CN110938603B - 一种通用型病毒样本保存缓冲液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了生物试剂相关技术领域的一种通用型病毒样本保存缓冲液及其制备方法，包括以下组分：无RN酶纯水、六水氯化镁、二水氯化钙、咪唑、曲拉通X‑100、液体生物防腐剂Proclin 300和pH值调节剂；是一种通用型病毒样本保存缓冲液，既能适用于PCR方法或其他分子检测方法的使用，又能适用于病毒抗原或抗体的检测，具有更好的维持病毒完整性的能力，可适用于核酸、抗体抗原或功能酶的保存；保存的样本，可直接用于PCR、ElISA或胶体金、荧光等其他检测方法的使用。

Description

一种通用型病毒样本保存缓冲液及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物试剂相关技术领域，特别涉及一种通用型病毒样本保存缓冲液及其制备方法。

背景技术

一直以来，病毒感染时常侵袭着人类的健康，也是目前传染性疾病，甚至导致疾病大流行的主要原因之一。因此，病毒的研究，是现代医学发展的一大热点。现有技术中，病毒提取，病毒培养，甚至病毒的检测与鉴别方面的研究都有着长足的进步。但是，现有技术还存在比较多的技术问题等待研究，例如，从样本中提取出的病毒，大部分并不稳定，需要借助一些辅助工具来维持病毒长期的活性稳定，这就对病毒样本保存缓冲液的技术效果提出更高的要求。理想的病毒样本保存液需要能够较好地稳定病毒，并且能够方便病毒样本的运输和进一步的研究使用。然而，病毒的繁殖与变异速度较快，要维持病毒样本的稳定性，病毒样本保存缓冲液起着至关重要的作用。

现有技术中常见的病毒样本保存缓冲液的设计或针对于核酸的保护，会指向病毒功能蛋白的保护。例如针对核酸的样本保存缓冲液中，通常含有DNase/RNase和其他功能酶的抑制作用，破坏功能蛋白，而主要保护功能蛋白的病毒样本保存缓冲液，对于核酸的保护效果又不佳。第一类病毒样本保存缓冲液更适用于PCR方法或其他分子检测方法的使用，而第二类病毒样本保存缓冲液更适用于病毒抗原或抗体的检测，比如ElISA或胶体金、荧光等快速检测的使用。但是，现有技术中缺乏一种通用型的病毒样本保存缓冲液，能够适应上述两类病毒样本保存的需求。

发明内容

针对现有技术存在的缺乏一种通用型的病毒样本保存缓冲液，能够适应上述两类病毒样本保存的需求的技术问题，本发明提供一种通用型病毒样本保存缓冲液及其制备方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种通用型病毒样本保存缓冲液，包括以下组分：无RNA酶纯水、六水氯化镁、二水氯化钙、咪唑、曲拉通X-100、液体生物防腐剂Proclin 300和pH值调节剂。

进一步的，包括按重量份计的以下的组分：900～1100份无RNA酶纯水、1.44～1.76份六水氯化镁、5.94～7.26份二水氯化钙和3.06～3.74份咪唑；还包括按体积份计的以下组分：4.5～5.5份曲拉通X-100和0.9～1.1份液体生物防腐剂Proclin300；其中，1重量份所述无RNA酶纯水换算成体积份计为1体积份；所述通用型病毒样本保存缓冲液的pH值为6.8～7.4。

优选的，包括以下用量的组分：包括按重量份计的以下的组分：1000份无RNA酶纯水、1.6份六水氯化镁、6.6份二水氯化钙和3.4份咪唑；还包括按体积份计的以下组分：5.0份曲拉通X-100和1.0份液体生物防腐剂Proclin300；其中，1重量份所述无RNA酶纯水换算成体积份计为1体积份；所述通用型病毒样本保存缓冲液的pH值为7.0～7.2。

优选的，所述pH值调节剂为6N盐酸和/或5N氢氧化钠溶液。

优选的，所述通用型病毒样本保存缓冲液的保存温度为2～8℃。

一种上述任一项所述的通用型病毒样本保存缓冲液的制备方法，包括以下步骤：

S1)准确称量所述无RNA酶纯水，并将所述无RNA酶纯水分成第一无RNA酶纯水和第二无RNA酶纯水，其中，所述第一无RNA酶纯水的量为所述无RNA酶纯水总用量的60～80％；

S2)准确称量所述六水氯化镁、所述二水氯化钙、所述咪唑、所述曲拉通X-100、所述液体生物防腐剂Proclin 300并加入所述第一无RNA酶纯水中，制得混合液；

S3)对所述混合液进行充分混合制得混匀液；

S4)在搅拌状态下将所述混匀液的pH值调节至最终数值；

S5)将所述第二无RNA酶纯水加入经过S4)处理的所述混匀液；

S6)对S5)制得的溶液进行充分混匀即得所述通用型病毒样本保存缓冲液。

优选的，S3)中所述充分混合的操作为充分搅拌25～35min。

优选的，S6)中所述充分混匀的操作为充分搅拌10～20min。

进一步的，上述任一项所述的通用型病毒样本保存缓冲液的制备方法，在S6)操作后还包括分装贴标签。

本发明的配方中，各种组分的作用如下：

无RNA酶纯水：确保无生物活性酶的干扰，避免核酸检测时有其他干扰；

六水氯化镁、二水氯化钙：提供镁离子和钙离子，维持离子平衡；

曲拉通X-100、咪唑、液体生物防腐剂Proclin 300：均为防腐用，防止溶液生菌变质；

6N盐酸和5N氢氧化钠溶液：用于pH调试。

本发明具有如下优点：

1.本发明的通用型病毒样本保存缓冲液，既能适用于PCR方法或其他分子检测方法的使用，又能适用于病毒抗原或抗体的检测，具有更好的维持病毒完整性的能力，可适用于核酸、抗体抗原或功能酶的保存；

2.用本发明的通用型病毒样本保存缓冲液保存的样本，可直接用于PCR、ElISA或胶体金、荧光等其他检测方法的使用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的配置流程示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，在以下说明中，省略了对公知结构、技术及操作的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。另外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

需要说明的是，对于本技术方案中的“第一”和“第二”，仅为对相同或相似组分或组分的混合物的称谓区分，不是对重要性的排列，也没有排序、或比较大小、或其他含义。

为了便于本领域技术人员实施本发明的技术方案，先对本发明中所使用的原料进行优选示意，具体如下：

六水氯化镁——MgCl₂·6H₂O——厂家：潍坊海博化工有限公司；

二水氯化钙——CaCl₂·2H₂O——厂家：潍坊海博化工有限公司；

曲拉通X-100——4-(C₈H₁₇)C₆H₄(OCH₂CH₂)_nOH，n＝9-10——分子结构式：

厂家：北京索莱宝科技有限公司；

咪唑——C₃H₄N₂——分子结构式：

厂家：美国阿拉丁工业公司；

液体生物防腐剂Proclin 300——厂家：上海安研生物科技有限公司；

盐酸——HCl——厂家：潍坊海博化工有限公司；

氢氧化钠——NaOH——厂家：潍坊海博化工有限公司；

制备过程中所需设备工具包括：计时器、移液器、天平、pH分析仪、搅拌器、磁力搅拌棒、合适尺寸的容器、合适尺寸的药勺、磁铁。

需要说明的是，以上所列原料试剂和设备工具，均是仅为方便本领域技术人员实施本发明所做的提示，不是对原料试剂来源的限制，也不是对设备工具的限制，本领域技术人员可以结合自身知识，进行实施，不必局限于上述提示。

如图1本发明的配置流程示意图所示，称量溶剂并分成两份、称量溶质并溶于第一溶剂、混匀溶液、调节溶液pH值、将第二溶剂加入溶液、混匀制得最终产品、后处理，这些操作步骤体现到具体的操作中，实施步骤体现为如下实施例：

实施例1

S1)准确称量无1100mLRN酶纯水，并将无RNA酶纯水分成第一无RNA酶纯水和第二无RNA酶纯水，其中，第一无RNA酶纯水的量为无RNA酶纯水总用量的60％；

S2)准确称量1.44g六水氯化镁、5.94g二水氯化钙和3.06g咪唑；4.5mL曲拉通X-100和0.9mL液体生物防腐剂Proclin300；并加入第一无RNA酶纯水中，制得混合液；

S3)对混合液充分搅拌25min。

S4)用6N盐酸或者5N氢氧化钠溶液，在搅拌状态下将混匀液的pH值调节至6.8；

S5)将第二无RNA酶纯水加入经过S4)处理的混匀液；

S6)对S5)制得的溶液充分搅拌10min。

S7)将S6)制得的通用型病毒样本保存缓冲液分装贴标签，在温度条件下2℃保存。

实施例2

S1)准确称量无1000mLRN酶纯水，并将无RNA酶纯水分成第一无RNA酶纯水和第二无RNA酶纯水，其中，第一无RNA酶纯水的量为无RNA酶纯水总用量的70％；

S2)准确称量1.6g六水氯化镁、6.6g二水氯化钙和3.4g咪唑；5.0mL曲拉通X-100和1.0mL液体生物防腐剂Proclin300；并加入第一无RNA酶纯水中，制得混合液；

S3)对混合液充分搅拌30min。

S4)用6N盐酸或者5N氢氧化钠溶液，在搅拌状态下将混匀液的pH值调节至7.1；具体实施时pH值可以设置在7.0～7.2之间；

S5)将第二无RNA酶纯水加入经过S4)处理的混匀液；

S6)对S5)制得的溶液充分搅拌15min。

S7)将S6)制得的通用型病毒样本保存缓冲液分装贴标签，在温度条件下4℃保存。

实施例3

S1)准确称量无900mLRN酶纯水，并将无RNA酶纯水分成第一无RNA酶纯水和第二无RNA酶纯水，其中，第一无RNA酶纯水的量为无RNA酶纯水总用量的80％；

S2)准确称量1.76g六水氯化镁、7.26g二水氯化钙和3.74g咪唑；5.5mL曲拉通X-100和1.1mL液体生物防腐剂Proclin300；并加入第一无RNA酶纯水中，制得混合液；

S3)对混合液充分搅拌35min。

S4)用6N盐酸或者5N氢氧化钠溶液，在搅拌状态下将混匀液的pH值调节至7.4；

S5)将第二无RNA酶纯水加入经过S4)处理的混匀液；

S6)对S5)制得的溶液充分搅拌20min。

S7)将S6)制得的通用型病毒样本保存缓冲液分装贴标签，在温度条件下8℃保存。

效果试验：

采集人流感病毒拭子样本，然后在同样条件下，分别将采集的病毒样本接种到实施例1、实施例2和实施例3制备的通用型病毒样本保存缓冲液中，再将接种有病毒样本的通用型病毒样本保存缓冲液分装成同样规格，置于-20℃冰箱内，在不同的时间段，分别取分装的接种有病毒样本的通用型病毒样本保存缓冲液进行检测。

检测的具体方法为，使用甲、乙型流感病毒检测试剂盒(赛莱克斯(深圳)科技有限公司生产)配合匀相生化发光检测仪监测病毒功能酶的活性，使用甲、乙型流感病毒核酸联合测定试剂盒(荧光PCR法)(上海之江生物科技股份有限公司生产)配合Bio-Rad CFX96实时荧光PCR仪监测病毒RNA的活性。

不同实施例配置的通用型病毒样本保存缓冲液中保存的病毒样本，在不同时间段的检测结果统计数据分别如下面三个表格所示：

实施例1检测数据如下：

实施例2检测数据如下：

实施例3检测数据如下：

通过以上数据可以看出，使用本发明的病毒样本保存缓冲液保存流感临床样本，可稳定保存流感病毒的功能酶和RNA的活性至少24个月，并且可直接适用于PCR和匀相发光方法的检测，保存效果好，检测手段简便。

以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，在没有做出创造性劳动前提下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种流感病毒样本的保存缓冲液，其特征在于：由以下的组分组成：

按重量份计：900～1100份无RNA酶纯水、1 .44～1 .76份六水氯化镁、5.94～7.26份二水氯化钙和3.06～3.74份咪唑；

按体积份计分：4.5～5.5份曲拉通X-100和0.9～1.1份液体生物防腐剂Proclin 300；

其中，1重量份所述无RNA酶纯水换算成体积份计为1体积份；所述流感病毒样本的保存缓冲液的pH值为6.8～7.4。

2.根据权利要求1所述的流感病毒样本的保存缓冲液，其特征在于：由以下的组分组成：

按重量份计：1000份无RNA酶纯水、1.6份六水氯化镁、6.6份二水氯化钙和3.4份咪唑；

按体积份计：5.0份曲拉通X-100和1.0份液体生物防腐剂Proclin 300；

其中，1重量份所述无RNA酶纯水换算成体积份计为1体积份；所述流感病毒样本的保存缓冲液的pH值为7.0～7.2。

3.根据权利要求1所述的流感病毒样本的保存缓冲液，其特征在于：所述pH值调节剂为6N盐酸和/或5N氢氧化钠溶液。

4.根据权利要求1～3任一项所述的流感病毒样本的保存缓冲液，其特征在于：所述流感病毒样本的保存缓冲液的保存温度为2～8℃。

5.一种如权利要求1～4任一项所述的流感病毒样本的保存缓冲液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1)准确称量所述无RNA酶纯水，并将所述无RNA酶纯水分成第一无RNA酶纯水和第二无RNA酶纯水，其中，所述第一无RNA酶纯水的量为所述无RNA酶纯水总用量的60～80％；

S2)准确称量所述六水氯化镁、所述二水氯化钙、所述咪唑、所述曲拉通X-100、所述液体生物防腐剂Proclin 300并加入所述第一无RNA酶纯水中，制得混合液；

S3)对所述混合液进行充分混合制得混匀液；

S4)在搅拌状态下将所述混匀液的pH值调节至最终数值；

S5)将所述第二无RNA酶纯水加入经过S4)处理的所述混匀液；

S6)对S5)制得的溶液进行充分混匀即得所述流感病毒样本的保存缓冲液。

6.根据权利要求5所述的流感病毒样本的保存缓冲液的制备方法，其特征在于：S3)中所述充分混合的操作为充分搅拌25～35min。

7.根据权利要求5所述的流感病毒样本的保存缓冲液的制备方法，其特征在于：S6)所述充分混匀的操作为充分搅拌10～20min。

8.根据权利要求5～7任一项所述的流感病毒样本的保存缓冲液的制备方法，其特征在于：在S6)操作后还包括分装贴标签。

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