JPH02434A - 熱安定性ｄｎａポリメラーゼをコードする遺伝子 - Google Patents

熱安定性ｄｎａポリメラーゼをコードする遺伝子

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JPH02434A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、精製した熱安定酵素に関する。一つの態様で
は、この酵素はテルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕ
ｓ　ａ　ｕａｔｉｃｕｓ）から精製されたＤＮＡポリメ
ラーゼであり、その分子量は約８６．０００〜９０．０
００である。
本発明は、既存の核酸配列が試験試料中に存在するなら
ばそれらを増幅し、且つもし存在するならばそれらをプ
ローブを用いることによって検出する方法に関する。更
に具体的には、本発明は、ＤＮＡまたはＲＮＡの所定の
配列から特定の核酸配列を最初に存在している量に比較
して大量に産生じてこれらの配列の検出を容易にし、反
応を触媒する熱安定酵素を用いる方法に関する。ＤＮＡ
またはＲＮＡは、−末鎖または二本鎖であってもよく、
比較的純粋な種類または核酸の混合物の一成分であって
もよい０本発明の方法は、所望な核酸配列の増幅を達成
するため、反復反応を利用する。
〔従来の技術〕 Ｅ、コリ　（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）のような中温微生物か
らのＤＮＡポリメラーゼの単離について、広範な研究が
行われてきた０例えば、ベスマンＣＢｅｓｓｍａｎ）ら
、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　（１９５７年）、２３３
巻、１７１〜１７７頁およびブチン（１３ｕｔｔｉｎ）
とコルンベルグ（Ｋｏｒｎ−ｂｅｒｇ）Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、　（１９６６年）、２４１巻、５４１９〜５
４２７頁を参照されたい。
対照的に、テルムス・アクアチクスＣＴｈｅｒｍｕｓエ
アーのような好熱菌からのＤＮＡポリメラーゼの単離と
精製については、余り研究が行なわれていない。カレジ
ン（Ｋａｌｅｄｉｎ）ら、７゜（１９８０年）４５巻、
６４４〜６５１頁は、テルムス・アクアチクス（Ｔ、　
　剋ｎ旦ｃｕｓ）ＹＴＩ株の細胞からのＤＮＡポリメラ
ーゼの６段階単離および精製法を開示している。これら
の工程は、粗製抽出物の単離、ＤＥＡＥ−セルロース・
クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイト上での分別、
ＤＥＡＥ−セルロース上での分別および車−ｆｆＤＮＡ
−セルロース上でのクロマトグラフィから成っている。
それぞれの段階からのプールは、エンド−およびエクソ
ヌクレアーゼの混入についてはスクリーニングされてい
ない、精製された酵素の分子量は、モノマー単位当たり
６２．０００ドルトンと報告されている。
テルムス・アクアチクス（７、７カラ（７）ポリメラー
ゼについての第二の精製法は、エイ・チェ７（Ａ、Ｃｈ
ｉｅｎ）ら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９７６年
）、１２７巻、１５５０〜１５５７頁によって記載され
ている。
この方法では、粗製の抽出物をＤＥＡＥ−セファデック
スカラムにかける。透析下プール分画を次に、ホスホセ
ルロースカラム上での処理に付す。このプールした分画
を透析して、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えてポ
リメラーゼの活性の損失を防止する。生成する混合物を
ＤＮＡ−セルロースカラムにかける。カラムからのプー
ルした物質透析し、ゲル濾過によって分析すると分子量
は約６３　、０００ドルトンであり、スクロース遠心分
離によれば約６８．０００ドルトンである。
熱安定酵素を用いて、既存の核酸配列を初めに存在する
量に比べて大量に増幅する方法は、１９８６年１２月１
０日発行の欧州特許公開第２００，３６２号明細書に示
唆されている。この方法では、プライマーヌクレオチド
トリホスフェートおよびポリメラーゼが用いられ、変性
、鋳型類の合成およびハイブリダイゼーションからなっ
ている。それぞれのプライマーの伸長生成物は、所望の
核酸配列を製造するための鋳型になる。この明細書では
、用いられるポリメラーゼが熱安定酵素である場合には
、熱によってその活性が破壊されないので、各変性工程
の後にそれを添加する必要はない。精製された熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼの使用については、他の利益および
詳細な点についてはなにも提供されていない、増幅およ
び検出工程も、サイキ（Ｓａｉｋｉ）らの５ｃｉｅｎｃ
ｅ、２３０巻、１３５０〜１３５４頁（１９８５年）お
よびサイキ（Ｓａｉｋｉ）らの−Ｂｉｏ　　Ｔｅｃｈ−
匹技江、３巻、１００８〜１０１２頁（１９８５年）に
記載されている。
〔発明が解決しようとする問題点〕
したがって、当業界では、上記の診断用増幅工程を改良
するために使用することができる精製された安定な熱安
定酵素を製造することが望まれている。
〔問題点を解決するための手段〕
したがって、本発明はヌクレオチドトリホスフェートの
結合を触媒して核酸鋳型類に相補的な核酸類を形成する
精製された熱安定酵素を提供する。
好ましくは、精製された酵素はテルムス・アクア−Ｊ”
ス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　７由来のＤＮＡポリメラーゼで
あり、分子量は約８６，０００〜９０，０００ドルトン
である。この精製された材料を温度サイクル増幅反応に
用いて、所定の核酸配列から核酸配列を初めに存在する
量に比較して大量に産生させて、それらを容易に検出す
ることができるようにすることができる。
テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　凹旦旦皿
■由来のＤＮＡポリメラーゼからの酵素をコードする遺
伝子も同定され、本発明の熱安定酵素を回収するもう一
つの手段を提供する。約８６　、０００〜９０．０００
ドルトンの酵素をコードする遺伝子に加えて、ＤＮＡポ
リメラーゼ活性をコードする遺伝子誘導体も提供される
。
最後に、本発明は、１種以上の非イオン性のポリマー性
洗剤を含む緩衝液に上記のような精製された熱安定酵素
を含有する安定な酵素組成物をも包含する。
精製された酵素および組替えＤＮＡ技術によって産生さ
れる酵素は、熱安定性ではないフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ
）フラグメントよりも遥かに高い特異性を提供する。更
に、精製された酵素及び組換え技術によって産生された
酵素は、ｄＴＴＰまたは他のヌクレオチドトリホスフェ
ートがＤＮＡ鋳型と共にインキュベーシゴン混合物中に
存在しないときに予想される適当な活性を示す。また、
これらの酵素は、文献に記載されているテルムス・アク
アチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　赳皿且印旦由来の熱安定
酵素のｐＨよりも広いＪ）Ｈ範囲を存し、ｐＨ７ではｐ
Ｈ８における場合の５０％より大きな活性を示す、更に
、これらの熱安定酵素は、非イオン性洗剤を有する緩衝
液中に保存して、長時間に互って活性を失わずに安定で
あるようにすることができる。
本発明は、プライマーおよび熱安定酵素を用いて、核酸
またはそれらの混合物中に存在する１種又は複数種の特
定の核酸配列を増幅する方法にある。一つのプライマー
の伸長生成物が他のものにハイブリダイズすると、所望
の特定の核酸配列を産生ずるための鋳型になり、その逆
も同じであり、この方法は所望の量の配列を産生ずるの
に必要な回数だけ反復される。この方法は、増幅反応の
特異性を向上させて、増幅された核酸の極めて明瞭なシ
グナルを生じる。更に、本発明の方法は、それぞれの増
幅サイクルの後に一つの容器から別の容器に試薬を移す
必要をなくする。熱安定酵素は、核酸鎖を変性するのに
要する高温に対して耐性を有し、それ故取り替える必要
がないので、上記のような移し替えは必要でない。更に
、温度サイクル変化を自動化して、増幅反応を行うのに
必要な人員と工程数を更に削減することができる。
更に具体的には、本発明は、核酸または核酸の混合物に
含まれる少なくとも１種の特定の核酸配列を増幅する方
法であって、核酸が二本鎖である時には、この核酸が同
じまたは異なる長さの２本の別々の相補的鎖からなり、 （ａ）それぞれの核酸鎖を、４個の異なるヌクレオチド
トリホスフェートと増幅されるべきそれぞれの異なる特
定の配列について１個のオリゴヌクレオチドプライマー
とに接触させ、但しそれぞれのプライマーはそれぞれの
特定の配列の異なる鎖に実質的に相補的であるように選
択され、１個のプライマーから合成された伸長生成物が
、その相補体から分離したとき、他のプライマーの伸長
生成物の合成の鋳型として働くことができるようにし、
上記接触を、それぞれのプライマーのその相補的核酸鎖
へのハイブリダイゼーションを促進する温度で行い； （ｂ）それぞれの核酸鎖を、工程（ａ）と同時にまたは
この工程の後に、ヌクレオチドトリホスフェートの結合
を触媒する熱安定酵素と接触させて、それぞれの核酸の
それぞれの鎖に相補的なプライマー伸長生成物を形成し
； （ｃ）酵素の活性化し、そして増幅されるべきそれぞれ
の異なる配列について、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的
なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成するために
は有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成物をそ
の相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温度にお
いて、有効な時間にわたり、工程（ｂ）からの混合物を
保持し：（ｄ）プライマー伸長生成物がその上で合成さ
れた鋳型から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖
分子を生成せしめるためには有効な温度ではあるがしか
し酵素を不可逆的に変性させる程の高温ではない温度に
おいて、有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの混合物
を加熱し； （ｅ）工程（ｄ）からの混合物を、それぞれのプライマ
ーの工程（ｄ）で産生される一本鎖分子のそれぞれへの
ハイブリダイゼーションを促進するために有効な温度に
有効な時間にわたり冷却し；（ｆ）酵素の活性を促進さ
せ、そして増幅されるべきそれぞれの異なる配列につい
て、工程（ｄ）で産生されるそれぞれの核酸鎖鋳型に相
補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成するた
めには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成物
をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温度
において、有効な時間にわたり、工程（ｂ）からの混合
物を保持し、工程（ｅ）および（ｆ）　を同時にまたは
順次に行うことをコード化する、方法を提供する。
工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）は、所望な水準の配列
の増幅が得られるまで繰り返すことができる。本明細書
記載の好ましい熱安定酵素は、テルムス・アクアチクス
（Ｔ　ｈ　ｅ　ｒ　ｍ　ｕ　ｓ　　７カラ抽出されたポ
リメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）である、最も好まし
くは、酵素がＴａｑポリメラーゼである時には、工程（
ａ）では核酸鎖を、約１．５〜２ｍＭのマグネシウム塩
、１５０〜２００囲のそれぞれのヌクレオチドおよび１
オのそれぞれのプライマーを含んで成る援衝液と接触さ
せ、工程（ａ）、（ｅ）および（ｆ）　を約４５〜５８
℃で行い、工程（ｄ）を約９０〜１００℃で行う。
好ましい態様では、１種又は複数種の核酸は二本鎖であ
り、工程（ａ）は、（ｉ）それぞれの核酸を、４個の異
なるヌクレオチドトリホスフェート及び増幅されるべき
それぞれの異なる特定の配列について１個のオリゴヌク
レオチドプライマーの存在下で、それぞれの核酸を変性
するのに有効な時間、有効な温度に加熱して、但しそれ
ぞれのプライマーはそれぞれの特定の配列の異なる鎖に
実質的に相補的であるように選択され、１個のプライマ
ーから合成された伸長生成物が、その相補体から分離し
たとき、他のプライマーの伸長生成物の合成の鋳型とし
て働くことができるようにし、（ｉｉ　）変性した核酸
を、それぞれのプライマーのその相補的な核酸鎖へのハ
イブリダイゼーションを促進する温度に冷却することに
よって行なわれる。
他の態様では、本発明は、核酸または核酸の混合物を含
む試料において少なくとも１種の特定の核酸配列の存在
または不存在を検出し、または上記試料における２種の
異なる配列を識別する方法であって、試料は上記ｌまた
は複数の配列を含むものと予想され、且つ１又は複数の
核酸が二本鎖である時には、それらはそれぞれ、等しい
または等しくない長さの２本の分離された相補的鎖から
なり、工程（ａ）〜（ｆ）　　は上記と同じであり、特
定の１つの核酸配列または、存在するならば、複数の配
列の量を増幅させ、工程（ｅ）および（ｆ）を同時にま
たは順次に行い、 （ｇ）工程（ｆ）の生成物に、上記配列へのまたはその
変異体へハイブリダイズすることができる、検出される
べきそれぞれの配列のための、標識したオリゴヌクレオ
チドプローブを加え；そして （ｈ）上記ハイブリダイゼーションが起こったかどうか
を決定することをコード化する、方法に関する。
更にもう一つの６４１では、本発明は、試料中に含まれ
る１種又は複数種の核酸中の少なくとも１つのヌクレオ
チド配列の変化の存在または不存在を検出する方法であ
って、核酸が二本鎖である時には、それはそれぞれ、等
しいまたは等しくない長さの２本の分離された相補的鎖
からなり、上記工程（ａ）〜（ｆ）を含み、■又は複数
の配列変化が存在するときには、これらを含む核酸の検
出可能な増幅を得るのに十分な回数だけ、工程（ｄ）。
（ｅ）および（ｆ）を繰り返し、且つ工程（ｅ）と（ｆ
）は同時にまたは順次に行い、 （ｇ）工程（ｆ）の生成物を膜に固定し、（ｈ）プロー
ブの配列が増幅された配列の領域に相補的であるときに
のみ増幅された核酸配列とハイブリダイズすることがで
きる、標識された配列特異的オリゴヌクレオチドプロー
ブで、上記膜をハイブリダイゼーション条件下で処理し
；そして　（ｉ）プローブが核酸試料中の増幅された配
列にハイブリダイズしたか否かを検出することをコード
化する、方法に関する。
試料が細胞を含有するときには、好ましくは、それらの
細胞を工程（ａ）の前に加熱してその中の槙談を試薬に
暴露させる。この工程は、試薬の添加前の核酸の抽出を
回避する。
この方法の変法においては１種又は複数のプライマーお
よび／またはヌクレオチドホスフェートを標識して、生
成する増幅された配列を標識するようにする。標識され
た１種又は複数のプライマーおよび／またはヌクレオチ
ドホスフェートは、最初から反応混合物中に存在しても
よくまたは後のサイクルで添加することもできる。（非
標識）配列特異的オリゴヌクレオチドトリホスフェート
を膜に固定し、標識された増幅生成物によりハイブリダ
イゼーション条件下で処理して、膜に結合した配列が増
幅生成物に存在するときにのみハイブリダイゼーション
が起こるようにする。
更にもう一つの態様では、本発明は、核酸または核酸の
混合物に含まれる１種又は複数種の特異的核酸配列をク
ローニングベクターにクローン化する方法であって、１
種又は複数の核酸が二本鎖である時には２本の分離され
た相補的鎖がらなり、該１種又は複数種核酸がクローニ
ングの前に量的に増幅され、この方法は上記工程（ａ）
〜（ｆ）を含み、工程（ｄ）、Ｃｅ”）および（ｆ）は
１種又は複数種の配列を含む１種又は複数種の核酸の検
出可能な増幅を生じるのに十分な回数だけ繰り返し； （ｇ）工程（ｆ）の生成物に上記制限部位のそれぞれに
対する制限酵素を加えて、制限消化物中に開裂生成物を
得； （ｈ）クローン化されるべき特定の配列を含む工程（ｇ
＞の開裂生成物を１個以上のクローニングベクターに連
結することからなる方法に関する。
最後の態様では、本発明は、核酸または核酸の混合物に
含まれる１種又は複数種の特定の核酸配列をクローニン
グベクターにクローン化する方法であって、１種又は複
数種の核酸が二本鎖である時には、長さが等しいまたは
等しくない２本の分離された相補的鎖からなり、該１種
又は複数種の核酸がクローニングの前に量的に増幅され
、この方法は上記工程（ａ）〜（ｆ）を含み、工程（ｄ
）。
（ｅ）および（ｆ）を、１種以上のクローニングベクタ
ーに平滑末端連結するために、１種又は複数の配列を含
む１種又は複数の核酸の検出可能な増幅を生じるのに十
分な回数だけ繰り返し、（ｇ）工程（ｆ）　から得られ
たクローン化されるべき１種又は複数種の増幅された特
定の列をリガーゼの存在下で１種又は複数種の上記クロ
ーニングベクターへ連結し、ここで、１種又は複数種の
上記増幅された配列及び１種又は複数種のベクターが連
結を行うのに十分な量で存在することをコード化する、
方法に関する。
生成物の態様では、本発明は、核酸または核酸の混合物
に含まれる少くとも１種の特定の核酸配列を増幅するの
に有用な組成物であって、増幅されるべきそれぞれの異
なる特定の配列について、４個の異なるヌクレオチドト
リホスフェートと１個のオリゴヌクレオチドプライマー
を含有し、それぞれのプライマーはそれぞれの特定の配
列の異なる鎖に実質的に相補的であるように選択され、
一つのプライマーから合成された伸長生成物は、その相
補体から分離されたと、他のプライマーの伸長生成物の
合成の鋳型として働くことができるようになる。
もう一つの生成物の態様では、本発明は、核酸に含まれ
る特定の核酸配列の複数積を含んで成る１種又は複数種
の核酸の試料を提供する。この試料は、約１０〜１００
の鎖、約１００〜１０００の鎖、または約１０００を超
える鎖を有することができる。
最後の生成物の態様では、本発明は、本発明の増幅法に
よって産生される配列の複数のコピーを含有する核酸ま
たは核酸の混合物からの増幅された核酸配列を提供する
。
本明細書に用いられる「細胞」　「細胞系（セルライン
）Ｊおよび「細胞培養物」は相互交換可能に用いること
ができ、これらの名称は総て子孫を包含する。したがっ
て、「形質転換体」または「形質転換された細胞」とは
、−次細胞およびトランスファーの回数とは関係なしに
その細胞に由来する培養物を包含する。また、総ての子
孫は、故意のまたは偶然の突然変異によりＤＮＡ含量が
正確には同一ではないことがあることも理解される。最
初に形質転換された細胞に置いてスクリーニングしたの
と同じ機能を有する変異体子孫も包含される。
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物における作
用可能に連結されたコード配列の発現に必要なりＮＡ配
列を指す。原核生物に好適な制御配列は、例えばプロモ
ーター、任意にはオペレーター配列、リボゾーム結合部
位があるが、さらにその他の余り理解されていない配列
も包含することが可能である。真核細胞は、プロモータ
ー、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサ−を利用
することが知られている。
「発現系」という用語は、作用可能に連結された所望の
コード配列および制御配列を含むＤＮＡ配列を指し、こ
れらの配列で形質転換される宿主はコードされた蛋白質
を産生ずることができる。
形質転換を行うために、発現系をベクターに包含させて
もよいが、次に、関連のＤＮＡが宿主染色体に組み込ま
れてもよい。
本明細書で用いられる「遺伝子」という用語は、回収可
能な生物活性を有するポリペプチドまたは前駆体をコー
ド化するＤＮＡ配列を指す。このポリペプチドは、完全
な長さの遺伝子配列によりまたは酵素活性が保持されて
いるかぎりコード配列のいずれかの部分によってコード
されていてもよい。
「作用可能に連結した」という用語は、成分の正常な機
能を行うことができる併置を指す。例えば、制御配列に
「作用可能に連結した」コード配列は、このコード配列
が制御配列の制御下で発現することができる配置を指す
。
「非イオン性のポリマー性洗剤」とは、イオン性電荷を
持たず、本発明の目的には、約３．５〜約９．５のｐｉ
ｆ範囲、好ましくは４〜８．５のｐ）ｌ範囲で酵素を安
定化することができることをコード化する、界面活性剤
を指す。
本明細書に用いられる「オリゴヌクレオチド」という用
語は、２個以上のデオキシリボヌクレオチドまたはりポ
ヌクレオチド、好ましくは３個以上のものからなる分子
として定義される。その正確な大きさは多くのファクタ
ーによって異り、これらのファクターはオリゴヌクレオ
チドの最終的な機能または用途によって異る。オリゴヌ
クレオチドは、合成的にまたはクローニングによって誘
導することができる。
本明細書に用いられる「プライマー」という用語は、生
成された制限消化物中におけるように天然存在し、また
は合成的に製造されるオリゴヌクレオチドであって、核
酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成を誘発する
条件、すなわち、適当な緩衝液（「緩衝液」とはｐＨ、
イオン強度、コファクター等を包含する）中で、好適な
温度で４種の異なるヌクレオチドトリホスフェートと熱
安定酵素の存在の条件下に置くとき、合成の開始点とし
て作用することができるものを指す。Ｔａｑポリメラー
ゼについては、本明細書の緩衝液は、好ましくは１．５
〜２ｍＭのマグネシウム塩、好ましくはＭａＣｊ！ｚ、
１５０〜２００団のそれぞれのヌクレオチドおよび１娼
のそれぞれのプライマーを含有し、好ましくは、５０１
ＩＭのＫＣｌ、と１０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８〜８
．４）および１１００ＪＩ／−のゼラチンを含む。
このプライマーは、増幅において最大効率を得るには好
ましくは単一鎖であるが、二本鎖でもよい。二本鎖の場
合には、プライマーは最初に処理されて、伸長生成物を
調製するのに用いる前にそれらの鎖ごとに分離される。
好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレ
オチドである。
プライマーは十分に長く、熱安定酵素の存在で伸長生成
物の合成をプライムできるものでなければならない。プ
ライマーの正確な長さは、温度、プライマー由来および
方法用途のような多くのファクターによって変わる。例
えば、目標とする配列の複雑さによっては、オリゴヌク
レオチドプライマーは典型的には、１５〜２５ヌクレオ
チドを含むが、それより多くのまたはそれより少ないヌ
クレオチドを含むこともある。短いプライマー分子は一
般的には、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形
成するには、低温が必要である。
これらのプライマーは、増幅されるそれぞれの特定の列
の異なる鎖に「実質的にＪ相補的になるように選択され
る。これは、それらのそれぞれの鎖とハイブリッド形成
するには十分に相補的でなければならないことを意味す
る。それ故、プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映
する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグ
メントをプライマーの５′末端に結合させ、残りのプラ
イマー配列が鎖に対して相補的であるようにすることが
できる。また、プライマー配列が増幅される鎖の配列に
対して十分に相補的で、この鎖とハイブリッド形成する
ことによって、他のプライマーの伸長生成物の合成用の
鋳型となる場合には、非相補的塩基またはより長い配列
をプライマー中に含むことができる。しかしながら、検
出の目的には、詳細には標識した配列特異的プローブを
用いて検出するには、プライマーは典型的には正確な相
補性を有する場合に最高の結果が得られる。
本明細書に用いられる［制限エンドヌクレアーゼ」およ
び「制限酵素」という用語は、細菌酵素であって、それ
ぞれが特異的ヌクレオチド配列のまたはその付近の二重
ｉＪ　Ｄ　Ｎ　Ａを切断するものを指す。
本明細書に用いられるｒＤＮＡ多形」という用語は、２
種以上の異なるヌクレオチド配列がＤＮＡの特定の部位
に存在することができる状態を指す。
本明細書に用いられる「ヌクレオチド配列の変化」とい
う用語は、ある種の単一または複数のヌクレオチド置換
、欠失または挿入を指す。これらのヌクレオチド変化は
、突然変異または多形性対立遺伝子変異であることもあ
る。それ故、本明細書に用いられる方法は、単一塩基の
変異、付加または欠失によって起こされるβ−グロブリ
ン遺伝症（ある種のβ−サラセミア、繊状赤血球貧血、
ヘモグロビンＣ症など）において起こるような核酸での
単一ヌクレオチド変化を検出することもでき、またα−
サラセミアまたはある種のβ−サラセミアに包含される
ような多数塩基変異を検出することもできる。更に、本
発明の方法は病気に必然的には関連せず、集団中の核酸
の特定の部位、例えばヒトゲノム及びランダム多形例え
ばミトコンドリアＤＮＡのＨＬ　Ａ　６３域に華に（置
換された、欠失されたまたは挿入されたヌクレオチド塩
基対のような）２種以上の異なるヌクレオチド配列が存
在するような状態である多形を検出することができる。
以下に詳細に記載する多形配列に特異的なオリゴヌクレ
オチドプローブは、インシュリン依存性の糖尿病メリト
ウス（ｍｅｌｌｉｔｕｓ）のような病気に関連した遺伝
的マーカーを検出するのに使用され、または法医学の応
用に用いることもできる。核酸が二本鎖である時には、
配列中のヌクレオチド変化は配列の塩基対変化になる。
「配列特異的オリゴヌクレオチド」という用語は、対立
遺伝子に含まれるまたは含まれない特定の配列にハイブ
リッド形成するオリゴヌクレオチドを指し、これらの配
列は検出される塩基対変化を含み、そして検出される配
列変異に特異的である。分析される配列によっては、１
種以上の配列特異的ヌクレオチドをそ抗ぞれの配列に対
して、以下に更に記載のように用いることもできる。
本明細書に用いられる［制限フラグメント長さ多形Ｊ　
（ＲＦＬＰ）という用語は、特定の制限エンドヌクレア
ーゼで消化することによって形成される制限フラグメン
トの長さの個体間の差を指す。
本明細書に用いられる「熱安定酵素」という用語は、熱
に安定であり、耐熱性を有し、それぞれの核酸鎖に相補
的であるプライマー伸長生成物を形成する適当な方法で
ヌクレオチドの結合を触媒（促進）する酵素を意味する
。一般的には、合成はそれぞれのプライマーの３′末端
で開始され、合成が終結するまで鋳型鎖に沿って５′方
向に進行し、異なる長さの分子を産生ずる。しかしなが
ら、５′末端で合成を開始し、上記と同様な工程を用い
て、他の方向に進む熱安定酵素もある。
本明細書に用いられる熱安定酵素は、増幅反応に効果的
であるという唯への規準を満たすものでなければならず
、すなわち、酵素は、二本鎖核酸の変性を行うのに必要
な時間高温に付す時に、不可逆的に変性（不活性化）す
るものであってはならない。この場合の不可逆的変性と
は、酵素活性を永久に且つ完全に喪失することを意味す
る。変性に必要な加熱条件は、例えば緩衝液の塩濃度、
変性される核酸の長さおよびヌクレオチド組成によって
変わるが、典型的には、約９０〜約１０５℃の範囲であ
り、時間については主として温度および核酸の長さによ
って変わり、典型的には約０．５〜４分間である。緩衝
液の塩濃度および／または核酸のＧＣＭｉ成が増加する
と、更に高温を用いることもできる。好ましくは、酵素
は約９０〜１００℃で不可逆的に変性しない。
本明細書に用いられる熱安定酵素は、好ましくはその酵
素が機能する最適温度は約４０°Ｃよりも高く、鋳型へ
のプライマーのハイブリダイゼーションが促進される温
度よりも低い温度であるが、（１）マグネシウムおよび
塩濃度および（２）プライマーの組成および長さによっ
ては、ハイブリダイゼーションは更に高い温度（例えば
４５〜７０°Ｃ）で起こることができる。酵素にとって
の最適温度が高くなれば、プライマー関連の伸長法の特
異性および／または選択性は大きくなる。しかしながら
、４０℃未満（例えば３７℃）で活性な酵素も、熱に安
定であるかき゛す、本発明の範囲内に含まれる。好まし
くは、最適温度は約５０〜９０℃であり、更に好ましく
は６０〜８０℃である。
本明細書に用いられる熱安定酵素は、如何なる由来から
得ることもでき、天然または組換え蛋白質であってもよ
い。耐熱性を有するものとして文献に報告されている酵
素の例は、熱に安定なポリメラーゼ、例えば好熱菌のテ
ルムス・フラブス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ｆｌａｖｕｓ）
　、テルムス・テルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　Ｔ
ｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ）　、バシルス・ステアロテル
モフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓＬｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ）（他の文献に報告されているもの
よりも幾分低い最適温度を有する）、テルムス・アクア
チクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　肥且Ｉ士」（転）−、テル
ムス・ラフテラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　Ｉａｃｔｅｕｓ
）テルムス・ルーベンス（Ｔｈｅｒｍｕｓｒｕｂｅｎｓ
）　、およびメタノテルムス・フエルビドウス　（Ｍｅ
ｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ　　ｆｅｒｖｉｄｕｓ）から
抽出されたポリメラーゼがある。
本明細書に用いられる好ましい熱安定酵素は、テルムス
・アクアチクス（Ｔｈｅｒａ＋ｕｓ　　姐姐旦匹蝮から
単離されたＤＮＡポリメラーゼである。その各種の株も
、アメリカン・タイプ・カルチャ・コレクション（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ
ｃｔｉｏｎ）ロックビル、メリーランド、から入手する
ことができ、ティ・デイ・ブ０７り　（Ｔ、　Ｄ、　Ｂ
ｒｏｃｋ）、Ｊ、Ｂａｃｔ。
（１９６９年）、９８巻、２８９〜２９７頁、およびテ
ィ・オシマ（Ｔ、Ｏｓｈｉｍａ）、Ａｒｃｈ、　Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ、、（１９７８年）、１１７巻、１８９〜
１９６頁に記載されている。これらの好ましい菌株の一
つは、ＹＴ−１株である。
天然タンパク質を回収するためには、細胞を適当な技術
を用いて増殖させる。この様な技術は、カルジン（Ｋａ
ｌｅｄｉｎ）ら、紅吐紅１Ｌ、（１９８０年）同上、に
記載されている。簡単に言えば、１リツトルに、ニトリ
ロトリ酢酸（１００Ｑｒ）　、）リプトン（ａｇ）酵母
抽出液（ａｇ）、コハク酸（５ｇ）、亜硫酸ナトリウム
（５０ｆｆｆ）、リボフラビン（ＩＴＩＮ）　、ＫｔＨ
ＰＯｎ（５２２ｎｖ＞　、Ｍｇ５Ｏａ（４８０１１Ｗ）
　、ＣａＣ１ｔ（２２２ａｇ）　、ＮａＣｊ！　　（２
０ｍｇ）　、および痕跡量の元素を含む培地上で細胞を
増殖させる。培地のｐＨは、にＯＨで８．０±０．２に
調整している。７０℃の温度で激しく通気しながら、細
胞１リツトルに対して２０ｇまで培養すると、収量は増
加する。後期対数増殖期における細胞（５５０ｎｔｏで
の吸収により測定）を遠心分離によって集めて、緩衝液
で洗浄し、−２０℃に凍結保存した。
チェノ（ｃｈｉｅｎ）ら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
　、１９７６年、同上、による細胞を生育させるもう一
つの方法では、０．１ｎｔｒ／７！のビオチンを補填し
た０、３％のグルタミン酸、Ｏ，Ｉｍｇ／ｌチアミンお
よび０．０５ｍｇ／ｌのニコチン酸を含む定義された無
機塩培地が用いられる。これらの塩にはニトリロトリ酢
酸、Ｃａ５Ｏｔ＋　Ｍｇ５Ｏａ、Ｎａ（／！　、　ＫＮ
Ｏｘ　、　ＮａＮ０ｚ、Ｚｎ５Ｏａ、ＨＪＯｚＣＬＩＳ
Ｏ４，ＮａＭｏＯ４，ＣｏＣ１ｚ、　ＦｅＣ１−ｒ、　
ＭｎＳＯ４、およびＮａｔＨＰｏイがある。培地のｐ）
ｌはＮａＯＨで８．０に調整している。
チェノ（ｃｈｉｅｎ）らの方法では、細胞は最初は７５
°Ｃで水浴シェーカー中で増殖させる。一定の濃度に達
したなら、これらの細胞１リツトルを、熱風インキュベ
ーターに入れである１６リツトルのカーボーイ　（ｃａ
ｒｂｏｙｓ）に移す。無菌空気を培養液中に通して、温
度を７５℃に維持する。細胞を２０時間増殖させた後、
遠心分離によって回収する。
細胞の増殖の後、酵素の単離および生成を６段階で行い
、それぞれの段階は室温より低い温度、好ましくは約４
°Ｃで行う。
第への段階または工程では、細胞が、凍結している場合
には、解凍し、超音波で破砕し、ｐＨが約７．５の緩衝
液に懸濁する。
第二の段階では上澄液を集めて、次いで乾燥硫酸アンモ
ニウムのような塩を加えることによって分別する。適当
な両分（典型的には、４５〜７５％飽和）を集めて、０
．２リン酸カリウム緩衝液、好ましくはｐＨ６，５の緩
衝液に溶解して、同じ緩衝液に対して透析する。
第三の段階では、核酸及びある種の蛋白質を取り除く。
第二の段階からの両分を、上記と同じ緩衝液で平衡化し
たＤＥＡＥ−セルロースカラムにかける。次いで、この
カラムを同じ緩衝液で洗浄し、蛋白質含有画分を溶出し
、２８Ｏｒ＋ｍでの吸収によって測定し、集めて、１０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液に対して、好ましくは第への
緩衝液でｐＨを７．５にしたものと同じ成分を有するも
ので透析する。
第四の段階では、上記のようにして集めた分画を、第三
の段階で透析に用いた緩衝液で平衡にしたヒドロキシア
パタイトカラムにかける。次いで、このカラムを洗浄し
、１０ｍＭの２−メルカプトエタノールと５％のグリセ
リンを含むｐＨ７，５のＯ９旧Ｍ〜０．５Ｍリン酸カリ
ウム緩衝液の直線グラジェントで酵素を溶出する。プー
ルした熱安定酵素（例えばＤＮＡポリメラーゼ）活性を
含む画分を、第三の段階で透析に使用したのと同じ緩衝
液で透析する。
第五の段階では、透析した画分を、第三の段階で透析に
使用した緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラ
ムにかける。このカラムを次に洗浄し、第三の段階で透
析に使用した緩衝液中で０．０１〜０．６ＭのＫ（ｆの
ような緩衝液の直線グラジェントで、酵素を溶出する。
熱安定酵素の活性ををする百分を、適当な方法を用いて
デオキシリボヌクレアーゼ（エンド−およびエキソヌク
レアーゼ）の混入について試験した。例えば、エンドヌ
クレアーゼ活性は、過剰のＤＮＡポリメラーゼと共にイ
ンキュベートした後ファージλＤＮＡまたはスーパーコ
イルプラスミドＤＮＡの分子量の変化から、電気泳動に
よって測定することができる。同様に、エキソヌクレア
ーゼ活性は、数個の部位で開裂する制限酵素を用いて処
理した後、ＤＮＡの分子量の変化から電気泳動によって
測定することができる。
デオキシリボヌクレアーゼ活性を持たないと決定された
両分をプールして、第三の段階で用いたのと同じ緩衝液
で透析する。
第六の段階では、プールした画分を、一定のベツドボリ
ウムを有するホスホセルロースカラムに入れる。このカ
ラムを洗浄して、ｐＨ７，５でリン酸カリウム緩衝液中
０．０１〜０．４ＭのＫＣｌのような緩衝液の直線グラ
ジェントで酵素を溶出する。熱安定なポリメラーゼ活性
を有し、デオキシリボヌクレアーゼ活性を有しないプー
ルした画分を、ｐ。
８．０の緩衝液で透析する。
透析した生成物の分子量は、蛋白質分子量マーカーを用
いてＳＯ５ＰＡＧＥによる方法等によって決定すること
ができる。好ましい酵素の一つであるテルムス・アクア
チクス（Ｔ　ｈ　ｅ　ｒ　ｍ　ｕ　ｓ　　７カラ精製さ
れたＤＮＡポリメラーゼの分子量は、上記方法によって
、約８６．０００〜９０．０００ドルトンと決定される
。
本発明の熱安定酵素は、この酵素をコードする遺伝子が
テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ａ３ｇ。
ａｔｉｃｕｓ）ゲノムＤＮＡからクローン化されたとき
、組換えＤＮＡ技術によって産生させることもできる。
テルムス・アクアチクス（Ｔａｑ）ポリメラーゼについ
ての完全なコード配列は、約１８ｋｂ（キロベース）の
ゲノムＤＮＡインサートフラグメント内に含まれる約３
．５ｋｂのＢｇｌ　ＩＩ　−Ａｓｐ７１８（部分）制限
フラグメント上バクテリオファージＣ）１３５：Ｔａｑ
＃　４−２から誘導することができる。このバクテリオ
ファージは、１９８７年５月２９日にアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され
、寄託番号第４０．３３６号を有する。また、この遺伝
子は、プラスミドｐＦｃ８３　（ＡＴＣＣ第６７．４２
２号、１９８７年５月２９日寄託）から単離された約７
５０塩基対（ｂｐ）のＢｇｌ　ＩＩ　−Ｈｉｎｄ　ＩＩ
Ｉ制限フラグメントを、プラスミドｐＦＣ８５（ＡＴＣ
Ｃ第６７．４２１号、１９８７年５月２９日寄託）から
単離された約２．８　ｋｂＨｒｎｄ　ＩＩ［−Ａｓｐ７
１８制限フラグメントに連結することによって造成する
ことができる。ｐＦＣ８３制限フラグメントはＴａｑポ
リメラーゼ遺伝子のアミノ末端を有するが、ｐＦＣ８５
からの制限フラグメントはカルボキシ末端を有する。し
たがって、これらの２個のフラグメントを、適当な制御
配列を有する対応して消化されたベクターと連結すると
、全長Ｔａｑポリメラーゼの翻訳が得られる。
Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子の全コード配列は、所望の酵
素活性を有する生物学的に活性な遺伝子生成物を回収す
ることを必要としないことも見出された。アミノ末端の
欠失であって、コード配列の約３分の１が不在であるも
のが、ポリメラーゼ分析において完全に活性な遺伝子生
成物を産生じた。
Ｎ−末端の欠失に加えて、Ｔａｑポリメラーゼを構成す
るペプチド鎖中の個々のアミノ酸残基は、酸化、還元、
またはその他の誘導体化によって改変することができ、
そしてこの蛋白質を開裂して、活性を保持するフラグメ
ントを得ることができる。
活性を破壊しないかかる変更は、遺伝子の定義から上記
蛋白質をコードするＤＮＡ配列を除外しない。
したがって、翻訳の間に配列に組み込まれるアミノ酸の
欠失、付加または変更による一次構造自体の改変は、蛋
白質の活性を破壊することなく行うことができる。かか
る置換またはその他の変更は、本発明の予想された範囲
内にあるＤＮＡによってコードされたアミノ酸配列を有
する蛋白質をもたらす。
本発明の精製された８６，０００〜９０．０００ドルト
ンのポリメラーゼで免疫したウサギからのポリクローナ
ル抗血清を用いて、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒ
ｍｕｓ　　７−の部分ゲノム発現ライブラリーをプロー
ブして、下記のようにして適当なコード配列を得た。ク
ローン化されたゲノム配列は融合ポリペプチドとして発
現させたり、それ自体の制御配列を用いて直接に発現さ
せたり、または酵素の発現に用いられる特定の宿主に好
適な制御配列を用いる構成によって発現させることがで
きる。
勿論、これらの配列をコードするＤＮＡ入手可能性は、
コドン配列を改変してＤＮＡポリメラーゼ活性をも有す
るムティン（ｍｕｔｅｉｎ）形を生じるようにする機会
を提供する。
例えば、これらの手段は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの
ための完全なコード配列を提供して、これから、各種の
宿主系に通用できるものを発現ベクター構成し、そして
コード配列を発現することができる。
以上のことから、Ｔａｑポリメラーゼコード配列の部分
はプローブとして有用であり、色々な種のその他の熱安
定ポリメラーゼコード配列を回収するためのプローブと
して有用であることも明らかである。したがって、少な
くとも６個のアミノ酸をコードするゲノムＤＮＡの部分
をＥ、コリ　（Ｅ。
ｃｏｌｉ）において複製することができ、そして少なく
とも６個のアミノ酸をコード化し且つ熱安定ポリメラー
ゼをコード化するその他のＤＮＡを回収するために使用
されるプローブまたはオリゴデオキシリボヌクレオチド
プローブとして用いられる変形した形態のものを合成す
ることができる。テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍ
ｕｓ　　姐閃辷旦旦）におけるヌクレアーゼ配列とその
他の種類の対応する部分の配列は正確には一致しないこ
とがあるので、　（６個のアミノ酸ストレンチをコード
する）約１８個のヌクレオチドを有するオリゴマーは、
恐らく、間違った陽性を排除するのに十分なストリンジ
エンシー条件下でハイブリダイゼーションを行うのに必
要であろう。６個のアミノをコードする配列は、かかる
プローブに十分な情報を供給するであろう。
な　　、　　　　および 一般的な言い方では、組換え形のＴａｑポリメラーゼの
製造は、以下のような工程を含む。
第一に、成熟酵素（この場合、総てのムティンを含むよ
うに用いられる）、あるいはＴａｑポリメラーゼとその
活性を破壊しない追加の配列との融合体または制御され
た条件下で（例えば、ペプチドでの処理によるような）
の開裂して他の蛋白質をもたらすことができる追加の配
列との融合体をコード化するＤＮＡを得る。配列がイン
トロンによって中断されていないときには、それは如何
なる宿主における発現にも好適である。この配列は、切
り出し可能で且つ回収可能な形であるべきである。
次に、好ましくは、切り出されたまたは回収されたコー
ド配列を、複製可能な発現ベクター中の好適な制御配列
と作用可能に連結する。このベクターを用いて、好適な
宿主を形質転換し、形質転換された宿主を好ましい条件
下で培養して、組替えＴａｑポリメラーゼを産生させる
。任意には、’ｌ’ａｑポリメラーゼを培養液または細
胞から単離するが、ある種の不純物が許容される場合に
は、蛋白質の回収および精製は必要でないこともある。
上記の段階のそれぞれは、各種の方法で行うことができ
る。例えば、所望のコード配列をゲノムフラグメントか
ら得て、適当な宿主に直接用いることもできる。各種の
宿主で作用可能な発現ベクターの造成は、以下のような
適当なレプリコンを用いて行なわれる。好適な制限部位
は、通常は利用可能でない場合には、コード配列の末端
に加えて切り出し可能な遺伝子を得、これらのベクター
に抽入することができる。
制御配列、発現ベクターおよび形質転換法は、遺伝子を
発現するのに用いられる宿主細胞の型によって異る。一
般的には、原核細胞、酵母、昆虫または哺乳類細胞が、
宿主として現在有用である。
原核宿主は、一般的には組換え蛋白質の産生にとって最
も有効で好都合であり、それ故Ｔａｑポリメラーゼの発
現にとって好ましい。
Ｔａｑポリメラーゼの特定の場合には、組換え条件下お
よび自然条件下のいずれにおいても、蛋白質のＮ−末端
でかなり欠失が起こり、そして蛋白質の活性はなお保持
されたままであることを示す証拠が存在する。亘離され
た天然蛍白質は、蛋白質分解による減成の結果であり、
不完全な遺伝子の翻訳の結果ではない。プラスミドＩ）
Ｆｅ１２の不完全な遺伝子から産生されたムティンは、
しかしながら、ＤＮＡポリメラーゼの分析で完全な長さ
を存する配列をコード化するＤＮＡから産生されたムテ
ィンと同様に、完全に活性である。ある種のＮ末端が短
縮された形は活性であることが明らかであるので、用い
られる遺伝子構成またはポリメラーゼの発現も、対応す
る短縮された形状のコード配列を存することがある。
′配Ｉおよび、応　る　゛ 原核生物は、最も一般的には、Ｅ、コリ　（Ｌ萱旦）の
各種株によって代表される。しかしながら、バシルス属
、例えばバシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｕｓ　５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ）、各種のシュドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ）またはその他の菌株のような他の微生物株を
用いることもできる。かかる原核系では、宿主と適合性
の種に由来する複製部位と制御配列を有するプラスミド
ベクターが用いられる。
例えば、Ｅ、コリ　（Ｌｃｏｌｉ）は、典型的には、ポ
リバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら、Ｇｅｎｅ、１９７７年、
２巻、９５頁によるＥ、コリ　（Ｌｃｏｌｉ）種に由来
するプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形
質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテト
ラサイクリン耐性の遺伝子を有し、所望のベクターを造
成する際に保持されまたは破壊される付加的マーカーを
提供する。転写開始を促進し、任意にはオペレーターを
有し且つリボゾーム結合部位配列を有する本明細書記載
の一般的に用いられる原核制御配列には、β−ラクタマ
ーゼ（ベニシリナーゼ）およびラクトース（Ｉ　ａ　ｃ
）プロモーター系〔チャン（ｃｈａｎｇ）ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ　（１９７７年）１９８巻、１０５６頁〕、トリプ
トファン（ｔｒｐ）プロモーター系〔ゲーデル（Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
　（１９８０年）８巻、４０５７頁〕、およびλ由来の
ＰＬプロモーター〔シマタケ（Ｓｈ　ｉｍａ　核酸ｋｅ
）ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１年）２９２巻、１２８
頁〕および輸送可能な制御カセットとして有用なＮ−遺
伝子リボゾーム結合部位があり、これはポータプル制御
カセットとして有用にされており、このものは、Ｎ□、
配列の６ｂｐ３’内での開裂を可能にする少なくとも１
個の制限部位を有する第三のＤＮＡ配列のＮＩ？ＢＳ上
流に対応する第二のＤＮＡ配列に操作可能に連結したＰ
Ｌプロモーターである第−ＤＮＡ配列を含んで成る。
チャン（ｃｈａｎｇ）らの欧州特許出願公開第１９６，
８６４号明細書（１９８６年１０月８日発行）に記載さ
れ、同じ承継人に承継されたホスファターゼＡ　（ｐｈ
ｏＡ）系も有用である。しかしながら、原核生物に適合
性の如何なる利用可能なプロモーターも用いることがで
きる。
細菌に加えて、酵母のような真核微生物も宿主として用
いることができる。サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の
実験室菌株であるパン酵母が最も多く用いられるが、そ
の他の多くの菌株も一般的に利用可能である。
２ミクロン複製開始点用いるベクターが示されているが
〔ブローチ１　ジェイ、アール（Ｂｒｏａｃｈ。
Ｊ、Ｒ，）　、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、（１９８３年）１０
１巻、３０７頁〕、酵母の発現に好適な他のプラスミド
ベクターも知られている〔例えば、スチンクコンブ（Ｓ
ｔｉｎｃｂｃｏａｂ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７９年
）２８２巻、３９頁、チェンベ（Ｔｓｃｈｅａ＋ｐｅ）
ら、Ｇｅｎｅ　（１９８０年）１０巻、１５７頁および
クラーク　（ｃ１ａｒｋｅ）　　ら、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ
、　（１９８３年）１０１巻、３００頁を参照されたい
〕　。酵母ベクターに対する制御配列は、解糖酵素の合
成のプロモーターを有する　Ｌヘス　（Ｈｅｓｓ）　　
ら、ムル比」ＭＰ五上」（１９６８年）７＠、１４９頁
、ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら、１堕１四１ｙ汀立ｌ
　（１９７８年）１７巻、４９００頁〕。
その他の当業界に知られているプロモーターには、３−
ホスフィングリセレート・キナーゼ（ヒフツェマン（Ｈ
ｉｔｚｅｍａｎ）　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　（
１９８０年）２５５巻、２０７３頁）およびその他の解
糖酵素、例えばグリセルアルデヒド−３−ホスフェート
・デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、とルベート・デ
カルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコー
ス−６−ホスフェート・イソメラーゼ、３−ホスホグリ
セレート・ムターゼ、ピルベート。
キナーゼ、トリオセホスフェート・イソメラーゼ、ホス
ホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのプロ
モーターがある。増殖条件により制御される追加の利点
を有するその他のプロモーターは、アルコールデヒドロ
ゲナーゼ２、イソチトクロームＣ，酸性ホスファターゼ
、窒素代謝に関係する分解酵素およびマルトースおよび
ガラクトース利用に関する酵素のプロモーターである（
ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）同上〕。
ターミネータ−配列は、コード配列の３′末端において
望ましいと思われる。かかるターミネータ−は、酵母由
来の遺伝子におけるコード配列に続く３′非翻訳領域に
見出される。示されたベクターの多くはプラスミドｐｅ
ｎｏ４６を有するエノラーゼ遺伝子〔ホランド（Ｈｏｌ
ｌａｎｄ、Ｍ、Ｊ、）ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、　　（１９８１年）２５６巻、１３８５頁〕
またはＹＥｐ１３から得られるＬＥＵ　２遺伝子〔ブロ
ーチ（Ｂｒｏａｃｈ　、　Ｊ、　）ら、釦ｎｅ　（１９
７８年）８巻、１２１頁〕から誘導される制御配列を有
するが、酵母適合性プロモーター、複製開始点およびた
の制？′ｆｉｌ配列を有する如何なるベクターも好適で
ある。
勿論、多細胞生物に由来する真核宿主細胞培養液におい
てポリペプチドをコードする遺伝子を発現させることも
可能である。例えば、Ｔｉ５ｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ　％
アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ
）、グルコ（ｃｒｕｚ）　とパターリン（Ｐａ　ｔ　ｔ
ｅｒｓｏｎ）監修（１９７３年）を参照されたい。有用
な宿主細胞系には、ネズミミエローマＮ５１、ＶＥＩ？
ＯおよびＨｅ１ａ＄［ｌＴ胞、およびテンジクネズミ卵
巣（ｃＨＯ）細胞がある。
これらの細胞の発現ベクターは、通常は、シミアンウィ
ルス４０　（ＳＶ４０）からの−船釣に用いられる早期
および後期プロモーター（フィールス（Ｆｉｅｒｓ）ら
、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７８年）２７３巻、１１３頁）
、またはポリオーマ、アデノウィルス２、ウシパピロー
マウィルスまたはトリザルコーマウィルスに由来するよ
うなプロモーター、または免疫グロブリンプロモーター
および熱シヨツクプロモーターのような哺乳類細胞に適
合性のプロモーターおよび制御配列を有する。ＢＰＶを
ベクターとして用いる哺乳類系におけるＤＮＡ発現系は
、米国特許第４、４１９．４４６号明細書に開示されて
いる。この系の変形は、米国特許第４，６０１．９７８
号明細書に記載されている。哺乳類細胞系の形質転換の
一般的態様は、米国特許第４，３９９．２１６号明細書
に記載されている。「エンハンサ−」領域が、最適な発
現において重要であると思われるが、これらの領域は一
般的にはプロモーター領域の上流に見出される配列であ
る。所望であるならば、複製開始点をウィルス源から得
ることができる。しかしながら、染色体への組み込みは
、真核生物でのＤＮＡ複製では一般的な機構である。
植物細胞も宿主として利用可能であり、植物細胞に適合
する制御配列、例えばツバリン・シンターゼ・プロモー
ターおよびポリアデニル化シグナル配列（デピソカー（
Ｄｅｐｉｃｋｅｒ、　Ａ、）ら、Ｊ、Ｍｏｌ。
幻」土−旦肋一（１９８２年）１巻、５６１頁）が利用
できる。
更に、最近では、バクロウィルス・ベクターによって提
供される制御系を利用する昆虫細胞を用いた発現系も報
告されている〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ。
Ｄ、Ｗ、）　　ら、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅｒ
ｉｎ　　（１９８６年）、セトロウ　（Ｓｅｔｌｏｗ、
　Ｊ、に、）ら監修、ブレナム・パブリッシング（Ｐｌ
ｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、８巻、２７７〜２
９７頁〕。これらの系はＴａｑポリメラーゼの産生にも
成功している。
形１五亘 用いる宿主細胞に依存して、形質転換はその細胞に適当
な標準的な技術を用いて行なわれる。塩化カルシウムを
用いるカルシウム処理（コーヘン（ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、
Ｎ、）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（
ＵＳＡ）　（１９７２年）６９巻、２１１０頁）は、原
核生物またはその他の実質的な細胞障壁を有する細胞に
用いられる。アグロバクテリウム・チュメファシエンス
（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）での感染〔シアウ（Ｓｈａｗ、　Ｃ，Ｈ，）　　ら
、Ｇｅｎｅ　（１９８３年）２３巻、３１５頁）は、あ
る種の植物細胞で用いられる。上記のような細胞壁を持
たない哺乳類細胞では、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）とヴ
アン・デル・ニブ（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）のリン酸カ
ルシウム沈澱法が好ましい〔■二圏■（１９７８年）５
２巻、５４６頁〕。酵母への形質転換は、ヴアン・ゾリ
ンゲン（ＶａｎＳｏｌｉｎｇｅｎ、Ｐ、）ら（Ｊ、Ｂａ
ｃｔ、、１９７７年、１３０巻、９４６頁）およびシア
オ（Ｈｓｉａｏ。
Ｃ，Ｌ、）　　ら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、１９７９年、７６巻、３８２９頁
）の方法によって行なわれる。
λ　ｔｌ　　−イブ−■−〇″ 所望の蛋白質をコードするＤＮＡ、例えばＴａｑポリメ
ラーゼをコードするＤＮＡをバクテリオファージλｇｔ
ｌｌを用いて単離する方法は、次の通りである。ライブ
ラリーは、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　
ａ　ｕａｔｉｃｕｓ）　ＤＮＡの完全な消化によって生
じ、λｇｔｌｌファージのＥｃｏＲＩ部位に挿入された
ＥｃｏＲ１部位を両端に有するＡｌｕｌフラグメントか
ら構成され得る〔ヤング（Ｙｏｕｎｇ）とデービス（Ｄ
ａｖｉｓ）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
　ＵＳＡ　ｓ　１９８３年、８０巻、１１９４〜１１９
８ｉ）。このバクテリオファージ中のユニークＥｃｏＲ
１部位がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のカルボキシ末端
に配置しているので、（適当なフレームおよび方向で）
挿入されたＤＮＡは、ラクトースオペロンプロモーター
／オペレーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼと融合
した蛋白質として発現される。
ゲノム発現ライブラリーを次に抗体プラークハイブリダ
イゼーション法を用いてスクリーニングする。この方法
は「エピトープ選択」と呼ばれ、このファージによって
コードされた融合蛋白質配列に対する抗血清を用いてハ
イブリッ、ド形成したプラークを同定するものである。
例えば、この組換えファージのライブラリーは、８６，
０００〜９０，０００ドルトンのＴａｑポリメラーゼを
認識する抗体を用いてスクリーニングして、この蛋白質
の抗原決定基をコードするＤＮＡセグメントを存するフ
ァージを同定することができる。
約２Ｘ１０ｓ個の組換えファージを、全ウサギＴａｑポ
リメラーゼ抗血清を用いてスクリーニングする。この−
次スクリーニングでは、陽性シグナルが検出され、これ
らのプラークの１種以上が、免疫前血清と反応せず且つ
免疫血清と反応する候補プラークから精製され、幾分詳
細に分析される。
組換えファージによって産生される融合蛋白質を検査す
るため、宿主Ｙ　１０８９におけるファージの溶原株を
得る。溶原株を誘発し、生成する蛋白質をゲル電気泳動
した後、それぞれの溶原株が他の溶原株には見られない
新たな蛋白質を産生ずるのを観察することができ、また
は重複配列が生じることもある。陽性シグナルを有する
ファクターを取り出す。ここに記載する例においては陽
性プラークを取り出して更に同定を行ない、低密度で再
プレートして組換体を純化し、純化したクローンをＥｃ
ｏＲＩ制限酵素での消化によるサイズクラスによって分
析した。次に、プローブを単離されたＤＮＡ挿入配列か
ら作り、適当に標識を行い、そしてこれらのプローブを
マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ
ａｎｕａｌ。
１９８２年に記載されている通常のプラークノ−イプリ
ダイゼーション又はコロニーハイブリダイゼーション分
析法に用いることができる。
標識したプローブを用いて、シャロン（ｃｈａｒｏｎ）
３５バクテリオフアージ中に構成された第二のゲノムラ
イブラリーをプローブした（ウイルヘルマイン（Ｗｉｌ
ｈｅｌｍｉｎｅ、　Ａ、Ｍ、）ら、Ｇｅｎｅ、１９８３
年、２６巻、１７１〜１７９頁）。このライブラリーは
、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｌｏｕｓ　　赳旦
旦赳旦ゲノムＤＮＡのＳ　ａｕ３Ａ部分消化によって作
られ、そしてサイズ分別したフラグメント（１５〜２０
ｋｂ）をシャロン３５フアージのＢａｎ旧部位にクロー
ン化した。
このプローブを用いて、Ｔａｑポリメラーゼをコードす
るＤＮＡを含むファージを単離した。ＣＨ３５：Ｔａｑ
＃４−２と命名した生成するファージの一つは、全遺伝
子配列を有することが判明した。この遺伝子の部分をコ
ードする部分配列も単離された。
さ又叉二叫遺戊 所望のコード配列および制御配列を含有する好適なベク
ターの造成は、当業界で周知の標準的な連結および制限
技術を用いる。単離したプラスミド、ＤＮＡ配列または
合成されたオリゴヌクレオチドを開裂し、ととのえ、そ
して再連結して所望の形状にする。
部位特異的ＤＮＡ開裂は、当業界で周知の条件下で好適
な（１種以上の）制限酵素を用いて処理することによっ
て行ない、その詳細はこれらの市販の制限酵素の製造業
者によって記載されている。
例えば、二ニー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、製品カタログを
参照されたい、−船釣には、約１河のプラスミドまたは
ＤＮＡ配列を、約２０ｔｌｌの緩衝溶液中で１単位の酵
素で開裂し、本明細書の実施例では、典型的には、過剰
量の制限酵素を用いてＤＮＡ基質を完全に消化するよう
にしている。約３７℃で約１〜２時間のインキュベーシ
ョン時間が有効であるが、変更を行なうこともできる。
それぞれのインキュベーションの後に、蛋白質をフェノ
ール／クロロホルムで抽出して、次いでエーテル抽出を
行なうことによって除去して、核酸を水性分画からエタ
ノール沈澱によって回収することができる。所望ならば
、開裂フラグメントのサイズ分離を、標準的技術を用い
るポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳
動によって行なうことができる。サイズ分離の一般的説
明については、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ、１９８０年、６５巻、４９９〜５６０頁に記載され
ている。
制限開裂したフラグメントを、５０ｍＭのトリス、ｐＨ
７，６，５０ｍＭのＮａＣｎ　、　１０ｍＭのＭｇＣ’
　ｚ　、１０＋１ＭのＤＴＴおよび５０〜Ｌｏｏｍのｄ
ＮＴＰｓ中で、２０〜２５℃で約１５〜２５分間のイン
キュベーション時間を用いて、４種類のデオキシヌクレ
オチドトリホスフェート　（ｄＮＴＰ）の存在でＥ、コ
リ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩ　（フ
レノウ　（Ｋｌｅｎｏｗ））の大フラグメントで処理す
ることによって平滑末端にすることができる。フレノウ
フラグメントは５′接着末端をフィルインするが、４種
のｄＮＴＰｓが存在していても、突出する３′単一鎖を
チューバック（ｃｈｅｗｓｂａｃｋ）する。所望ならば
、接着末端の性状によって指定される制限内で唯Ｉ種の
または選択された複数のｄＮＴＰｓを供給することによ
って選択的修復を行なうことができる。フレノウで処理
した後、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、
エタノールで沈澱させた。適当な条件下で３１ヌクレア
ーゼを用いて処理すると、単一鎖部分の加水分解が起こ
る。
合成オリゴヌクレオチドは、マテウチ（Ｍａｔｔｅ−ｕ
ｃｃｉ）ら（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、１
９８１年、１０３巻、３１８５〜３１９１頁）のトリエ
ステル法を用いて、または自動合成法を用いて調製する
ことができる。アニーリングの前のまたは標識のための
単一鎖のキナーゼ処理は、５０ＩＩ＋）１のトリス、ｐ
Ｈ７，６，１０ｍＭのＭｇＣｊ！ｚ　、５ｍＭのジチオ
スレイトール、１〜２ｍＭのＡＴＰの存在下で、１ｎＭ
の基質に対して過剰量の、例えば約１０単位のポリヌク
レオチドキナーゼを用いて行なう。このキナーゼ処理が
プローブの標識するためのものであるときには、ＡＴＰ
は高圧活性のＴ　３Ｚｐを有する。
連結は、下記の標準的条件及び温度で１５〜３０ｍの容
積で行なう。２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ！　、　　（ｐ
Ｈ７，５）１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ　、１０ｍＭ　ＤＴＴ
１３３ｉ／　ａ／　Ｂ５Ａ１１０ｍＭ〜５０ｍＭのＮａ
（Ｊ　、および（「接着末端」の連結には）４０オのＡ
ＴＰ　、　０．０１〜０．０２　（ワイス　（Ｗｅｉｓ
ｓ））単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ、０゛Ｃ；または（「
平滑末端」の連結ニハ）　　１ｍＭ（７）ＡＴＰ　、　
０．３〜０．６　（’ワイス（Ｗｅｉｓｓ）　）単位の
Ｔ４［ＩＮＡ　リガーゼ、１４℃。分子内「粘着末端」
連結は、通常は３３〜１００鱈／ｍ／の総ＤＮＡ濃度（
５〜１１００ｎの総末端濃度）で行なう。分子間平滑末
端連結（通常は１０〜３０倍の過剰モルのリンカ−を用
いる）は、１茹の総末端濃度で行なう。
「ベクターフラグメント」を用いるベクターの造成では
、ベクターフラグメントを通常は細菌性アルカリホスフ
ァターゼ（ＢＡＰ）で処理して５′ホスフエートを除去
して、ベクターの再連結を防止する。ＢＡＰ消化は、ｐ
Ｈ８で、約１５０ｍＭのトリス中で、Ｎａ”およびＭｇ
−２の存在で、ベクター１■当たり約１単位のＢＡＰを
用いて、６０°Ｃで約１時間行なう。核酸フラグメント
を回収するため、調製物をフェノール／クロロホルムで
抽出し、エタノール沈澱せしめる。また、好ましくない
フラグメントを追加的制限酵素消化によって二重消化さ
れたベクターでは、連結は防止することができる。
ユ主」」びト（社）又変 配列の改変を必要とするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに
由来するベクターの部分については、部位特異的なプラ
イマー指令変異誘発を用いる。この技術は現在では当業
界で標準的であり、所望の変異を表わす限定されたミス
マツチを除いて変異誘発されるべき単一鎖ファージＤＮ
Ａに相補的なプライマー合成オリゴヌクレオチドを用い
て行なわれる。要約すれば、ファージに相補的な鎖の合
成を指令するプライマーとして合成オリゴヌクレオチド
を用い、生成する二本鎖ＤＮＡをファージ支持性の宿主
細菌に形質転換する。形質転換された細菌の培養液を上
Ｎ寒天に塗布しファージを有する単一細胞からプラーク
を形成させる。
理論的には、新たなプラークの５０％は変異形を単一鎖
として有するファージを含み、５０％はもとの配列を有
する。プラークをニトロセルロースフィルターに移して
、正確にマツチするハイブリダイゼーション可能にし且
つもとの鎖とのミスマツチがハイブリダイゼーションを
防止するのに十分であるような温度で、キナーゼ処理し
た合成プライマーで［リフト（ＩｉｆｔｓＮハイブリダ
イゼーションを行なう。次に、このプローブとハイフリ
フド形成するプラークを採取して、培養し、ＤＮＡを回
収する。
１威坐証亙 以下の造成では、プラスミド造成物の正確な連結を、最
初に連結混合物を用いてＥ、コリ　（Ｅ。
ｃｏ　Ｉ　ｉ）　ＭＭ２９４株または他の適当な宿主を
形質転換することによって確かめる。当業界で理解され
ているように、好結果の形質転換体を、プラスミド造成
の方式に依存してアンピシリン耐性、テトラサイクリン
耐性またはその他の抗生物質耐性によって選択する６次
に、形質転換体からのプラスミドを、フレウェル（ｃｌ
ｅｗｅｌｌ、　Ｄ、Ｂ、）ら、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、１９６９年、６２巻、１１
５９頁）の方法により、場合によってはクロラムフェニ
コール増幅法（フレウェル（ｃ１ｅｎｅｌ　ｌ＋　Ｄ、
Ｂ、）、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１９７２年、１
１０巻、６６７頁）によって調製する。単離したＤＮＡ
を、制限処理により分析しそして／又はサンガー（Ｓａ
ｎｇｅｒ、　Ｆ、）ら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ　、１９７７年、７４巻、５４６３頁）
のジデオキシ法であって更にメフシング（Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ）ら（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　、１９
８１年、９巻、３０９頁）によって記載されている方法
またはマクサム（Ｍａｘａｌｌ）ら（Ｍｅｔｈｏｄｓｉ
ｎ　Ｅｎｚ　５ｏｌｏ　　、　１９８０年、６５巻、４
９９頁）の方法によって配列決定する。
且土■且 この発明においてクローニング及び発現に用いられる宿
主菌株は、次の通りである。
クローニング及び配列決定、並びにほとんどの細菌性プ
ロモーターの制御下での造成物の発現には、Ｅ、コリ　
（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）ゲネチソク・ストック・センター
ＧＣ５Ｇ＃６１３５から得たＥ、コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ
）株間２９４を宿主として用いた。ＰＬＮｌｌｌ＋３プ
ロモーターの制御下での発現には、Ｅ、コリ　（旦−ｃ
ｏｌｉ）　Ｋ１２株ＭＣ１０００λ溶原株、ＮＪｓｔＣ
１８５７ＳｕｓＰｇｏ、ＡＴＣＣ３９５３１を用いるこ
とができる。本明細書では、１９８７年４月７日にＡＴ
ＣＣ（ＡＴＣＣ５３６０６）で寄託したＥ。
コリ　（Ｌ　並置）ＤＧ１１６を用いる。
Ｍ１３ファージ組換体のためには、ファージ感染を受け
やすいＥ、コリ　（Ｅ、　　ｃｏｌｔ）　、例えばＥ。
コリに１２株ＤＧ９Ｂを用いる。ＤＧ９８株は１９８４
年７月１３日にＡＴＣＣ寄託され、寄託番号３９７６８
を有する。
哺乳類テノ発現はＣＯ５−７、ＣＯ５−Ａ２、ＣＶ−１
およびネズミ細菌で行うことができ、そして昆虫細胞で
はスボドブテラ・フルジペイダ℃組ｏ　ｄ旦起旦ｒａ−
紅■並虹額）での発現を基礎とする。
Ｍ１擢迂Ｌｍ支定進。
酵素は、長期間安定にするためには、１種又は複数種の
非イオン性ポリマー性洗剤を含む緩衝液中に貯蔵しなけ
ればならない。この様な洗剤は一般的には分子量が約１
００〜２５０，０００の範囲であり、好ましくは約４，
０００〜２００．０００ドルトンであり、ｐＨが約３．
５〜約９．５、好ましくは約４〜８．５で酵素を安定化
するものである。この様な洗剤の例としては、フック・
クチェオン（ＭｃＣｕ　ｔｃｈｅｏｎ）のＥｍｕｌｓｉ
ｆｉｅｒｓ　＆　Ｄｅｔｅｒ　ｅｎｔｓ、北アメリカ版
（１９８３年）エムシー・パブリッシング・カンパニー
（ＭＣＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、）のフック・クチ
ェオン部門発行、１７５、ロックロード、グレンロック
、ニュージャージ（米国）、の２９５〜２９８頁に記載
されているものがあり、その詳細については上記文献を
参照されたい。好ましくは、洗剤はエトキシル化した脂
肪族アルコールエーテルおよびラウリルエーテル、エト
キシル化したアルキルフェノール、オクチルフェノキシ
ポリエトキシエタノール化合物、改質オキシエチル化し
たおよび／またはオキシプロピル化した直鎖状アルコー
ル、ポリエチレングリコールモノオレエート化合物、ポ
リソルベート化合物およびフェノール性脂肪族アルコー
ルエーテルからなる群から選択される。更に詳細には、
好ましくは、ポリオキシエチル化（２０）ソルビタンモ
ノラウレートであるツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０（Ｉ
Ｃｒ　・アメリカス・インコーボレーテド（ｒ（ＪＡｍ
ｅｒｉｃａｓ　Ｉｎｃ、）、ウイルミントン、ＤＥ）お
よびエトキシル化アルキルフェノール（ノニル）である
イコノール（Ｔｃｏｎｏｌ）　（登録商標）　ＮＰ−４
０（バスフ（ＢＡＳＦ）　イアンドット・コーポレーシ
ョン、パーシバニー、ニューシャーシー）である。
本発明の熱安定酵素は、この酵素が必要であるかまたは
望ましいような目的に用いられる。特定の好ましいＢ様
では、この酵素は下記のような増幅プロトコールに用い
られる。
１指１旦上ユニ火 本発明の酵素を用いる増幅プロトコールは、欧州特許出
願公開第２００，３６２号明細書に開示され且つ特許請
求されている既存の核酸配列を増幅する方法である。し
かしながら、この酵素は以下のような増幅工程で用いる
のが好ましい。
−船釣には、増幅工程は、連鎖反応であって、関与する
反応段階の数に関して対数的な量で少なくとも１種の特
異的核酸配列を産生ずる連鎖反応からなる。但し、（ａ
）所望な配列の末端が十分詳細に知られており、それら
にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを合成する
ことができ、（ｂ）少量の配列を連鎖反応を開始するの
に利用することができることを条件とする。連鎖反応の
生成物は、用いられる特定のプライマーの末端に対応す
る末端を有する別個の核酸デュプレックスであろう。
精製されたまたは未精製の形の如何なる核酸配列も、そ
れが所望の特定の核酸配列を含むかまたは含むと考えら
れる場合には、出発核酸として用いることができる。し
たがってこの工程は、例えばＤＮＡまたはメツセンジャ
ーＲＮＡを包含するＲＮＡを用いることができ、これら
のＤＮＡまたはＲＮＡは一本鎖または二本鎖であっても
よい。
更に、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであってそれぞれの
１つづつの鎖を有するものを利用することもできる。こ
れらの核酸のいずれかの混合物を用いることもでき、ま
たは同じまたは異るプライマーを用いて先行する増幅反
応から産生された核酸も同様に用いることができる。増
幅されるべき特定の核酸配列は大きな分子の単なる部分
であってもよく、または最初から別個な分子として存在
し、該特定の配列が全核酸を構成していてもよい。
増幅される配列は純粋な形で存在することは必要ではな
く、複雑な混合物の少量分画、例えば全ヒトＤＮＡに含
まれるβ−グロビンの一部分（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら
、５ｃｉｅｎｃｅ、２３０巻、工５−３０〜１５３４頁
、１９８５年、に例示されているようなもの〕または、
特定の生物学的試料の極少量部分のみを構成する特定の
微生物の核酸配列の一部分であることもできる。出発核
酸配列は１種又は複数の所望の特定の核酸配列を有し、
この配列は同じでも異なるものであってもよい、それ故
、この増幅工程は、ある種の特定の核酸配列を多量に産
生ずるのに有用であるだけでなく、同じまたは異る核酸
分子に配置された１種以上の異る特定の核酸配列を同時
に増幅するのにも有用である。
１種又は複数種の核酸は、如何なる由来からも得ること
ができ、例えばｐＢ！？３２２のようなプラスミド、ク
ローン化されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、または細菌、酵
母、ウィルス、オルガネラおよび植物または動物のよう
な高等生物のあらゆる由来の天然ＤＮＡまたはＲＮＡか
ら得ることもできる。
ＤＮＡまたはＲＮＡは血液、組織材料例えば絨毛膜また
は羊膜細胞から、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、
同上、２８０〜２８１頁によって記載されている方法の
ような各種技法によって抽出することができる。
増幅され、その後検出される配列に特異的なプローブを
用いるときには、細胞は核酸の抽出を行なわずに直ちに
用いることができ、この場合にはそれらを低張緩衝液に
懸濁して、細胞の溶解及び分子内成分の分散が起こるま
で、一般的には１〜１５分間約９０〜１００℃に加熱す
る。加熱工程の後、増幅試薬を、溶解した細胞に直接に
加えることができる。
如何なる特定の核酸配列も、増幅工程によって産生ずる
ことができる。必要なことは、配列の両端の十分な数の
塩基が十分詳細に知られており、所望の配列の異なる鎖
と共に配列に沿った相対的な位置でハイブリッド形成す
る２個のオリゴヌクレオチドプライマーを調製すること
ができ、一つのプライマーから合成された伸長生成物が
、その鋳型（相補体）から分離した時に、画定された長
さの核酸配列へのもう一方の伸長のための鋳型として働
くことができるようにすることである。配列の両端の塩
基についての知識が多くなるに従って、標的核酸配列の
ためのプライマーの特異性を高くすることができ、工程
の効率も高くなる。
これ以後に用いられる「プライマー」という用語は、増
幅される１又は複数のフラグメントの末端配列に関する
情報が幾分不明確である場合には特に、１種より多くの
プライマーを意味することができる。例えば、核酸配列
が蛋白質配列情報から推定される場合には、遺伝子コー
ドの縮重による総ての可能なコドンの多様性を代表する
配列が有するプライマーの集合をそれぞれの鎖について
用いられるであろう。この集合からのある１つのプライ
マーは、増幅されるべき所望の配列の末端と相同であろ
う。
オリゴヌクレオチドプライマーは、例えば上記のホスホ
トリエステルおよびホスホジエステル法又はそれらの自
動化した態様のような如何なる好適な方法を用いても調
製することができる。この様な自動化した態様ではジエ
チルホスホルアミダイトを出発物質として用い、ビュー
ケージ（Ｂｅａ−ｕｃａｇｅ）らの方法（Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　１９８１年、２２巻
、１８５９〜１８６２頁）によって合成してもよい。
修飾された固形支持体上でオリゴヌクレオチドを合成す
る方法は、米国特許第４，４５８，０６６号明細書に記
載されている。生物学的起源（例えば制限エンドヌクレ
アーゼ消化物）から単離したプライマーを用いることも
可能である。
特定の核酸配列は、この配列を含有する核酸を鋳型とし
て用いて産生される。第への段階は、それぞれの核酸鎖
を、増幅されまたは検出されるべきそれぞれの異なる核
酸配列について、４種の異なるヌクレオチドトリホスフ
ェートと１種のオリゴヌクレオチドプライマーと接触さ
せることを含む、増幅されまたは検出されるべき核酸が
ＤＮＡである時には、ヌクレオチドトリホスフェートは
ｄＡＴＰ　、　ｄｃＴＰ　、　ｄＧＴＰおよびＴＴＰで
ある。
核酸鎖は、追加の核酸鎖の合成用の鋳型として用いられ
る。この合成は、如何なる好適な方法を用いて行なうこ
ともできる。一般的には、それは、好ましくはｐＨは７
〜９であり、最も好ましくは約８である水性緩衝溶液中
で起こる。好ましくは、分離された鋳型類を含む緩衝液
に２種のオリゴヌクレオチドプライマーを、過剰モル量
で（クローン化された核酸については、通常は約１００
０：１のプライマー二鋳型比であり、ゲノム性核酸につ
いては、通常は約ｔｏ’：ｔのプライマー二鋳型比であ
る）加える。しかしながら、この方法を診断的用途に用
いるときには、相補的鎖の量が知られていないことがあ
り、したがって相補的鎖の量に対するプライマーの量は
確定することができないことがあることが理解される。
しかしながら、実際的には、加えられるプライマーの量
は、一般的には、増幅される配列が複雑な長鎖核酸鎖の
混合物中に含まれるときには、相補的鎖（鋳型）の量に
対して過剰モル量となるであろう。工程の効率を向上す
るには、大過剰量が好ましい。
ヌクレオチドトリホスフェートの濃度は、増幅用の緩衝
液中ではそれぞれ１５０〜２００団であり、ＭｇＣＩ−
ｔは緩衝液中に１６５〜２ｍＭの量で存在することによ
り反応の効率及び特異性を増加させる。
次に、生成する溶液を、増幅または検出されるべき核酸
が二本鎖か一本鎖かに依存して処理する。
核酸が一本鎖であるときには、変性段階を用いる必要は
なく、反応混合物は、プライマーのその相補的標的（鋳
型）配列へのハイブリダイゼーションを促進する温度に
保持される。このような温度は一般的には約３５℃〜６
５℃又はそれ以上であり、好ましくは約３７〜６０℃で
あり、効果的な時間は一般的には０．５〜５分間であり
、好ましくは１〜３分間である。好ましくは、Ｔａｑポ
リメラーゼ及び１５−マー以上のプライマーについては
４５〜５８℃を用いてプライマーのハイブリダイゼーシ
ョンの特異性を増加させる。プライマーが短い場合には
、より低温が必要である。
もとの−末鎖の核酸に対する相補体は、それに１または
２個のオリゴヌクレオチドプライマーを加えることによ
って合成することができる。適当な単一プライマーを加
えた場合、プライマー伸長生成物が、該プライマー、熱
安定酵素およびヌクレオチドトリホスフェートの存在で
合成される。
この生成物は該−末鎖の核酸に部分的に相補的であり、
そして該核酸鎖とハイブリダイズして等しくない長さの
鎖のデュプレックスを形成し、次いでこれが上記のよう
に一本鎖に分離されて、２本の単への分離された相補的
鎖を生成する。また、２種の適当なプライマーを一本鎖
核酸に加えて、反応を行なってもよい。
核酸が二本の鎖を有するときには、これを鋳型として用
いる前に核酸の鎖を分離する必要がある。
この鎖分離は、物理的、化学的または酵素的手段のよう
な好適な変性法によって行なうことができる。核酸の鎖
を分離する好ましい物理的方法は、核酸が完全（９９％
以上）に変性するまで加熱することを含む。典型的な熱
変性の温度は約９０〜１０５’Ｃであり、時間は一般的
には約０．５〜５分間である。好ましくは、効果的な変
性温度は、９０〜１００℃であり、０．５〜３分間であ
る。鎖の分離は、ヘリカーゼとして知られている酵素の
クラスからの酵素、またはヘリカーゼ活性を有しそして
リボＡＴＰの存在下でＤＮＡを変性することが知られて
いる酵素ＲｅｃＡによって誘発することもできる。
ヘリカーゼを用いて核酸の鎖を分離するのに好適な反応
条件は、ターン・ホフマンーベーリング（Ｋｕｈｎ　Ｈ
ｏｆｆｍａｎｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇ）　、　Ｃ３Ｈ−Ｑｕ
ａｎｔｉ核酸ｔｉｖｅｌ堕１幻α−４３巻、６３頁、１
９７８年に記載されており、ＲｅｃＡを用いる技法はシ
ー・ラッシング（ｃ，Ｒａｄｄｉｎｇ）Ａｎｎ、Ｒｅｖ
、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６巻、４０５〜３７頁、１９８
２年に記載されている。これらの変性法により、等しい
かまたは等しくない長さの２本の分離された相補的鎖が
生じる。
二本鎖核酸が熱によって変性された場合には、反応混合
物を、存在するそれぞれのプライマーの相補的標的（鋳
型）配列へのハイブリダイゼーションを促進する温度に
放冷する。この温度は、試薬によって異り、通常は約３
５°Ｃ〜６５℃又はこれ以上であり、好ましくは３７〜
６０℃であり、効果的な時間、一般的には０．５〜５分
間、好ましくは１〜３分間維持される。実際には、Ｔａ
ｑポリメラーゼについては、温度は単に約９５℃から３
７℃程度へ、好ましくは約４５〜５８°Ｃへ低下させる
だけであり、ハイブリダイゼーションはこの範囲内の温
度で起きる。
核酸が一本鎖または二本鎖のいずれであっても、熱安定
酵素を変性段階で加えることができ、あるいはハイブリ
ダイゼーションを促進する範囲まで温度が下がった時又
はこの範囲の温度にあるときに加えることができる０次
いで、反応混合物を、酵素の活性が促進されまたは最適
化される温度、すなわちハイブリダイズしたプライマー
及び鋳型からのプライマー伸長生成物の合成を促進する
のに酵素の活性を増加させるのに十分な温度まで加熱す
る。この温度は、実際にそれぞれの核酸鋳型に相補的な
それぞれのプライマーの伸長生成物を合成するのに十分
なものでなければならないが、その相補的鋳型からのそ
れぞれの伸長生成物を変性してしまうほど高温であって
はならない（すなわち、この温度は一般的には約８０℃
〜９０℃以下である）。
この合成反応に効果的な典型的な温度は、主として用い
られる酵素および１種又は複数種の核酸のタイプによっ
て異り、一般的には約４０〜８０℃、好ましくは５０〜
７５℃である。この温度は更に好ましくは、テルムス・
アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａａｕａ　ｔ　１ｃｕｓ
）からのＤＮＡポリメラーゼを用いる場合には、約６５
〜７５℃である。この合成に要する時間は、主として温
度、核酸の長さ、酵素および核酸混合物の複雑さによっ
て変わり、約０．５〜４０分間又はこれ以上、好ましく
は１〜３分間の範囲にある。核酸が長いものであれば、
一般的にはより長時間を必要とする。ジメチルスルホキ
シド（ＤＭＳＯ）はＴａｑポリメラーゼ酵素の活性を阻
害することが見出だされているので、ＤＭＳＯは存在す
る必要はなくまたは推奨されない。
新たに合成された鎖とその相補的核酸鎖は二本鎖の分子
を形成し、この分子はこの工程の引き続く段階において
用いられる。次の段階では、二本鎖分子を変性するのに
効果的ではあるがしかし熱安定酵素が完全且つ不可逆的
に変性しまたは不活性化するほど高くはない温度で熱変
性することによって二本鎖分子の鎖を分離する。この温
度は、主として酵素のタイプおよび核酸の長さによって
異り、−Ｊｎ的には約９０〜１０５℃、更に好ましくは
９０〜１００℃であり、変性に要する時間は、主として
温度と核酸の長さによって変わり、典型的には０．５〜
４分間である。この処理時間の後、プライマーに相補的
な前の段階から生成した一本鎖分子（鋳型）へのプライ
マーのハイブリダイゼーションを促進する水準まで温度
を下げる。この温度は、上記したような温度である。
このハイブリダイゼーション段階の後に、またはハイブ
リダイゼーション段階の代わりに（またはそれと同時に
）、熱安定酵素の活性を促進しそして前の段階からの新
たに合成された鎖を鋳型として用いてプライマー伸長生
成物を合成することができる温度に調整する。この温度
も、上記したように、その鋳型から伸長生成物を分離（
変性）するほど高いものであってはならない（通常は、
４０〜８０℃で０．５〜４分間、好ましくは５０〜７０
“Ｃで１〜３分間である）。ハイブリダイゼーションが
この段階中に起こるので、前の段階の変性後冷却は必要
でない、このような２つ以上の段階を同時に行なう場合
には、好ましい温度範囲は５０〜７０’Ｃである。
鎖の分離、ハイブリダイゼーションおよび伸長生成物の
合成の加熱および冷却段階は、所望量の特定の核酸配列
を産生ずるのに必要な回数だけ繰り返すことができ、こ
の回数は最終的用途によって変わる。この回数は、存在
するプライマー、熱安定酵素およびヌクレオチドトリホ
スフェートの量によって制限されるだけである。これら
の段階は、少なくとも２回繰り返すのが好ましい。検出
に使用するためには、サイクルの数は、例えば試料の性
状によって変わる０例えば、増幅されるべき試料が純粋
なときにはサイクル数は少なくて済む。試料が核酸の複
雑な混合物であるときには、シグナルを十分に増幅して
検出するには、より多くのサイクル数が必要となる。一
般的な増幅および検出には、工程を少なくとも２０回繰
り返すのが好ましい。
下記のように、標識した配列特異的プローブを用いると
きには、これらの段階を少なくとも５回繰り返すのが好
ましい。ヒトゲノムＤＮＡを上記のようなプローブと共
に用いるときには、この工程を好ましくは１５〜３０回
繰り返して配列を十分に増幅して、明確に検出可能なシ
グナルが生成するようにする。すなわちバンクグラウン
ドノイズが検出を妨げないようにする。
以下に更に詳細に説明するように、生成した特異的核酸
配列の量は、指数的に蓄積する。
酵素が不可逆的に変性または不活性化しない限り、ヌク
レオチド、プライマーまたは熱安定酵素を最初に加えた
後に更に添加する必要はない。酵素が不可逆的変性又は
不活性化を受ける場合には、それぞれの変性段階の後に
酵素を補充する必要がある。しかしながら、それぞれの
段階でこれらの物質を添加しても反応には悪影響を及ぼ
さない。
第への核酸または核酸の混合物から１種より多くの特定
の核酸配列を産生させることが所望な時には、適当な数
の異なる種類のオリゴヌクレオチドプライマーを利用す
る。例えば、２種類の異なる特定の核酸配列を産生させ
るときには、４種類のプライマーを用いる。これらのプ
ライマーの２つは特定の核酸配列の一つに特異的であり
、残りの２種のプライマーは第二の特定の核酸配列に特
異的である。この場合には、２種類の異なる特定の配列
のそれぞれが、本発明によって指数的に産生される。
適当な長さの時間が経過して所望量の特定の核酸配列が
産生された後、既知の方法（例えば、ＥＤＴＡ　、フェ
ノール、ＳＤＳまたはＣＨＣＮ　１の添加）で酵素を不
活性化することによって、または反応の成分を分離する
ことによって、反応を停止させる。
増幅工程は連続的に行なってもよい。自動化法の一態様
では、温度を所定の水準に所定の時間制御するように設
定する温度サイクルを反応混合物に行なってもよい。
この目的のための一つの装置は、本発明の増幅反応を制
御するための自動化された装置である。
この装置はコンピューターによって制御される液体取扱
系を利用しており、第への容器で成る制御された温度で
保管された酵素を、温度がコンピューターで制御されて
所定のインキュベーション方式に一致するようになって
いる第二の容器に液体移動させるものである。この第二
の容器は１種又は複数の増幅される核酸配列とヌクレオ
チドトリホスフェートとプライマーを貯蔵している。コ
ンピューターはユーザー・インターフェースを備えてお
り、それによって使用者がインキュベーションの時間お
よび温度、移動させる酵素の量などの、増幅工程におけ
る各種段階の特徴を制御する工程パラメーターを入力す
ることができるようになっている。
酵素はサイクル毎に移動させる必要はないので、用いる
ことができる好ましい装置は液体制御系のない温度循環
を利用している。この様な装置は、下記のような系から
なっている。
１、所定数の試験管、好ましくは５００μノ試験管であ
って、ヌクレオチドトリホスフェート、プライマー、核
酸配列および酵素の反応混合物が入っている試験管を固
定する熱伝導性容器。
２、熱伝導性容器を加熱、冷却し且つ室温より高いおよ
び低い温度に保持する装置であり、この装置は容器を加
熱、冷却しまたは保持する温度を制御する制御シグナル
を受けとる入力部を有する〔この様な装置はマテリアル
ス・エレクトロニクス・プロダクツ・コーポレーション
（ＦＩａｔｅｒｉａｌｓＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ　Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）　、　　トレ
ントン、ニューシャーシーから発売されているベルティ
ーア（Ｐｅｌ　ｔｉｅｒ）熱ポンプまたは水熱交換器で
もよい〕 ３、上記の装置の入力部に接続したコンピューター装置
（例えば、マイクロプロセンサー・コントローラー）で
あって、増幅工程、温度水準および温度勾配とタイミン
グを自動的に制御するシグナルを発生する装置。
もう一つの態様では、プライマー伸長生成物の合成に用
いられる酵素は、カラム中に固定することができる。他
の反応成分をポンプによってこのカラムと加熱コイル中
を連続的に循環させることができる。したがって、生成
した核酸を、酵素を不活性化することなく繰り返し変性
させることができる。
次に、増幅プロトコールを模式的に示す。ここでは、相
補的なｔＮ（Ｓ”〕及び［Ｓ−］を含んで成る所望の配
列（Ｓ）を含有する２末鎖Ｄ　Ｎ　Ａが核酸として使用
される。第１の及びこれに続く各反応サイクルの間、も
との鋳型上での各オリゴヌクレオチドプライマーの延長
が、プライマーの１つのみにより停止する無限長の新し
い、、ＤＮＡ分子生成物を生成する。今後“長生酸物″
と称するこれらの生成物は直線的に蓄積するであろう。
すなわち、ある数のサイクルの後に存在する量がサイク
ル数に比例するであろう。
こうして生成された長生酸物は、その後のサイクルの間
一方又は他方のオリゴヌクレオチドプライマーの鋳型と
して機能し、そして所望の配列（Ｓｏ）又は〔Ｓ−〕の
分子を生成するであろう。
これらの分子もまた、一方又は他方のオリゴヌクレオチ
ドプライマーの鋳型として機能してさらに〔Ｓ゛〕及び
〔Ｓ−〕を生成し、そしてそれ故に、サイクル数に対し
て指数的速度での［５］の蓄積をもたらすであろう連鎖
反応が継続され得る。
意図されるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション
以外のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによ
り生成される副産物は自己触媒的ではなく、そしてそれ
故に直線的速度で蓄積する。
以下余白 １つのプライマーのオリゴヌクレオチド配列で停止する
各類及び他方の相補鎖は生成することが所望される特定
の核酸鎖（Ｓ）であることがわかる。
この工程の段階は無限に反復することができ、プライマ
ー１及び２、誘導剤及び存在するヌクレオチドによって
のみ限定される。もとのヌクレオチドは複製されないの
で、その量は全工程を通じて一定に維持される。長生酸
物はもとの核酸からのみ生成されるのでその量は直線的
に増加する。
特定の配列の量は指数的に増加する。すなわち、特定の
配列は支配的な種となる。これは次の表に示される。こ
の表は、各サイクルの効率を１００％として、ｎサイク
ル後に存在する種の相対量を示す。
以下余白 ０〜ｎサイクル′の２ の ２　　　　　　　ｌ　　　　　　　２　　　　　　　　
　１３　　　　　　　工　　　　　　　３　　　　　　
　　　４１５　　　　　　　１　　　　　　１５　　　
　　　３２．７５２２０　　　　　　１　　　　　　２
０　　　　１．０４８，５５５ｎ　　　　　　　　１　
　　　　　　　ｎ　　　　（２Ｌｌ−ｎ−１）鋳型とし
て一末鎖ヌクレオチドが使用される場合、サイクル当り
１個のみの長生酸物が生成する。
少なくとも１サイクルの増幅の後に、増幅される配列の
（末端にない）内部配列に相補的な一組のプライマーを
加えることによって、所定回数の増幅の後、所定の配列
内の配列を増幅して反応の特異性を大きくすることがで
きる。この様なプライマーは如何なる段階で加えてもよ
く、そしてこのちのはより短い増幅されたプライマーを
供するであろう。また、非相補的末端を有するが、増幅
において前に用いてプライマーと幾分オーバーラツプす
るプライマーを用いることによってより長いフラグメン
トを調製することができる。
この発明方法を用いて、特定の核酸配列をクローン化し
て、適当な発現ベクターに挿入することができる０次に
、このベクターを用いて適当な宿主生物を形質転換して
、組換えＤＮＡ技法の標準的方法によって配列の遺伝子
生成物を産生させることができる。
この増幅工程は、元の鋳型核酸、予想される標的増幅生
成物および各種のバックグラウンドの非標的生成物から
の核酸の混合物を生じさせることができる。元の鋳型Ｄ
ＮＡかへテロ接合性二倍体ゲノムにおけるような複数の
標的配列を有するとき、または関連遺伝子のファミリー
があるときには、増幅された生成物は混合物であること
もある。
これらのプライマーを改変して、増幅反応によって生成
されるＤＮＡの混合物の速やかで且つ特異的なりローン
化を補助することができる。この様な改変では、プライ
マーのそれぞれに、または増幅され且つクローン化され
る配列中に制限部位が含まれる。好ましくは、同じまた
は異なる制限部位をプライマーの５′末端に導入し、増
幅された生成物の二個の末端に制限部位を生じるように
するのが好ましい。適当な酵素で切断すると、増幅され
た生成物は容易にプラスミドまたはバイアルベクター中
に挿入されて、クローン化される。
このクローニングによって、混合物ではなく個々の増幅
された生成物の分析または発現が可能になる。
プライマーがその中に導入された制限部位を有するとき
には、同じ制限部位を両方のプライマーに用いることが
できる。しかしながら、異なる制限部位を用いると、生
成物を特異的な方向でベクター中に挿入することができ
、複数の挿入、及び２個のプライマーの一方のみに基づ
いた増幅から生じる挿入は抑制する。特異的方向性は、
−末鎖配列ベクターへのクローニング時、−零鎖ハイブ
リダイゼーションプロープを用いる時またはクローン化
された生成物が発現されるべき場合に有用である。
プライマーを調製する一つの方法は、標的配列から極僅
に異なるプライマー配列を選択することである。プライ
マーのそれぞれが配置されるべき傾城は、所望のベクタ
ーに適当な制限部位に対する相同性についてスクリーニ
ングされる。例えば、標的配列ｒＣＡＧＴＡＴＣＣＧＡ
、、、　Ｊは、ＢａｍＨＩ部位を有するものと一個の塩
基しか違わない、プライマー配列はその３′末端で正確
にマツチし、その５′末端付近に変更された配列および
制限部位を有するように選択される（例えば、ｒＣＡＧ
ｇＡＴＣＣＧＡ、、、　Ｊであり、小文字は標的配列と
マツチしないものを表わしている）。この最少限に変更
した配列は、プライマーが元の標的配列とハイブリッド
形成し、重合を開始する能力を妨げない。第への増幅サ
イクルの後、プライマーはコピーされて、標的となり、
新たなプライマーと正確にマツチする。
増幅工程の後、生成物を適当な制限酵素で開裂せしめ、
例えば、脱塩カラムまたは分子量クロマトグラフィカラ
ムを通過させあるいは膜を通過させることによって、制
限消化物を場合によってはヌクレオチドトリホスフェー
トおよび塩のような連結の阻害側から分離させ、クロー
ン化されるべき増幅配列を含有する（１種以上の）消化
生成物は、連結反応によって、バクテリオファージＭ１
３のようなりローユングベクターに挿入される。クロー
ニングベクターは、−Ｊ’ｌＱに選択マーカーを有し、
そして場合によってはさらにプロモーターを有すること
もある。次に、遺伝子が蛋白質をコードするときには、
これを公知の技法によって配列決定し、そして／または
発現させることができる。
遺伝子はまた、配列決定されるべき所望の部分に相補的
な適当なプライマーを増幅工程中に加えることによって
配列決定することもできる。このプライマーは伸長生成
物を形成して、この伸長生成物を有する増幅の程度が配
列情報を提供することになる。
プライマーを調製するためのもう一つの方法は、標的配
列からプライマーの３′末端を取り出して、プライマー
の５′末端へ所望の制限部位を加えることからなってい
る０例えば、ＨｉｎｄＩ［Ｉ部位を加えて、配列ｒｃｇ
ａａｇｃｔｔＣＡＧＴＡＴＣＣＧＡ、、Ｊ　　（但し、
小文字は上記定義の通りである）を作ることができる。
加えられた塩基は増幅の第へのサイクルでハイブリダイ
ゼーションには寄与しないが、これ以後のサイクルでマ
ツチする。次に、最終的に増幅された生成物を１種又は
複数種の制限酵素で切断して、上記のようにクローン化
し、発現させる。
増幅される遺伝子は、例えばヒトβ−ヘモグロビンまた
はヒトＨＬＡＤ口、ＤＲまたはＤＰ−αおよびβ遺伝子
であってもよい。
もう一つの、余り好ましくはなく且つあまり効率的なも
のとはいえないクローニング法であって（制限酵素を用
いる）接着末端連結よりはむしろ平滑末端連結を用いる
方法においては、クローン化されるべき１種又は複数種
の配列あるいはプライマー中の制限酵素とは無関係に基
本的増幅方法が用いられる。しかしながら、これらの段
階は、連結を行なうのに十分なだけ増幅された１種又は
複数種の配列を産生ずるのに十分な回数にわたり繰り返
さなければならない。平滑末端連結では、接着末端連結
の場合よりも高濃度の１種又は複数種の配列と１種又は
複数種のクローニングベクターを必要とする。更に、こ
の連結反応はＴ４リガーゼ、Ｅ、コリ　（ＥＬｃｏｌｉ
）　　リガーゼのようなりガーゼの存在で行なわなけれ
ばならない。増幅された生成物が得られたならば、連結
処理法は当業者に周知の条件を用いる標準的処理法によ
り行われる。
平滑末端連結反応を用いないクローニング法は、増幅さ
れた生成物のクローニングベクターへの挿入の方向性ま
たは多重性を制御する。
更に、この工程は、試験管内での変異誘発に用いること
ができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、増幅され
るべき核酸配列に正確に相補的である必要はない。それ
らは、熱安定酵素によって伸長されるべき配列十分にハ
イブリダイズすることだけが必要である。用いられるプ
ライマーが元の鋳型に正確には相補的ではない場合の増
幅反応の生成物は、鋳型配列ではなくプライマーの配列
を有するので、試験管内突然変異が導入される。
引き続くサイクルでは、この突然変異は、それ以上不対
台ブライミングを必要としないので、限定されない効率
で＃Ｉ輻される。このようにして産生された変異体を標
準的な生物学的技法によって適当なベクターへ挿入する
ことができ、このベクターに変更された蛍白質の産生態
のような変異体特性を付与することができる。
上記のような変更されたＤＮＡ配列を作る工程は、他の
配列の変化を誘発するための異なるプライマーを用いて
、変更されたＤＮＡに対して繰り返すことができる。こ
のようにして、一連の変異配列が徐々に産生され、この
シリーズに新たに加えられたそれぞれのものは前のもの
から僅かしか粉となっていないが元のＤＮＡ源配列から
はかなりの点で異なっているようにすることができる。
このようにして、非常に不適正なプライマーを機能させ
ることはできないために単一段階では得られないような
変化を、最終的に行なうことができる。
更に、十分な量のプライマーが、増幅されるべき鎖に相
補的な配列を含有する場合には、プライマーはその配列
の一部に非相補的配列を有することができる０例えば、
（プロモーター、リンカ−コード配列などの）鋳型配列
に相補的でないヌクレオチド配列をプライマーの一方ま
たは両方の５′末端に結合させ、これによって増幅工程
の生成物に付加することができる。伸長プライマーが添
加された後、工程を十分な回数だけ繰り返し、非相補的
ヌクレオチド挿入部を含有する新たな鋳型を所望な量で
得る。これによって、単純な技法を用いて、比較的短時
間（例えば２時間以下）で結合したフラグメントを多量
に産生ずることができる。
この方法を用いて、感染症、遺伝学的疾患または細胞性
疾患、例えば癌に関する特異的核酸配列、例えば腫瘍遺
伝子の検出および／または特徴化を行なうことができる
。分析に利用できる核酸の量が極めて少ないとき、例え
ば胎児細胞から得られるＤＮＡを用いる鎌状赤血球貧血
の出生前診断で有用である。この増幅法は、非放射性検
出法を用いる本来鋭敏でない分析法を用いて少量試料の
分析を行なう場合、または放射分析法を用いる場合であ
って速やかな検出が望まれる場合に、特に有用である。
本発明の目的に関して、遺伝学的疾患は、例えば鎌状赤
血球貧血、α−サラセミア、β−サラセミア等のような
生体からのゲノムＤＮＡの特異的欠失および／または変
異誘発を包含する。鎌状赤血球貧血は、本方法によ・り
適当なりＮＡ配列の増幅を行なった後の１９８５年１２
月１１日発行の欧州特許出願公開第１６４　、０５４号
明細書に記載のオリゴマー制限分析によりまたはＲＦＬ
Ｐ様分析により、容易に検出することができ、α−サラ
セミアは、この疾患を起こす変異部に緊密に関連した多
形制限部位の不在によって検出することができ、またβ
−サラセミアはその制限部位の存在によって検出するこ
とができる。
これらの遺伝的疾患の総ては、適当な配列を増幅し、そ
れをサザン法によって放射性プローブを用いることなく
分析することによって検出することができる。この様な
方法では、例えば極めて低水準の所望な配列を含む羊水
からのＤＮＡの少量の試料を増幅し、制限酵素で切断し
、サザン法によって分析する。増幅された高水準のシグ
ナルによって非放射性プローブの使用が容易になる。
もう一つの態様では、ＤＮＡの少量試料を通常の水準に
まで増幅した後、伸長反応のサイクルを続けて行ない、
この場合、（ｆｆＺ　ｐ−標識またはビオチン−標識し
たヌクレオチドトリホスフェートのような）容易に検出
されるヌクレオチド誘導体を最終のＤＮＡ生成物中に直
接に導入し、これを制限酵素処理および電気泳動法によ
る分離またはその他の適当な方法で分析することが可能
である。
もう一つの態様では、核酸を、増幅前に特定の制限エン
ドヌクレアーゼに暴露することができる。
切断された配列は増幅することは出来ないので、あらか
じめＤＮＡ試料を制限酵素処理したにもかかわらず増幅
されたフラグメントが出現することは、増幅された配列
内のエンドヌクレアーゼの部位の不在を示唆する。増幅
された配列の存在または不在は、適当な方法によって検
出することができる。
本発明の方法の実際的応用は、本明細書、および欧州特
許第１６４，０５４号明細書（同上）およびサイキ（Ｓ
ａｉｋｉ）らのＢｉｏ／　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３巻
、１００８〜１０１２頁に記載されているオリゴマー制
限法によって鎌状赤血球貧血の検出を容易にするための
その使用によって例示することができる。鎌状赤血球貧
血は、β−グロブリン遺伝子の６番目のコドンにおける
唯一つの塩基対の変化によって起こるヘモグロビン疾患
である。
本発明の方法は、配列特異的オリゴヌクレオチドを用い
て（ゲノムＤＮＡのような）核酸配列の一塩基対の変化
を直接に検出するのにも用いるこ止ができる。この方法
では、癌、感染症または遺伝的疾患例えば遺伝的欠失か
ら生じるような配列変化を直接に検出することができ、
本来なら必要な制限酵素消化、電気泳動およびゲル操作
の必要がなくなる。本明細書に記載する増幅の後のドツ
ト・プロット方式において配列特異的オリゴヌクレオチ
ドを用いると、プローブの特異性および感受性が向上し
、解釈可能なシグナルを、０．０４ｇの試料を用いて６
時間以内に得ることができる。また、膜にスポットする
試料の量を０．１−０．５　ｇに増加すると、従来の方
法で用いられる放射性プローブの代わりに、非放射性標
識されたオリゴヌクレオチドを用いることができる。更
に、以下に記載の方法は、大きさが１９−マー未満の配
列特異的オリゴヌクレオチドの使用に適用することがで
き、したがって更に識別力のある配列特異的オリゴヌク
レオチドを使用することができる。
遺伝的疾患に関しては、ＲＦＬＰはこの疾患に関する多
形制限部位を必要とするが、配列特異的オリゴヌクレオ
チドは直接に遺伝的欠失を検出し、単への塩基の突然変
異によって住じるヘモグロビンＣ症、α−１−アンチト
リプシンおよびβ−サラセミアのような病気の解析に極
めて有用である。
また、オリゴヌクレオチドを用いて、異なる対立遺伝子
（例えばＨＬＡ型）を表わす遺伝的変異体を識別するこ
とができるので、熱安定酵素を含む配列特異的オリゴヌ
クレオチドを基礎としたキットの可能性が示唆される。
本発明の１態様では、ヌクレオチドの配列変化を検出し
ようとするときには、上記の様に、ヌクレオチド変化を
含むと推定されるそれぞれの核酸のそれぞれの鎖につい
て１個のプライマーを用いて増幅した試料を一連の膜に
直接にスポットし、そしてそれぞれの膜を異る標識され
た配列特異的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダ
イズをせしめる。膜への試料のスポット法については、
カホトス（Ｋａｆｏｔｏｓ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ７巻、１５４１〜１５５２頁
、１９７９年に記載されている。
要約していえば、膜に固定されたＤＮＡ試料を、ドデシ
ル硫酸ナトリウム、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、血清
アルブミンおよび各種の塩を含むブレハイブリダイゼー
ション溶液を用いて、プローブを加える前に、前処理す
ることができる。次いで、標識されたヌクレオチドプロ
ーブであって検出しようとするそれぞれの配列変化に特
異的なものをプレハイブリダイゼーション溶液と同様の
ハイブリダイゼーション溶液に加える。このハイブリダ
イゼーション溶液を膜に適用して、この膜を、プローブ
の型および長さ、成分の型および濃度等によって異るハ
イブリダイゼーション条件に付す、−船釣には、ハイブ
リダイゼーションは約２５〜７５℃、好ましくは３５〜
６５℃、０．２５〜５０時間、好ましくは３時間未満行
なう。条件のストリンジエンシーが大きくなればなるほ
ど、プローブと試料とのハイブリダイゼーションに必要
な相補性は大きくなる。
バックグラウンド水準が高ければ、それだけストリンジ
エンシーは高くなる。ストリンジエンシー条件は、洗浄
にも取り込むことができる。
ハイブリダイゼーションの後、好適な手段を用いてハイ
ブリダイゼーションされないプローブを試料から洗浄除
去する。例えば各種濃度の標準的塩リン酸ＥＤＴＡ（Ｓ
ＳＰＥ）　（１８０ｍＭのＭａｃｌ、　１０ｍＭのＮａ
）ｌＰＯ４およびＩＭのＥＤＴＡ　、　ｐＨ７，４）溶
液で２５〜７５℃で約１０分間〜時間、１回以上洗浄す
るが、この時間は温度によって変化する０次いで、この
標識を適当な検出法を用いて検出する。
ここで用いられる配列特異的オリゴヌクレオチドは、−
Ｇ的には、プライマーを調製するために上記の方法で調
製され選択されるオリゴヌクレオチドである。上記のよ
うに、配列特異的オリゴヌクレオチドは、検出されるべ
きヌクレオチド変化にわたる配列の領域を包含し、検出
されるべきヌクレオチド変化に特異的なものでなければ
ならない。例えば、試料が綿状赤血球貧血の変異を含む
かどうかを検出することが所望ならば、正常なβ−グロ
プリン遺伝子に特徴的なヌクレオチド配列部位を含むオ
リゴヌクレオチドを調製し、さらに鎌状赤血球対立遺伝
子に特徴的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチ
ドを調製する。それぞれのオリゴヌクレオチドを同じ試
料の複製物とハイブリダイズせしめ、試料が変異を含む
かどうかを決定する。
ＨＬＡクラス■遺伝子の多形性領域は第一エクソンの特
定の領域に局在しており、保存された配列によって挟ま
れているので、第一エクソンの保存された５′および３
′末端の対向する鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプラ
イマーを調製することができる。
ＨＬＡクラス■遺伝子の多形性領域の検出に用いられる
オリゴヌクレオチドの数は、クラスター構造を有するま
たはばらばらに分散している塩基対変異の領域を有する
遺伝子の型によって異る。
）ＩＬＡ　−Ｄローαの場合のように、この領域がクラ
スター構造を有するときには、それぞれの対立遺伝子に
ついて一つのオリゴヌクレオチドを用いる。
この領域が、ＨＬＡ　−ＤローβおよびＨＬＡ　−ＤＲ
−βの場合のように、分散しているときには、それぞれ
の対立遺伝子について１種より多くのプローブであって
それぞれ対立遺伝子変異体を包含するものが用いられる
。Ｉ（ＬＡ　−ＤＱ−βおよび）ＩＬＡ　−Ｄｉ？−β
の場合には、３種のプローブを、対立遺伝子変異が起き
る遺伝子座の３個の領域について用いる。
インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）の検出には
、ＨＬＡ　−ＤＲβ第二第二エキソウいて４個のプロー
ブを用いる。
ハブロタイブは、家族における分離（ｓｅｇｒｅｇａｔ
ｉｏｎ）から、または場合によって個体のＤＮＡ試料の
直接分析によって推定することができる。配列特異的オ
リゴヌクレオチド反応性の特異的対立遺伝子の組合せ（
ハロタイプ）は、増幅前にゲノムＤＮＡの制限酵素消化
を用いることによってペテロ接合細胞において同定する
ことができる。
例えば、ＤＱβで、高度に変異可能な副領域Ａ、Ｂおよ
びＣが単への増幅領域内に見出される場合、およびそれ
ぞれの領域で６個の異なる配列（ＡＩ−６，Ｂ１−６．
Ｃｌ−６）がある場合には、可能なハブロタイブの組合
わせＡＩ　、　Ｂ２　、　Ｃ１；＾１　、　Ｂ２゜Ｃ４
；　Ａ２　、　Ｂ２　、　Ｃ１；　Ａ２　、　Ｂ２　、
　Ｃ４；　Ａｌ　、　Ｂ３　、　Ｃ１；　Ａｌ　。
Ｂ３　、　Ｃ４；　Ａｌ　、　８２　、　Ｃ１ｉおよび
ＡＩ　、　Ｂ２　、　Ｃ４を伴って、配列特異的オリゴ
ヌクレオチドプローブ分析によって個体をＤＱβ座にお
いてＡｔ　、　Ａ２　；　Ｂ２　、　Ｂ３　；　ＣｌＣ
４を含むものとしてタイプ分けすることができる。
ゲノムＤＮＡが多形性限酵素によって増幅前に消化され
る場合、及びこの酵素がプライマーの間の対立遺伝子を
両方とも切断する場合、増幅の欠如のため配列特異的プ
ローブとの反応性はなく、同等情報を提供しない。この
酵素が対立遺伝子を切断しないときには、消化されたお
よび消化されないゲノムＤＮＡでの結果は同じになり、
その結果は同等情報を提供しないものとなる。この酵素
が一方の対立遺伝子のみを切断するときには、消化され
たおよび消化されないＤＮＡのプローブ反応性パターン
を比較することによって両方のハブロタイブを推定する
ことができる。
これらのハブロタイブは、未切断ゲノムＤＮＡおよび多
形であり且つプライマーの間の部位を認識する事が知ら
れている１〜数個の酵素で切断したゲノムＤＮＡと配列
特異的オリゴヌクレオチドとの反応性を比較することに
よって推定することができる。
配列特異的オリゴヌクレオチドの長さは、検出されるべ
き特定の標的分子、オリゴヌクレオチド源およびヌクレ
オチド組成のような多くのファクターによって異る０本
発明の場合には、配列特異的オリゴヌクレオチドは、典
型的には、１５〜２５ヌクレオチドを有するが、より多
くのまたは少ないヌクレオチドを含んでいてもよい。長
さが少なくとも１９７−であるオリゴヌクレオチドは、
特異性および／または感受性を高めるが、１９マ一未満
の、例えば１６−マーであるプローブは、おそラフ単一
ミスマッチがより不安定化するので、更に高い配列特異
的識別力を示すことができる。増幅によって特異性が増
加するので、より長い長さは必須ではなく、ハイブリダ
イゼーションおよび洗浄温度は同し塩濃度について低い
ものでもよく、長さがＩ９マー未溝のオリゴヌクレオチ
ドを用いることが好ましい。
試料を最初に膜に置いて、次いでオリゴヌクレオチドで
検出するときには、このオリゴヌクレオチドは、分光的
、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段に
よって検出することができる好適な標識残基で標識しな
ければならない。免疫化学的手段には、適当な条件下で
オリゴヌクレオチドと複合体を形成することができる抗
体があり、生化学的手段には適当な条件下でオリゴヌク
レオチドと複合体を形成することができるポリペプチド
またはレクチンがある０例えば、螢光線量、エレクトロ
ン・デンス（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｄｅｎｓｅ）試薬、不
溶性反応生成物を沈澱させまたは発色によって検出する
ことができる酵素、例えば西洋ワサビ・ペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼのようなもの、ｉｚｐのよ
うな放射性標識またはビオチンがある。ビオチンを用い
るときには、スペーサーアームを用いてそれをオリゴヌ
クレオチドに結合せしめる。標識残基として西洋ワサビ
・ペルオキシダーゼが好ましい。
また、「逆」ドツト・プロット方式では、プライマーの
少なくとも１個および／または４種のヌクレオチドトリ
ホスフェートの少なくとも１つを検出可能な標識で標識
して、生成する増幅された配列を標識記する。これらの
標識残基は最初から反応混合物中に存在してもよくまた
は増幅の後期サイクルで加えて増幅生成物に標識を導入
することができる。次に、配列変異（正常または突然変
異体のいずれでも）が存在するときには、増幅された核
酸配列でハイブリッド形成できる未標識の配列特異的オ
リゴヌクレオチドを上記のようなプレハイブリダイゼー
ション条件下で膜にスポット（または固定）する０次に
、増幅された試料を、上記のようにハイブリダイゼーシ
ョン条件下で前処理した膜に加える。最後に、検出手段
を用いて、核酸試料の増幅された配列が膜に固定された
オリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションする場合
に検出を行なう。ハイブリダイゼーションは変異を含む
膜に結合した配列が増幅生成物に存在するときにのみ、
すなわちプローブの配列が増幅された配列の領域に相補
的である場合にのみ起こる。
「逆」ドツト・プロット方式のもう一つの態様では、上
記の「順Ｊドツト・ブロック方式でのように標識を用い
ることはなく増幅を行ない、変異が存在するときにはそ
れを含む増幅された核酸配列とハイブリダイズすること
ができる標識された配列特異的オリゴヌクレオチドプロ
ーブを、上記のようなプレハイブリダイゼーション条件
下で膜にスポット（または固定）する０次に、増幅され
た試料を、上記のようなハイブリダイゼーション条件下
で前処理した膜に加える。次いで、標識したオリゴヌク
レオチドまたはそのフラグメントを膜から遊離せしめ、
試料中の増幅された配列が標識されたオリゴヌクレオチ
ドにハイブリダイゼーションする場合に、検出手段を用
いて検出することができるようにする。遊離は、例えば
プローブの制限部位を認識する膜に制限酵素を加えるこ
とによって起こすことができる。オリゴマー制限として
知られているこの方法は、１９８５年１２月１１日発行
の欧州特許出願公開第１６４，０５４号明細書に更に詳
細に記載されている。
順および逆ドツト・プロット方式のいずれでも、いずれ
かの生物からの検出される遺伝的疾患は、特異的欠失、
挿入および／またはゲノムＤＮＡのような核酸のいずれ
かの塩基対の突然変異または多形における置換を含む。
塩基対の変異が知られている疾患の例としては、鎌状赤
血球貧血、ヘモグロビンＣ症、α−サラセミア、β−サ
ラセミア等がある。検出することができる他の病気には
ＲＡＡ腫瘍遺伝子、例えばｎ−ＲＡＳ腫瘍遺伝子を含む
癌性疾患および感染症がある。
ドツト・プロット法は、組織の移植、病気に罹り易さお
よび父性の決定の分野でのＨＬＡタイピングに用いるこ
ともできる。ＨＬＡクラス■遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＲ，
ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ　−ＤＰ領領域らのαおよび
β遺伝子からなり、極めて多形性が高く、それらのＤＮ
Ａ水準での遺伝学的複雑性は血清学的タイピングによっ
て一般的に定義されている多形よりも著しく大きい。更
に、本発明の方法は、インシュリン依存性真性糖尿病（
ＩＤＤＭ）に関するＨＬＡクラス■βタンパク賞（例え
ば、ＤＲβ）をコードする４個のＤＮＡ配列を検出する
のに用いることができる。
簡単にいえば、ＩＤＤＨに関する４種のＤＮＡ配列は、 （１）　　　５　　’　−ＧＡＧＣＴＧＣＧＴＡＡＧＴ
ＣＴＧＡＧ−３’（２）　　　５　　’　−ＧＡＧＧＡ
ＧＴＴＣＣＴＧＣＧＣＴＴＣ−３’（ａ）　　５　’　
−ＣＣＴＧＴＣＧＣＣＧＡＧＴＣＣＴＧＧ−３’および
（４”）　　　５　’　−ＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧ
ＡＣＧＡＧＡＧＡ−３’またはそれらに相補的なりＮＡ
鎖からなる群から選択される。これらの配列の１種又は
複数種にハイブリッド形成する配列特異的プローブを調
製することができる。
各種感染生疾患は、臨床試料中に起因微生物に特徴的な
特定のＤＮＡ配列が存在することによって診断すること
ができる。これら起因微生物には、サルモネラ、クラミ
ジア、ネイセリアのような細菌、肝炎ウィルスのような
ウィルスおよびマラリアの原因となるプラスモジウムの
ような寄生虫がある。ファルコウ（Ｆａｌｋｏｗ）らに
発行された１９８６年５月１３日付は米国特許再審査証
明書筒８１４．３５８．５３５号は、感染性疾患の診断
への特異的ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブの使
用を記載している。
比較的少数の病原生物が、感染した患者からのｂｔ床試
料中に存在するので、これらから抽出されるＤＮＡは試
料中の総ＤＮＡの極めて小さな分画だけを構成すること
がある。ＤＮＡ試料の固定の前に、推定される配列を特
異的に増幅し、ハイブリダイゼーション検出することに
よって、従来の方法の感度および特異性を著しく向上す
ることができる。
ワード（Ｗａｒｄ）の欧州特許第６３，８７９号明細書
に記載されているように、非放射性標識されたプローブ
を用いることができれば、感染性疾患の診断のためのＤ
ＮＡプローブの日常的臨床使用はかなり簡略化されるで
あろう、この方法では、ビオチン含有ＤＮＡプローブを
、アビジンまたはビオチン特異的抗体に結合した発色性
酵素によって検出する。この型の検出法は好都合である
が、感受性が比較的低い０本発明の方法による特異的Ｄ
ＮＡ増幅と安定に標識されたプローブの使用の組み合わ
せによって、ファルコウ（Ｐａｌｋｏｗ）とワード（Ｗ
ａｒｄ）の方法を日常の臨床検査に有用にするのに要す
る便宜と感度が得られる。
ＡＩＤＳウィルスの検出と監視に対するこの増幅技術の
具体的な使用を以下に説明する。プライマーとプローブ
であって、それぞれＡＩＤＳウィルスの°核酸中に実質
的に保存されておりＡ　ＩＯＳウィルス中の核酸に特異
的な核酸配列を増幅し検出するように設計されているも
のを、増幅および検出法に用いる。したがって、検出さ
れる配列はＡＩＤＳウィルス中の核酸に十分に相補的で
あり、酵素およびヌクレオチドトリホスフェートの存在
で、好ましくは室温で重合を開始するものでなければな
らない。
また、このプローブは、ビオチンが、式％式％ （式中、ＹはＯ，ＮＨまたはＮ−ＣＨｏであり、Ｘは１
〜４の数であり、ｙは２〜４の数である）を有するスペ
ーサー・アームに結合しているビオチン化したプローブ
である。このスペーサー・アームはまた、式 のプソラシン残基に結合している。このプソラシン残基
は、コーラジーテベ（ｃｏｕｒａｇｅ−Ｔｅｂｂｅ）　
ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ａｃ核酸、　、
６９７巻、１９８２年、１〜５頁に記載のように、「ギ
ャップド・サークル（ｇａｐｐｅｄ　ｃｉｒｃｌｅ）　
Ｊプローブ中にインターカレーションして、架橋してお
り、ギャップド・サークルの一末鎖ハイプリダイゼーシ
ョン領域はプライマー中に含まれる領域に及んでいる。
ビオチン化とドツト・プロット法の詳細については、１
９８６年４月１５日発行の米国特許第４．５８２．７８
９号明細書および１９８６年１０月１４日発行の米国特
許第４，６１７．２６１号明細書に更に完全に記載され
ている。
この増幅法を利用して、単一コピーヒト遺伝子からＤＮ
Ａを十分な量で産生させ、単純な非特異的ＤＮＡ染色剤
例えば臭化エチジウムをＤＮＡの検出に直接に用いられ
る様にできる。
生物のゲノムにおける感染性疾患及び病理学的異常の検
出に加えて、病的状態を伴わないＤＮＡ多形を検出する
のに用いることもできる。
要約すれば、増幅法は連鎖反応と熱安定酵素を用いる１
種以上の特定の核酸配列を増幅する方法を提供するもの
であり、上記反応においてプライマー伸長生成物を産生
させ、これを次にその後のプライマー伸長反応の鋳型と
して働くことができるようにする。この方法は、最初は
極めて少量でのみ存在する核酸配列を検出するのに特に
有用である。
以下の実施例は、単に例示のために提供するものであり
、発明の範囲および特許請求の範囲を限定することを意
図するものではない。これらの実施例において、総ての
パーセンテージは、特に断らないかぎり、固体の場合に
は重量％、液体の場合には容積％であり、総ての温度は
摂氏で表わしている。
肛 ■、プライマーの合成 次の２種類のプライマーを下記の方法により調製した。
これらのプライマーはいずれも２０−マーであり、ゲノ
ムＤＮＡの相対する鎖に、１１０塩基対の間隔をおいて
それらの５′端にアニールする。
Ａ、自動化された合成法 Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ　　（ＴｅＬ
ｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ　（１９８１）２２　
：　１８５９−１８６２）の方法に従って合成されたジ
エチルホスホラミダイトを、ヌクレオチドで誘導体化さ
れた制御された孔サイズのガラス支持体上に逐次縮合さ
せた。この方法は、ジクロロメタン中トリクロロ酢酸に
よる脱トリチル化、活性化プロトン供与体としてベンゾ
トリアゾールを使用する縮合、並びにテトラヒドロフラ
ン及びピリジン中無水酢酸及びジメチルアミノピリジン
によるキャッピングを含む。サイクル時間は約３０分間
であった。各段階での収率は本質的に定量的であり、そ
して脱トリチル化中に放出されるジメトキシトリチルア
ルコールの回収及び分光分析により決定した。
Ｂ、オリゴデオキシリボヌクレオチドの脱保護及び精製 固体支持体をカラムから取り出し、そして密閉チューブ
中で室温にて４時間、１艷の濃水酸化アンモニウムに暴
露した。次に、支持体を濾過によって除去し、そして部
分的に保護されたオリゴデオキシヌクレオチドを含有す
る溶液を５時間５５℃とした。アンモニアを除去し、そ
して残渣を分取用ポリアクリルアミドゲルに通用した。
３０Ｖ／ａｌｌにて９０分間電子泳動を行い、次に生成
物を含有するバンドを、蛍光プレートのＵＶシャドーに
より同定した。バンドを切り出し、そして１１Ｒ１の蒸
留水により４℃にて一夜溶出した。この溶液をＲＰ　−
ＨＰＬＣカラムに適用し、そして１％酢酸アンモニウム
緩衝液（ｐＨ６，０）中アセトニトリル７〜１３％のグ
ラジェントにより溶出した。この溶出を２６０ｎｍでの
ＵＶ吸収によりモニターし、そして適当な両分を集め、
一定容量中でのＵＶ吸収により定量し、そして真空遠心
機中で室温にて蒸発乾固した。
Ｃ，オリゴデオキシヌクレオチドの特徴付は精製された
オリゴヌクレオチドの試験アリコートをポリヌクレオチ
ドキナーゼ及びＴノ”Ｐ−ＡＴＰにより″′Ｐ−ラベル
した。ラベルされた化合物を、５Ｑｖ／ａｎにて４５分
間の電気泳動の後、１４−２０％ポリアクリルアミドゲ
ルのオートラジオグラフィーにより試験した。この方法
により分子量が確認される。塩基組成を、ヘビ毒ジェス
テラーゼ及び細菌アルカリ性ホスファターゼによるオリ
ゴデオキシヌクレオチドのヌクレオシドへの消化、並び
にこれに続＜、逆相ＨＰＬＣカラム及び１０％アセトニ
トリル＋１％酢酸アンモニウム移動相を用いる該ヌクレ
オシドの分離・定量により決定した。
■、セルラインからのヒトゲノムＤＮＡの単離高分子量
ゲノムＤＡＮを、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、前掲、Ｐ２Ｓ５
−２８１に本質的に従って、ヒユーマン・ゼネティック
・ミュータント・セル・デボジトリ−、カムテン、ＮＪ
から１Ｊ２２１９ｃとして入手可能な、正常β−グロビ
ンについてホモ接合性のＴ＠胞系から単離した。
■、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ主阻Ｉ±
匹（転）−からのポリメラーゼの精製 アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション、１
２３０１パークラウンドライブ、ロックビル、ＭＤから
ＡＴＣＣ患２５．１０４としてなんら制御なく入手でき
るテルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ…ｕａｔｉ
ｃｕｓ）　ＹＴＩ株をフラスコ中で、下記の培地テ増殖
せしめた。
クエン酸ナトリウム　　　　　　　１ｗＭリン酸カリウ
ムｐＨ７，９５ａ＋Ｍ 塩化アンモニウム　　　　　　　１０ｍＭ硫酸マグネシ
ウム　　　　　　　０．２ｍＭ塩化カルシウム　　　　
　　　０．Ｉｎ＋Ｍ塩化ナトリウム　　　　　　　　　
Ｉｇ／ｌ酵母エキス　　　　　　　　　　Ｉｇ／ｌトリ
プトン　　　　　　　　　　　Ｉｇ／ｌグルコース　　
　　　　　　　　２ｇ／ｌ硫酸第一鉄　　　　　　　　
　０．０１ｍＭ（オートクレーブ前にｐ）Ｉを８．０に
調整）上記培地中で７０℃にて一夜培養したフラスコ種
母を１０！発酵槽に接種した。種母フラスコがらの合計
６００−の種母を１０１の同じ培地に接種した。ｐＨを
水酸化アンモニウムにより８，０に澗節し、溶存酸素を
４０％に調節し、温度を７０’Ｃに調節し、そして攪拌
速度を４００ｒｐｍとした。
細胞の増殖の後、最初の５段階についてばＫａｌｅｄｉ
ｎ等、前掲、の方法（わずかに変更を加えて）を用い、
そして第６段階では異る方法を用いて精製を行った６６
段階すべてを４℃にて行った。
カラムでの分画速度は０．５力ラム／時とし、溶出中の
グラジェントの容量は１０カラム容量とした。
これに代る好ましい方法を例６に後記する。
要約すれば、上記培養のＴ、アクアチフス（Ｌ　赳胆旦
剋■　細胞を、９時間の培養の後、後期対数期１．４ｇ
乾燥重量／ｌの細胞濃度において、遠心分離により集菌
した。２０ｇの細胞を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（
ｐＨ７，５）及びＯｌｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む緩衝液
８〇−中の懸濁した。細胞を溶解し、そして溶解物を４
℃のローター中で３５．　ＯＯＯｒｐｍにて２時間遠心
した。上清を集め（画分Ａ）、そして硫酸アンモニウム
の４５〜７５飽和の間で沈澱する蛋白質画分を集め、０
．２Ｍリン酸カリウム（ｐ）１６．５）、１０ｍＭ２−
メルカプトエタノール及び５％グリセリンを含有する緩
衝液中に溶解し、そして最後に同じ緩衝液に対して透析
して画分Ｂを得た。
画分Ｂを、上記の緩衝液で平衡化されたＤＥＡＥ　−セ
ルロースの２．２Ｘ３０ｃｍカラムに適用したい次に、
このカラムを同じ緩衝液で洗浄し、そして蛋白質を含有
する画分（２８０ｎｍにおける吸収により決定する）を
集めた。−緒にしだ蓋白質画分を、０．０１Ｍリン酸カ
リウム　（ｐＨ７，５）　、１０ＩＩＩＭ２−メルカプ
トエタノール及び５％グリセリンを含有する第二緩衝液
に対して透析して画分Ｃを得た。
百分Ｃを、第二緩衝液で平衡化されたヒドロキシアパタ
イトの２．６Ｘ２１ｃｍカラムに適用した。
次に、このカラムを洗浄し、そして１０ｍＭ２−メルカ
プトエタノール及び５％グリセリンを含有する０、０１
〜０．５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７，５）緩衝液の直線
グラジェントにより酵素を溶出した。ＤＮＡポリメラー
ゼ活性を含有する両分（９０〜１８０ｍＭリン酸カリウ
ム）を集め、アミコン攪拌セル及びｎ＋１０Ｊｌ！を用
いて４倍に濃縮し、そして第二緩衝液に対して透析して
画分りを得た。
画分りを、第二緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロー
スの１．６Ｘ２Ｂｃｍカラムに適用した。このカラムを
洗浄し、そして第二緩衝液中０．０１〜０．５Ｍリン酸
カリウムの直線グラジェントによりＤＮＡポリメラーゼ
を溶出した０画分をエンドヌクレアーゼ及びエキソヌク
レアーゼの汚染について測定したにれは、過剰のＤＮＡ
ポリメラーゼと共にインキュベートした後のファージλ
ＤＮＡ又はスーパーコイルプラスミドＤＮＡの分子量の
変化を電気泳動により検出することにより　（エンドヌ
クレアーゼについて）、そしてＤＮＡを幾つかのフラグ
メントに開裂せしめる制限酵素による処理の後に（エキ
ソヌクレアーゼについて）行った。最少のヌクレアーゼ
汚染を有するＤＮＡポリメラーゼ画分（６５〜９５Ｉｎ
Ｍリン酸カリウム）のみをプールした。このプールにオ
ートクレーブしたゼラチンを２５０ｎ／−の量で添加し
、そして第二緩衝液に対して透析を行って画分Ｅを得た
。
画分Ｅをホスホグルコースカラムに適用し、そして２０
１ＩＩＭリン酸カリウム（ｐＨ７，５）中０．０１〜０
、４　Ｍ　ＫＣｌのグラジェント１００−により溶出し
た。
両分を上記のようにしてエンドヌクレアーゼ／エキソヌ
クレアーゼの汚染について、そしてさらにポリメラーゼ
活性について（Ｋａｌｅｄｉｎ等の方法により）測定し
た。プールした両分を第二踵衝液に対して透析し、次に
５０％グリセリン及び第二緩衝液に対する透析により濃
縮した。
ポリメラーゼの分子量を５ＯＳ−ＰＡＧＥにより決定し
た。マーカー蛋白質はホスフェ−トＢ　（９２，０００
）、ウシ血清アルブミン（６６，２００）、オバルブミ
ン（４５，０００）、カーボニックアンヒドラーゼ（ａ
１，０００）、大豆トリプシンインヒビター（２１，５
００）、及びリゾチーム（１４，４００）であった。
予備的データは、文献（例えばＫａｌｅｄｉｎ等）に報
告されている６２，０００〜６３，０００ドルトンでは
なく、約８６，０００〜９０．０００ドルトンであった
。
このポリメラーゼを、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　
　（ｐＨ６，４及びｐＨ８，０）　、Ｏ，ＬＭ　Ｋ側、
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ！、ｚ　、１ｍＦＩ２−メルカプト
エタノール、１０ｎｍｏｌｅずつのｄＧＴＰ　。
ｄＡＴＰ及びＴＴＰ　、及び０．５μＣｉ（’Ｈ）ｄＣ
ＴＰ、　８　ｎの“活性化されたウシ”胸腺ＤＮＡ並び
に０．５−５ユニツトのポリメラーゼを含有する混合物
５ＯＪｄ中でインキュベートした。“活性化された”Ｄ
ＮＡは、ＤＮＡの５％が酸−溶解性画分に移るまでＤＮ
ａｓｅ　Ｉにより消化して部分加水分解した後のＤＮＡ
の天然調製物である。この反応は７０℃にて３０分間行
い、そして０．１２５Ｍ　ＥＤＴＡ−Ｎａｚを含有する
リン酸ナトリウムの飽和水溶成約５０ｍの添加により停
止せしめた。サンプルをＫａｌｅｄｉｎ等、前掲に記載
されているようにして処理しそして活性を測定した。
この結果は、ポリメラーゼはｐＨ６，４においてｐＨ８
，０における活性の半分より活性であることを示した。
これに対して、Ｋａｌｅｄｉｎ等は、酸素はｐＨ約７、
０において、ｐＨ８，３における活性の８％を有するこ
とを見出した。従って、本発明の熱安定酵素のｐＨプロ
フィールはＫａｌｅｄｉｎ等の酵素のそれよりも広い。
最後に、ＤＮＡポリメラーゼ測定反応混合物から１種類
のみ又は複数種類のヌクレオチドトリホスフェートを除
去した場合、本発明の酵素を用いて活性がほとんど観察
されず、活性は予想値と一致しており、そして酵素は高
い忠実性を示した。
これに対して、Ｋａｌｅｄｉｎ等、前掲、を用いて観察
さた活性は予想値と一致しておらず、そしてヌクレオチ
ドトリホスフェートの間違った導入が示唆される。
■、増幅反応 上記のｌｕのゲノムＤＮＡを、２５＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ−
）１（Ｊ（ｐ）１８．０）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、　１０
ｎ＋Ｍ門ｇ（／！□、５ＩＩＩＭジチオスレイトール、
２００１ｔｇ／ｄゼラチン、１オのプライマーＰＣＯ２
，１戸のプライマーＰＣＯ４，１，５ｍＭｄＡＴＰ、　
１．５ｍＭ　ｄｃＴＰ　、１．５ｍＭ　ｄＧＴＰ及び１
．５ｍＭＴＴＰを含有する１００１１Ｉの初期水性反応
容量中に稀釈した。サンプルを９８°Ｃにて１０分間加
熱してゲノムＤＮＡを変性せしめ、次に室温に冷却した
。
テルムス・アクアチクスからのポリメラーゼ４Ｉを反応
混合物に加え、そしてＬｏｏｊｌｌの鉱油を重層した。
次にサンプルを、溶体を供給するためにプログラムされ
たピペット及び変温のための温度調節装置を用いる上記
の液体取扱い及び加熱装置のアルミニウム加熱ブロック
に入れた。
ＤＮＡサンプルを、次のプログラムサイクルを反復して
２０サイクルの増幅にかけた。
１）加熱ブロック中で２．５分間にわたり３７℃から９
８℃に加熱し；そして ２）３分間にわたって９８℃から３７℃に冷却してプラ
イマーとＤ　Ｎ　Ａとのアニールを可能にする。
最終サイクルの後、サンプルをさらに１０分間５５℃で
インキュベートして最終伸長反応を完了する。
■、オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブの合成及
びリン酸化 次の配列： を有しＲ３２４と称するラベルされたＤＮＡＮロブフを
調製した。配列中、＊はラベルを示す。このプローブは
４０塩基の長さを有し、遺伝子の第４コドンから第７コ
ドンまでを含み、そして正常βグロビン対立遺伝子（β
Ａ）を相補的である。プライマーとプローブとの関係を
次に模式的に示す。
このプローブを例１．工、に記載した方法に従って合成
したａ　２０ｐｍｏｌｅのプローブを４ユニツトのＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼおよび約４０ｐｍｏｌｅのＴ
ノ”Ｐ−ＡＴＰ　（約７０００Ｃｉ　／　ｍｍｏ　ｌｅ
）と、７０ｍＭＴｒｉｓ　（ｐＨ７，６）　、１０ｍＭ
　Ｍｇ（Ｊ　ｚ　、１．５ｍＭスペルミン及び１０ｍＭ
ジチオスレイトールを含有する４０１の反応容量中で３
７℃にて６０分間接触せしめた。次に２５ｍＭ　ＥＤＴ
Ａにより全容量を１００ＩＪ１に調製し、そしてＴｒｉ
ｓ　−ＥＤＴＡ　（ＴＥ）　１１衝液（１０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ、０、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　５ｐＨ８，０）により
平衡化したｌ　ｍｌスピン透析カラム上で、Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ等、前掲、ｐ４６６４６７の方法に従って精製し
た。反応生成物のＴＣＡ沈澱は、Ｒ５２４について比活
性が４．３　ｕ　Ｃｉ／ｐｍｏｌｅであり、そして最終
濃度が０．１１８ｐｍｏｌｅ／　ｌであることを示した
。
■、ドツトプロットハイブリダイゼーション前記■、か
らの増幅されたサンプル４ｐ！、並びに７０　、７５　
、８０　、８５　、９０　、９５及び１００％の増幅効
率を代表するように計算されたβ−グロビンプラスミド
ＤＮＡの適当な稀釈物５，６Ｉを２００　ｉｌｌの０．
４ＮＮａＯＨ及び２５ｍＭ　ＥＤＴＡ　Ｔ：ｍ釈し、そ
してナイロンフィルター上にスポットした。これは、フ
ィルターを水で湿し、これを、フィルターを定位置に保
持するドツトブロック調製用装置中に入れ、サンプルを
適用し、そしてＲｅｅｄ及びＭａｎｎ、　Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、　１３．７２０２　
７２２Ｈ１９８５）により開示されているようにして、
Ｑ、　ｌ　ｍｌの２０ｘｓｓｐＥ　（ａ，６ＭＮａＣｌ
　％　　２００ＴＩＩＭ　Ｎａ）ＩｚＰＯ４，２０＋ｎ
Ｍ　ＥＤＴＡ）により各ウェルをすすいだ。次に、フィ
ルターを取り出し、２ＯＸ　５ＳＰＥ中で洗浄し、そし
て真空オープン中で８０℃にて３０分間加熱した。
加熱の後、各フィルターを、３ＸＳＳＰＥ、５×デンハ
ート溶液（Ｉ　Ｘ　＝０．０２％ポリビニルピロリドン
、０．０２％フィコール、０．０２％ウシ血清アルブミ
ン、０．２ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ
　、　ｐＨ８，０）、０．５％ＳＯ８及び３０％ホルム
アミドから成るハイブリダイゼーション溶液１６ｍと接
触せしめ、そして４２℃にて２時間インキュベートした
。次に、２ｐ１１ｏｌｅのプローブ１ｌｓ２４をハイブ
リダイゼーション溶液に加え、そしてフィルターを４２
℃にて２分間インキュベートした。
最後に、ハイブリダイズした各フィルターを１００＋ｄ
の２　Ｘ５ＳＰＥ及び０．１％ＳＤＳで２回室温にて１
０分間洗浄した。次に、フィルターを１００−の２　Ｘ
５ＳＰＥ、０．１％ＳＯＳで、６０℃にて１０分間処理
した。
次に、各フィルターをオートラジオグラフ処理した。シ
グナルは２時間後に容易に出現した６■、オートラジオ
グラムの検討 ２時間後にドツトプロットのオートラジオグラムを分析
して、そしてＨａｅｍ／□Ｉ−消化ｐＢＲ：β＾により
調製された標準逐次稀釈β−グロビン調製物と、強度に
ついて比較した。βＡは、５ａｉｋｉ等５ｃｉｅｎｃｅ
　％前掲、において記載されている野性型対立遺伝子で
ある。反応生成物の分析により、全体の増幅効率は約９
５％であることが示され、これはβ−グロビン標的配列
の６３０，０００倍の増加に相当する。
１６増幅反応 例１に記載したようにしてＭｏ１ｔ４セルラインから抽
出されたゲノムＤＮＡの１鱈のサンプル２個をそれぞれ
、５０ｍＭ　　ＫＣｌ、２５ｍＭ　Ｔｒ’＋５−ＨＣｌ
２　（ｐ）１８．０）、１０ｍＭ　ＭｇＣｊｌ！　ｚ　
、１　ｔｉ？’＋のプライマーＰＣＯ３，１−のプライ
マーＰＣＯ４，２００鱈／−のゼラチン、１０％ジメチ
ルスルホキシド、並びに１．５１ずつのｄＡＴＰ　。
ｄＣＴＰ　、　ｄＧＴＰ及びＴＴＰを含有する１００Ｉ
ＪＩの反応容量中に稀釈した。この混合物を９８°Ｃで
１０分間加熱してゲノムＤＮＡを変性した後、サンプル
を室温に冷却し、そして例１に記載したテルムス・アク
アチクスからのポリメラーゼ４　ｐｌを各サンプルに加
えた。サンプルに鉱油を重層して凝縮及び蒸発ロスを防
止した。
サンプルの１つを例１に記載した機械の加熱ブロックに
入れ、そして次のプログラムサイクルを反復して２５サ
イクルの増刷にかけた。
（１）２．５分間にわたり３７℃から９３℃に加熱し： （２）３分間にわたって９３℃から３７℃に冷却するこ
とによりプライマー及びＤＮＡをアニルせしめ；そして （ａ）３７℃に２分間保持した。
最終サイクルの後、サンプルを６０℃にてさらに１０分
間インキュベートして最終伸長反応を完結した。
第二サンプルを温度サイクル（加熱及び冷却）機の熱伝
導コンテナーに入れた。この機械においては、熱伝導コ
ンテナーに温度を上方又は下方に調節するベルティール
ヒートポンプ並びに増幅サイクル、温度レベル、温度勾
配及び温度のタイミングを自動的にコントロールするマ
イクロプロセッサ−に取り付けられる。
第二サンプルを、次のプログラムサイクルを反復する２
５サイクルの増幅に付した。
（１）３分間にわたり３７℃から９５℃に加熱し； （２）９５℃に０．５分間保持して変性を生じさせ； （ａ）１分間にわたり９５℃から３７℃に冷却し；そし
て （４）３７℃にて１分間保持する。
■、アッセイ 分析、すなわちドツトプロット分析及びアガロース分析
のために２つの試験を行った。
ドツトプロット分析のためには、次の配列：５′−“Ｃ
ＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣ−３’　（ＲＳ
１８）のラベルされたＤＮＡブローフ゛を８周製した。
この配列中＊はラベルを示す。このプローブは１９塩基
の長さを有し、遺伝子の第４〜第７コドンを含み、そし
て正常β−グロビン対立遺伝子（βＡ）に相補的である
。プライマー及びプローブの概略の関係を次に示す。
以下余白 このプローブを、例１．１．に記載した方法により合成
した。１０ｐ蒙ｏｌｅのプローブを４ユニツトＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ及び約４０ｐｍｏｌｅのＴノ”Ｐ
−ＡＴＰ　（約７０００Ｃｉ　／　ｒａｒａｏ　ｌ　ｅ
）と、７０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　　（ｐＨ７，６）
　、１０ｍＭ　Ｍｇ（４２，１，Ｆ＋＋Ｍスペルミン及
び１０１ジチオスレイトールを含む４０Ｊｌｌの反応容
量中で３７℃にて６０分間接触せしめた。
次に２５ｍＭ　ＥＤＴＡにより全容量を１００Ｊに調整
し、そしてＴｒｉｓ　−ＥＤＴＡ　（ＴＥ）緩衝液（１
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ’　。
０、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐＨ８，０）で平衡化さ
れたｌ　ｍｌスピン透析カラム上でＭａｎｉａｔｉｓ等
、前掲、ｐイ６６−４６７の方法に従って精製した。反
応生成物のＴＣＡ沈澱は、Ｒ５１Ｂについては比活性が
４．６　ｐ　Ｃｉ　／　ｐｍｏｌｅでありそして最Ｐ、
濃度が０．１１４ｐｍｏｌｅ／μ！であることを示した
。
前記１．からの増幅されたサンプル５μ！、及び熱安定
酵素の代りにＥ、コリＤＮＡポリメラーゼ■のＫｌｅｎ
ｏｗ断片を用いたほか前記の方法と同様にして増幅した
サンプル５Ｉを、１９５Ｉの０．４ＮＮａｉｌ（，２５
ｖＭ　ＥＤＴＡにより稀釈し、そして２枚のナイロンフ
ィルターにスポットした。この場合、まずフィルターを
水で湿し、フィルターを適切な場所に保持するトンドブ
ロット調製用装置に入れ、サンプルを通用し、そしてＲ
ｅｅｄ及びＭａｎｎ、前掲、により開示されている様に
して０．４　ａｄの２０　Ｘ　ＳＳＰ［！（ａ，６Ｍ　
　ＮａｆＪ、２００核酸ＭＮａＨｔＰＯ＊、２０ａ＋Ｍ
　ＥＤＴＡ）で各ウェルをすすいだ６次に、フィルター
を取り出し、そして真空オーブン中で８０℃にて３０分
間加熱した。
加熱の後、各フィルターを、５　Ｘ５ＳＰＥ、５×デン
ハート溶液（１ｘ　＝０．０２％ポリビニルピロリドン
、０．０２％フィコール、０．０２％ウシ血清アルブミ
ン、０．２ｙｎＭ　Ｔｒｉｓ　、０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ
　、　ｐＨ８，０）及び０．５％ＳＤＳから成るハイブ
リダイゼーション溶液６−と接触せしめ、そして５５℃
にて６０分間インキュベートした０次に、５ｕ１のプロ
ーブＲ３１８をハイブリダイゼーション溶液に加え、そ
してフィルターを５５℃にて６０分間インキュベートし
た。
最後に、ハイブリダイズした各フィルターを１００ｄの
２ＸＳＳＰＥ及び０．１％ＳＯＳで２回室温にて１０分
間洗浄した０次に、フィルターをさらに２回（１回は１
分間、２回目は３分間）１００Ｍ１の５×５ＳＰＥ、、
０．１％ＳＤＳにより処理した。
次に、各フィルターをオートラジオグラフ処理し、シグ
ナルは９０分間後に容易に現われた。
アガロースゲル分析において、５ｔＩＩずつの増幅反応
混合物を、Ｉ　ＸＴＢＥ　７１衝液（０，０８９Ｍ　Ｔ
ｒｉｓ、０．０８９Ｍ？１ｌｌｌ！酸及び２　ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ）中４％ＮｕＳｉｅｖｅ１０、５％アガロースゲ
ルに負荷し、そして１００Ｖにて６０分間電気泳動した
。臭化エチジウムで染色した後、ＤＮＡをＵＶ蛍先によ
り可視化した。
この結果は、例１において使用した機械及びこの例がＤ
ＮＡの増幅において同様に効果的であることを示し、目
的の配列に対応する同様の強度の別個の高強度１１０塩
基対、並びに非常に低強度の少数の他の別個のバンドを
示した。これに対して、Ｅ、コリーポリメラーゼＩのフ
レノウフラグメントを用いて各サイクルの後に試薬を移
送する増幅方法は、多くの無関係のＤＮＡ配列の非特異
的増幅から生ずるＤＮＡのよごろ（ｓｅｅｒ）をもたら
した。
ＦＩＬＡ−ＤＱ　、　ＤＩ？及びＤＰ病変の評価におい
て、増幅及び検出の同様の改良が達成されることが期待
される。
上記の実験において、増幅反応緩衝液が１０＋ａＭＭｇ
Ｃｊ！　ｘではなく　２ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、及び１．
５ｍＭずつではなく１５０〜２００声ずつの各ヌクレオ
チドを含有する場合、並びに増幅の間３７℃の低温を４
５℃〜５８℃に上げた場合、増幅の一層良好な特異性及
び効率が得られる。さらに、ＤＭＳＯは増幅のために必
要でないか、又は好ましくないことが見出された。
■１ ヒトβ−グロビン遺伝子上の１１９塩基対断片の増幅の
ため、Ｍｏ１ｔ４セルラインから又はＧＭ２０６４Ｍｏ
１ｔ４セルラインδ−ヒモグロビン領域のホモ接合性欠
失を代表し、そしてヒト・ケノミック・ミュータント・
セル・デボンジトリー、カムテン、ＮＪから得られる）
を、５０ｍＭ　ＭＣＩ　、　２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｊ！　　（ｐＨ８）　、１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、２００
バ／−ゼラチン、５−Ｍ２−メルカプトエタノール、１
．５１ＭずつのｄＡＴＰ　、　ｄＣＴＰ　、　ＴＴＰ及
びｄＧＴＰ、並びに１戸ずつの次のプライマｍ： ５　’　−ＣＴＴＣＴＧｃａｇＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣ
ＡＣＴＡＧＣ−３’　（ＧＨｌＢ）５　’　−ＣＡＣａ
ＡｇＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ−３’　　　
（Ｇ）１１９）を含有する１００Ｊ１１の反応容量中で
増幅した。上記プローブの配列中、小文字は制限酵素部
位を形成するための野性型配列からのミスマツチを示す
。
ＧＨｌＢは負鎖に対して相補的な２６−塩基のオリゴヌ
クレオチドであり、そして内部Ｐｓｔｒ部位を含有する
。Ｇｌｆ１９は、１鎖に対して相補的な２９−塩基オリ
ゴヌクレオチドであり、そして内部Ｈｉｎｄ■認識部位
を含有する。これらのプライマーは、ヱユロ及び１亘ｄ
ＩＩＩＩ制限部位に相同な遺伝子の領域をまずスクリー
ニングすることにより選択された。次に、例１に記載し
たようにしてプライマーを！Ｐｌ製した。
上記の反応混合物を９５℃にて１０分間加熱しそして次
に室温に冷却した１例１に記載したポリメラーゼ合計４
ｐ１を各反応混合物に加え、そして次に各混合物に鉱油
を重層した。この反応混合物を次のプログラムによる３
０サイクルの増幅に付した。
２分間にわたり３７℃から９８℃に加熱し；３０分間に
わたり９８℃から３７℃に冷却し；そして ３７℃に２分間浸漬する。
最終サイクルの後、反応混合物を６５℃にて２０分間イ
ンキュベートして最終伸長を完結した。
クロロホルムにより鉱油を抽出し、そして混合物を一２
０゛Ｃに貯蔵した。
合計１０μｌの増幅生成物を、一般に人手可能なＭ１３
ｍｐｌＯクローニングベクター０．５ｎと共に、５０ｍ
１Ｉ　Ｎａｃｅ　、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１１！
　　（ｐＨ７，８）　、１０ｍＭＭｇＣ４□、２０ユニ
ツトのＰｓｔＩ及び２６ユニツトのＨｉｎｄＩ［Ｉを含
有する５０ｍの容量中で３７℃にて９０分間消化した。
−２０℃に凍結することにより反応を停止した。ＴＥｉ
衝液により容量を１１０１ｔ！に調整し、そして１００
Ｉを１ａ／のビオゲルＰ−４スピン透析カラムに負荷し
た。１個の０．１ａ／画分を集め、そしてエタノール沈
澱せしめた。
（この時点において、ＧＭ２０６４サンプル中にβ−グ
ロビン増幅生成物が存在することが見出された。
次の実験は、プライマーＧ）１１８又はＧＨ１９への汚
染源を追跡した。他のプライマー源が得られなかったの
で、若干のクローン化配列がプライマー中の汚染ＤＮＡ
に由来するであろうと理解して実験を続けた。） エタノールペレットを１５ｔ１！の水に再懸濁し、次に
５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐｉ（７，８）　、
１０ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ　ｚ、０、５　ｍＭ　ＡＴＰ、１１
０１ＩＩジチオスレイトール及び４００ユニツトのりガ
ーゼを含有する２０Δ容量に調整した。〔１ユニツトは
、５′末端濃度０．１２ｍＭ　（約３００ｍ／ｉ））に
おいて２０４中で、１６℃にて３０分間に、Ｈｉｎｄ　
ｍで消化されたλＤＮＡの５０％の連結をもたらすのに
必要な酵素の量である。この混合物を１６℃にて３時間
インキュベートした。
Ｍｏ１ｔ　４　ＤＮＡを含有する１０ｄの連結反応混合
物を、−Ｍに入手可能なＥ、コリＪＭ１０３のコンピテ
ント細胞に形質転換した。形質転換された株を調製する
ための方法はＭｅｓｓｉｎｇ　Ｊ、　（１９８１）丁ｈ
５ｒｄＣ１ｅｖｅｌａｎｄ　Ｓ　ｍ　ｏｓｉｕｍ　ｏｎ
　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｓ：Ｒｅｃｏｍ−ｂｉｎ
ａｎｔ　ＤＮＡ　、　Ａ、Ｗａｌｔｏｎｌｉｉ、エルゼ
ビール、アムステルダム、　１４３−１６３に記載され
ている。合計６５１個の無色のプラーク（及び０個の青
色プラーク）が得られた。これらの内、１１９個（１８
％）は（＋）幀挿入部を有し、１９個（ａ％）は（−）
鎖挿入部を有していた。これば、Ｅ、コリーポリメラー
ゼＩのＨｅｎｏｗフラグメントを用いる増幅技法からの
プライマー−陽性プラーク中のβ−グロビン陽性プラー
クのパーセントのほとんど２０倍である。　Ｋｌｅｎｏ
ｗフラグメントを用いる方法においては、反応を２５℃
にて２分間行い、次に１００℃への加熱段階を２分間行
い、冷却し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントを添加し、そし
て反応を９回反復した。
これらの結果は、この発明の熱安定酵素を用いる増幅反
応の改良された特異性を確認している。
ＧＭ２０６４及び汚染されたプライマーを用いる後のク
ローニング実験においては、５１０個の無色プラーク中
４３個（ｅ％）が（＋）１！挿入部を有していた。これ
は、Ｍｏ１ｔ４からの１１９クローンの約半分が汚染配
列を含有することを示唆する。
Ｍｏ１ｔ４からの（＋）鎖クローンの１０個を配列決定
した。５個は正常な野性型配列であり、そして１個のＣ
からＴへの変異を遺伝子の第二コドンの第三位置に有し
ていた（ｃＡＣ→ＣＡＴ）。ＧＭ２０６４からの汚染ク
ローンの４個を配列決定し、４個すべてが正常であった
。
上記の技法を用いながら、制限部位変形プライマーを用
いてヒトＮ−ｒａｓ発癌遺伝子を増幅し、クローン化し
、そして部分的に配列決定し、及びＨＬＡＤＱ−α、Ｄ
Ｑ−β及びＤＲ−β遺伝子の塩基対セグメントをクロー
ン化するために使用することができる。
以下余白 、例」工 」七ｊジ復支襄 Ａ、Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子のためのＤＮＡ配列プロ
ーブの同定 Ｔａｑ　ｏｏｌ遺伝子のための特異的ＤＮＡ配列プロー
ブを、λｇｔｌ１発現ライブラリーの免疫的スクリユン
グにより得た。Ｔ、アクアチフスのＤＮＡを人旦Ｉによ
り完全消化し、ＥｃｏＲＩ　１２−マーリンカ−（ｃＣ
ＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧ　、ニューイングランドバイオラ
プス）に連結し、ＥｃｏＲＩで消化し、そして−Ｅ−ｃ
ｏＲＩ−消化され脱リン酸化されたλｇｔｌｌ　ＤＮＡ
（ブロゲマ・バイオチク）と連結した。連結されたＤＮ
Ａをパッケージしくジガパフクプラス、ストラテジーン
）、そしてＥ、コリに一１２株Ｙ１０９０（Ｒ，Ｙｏｕ
ｎｇより入手）にトランスフェクトした。
２Ｘ１０’プラークの最初のライブラリーを、精製され
たＴａｑポリメラーゼ（例１及び例６を参照のこと）に
対するラビットポリクローナル抗血清の１：２０００ｉ
釈物を用いてスクリーニングしたＣＹａｕｎｇ＋Ｒ，Ａ
、及びＲ，１１，Ｄａｖｉｓ（１９８３）　５ｃｉｅｎ
ｃｅ　。
２２２　ニア７Ｂ−７８２１、候補プラークを限界稀釈
で再プレートし、そして均一になるまで（約３サイクル
）再スクリーニングした。免疫前血清と反応せずそして
免疫血清と反応する候補プラークからファージを精製し
た。
候補ファージを用いてＥ、コリに一１２株Ｙ１０８９（
Ｒ，Ｙｏｕｎｇ）を溶原化した。溶原菌を、Ｔａｑポリ
メラーゼ抗血清と反応するＩＰＴＧ誘導性誘導性融合蛍
白−ガラクトシダーゼより大）の産生についてスクリー
ニングした。固相のサイズ分画された融合蛍白質を用い
て、全ポリクローナル抗体からエピトープ特異的抗体を
アフィニティー精製した（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、　Ｌ、
Ｓ、Ｂ、等（１９８６）Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　　
１０２　：２０７６−２０８７　）。
“つり上げられた”エピトープ−選択された抗体をウェ
スタン分析において用いて、Ｔａｑポリメラーゼに特異
的なりＮＡ配列をコードしているλｇｔｌｌファージ候
補を同定した。λｇｔ：１と称する１つのλｇｔｌｌフ
ァージ候補が、精製されたＴａｑポリメラーゼ及びＴａ
ｇポリメラーゼを含有する粗抽出画分の両者と特異的に
反応する抗体を、全ラビットポリクローナルＴａｑポリ
メラーゼ抗血清から特異的に選択した。このファージ／
？ｇｔ：】を使用してさらに検討した。
テルムス・アクアチクスＤＮＡの約１１５ｂｐの呈匹Ｒ
Ｉ〜適合人旦■断片をラベルしくＭａｎｉａｔｉｓ等、
前掲）で、Ｔａｑポリメラーゼ特異的プローブを形成し
た。このプローブをサザン分析において、及びＴ、アク
アチフスＤＮＡランダムゲノムライブラリーをスクリー
ニングするために用いた。
Ｂ、テルムス・アクアチクス−ランダムゲノムライブラ
リーの造成及びスクリーニング λフアージシャロン３５　（Ｗｉｌｈｅ１ｍｉｎｅ＋Ａ
、Ｍ、等、前掲）をその接着末端を介してアニールしそ
して連結し、旦憇旧により完全消化し、そしてアニルさ
れたアームをスタファ−（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメン
トから、酢酸カルシウム密度勾配超遠心（Ｍａｎｉ−ａ
ｔｉｓ等、前掲）により精製した。Ｔ、アクアチフスの
ＤＮＡをＳ　ａｕ３Ａで部分分解し、そして１５〜２゜
ｋｂサイズの両分をシェークロース密度勾配超遠心によ
り精製した。標的ＤＮＡフラグメント及びベクターＤＮ
Ａフラグメントを１＝１のモル比で連結することにより
ランダムゲノムライブラリーを造成した。ＤＮＡをパン
ケージし、そしてＥ、コリに一１２株ＬＥ３９２又はに
８０２にトランスフェクトした。９９％以上の組換体を
含有する２０　、０００以上の最初のファージのライブ
ラリーをＥ、コリに一１２株ＬＥ３９２上で増幅した。
λｇｔｔｔ：１の放射性ラベルされたＥｃｏＲＩ挿入部
によりＣ）１３５　Ｔａｑゲノムファージライブラリー
をスクリーニングした（マニアチス等、前掲）。特異的
にハイブリダイズする候補ファージプラークを精製し、
そしてさらに分析した。　ＣＨ３５二：４−２と称する
１つのファージが、ＨｉｎｄＩ［ｌによる消化の後に４
個以上のＴ、アクアチフスＤＮＡフラグメントを放出し
た（約８．０　、４．５　、０．８　、０．５８ｋｂ）
。
４種類のＨｉｎｄ　ｎｌＴ、アクアチフスＤＮＡフラグ
メントを、ＨｉｎｄＩ［［で消化したプラスミドＢＳＭ
１３”　　（ａ，２ｋｂ、ベクタークローニングシステ
ムス、サンジエゴ）に連結し、そしてそれぞれＥ。
コリに一１２株ＤＧ９８の形質転換にクローン化した。
Ｃ）１３５　：　：　４−２からの約８．０　ｋｂの且
１ｎｄＩ［ＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＦＣ８２
（１１、２ｋｂ）中にｊ！ｉ離し、他方ＣＨ３５：：４
−２からの４．５　ｋｂ且１ｎｄｌ’［ＤＮＡフラグメ
ントをプラスミドｐＦＣ８３（７，７ｋｂ）中に単離し
た。
ｐＦＣ８２を含有するＥ、コリＤＧ９８株は熱安定性高
温ＤＮＡポリメラーゼ活性を含有することが示された（
第１表）、さらに、この細胞は、免疫的にＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼと関連する新たな約６０ｋｄの分子量のポ
リペプチドを合成する。
８．０ｋｂＨｉｎｄ　ｍＤＮＡフラグメントの’７’ａ
ｑポリメラーゼコード領域をさらに、８．０ｋｄＨｉｎ
ｄ　ｍフラグメントの工旦−プロモーター近位２．８ｋ
ｂＨ１ｎｃｌ　１１−人証７１８部分に位置付けた。こ
の領域をサブクローニングしてプラスミドｐＦＣ８５（
６，０ｋｂ）を得た。ＩＰＴＧと共にインキュベートし
た後、プラスミドｐＦｃ８５を含有するＥ、コリＤＧ９
８Ｉ［１胞は、もとの親クローン（ｐＦＣ８２／　ＤＧ
９８）に比べて１００倍までの熱安定性７ａｑポリメラ
ーゼ関連活性を合成する（第１表）。ｐＦＣ８５を含有
する細胞は有意量の熱安定ＤＮＡポリメラーゼ活性を合
成するが、Ｔａｑ　Ｐ！！２ＬＤＭＡ配列の一部分のみ
が翻訳され、約６０ｋｄのＴａｑポリメラーゼ関連ポリ
ペプチドの蓄積が起こる。
星−上−ｌ Ｅ、コリ（＃）における熱安定ＤＮＡポリメラーゼ活性
の発現 ＢＳ門１３／ＤＧ９８−　　　　　　　−０．０２ｐＦ
Ｃ８２／ＤＧ９８　　　　　　２．２　　　２．７ｐＦ
ｃ８５／ＤＧ９８　　　　　　１１．９　　６４３．８
（＃）細胞は後期対数期まで増殖せしめ（＋／−ＩＰＴ
Ｇ　、　１０ｄ）　、集菌し、音波処理し、７５℃にて
２０分間加熱し、遠心し、そして透明な上清を７０℃に
てＤＮＡポリメラーゼ活性について測定した。
（本）１ユニット−３０分間に１　ｎＭ　ｄＣＴＰの導
入。
この発明の熱安定酵素の遺伝子は種々の細菌発現ベクタ
ー、例えばＤＧ１４１（ＡＴＣＣ３９５８８）及びｐＰ
Ｌ　Ｎ　ｍｕｓ　ＡＴＧ中で発現せしめることができる
。
これらの宿主ベクターの両者はｐＢｌ？３２２の誘導体
であって、トリプトファン・プロモーターオペレーター
及びＡＴＧ開始コドンと作用可能に連結されたりボゾー
ム結合部位（ＤＧ１４１）　、又はλＰｔプロモーター
を含む配列及びＡＴＧ開始コドンに作用可能に連結され
た遺伝子Ｎ結合部位（＋）ＰＬ　Ｎ　＊＊５ＡＴＧ）を
有する。これらの宿主ベクターのいずれか一方を５ａｃ
ｒにより制限酵素処理し、そしてＫｌｅｎｏｗ又はＳ１
ヌクレアーゼにより平滑末端化して、Ｔａｑポリメラー
ゼ遺伝子を後で挿入するための便利な部位を作ることが
できる。
次の様にして、プラスミドｐＦＣ８３及びρＦＣ８５に
サブクローニングされたＤＮＡ挿入フラグメントから完
全な長さのＴａｑポリメラーゼ遺伝子を造成した。ベク
ターＢＳＭ１３”　　（ベクタークローニングシステム
ス、サンジエゴ、ＣＡから市販されている）をユニーク
Ｈ４ｎｄ　ｍ部位において消化し、Ｋｌｅｎｏ−及びｄ
ＮＴＰにより修復し、そしてＴ４　ＤＮＡリガーゼを用
いてに■オクタヌクレオチドチドリフカ−５’−ＣＡＧ
ＡＴＣＴＧ−３’に連結し、そしてＥ、コリＤＧ９８株
に形質転換したａ　　Ａｓ＋ｐ”１旦２ヶ°形質転換体
からプラスミドを単離した。クローンの１つをＩＩＩ及
び人証７１８により消化し、そして大ベクターフラグメ
ントをゲル電気泳動により精製した。
次に、プラスミドｐＰｃ８３をＩＩＩ及びＨｉｎｄ　ｍ
で消化し、そして約７５０ｂｐのフラグメントを単離し
た。プラスミドｐＦＣ８５をＨ４ｎｄＩ［ｌ及び人旦７
１８で消化し、そして約２．８ｋｂのフラグメントを単
離し、そして３片連結によりｐＦＣ８３からの約７５０
ｂｐの旦ＬＬＩＩ−Ｈ側ｄＩ［！フラグメント及び８５
Ｍ１３°の且ｄＩＩ　−人亘１１８ベクターフラグメン
トと連結した。この連結混合物を用いてＥ、コリＤＧ９
８株（１９８４年７月１３日に寄託のＡＴＣＣ患３９．
７６８）を形質転換し、これからＡｍｐ”コロニーを選
択し、そして約６．７５ｋｂのプラスミド（ｐＬｓＧ＋
）を単離した。　ｐＬｓＧ＋を含存するイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）−誘導ＤＧ９８
細胞は、Ｔ、アクアチフスから単離された天然酵素とは
サイズを異にするＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを合成し
た０次に、プラスミドｐＬｓＧ１を用いて、ベクターク
ローニングシステムスにより推奨される方法に従って単
ｔｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ鋳型を形成することができる。
次に、オリゴヌクレオチド−指令変異誘発［Ｚｏｌ　Ｉ
ｅｒ及びＳ＋ｉｔｈ、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（
１９８２）１０：６４８７−６５００）を用いてＡＴＧ
開始コドンの部分として５堕Ｉ制限部位を導入すること
ができる（Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子のコード配列中の
内部Ｈｉｎｄ■部位の上流に）。同様にして、遺伝子の
カルボキシ末端の後（助７１８部位から約０．７ｋｂ上
流）にＢＰＩ１１部位を導入して発現ベクターへのＴａ
ｑポリメラーゼ遺伝子のサブクローニングを容易にする
ことができる０部位特定変異誘導を終った後、遺伝子を
ＢＳ）１１３”から約３．２ｋｂの盈此■−旦ｓｔＥ■
制限フラグメント上に単離し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメン
ト及び４種類すべてのｄＮＴＰにより処理し、そしてＴ
４ＤＮＡ　リガーゼを用いて（平滑末端条件）、あらか
じめ５ａｃｌで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ及びｄＮＴＰによ
り修復しそしてウシ腸ホスファターゼで処理して脱リン
酸化平滑末端を形成しておいた前記の発現ベクターに挿
入することができる。この連結混合物を用いてＥ、コリ
ＤＧ１１６を形質転換し、そして得られる形質転換体を
Ｔａｑポリメラーゼの産生についてスクリーニングする
。酵素の発現は、ウェスタンイムノプロット分析及び活
性分析により確認することができる。
プラスミドｐＦｃ８５の約２．８ｋｂの且釦ｄＩ［［−
人証７１８フラグメント中に含有されるＴａｑポリメラ
ーゼ遺伝子のより大きな部分を、例えばプラスミドｐＰ
Ｌ　Ｎ　ａｓｓ　ＡＴＧを用いて、Ｔａｑ　競り遺伝子
をコードするアミノ−末端Ｈ４ｎｄＩ［ｌ制限部位をＡ
ＴＧ開始コドンに連結することにより、発現せしめるこ
とができる。この融合体の発現生成物は約６６、０００
〜６８．０００ドルトンの端が切り取られたポリメラー
ゼをもたらす。
この特定の造成は、プラスミドｐＦＣ８５をＨｉｎｄ■
で消化し、そしてｄＡＴＰ　、　ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ
の存在下でＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理することに
より行うことができる。生じたフラグメントを８１ヌク
レアーゼでさらに処理することにより単鎖延長部を除去
し、そして生じたＤＮＡを１１１１８で消化し、そして
４種類すべてのｄＮＴＰの存在下でＫｌｅｎｏｗフラグ
メントにより処理する。回収された断片を、Ｔ４ＤＮＡ
　リガーゼを用いて、あらかじめ５ａｃｌにより消化し
そしてｄＧＴＰの存在下でＫｌｅｎｏｗフラグメントで
処理してＡＴＧ平滑末端を形成しておいた脱リン酸化プ
ラスミドＩ］Ｐｔ　Ｎ　＊＊ｓ八Ｔへに連結することが
できる。次に、この連結混合物を用いてＥ。
コリＤＧ１１６を形質転換し、そして形質転換体をＴａ
ｑポリメラーゼの産生についてスクリーニングする。や
はり、ウェスタンイムノプロット分析及び活性分析によ
り発現を確認することができる。
拠旦 ■ 熱安定性ポリメラーゼは、後に記載する例に従って、テ
ルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ１ｕ１ｕμ、４
ｓ）の培養物から直接精製することができ、あるいは粗
抽出物の調製において必要なわずかな変更を伴って、組
換生産された酵素を含有する細菌培養物から精製するこ
とができる。
遠心分離により集菌した後、６０ｇの細胞を５０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　　（ｐＨ８，１＞及び１　ｍＭ　
ＥＤＴＡを含有する緩衝液７５ｙ４中に懸濁した。細胞
をフレンチプレス中で１４，０００〜１６，０ＯＯＰＳ
Ｉにて溶菌し、この後４容積（ａ００−）の追加のＴｒ
ｉｓ　−ＥＤＴＡを加えた。緩衝液Ａ（β−メルカプト
エタノールを５ｎ＋Ｈに、そしてＮＰ　−４０及びトウ
ィーン２０をそれぞれ０．５ｖ／Ｖ％に）を添加し、そ
してこの溶液を冷却しながら十分に音波処理した。得ら
れる均質ｙＱ濁液を緩衝液Ａによりさらに稀釈して最終
容量が出発細胞重量の７．５〜８倍となるようにした。
これを画分Ｉと称する。
画分Ｉ及び上清画分中のポリメラーゼ活性を、０．０２
５Ｍ　ＴＡＰＳ−ＨＣｌ　（ｐＨ９，２、２０°Ｃ’）
　、０．００２ＭＭｇＣｌ　ｚ　、０．０５Ｍ　ＫＣＲ
１１ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭずつの
ｄＧＴＰ　、　ｄＡＴＰ　、　ＴＴＰ　　、　０．１　
ｍＦｄＣＴＰ　　ＣＣｒ　　”Ｐ　、　０．０５Ｃｉ／
＋＋ｃＭ）　、１２．５ｇ　”活性化された゛サケ精子
ＤＮＡ及び０．０１〜０．２ユニツトのポリメラーゼ（
１０ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＦＩＣｊ！　、　ｐＨ８，５０
ｎ？Ｋ（ｆ、１■／−のオートクレーブされたゼラチン
、０．５％ＮＰ　−４０，０，５％トウィーン２０及び
１ｍＭ　２−メルカプトエタノール中に稀釈）を含んで
成る５０ｍの混合物中で測定した。１ユニツトは３０分
間中１０ｎＦＩの生成物に相当する。°活性化された”
ＤＮＡは、ＤＮＡの５％が酸可溶性画分に変るまでＤＮ
ａｓｅ　Ｉにより部分加水分解された後のＤＮＡの天然
調製物である。反応を７４℃にて１０分間行い、そして
次に４０ｍを２ｍＭＥＤＴＡ中５０ｎ／ｍｌりキャリヤ
ーＤＮＡ溶液１．０ｍｆｆ１（０’ｃ）中に移した。同
容量（１，０Ｒ１）の２０％ＴＣＡ及び２％ビロリン酸
ナトリウムを加えた。０°Ｃにて１５〜２０分間の後、
サンプルをワットマンＧＦ／Ｃディスクを通して濾過し
、そして冷５％ＴＣＡ−１％ビロリン酸塩により十分に
洗浄し、次に冷９５％エタノールで洗浄し、そして乾燥
し、計数した。
画分■を、ベックマンＴｌ４５０−ター中で３５．００
０ｒｐｍにて２時間、２℃にて遠心し、そして集めた上
清を画分■とした。
活性の９０〜９５％を沈澱せしめるのに必要なポリミン
（Ｐｏｌ＋１ｉｎ）　Ｐの最少量（この量は一般に最終
容量の０．２５〜０．３％であることが見出された）を
決定した後、ボリミンＰ　（ＢＲＬ、ガイセルブルグ、
ＭＤ）（ＩＯＶ／Ｖ％、ｐＨ７，５に調整しそしてオー
トクレーブしたもの）によりＴａｑポリメラーゼ活性を
沈澱せしめた。
０℃にて１５分間にわたり攪拌しながら、適当なレベル
のボリミンＰを画分■に徐々に添加した。
この溶液を０℃にてベフクマンＪＡ１４０−ター中で２
０分間にわたり１３．００Ｏｒｐｍにて遠心した。上滑
の活性を測定し、そしてペレットを１１５容量の０．５
×緩衝液Ａ（水でＩ：２に稀釈したもの）に再懸濁した
。この懸濁液を再遠心分離し、そしてペレットを１／４
容量の緩衝液Ａ　（０，４Ｍ　ＫＣｊ！を含有）に再懸
濁した。この懸濁液を十分にホモジナイズし、そして４
℃に一装置いた。このホモジネートを前記のように遠心
し、そして集めた上清を画分■と命名した。
蛋白質画分を硫酸アンモニウムの７５％飽和での“沈澱
”により集め、遠心分離しく２７．００Ｏｒｐｍ、５Ｗ
２７０−ター、３０分間）そして浮上した薄膜を５０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　　（ｐＨ８）　、１ｍ？Ｉ　
ＥＤＴＡ中に再′ｇ、濁した。これらの段階を反復し、
そして蛋白質懸濁液を８０ｍＭ　ＫＣｊ！を含有するＰ
−ｃｅｌｌ緩衝液（２０ｍＭＫＰＯ。
ｐＨ７，５，０，５ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ　、　　５　ｍＭ
β−メルカプトエタノール、５ｗ／ｖ％グリセロール、
０．５ｖ／ｖ％ＮＰ　−４０及びトウィーン２０〕によ
り十分に透析した。
透析物を遠心ビンに移し、これに、８０ｍＭ　ＫＣｌ２
を含有するＰ−ｃｅｌｌｌ街液ですすがれたサックから
回収された蛋白質を加えた。遠心を２０，０ＯＯＸ　ｇ
にて行い、そして時間は１５分間に短縮した。上清を貯
蔵し、そして残ったペレットをＰ−ｃｅｌｌ緩衝液及び
８０ｍＭ　ＫＣｊ！により洗浄・抽出し、そして再遠心
した。次に上清を一緒にして画分■と命名した。
画分■を、８０＋＋Ｍ　ＫＣｌを含有するＰ−ｃｅｌｌ
緩衝液で平衡化したホスホセルロースの２．２Ｘ２２ｃ
ｍのカラムに適用した。このカラムを同じ緩衝液で洗浄
しくカラムの２．５〜３倍容量）、そしてＰ−ｃｅｌｌ
緩衝液中８０〜４００ｍＭ　ＫＣｌの直線グラジェント
を用いて蛋白質を溶出した。ＤＮＡポリメラーゼ活性を
含有する画分（約０．１８〜０．２０？Ｉ　ＫＣｊ！　
）をプールし、そしてアミコン攪拌セル及びＹ）１３０
膜上で３〜４倍濃縮した。このセルを、Ｋ（ｊ！を含有
しないＰ−ｃｅ１１緩衝液ですすぎ、そして画分濃縮￥
ｙＪ（０，１５ＭＫＣｌ最終容量調整）に加えて画分■
とした。
画分■を、Ｐ−ｃｅｌｌ緩衝液及び０．１５？Ｉ　ＫＯ
２で平衡化したヘパリン・セファロースＣＬ　−６Ｂカ
ラム（ファルマシア）５艷に適用した。カラムを０．１
５Ｍ　ＫＣＩ媛街液（ａ〜４カラム容量）により洗浄し
、そしてＰ−ｃｅ１１緩衝液中０．１５〜０．６５１１
　ＫＣ／！の直線グラジェントにより蛋白質を溶出した
。５Ｏ５−ＰＡＥＧ分析のためにゼラチンを含まない稀
釈剤への１：１０稀釈を行い、そして酵素の測定に使用
するため１■／−のゼラチンを含有する稀釈剤への引続
いての１：２０稀釈を行った。活性画分（約０．３Ｍ　
ＫＣｊｌ！で溶出）を、スーパーコイルＤＮＡ鋳型上で
特異的及び非特異的エンドヌクレアーゼ／トポイソメラ
ーゼについて、過剰のＤＮＡポリメラーゼと共にインキ
ュベートした後のスーパーコイルプラスミドＤＮＡの分
子量の変化を電気泳動により検出することによって測定
した。少量の線状ＤＮＡフラグメントとのインキュベー
ションの後エキソヌクレアーゼの汚染が検出された。ピ
ーク画分中、約８８ｋｄ蛋白質が主たるバンドであるこ
とが見出された。画分■と称する主要画分は、このプー
ルを約３〜５ポリメラーゼユニツト／６００ｎｇ　ＤＮ
Ａで５５℃にて３０分間測定した場合、最少の検出可能
なエンドヌクレアーゼ活性を伴って最高のポリメラーゼ
活性を有していた。
画分■を、１０＋ｎＭ　ＫＰＯ４，（ｐＨ７，５）　、
５　ｉＭβ−メルカプトエタノール、５％グリセロール
、０．２％ＮＰ　−４０及び０．２％トウィーン２０（
ＨＡ緩衝液）に対して透析した。この透析されたサンプ
ルを、ヒドロキシアパタイトの３１ｎｌのカラムに適用
し、そしてＨＡ緩街液中１０〜２５０ｍＭ　ＫＰＯ＝　
（ｐＨ７，５）の直線グラジェントにより酵素を溶出し
た。ポリメラーゼ活性は７５１１１Ｍ　ＫＰＯ４におい
て溶出し始め、１００ｍＭ　ＰＯ，においてピークを示
した。活性ピーク画分を１＝１００〜１：３００稀釈で
測定した。前のクロマトグラフィー段階におけるように
、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析のため、ゼラチンを含まない稀
釈剤中１：１０の稀釈物を調製した。５ポリメラーゼユ
ニツトで５５℃において有意なエンドヌクレアーゼ又は
二本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有しない両分をプール
し、そして画分■と命名した。
画分■を、２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐ）１５．２　）
、５％グリセロール、５ｍＭβ−メルカプトエタノール
、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０．１％ＮＰ　−４０
及び０．１％トウィーン２０の溶液に対して透析し、室
温においてｐＨ５に調整した。透析されたサンプルを、
あらかじめ平衡化した２−のＤＥＡＥ−Ｔｒｉｓ−Ａｃ
ｒｙｌ−Ｍ（ＬＫＢ）カラムに適用し、そして次に同じ
緩衝液で洗浄した。
カラムに付着しなかったポリメラーゼ活性を含有する両
分をプールし、そして同じ緩衝液中５０ｍＭＮａＣ１に
調整し、画分■を得た。
画分■を、同じ緩衝液（２５ｍＭ酢酸ナトリウム、５０
ｍＭ　Ｎａ（Ｊ　、　５％グリセロール、０．１　ｍＭ
　ＥＤＴＡ　。
０．１％ＮＰ　−４０及び０．１％トウィーン２０）で
平衡化された２−のＣＭ−Ｔｒｉｓ−Ａｃｒｙｌ−Ｍ（
ＬＫＢ）カラムに適用した。このカラムを、４〜５カラ
ム容量の同じ緩衝液で洗浄し、そして酵素を酢酸ナトリ
ウム緩衝液中５０〜４００ｍＭ　ＮａＣ１の直線グラジ
ェントにより溶出した。ポリメラーゼ活性のピークは約
０．１５〜０．２０Ｍ　　ＮａＣｊ！において溶出され
た。ポリメラーゼ活性を、５Ｏ５−ＰＡＧＥ分析のため
ゼラチンを含有しない稀釈剤中にまず１：１０で稀釈し
、１：３００〜１：５００１釈において測定した。７４
℃にてＤＮＡポリメラーゼアッセイ塩（２５ｍＭ　ＴＡ
ＰＳ−ＨＣｌ２　。
ＰＩ（９，４，２，０ｍＭＨｇＣ１ｚ及び５ＱｍＦＩＫ
ＣＡ　）を用いて特異的及び非特異的エンドヌクレアー
ゼ／トポイソメラーゼについてスーパーコイルＤＮＡ！
寿型に対する活性ピークにわたる測定を行い、さらにＭ
１３ｓｓＤＮＡ及びｐＢＩ１３２２７ラグメントに対す
るヌクレアーゼの測定も行った。検出可能なヌクレアー
ゼを含有しない活性画分をプールし、そして銀染色５Ｏ
Ｓ−ＰＡＧＥミニゲル上を泳動廿しめた。この結果は、
約２５０．０００ユニツト／■の比活性を有する約８８
ｋｄの単一バンドを示す。
ユニ 例６に記載したようにして精製されたＴａｑポリメラー
ゼは、Ｔａｑエンドヌクレアーゼ活性及びＴａｑエキソ
ヌクレアーゼ活性により汚染されていないことが見出さ
れた。さらに、Ｔａｑポリメラーゼは好ましくは、使用
される各非イオン性洗剤約０．１〜約Ｑ、５ｖ／ｖ％を
含有する貯蔵緩衝液中に貯蔵される。さらに好ましくは
、貯蔵緩衝液は５０ｖ／ｖ％グリセロール、１１００ｎ
ｃ　ＫＣＩ　、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　　（ｐＨ
８，０）　、０．１　ｍＭエチレシンアミン四＃酸（Ｅ
ＤＴＡ）　、ＬｍＦＩジチオスレイトール、０、５　ｖ
　／　ｖ％ＮＰ　−４０，０，５ｖ　／　ｖ％トウィー
ン２０及び２０ｎ／ｒｎ１ゼラチンからなり、そして好
ましくは一２０℃で貯蔵される。
この貯蔵されたＴａｑポリメラーゼを、２５ｍＭＴｒｉ
ｓ　−Ｈ（Ｊ　　（ｐＨ８，０）、２０ｍＭ　ＫＣｌ、
１ｍＭβ−メルカプトエタノール、０．５％ＮＰ　−４
０，０，５％トウィーン２０及び５００ｉ／−ゼラチン
から成る緩衝液に稀釈した。次に、５０ｍＭ　ＫＣＩ　
、　１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８，３）　、１．
５ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ　、０．０１Ｗ／　Ｖ％ゼラチン、
２００禮ずつのｄＮＴＰ、　　１ｍずつのプライマー（
バクテリオファージλからの対照鋳型上の５００塩基対
の標的配列を定義する）、及び２．０〜２．５ユニツト
のＴａｑポリメラーゼ／１測定を１００４の最終容量中
に含有する反応緩衝液を調製した。この反応緩衝液に鋳
型を添加し、サンプルを０．５　、ｄのポリプロピレン
チューブに入れ、そしてサンプルを１００μｌの重白色
鉱油で覆って蒸発を防止した。
ｌｎｇの対照鋳型（バクテリオファージλＤＮＡ）を使
用し、標的配列がＤＮＡの出発量の約１％を占め、次の
条件を用いた場合、少なくとも１０５倍の増幅が達成さ
れた。
チューブを熱浴中に置くことにより９４℃にて３０秒間
、１分間にわたり鋳型混合物をまず変性した。次に、チ
ューブを３７℃の熱浴に２分間入れた０次に、チューブ
を７２℃の熱浴に３分間入れ、そして次に９４℃の熱浴
に１分間入れた。このサンプルを合計２５サイクル反復
した。２５回目のサイクルの終りにおいて、９４℃にお
ける熱変性段階を省略し、そしてその代りに、７２℃の
インキュベーション段階をさらに３分間延長した。
測定を停止した後、サンプルを室温に放冷し、そして先
行例において記載したようにして分析した。
異る濃度のｄＮＴＰ及び異る濃度のＴａｑポリメラーゼ
を用いて、鋳型を最適に増幅することができよう。さら
に、ＤＮＡサンプル中の標的配列のサイズは、適切な伸
長（７２°Ｃでのインキュベーション段階）のために必
要な最短時間に影響を与えるであろう。最大の効率を得
るため、増幅されるべき個々の鋳型について温度サイク
ルプロフィールの最適化を行うべきである。
貫１ 例１に記載したようにして精製したＴａｑポリメラーゼ
を先行する例において記載したようにして貯蔵のために
製剤化した。但し、非イオン性ポリマー洗剤を使用しな
かった。その例において記載したようにして活性を測定
した場合、この酵素貯蔵混合物は不活性であることが見
出された。貯蔵緩衝液にＮＰ　−２０及びトウィーン２
０を添加した場合、十分な酵素活性が保存されており、
酵素製剤の安定のために非イオン性洗剤が必要であるこ
とが示された。
劃」ユ ヒトゲノムＤＮＡの１ｎのサンプル数個を、同等のユニ
ット数のＫｌｅｎｏ−フラグメント又はＴａｑポリメラ
ーゼを用いて、例５に記載したようにして２０〜３５サ
イクルの増幅に付し、そしてアガロースゲル電気泳動及
びサンプル数個により分析した。これらの反応において
使用されたプライマーＰＣＯ３及びＰＣＯ４はヒトβ−
グロビン遺伝子の１１０ｂｐセグメントの合成を指令す
る。Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ増幅は、この酵素を用い
る場合に典型的に観察されるＤＮＡの汚れ（ｓｍｅａｒ
）を示し、その予想される原因は非特異的アニーリング
、及び本質的に非−ストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件（Ｉ　Ｘ　Ｈｅｎｏ−塩、３７°Ｃ）下で
の無関係のゲノム配列へのプライマーの伸長である。そ
れにもかかわらず、サザンフ゛ロントにおいて、すべて
のレーンで特異的１１０ｂｐβ−グロビン標的フラグメ
ントが観察された。Ｔａｑポリメラーゼを用いて行われ
た増幅において実質的に異る電気泳動パターンが見られ
、この場合、単への主要バンドは１１０ｂｐ標的配列で
ある。この顕著な特異性は疑いなくプライマーが伸長さ
れた時の温度によるものであった。
Ｋｌｅｎｏ−フラグメント増幅の場合のように、アニー
リング段階は３７℃で行われたが、Ｔａｑ−触媒反応の
温度を約７０℃に上昇せしめた後に酵素は有意な活性を
示した。３７°Ｃから７０°Ｃへのこの変温の間、貧弱
にマツチしたプライマー−鋳型バイブリド（ａ７℃で形
成される）が解離し、反応混合物が酵素活性化温度に達
する時点までに、高度に相補的な基質のみが伸長のため
に利用可能であった。この特異性はまた、Ｋｌｅｎｏｗ
フラグメントを用いて行われる同様の増幅に比べて高収
量の標的配列をもたらす。なぜなら、非特異的伸長生成
物がポリメラーゼに関して効果的に競争し、これにより
Ｋｌｅｎｏｗフラグメントにより作られ得る１１〇−マ
ーの量が減少するからである。
勇上■ １　ｔｓ　Ｍｏ１ｔ４ＤＮＡ　、　　５０ｍＭ　ＫＣｊ
！　、　１０ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８、３）　、１０
＋ｌ１Ｍ　ＭｇＣｌ　ｚ　、０．０１％ゼラチン、１犀
ずつの次のプライマー（１５０ｂｐ領域を増幅するため
のもの）： ５　’　−ＣＡＴＧＣＣＴＣＴＴＴＧＣＡＣＣＡＴＴＣ
−３’　（Ｒ３７９）及び ５　’　−ＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＴＴＧＴＡＧＣＴＧ
−３’　（Ｒ５８０）１．５ｍＭずつのｄＮＴＰ及び５
．０ユニー／トのＴａｑポリメラーゼを１００４の反応
容量光りに含有するサンプルの増幅を行った。２．５，
１．３、又は０．６ユニツトのＴａｑポリメラーゼを含
有する３個の追加のサンプルを調製した。次のサイクル
を用いて前記の温度サイクル機中で３０サイクルの増幅
を行った。
１分間にわたり７０℃から９８゛Ｃに加熱し；９８°Ｃ
にて１分間保持し； １分間にわたり９８℃から３５°Ｃ２４５°Ｃ又は５５
℃に冷却し； ３５℃、４５℃又は５５℃に１分間保持し；１分間にわ
たり３５℃、４５℃又は５５℃から７０℃に加熱し；そ
して ７０℃に３０秒間保持する。
３５℃のアニーリング温度において、２．５ユニツト／
　１００ｔ１！のＴａｑ酵素稀釈物が、アガロースゲル
電気泳動において、他のすべてのＴａｑポリメラーゼ濃
度に比べて最良のシグナル：ノイズ比を与える。４５°
Ｃにおいては、５ユニツト／１００ＩのＴａｑ酵素が、
他の濃度に比べて最良のシグナル：ノイズ比を与える。
５５℃においては、５ユニソ）／１００ｔ１１のＴａｑ
酵素が、他の濃度及び４５°Ｃでのアニーリングに比べ
て最良のシグナル：ノイズ比、及び改良された収量を与
える。７’ａｑポリメラーゼは５５゛Ｃにおいて一層特
異性が高（、そして−層好収量を与える。
別の実験において、Ｍｏ１ｔ　４　ＤＮＡを、ヒユーマ
ン・ゼネテインク・ミュータント・セル・デボジトリ（
Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍｕ核酸ｎｔ　Ｃｅ１ｌ
　Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）、カムテン、ニューシャーシ
ーから得られるβ−又はＴ−グロビン配列を含有するセ
ルラインＧＭ２０６４ＤＮＡに１０倍ごとに、細胞当り
のコピーの相違を代表する種々の濃度で稀釈し、そして
これらのサンプルについて、３５℃及び５５℃のアニー
リング温度においてこの例において記載したようにして
増幅を行った。３５℃において、アガロースゲル電気泳
動により見ることができる最良のものは５０細胞中１コ
ピーであった。５５℃においては、見られる最良のもの
は１　／　５，０００細胞（低温に比べて１００倍の改
良）であり、これらの条件下での’ｌ’ａｑポリメラー
ゼの特異性のためには上昇したアニーリング温度が重要
であることが示された。
第三の実験において、ニューヨーク、シラクスのＢ、Ｐ
ｏ１ｅｓｚ州立大学から得られるＨＩＶ−陽性ＤＮＡを
含有するセルライン３６８ＨからのＤＮＡを同様にして
、ＳＣＩセルライン（１９８５年３月１９日にＡＴＣＣ
に寄託されている；鎌形赤血球対立遺伝子についてホモ
接合性でありそしてＨＩＶ配列をすべて欠いているＥＢ
Ｖ−形質転換されたβ−セルライン）からのＤＮＡに、
細胞当りのコピーの相違を代表する種々の濃度で稀釈し
、そしてＨ１■配列の１１５ｂｐｅＪｆ域を増幅するプ
ライマー５Ｋ３８及び５Ｋ３９　： ５　’　　−ＡＴＡＡＴＣＣＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴ
ＡＧＧＡＧＡへＡＴ−３’　　（ＳＫ３８）及び ５　’　−ＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣ
ＣＡＧＡＡＴＧＣ−３’　（ＳＫ３９）を用いて、３５
℃及び５５℃のアニーリング温度において、この例に記
載したようにして増幅を行った。
アガロースゲル電気泳動による結果が示すところによれ
ば、３５℃のアニーリング温度においては未稀釈の３６
８Ｈサンプルのみが検出されたが、５５℃のアニーリン
グ温度によれば少なくとも１０−２稀釈を検出すること
ができ、検出における１００倍の改良が与えられた。
劃」」よ Ｉｎのラビット網状赤血球ｍＲＮＡ　（ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラドリース）から、ｃＤＮＡを、１５０１Ｋ
（Ｊ！　、　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　　（ｐＨ８
，３）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｊ！　ｚ、５１Ｍ　ＤＴＴ
、０．５ｍＭ　ｄＡＴＰ　　、０．５ｍＭ　ｄＣＴＰ　
　、０．５ｍＭＴＴＰ　、　０．５ｏＭ　ｄＧＴＰ　、
　０．２　ｎオリゴ（ｄＴ）　１２−１８（ファルコシ
ア）、４０ユニツトＲＮａｓｉｎ　（プロメガ・バイオ
チック）及び５ユニツトのＡＭＶ逆転写酵素を含有する
１００Ｊ１！の反応容量中で作り、そして４２℃にて３
０分間インキュベートした。
９５℃にて１０分間加熱することにより反応を停止した
。２バのＲＮａｓｅ（水中２■／−の溶液２４）をサン
プルに加え、そして３７℃にて１０分間インキュベート
した。
異る対のプライマーを用いて、Ｋｌｅｎｏ−フラグメン
トにより３回の増幅反応を行った。プライマーＰＣＯ３
／ＰＣＯ４は１１０ｂｐの生成物を定義する。プライマ
一対Ｒ５４５／オリゴ（ｄＴ）　２５−３０は約３７０
ｂｐの生成物を定義し、そしてプライマ一対ＰＣＯ３／
オリゴ（ｄＴ）　２５−３０は約６００ｂｐの生成物を
定義する。ＰＣＯ３゜ＰＣＯ４、及びＲ５４５はヒトβ
−グロビン遺伝子に対して相補的であり、そしてラビッ
ト遺伝子との間に２個のミスマツチを有する。ＰＣＯ３
及びＰＣＯ４は例１に記載されている。Ｒ３４５は配列
：５　’　−ＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＣＴＡＧＧＴＧＣＣ
−３’を有する。
増幅反応は、５０ｎＭ　ＮａｆＪ　、　１０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ４１（Ｊ！　　（ｐ）１７、６　）　、１０ｍＭ　
ＭｇＣｊ！　２．２００硝／−ゼラチン、１０％ＤＭＳ
Ｏ１１声ＰＣ０３又はＩ？Ｓ４５．１オＰＣＯ４又はオ
リゴ（４Ｔ）　２５−３０．１．５　ｍＭ　ｄＡＴＰ　
、１．５　ｍＭ　ｄＣＴＰ、１、５　ｎＭ　ＴＴＰ及び
１．５　ｍＭ　ｄＧＴＰを含有する１００Ｉの反応容量
中で、前記のｃＤＮＡの１／２０（５ｍ）を用いて行っ
た。サンプルを９８℃にて５分間加熱し、次に室温に冷
却し、そして１００ＩＪ１の鉱油を重層した。
このサンプルを、例１に記載した機械を用いてそして次
のプログラムを用いて、１０サイクルの増幅に付した。
１）加熱ブロック中で２，５分間にねたり３７°Ｃから
９８℃に加熱しく変性）； ２）３．０分間にわたって９８℃から３７℃に冷却しく
アニール）： ３）１ユニツトのＫｌｅｎｏｗ断片を添加し；そして′
４）３７°Ｃにて２０分間保持した（伸長）。
各サンプルの１／２０（７Ｊ）を２％アガロースゲル上
での電気泳動により分析した。臭化エチジウムにより染
色した後、ＰＣＯ３／ＰＣＯ４サンプル及びＲ５４５／
オリゴ（ｄＴ）サンプル中に異るバンドが見られた。バ
ンドのサイズは予想した長さと一致した。
すなわち、前者については１１０ｂｐであり、後者につ
いては約３７０ｂｐであった。ＰＣＯ３／オリゴ（ａＴ
）プライマ一対による約６００ｂｐフラグメントの増幅
の証拠はなかった。
ゲルの内容物をゲナントラン（Ｇｅｎａｎ　ｔｒａｎ）
ナイロン膜にサザンブロッティングし、そして標準的方
法により５ａｉｋｉ等、５ｃｉｅｎｃｅ　％前掲、に記
載されているニックトランスレーションされたヒトβグ
ロビンプローブｐＢＲ３２８：βＡとハイブリダイズせ
しめた。得られたオートラジオダラムは前に達した結論
を拡張した。すなわち、１１０ｂｐ及び約３７０ｂｐの
フラグメントはβ−グロビン特異的増幅生成物であり、
そして約６００ｂｐバンドの有意な増幅は検出されなか
った。
３個の追加のサンプルを、上記の様にして得られたＴａ
ｑポリメラーゼにより、前記と同じプライマ一対を用い
て増幅した。ｃＤＮＡの５４部分を、５０ｍＭ　ＭＣＩ
　、　２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（１／！　　（ｐＨ８，
０）　、１０ｍＭ？Ｉｇ（ｆ　！、２００鱈／−ゼラチ
ン、１０％叶５Ｏ２１団ＰＣＯ３又はＲ５４５，１声Ｐ
ＣＯ４又はオリゴ（ｄＴ）　２５−３０．１、５ｍＭ　
ｄＡＴＰ　、　１．５ｄ　ｄＣＴＰ　、１．５ｍ）ｌ　
ＴＴＰ及び１、５　ＩＩＭ　ｄＧＴＰを含有する１００
Ｉの反応容量中で増幅した。サンプルを９８℃にて５分
間加熱し、そして室温に冷却した。１！Ｊ１のＴａｑポ
リメラーゼ（ロフト２の１／８稀釈物）をそれぞれに加
え、そして約１００ＩＪ１の鉱油を重層した。
このサンプルを、次のプログラムを用いて前に記載した
ベリティール（Ｐｅｌｔｉｅｒ）の装置中で９サイクル
の増幅に付した。
１）１分間にわたり３５°Ｃから６０°Ｃに加熱し；２
）１２分間にわたり６０℃から７５°Ｃに加熱しく伸長
）； ３）１分間にわたり７０℃から９５℃に加熱しく変性）
： ４）９５°Ｃに３０秒間浸漬し； ５）１分間にわたり９５℃から３５℃に冷却し（アニー
ル）；そして ６）３５℃にて３０秒間浸漬した。
最後のサイクルの後、サンプルをさらに１０分間７０℃
にてインキュベートすることにより最終（１０サイクル
目）伸長を完結した。それぞれの最終容量は約１００Ｊ
ｄであった。
前記のごとく、各サンプルの１　／２０　（１０ｔｄ）
を２％アガロースゲル上で分析した。このゲル中で、増
幅生成物は３個のサンプルすべてに存在した。すなわち
、ＰＣＯ３／ＰＣＯ４については１１０ｂｐ、Ｒ５４５
／オリゴ（ｄＴ）については約３７０ｂｐ、そしてＰＣ
Ｏ３／オリゴ（ｄＴ）については約６ｏｏｂｐであった
。
これらの結果は、サザン移行及びｐＢＲ３２８：βＡプ
ローブとのハイブリダイゼーションにより確認された。
ＫｌｅｎｏｗフラグメントによってではなくＴａｑポリ
メラーゼによる６００ｂｐ生成物の生成は有意であり、
そしてＴａｑポリメラーゼがＫｌｅｎｏｗフラグメント
より一層長いＤＮＡを生成せしめることができることを
示唆する。
下記のバクテリオファージ及び細菌株がシタス・マスタ
ー・カルチュア・コレクション（ｃｅ　ｔｕｓＭａｓｔ
ｅｒ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ＣｏｌｌＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
）（ｃ、米国力リホルニア、エメリービル、　１４００
．５３ストリート、及びアメリカン・タイプ・カルチュ
ア・コレクション（ＡＴＣＣ）、米国マリ−ランド、ロ
ックビル、　１２３０１パークラウンドライブ、に寄託
された。これらの寄託は、特許手続のための微生物の寄
託の国際的承認についてのブタペスト条約及びそれに暴
く規則（ブタペスト条約）の規定のもとに行われた。
これは、寄託の日から３０年間にわたる生存培養物の維
持を保証する。これらの微生物はブタペスト条約の規定
のもとにＡＴＣＣにより入手可能にされ、そして関連す
る米国特許の発行の後の無限定の入手可能性を保証する
本件出願人とＡＴＣＣとの契約に従って入手可能にされ
るであろう。寄託された微生物の入手可能性は、いずれ
かの政府の権威のもとにその特許法に従って認められた
権利に反してこの発明を実施することの許諾であると解
してはならない。
ＣＨ３５：Ｔａｑ＃４−２　　　３１２５　４０．３３
６　１９８７年５月２９日Ｅ、コリＤＧ９８／ｐＦＣ８
３３１２８６７，４２１１９８７年５月２９日要約すれ
ば、この発明は、温度サイクル連鎖反応及び熱安定酵素
を用いる、１又は複数の特定の核酸配列を増幅するため
の方法を提供し、この方法においては次のプライマー伸
長反応のだめの鋳型として機能し得る反応プライマー伸
長生成物が生成される。この方法は、最初に非常に少量
のみ存在する核酸配列を検出する場合、及び配列特異的
オリゴヌクレオチドを用いてヌクレオチド変化を検出す
る場合に特に有用である。
この発明の方法は、増幅された生成物の収量の増加、よ
り高い特異性、及び増幅方法を行うのに必要な、従来開
示されていたのよりも少ない段階を提供する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミド８５Ｍ１３°中にサブクローニン
グされた約４．５　ｋｂのＨｉｎｄ　ｍ　１．アクアチ
クスＤＮＡ挿入部を含有するプラスミドｐＦＣ８３の制
限地図である。 第２図は、プラスミドＢＳＭ１３”中にサブクローニン
グされた約２．８　ｋｂの且ｉｎｄ　ｍ　−Ａｓｐ７１
８　Ｔ、アクアチクスＤＮＡ挿入部を含有するプラスミ
ドｐＦＣ８５の制限地図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、核酸の鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成するためヌク
    レオチドトリホスフェートの結合を触媒する、精製され
    た熱的に安定な酵素。 ２、ＤＮＡポリメラーゼである、特許請求の範囲第１項
    記載の酵素。 ３、約８６，０００〜９０，０００ダルトンの分子量を
    有する、特許請求の範囲第１項または第２項記載の酵素
    。 ４、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕ
    ａ−ｔｉｃｕｓ）に由来する、特許請求の範囲第３項記
    載の酵素。 ５、ｐＨ６．４では、ｐＨ８．０の活性の少なくとも５
    ０％の活性を有する、特許請求の範囲第１項〜第４項の
    いずれか１項記載の酵素。 ６、天然の形体である特許請求の範囲第１項〜第５項の
    いずれか１項記載の酵素。 ７、特許請求の範囲第２項記載の酵素をコード化する遺
    伝子。 ８、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕ
    ａ−ｔｉｃｕｓ）のゲノムからクローン化された、特許
    請求の範囲第７項記載の遺伝子。 ９、分子量が約８６，０００〜９０，０００ダルトンで
    ある酵素をコード化する、特許請求の範囲第８項記載の
    遺伝子。 １０、分子量が約６０，０００〜６５，０００ダルトン
    である酵素をコード化する、特許請求の範囲第８項記載
    の遺伝子。 １１、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑ
    ｕａ−ｔｉｃｕｓ）またはバクテリオファージＣＨ３５
    ：Ｔａｑ＃４−２のいずれかの約３．５ｋｂのＢｇＩI
    I−Ａｓｐ７１８（部分）制限フラグメント内に含まれ
    る、特許請求の範囲第９項記載の遺伝子。 １２、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑ
    ｕａ−ｔｉｃｕｓ）のゲノムまたはプラスミドｐＦＣ８
    ５のいずれかの約２．８ｋｂのＨｉｎｄIII−Ａｓｐ７
    １８制限フラグメント内に含まれる、特許請求の範囲第
    １０項記載の遺伝子。 １３、ｐＦＣ８５またはｐＦＣ８３から選択されるプラ
    スミド。 １４、バクテリオファージＣＨ３５；Ｔａｑ＃４−２。 １５、１種以上の非イオン性のポリマー性洗剤を含んで
    成る緩衝液中に特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれ
    か１項記載の酵素を含有する安定な酵素組成物。 １６、洗剤がそれぞれ全組成物の約０．１％〜約０．５
    ％（容積／容積）の濃度で存在する、特許請求の範囲第
    １５項記載の組成物。 １７、洗剤がポリオキシエチル化ソルビタンモノラウレ
    ートおよびエトキシル化ノニルフェノールである、特許
    請求の範囲第１５項または第１６項記載の組成物。 １８、緩衝液がグリセロール、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、（ｐ
    Ｈ８．０）エチレンジアミン四酢酸、ジチオスレイトー
    ル、ポリオキシエチル化ソルビタンモノラウレート、エ
    トキシル化ノニルフェノールおよびゼラチンを含んで成
    る、特許請求の範囲第１５項〜第１７項のいずれか１項
    記載の組成物。 １９、核酸または核酸の混合物に含まれる少なくとも１
    種の特定の核酸配列を増幅する方法であって、核酸が二
    本鎖である時には、この核酸が同じまたは異なる長さの
    ２本の別々の相補的鎖からなり、 （ａ）それぞれの核酸鎖を、４個の異なるヌクレオチド
    トリホスフェートと、増幅されるべきそれぞれの異なる
    特定の配列について１個のオリゴヌクレオチドプライマ
    ーとに接触させ、但しそれぞれのプライマーはそれぞれ
    の特定の配列の異なる鎖に実質的に相補的になるように
    選択され、こうして１個のプライマーから合成された伸
    長生成物がその相補体から分離したとき、他のプライマ
    ーの伸長生成物の合成の鋳型として働くことができるよ
    うにし、上記接触を、それぞれのプライマーのその相補
    的核酸鎖へのハイブリダイゼーションを促進する温度で
    行い； （ｂ）それぞれの核酸鎖を、工程（ａ）と同時にまたは
    この工程の後にヌクレオチドトリホスフェートの結合を
    触媒する熱安定酵素と接触させて、それぞれの核酸のそ
    れぞれの鎖に相補的なプライマー伸長生成物を形成し； （ｃ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、それぞれの核酸鎖鋳型に
    相補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成する
    ためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成
    物をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温
    度において、有効な時間にわたり、工程（ｂ）からの混
    合物を保持し； （ｄ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるがしかし酵素を
    不可逆的に変性させる程の高温ではない温度において、
    有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの混合物を加熱し
    ； （ｅ）工程（ｄ）からの混合物を、工程（ｄ）で産生さ
    れた一本鎖分子のそれぞれへのそれぞれのプライマーの
    ハイブリダイゼーションを促進するために有効な温度に
    まで冷却し；そして （ｆ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、工程（ｄ）で産生された
    それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライマー
    の伸長生成物を合成するためには有効な温度であるがし
    かしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から分離
    する程の高温ではない温度において、有効な時間にわた
    り、工程（ｂ）からの混合物を保持し、工程（ｅ）およ
    び（ｆ）を同時にまたは順次に行うことを特徴とする方
    法。 ２０、核酸または核酸の混合物に含まれる少なくとも１
    種の特定の核酸配列を増幅する方法であって、この核酸
    が同じまたは異なる長さの２本の別々の相補的鎖からな
    り、 （ａ）それぞれの核酸を、４個の異なるヌクレオチドト
    リホスフェート及び増幅されるべきそれぞれの異なる特
    定の配列についての１個のオリゴヌクレオチドプライマ
    ーの存在下で、それぞれの核酸を変性するのに有効な時
    間にわたり有効な温度において加熱し、但しそれぞれの
    プライマーはそれぞれの特定の配列の異なる鎖に実質的
    に相補的になるように選択され、こうして１個のプライ
    マーから合成された伸長生成物がその相補体から分離し
    たとき、他のプライマーの伸長生成物の合成の鋳型とし
    て働くことができるようにし； （ｂ）変性した核酸を、それぞれのプライマーのその相
    補的な核酸鎖へのハイブリダイゼーションを促進する温
    度に冷却し； （ｃ）工程（ａ）または（ｂ）と同時にまたはその後に
    、変性した核酸を、ヌクレオチドトリホスフェートの結
    合が可能であって、それぞれの核酸のそれぞれの鎖に相
    補的なプライマー伸長生成物を形成させることができる
    熱安定酵素と接触させ； （ｄ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、それぞれの核酸鎖鋳型に
    相補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成する
    ためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成
    物をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温
    度において、有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの混
    合物を保持し； （ｅ）プライマー伸長生成物がその上に合成された鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるがしかし酵素を
    不可逆的に変性させる程の高温ではない温度において、
    有効な時間にわたり、工程（ｄ）からの混合物を加熱し
    ； （ｆ）工程（ｅ）からの混合物を、工程（ｅ）で産生さ
    れた一本鎖分子へのプライマーのハイブリダイゼーショ
    ンを促進するために有効な時間にわたり有効な温度に冷
    却し；そして（ｇ）酵素の活性を促進させ、そして増幅
    されるべきそれぞれの異なる配列について、工程（ｆ）
    で産生されたそれぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれ
    のプライマーの伸長生成物を合成するためには有効な温
    度であるがしかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖
    鋳型から分離する程の高温ではない温度において、有効
    な時間にわたり、工程（ｆ）からの混合物を保持し、工
    程（ｆ）および（ｇ）を同時にまたは順次に行うことを
    特徴とする方法。 ２１、核酸または核酸の混合物を含む試料中の少なくと
    も１種の特定の核酸配列の存在または不在を検出し、ま
    たは上記試料中の２種の異なる配列を識別する方法であ
    って、該試料は上記１または複数の配列を含むものと予
    想されるものであり、且つ該１または複数の核酸が二本
    鎖である時には、それらはそれぞれ、等しいまたは等し
    くない長さの２本の分離された相補的鎖からなり、 （ａ）上記試料を、検出されるべきそれぞれの異なる特
    定の配列について、４個の異なるヌクレオチドトリホス
    フェートと、１個のオリゴヌクレオチドプライマーとに
    接触させ、但しそれぞれのプライマーはそれぞれの特定
    の配列の異なる鎖に実質的に相補的になるように選択さ
    れ、こうして１個のプライマーから合成された伸長生成
    物が、その相補体から分離したとき、他のプライマーの
    伸長生成物の合成の鋳型として働くことができるように
    し、上記接触を、それぞれのプライマーのその相補的核
    酸鎖へのハイブリダイゼーションを促進する温度で行い
    ； （ｂ）それぞれの核酸鎖を、工程（ａ）と同時にまたは
    この工程の後に、ヌクレオチドトリホスフェートの結合
    を触媒する熱安定酵素と接触させて、それぞれの核酸の
    それぞれの鎖に相補的なプライマー伸長生成物を形成し
    ； （ｃ）酵素の活性を促進させ、そして検出されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、それぞれの核酸鎖鋳型に
    相補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成する
    ためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成
    物をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温
    度において、有効な時間にわたり、工程（ｂ）からの混
    合物を保持し； （ｄ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるが熱安定酵素を
    不可逆的に変性させる程の高温ではない温度において、
    有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの混合物を加熱し
    ； （ｅ）工程（ｄ）からの混合物を、工程（ｄ）で産生さ
    れた一本鎖分子へのそれぞれのプライマーのハイブリダ
    イゼーションを促進するために有効な時間にわたり、有
    効な温度に冷却し； （ｆ）酵素の活性を促進させ、そして検出されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、それぞれの核酸鎖鋳型に
    相補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成する
    ためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成
    物をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温
    度において、有効な時間にわたり、工程（ｅ）からの混
    合物を保持し、こうして特定の１つの核酸配列または、
    存在するならば、複数の核酸配列の量を増幅させ、工程
    （ｅ）および（ｆ）を同時にまたは順次に行い； （ｇ）工程（ｆ）の生成物に、上記配列へのまたはその
    変異体へのハイブリダイゼーションが可能な検出される
    べきそれぞれの配列のための標識したオリゴヌクレオチ
    ドプローブを加え；そして（ｈ）上記ハイブリダイゼー
    ションが起こったか否かを決定することを特徴とする方
    法。 ２２、核酸または核酸の混合物を含む試料中の少なくと
    も１種の特定の核酸配列の存在または不在を検出し、ま
    たは上記試料中の２種の異なる配列を識別する方法であ
    って、該試料は上記１または複数の配列を含むものと予
    想されるものであり、そして該１又は複数の核酸が二本
    鎖であり、（ａ）試料を、検出されるべきそれぞれの異
    なる特定の配列について、４個の異なるヌクレオチドト
    リホスフェート及び１個のオリゴヌクレオチドプライマ
    ーの存在下で、試料中のそれぞれの核酸を変性するのに
    有効な時間にわたり、有効な温度で加熱し、但しそれぞ
    れのプライマーはそれぞれの特定の配列の異なる鎖に実
    質的に相補的になるように選択され、こうして１個のプ
    ライマーから合成された伸長生成物がその相補体から分
    離したとき、他のプライマーの伸長生成物の合成の鋳型
    として働くことができるようにし； （ｂ）変性した核酸を、それぞれのプライマーのその相
    補的な核酸配列へのハイブリダイゼーションを促進する
    温度に冷却し； （ｃ）工程（ａ）または（ｂ）と同時にまたはその後に
    、変性した核酸を、ヌクレオチドトリホスフェートの結
    合を触媒してそれぞれの核酸のそれぞれの鎖に相補的な
    プライマー伸長生成物を形成させることができる熱安定
    酵素と接触させ；（ｄ）酵素の活性を促進させ、そして
    検出されるべきそれぞれの異なる配列について、それぞ
    れの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライマーの伸長
    生成物を合成するためには有効な温度であるがしかしそ
    れぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から分離する程
    の高温ではない温度において、有効な時間にわたり、工
    程（ｃ）からの混合物を保持し； （ｅ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
    からプライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生成
    せしめるためには有効な温度ではあるが酵素を不可逆的
    に変性させる程の高温ではない温度において、有効な時
    間にわたり、工程（ｄ）からの混合物を加熱し； （ｆ）工程（ｅ）からの混合物を、工程（ｅ）で産生さ
    れる一本鎖分子へそれぞれのプライマーのハイブリダイ
    ゼーションを促進するために有効な時間にわたり有効な
    温度に冷却し； （ｇ）酵素の活性を促進させ、そして検出されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、それぞれの核酸鎖鋳型に
    相補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成する
    ためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成
    物をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温
    度において、有効な時間にわたり、工程（ｆ）からの混
    合物を保持し、こうして特定の１つの核酸配列または、
    存在するならば、複数の核酸配列の量を増幅させ、工程
    （ｆ）および（ｇ）を同時にまたは順次に行い； （ｈ）工程（ｇ）の生成物に、上記配列へのまたはその
    変異体へのハイブリダイゼーションが可能な検出される
    べきそれぞれの配列のための標識したオリゴヌクレオチ
    ドプローブを加え；そして（ｉ）上記ハイブリダイゼー
    ションが起こったか否かを決定することを特徴とする方
    法。 ２３、試料中に含まれる１種又は複数種の核酸中の、少
    なくとも１つのヌクレオチド配列の変化の存在または不
    存在を検出する方法であって、該核酸が二重鎖である時
    には、それはそれぞれ、等しいまたは等しくない長さの
    ２本の分離された相補的鎖からなり、 （ａ）上記試料を、上記変化を含むものと予想されるそ
    れぞれの核酸のそれぞれの鎖について、４個の異なるヌ
    クレオチドトリホスフェートと１個のオリゴヌクレオチ
    ドプライマーとに接触させ、但しそれぞれのプライマー
    はそれぞれの特定の配列の異なる鎖に実質的に相補的に
    なるように選択され、１個のプライマーから合成された
    伸長生成物が、その相補体から分離したとき、他のプラ
    イマーの伸長生成物の合成の鋳型として働くことができ
    るようにし、上記接触を、それぞれのプライマーのその
    相補的核酸鎖へのハイブリダイゼーションを促進する温
    度で行い； （ｂ）試料を、工程（ａ）と同時にまたはこの工程の後
    に、ヌクレオチドトリホスフェートの結合を触媒する熱
    安定酵素と接触させて、それぞれの核酸のそれぞれの鎖
    に相補的なプライマー伸長生成物を形成し； （ｃ）酵素の活性を促進させ、そして上記１又は複数の
    変化を含むものと予想されるそれぞれの異なる核酸につ
    いて、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプラ
    イマーの伸長生成物を合成するためには有効な温度であ
    るがしかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型か
    ら分離する程の高温ではない温度において、有効な時間
    にわたり、工程（ｂ）からの混合物を保持し： （ｄ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
    からプライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生成
    せしめるためには有効な温度ではあるがしかし熱安定酵
    素を不可逆的に変性させる程の高温ではない温度におい
    て、有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの混合物を加
    熱し； （ｅ）工程（ｄ）からの混合物を、工程（ｄ）で産生さ
    れた一本鎖分子へのそれぞれのプライマーのハイブリダ
    イゼーションを促進するために有効な時間にわたり有効
    な温度に冷却し； （ｆ）酵素の活性を促進させ、そして上記１又は複数の
    変化を含むものと予想されるそれぞれの異なる核酸につ
    いて、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプラ
    イマーの伸長生成物を合成するためには有効な温度であ
    るがしかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型か
    ら分離する程の高温ではない温度において、有効な時間
    にわたり、工程（ｅ）からの混合物を保持し、１又は複
    数の配列変化が存在するときには、これらを含む核酸の
    検出可能な増幅を得るのに十分な回数だけ、工程（ｄ）
    、（ｅ）および（ｆ）を繰り返し、そして工程（ｅ）と
    （ｆ）は同時にまたは順次に行い；（ｇ）工程（ｆ）の
    生成物を膜に固定し、 （ｈ）プローブの配列が増幅された配列の領域に相補的
    であるときにのみ増幅された核酸配列とハイブリダイズ
    することができる、標識された配列特異的オリゴヌクレ
    オチドプローブで、上記膜をハイブリダイゼーション条
    件下で処理し；そして （ｉ）プローブが核酸試料中の増幅された配列にハイブ
    リダイズしたか否かを検出することを特徴とする方法。 ２４、試料中に含まれる１種又は複数種の核酸中の少な
    くとも１つのヌクレオチド配列の変化の存在または不存
    在を検出する方法であって、該１種又は複数種の核酸は
    それぞれ、等しいまたは等しくない長さの２本の相補的
    鎖からなり、 （ａ）試料を、上記変化を含むものと予想されるそれぞ
    れの核酸のそれぞれの鎖について、４個の異なるヌクレ
    オチドトリホスフェート及び１個のオリゴヌクレオチド
    プライマーの存在下で、試料中のそれぞれの核酸を変性
    するのに有効な時間にわたり有効な時間で加熱し、但し
    それぞれのプライマーはそれぞれの特定の配列の異なる
    鎖に実質的に相補的になるように選択され、１個のプラ
    イマーから合成された伸長生成物がその相補体から分離
    したとき、他のプライマーの伸長生成物の合成の鋳型と
    して働くことができるようにし；（ｂ）変性した核酸を
    、それぞれのプライマーのその相補的な核酸鎖へのハイ
    ブリダイゼーションを促進する温度に冷却し； （ｃ）工程（ａ）または（ｂ）と同時にまたはその後に
    、変性した核酸を、ヌクレオチドトリホスフェートの結
    合を触媒する熱安定酵素と接触させて、それぞれの核酸
    のそれぞれの鎖に相補的なプライマー伸長生成物を形成
    し； （ｄ）酵素の活性を促進させ、そして上記１又は複数種
    の変化を含むと予想されるそれぞれの異なる核酸につい
    て、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライ
    マーの伸長生成物を合成するためには有効な温度である
    がしかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から
    分離する程の高温ではない温度において、有効な時間に
    わたり、工程（ｃ）からの混合物を保持し； （ｅ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるがしかし酵素を
    不可逆的に変性させる程の高温ではない温度において、
    有効な時間にわたり、工程（ｄ）からの混合物を加熱し
    ； （ｆ）工程（ｅ）からの混合物を、工程（ｅ）で産生さ
    れた相補的な一本鎖分子への各プライマーのハイブリダ
    イゼーションを促進するために有効な時間にわたり有効
    な温度に冷却し； （ｇ）酵素の活性を促進させ、そして上記１又は複数の
    変化を含むと予想されるそれぞれの異なる核酸について
    、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライマ
    ーの伸長生成物を合成するためには有効な温度であるが
    しかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から分
    離する程の高温ではない温度において、有効な時間にわ
    たり、工程（ｆ）からの混合物を保持し、１又は複数の
    配列の変化が存在するときには、これらを含む核酸の検
    出可能な増幅を得るのに十分な回数だけ、工程（ｅ）〜
    （ｇ）を繰り返し、そして工程（ｆ）と（ｇ）は同時に
    または順次に行い； （ｈ）工程（ｇ）の生成物を膜に固定し、 （ｉ）プローブの配列が増幅された配列の領域に相補的
    であるときにのみ増幅された核酸配列とハイブリダイズ
    することができる、標識された配列特異的オリゴヌクレ
    オチドプローブで、上記膜をハイブリダイゼーション条
    件下で処理し；そして （ｊ）プローブが核酸試料中の増幅された配列にハイブ
    リダイズしたか否かを検出することを特徴とする方法。 ２５、試料中に含まれる１種又は複数種の核酸中の少な
    くとも１つのヌクレオチド配列の変化の存在または不存
    在を検出する方法であって、核酸が二本鎖である時には
    、それはそれぞれ、等しいまたは等しくない長さの２本
    の分離された相補的鎖からなり、 （ａ）上記試料を、上記１又は複数の変化を含むものと
    予想されるそれぞれの核酸のそれぞれの鎖について、４
    個の異なるヌクレオチドトリホスフェートと１個のオリ
    ゴヌクレオチドプライマーとに接触させ、但しそれぞれ
    のプライマーはそれぞれの特定の配列の異なる鎖に実質
    的に相補的になるように選択され、１個のプライマーか
    ら合成された伸長生成物が、その相補体から分離したと
    き、他のプライマーの伸長生成物の合成の鋳型として働
    くことができるようにし、上記接触を、それぞれのプラ
    イマーのその相補的核酸鎖へのハイブリダイゼーション
    を促進する温度で行い； （ｂ）試料を、工程（ａ）と同時にまたはこの工程の後
    に、ヌクレオチドトリホスフェートの結合を触媒する熱
    安定酵素と接触させて、それぞれの核酸のそれぞれの鎖
    に相補的なプライマー伸長生成物を形成し； （ｃ）酵素の活性を促進させ、そして上記１又は複数の
    変化を含むものと予想されるそれぞれの異なる核酸につ
    いて、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプラ
    イマーの伸長生成物を合成するためには有効な温度であ
    るがしかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型か
    ら分離する程の高温ではない温度において、有効な時間
    にわたり、工程（ｂ）からの反応混合物を保持し； （ｄ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるがしかし熱安定
    酵素を不可逆的に変性させる程の高温ではない温度にお
    いて、有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの反応混合
    物を加熱し； （ｅ）工程（ｄ）からの反応混合物を、工程（ｄ）で産
    生された一本鎖分子へのそれぞれのプライマーのハイブ
    リダイゼーションを促進するために有効な時間にわたり
    有効な温度に冷却し； （ｆ）酵素の活性を促進させ、そして上記１又は複数の
    変異体を含むものと予想されるそれぞれの異なる核酸に
    ついて、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプ
    ライマーの伸長生成物を合成するためには有効な温度で
    あるがしかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型
    から分離する程の高温ではない温度において、有効な時
    間にわたり、工程（ｅ）からの反応混合物を保持し、１
    又は複数の配列変化が存在するときには、これらを含む
    核酸の検出可能な増幅を得るのに十分な回数だけ、工程
    （ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を繰り返し、そして工程（
    ｅ）と（ｆ）は同時にまたは順次に行い； （ｇ）オリゴヌクレオチドの配列が増幅された配列の領
    域に相補的であるときのみ増幅された核酸配列とハイブ
    リダイズすることができる配列特異的オリゴヌクレオチ
    ドを膜に固定し； （ｈ）この膜をハイブリダイゼーション条件下で工程（
    ｆ）の生成物で処理し；そして （ｉ）核酸試料の増幅された配列が、膜に固定されたオ
    リゴヌクレオチドにハイブリダイズしたか否かを検出す
    ることを特徴とする方法。 ２６、試料中に含まれた１種又は複数種の核酸中の少な
    くとも１つのヌクレオチド配列の変化の存在または不存
    在を検出する方法であって、該１種又は複数種の核酸は
    それぞれ、等しいまたは等しくない長さの２本の相補的
    鎖からなり、 （ａ）試料を、上記変化を含むと思われるそれぞれの核
    酸のそれぞれの鎖について、４個の異なるヌクレオチド
    トリホスフェート及び１個のオリゴヌクレオチドプライ
    マーとの存在下で、試料中のそれぞれの核酸を変性する
    のに有効な時間にわたり有効な温度に加熱して、但しそ
    れぞれのプライマーはそれぞれの特定の配列の異なる鎖
    に実質的に相補的になるように選択され、１個のプライ
    マーから合成された伸長生成物が、その相補体から分離
    したとき、他のプライマーの伸長生成物の合成の鋳型と
    して働くことができるようにし、（ｂ）前記変性した核
    酸を、それぞれのプライマーのその相補的な核酸鎖への
    ハイブリダイゼーションを促進する温度に冷却し； （ｃ）工程（ａ）または（ｂ）と同時にまたはその後に
    、変性した核酸を、ヌクレオチド、トリホスフェートの
    結合を触媒する熱安定酵素と接触させて、それぞれの核
    酸のそれぞれの鎖に相補的なプライマー伸長生成物を形
    成し； （ｄ）酵素の活性を促進させ、そして上記１又は複数の
    変化を含むと予想されるそれぞれの異なる核酸について
    、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライマ
    ーの伸長生成物を合成するためには有効な温度であるが
    しかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から分
    離する程の高温ではない温度において、有効な時間にわ
    たり、工程（ｃ）からの反応混合物を保持し； （ｅ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるがしかし酵素を
    不可逆的に変性させる程の高温ではない温度において、
    有効な時間にわたり、工程（ｄ）からの反応混合物を加
    熱し； （ｆ）工程（ｅ）からの反応混合物を、工程（ｅ）で産
    生される相補的な一重鎖分子へのそれぞれのプライマー
    のハイブリダイゼーションを促進するために有効な時間
    にわたり有効な温度に冷却し； （ｇ）酵素の活性を促進させ、そして上記１又は複数の
    変化を含むと予想されるそれぞれの異なる核酸について
    、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライマ
    ーの伸長生成物を合成するためには有効な温度であるが
    しかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から分
    離する程の高温ではない温度において、有効な時間にわ
    たり工程（ｆ）からの反応混合物を保持し、１又は複数
    の配列変化が存在するときには、これらを含む核酸の検
    出可能な増幅を得るのに十分な回数だけ、工程（ｅ）〜
    （ｇ）を繰り返し、少なくとも１個のプライマーおよび
    ／または４個のヌクレオチドトリホスフェートの少なく
    とも１個を検出可能な残基で標識しておき、そして工程
    （ｆ）と（ｇ）は同時にまたは順次に行い；（ｈ）オリ
    ゴヌクレオチドの配列が増幅された配列の領域に相補的
    であるときのみ増幅された核酸配列とハイブリダイズす
    ることができる配列特異的オリゴヌクレオチドを膜に固
    定し、 （ｉ）この膜をハイブリダイゼーション条件下で工程（
    ｇ）の生成物で処理し；そして （ｊ）核酸試料の増幅された配列が、膜に固定されたオ
    リゴヌクレオチドにハイブリダイズしたか否かを検出す
    ることを特徴とする方法。 ２７、試料中に含まれた１種又は複数種の核酸中の少な
    くとも１つのヌクレオチド配列の変化の存在または不存
    在を検出する方法であって、該核酸が二本鎖である時に
    は、それはそれぞれ、等しいまたは等しくない長さの２
    本の分離された相補的鎖からなり、 （ａ）上記試料を、上記変化を含むものと予想されるそ
    れぞれの核酸のそれぞれの鎖について、４個の異なるヌ
    クレオチドトリホスフェートと１個のオリゴヌクレオチ
    ドプライマーとに接触させ、但しそれぞれのプライマー
    はそれぞれの特定の配列の異なる鎖に実質的に相補的に
    なるように選択され、１個のプライマーから合成された
    伸長生成物が、その相補体から分離したとき、他のプラ
    イマーの伸長生成物の合成の鋳型として働くことができ
    るようにし、上記接触を、それぞれのプライマーのその
    相補的核酸鎖へのハイブリダイゼーションを促進する温
    度で行い； （ｂ）試料を、工程（ａ）と同時にまたはこの工程の後
    に、ヌクレオチドトリホスフェートの結合を触媒する熱
    安定酵素と接触させて、それぞれの核酸のそれぞれの鎖
    に相補的なプライマー伸長生成物を形成し； （ｃ）酵素の活性を促進させ、そして上記１又は複数の
    変化を含むものと予想されるそれぞれの異なる核酸につ
    いて、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプラ
    イマーの伸長生成物を合成するためには有効な温度であ
    るがしかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型か
    ら分離する程の高温ではない温度において、有効な時間
    にわたり、工程（ｂ）からの混合物を保持し； （ｄ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるがしかし熱安定
    酵素を不可逆的に変性させる程の高温ではない温度にお
    いて、工程（ｃ）からの混合物を加熱し； （ｅ）工程（ｄ）からの混合物を、工程（ｄ）で産生さ
    れた一本鎖分子へのそれぞれのプライマーのハイブリダ
    イゼーションを促進するために有効な時間にわたり有効
    な温度に冷却し； （ｆ）酵素の活性を促進させ、そして上記１又は複数の
    変化を含むものと予想されるそれぞれの異なる核酸につ
    いて、それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプラ
    イマーの伸長生成物を合成するためには有効な温度であ
    るがしかしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型か
    ら分離する程の高温ではない温度において、有効な時間
    にわたり、工程（ｅ）からの混合物を保持し、１種以上
    の配列変化が存在するときには、これらを含む核酸の検
    出可能な増幅を可能にするのに十分な回数だけ、工程（
    ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を繰り返し、そして工程（ｅ
    ）と（ｆ）は同時にまたは順次に行い； （ｇ）オリゴヌクレオチドプローブの配列が増幅された
    配列の領域に相補的であるときのみ増幅された核酸配列
    とハイブリダイズすることができる標識された配列特異
    的オリゴヌクレオチドプローブを膜に固定し、 （ｈ）この膜をハイブリダイゼーション条件下で工程（
    ｆ）の生成物で処理し； （ｉ）プローブと検出される変化の両方が酵素によって
    認識される制限部位を有するときに形成される如何なる
    ハイブリッドをも開裂するであろう制限酵素で、工程（
    ｈ）の生成物を処理し； （ｊ）ハイブリダイゼーションが起こったことを示す必
    要な長さの標識された制限フラグメントが制限消化物中
    に存在するか否かを検出することを特徴とする方法。 ２８、核酸または核酸の混合物に含まれる１種又は複数
    種の特定の核酸配列をクローニングベクターにクローン
    化する方法であって、１種又は複数種の核酸が二本鎖で
    ある時には２本の分離された相補的鎖からなり、該１種
    又は複数種の核酸がクローニングの前に量的に増幅され
    、 （ａ）それぞれの核酸鎖を、４個の異なるヌクレオチド
    トリホスフェートと、増幅されるべきそれぞれの異なる
    特定の配列について１個のオリゴヌクレオチドプライマ
    ーとに接触させ、但しそれぞれのプライマーはそれぞれ
    の特定の配列の異なる鎖に実質的に相補的になるように
    選択され、１個のプライマーから合成された伸長生成物
    が、その相補体から分離したとき、他のプライマーの伸
    長生成物の合成の鋳型として働くことができるようにし
    、それぞれの配列が増幅され、またはそれぞれのプライ
    マーが制限部位を含み、上記接触を、それぞれのプライ
    マーのその相補的核酸鎖へのハイブリダイゼーションを
    促進する温度で行い； （ｂ）それぞれの核酸鎖を、工程（ａ）または（ｂ）と
    同時にまたはこの工程の後に、ヌクレオチドトリホスフ
    ェートの結合を触媒する熱安定酵素と接触させることに
    よりそれぞれの核酸のそれぞれの鎖に相補的なプライマ
    ー伸長生成物を形成し； （ｃ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、それぞれの核酸鎖鋳型に
    相補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成する
    ためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成
    物をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温
    度において、有効な時間にわたり、工程（ｂ）からの混
    合物を保持し； （ｄ）プライマー伸長生成物がその上で合成される鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるがしかし酵素を
    不可逆的に変性させる程の高温ではない温度において、
    有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの混合物を加熱し
    ； （ｅ）工程（ｄ）からの混合物を、それぞれのプライマ
    ーの工程（ｄ）で産生された一本鎖分子のそれぞれへの
    ハイブリダイゼーションを促進するために有効な時間に
    わたり有効な温度に冷却し； （ｆ）酵素の活性を促進し、そして増幅されるべきそれ
    ぞれの異なる配列について、工程（ｄ）で産生されるそ
    れぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライマーの
    伸長生成物を合成するためには有効な温度であるがしか
    しそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から分離す
    る程の高温ではない温度において、有効な時間にわたり
    、工程（ｅ）からの混合物を保持し、工程（ｄ）、（ｅ
    ）および（ｆ）を１種又は複数種の配列を含む１種又は
    複数種の核酸の検出可能な増幅を生じるのに十分な回数
    だけ繰り返し、工程（ｅ）および（ｆ）を同時にまたは
    順次に行い； （ｇ）工程（ｆ）の生成物に上記制限部位のそれぞれに
    対する制限酵素を加えて、制限消化物中に開裂生成物を
    得； （ｈ）クローン化されるべき特定の配列を含む工程（ｇ
    ）の開裂生成物を１又は複数のクローニングベクターに
    連結することを特徴とする方法。 ２９、核酸または核酸の混合物に含まれる少なくとも１
    種の特定の核酸配列をクローニングベクターにクローン
    化する方法であって、１種又は複数種の核酸は等しいま
    たは等しくない長さの２本の分離された相補的鎖からな
    り、該１種又は複数種の核酸がクローニングの前に量的
    に増幅され、 （ａ）それぞれの核酸を、増幅されるべきそれぞれの異
    なる特定の配列について、４個の異なるヌクレオチドト
    リホスフェート及び１個のオリゴヌクレオチドプライマ
    ーの存在下で、それぞれの核酸を変性するのに有効な時
    間、有効な温度に加熱し、但しそれぞれのプライマーは
    それぞれの特定の配列の異なる鎖に実質的に相補的であ
    るように選択され、１個のプライマーから合成された伸
    長生成物が、その相補体から分離したとき、他のプライ
    マーの伸長生成物の合成の鋳型として働くことができる
    ようにし、それぞれの配列が増幅されまたはそれぞれの
    プライマーが制限部位を含み； （ｂ）変性した核酸を、それぞれのプライマーとその相
    補的な鎖との間でハイブリダイゼーションを促進する温
    度に冷却し； （ｃ）工程（ａ）または（ｂ）と同時にまたはその後に
    、変性した核酸を、ヌクレオチドトリホスフェートの結
    合を触媒する熱安定酵素と接触させることにより、それ
    ぞれの核酸のそれぞれの鎖に相補的なプライマー伸長生
    成物を形成させ； （ｄ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、それぞれの核酸鎖鋳型に
    相補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成する
    ためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成
    物をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温
    度において、有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの混
    合物を保持し； （ｅ）プライマー伸長生成物がその上で合成される鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるがしかし酵素を
    不可逆的に変性させる程の高温ではない温度において、
    有効な時間にわたり、工程（ｄ）からの混合物を加熱し
    ； （ｆ）工程（ｅ）からの混合物を、それぞれのプライマ
    ーの工程（ｅ）で産生される相補的な一本鎖分子へのハ
    イブリダイゼーションを促進するために有効な時間にわ
    たり有効な温度に冷却し； （ｇ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、工程（ｆ）で産生される
    それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライマー
    の伸長生成物を合成するためには有効な温度であるがし
    かしそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から分離
    する程の高温ではない温度において、有効な時間にわた
    り、工程（ｆ）からの混合物を保持し、工程（ｅ）、（
    ｆ）および（ｇ）を１種又は複数種の配列を含む１種又
    は複数種の核酸の増幅を検出可能にするのに十分な回数
    だけ繰り返し、工程（ｆ）および（ｇ）を同時にまたは
    順次に行い； （ｈ）工程（ｇ）の生成物に、上記制限部位のそれぞれ
    に対する制限酵素を加えて、制限消化物中に開裂生成物
    を得； （ｉ）クローン化されるべき特定の列を有する工程（ｈ
    ）の１種又は複数種の開裂生成物を選択可能なマーカー
    を有する１種又は複数種のクローニングベクターに連結
    することを特徴とする方法。 ３０、核酸または核酸の混合物に含まれる１種又は複数
    種の特定の核酸配列をクローニングベクターにクローン
    化する方法であって、１種又は複数種の核酸が二本鎖で
    ある時には等しいまたは等しくない長さの２本の分離さ
    れた相補的鎖からなり、該１種又は複数種の核酸がクロ
    ーニングの前に量的に増幅され、 （ａ）それぞれの核酸鎖を、増幅されるべきそれぞれの
    異なる特定の配列について、４個の異なるヌクレオチド
    トリホスフェートと１個のオリゴヌクレオチドプライマ
    ーとに接触させ、但しそれぞれのプライマーはそれぞれ
    の特定の列の異なる鎖に実質的に相補的であるように選
    択され、１個のプライマーから合成された伸長生成物が
    、その相補体から分離したとき、他のプライマーの伸長
    生成物の合成の鋳型として働くことができるようにし、
    上記接触を、それぞれのプライマーのその相補的核酸鎖
    へのハイブリダイゼーションを促進する温度で行い； （ｂ）それぞれの核酸鎖を、工程（ａ）または（ｂ）と
    同時にまたはこの工程の後に、ヌクレオチドトリホスフ
    ェートの結合を触媒する熱安定酵素と接触させることに
    よりそれぞれの核酸のそれぞれの鎖に相補的なプライマ
    ー伸長生成物を形成し； （ｃ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、それぞれの核酸鎖鋳型に
    相補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成する
    ためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成
    物をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温
    度において、有効な時間にわたり、工程（ｂ）からの混
    合物を保持し； （ｄ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるがしかし酵素を
    不可逆的に変性させる程の高温ではない温度において、
    有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの混合物を加熱し
    ； （ｅ）工程（ｄ）からの混合物を、それぞれのプライマ
    ーの工程（ｄ）で産生される一本鎖分子のそれぞれへの
    ハイブリダイゼーションを促進するために有効な時間に
    わたり有効な温度に冷却し； （ｆ）酵素の活性を促進し、そして増幅されるべきそれ
    ぞれの異なる配列について、工程（ｄ）で産生されたそ
    れぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライマーの
    伸長生成物を合成するためには有効な温度であるがしか
    しそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から分離す
    る程の高温ではない温度において、有効な時間にわたり
    、工程（ｅ）からの混合物を保持し、工程（ｄ）、（ｅ
    ）および（ｆ）を、１種又は複数種のクローニングベク
    ターに平滑末端連結するために効果的な、１種又は複数
    種の配列を含む１種又は複数種の核酸の増幅を生じるの
    に十分な回数だけ繰り返し、工程（ｅ）および（ｆ）を
    同時にまたは順次に行い；（ｇ）工程（ｆ）から得られ
    たクローン化されるべき１種又は複数種の増幅された特
    異配列をリガーゼの存在下で１種又は複数種のクローニ
    ングベクターへ連結し、ここで１種又は複数種の上記増
    幅された配列及び１種又は複数種のベクターは連結を行
    うのに十分な量で存在する、ことを特徴とする方法。 ３１、核酸または核酸の混合物に含まれる少なくとも１
    種の特定の核酸配列をクローニングベクターにクローン
    化する方法であって、１種又は複数種の核酸は等しいま
    たは等しくない長さの２本の分離された相補的鎖からな
    り、該１種又は複数種の核酸がクローニングの前に量的
    に増幅され、 （ａ）それぞれの核酸を、増幅されるべきそれぞれの異
    なる特異的配列について、４個の異なるヌクレオチドト
    リホスフェート及び１個のオリゴヌクレオチドプライマ
    ーの存在下で、それぞれの核酸を変性するのに有効な時
    間、有効な温度に加熱し、但しそれぞれのプライマーは
    それぞれの特定の配列の異なる鎖に実質的に相補的であ
    るように選択され、１個のプライマーから合成された伸
    長生成物が、その相補体から分離したとき、他のプライ
    マーの伸長生成物の合成の鋳型として働くことができる
    ようにし； （ｂ）変性した核酸を、それぞれのプライマーとその相
    補的な鎖との間でハイブリダイゼーションを促進する温
    度に冷却し； （ｃ）工程（ａ）もしくは（ｂ）と同時にまたはその後
    に、変性した核酸を、ヌクレオチドトリホスフェートの
    結合を触媒する熱安定酵素と接触させることによりそれ
    ぞれの核酸のそれぞれの鎖に相補的なプライマー−伸長
    生成物を形成させ； （ｄ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、それぞれの核酸鎖鋳型に
    相補的なそれぞれのプライマーの伸長生成物を合成する
    ためには有効な温度であるがしかしそれぞれの伸長生成
    物をその相補的鎖鋳型から分離する程の高温ではない温
    度において、有効な時間にわたり、工程（ｃ）からの混
    合物を保持し； （ｅ）プライマー伸長生成物がその上で合成された鋳型
    から該プライマー伸長生成物を分離して一本鎖分子を生
    成せしめるためには有効な温度ではあるが酵素を不可逆
    的に変性させる程の高温ではない温度において、有効な
    時間にわたり、工程（ｄ）からの混合物を加熱し； （ｆ）工程（ｅ）からの混合物を、それぞれのプライマ
    ーの工程（ｅ）で産生される相補的な一本鎖分子へのハ
    イブリダイゼーションを促進するために有効な時間にわ
    たり有効な温度に冷却し； （ｇ）酵素の活性を促進させ、そして増幅されるべきそ
    れぞれの異なる配列について、工程（ｆ）で産生された
    それぞれの核酸鎖鋳型に相補的なそれぞれのプライマー
    の伸長生成物を合成するためには有効な温度であるがそ
    してそれぞれの伸長生成物をその相補的鎖鋳型から分離
    する程の高温ではない温度において、有効な時間にわた
    り、工程（ｆ）からの混合物を保持し、工程（ｅ）、（
    ｆ）および（ｇ）を１種又は複数種のクローニングベク
    ターに平滑末端連結するために効果的な、それぞれの配
    列を含む１種又は複数種の核酸増幅を生じるのに十分な
    回数だけ繰り返し、工程（ｅ）および（ｆ）を同時にま
    たは順次に行い； （ｈ）工程（ｇ）から得られるクローン化されるべき１
    種又は複数種の増幅された特異配列をリガーゼの存在下
    で１種又は複数種の上記クローニングベクターへ連結し
    、ここで１種又は複数種の上記増幅された配列及び１種
    又は複数種のベクターは連結を行うのに十分な量で存在
    する、ことを特徴とする方法。 ３２、特許請求の範囲第１９項または第２０項の増幅工
    程によって産生される上記配列の複数のコピーを有する
    核酸または核酸の混合物からの増幅された核酸配列。
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