eksempel ved til membranet å sette et restriksjonsenzym som erkjenner et restriksjonssete i proben. Denne prosedyre, kjent som oligomerrestriksjon, er beskrevet mer utførlig i EP 0 164 054. 1 både "rett frem" og "reverse" dot-blott-metoden inkluderer de genetiske mangler som kan detekteres spesifikke utelatelser, Innskudd og/eller substitusjoner i en hvilken som helst basepar-mutasjon eller polymorfi i nukleinsyrer, for eksempel genom-DNA, fra enhver organisme. Eksempler på mangler hvori basepar-variasjon er kjent inkluderer sigdcelleanemi, hemoglobin C-mangel, a-talassemi, p<->talassemi og lignende. Andre mangler som kan detekteres inkluderer cancerøse mangler slik som de som involverer RAS-onkogener, for eksempel n-RAS-onkogener, og infektiøse mangler.

En dot-blott-prosess kan også benyttes for HLA-typing i områder med vevtransplantasjoner, mangelsykdomsømfintlighet og paternitetsbestmmelse. HLA-klasse-II-gener bestående av a-og P-genene fra HLA-DR-, HLA-DQ- og HLA-DP-områdene, er sterkt polymorfe; deres genetiske kompleksitet på DNA-nivået er signifikant større enn den polymorfi som idag defineres ved serologisk typing. I tillegg kan foreliggende fremgangsmåte benyttes til å detektere fire DNA-sekvenser som koder for HLA-klasse-II-p-proteiner (for eksempel DR-P) forbundet med insulin-avhengig diabetes mellitt, IDDM. Kort sagt blir de fire DNA-sekvenser som er forbundet med IDDM valgt blant gruppen:

eller DNA-strenger som er komplementære dertil. Sekvens-spesifikke prober kan fremstilles som vil hybridisere til en eller flere av disse sekvenser.

Forskjellige infektiøse sykdommer kan diagnostiseres ved nærvær i kliniske prøver av spesifikke DNA-sekvenser som er karakteristiske for den kausative mikroorganisme. Disse inkluderer bakterier, som Salmonella, Chlamydia, Neisseria; viruser som hepatittvirus og parasitter som det Plasmodium som er ansvarlig for malaria. US-reissue B14 358 535 av 13. mai 1986 beskriver bruken av spesifikke DNA-hybridiserings-prober for diagnose av infektiøse sykdommer. Et relativt lite antall patogene organismer kan være tilstede i en klinisk prøve fra en infisert pasient og det DNA som ekstraheres fra disse kan utgjøre kun en meget liten fraksjon av det totale DNA i prøven. Spesifikk forsterkning av mistenkelige sekvenser før immobilisering og hybridiseringsdetektering av DNA-prøvene kan sterkt forbedre sensitiviteten og spesifisiteten for de tradisjonelle prosedyrer.

Rutinemessig klinisk bruk av DNA-prober for diagnose av infektiøse sykdommer ville i vesentlig grad forenkles hvis ikke radioaktivt merkede prober kunne benyttes som beskrevet i EP 0 063 879. Ved denne prosedyre blir biotinholdige DNA-prober detektert ved kromogene enzymer bundet til avidin-eller biotin-spesifikke antistoffer. Denne type detektering er hensiktsmessig, men relativt ufølsom. Kombinasjonen av en spesifikk DNA-forsterkning ved foreliggende fremgangsmåte og bruken av stabilt merkede prober kunne tilveiebringe den bekvemmelighet og følsomhet som er nødvendig for å gjøre Falkow- og Ward-prosedyrene brukbare i et rutinemessig klinisk oppsett.

En spesifikk bruk av forsterkningsteknologien for detektering eller overvåking med henblikk på Aids-virus beskrives som følger. Forsterknings- og detekteringsprosessen benyttes med primere og prober som er designert til å forsterke henholdsvis detektere nukleinsyresekvenser som i det vesentlige bevares blant nukleinsyrene i Aids-virusene og spesifikt for nukleinsyrer i Aids-virusene. Således må sekvensene som skal detekteres være tilstrekkelig komplementære til nukleinsyrene i Aids-virusene til å initiere polymerisering, fortrinnsvis ved romtemperatur, i nærvær av enzymet og nukleotidtrifosfatene.

I tillegg kan proben være en biotinylert probe der biotinet er bundet til et avstandselement med formelen: der Y er 0, NB eller N-CHO, x er et helt tall fra 1 til 4, og y er et helt tall fra 2 til 4. Avstandselementet i sin tur er bundet til en psoralendel med formelen:

Psoralendelen interkalerer inn i og kryssbinder en "gapped circle"-probe som beskrevet av Courage-Tebbe et al., "Biochim. Biophys. Acta", 697 (1982) 1-5, hvori det enkeltstrengede hybridiseringsområdet av denne spaltede sirkel spenner over området som er inneholdt i primerne. Detaljer ved denne biotinyleringen og dot-blott-prosedyren er mer fullstendig beskrevet i US-PS 4 582 789 og 4 617 261.

Forsterkningsprosessen kan også benyttes for å gi tilstrekkelige mengder DNA fra en enkelt kopi-humangen slik at detektering ved hjelp av en enkelt ikke-spesifikk DNA-stamme som etidiumbromid kan benyttes for direkte diagnostisering av

DNA.

I tillegg til detektering av infektiøse sykdommer og patolo-giske abnormaliteter i genomene til organismene, kan forsterkningsprosessen også benyttes for å detektere DNA-polymorfi som ikke behøver å være forbundet med noen pato-logisk tilstand.

Som en oppsummering synes forsterkningsprosessen å tilveiebringe en fremgangsmåte for forsterkning av en eller flere spesifikke nukleinsyresekvenser ved bruk av en kjedereaksjon og et termostabilt enzym hvori reaksjonsprimerekstensjons-produktene fremstilles som derefter kan virke som sjabloner for ytterligere primerekstensjonsreaksjoner. Prosessen er spesielt brukbar ved detektering av nukleinsyresekvenser som til å begynne med er tilstede kun i meget små mengder.

De følgende eksempler skal illustrere oppfinnelsen. I disse eksempler er alle prosentandeler på vektbasis for faststoffer og på volumbasis for væsker hvis ikke annet er sagt, og alle temperaturer er gitt i °C.

EKSEMPEL I

I. Syntese av primerne

De følgende to oligonukleotidprimere ble fremstilt ved den metode som er beskrevet nedenfor:

Disse primere, begge 20-merer, forbinder seg til motsatte strenger av det genome DNA med deres 5'-ender adskilt i en avstand på 110 basepar.

A. Automatisert synteseprosedyre: Dietylfosforami-dittene, syntetisert i henhold til Beaucage og Caruthers ("Tetrahedron Letters" (1981) 22:1859-1862) ble sekvensielt kondensert til en nukleosid deriva-tisert kontrollert poreglassbærer. Prosedyren inkluderte ditritylering med trikloreddiksyre i diklormetan, kondensering ved bruk av benzotriazol som aktiveringsprotondonor og oppkutting med eddik-syreanhydrid og dimetylaminopyridin i tetrahydrofuran og pyridin. Cyklustiden var ca. 30 minutter. Utbytter på hvert trinn var i det vesentlige kvantitativt og ble bestemt ved samling og spektroskop!sk under-søkelse av det dimetoksytritylalkohol som ble frigitt under detritylering.

B. Oligodeoksyribonukleotidavbeskyttelse og -rensings-prosedyre: Den faste bærer ble fjernet fra kolonnen og eksponert til 1 ml konsentrert ammoniumhydroksyd ved romtemperatur i 4 timer i et lukket rør. Bæreren ble så fjernet ved filtrering og oppløsningen inneholdende det partielt beskyttede oligodeoksyd-nukleotid ble bragt til 55"C i 5 timer. Ammoniakk ble fjernet og resten ble lagt på en preparativ polyakrylamidgel. Elektroforesen ble gjennomført ved 30 Volt/cm i 90 minutter hvorefter båndet inneholdende produktet ble identifisert ved UV-skygging av en fluorescent plate. Båndet ble skåret ut og eluert med 1 ml destillert vann over natten ved 4°C. Denne

oppløsning ble bragt på en RP-HPLC-kolonne og eluert med 7-13$ gradient av acetonitril i 1$ ammonium-acetatbuffer ved pH 6,0. Elueringen ble overvåket ved UV-absorbans ved 260 nm og den riktige fraksjon samlet, kvantitert ved UV-absorbans i et fiksert

volum og fordampet til tørr tilstand ved romtemperatur i en vakuumsentrifuge. C. Karakterisering av oligodeoksyribonukleotider: Prøvemengder av de rensede oligonukleotider ble<32p_>merket med polynukleotidkinase og ^-^ P- ATP. De merkede forbindelser ble undersøkt ved autoradiografi av 14-20$ polyakrylamidgeler efter elektroforese i 45 minutter ved 50 Volt/cm. Denne prosedyre verifiserer molekylvekten. Basissammensetningen ble bestemt ved nedbrytning av oligodeoksyribonukleotidet til nukleosider ved hjelp av venomdiesterase og bakteriell alkalisk fosfatase og efterfølgende separering og kvantitering av de avledede nukleosider ved bruk av en reversfase-EPLC-kolonne og en 10$ acetonitril-1$ ammoniumacetat- mobilfase. II. Isolering av humangenom- DNA fra cellelln. le Høymolekylvektsgenom-DNA ble isolert fra en T-cellelinje, Molt 4, homozygøs for normal p<->globin tilgjengelig fra Human Genetic Mutant Cell Depository, Camden, NJ som GM2219C, ved bruk av metoden i det vesentlige i henhold til Maniatis et al., supra, s. 280-281. III. Rensing av en polymerase fra Thermus aquaticus Thermus aquaticus-stamme YT1, tilgjengelig uten begrensning fra ATCC under nummeret 25 104 ble dyrket i kolber i følgende medium:

(pH-verdien ble justert til 8,0 før autoklavering. )

En 10-liters fermenter ble inokulert fra en podingskolbe dyrket over natten i det ovenfor angitte medium ved 70"C. Tilsammen 600 ml fra podingskolben ble benyttet for å inokulere 10 liter av det samme medium. pH-verdien ble regulert til 8,0 med ammoniumhydroksyd der det oppløste oksygen var 40$, med en temperatur på 70 °C og der omrøringshastigheten var 400 omdr./min.

Efter dyrking av cellene ble disse renset ved bruk av opplegget (med lette modifikasjoner) i henhold til Kaledin et al., supra, gjennom de første fem trinn og ved bruk av et annet opplegg for det sjette trinn. Alle seks trinn ble gjennomført ved 4°C. Fraksjonerings-hastigheten på kolonnene var 0,5 kolonner pr. time og volumene for gradienten under elueringen var 10 kolonnevolumer. En alternativ og foretrukket rensemetode er gitt i eksempel VI nedenfor.

Kort sagt ble den ovenfor angitte kultur av T. aquaticus-celler høstet ved sentifugering efter 9 timers dyrking i sen logfasen, ved en celledensitet på 1,4 g tørrvekt pr. liter. 20 g celler ble omsuspendert i 80 ml av en buffer bestående av 50 mM Tris*HCl, pH 7,5, 0,1 mM DTA. Cellene ble lysert og lysatet ble sentrifugert i 2 timer ved 35 000 omdr./min. i en rotor ved 4°C. Supernatanten ble samlet, fraksjon A, og den proteinfraksjon som precipiterte mellom 45 og 75$ metning av ammoniumsulfat ble samlet, oppløst i en buffer bestående av 0,2 M kaliumfosfatbuffer, pH 6,5, 10 mM 2-merkaptoetanol og 5$ glyserol, og til slutt dialysert mot den samme buffer for derved å oppnå fraksjon B

Fraksjon B ble lagt på en 2,2 x 30 cm kolonne av DEAE-cellulose, ekvilibrert med den ovenfor angitte buffer. Kolonnen ble så vasket med den samme buffer og fraksjonene inneholdende protein (bestemt ved absorbans ved 280 nm) ble samlet. Den kombinerte proteinfraksjon ble dialysert mot en andre buffer inneholdende 0,01 M kaliumfosfatbuffer, pH 7,5, 10 mM 2-merkaptoetanol og 5$ glyserol, hvorved man oppnådde fraksjon C.

Fraksjon C ble lagt på en 2,6 x 21 cm kolonne av hydroksyapatitt, ekvilibrert med en andre buffer. Kolonnen ble så vasket og enzymet ble eluert med en lineær gradient av 0,01-05 M kaliumfosfatbuffer, pH 7,5, inneholdende 10 mM 2-merkaptoetanol og 5$ glyserol. Fraksjoner inneholdende DNA-polymeraseaktivitet (90-180 mM kaliumfosfat) ble kombinert, konsentrert fire ganger ved bruk av en Amicon omrørt celle og YMIO-membran, og dialysert mot den andre buffer for derved å oppnå fraksjon D.

Fraksjon D ble lagt på en 1,6 x 28 cm kolonne av DEAE-cellulose, ekvilibrert med den andre buffer. Kolonnen ble vasket og polymerasen ble eluert med en lineær gradient på 0,01-0,5 M kaliumfosfat i den andre buffer. Fraksjonene ble analysert for kontaminerende endonu-kleaser og eksonukleaser ved elektroforetisk detektering av endringen i molekylvekt av fag-X-DNA eller superviklet plasmid-DNA efter inkubering med et overskudd av DNA-polymerase (for endonuklease) og efter behandling med et restriksjonsenzym som spalter DNA i diverse fragmenter (for eksonuklease). Kun de DNA-polymerase-fraksjoner (65-95 mM kaliumfosfat) med minimal nuklease-forurensning ble slått sammen. Til dette ble det satt autoklavert gelatin i en mengde av 250 pg/ml og dialysen ble gjennomført mot den andre buffer for derved å oppnå fraksjon E.

Fraksjon E ble lagt på en f osf ocellulosekolonne og eluert med en 100 ml gradient (0,01-0,4 M KCl-gradient i 20 mM kaliumfosfatbuffer, pH 7,5). Fraksjonene ble analysert med henblikk på kontaminerende endo/eksonukleaser som beskrevet ovenfor, så vel som med henblikk på polymeraseaktivitet (i henhold til Kaledin et al.) og så slått sammen. De sammenslåtte fraksjoner ble dialysert mot den andre buffer, så konsentrert ved dialyse mot 50$ glyserol og den andre buffer.

Molekylvekten til polymerasen ble bestemt ved SDS PAGE. Markørproteiner var fosforylase B (92 500), bovinserumalbumin (66 200), ovalbumin (45 000), karbonisk anhydrase (31 000), soyabønnetrypsin-inhibitor (21 500) og lysozym (14 400).

Preliminære data antyder at polymerasen har en molekylvekt på ca. 86 000-90 000 dalton og ikke 62 000-63 000 dalton som angitt i litteraturen (for eksempel av Kaledin et al.).

Polymerasen ble inkubert i 50 pl av en blanding inneholdende 25 mM Tris-ECl, pH 6,4 og pH 8,0, 0,1 M KC1, 10 mM MgCl2t1 mM 2-merkaptoetnol, 10 nmol hver av dGTP, dATP og TTP og 0,5 pCi (<3>H) dCTP, 8 pg "aktivert" kalvethymus-DNA, og 0,5-5 enheter polymerse. "Aktivert" DNA er et nativt preparat av DNA efter partiell hydrolyse med DNase I inntil 5$ DNA var overført til den syreoppløselige fraksjon. Reaksjonen ble gjennomført ved 70°C i 30 minutter og stanset ved tilsetning av 50 pl av en mettet vandig oppløsning av natriumpyrofosfat inneholdende 0,125 M EDTA-Na2• Prøvene ble behandlet og aktiviteten ble bestemt som angitt av Kaledin et al., ovenfor.

Resultatene viste at ved pH 6,4 var polymerase mer enn halvparten så aktiv som ved pH 8,0. Imidlertid fant

Kaledin et al. at ved en pH-verdi på ca 7,0, hadde enzymet 8% av aktiviteten ved pH 8,3. Derfor er pH-profilen for det termostabile enzym bredere enn for enzymet i henhold til Kaledin et al.

Til slutt ble når kun en eller flere nukleosidtrifosfater ble eliminert fra en DNA-polymerase-analyse-reaksjonsblanding kun lite hvis overhodet noen aktivitet observert ved bruk av det her angitte enzym, og aktiviteten var konsistent med den forventede verdi og med et enzym som viste høy tilpasningsevne. I motsetning til dette er den aktivitet som observeres ved bruk av enzymet i henhold til Kaledin et al. ovenfor ikke konsistent med den forventede verdi og antyder misinn-arbeiding av ett eller flere nukleosidtrifosfater.

IV. Forsterkningsreaks. ion.

1 pg av det ovenfor beskrevne genom DNA ble fortynnet i

et opprinnelig 100 pl vandig reaksjonsvolum inneholdende

25 mM Tris-HCl-buffer (pH 8,0), 50 mM KC1, 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 200 pg/ml gelatin, 1 pM primer PC03, 1 pM primer PC04, 1,5 mM dATP, 1,5 mM dCTP, 1,5 mM dGTP

og 1,5 mM TTP. Prøven ble oppvarmet i 10 minutter til 98°C for å denaturere dette genom-DNA og så avkjølt til romtemperatur. 4 pl av polymerase fra Thermus aquaticus ble satt til reaksjonsblandingen og dekket med et 100 pl mineraloljelokk. Prøven ble så anbragt i oppvarmingsblokken i væskebehandlings- og oppvarmingsinstrumentet som beskrevet ovenfor ved bruk av pipetter som var programmert for å avgi væske og en temperaturkontroll-anretning for å bevirke temperaturendringer.

DNA-prøven undergikk 20 cykler forsterkning i maskinen idet man gjentok den følgende programcyklus: 1) Oppvarming fra 37°C til 98"C i varmeblokk i løpet av en periode på 2,5 minutter; og 2) Avkjøling fra 68°C til 37°C i løpet av en periode på 3 minutter for å tillate primer-DNA-sammenføyning. Efter den siste cyklus ble prøven inkubert i ytterligere 10 minutter ved 55°C for å fullføre den endelige ekstensjonsreaksjon.

V. Syntese og fosforylering av oligodeoksyribonukleotid-prober

En merket DNA-probe kalt RS24 med følgende sekvens ble fremstilt: hvor<*>antyder merkelappen. Denne probe er 40 baser lang og overspenner den fjerde til syttende kodon av genet, og er komplementær til det normale p<->globin-arveanlegg, pA. Det skjematiske diagram for primere og prober er gitt nedenfor.

Denne probe ble syntetisert i henhold til prosedyrene som beskrevet i avsnitt I i eksempel I. Proben ble merket ved å kontakte 20 pmol derav med 4 enheter T4-polynukleotidkinase og ca. 40 pmol -y-32P-ATP (ca. 7000 Ci/mmol) i et 40 pl reaksjonsvolum inneholdende 70 mM Tris-buffer (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 1,5 mM spermin og 10 mM ditiotreitol i 60 minutter ved 37°C. Det totale volum ble så justert til 100 pl med 25 mM EDTA og renset i henhold til Maniatis et al. supra, s. 466-467 over en 1 ml spinndialysekolonne som er ekvilibrert med Tris-EDTA, TE, buffer (10 mM Tris-buffer, 0,2 mM EDTA, pH 8,0). TCA-precipitering av reaksjonsproduktet indikerte at for RS24 var den spesifikke aktivitet 4,3 pCi/pmol og sluttkonsentrasjonen var 0,118 pmol/pl.

VI. Dot- blott- hybridlseringer

4 pl av den forsterkede prøve av del IV og 5,6 pl egnede

fortynninger av p-globin plasmid DNA som ble beregnet til å representere forsterkningseffektiviteter på 70, 75, 80, 85, 90, 95 og 100$ ble fortynnet med 200 pl 0,4N NaOE, 25 mM EDTA og avsøkt på et nylonfilter ved først å fukte filteret med vann, og anbringe dette i en apparatur for fremstilling av dot-blott som holdt filtrene på plass, påføring av prøvene og å skylle hver brønn med 0,1 ml 20 x SSPE (3,6 M NaCl, 200 mM NaH2P04, 20 mM EDTA) som beskrevet av Reed og Mann, "Nucleic Acids Research", 13, 7202-7221 (1985). Filtrene ble så fjernet, skyllet i 20 x SSPE og oppvarmet i 30 minutter til 80°C i en vakuumovn.

Efter varmebehandlingen ble hvert filter så bragt i kontakt med 16 ml av en hybridiseringsoppløsning bestående 3 x SSPE, 5 x Denhardts oppløsning (1 x = 0,02$ polyvinylpyrrolidon, 0,02$ Ficoll, 0,02$ bovinserumalbumin, 0,2 mM Tris, 0,2 mM EDTA, pH 8,0), 0,5$ SDS og 30$ formamid, og inkubert i to timer ved 42° C. Derefter ble 2 pmol probe RS24 satt til hybridiserings-oppløsningen og filteret ble inkubert i 2 minutter ved 42°C.

Til slutt ble hvert hybridisert filter vasket med 2 x 100 ml 2 x SSPE og 0,1$ SDS i 10 minutter ved romtemperatur. Derefter ble filtrene behandlet en gang med 100 ml 2 x SSPE, 0,1$ SDS ved 60°C i 10 minutter.

Hver filter ble så autoradiografert der signalet lett kom til syne efter 2 timer.

VII. Diskusjon av autoradiogrammet

Autoradiogrammet av disse dot-blotts ble analysert efter 2 timer og sammenlignet når det gjelder intensitet med

standard seriefortynnings-p<->globin-rekonstruksjoner fremstilt med HaelII/Mael-nedbrutt pBR:p<A>, der pA er villtype-anlegget som beskrevet av Saiki et al., "Science", supra.

Analysen av reaksjonsproduktet indikerte at den totale forsterkningseffektivitet var ca. 95$, noe som tilsvarte en 630 000 gangers økning i p<->globin-målsekvensen.

EKSEMPEL II

I. Forsterkningsreaks. lon

To 1 pg prøver av genom-DNA ekstrahert fra Molt 4-cellelinjen som beskrevet i eksempel I ble fortynnet i et 100 pl reaksjonsvolum inneholdende 50 mM KC1, 25 mM Tris-HCl-buffer, pH 8,0, 10 mM MgCl2, 1 pM primer PC03, 1 pM primer PC04, 200 pg/ml gelatin, 10$ dimetylsulfoksyd (volum) og 1,5 mM hver av dATP, dCTP, dGTP og TTP. Efter at denne blandingen var oppvarmet i 10 minutter til 98° C for å denaturere genom-DNA ble prøvene avkjølt til romtemperatur og 4 pl polymerase fra Thermus aquaticus som beskrevet i eksempel I ble satt til hver prøve. Prøvene ble pålagt mineralolje for å forhindre kondensasjon og fordampningstap.

En av prøvene ble anbragt i oppvarmingsblokken til en maskin som beskrevet i eksempel I og underkastet 25 cykler forsterkning der syklene fulgte følgende mønster: 1) Oppvarming fra 37°C til 93°C i løpet av 2,5 minutter; 2) Avkjøling fra 93° C til 37° C i et tidsrom på 3 minutter for å tillate utreagering av primere og DNA;

og

3) å holde temperaturen 37°C i 2 minutter.

Efter den siste cyklus ble prøven inkubert i ytterligere 10 minutter ved 60°C for å fullføre den endelige ekstensjonsreaksjon.

Den andre prøve ble anbragt i en varmeledende beholder av en temperaturcykliserings (oppvarming og avkjøling)-maskin. I denne maskin blir den varmeledende beholder forbundet ved hjelp av Peltier-varmepumper som justerer temperaturene oppover eller nedover og mikroprosessor-kontroller som automatisk styrer forsterkningssekvensen, temperaturnivåene, temperaturutgangspunktet og tempera-turens tidsstyring.

Den andre prøve ble underkastet 25 cykler forsterkning som fulgte følgende program: 1) Oppvarming fra 37°C til 95°C i løpet av 3 minutter; 2) Å opprettholde 95° C i 0,5 minutter for å tillate denaturering; 3) Avkjøling fra 95°C til 37°C i løpet av ett minutt; og

4) Å opprettholde 37°C i ett minutt.

II. Analyse

To prøver ble gjennomført for analyse, en dot-blott og en agarosegelanalyse.

For den førstnevnte ble det fremstilt en merket DNA-probe kalt RS18 med følgende sekvens: der<*>antyder merkelappen. Denne probe er 19 baser lang, spenner over kodonene fra den fjerde til den syttende i genet og er komplementær til det normale p-globin-arveanlegg, p<->^. Det skjematiske diagram for primere og prober er gitt nedenfor:

Denne probe ble syntetisert i henhold til de prosedyrer som er beskrevet i del I av eksempel I. Proben ble merket ved å bringe i kontakt 10 pmol med 4 enheter T4 polynukleotidkinase og ca. 40 pmol -y-<3>2P-ATP (ca. 7000 Ci/mmol) i et 40 pl reaksjonsvolum inneholdende 70 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 1,5 mM spermin og 10 mM ditiotreitol i 60 minutter ved 37°C. Det totale volum ble så justert til 100 pl med 25 mM EDTA og renset i henhold til Maniatis et al. supra, s. 466-467 over en 1 ml spinndialysekolonne som er ekvilibrert med Tris-EDTA, TE, buffer (10 mM Tris'HCl-buffer, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). TCA-precipitering av reaksjonsproduktet indikerte at for RS18 var den spesifikke aktivitet 4,6 pCi/pmol og sluttkonsentrasjonen var 0,114 pmol/pl. 5 pl av den forsterkede prøve fra del I og av en prøve forsterket som beskrevet ovenfor bortsett ved bruk av Klenow-fragmentet av E. coli DNA-polymerase-I i stedet for det termostabile enzym, ble fortynnet med 195 pl 0,4 N NaOE, 25 mM EDTA og lagt på to repl ikat-nylonf il tre ved først å fukte filtrene med vann, anbringe disse i en apparatur for fremstilling av dot-blott som holder fibrene på plass, påføring av prøvene og skylling av hver brønn med 0,4 ml 20 x SSPE (3,6 M NaCl, 200 mM NaH2P04, 20 mM EDTA), som beskrevet av Reed og Mann, supra. Filtrene ble derefter fjernet, skyllet i 20 x SSPE og varmebehandlet i 30 minutter ved 80" C i en vakuumovn.

Efter varmebehandling ble hvert filter så bragt i kontakt med 6 ml av en hybridiseringsoppløsning bestå ende av 5 x SSPE, 5 x Denhardts oppløsning (1 x = 0,02$ polyvinylpyrrolidon, 0,02$ Ficoll, 0,02$ bovinserumalbumin, 0,02 mM Tris, 0,2 mM EDTA, pH 8,0) og 0,5$ SDS og inkubert i 60 minutter ved 55°C. Derefter ble 5 pl av proben RS18 satt til hybridiseringsoppløsningen og filteret ble inkubert i 60 minutter ved 55°C.

Til slutt ble hvert hybridiserte filter vasket med 2 x 100 1 2 x SSPE og 0,1$ SDS i 10 minutter ved romtemperatur. Derefter ble filtrene behandlet to ganger til med 100 ml 5 x SSPE, 0,1$ SDS ved 60°C i 1 henholdsvis 3 minutter.

Hvert filter ble så autoradiografert med signalet lett erkjent efter 90 minutter.

I agarosegelanalysen var 5 pl av hver forsterkningsreaksjon fylt på 4$ Nu-sikt/0,5$ agarosegel i 1 x TBE-buffer (0,089 M Tris, 0,089 M borsyre og 2 mM EDTA) og elektro-foresert i 60 minutter ved 100 V. Efter flekking med etidiumbromid ble DNA visualisert ved UV-fluorescens.

Resultatene viser at de maskiner som ble benyttet i eksempel I og i dette eksempel var like effektive ved forsterkning av DNA, viste diskrete høyintensitets 110 baseparbånd med tilsvarende intensitet, tilsvarende den ønskede sekvens, så vel som noen andre diskrete bånd med meget lavere intensitet. I motsetning til dette ga forsterkningsmetoden som involverte reagensoverføring efter hver cyklus ved bruk av Klenow-fragmentet av E. coli polymerse I en DNA-"smørje" som oppsto fra den ikke-spesifikke forsterkning av mange ikke-relaterte DNA-sekvenser.

Det er forventet at tilsvarende forbedringer i forsterkningen og detekteringen ville kunne oppnås ved eva-luering av HLA-DQ-, -DR- og -DP-områdene.

Hvis i de ovenfor angitte eksperimenter forsterknings-reaksjonsbufferen inneholder 2 i stedet for 10 mM MgCl2og 150-200 jiM av hvert nukleotid i stedet for 1,5 mM av hver, og hvis den nedre temperatur på 37°C heves til 45-58° C under forsterkning, skjer bedre spesifisitet og effektivitet. Videre ble DMSO ikke funnet nødvendig eller foretrukket for forsterkning.

EKSEMPEL III

Forsterkning og kloning

For forsterkning av et 119 baseparfragment av human P-globingen, ble tilsammen 1 jig hver av humangenom DNA isolert fra Molt 4 cellelinjen eller fra GM2064-cellelinjen (som representerer en homozygøs utelatese av p- og S-hemo-globinområdet og er tilgjengelig fra the Human Genetic Mutant Cell Depository, Camden, NJ) som beskrevet ovenfor, forsterket i et 100 jil reaksjonsvolum inneholdende 50 mM KC1, 25 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM MgCl2, 200 jig/ml geatin, 5 mM 2-merkaptoetanol, 1,5 mM hver av dATP, dCTP, TTP og dGTP og 1 jiM hver av de følgende primere:

der de små bokstaver angir mistilpasninger fra villtype-sekvensen for tildanning av restriksjonsenzymseter. GH18 er en 26 base oligonukleotid som er komplementær til den negative streng og inneholder et indre Pstl-sete. GH19 er et 29 base oligonukleotid som er komplementært til pluss-strengen og inneholder en indre Hindlll-erkjennelsessekvens.

Disse primere ble valgt ved først å avsøke områdene i genet for homologi til Pstl- og Hindlll-restriksjonssetene. Primerne ble så fremstilt som beskrevet i eksempel I.

Den ovenfor angitte reaksjonsblanding ble oppvarmet i 10 minutter til 95°C og så avkjølt til romtemperatur. Tilsammen 4 pl av polymerasen som "beskrevet i eksempel I ble satt til hver reaksjonsblanding og derefter ble hver blanding dekket med mineralolje. Reaksjonsblandingen ble underkastet 30 cykler forsterkning med følgende program:

2,5 min. "ramp", 37 til 98°C

3 min. "ramp", 98 til 37°C

2 min. "soak", 37°C

Efter den siste cyklus ble reaksjonsblandingen inkubert i 20 minutter ved 65°C for å fullføre den ferdige ekstensjon. Mineraloljen ble ekstrahert med kloroform og blandingen ble lagret ved -20°C.

Tilsammen 10 pl av det forsterkede produkt ble brutt ned med 0,5 pg M13mpl0-kloningsvektor av tilgjengelig type, i et 50 pl volum inneholdende 50 mM NaCl, 10 mM Tris'HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 20 enheter Pstl og 26 enheter Hindlll i 90 minutter ved 37°C. Reaksjonen ble stanset ved nedfrysing til -20°C. Volumet ble justert til 110 pl med TE-buffer og 100 pl ble fylt på en 1 ml BioGel P-4-spinndialysekolonne. En 0,1 ml fraksjon ble samlet og etanol precipitert.

(På dette punkt ble det oppdaget at det var p-globin-forsterkningsproduktet i GM2064-prøven. Efterfølgende forsøk oppsporet kilden for forurensning for primerne, nemlig enten GH18 eller GH19. Fordi ingen andre primerkilder var tilgjengelige, ble forsøkene fortsatt under den forutsetning at visse klonede sekvenser ville kunne avledes fra det kontaminerende DNA i primerne.)

Etanolpelleten ble resuspendert i 15 pl vann og derefter justert til 20 pl volum inneholdende 50 mM Tris'HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 0,5 mM ATP, 10 mM dtiotreitol og 400 enheter ligase. [En enhet er den mengde enzym som er nødvendig for å gi 50$ ligering av Hindlll-nedbrutt X DNA I løpet av 30 minutter ved 16° C i 20 pl ved en 5'-terminikonsentrasjon på 0,12 mM (ca. 330 pl/ml)]. Denne blanding ble inkubert i 3 timer ved 16°C. 10 pl ligeringsreaksjonsblanding inneholdende Molt 4 DNA ble transformert til E. coli-stamme JM103 kompetente celler som er generelt tilgjengelige. Prosedyren som fulgte for prepa-rering av den transformerte stamme er beskrevet av Messing, J. (1981) "Third Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA", utg. A. Walton, Elsevier, Amsterdam, 143-163. Tilsammen 651 farveløse plaquer (og ingen blå plaquer) ble oppnådd. Av disse hadde 119 et (+)-strenginnskudd tilsvarende 18$ og 19 hadde et (-)-strenginnskudd tilsvarende 3$. Dette er en økning på så å si 20 ganger i forhold til prosentandelen p<->globin positive plaquer blant de primer-positive plaquer som oppnås fra forsterkningsteknikken som bruker Klenow-fragmentet av E. coli polymerase I, der reaksjonen gikk frem i 2 minutter ved 25 "C hvorefter man oppvarmet til 100°C i 2 minutter, avkjølte, tilsatte Klenow-fragment og det hele ble gjentatt 9 ganger. Disse resultater bekrefter den forbedrede spesifisitet for forsterkningsreaksjonen som benytter det her beskrevne termostabile enzym.

I et senere kloningsforsøk med GM2064 og de kontaminerte primere hadde 43 av 510 farveløse plaquer, altså 8$, (+)-strenginnskuddet. Dette antyder at ca. halvparten av de 119 kloner fra Molt 4 inneholdt kontaminentsekvensen.

Ti av ( +)-strengklonene fra Molt 4 ble sekvensert. Fem var normale villtype-sekvenser og fem hadde en enkel C- til T-mutasjon i den tredje posisjon i det andre kodon av genet (CAC til CAT). Fire av de kontaminante kloner fra GM2064 ble sekvensert og alle fire var normale.

Restriksjonssete-modifiserte primere kan også benyttes for å forsterke og klone og partielt sekvensere human N-rase-onkogene og til å klone baseparsegmenter av HLA-DQ-a-, -DQ-P-og -DR-p-gener som benytter de ovenfor angitte teknikker. Nok en gang vil hvis konsentrasjonen av MgClg og nukleotidene reduseres til 2 mM henholdsvis 150-200 jjM, den minimale sirkuleringstemperatur kunne økes fra 37°C til 45-58°C, mens spesifisiteten og effektiviteten ved forsterkningsreaksjonen kan økes.

EKSEMPEL IV

Geneavledning

A. IDENTIFISERING AV EN DNA-SEKVENSPROBE FOR TAQ-POLYMERASEGENET

En spesifikk DNA-sekvensprobe for Taq-polgenet ble oppnådd ved å følge immunologiske avsøkningsprosedyrer av et Xgtll-eksprimeringsbibliotek. T. aquaticus DNA ble brutt ned fullstendig med Alul, ligert med EcoRI 12-mer-forbindere (CCGGAATTCCGG, New England Biolabs), brutt ned med EcoRI og ligert med defosforylert EcoRI-nedbrutt Xgtll DNA (Promega Biotech). Det ligerte DNA ble pakket (Gigapack Plus, Strategene) og transfektert til E. coli K-12 stamme Yl090 (oppnådd fra R. Young).

Det opprinnelige biblioteket på 2 x 10<5>plaquer ble avsøkt (Young, R.A. og R.W. Davis (1983, "Science", 222:778-782) med en 1:2000-fortynning av et kanin-polyklonalt antiserum dyrket til renset Taq-polymerasse (se eksemplene I og VI). Kandidatplaquer ble replatert ved begrensende fortynning og omavsøkt til homogenitet (ca. 3 cykler). Fag ble renset fra kandidatplaquer som ikke reagerte med preimmunserum og reagerte med immunserum.

Kandidatfager ble lysert til å lysogenisere E. coli K-12-stammen Y1089 (R. Young). Lysogener ble avsøkt for fremstilling av IPTG-induserbart fusjonsprotein (større enn P-galaktosidase) som reagerte med Taq-polymerase-antiserum. Fast-fase, størrelsesfraksjonerte fusjonsproteiner ble benyttet for affinitetsrensing av epitop-spesifikke anti stoffer fra det totale polyklonale antiserum (Goldstein, L.S.B, et al., (1986), "J. Cell Biol.", 102:2076-2087).

De "fiskede", epitop-valgte antistoffer Die benyttet i sin tur i en Western-analyse for å identifisere hvilke Xgtll-fagkandidater som kodet DNA-sekvenser unikt spesifikke til Taq-polymerase. En Xgtll-fagkandidat, kalt Xgt:l, selek-terte spesifikke antistoffer fra det totale kanin-polyklonale Taq-polymerase-antistoff som unikt reagerte med både renset Taq-polymerase og råekstraktfraksjoner inneholdende Taq-polymerase. Denne fag, Xgt:l, ble benyttet for ytterligere studium.

~115 bp EcoRI-adaptert Alul-fragment av Thermus aquatic DNA ble merket i henhold til Maniatis et al., supra, for å generere en Taq-polymerase-spesifikk probe. Proben ble benyttet i Southern-analyser og for å avsøke et T. aquaticus DNA vilkårlig genombibliotek.

B. KONSTRUKSJON OG AVSØKNING AV ET THERMUS AQUATICUS TIL-FELDIG GENOMBIBLIOTEK

X-fag Charon 35 (Wilhelmine, A.M. et al., supra) ble bearbeidet og ligert via sine kohesive ender, brutt ned fullstendig med BamHI, og de annelerte armer ble renset fra "stuffer"-fragmentene ved kaliumacetatdensitets-gradient-ultrasentrifugering (Maniatis, et al., supra). T. aquaticus DNA ble partielt brutt ned med Sau3A og 15-20 kb-størrelsesfraksjonen renset ved sukrosedensitets-gradient-ultrasentrifugering. Biblioteket ble konstruert ved ligering av mål- og vektor-DNA-f ragmenter i et molforhold på 1:1. DNA ble pakket og transfektert i E. coli K12-stammene LE392 eller K802. Et bibliotek på over 20 000 initialfager inneholdende mer enn 99$ rekombinanter ble forsterket på E. coli K12-stammen LE392.

CH35-Taq-genome fagbibliotek ble avsøkt (Maniatis et al., supra) med radiomerkede EcoRI-innskudd av Xgtll:l. Spesifikt hybridiserende kandidatfagplaquer ble renset og ytterligere analysert. En fag kalt Ch35::4-2, friga > fire T. aquaticus DNA-fragmenter ved nedbrytning med Hindlll (-8,0, 4,5, 0,8, 0,58 kb).

De fire Hindlll T. aquaticus DNA-fragmenter ble ligert med Hindlll-nedbrutt plasmid BSM13<+>(3,2 kb, Vector Cloning Systems, San Diego) og individuelt klonet efter transformering av E. coli K-12-stammen DG98.

~8,0 kb Hindlll DNA-fragmentet fra CH35::4-2 ble isolert i plasmid pFC82 (11,2 kb), mens 4,5 kb Hindlll DNA-fragmentet fra CH35::4-2 ble isolert i plasmid pFC83 (7,7 kb).

E. coli-stammen DG98 som huset pFC82 ble vist å inneholde en termostabil, høytemperatur DNA-polymeraseaktivitet, se tabell I. I tillegg syntetiserer disse celler et nytt ca. 60 kd molekylvektspolypeptid som er immunologisk relatert til Taq DNA-polymerase.

Taq-polymerase-kodingsregionen av 8,0 kb Hindlll DNA-fragmentet ble ytterligere lokalisert til lac-promoteren proksimalt 2,8 kb Hindlll til Asp718-delen av 8,0 kb HindIII-fragmentet. Dette området ble subklonet for å gi plasmid pFC85 (6,0 kb). Ved induksjon med IPTG syntetiserer E. coli DG98-celler som huser plasmid pFC85 opp til 100 ganger mer termostabilt den Taq-polymerase relaterte aktivitet, se tabell 1, enn den opprinnelige opphavsklon (pFC82/DG98). Mens celler som huser pFC85 syntetiserer en signifikant mengde av en termostabil DNA-polymerase-aktivitet, blir kun en del av Taq-pol-DNA-sekvensen translatert, noe som resulterer i akkumulering av et~60 kd Taq-polymerase-relatert polypeptid.

EKSEMPEL V

Eksprimering av Taq- polymerase

Det termostabile gen ifølge oppfinnelsen kan eksprimeres i en hvilken som helst av et antall bakterielle eksprimeringsvektorer inkludert DG141 (ATCC 39588) og pPL<N>RBS<A>TG. Begge disse vertsvektorer er pBR322-derivater som enten har en sekvens som inneholder en tryptofan-promoter-operator og ribosom-bindingssete med en opererbart forbundet ATG-startkodon, DG141, eller en sekvens som inneholder X-PL-promoteren og gene-N-ribosom-bindingssetet opererbart forbundet til ét ATG-startkodon, pPlNjjjjsATG. En av disse vertsvektorer kan restriksjonsbehandles med SacI, og stump-endes med Klenow-eller Sl-nuklease for å konstruere et hensiktsmessig restriksjonssete for et efterfølgende innskudd av Taq-polymerasegenet.

Full-lengde-Taq-polymerasegenet ble konstruert fra DNA-innskuddsfragmentene subklonet inn i plasmidene pFC83 og pFC85 som følger. Vektor BM13<+>(kommersielt tilgjengelig fra Vector Cloning Systems, San Diego, CA) ble brutt ned ved det unike HindiII-setet, reparert med Klenow og dNTP'er, og ligert med T4 DNA-ligase til en Bglll-oktanukleotid-forbinder, 5'-CAGATCTG-3', og transformert inn i E. coli-stamme DG98. Plasmider ble Isolert fra Amp® lacZa<+->transformanter. En av klonene ble brutt ned med Bglll- og Asp718-restriksjonsenzymer og det store vektorfragment renset ved gelelektroforese.

Derefter ble plasmid pFC83 brutt ned med Bglll og Hindlll og det ca. 750 basepar-fragment isolert. Plasmid pFC85 ble brutt ned med Hindlll og Asp718 og ca. 2,8 kb-fragmentet isolert og forenet i en tre-delers ligering til ca. 750 basepar Bglll-Hindlll-fragmentet fra pFC83 og BglII-Asp718-vektorfragmentet av BSM13<+>. Denne ligeringsblanding ble benyttet for å transformere E. coli-stamme DG98 (ATCC 39 768 av 13. juli 1984) fra hvilken Amp®-kolonier ble selektert og et~6,75 kilobase plasmid (pLSGl) ble isolert. Isopropyl-P-D-tio-galaktosid (IPTG)-induserte DG98-celler som huser pLSGl-syntetiserte Taq-DNA-polymerase som ikke i størrelse kan skilles fra det native enzym isolert fra T aquaticus. Plasmid pLSGl kan så benyttes for å generere en enkeltstreng-DNA-sjablon i henhold til det som er anbefalt av Vector Cloning Systems.

Oligonukleotid-rettet mutagenese (se Zoller og Smith, "Nuc. Acids Res.", (1982) 10:6487-6500) kan så benyttes for å innføre et Sphl-restriksjonssete som en del av ATG-start-kodonet (oppstrøms det indre Hindlll-setet i kodingssekvensen av Taq-polymerasegenet). På samme måte kan et Bglll-sete innføres efter karboksylterminus av genet (~0,7 kb oppstrøms Asp718-setet) for å lette subkloning av Taq-polymerasegenet til en eksprimeringsvektor. Efter at den sete-rettede mutagenese er gjennomført, kan genet isoleres fra BSM13<+->vektoren på et~3,2 kb Sphl-BstEII-restriksjonsfragment, behandles med Klenow-fragment og alle fire dNTP'er og skutt inn med en T4-DNA-ligase (stump-ende-betingelser) i en hvilken som helst av de forannevnte eksprimeringsvektorer som er nedbrutt med SacI, reparert med Klenow og dNTP'er og behandlet med kalveinnvoll-fosfatase for derved å oppnå defosforylerte stumpe ender. Denne llgerlngsblandlng benyttes for å transformere E. coli DG116 og de resulterende transformanter avsøkes med henblikk på fremstilling av Taq-polymerase. Eksprimering av enzymet kan bekreftes ved Westen-immunoblottanalyse og aktivitetsanalyse.

En større andel av Taq-polymerasegenet inneholdt i~2,8 kb HindIII-Asp718-fragmentet av plasmid pFC85 kan eksprimeres for eksempel ved bruk av plasmid pPLNjjggATG, ved opererbart å forbinde et amino-terminal Hindlll-restriksjonssete som koder Taq-pol-genet til et ATG-initieringskodon. Produktet av denne fusjon ved eksprimering vil gi en ca. 66 000 - 68 000 dalton avstumpet polymerase.

Denne spesifikke konstruksjon kan gjennomføres ved å nedbryte plasmid pFC85 med Hindlll og behandle det hele med Klenow-fragment i nærvær av dATP, dGTP og dCTP. Det resulterende fragment behandles ytterligere med Sl-nuklease for å fjerne enhver enkeltstrenget ekstensjon og det resulterende DNA brytes ned med Asp718 og behandles med Klenow-fragment i nærvær av alle fire dNTP'er. Det gjenvunne fragment kan ligeres ved bruk av T4-DNA-ligase til defosforylert plasmid P^L^RBSATG»som er nedbrutt med SacI og behandlet med Klenow-fragment 1 nærvær av dGTP for å konstruere en ATG-stumpende. Denne llgerlngsblandlng kan så benyttes på transformert E. coli DG116 og transformantene kan avsøkess for fremstilling av Taq-polymerase. Igjen kan eksprimering bekreftes ved western-immunoblott-analyse og aktivitetsanalyse.

EKSEMPEL VI

Rensing

Den termostabile polymerase kan renses direkte fra en kultur av et Thermus aquaticus ved å følge det nedenfor beskrevne eksempel eller alternativt fra en bakteriekultur som inne holder det rekombinant fremstilte enzym med kun mindre modifikasjoner nødvendig ved fremstilling av råekstraktet.

Efter høsting ved sentrifugering ble 60 g celler resuspendert i 75 ml av en buffer bestående av 50 mM Tris-Cl, pH 8, 1 mM EDTA. Cellene ble lysert i en French-presse ved 14 000-16 000 PSI hvorefter 4 volumer eller 300 ml ytterligere Tris-EDTA ble tilsatt. Buffer A (p-merkaptoetanol til 5 mM og NP-40 og "Tween 20" til 0,5$ (volum/volum) hver) ble tilsatt og oppløsningen ble sonikert grundig under avkjøling. Den resulterende homologe suspensjon ble fortynnet ytterligere med buffer A slik at sluttvolumet var 7,5-8 ganger utgangs-cellevekten; dette ble kalt fraksjon I.

Polymeraseaktiviteten i fraksjon I og efterfølgende fraksjoner ble bestemt i en 50 pl blanding inneholdende 0,025 M TAPS-HC1, pH 9,4 (20°C), 0,002 M MgCl2, 0,05 M KC1, 1 mM

2-merkaptoetanol, 0,2 mM hver av dGTP, dATP, TTP, 0,1 mM dCTP [a-<32>P, 0,05 Ci/mM], 12,5 pg "aktivert" laksespermå DNA og 0,01-0,2 enheter av polymerasen (fortynnet i 10 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM KC1, lmg/ml autoklavert gelatin, 0,5$ NP-40, 0,5$ "Tween 20" og 1 mM 2-merkaptoetanol). En enhet tilsvarer 10 nM produkt i 30 minutter. "Aktivert" DNA er et nativt preparat av DNA efter partiell hydrolyse med DNase I inntil 5$ av dette DNA var overført til den syreoppløselige fraksjon. Reaksjonen ble gjennomført ved 74°C i 10 minutter og derefter ble 40 pl overført til 1,0 ml 50 pg/ml bærer-DNA i 2 mM EDTA ved 0°C. Et likt volum, 1,0 ml, av 20$ TCA, 2$ natriumpyrofosfat, ble tilsatt. Efter 15-20 minutter ved 0°C ble prøvene filtrert gjennom Whatman GF/C-skiver og vasket grundig med kald 5$ TCA-1$ pyrofosfat, fulgt av kald 95$ etanol, tørket og tellet.

Fraksjon I ble sentrifugert i 2 timer ved 35 000 omdr./min. i en Beckman Tl 45-rotor ved 2°C og den samlede supernatant ble kalt fraksjon II.

Taq-polymerase-aktiviteten ble preclpitert med Polymln P (BRL, Gaithersburg, MD) (10$, vekt/volum, justert til pH 7,5 og autoklavert) efter at den minimale mengde Polymin P som var nødvendig for å felle ut 90-95$ av aktiviteten var bestemt, en mengde som generelt ble funnet å ligge mellom 0,25$ og 0,3$ sluttvolum.

Et egnet nivå polymin P' ble langsomt satt til fraksjon II under omrøring i 15 minutter ved 0°C. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 13 000 omdr./min. i 20 minutter i en Beckman JA 14-rotor ved 2"C. Supernatanten ble analysert på aktivitet og pelleten ble resuspendert i 1/5 volum 0,5X buffer A (fortynnet 1:2 med H2O). Denne suspensjon ble resentrifugert og pelleten resuspendert i 1/4 volum buffer A inneholdende 0,4 M KC1. Denne suspensjon ble homogenisert grundig satt hen over natten ved 4°C. Homogenatet ble sentrifugert som ovenfor og den samlede supernatant kalt fraksjon III.

Proteinfraksjonen ble samlet ved "precipitering" ved 75$ metning av ammoniumsulfat, sentrifugert ved 37 000 omdr./min. i en SW27-rotor i 30 minutter og den flytende pellikel ble resuspendert 1 50 mM Tris-Cl, pH 8, 1 mM EDTA. Disse trinn ble gjentatt og proteinsuspensjonen ble dialysert i utstrakt grad med P-cellebuffer (20 mM KP04, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 5 mM3-merkaptoetanol, 5$ (vekt/volum)glyserol, 0,5$ (volum/volum) NP-40 og "Tween 20") inneholdende 80 mM KC1.

Dialysatet ble overført til en sentrifugeflaske hvortil det var tilsatt ethvert gjenvunnet protein fra sekker skyllet med P-cellebuffer inneholdende 80 mM KC1. Sentrifugeringen ble gjennomført ved 20 000 x g og tiden ble redusert til 15 minutter. Supernatanten ble samlet opp og enhver gjenværende pellet ble vasket, ekstrahert med P-cellebuffer og 80 mM KC1 og resentrifugert. Supernatantene ble så kombinert til fraksjon IV.

Fraksjon IV ble lagt på en 2,2 x 22 cm kolonne av fosfocellulose, ekvilibrert med P-cellebufferen inneholdende 80 mM KC1. Kolonnen ble vasket med 2,5-3 kolonnevolumer med den samme buffer og proteinet eluert ved bruk av en lineær gradient av 80 til 400 mM KC1 i P-cellebuf fer. Fraksjoner inneholdende DNA-polymerase-aktivitet (~0,18-0,20 M KC1) ble slått samen og konsentrert 3-4 ganger på en Amicon-omrørt celle og YM30-membran. Cellen ble skyllet med P-cellebufferen uten Cl og satt til fraksjonskonsentratet (0,15 M KC1 justert sluttvolum) for derved å danne fraksjon V.

Fraksjon V ble bragt på en 5 1 Heparin Sepharose CL-68-kolonne (Pharmacia) som er ekvilibrert med P-cellebuffer og 0,15 M KC1. Kolonnen ble vasket med 0,15 M KCl-buffer i en mengde av 3-4 kolonnevolumer og proteinet eluert med en lineær gradient fra 0,15 til 0,65 M KC1 i P-cellebuf fer. En 1:10-fortynning i fotynningsmiddel uten gelatin ble gjennom-ført for SDS-PAGE-analyse og en efterfølgende 1:20-fortynning i fortynningsmiddel med 1 mg/ml gelatin ble gjennomført for bruk i enzymanalysene. Aktivitetsfraksjonene som eluerte ved ca. 0,3 M KC1, ble analysert på superviklet DNA-sjablon for spesifikk og ikke-spesifikk endonukleaser/topoisomerase ved elektroforetisk detektering av endringen i molekylvekt av det superviklede plasmid-DNA efter inkubering med et overskudd av DNA-polymerase. Eksonuklease-forurensning ble detektert efter inkubering med små lineære DNA-fragmenter. I toppfraksjoner ble et~88 kd protein funnet å være hovedbåndet. Den vesentlige mengde, kalt fraksjon VI, hadde den høyeste polymerase-aktivitet med minimal detekterbar endonukleaseaktivitet når denne mengde ble analysert i 30 minutter ved 55° C med~3-5 polymeraseenheter pr. 600 ng DNA.

Fraksjon VI ble dialysert mot 10 mM KP04, pH 7,5, 5 mM e-merkaptoetanol, 5$ glyserol, 0,2$ NP-40 og 0,2$ "Tween 20"

(HA-buffer). Den dialyserte prøve ble lagt på en 3 ml kolonne av hydroksyapatitt og enzymet eluert med en lineær gradient av 10-250 mN KP04, pH 7,5, HA-buffer. DNA-polymerase-aktivi-

teten begynte å eluere ved 75 mM KPO4med toppen ved 100 mM KPO4. Aktive toppfraksjoner ble analysert ved en fortyning på 1:100 - 1:300. Som i tidligere kromatografitrinn ble en 1:10-fortynning i fortynningsmiddel preparert uten gelatin for SDS-PAGE-analyse. Fraksjoner uten vesentlig endonuklease eller dobbeltstreng-eksonuklease ved analyse ved 55° C med 5 polymeraseenheter ble slått sammen og kalt fraksjon VII.

Fraksjon VII ble dialysert mot en oppløsning av 25 mM natriumacetat, pH 5,2, 5$ glyserol, 5 mM g<->merkaptoetanol, 0,1 mM EDTA, 0,1$ NP-40 og 0,1$ "Tween 20", justert til pH 5 ved romtemperatur. Den dialyserte prøve ble lagt på en 2 ml DEAE-Tris-akryl-M (LKB)-kolonne forekvilibrert og derefter vasket med den samme buffer. Fraksjonen inneholdende polymerase-aktivitet som ikke adherte til kolonnen ble slått sammen og justert t 50 mM NaC i den samme buffer for derved å gi fraksjon VIII.

Denne ble lagt på den 2 ml CM-Tris-Akryl M (LKB )-kolonne ekvilibrert med den samme buffer (25 mM natriumacetat, 50 mM NaCl, 5$ glyserol, 0,1 mM EDTA, 0,1$ NP-40 og 0,1$ "Tween 20"). Kolonnen ble vasket med 4-5 kolonnevolumer av den samme buffer og enzymert eluert med en lineær gradient fra 50-400 mM NaCl i natriumacetatbuffer. Polymerase-aktivitettoppen eluerte ved ca. 0,15-0,20 M NaCl. Polymerase-aktiviteten ble analysert ved 1:300- til 1:500-fortynning der den første fortynning 1:10 skjedde til et fortynningsmiddel uten gelatin for SDS-PAGE-analyse. En analyse på tvers av aktivitetstoppen på superviklede DNA-sjabloner for spesifikk og ikke-spesifikk endonuklease/topoisomerase ved bruk av DNA-polymerase-analyseringssalter (25 mM TAPS-HC1, pH 9,4, 2,0 mM MgCl2og 50 mM KC1) ved 74 °C ble gjennomført på samme måte som analyser for nukleaser på M13 ss DNA- og pBR322-fragmenter. Aktive fraksjoner uten detekterbar nuklease ble slått sammen og kjørt på en sølvflekket SS-PAGE minigel. Resultatene viser et enkelt ca. 88 kd bånd med en spesifikk aktivitet på ca 250 000 enheter/mg.

Ved denne spesifikke aktivitet er mer enn en størrelsesorden over det som kreves for tidligere isolerte Taq-polymerase og er i det minste en størrelsesorden høyere enn den til E. coli polymerase I

EKSEMPEL VII

Taq-polymerasen som renset som beskrevet ovenfor i eksempel VI ble funnet å være fri for kontaminerende Taq-endonuklese-og eksonukleaseaktiviteter. I tillegg blir Taq-polymerasen fortrinnsvis lagret i buffer inneholdende fra ca. 0,1 til ca. 0,5$ volum/volum hver av benyttet ikke-ioniske polymerdetergent. Mer spesielt inneholder lagringsbufferen 50$ volum/volum glyserol, 10 mM KC1, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 0,1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 1 mM ditiotreitol, 0,5$ volum/volum NP-40, 0,5$ volum/volum "Tween 20" og 200 pg/ml gelatin, og lagres fortrinnsvis ved -20°C.

Den lagrede Taq-polymerase ble fortynnet i en buffer bestående av 25 mM Tris-Cl, pH 8,0, 20 mM KC1, 1 mM p-merkaptoetanol, 0,5$ NP-40, 0,5$ "Tween 20" og 500 pg/ml gelatin. En reaksjonsbuffer ble så fremstilt inneholdende 50 mM KC1, 10 mM Tris-Cl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 0,01$ (vekt/volum) gelatin, 200 pM av hver dNTP, 1 pM hver av primerne som definerer en 500 basepar-målsekvens på en kontrollsjablon fra bakteriofag X, og 2,0-2,5 enheter Taq-polymerase/analyse i et sluttvolum på 100 pl. Sjablonen ble satt til reaksjonsbufferen, prøven bragt i 0,5 ml polypropylenrør, og prøven toppet med 100 pl av tung white spirit for å forhindre fordampning.

En minst 10^-gangers forsterkning ble oppnådd når de følgende betingelser ble benyttet ved bruk av 1 ng av kontroll-sjablonen (bakteriofag X-DNA) der målsekvensen representerte ca. 1$ av utgangsmassen av DNA.

For det første ble sjablonblandingen denaturert i et minutt og 30 sekunder ved 94°C ved å anbringe røret i et varmebad. Derefter ble røret anbragt i et varmebad ved 37 "C 1 2 minutter, 72 °C 1 3 minutter og 94 °C 1 1 minutt. Denne cyklus ble gjentatt tilsammen 25 ganger. Ved slutten av den 25. cyklus ble varmedenaturerlngstrlnnet ved 94 °C utelatt og erstattet ved å utvide 72°C Inkuberlngstrinet med ytterligere 3 minutter. Efter avslutning av analysen ble prøvene tillatt avkjøling til romtemperatur og analysert som beskrevet tidligere.

Sjablonene kan eventuelt forsterkes med en annen konsentrasjon av dNTP'er og en annen mengde Taq-polymerase. Videre vil størrelsen av målsekvensen i DNA-prøven direkte innvirke på den minimale tid som er nødvendig for den riktige utvidelse (72°C inkuberingstrinn). En optimalisering av temperatur-cyklusprofilen bør kunne gjennomføres for hver individuelle sjablon som skal forsterkes for å oppnå maksimal effektivitet .

EKSEMPEL VIII

Taq-polymerase som renses som beskrevet ovenfor 1 eksempel I ble formulert for lagring som beskrevet i det foregående eksempel, men uten ikke-ioniske polymerdetergent. Analysert på aktivitet som beskrevet i dette eksempel, ble enzym-lagringsblandingen funnet å være inaktiv. Når NP-40 og "Tween 20" ble satt til lagringsbufferen, ble hele enzymaktiviteten gjenopprettet, noe som antydet at nærværet av den ikke-ioniske detergent er nødvendig når det gjelder stabili-seringen av enzymformuleringen.

EKSEMPEL IX

Diverse 1 jjg prøver av humangenom-DNA ble underkastet 20-35 cykler forsterkning som beskrevet i eksempel V, med ekviva-lente enheter av enten Klenow-fragmenet eller Taq-polymerase, og analysert ved agarosegel-elektroforese og Southern-blott. Primerne som ble benyttet i disse reaksjoner, PC03 og PC04, styrte syntesen av et 110 bp segment av det human-p<->globingen. Klenow-polymerase-forsterkninger viste en utsmøring av DNA som karakteristisk oppleves med dette enzym, den åpenbare grunn til hvilken er den ikke-spesifikke sammenhefting og ekstraksjon av primere til ikke-relaterte genome sekvenser under det som i det vesentlige var ikke-stringente hybridiseringsbetingelser (lx Klenow-salter ved 37°C). Ikke desto mindre ble det ved Southern-blott oppdaget et spesifikt 110 bp p<->globin målf ragment i alle spor. Et i det vesentlige forskjellig elektroforetisk mønster ble sett ved forsterkninger gjennomført med Taq-polymerase der det enkelte hovedsignal er 110 bp målsekvensen. Denne bemerkelsesverdige spesifisitet skyldtes utvilsomt den temperatur ved hvilken primerne ble forlenget.

På samme måte ble som ved Klenow-fragment-forsterkning, sammenføyningen gjennomført ved 37"C idet temperaturen til Taq-katalyserte reaksjoner måtte heves til ca. 70 "C før enzymet viste signifikant aktivitet. Under denne endring fra 37-70°C, disassosierte dårlig tilpassede primer-sjablon-hybrider (som ble dannet ved 37°C) slik at på det tidspunkt reaksjonen nådde en enzym-aktiverende temperatur, var kun meget komplementære substrater tilgjengelige for ekstensjon. Dette resulterer også spesifikt i et større utbytte av målsekvens enn tilsvarende forsterkninger gjennomført med Klenow-fragment på grunn av at de ikke-spesifikke eksten-sjonsprodukter effektivt konkurrerer om polymerasen og derved reduserer mengden av 110-meren, men som kan dannes ved Klenow-fragmentet.

EKSEMPEL X

Forsterkning gjennomføres i en prøve inneholdende 1 pg Molt 4 DNA, 50 mM KC1, 10 mM Tris, pH 8,3, 10 mM MgCl2, 0,01$ gelatin, IjjM av hver av de følgende primere (for å forsterke et 150 bp-område):

l,5mM av hver av dNTP og 5,0 enheter Taq-polymerase pr. 100 pl reaksjonsvolum. Tre ytterligere prøver ble fremstilt Inneholdende 2,5, 1,3 eller 0,6 enheter Taq-polymerase. Forsterkningen hie gjennomført 1 den temperaturcyklusmaskln som er beskrevet ovenfor i 30 cykler ved bruk av følgende oppsett:

fra 70 til 98 °C i 1 minutt

ved 98"C i 1 minutt

fra 98°C ti 35, 45 eller 55°C 1 1 minutt ved 35, 45 eller 55"C i 1 minutt

fra 35, 45 eller 55°C til 70°C i 1 minutt ved 70°C i 30 sekunder

Ved en temperatur på 35°C, ga 2,5 enheter/100 pl Taq-enzym det beste forhold ved agarosegel-elektroforese i forhold til alle andre Taq-polymerase-konsentrasjoner. Ved 45° C var 5 enheter/100 pl Taq-enzym best, mens ved 55°C var 5 enheter/- 100 pl Taq best og over 45° C resultatet. Taq-polymerasen hadde mer spesifisitet og bedre utbytte ved 55°C.

I et separat forsøk ble Molt 4 DNA fortynnet 10 ganger i serie inn i cellelinjen GM2064 DNA som ikke inneholdt p-eller S-globinsekvenser, oppnådd fra Human Genetic Mutant Cell Depository, Camden, New Jersey, ved forskjellige konsentrasjoer som representerte forskjellige kopier pr. celle, og forsterkningen ble gjennomført på disse prøver som beskrevet i dette eksempel ved behandlingstemperaturer på 35°C og 55°C. Ved 35°C er det beste man kan se det som oppnås ved agarosegel-elektrof orese 1 koP i 50 celler. Ved 55° c er det beste 1/5000 celler (en 100 gangers forsterkning i forhold til den lavere temperatur), noe som illustrerer viktigheten av økede behandlingstemperaturer for Taq-polymerase-spesifisitet under disse betingelser.

I et tredje forsøk ble DNA fra en cellelinje 368H inneholdende HIV-positivt DNA, tilgjengelig fra B. Poiesz, State University of New York, Syracuse, NY, på samme måte fortynnet inn i DNA fra SCl-cellelinjen (ATCC, 19. mars 1985, en EBV-transformert p-cellelinje som er homozygøs for sigdcelle-arveanlegget og som mangler enhver HIV-sekvens) ved forskjellige konsentrasjoner som representerer forskjellige kopier pr. celle, og forsterkningene ble gjennomført som beskrevet i dette eksempel ved behandlingstemperaturer på 35 "C og 55°C ved bruk av primerne SK38 og SK39, som for-sterker et 115 bp-område med HIV-sekvensen:

Resultatene fra agarosegel-elektroforesen viste at kun ikke-fortynnet 368H-prøven ikke detekteres efter behandlings-temperatur ved 35°C, mens minst IO-<2>fortynning kan detekteres ved behandlingstemperaturen 55"C, noe som gir en 100 gangers forbedring i detektering.

EKSEMPEL XI

cDNA ble fremstilt fra 1 pg kaninretikulocytt-mRNA (Bethesda Research Laboratories) i et 100 pl reaksjonsvolum Inneholdende 150 mM KC1, 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,5 mM dATP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM TTP, 0,5 mM dGTP, 0,2 pg oligo(dT)12-18 (Pharmacia), 40 enheter RNasin (Promega Biotec) og 5 enheter AMV reverse transkriptase (BRL) og det hele inkuberes i 30 minutter ved 42°C. Reaksjonen ble stanset ved oppvarming i 10 minutter til 95°C. 2 pg RNase A ble satt til prøven (2 pl av en 2 pg/ml oppløsning i vann) og inkubert i 10 minutter ved 37°C.

Tre forsterkningsreaksjoner ble gjennomført med Klenow-fragmentet ved bruk av forskjellige primerpar. Primerparet C03/PC04 definerer et 110 bp-produkt, primerparet RS45/oligo-(dT)25-30 definerer et 370 bp-produkt og primerparet PC03/- oligo(dT)25-30 definerer et ca. 600 bp-produkt. PC03, PC04 og RS45 er komplementære til human-B-globingenet og hver har to mistilpasninger med kaningenet. PC03 og PC04 er beskrevet i eksempel I. RS 45 har sekvensen: 5'-CAAGAAGGTGCTAGGTGCC-3'.

Forsterkningsreaksjonene ble gjennomført med 1/20 (5 pl av det cDNA som er beskrevet ovenfor 1 et 100 pl reaksjonsvolum inneholdende 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 200 pg/ml gelatin, 10$ DMSO, 1 pM PC03 og RS45, 1 pM PC04 eller oligo(dT )25-30, 1,5 mM dATP, 1,5 mM dCTP, 1,5 mM TTPog 1,5 mM dGTP. Prøvene ble oppvarmet i 5 minutter ved 98°C og derefter avkjølt til romtemperatur og dekket med 100 pl mineralolje.

Prøvene ble underkastet 10 cykler automatisert forsterkning ved bruk av den apparatur som er beskrevet i eksempel I og ved bruk av det følgende program: 1) Oppvarming fra 37° C til 98° C i en varmeblokk i løpet av 2,5 minutter (denaturering); 2) Avkjøling fra 98°C til 37°C i løpet av 3 minutter (sammenføyning);

3) Tilsetning av 1 enhet Klenow-fragment; og

4) Å holde temperaturen ved 37°C i 20 minutter (utvidelse).

Sluttvolumet for hver prøve var ca. 140 pl.

1/20 (7 pl) av hver prøve ble analysert ved elektroforese på en 2$ agarosegel. Efter flekking med etidlumbromid så man diskrete bånd i PC03/PC04- og RS45/oligo(dT)-prøvene. Størrelsen av disse bånd var konsistente med de forventede lengder: 110 bp for den førstnevnte og c-. 370 bp for den sistnevnte. Ingen tegn på forsterkning av et ca. 600 bp-fragment med PC03/oligo(dT)-primerpar ble observert.

Innholdet av gelen ble Southern-blottet på et Genatran-nylonmembran og hybridisert med en nick-translatert human-e-globinprobe, pBR328:<p>A, beskrevet av Saiki et al., "Science", supra, ved bruk av standardteknikker. Det resulterende autoradogram utvidet de tidligere nådde konklusjoner, 110- og ca. 370 bp-fragmentet var B-globin spesifikke forsterknings-produkter og ingen signifikant forsterkning av 600 bp-båndet ble påvist.

Tre ytterligere prøver ble forsterket med Taq-polymerasen som ble oppnådd som beskrevet ovenfor ved bruk av de samme primerpar som tidligere er beskrevet. 5 pl andeler cDNA ble forsterket i 100 pl reaksjonsvolumer inneholdende 50 mM KC1, 25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl2, 200 pg/mlgelat in, 10$ DMSO, 1 pM PC03 eller RS45, 1 pM PC04 eller oligo-(dT)25-30, 1,5 mM dATP, 1,5 mM dCTP, 15mM TTP ogl5 mM dGTP. Prøvene ble oppvarmet i 5 minutter til 98°C og derefter avkjølt til romtemperatur. 1 pl Taq-polymerase (1/8 fortynning av lot 2) ble satt til hver og dekket med ca. 100 pl mineralolje.

Prøvene ble underkastet 9 cykler forsterkning i Peltier-apparaturen som beskrevet tidligere ved bruk av følgende program: 1) 1 minutt, 35°C til 60°C "ramp"; 2) 12 minutter, 60°C til 70°C "ramp" (utvidelse); 3) 1 minutt, 70 til 95 °C "ramp" (denaturering); 4) 30 sekunder, 95"C "soak";

5) 1 minutt, 95°C til 35"C "ramp" (sammenføyning); og

6) 30 sekunder, 35°C "soak".

Efter den siste cyklus ble prøvene inkubert i ytterligere 10 minutter ved 70°C for å fullstendiggjøre den siste og tiende cyklusutvidelse. Sluttvolumet for hver var ca. 100 pl.

Som før ble 1/20 eller 10 pl av hver prøve analysert på en 2$ agarosegel. I denne gel var forsterkningsproduktene tilstede i alle tre prøver, 110 bp for C03/PC04, ca. 370 bp for RS45/oligo(dT), ogca. 600 bp for PC03/oligo(dT). Disse resultater ble bekreftet ved Southern transfer og hybridisering med en pR328:<p>A-probe.

Fremstillingen av 600 bp-produktet med Taq-polymerase, men ikke med Klenow-fragmentet er signifikant og antyder at Taq-polymerase er i stand til å produsere lengre DNA enn Klenow-fragmentet.

De følgende bakteriofager og bakterielle stammer er deponert ved Cetus Master Culture Collection, 1400 Fifty-Third Street, Emeryville, California, USA (CMCC) og ved ATCC som angitt nedenfor idet søkeren forbeholder seg alle Budapest-avtalens rettigheter inkludert ekspertløsningen.

Som en oppsummering gir foreliggende oppfinnelse muligheter for å forsterke en eller flere spesifikke nukleinsyresekvenser ved bruk av en temperaturcyklus-kjedereaksjon og et termostabilt enzym der reaksjonsprimer-ekstensjonsproduktene produseres som i sin tur kan virke som sjabloner for ytterligere primerreaksjoner.

Fremgangsmåten er spesielt brukbar for å detektere nukleinsyresekvenser som til å begynne med kun er tilstede i små mengder og å detektere nukleotidvariasjoner ved bruk av sekvens-spesifikke oligonukleotider. Videre kan metoden benyttes for molekylær kloning.

Denne prosess gir høyere utbytter av forsterket produkt, større spesifisitet, færre nødvendige trinn for å utføre prosessen i forhold til det som er kjent.

Claims (18)

1. Termostabil DNA-polymerase fra en Thermus-specie som katalyserer dannelsen av en nukleinstreng som er komplementær til en nukleinsyretemplatstreng som benytter en polynukleo-tid- eller oligonukleotid primer annelert til templatet,karakterisert vedat polymerasen har en molekylvekt på 86 000 til 90 000 Dalton, bestemt ved SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese ved som molekylstandard å benytte fosforylase B (92 500 Dalton), bovinserumalbumin (66 200 Dalton) og ovalbumin (45 000 Dalton), forutsatt at hvis molekylvekten for fosforylase B er 97 400 er molekylvekten for den termostabile DNA-polymerase 90 000 til 94 000, og at polymerasen i det vesentlige er fri for kontaminerende, termostabil deoksyribonuklease-aktivitet.

2. DNA-polymerase ifølge krav 1,karakterisertved at den er avledet fra Thermus aquaticus.

3. DNA-polymerase ifølge krav 2,karakterisertved at den er avledet fra Thermus aquaticus YT1 (ATCC 25104 ).

4. DNA-polymerase ifølge krav 1,karakterisertved at den er avledet fra Thermus thermofilus.

5. DNA-polymerase ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4,karakterisert vedat den har minst 50 % aktivitet ved pH 6,4 av den den har ved pH 8,0.

6. DNA-polymerase Ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5,karakterisert vedat den foreligger i nativ form.

7. Termostabil DNA-polymerase ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6,karakterisert vedat den er oppnådd fra en termofil bakterie ved en fremgangsmåte omfattende: a) utvinning av cellene fra et medium og lysering av cellene; b) oppsamling av proteinfraksjonen ved hjelp av ammoniumsulfat-precipitering; c) å underkaste den gjenvundne fraksjon kromatografi ved bruk av en DEAE-cellulosekolonne og samling av proteinholdige fraksjoner; d) å bringe de samlede fraksjoner på en hydroksyapatittkolonne og kombinering av de eluerte fraksjoner inneholdende DNA-polymerase-aktivitet; e) å underkaste de kombinerte fraksjoner kromatografi ved bruk av en andre DEAE-cellulose-kolonne som er ekvilibrert med en andre buffer og sammenslåing av DNA-polymerase-fraksjoner med minimal nukleasekontaminering; og f) å underkaste de sammenslåtte fraksjoner kromatografi ved bruk av en fosfocellulose-kolonne og gjennomføring av eluering med en KCl-gradient og analysering av fraksjonene på kontaminerende endo/ekso-nukleaser og på polymerase-aktivitet og sammenslåing av fraksjoner med polymerase-aktivitet.

8. Termostabil DNA-polymerase ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6,karakterisert vedat den er oppnådd fra en kultur av Thermus aquaticus eller fra en bakteriekultur inneholdende det rekombinant produserte enzym, ved en fremgangsmåte som omfatter trinnene: a) innhøsting av cellene fra et medium og lyserlng av cellene; b) precipitering av DNA-polymerase-aktiviteten med Polymin P, lyserlng av precipitatet og samling av supernatantene fra den efterfølgende sentrifugering; c) samlig av proteinfraksjonen ved hjelp av ammoniumsulfat-precipitering; d) å underkaste den gjenvundne protein-fraksjon kromatografi ved bruk av en fosfo-cellulosekolonne og gjennomføring av eluering med en KCl-gradient og sammenslåing av fraksjonene inneholdende DNA-polymerase-aktivitet; e) å bringe de sammenslåtte fraksjoner på en Héparin-Sefarose CL-6B-kolonne, gjennomføring av eluering med en KCl-gradient og sammenslåing av fraksjonene med den høyeste polymerase-aktivitet og med minimal endo-nuklease-aktivitet; f) å bringe de sammenslåtte fraksjoner på en hydroapatitt-kolonne og kombinere eluerte fraksjoner med DNA-polymerase-aktivitet og uten vesentlig endo-nuklease- eller dobbeltstreng-eksonuklease-kontaminering; g) å underkaste de kombinerte fraksjoner kromatografi ved bruk av en DEAE-Tris-Akryl-M-kolonne og sammenslåing av DNA-polymerase-holdige fraksjoner; og h) å underkaste de sammenslåtte fraksjoner kromatografi ved bruk av en CM-Tris-Akryl-M-kolonne, gjennomføring av eluering med en NaCl-gradient og sammenslåing av DNA-polymerase-fraksjonene uten detekterbare nukleaser.

9. DNA-sekvens som koder for en termostabil DNA-polymerase ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8,karakterisert vedat den omfatter en DNA-del som er tilstede i et ca. 3,5 kb BgIII-Asp718 (partielt) restrik-sjonsf ragment av [enten genomet av Thermus aquaticus eller] DNA av bakteriofag CH35:Taq#4-2 (ATCC nr. 40336).

10. DNA-sekvens som koder for en termostabil DNA-polymerase Ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8,karakterisert vedat den består av det ca. 750 bp Bglll/Hindi 11-fragment av pFC83 (ATCC 67421) og det ca. 2,8 kb HindiII-Asp 718 DNA-innskudd av pFC85 (ATCC nr. 67422).

11. Vektor,karakterisert vedat den omfatter en DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst av kravene 9 til 11, flankert av signal- og reguleringssekvenser.

12. Vektor ifølge krav 11,karakterisert vedat den er plasmid pFC85 (ATCC 67422), plasmid pFC83 (ATCC 67421) eller et plasmid omfattende et innskudd bestående av det ca. 750 bp Bglll/HindiII-fragment av pFC83 (ATCC 67421) og det ca. 2,8 kb HindIII-Asp718 DNA innskudd av pFC85 (ATCC nr. 67422), eller bakteriofagen CH35:Taq#4-2 (ATCC nr.

40336).

13. Mikro-organisme,karakterisert vedat den er transformert med en DNA-sekvens som angitt i et hvilket som helst av kravene 9 eller 10 eller med en vektor som angitt i kravene 11 eller 12 og i stand til å uttrykke proteinet.

14. Mikro-organisme ifølge krav 13,karakterisertved at den er en stamme av E.coll.

15. Preparat omfattende en termostabil DNA-polymerase ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8 og en buffer,karakterisert vedat det videre omfatter en eller flere ikke-ioniske, polymere detergenser.

16. Preparat ifølge krav 15,karakterisertved at detergensene hver er tilstede i en konsentrasjon av 0,1 til 0,5 volum-# av det totale preparat.

17. Preparat ifølge krav 15 eller 16,karakterisert vedat detergensene er et polyoksyetylert sorhitan-monolaurat og en etoksylert nonylfenol.

18. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 15 til 17,karakterisert vedat bufferen omfatter glycerol, Tris-HCl (pH 8,0), etylendiamin tetraeddiksyre, ditiotreitol, et polyoksyetylert sorhitanmonolaurat, en etoksylert nonylfenol og gelatin.